nguyenthibichngoc.pdf - Đại học nguyễn tất thành

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC

ẢNH HƯỞNG CỦA ÁNH SÁNG VÀ NITƠ LÊN SỰ TĂNG TRƯỞNG,

HÀM LƯỢNG PROTEIN VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA

CỦA TẢO SPIRULINA SP.

Chuyên ngành: Sản xuất và phát triển thuốc

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Hướng dẫn khoa học: TS. Võ Hồng Trung

Tp HCM – 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bài khóa luận này là của riêng tôi; các kết quả và số liệu

trong báo cáo khóa luận tốt nghiệp không sao chép bất kỳ nguồn nào khác. Tôi hoàn

toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về sự cam đoan này.

TP. Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 2018

Sinh viên

Nguyễn Thị Bích Ngọc

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy TS. Võ Hồng Trung –

Trưởng Bộ môn Hóa sinh – Độc chất, trường Đại học Nguyễn Tất Thành đã tận tình

hướng dẫn chỉ bảo, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện

đề tài này.

Tôi xin trân trọng cảm ơn quý Thầy, Cô và Cán bộ trong khoa Dược, trường

Đại học Nguyễn Tất Thành đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình

học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.

Tôi chân thành cảm ơn các bạn moniter trong Bộ môn Độc chất – Hóa sinh:

Trần Huỳnh Phong, Lưu Thi Đan, Vũ Thị Thu Hồng và Đào Thu Hiền đã tận tình

giúp đỡ, động viên để tôi có thể hoàn thành tốt khóa luận này.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè và những người

thân đã ở bên tôi, tạo điều kiện cả về vật chất lẫn tinh thần trong suốt quá trình học

tập và nghiên cứu.

………………, ngày …..tháng …..năm 2018

Khóa luận tốt nghiệp

i

SVTT: Nguyễn Thị Bích Ngọc HDKH: TS. Võ Hồng Trung

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3

1.1. Giới thiệu về Spirulina sp. .................................................................................... 3

1.2. Đặc điểm sinh học của Spirulina sp. .................................................................... 3

1.2.1. Phân loại ........................................................................................................ 3

1.2.2. Đặc điểm hình thái và cấu trúc tế bào Spirulina sp. ...................................... 4

1.2.3. Đặc điểm sinh lý ............................................................................................ 6

1.2.4. Đặc điểm sinh hóa ......................................................................................... 7

1.3. Protein của Spirulina sp. ....................................................................................... 9

1.4. Khả năng chống oxy hóa của Spirulina sp. .......................................................... 9

1.5. Ứng dụng nuôi trồng của Spirulina sp. .............................................................. 10

1.6. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng tảo Spirulina sp. ......................................... 12

1.6.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ................................................................ 12

1.6.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong nước ........................................... 12

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................... 14

2.1. Chủng Spirulina sp. ............................................................................................ 14

2.2. Các phương pháp phân tích ................................................................................ 14

2.2.1. Quan sát hình thái tế bào Spirulina sp. ........................................................ 14

2.2.2. Xác định sinh khối tế bào Spirulina sp. ....................................................... 15

2.2.3. Xác định tốc độ tăng trưởng đặc hiệu .......................................................... 15

2.2.4. Xác định hàm lượng protein của Spirulina sp. bằng phương pháp Bradford15

2.2.5. Xác định hàm lượng phenolic tổng ............................................................. 16

2.2.6. Xác định hàm lượng chất oxy hóa tổng ....................................................... 16

2.2.7. Xác định hàm lượng các acid amin theo hệ thống Pico – Tag .................... 17

2.3. Phương pháp thiết kế thí nghiệm ........................................................................ 17

2.3.1. Thí nghiệm 1: Lựa chọn điều kiện ánh sáng nuôi cấy thích hợp................. 17

2.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố nitơ lên sự tăng trưởng và hàm

lượng protein ở Spirulina sp. ................................................................................ 18

2.3.3. Thí nghiệm 3: Nuôi cấy, thu sinh khối và phân tích thành phần acid amin 20


ii


2.4. Xử lý số liệu........................................................................................................ 21

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ........................................................... 22

3.1. Kết quả ................................................................................................................ 22

3.1.1. Lựa chọn điều kiện ánh sáng nuôi cấy thích hợp ........................................ 22

3.1.2. Ảnh hưởng của yếu tố nitơ lên sự tăng trưởng và hàm lượng protein ở

Spirulina sp. .......................................................................................................... 27

3.1.3. Nuôi cấy, thu sinh khối và phân tích thành phần acid amin ........................ 32

3.2. Biện luận ............................................................................................................. 41

3.2.1. Lựa chọn điều kiện ánh sáng nuôi cấy thích hợp ........................................ 41


Spirulina sp. .......................................................................................................... 42

3.2.3. Nuôi cấy, thu sinh khối và phân tích thành phần acid amin ........................ 44

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................... 47

4.1. Kết luận ............................................................................................................... 47

4.2. Kiến nghị ............................................................................................................ 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO


iii


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu Chú thích

% Phần trăm

µg Microgam

µL Microlít

g/L Gam/Lít

mcg Microgam

mg/L Miligam/Lít

mmol/L Milimol/Lít

UI International Unit


iv


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của tảo Spirulina so với % trọng lượng khô ............. 7

Bảng 1.2 Thành phần vitamin của tảo Spirulina so với % trọng lượng khô ............. 8

Bảng 1.3 Thành phần chất khoáng của tảo Spirulina so với% trọng lượng khô ....... 8

Bảng 3.1 Thành phần của môi trường Zarrouk ........................................................ 14

Bảng 3.1 Khối lượng sinh khối khô Spirulina theo từng loại ánh sáng ................... 24

Bảng 3.2 Nồng độ protein tổng (g/L) theo từng loại ánh sáng ................................. 26

Bảng 3.3 Hàm lượng protein (%) tổng theo từng loại ánh sáng ............................... 26

Bảng 3.4 Khối lượng sinh khối khô Spirulina theo từng nồng độ NaNO3 khác nhau

................................................................................................................................... 29

Bảng 3.5 Khả năng tích lũy protein theo từng nồng độ NaNO3 khác nhau.............. 31

Bảng 3.6 Khối lượng sinh khối khô của 2 chủng ..................................................... 34

Bảng 3.7 Hàm lượng protein tổng của các chủng Spirulina sp. ............................... 35

Bảng 3.8 Hàm lượng thành phần acid amin của Spirulina sp. ................................. 37

Bảng 3.9 Hàm lượng phenolic tổng của 2 chủng ..................................................... 39

Bảng 3.10 Hàm lượng chất chống oxy hóa tổng của 2 chủng Spirulina sp. ............ 40


v


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Hình thái tế bào Spirulina sp. ...................................................................... 4

Hình 1.2 Một phần của trichome xoắn ốc của Spirulina platensis; trong đó p là độ

cao và d đường kính ngoài của xoắn ốc ...................................................................... 5

Hình 1.3 Sơ đồ vòng đời của tảo Spirulina ................................................................ 7

Hình 2.1 Spirulina sp. nuôi cấy trong môi trường Zarrouk ...................................... 18

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nuôi cấy Spirulina trong các điều kiện ................ 18

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nuôi cấy Spirulina ở các điều kiện NaNO3 khác

nhau ........................................................................................................................... 19

Hình 2.4 Các bình chứa dịch tảo trong hệ thống thí nghiệm.................................... 20

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nuôi cấy các chủng Spirulina sp. ở điều kiện NaNO3

5 g/L .......................................................................................................................... 21

Hình 3.1 Hình thái tế bào Spirulina sp. trong các điều kiện nuôi cấy ánh sáng đỏ, ánh

sáng xanh dương và ánh sáng trắng .......................................................................... 22

Hình 3.2 Màu sắc dịch nuôi ngày thứ 10 trong điều kiện nuôi cấy ánh sáng đỏ, ánh

sáng xanh dương và ánh sáng trắng .......................................................................... 23

Hình 3.3 Sinh khối của Spirulina sp. trong các điều kiện ánh sáng khác nhau ....... 23

Hình 3.4 Tốc độ tăng trưởng đặc hiệu của Spirulina sp. trong các điều kiện ánh sáng

khác nhau................................................................................................................... 24

Hình 3.5 Hàm lượng protein tổng của Spirulina trong các điều kiện ánh sáng khác

nhau ........................................................................................................................... 25

Hình 3.6 Sinh khối của Spirulina sp. trong các nồng độ NaNO3 khác nhau ........... 28

Hình 3.7 Tốc độ tăng trưởng đặc hiệu của Spirulina sp. trong các nồng độ NaNO3

khác nhau................................................................................................................... 28

Hình 3.8 Hàm lượng protein tổng của Spirulina trong các nồng độ NaNO3 khác nhau

................................................................................................................................... 30

Hình 3.9 Hình thái của 2 chủng Spirulina sp. Mỹ và Nhật ...................................... 32

Hình 3.10 Màu sắc dịch nuôi cấy ngày thứ 5 trong môi trường Zarrouk chứa NaNO3

5,0 g/L của 2 chủng Spirulina sp. Nhật và Sprulina sp. Mỹ ..................................... 33


vi


Hình 3.11 Sinh khối của 2 chủng Spirulina sp. Mỹ và Nhật .................................... 33

Hình 3.12 Hàm lượng protein tổng (g/L) của 2 chủng Spirulina sp. ở nồng độ NaNO3

5,0 g/L ....................................................................................................................... 34

Hình 3.13 Hàm lượng phần trăm protein tổng của 2 chủng Spirulina sp. ở nồng độ

NaNO3 5,0 g/L........................................................................................................... 35

Hình 3.14 Hàm lượng phenolic tổng của 2 chủng Spirulina sp. ở nồng độ NaNO3 5,0

g/L ............................................................................................................................. 38

Hình 3.15 Hàm lượng chất chống oxy hóa tổng của 2 chủng Spirulina sp. ở nồng độ

NaNO3 5,0 g/L........................................................................................................... 39


vii


Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học - Năm học 2013– 2018

ẢNH HƯỞNG CỦA ÁNH SÁNG VÀ NITƠ LÊN SỰ TĂNG TRƯỞNG,

HÀM LƯỢNG PROTEIN VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA

CỦA TẢO SPIRULINA SP.

Nguyễn Thị Bích Ngọc

Hướng dẫn khoa học: TS. Võ Hồng Trung

Mở đầu: Spirulina sp. là sản phẩm thiên nhiên có giá trị dinh dưỡng và sinh học cao, đáp

ứng nhu cần vừa là thức ăn, vừa là dược phẩm chữa bệnh. Điều kiện nuôi cấy là yếu tố quan

trọng quyết định đến chất lượng sản phẩm từ Spirulina.

Đối tượng: Tảo Spirulina sp. Phương pháp nghiên cứu: phương pháp Bradford, xác định

hàm lượng chất oxy hóa tổng, hệ thống Pico – Tag và một số phương pháp khác.

Kết quả: Sinh khối cực đại ở ánh sáng đỏ (0,84 g/L) cao hơn so với điều kiện ánh sáng trắng

và ánh sáng xanh dương (0,57 g/L và 0,28 g/L) p<0,05. Spirulina tích lũy protein cao trong

điều kiện ánh sáng xanh dương khoảng 40,66% sinh khối khô, cao hơn gấp đôi trong ánh

sáng trắng và đỏ (17,42 và 15,91% ) (p<0,05). Trong môi trường có nồng độ NaNO3 (5,0

g/L) cho sinh khối đạt (0,60 g/L) và hàm lượng protein (34,41%) cao hơn so với khối lượng

sinh khối và hàm lượng protein được tạo ra khi nuôi cấy trong điều kiện nồng độ NaNO3

thấp (1,25 g/L và 2,5 g/L).

Kết luận: Chất lượng ánh sáng và nồng độ NaNO3 trong môi trường nuôi cấy có tác động

mạnh mẽ lên hình thái, sự tăng trưởng và tích lũy protein ở Spirulina sp. Khả năng chống

oxy hóa, tích lũy protein và thành phần acid min đều cao ở cả 2 chủng Spirulina sp. Mỹ và

Nhật trong điều kiện nuôi cấy có nồng độ NaNO3 5,0 g/L. Ngoài ra, hàm lượng phenolic

tổng và khả năng chống oxy của hai chủng Spirulina sp. này có mối tương quan dương với

nhau.

Từ khóa: Spirulina sp., phương pháp Bradford, nitrate, protein, amino acid, chống oxy hóa.


viii


Final assay for the degree of BS Pharm - Academic year: 2013-2018

EFFECT OF LIGHT QUALITY AND NITROGEN ON GROWTH,

PROTEIN CONTENT AND ANTIOXIDANT CAPACITY OF THE SPIRULINA SP.

Nguyen Thi Bich Ngoc

Supervisor: Dr. Trung Vo Hong

Introduction: Spirulina sp. is natural product known as a natural source of nutraceuticals

and bioactive compounds, responding to the demand of both food and medicinal products.

Cultural conditions are the key point to determine the quality of Spirulina’s products.

Materials: Spirulina sp. Methods: Bradford method, total oxidant quantitation, Pico - Tag

system and other methods.

Results: Maximum biomass under red light (0.84 g/L) was higher than those under white

and blue light conditions (0.57 g/L and 0.28 g/L) p <0.05. Protein contents obtained from

Spirulina sp. under the blue light condition was about 40.66% dry biomass, twice as much

as those under white and red light conditions (17.42 and 15.91%) (p <0.05). Under the high

NaNO3 concentration supplied Zarrouk medium (5.0 g/L), the dry biomass (0.60 g/L) and

protein content (34.41%) were higher than those under low NaNO3 concentration supplied

medium (1.25 g/L and 2.5 g/L).

Conclusion: The light quality and NaNO3 concentration in the culture medium strongly

influenced morphology, growth and protein content in Spirulina sp. The antioxidant

capacity, protein content and amino acid profiles were obtained high in both strains of

Spirulina sp. from USA and Japan under culture condition in which NaNO3 concentration

was of 5.0 g/L. In addition, there was a positive correlation between the total phenolic

content and the antioxidant capacity of the two strains of Spirulina sp.

Key words: Spirulina sp., Bradford method, nitrate, protein, amino acid, antioxidant

capacity.

Khóa luận tốt nghiệp Đặt vấn đề

1


ĐẶT VẤN ĐỀ

Khi đứng trên cao của sự phát triển của khoa học và công nghệ, con người dần

có xu hướng trở về với thiên nhiên. Vì thế mà các nhà khoa học không ngừng cho ra

đời những công trình nghiên cứu các loài thực vật, động vật trong tự nhiên nhằm tìm

ra những hoạt chất quý ứng dụng trong y học, để chữa những căn bệnh nguy hiểm

như ung thư, bệnh truyền nhiễm.

Bên cạnh đó, tiếp nối những thành công trong những thế kỷ trước, chúng ta đã

tìm ra những nguồn thực phẩm giàu dinh dưỡng từ tự nhiên như các loại bánh tảo,

thực phẩm chức năng. Đồng thời dựa vào thiên nhiên chúng ta cũng tìm ra nguồn

chiết xuất ra các hoạt chất trong ngành mỹ phẩm. Spirulina là một trong những loài

tảo được nghiên cứu nhiều nhất và cũng đem lại rất nhiều lợi ích cho con người trong

ngành thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm.

Các loài Spirulina có hoạt tính sinh học đa dạng và ý nghĩa về dinh dưỡng do

chúng có hàm lượng cao các chất dinh dưỡng tự nhiên, có vai trò điều hòa chức năng

sinh học và miễn dịch. Spirulina là loại vi tảo được tiêu thụ nhiều nhất do hàm lượng

protein cao và các lợi ích dinh dưỡng bổ sung, bao gồm chống tăng huyết áp, bảo vệ

thận, chống tăng lipid máu và chống tăng đường huyết [75]. Nhiều Spirulina ảnh

hưởng lên hệ thống miễn dịch thông qua tăng hoạt tính của đại thực bào, kích thích

tạo ra kháng thể, cytokine, tăng tích lũy tế bào NK (Natural Killer Cell) trong các mô,

tăng sự hoạt động và di chuyển của tế bào T và B [46]. Spirulina là một nguồn giàu

protein, chứa hàm lượng cao acid hypocholesterolemic γ-linoleic (GLA), vitamin B

và các phycobiliprotein tự do [71]. Do đó nó đã được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO)

gán danh hiệu là “siêu thực phẩm” [46]. Như một minh chứng cho điều này, Spirulina

có lượng canxi nhiều hơn 180% so với sữa, protein nhiều hơn 670% so với đậu hũ,

hơn 3100% β-carotene so với cà rốt và chất sắt nhiều hơn 5100% rau bina [20].

Nắm bắt được tiềm năng kinh tế cũng như giá trị dinh dưỡng từ Spirulina nhiều

nghiên cứu từ quy mô nhỏ như trong phòng thí nghiệm đến quy mô lớn như sản xuất

trong công nghiệp được thực hiện nhằm tìm ra phương pháp nuôi trồng để đạt được

hiệu suất cao nhất. Điển hình như: môi trường MS, Zarrouk… là một trong những

Khóa luận tốt nghiệp Đặt vấn đề

2


môi trường mang lại hiệu quả cao và tiết kiệm với những điều kiện chuẩn về chế độ

dinh dưỡng, pH, nhiệt độ, ánh sáng [27], [46].

Hiện nay, đã có nhiều công trình trong nghiên cứu về các điều kiện nuôi trồng

Spirulina mang lại hiệu suất tối ưu. Tuy nhiên, ở Việt Nam còn rất nhiều hạn chế về

lĩnh vực này. Dựa vào cơ sở đó, đề tài “Ảnh hưởng của ánh sáng và nitơ lên sự tăng

trưởng, hàm lượng protein tổng, acid amin và khả năng chống oxy hóa của

Spirulina sp.” thực hiện với mục đích:

Xác định điều kiện ánh sáng, nồng độ nitơ thích hợp cho tăng trưởng và tích

lũy protein ở Spirulina sp.

Xác định khả năng chống oxy hóa và hàm lượng acid amin ở các chủng

Spirulina sp.

Khóa luận tốt nghiệp Tổng quan

3


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về Spirulina sp.

Tảo Spirulina hay tảo xoắn Spirulina là tên gọi do nhà tảo học Deurben (Đức)

đặt vào năm 1827 dựa trên hình thái tảo Spirulina. Do hình dạng “xoắn lò xo” với

khoảng 5-7 vòng đều nhau không phân nhánh dưới kính hiển vi nên được gọi là

Spirulina với tên khoa học là tảo Spirulina platensis (bắt nguồn từ chữ spire, spiral

có nghĩa là “xoắn ốc”) và trước đây được coi là thuộc chi Spirulina. Spirulina thuộc

vi khuẩn lam (Cyanobacteria) nên chúng thuộc sinh vật nhân sơ hay nhân nguyên

thủy (Prokaryote)[22].

Cũng vào năm 1827, Turpin lần đầu tiên phân lập được tảo Spirulina từ nguồn

nước tự nhiên.

Năm 1960, Tiến sĩ Clement người Pháp tình cờ phát hiện loại tảo này khi đến

hồ Tchad ở Trung Phi. Nhà khoa học này không khỏi kinh ngạc khi vùng đất cằn cỗi,

đói kém quanh năm nhưng những thổ dân ở đây rất cường tráng và khỏe mạnh. Khi

Clement tìm hiểu về thức ăn của họ, bà phát hiện trong mùa không săn bắn, họ chỉ

dùng một loại bánh màu xanh mà nguyên liệu chính là thứ họ vớt lên từ hồ. Qua phân

tích, bà phát hiện ra loại bánh có tên Dihe này chính là tảo Spirulina. Năm 1963, bà

đã nghiên cứu thành công việc nuôi Spirulina ở qui mô công nghiệp [32].

Năm 1973, Tổ chức Nông lương Quốc tế (FAO) và Tổ chức Y tế Thế giới

(WHO) đã chính thức công nhận tảo xoắn Spirulina là nguồn dinh dưỡng và dược

liệu quý, đặc biệt trong chống suy dinh dưỡng và chống lão hóa [6].

Năm 1977, Viện sinh vật học là nơi tiên phong trong việc nuôi trồng Spirulina

ở Việt Nam theo mô hình ngoài trời, không mái che, có sục khí CO2 tại xí nghiệp

nước suối Vĩnh Hảo (Bình Thuận).

1.2. Đặc điểm sinh học của Spirulina sp.

1.2.1. Phân loại

Tảo (algae) là một nhóm vi sinh vật, nhưng chúng khác với vi khuẩn và nấm

men ở chỗ chúng có diệp lục và có khả năng tổng hợp được các chất hữu cơ từ các

chất vô cơ dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời [1].


4


Tảo Spirulina thuộc [2]:

Lãnh giới (domain): Bacteria

Ngành (phylum): Cyanophyta

Lớp (class): Cyanophyceae

Bộ (ordo): Oscillatoriales

Họ (familia): Oscillatoniaceae (Nostocales)

Chi (genus): Spirulina

Có hai loài quan trọng là Spirulina maxima và Spirulina platensis.

1.2.2. Đặc điểm hình thái và cấu trúc tế bào Spirulina sp.

Tảo lam được xếp vào nhóm vi khuẩn lam, loài vi sinh vật đầu tiên có khả năng

quang hợp và sinh ra khí oxy được phát hiện từ 3,5 tỷ năm trước [45].

Spirulina là tảo đa bào, dạng sợi xoắn lò xo khoảng 5-7 vòng đều nhau không

phân nhánh. Đường kính xoắn khoảng 35 – 50 µm, bước xoắn 60 µm, chiều dài thay

đổi có thể đạt 250 µm. Nhiều trường hợp tảo Spirulina có kích thước lớn hơn (hình

1.1 và hình 1.2).

Hình 1.1 Hình thái tế bào Spirulina sp. [43]


5


Thành tế bào Spirulina có cấu trúc nhiều lớp, không chứa cellulose mà chứa

mucopolyme pectin và các loại polysaccharide khác. Màng tế bào nằm sát ngay bên

dưới thành tế bào và nối với màng quang hợp nằm rải rác trong nguyên sinh chất [1].

Tế bào tảo Spirulina chưa có nhân điển hình, vùng nhân là vùng giàu acid

nucleic chưa có màng nhân bao bọc, phân bố trong nguyên sinh chất. Ngoài ra, tế bào

Spirulina không có không bào thực, chỉ có không bào chứa khí làm chức năng điều

Hình 1.1 Một phần của trichome xoắn ốc của Spirulina platensis; trong đó p là

độ cao và d đường kính ngoài của xoắn ốc [30]


6


chỉnh tỷ trọng tế bào. Nhờ có không bào chứa khí và hình dạng xoắn mà Spirulina có

thể nổi lên mặt nước [3].

Mặc dù không có ty thể và mạng lưới nội chất song tế bào Spirulina vẫn có

ribosom và một số thể vùi như các hạt polyphotphat, glycogen, phycocyanin,

carboxysome và hạt mesosome [1].

1.2.3. Đặc điểm sinh lý

Tảo Spirulina có thể phân bố rộng rãi trong đất, đầm lầy, nước sạch, nước mặn,

nước biển và suối nước nóng [4]. Do là một vi sinh vật quang dưỡng bắt buộc nên

ngoài hàm lượng chất dinh dưỡng cần thiết cho tảo là nguồn carbon và nguồn nitơ,

photpho; sự sinh trưởng của Spirulina còn phụ thuộc vào các yếu tố vật lý như sau:

- Yếu tố ánh sáng: là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát

triển của tảo. Spirulina ít bị chi phối bởi chu kỳ sáng/tối và đạt giá trị sinh khối

cao khi được chiếu sáng liên tục. Cường độ ánh sáng thích hợp khoảng: 25,000 -

30,000 lux [1].

- Yếu tố nhiệt độ: Spirulina phát triển ở nhiệt độ khá cao. Người ta phát hiện chúng

sống ở những suối nước nóng đến 690C. Chúng có khả năng phát triển ở khoảng

nhiệt độ 350C - 370C ở điều kiện phòng thí nghiệm. Spirulina phát triển rất chậm

dưới 250C [66].

- Yếu tố pH: Spirulina phát triển trong khoảng pH từ 8,3 – 11. Tuy nhiên, pH của

môi trường tối ưu cho sinh trưởng và phát triển của tảo là từ 8,5 – 9,0. Tại khoảng

pH này, nguồn carbon vô cơ được đồng hóa nhiều nhất [67]. Ở pH= 10 – 11, tảo

vẫn phát triển nhưng rất chậm.

Nếu pH ≤ 7: khí CO2 được đưa vào môi trường, tảo có thể sự dụng CO2

hòa tan là chủ yếu.

Nếu pH ≤ 9: CO2 hòa tan sẽ chuyển sang HCO3- và CO3

2-

CO2 H2CO3 H+ + HCO3 2H+ + CO32-

Nếu pH = 10 – 11: các nguồn carbon trên lại trở về trạng thái ban đầu

CO32- + H2O CO2 + 2OH-

OH- được giải phóng sẽ làm tăng pH.


7


Nếu pH quá cao tất cả HCO3- và CO3

2- sẽ tạo thành CO2 và OH-.

Chu kỳ phát triển của tảo rất ngắn, thường xảy ra trong 24 giờ như tảo Chlorella.

Tảo lam Spirulina có hai hình thức sinh sản:

- Sinh sản sinh dưỡng: thực hiện bằng cách đứt từng khúc ở chỗ có tế bào dị hình

trên sợi tảo, từ đó tạo ra sợi mới (hình 1.3).

- Sinh sản vô tính: thực hiện bằng cách tạo bào tử giống ở vi khuẩn trong điều kiện

không thuận lợi.

1.2.4. Đặc điểm sinh hóa

Tảo Spirulina chứa hàm lượng protein rất cao, cao hơn cả tảo Chlorella. Ngoài

ra chúng còn chứa đầy đủ các vitamin và khoáng chất [3] (bảng 1.1, 1.2 và 1.3).

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của tảo Spirulina so với % trọng lượng khô

STT Thành phần % so với trọng lượng khô

1

2

3

4

5

6

7

Protein tổng

Glucid

Lipid

Acid nucleic

Diệp lục

Caroten

Tro

60 – 70

13 – 16

7 – 8

4,29

0,76

0,23

4 – 5

Hình 1.2 Sơ đồ vòng đời của tảo Spirulina [23]


8


Tuy nhiên, hàm lượng các thành phần hóa học của tảo thay đổi tùy thuộc vào

điều kiện nuôi cấy [4].

Bảng 1.2 Thành phần vitamin của tảo Spirulina so với % trọng lượng khô[32]

STT Thành phần Trọng lượng trong 100g

1 Vitamin A(100% β-carotene) 352,000 IU

2 Vitamin K 1090 mcg

3 Thiamine HCl (Vitamin B1) 0,5 mg

4 Riboflavin (Vitamin B2) 4,53 mg

5 Niacin (Vitamin B3) 14,9 mg

6 Vitamin B6 (Pyridox. HCl) 0,96 mg

7 Vitamin B12 162 mcg

Bảng 1.3 Thành phần chất khoáng của tảo Spirulina so với% trọng lượng khô[32]

STT Thành phần Trọng lượng trong 100g

1 Caxi 468 mg

2 Sắt 87,4 mg

3 Photpho 961 mg

4 Iod 142 mcg

5 Magie 319 mg

6 Kẽm 1,45 mg

7 Selen 25,5 mcg

8 Đồng 0,47 mg

9 Mangan 3,26 mg

10 Clo <400 mcg

11 Kali 1,660 mg

12 Natri 641 mg


9


Các acid béo bão hòa và không bão hòa cũng có mặt trong thành phần của

Spirulina và chiếm tới 1,95g/100g chất khô. Hàm lượng cholesterol nhỏ hơn khoảng

0,1mg/100g chất khô, trong khi đó hàm lượng cholesterol trong 100 g chất khô của

trứng lên đến 600 mg. Điều này giải thích tại sao bột Spirulina được dùng bổ sung

thức ăn cùng với protein đồng thời nó kiểm soát việc tăng trọng lượng quá mức [3].

1.3. Protein của Spirulina sp.

Đặc điểm sinh hóa nổi bật của Spirulina là có hàm lượng protein rất cao, chiếm

khoảng 55 – 70% trọng lượng khô của tế bào, trong khi các thực phẩm được coi là

giàu chất đạm như đậu nành, thịt bò, photmat cũng chỉ có 18 – 37 % đạm. Nhiều

nghiên cứu đã chứng minh rằng protein trong Spirulina hoàn toàn không có hại. Tốc

độ đồng hóa protein rất cao: sau 18 giờ thì 58% protein được tiêu hóa và đồng hóa

[3]. Protein của tảo Spirulina có chứa acid amin thiết yếu và acid amin không thiết

yếu và tỷ lệ của các acid amin này khá cân đối. Trong số các acid amin có 4 loại

không thể thay thế và có vai trò quan trọng như: lysine, methionine, phenylanalin,

tryptophan.

Ngoài ra, trong thành phần protein của Spirulina còn chứa các phycobiliprotein

– một loại protein tan trong nước - một loại sắc tố lam có vai trò quan trọng trong quá

trình quang hợp của Tảo lam, Tảo đỏ [33]. Hàm lượng phycobiliprotein chiếm đến

20 – 25% trong tổng lượng protein của tế bào; bao gồm 2 loại sắc tố: C-phycocyanin

và allophycocyanin [16]. Chất này có hoạt tính sinh học cao đã được nghiên cứu và

thử nghiệm trong lĩnh vực Y-học. Một số bằng sáng chế liên quan đến hoạt tính sinh

học có lợi của phycobiliprotein cũng đã được công bố về các ứng dụng sinh học như

chống oxy hóa, chống viêm, chống virus, chống khối u, bảo vệ thần kinh và các hoạt

động bảo vệ gan [15], [49].

1.4. Khả năng chống oxy hóa của Spirulina sp.

Những năm gần đây, người ta đã bắt đầu nghiên cứu một số hoạt tính sinh học

ở tảo Spirulina và ứng dụng của chúng. Một trong số đó, khả năng chống oxy là hoạt

tính đang được chú ý nhiều nhất.


10


Do protein của Spirulina chứa phycobiliprotein có khả năng phát huỳnh quang

nên chúng được ứng dụng để đánh dấu các kháng thể đơn dòng trong việc chuẩn đoán

và phát hiện một số bệnh. Điều đáng được biết thêm là phycobiliprotein trong

Spirulina đã được phát hiện như là một tác nhân chống ung thư tuyến tụy ở chuột đực

nhờ khả năng chống oxy hóa và chống tăng sinh tế bào [49]. Vấn đề này đang được

các nhà khoa học quan tâm thí nghiệm ở các đối tượng khác.

Một nhóm hoạt chất có tác dụng sinh học quan trọng khác của Spirulina là các

carotenoid, tổng lượng chất này là 346mg/100g trọng lượng chất khô [64]. Tảo

Spirulina có tới 10 carotenoid khác nhau: oscillaxanthin, epoxy--carotene,

myxoxanthophyll, zeaxantin, -carotene, cismyxoxanthophyll, -cryptoxantin,

echinenone và hydroxyl-echinenone [38]. Trong đó đáng lưu ý là myxoxanthophyll,

zeaxantin, -carotene, echinenone là nhóm carotenoid đặc trưng cho cả ngành Tảo

Lam. Đặc biệt, tảo Spirulina là loại thực vật chứa hàm lượng -carotene cao, chiếm

52% trong tổng hàm lượng carotenoid (tiền Vitamin A), gấp 10 lần hàm lượng -

carotene có trong cà rốt, được biết đến như loại rau quả thông dụng giàu -carotene

nhất trong thực phẩm hàng ngày [63]. Beta – carotene trong Spirulina là chất chống

oxy hóa mạnh, giúp tiêu diệt các gốc tự do là nguyên nhân của nhiều bệnh tật. Dùng

liều cao -carotene trong khẩu phần dinh dưỡng hằng ngày sẽ rất hiệu quả trong việc

phòng chống các dạng ung thư [50].

Một nhóm các nhà khoa học ở trường Đại học Haward (Mỹ) nhận thấy chế phẩm

“Phycoten” về bản chất là tập hợp các carotenoid và diệp lục tố a chiết từ tảo Spirulina

có tác dụng rất tốt đối với hệ thống miễn dịch cơ thể người trong chống bệnh ung thư

[72].

1.5. Ứng dụng nuôi trồng của Spirulina sp.

Hiện nay, Spỉrulina được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau. Ngoài

những ứng dụng về dinh dưỡng và y tế trong một vài nghiên cứu, loài tảo này được

nuôi trồng ứng dụng trong các mô hình tiết kiệm chi phí và bảo vệ môi trường như:


11


sử dụng các nguồn carbon, nitơ hay photpho có sẵn trong tự nhiên để phát triển sinh

khối và một số hoạt chất.

Điển hình như một mô hình đã được khảo sát tại Braxil, Spirulina được nghiên

cứu để nuôi trồng trên mô hình sử dụng nguồn CO2 có trong không khí kết hợp với

monoethanolamine (MEA) – một chất hấp thụ CO2 và chuyển đổi thành bicarbonate

vừa góp phần giảm thải lượng carbon gây ô nhiễm môi trường vừa có thể thu lại

lượng sinh khối cao thu hoạch làm phân bón hoặc thức ăn cho gia cầm và thủy sản.

Kết quả của thí nghiệm này khá khả thi, ở nồng độ MEA 0,10; 0,20 và 0,41 mmol/L

Spirulina tăng trưởng cao hơn và có hàm lượng protein cao hơn 17% so với sử dụng

NaOH làm chất hấp thụ CO2 [69].

Ở Việt Nam, nhiều cơ sở nuôi trồng, sản xuất và chế biến các sản phẩm từ tảo

Spirulina được thành lập với công nghiệp nuôi tảo trên các bể cấy nông bằng xi măng

và sử dụng khí CO2 từ công nghệ tạo nguồn carbon, nguồn CO2 lấy trực tiếp tại các

nhà máy bia, cồn, rượu…được nén hóa lỏng vào bình chứa. Đó là các cơ sở ở Vĩnh

Hảo (Bình Thuận), Châu Cát, Lòng Sông (Thuận Hải), Suối Nghệ (Đồng Nai),…

Nguồn CO2 từ lò nung vôi (sau khi lọc bụi) và các hầm chứa khí biogas cũng được

nghiên cứu tận dụng để phát triển nuôi trồng tảo và cũng đã thu được một số kết quả.

Thử nghiệm nuôi trồng Spirulina bằng nước thải hầm biogas không chỉ là biện pháp

mở rộng sản xuất và hạ giá thành sản phẩm, mà còn giải quyết các vấn đề về môi

trường sinh thái cho nông thôn. Tảo này còn được sử dụng để xử lý nước thải giàu

NH4 từ nhà máy sản xuất urê thuộc xí nghiệp Liên hiệp Phân đạm Hóa chất Hà Bắc,

kết quả cho thấy nước thải sau khi pha loãng và bổ sung thêm một số khoáng chất

cần thiết rồi dùng nuôi Spirulina đã mang lại năng suất cao và có tác dụng bảo vệ môi

trường [5], [7].

Tuy nhiên, trong quá trình nuôi cấy Spirulina thường gặp một vài hạn chế cần

khắc phục để tránh ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của tảo. Điển hình như việc dư thừa

hoặc thiếu bicarbonate hay thiếu lượng nitơ trong môi trường nuôi cấy dẫn đến việc

sản xuất lượng đường quá mức trong quá trình quang hợp. Khi nồng độ chất này trở

nên dư thừa trong tế bào, chúng sẽ tiết ra môi trường. Vì những chất đường nhầy nên


12


khi sợi tảo trườn lên sẽ tạo sinh khối nhầy. Điều này có thể làm hỏng quá trình nuôi

cấy vì như vậy tảo sẽ tránh xa môi trường có dinh dưỡng nên chúng sẽ bị chết vì đói.

Ngoài ra ánh sáng, nhiệt độ, một số vi sinh vật như: vi khuẩn, động vật chân chèo,

động vật nguyên sinh và nhiễm một số loài tảo khác cũng ảnh hưởng đến sự sinh

trưởng của Spirulina. Việc thu hoạch tảo cũng gặp khá nhiều khó khăn bởi tế bào

Spirulina nhỏ dẫn đến việc lọc thu sinh khối bị hạn chế bởi lượng tảo có thể mất nhiều

trong quá trình lọc.

1.6. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng tảo Spirulina sp.

1.6.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Từ những giá trị dinh dưỡng và sinh học trên, tảo Spirulina đã được WHO và

các Bộ Y tế của nhiều quốc gia trên thế giới công nhận không chỉ là nguồn thực phẩm

sạch mà còn là giải pháp cho phòng và điều trị bệnh của thế kỷ 21. Đáng lưu ý trước

hết là công trình nghiên cứu phòng chống ung thư gây ra bởi tia phóng xạ hạt nhân

cho các nạn nhân của sự cố Nhà máy Điện hạt nhân Chernobul đã thu được kết quả

tốt khi điều trị bằng Spirulina nguyên chất. Khi uống Spirulina, lượng chất phóng xạ

đã được đào thải khỏi đường tiểu của người bị nhiễm xạ rất cao. Kết quả này đã được

biểu dương tại hội nghị quốc tế về tảo năm 1998 ở cộng hòa Czech [8].

Nhờ những tác dụng có lợi cho cơ thể, tảo Spirulina đang chứng minh hiệu

quả vượt trội của nó trong vai trò là một loại thực phẩm chức năng hữu hiệu, cũng

như một loại sản phẩm bổ sung tuyệt vời để tăng cường hoạt chất của các loại thuốc

chữa bệnh. Các yếu tố cấu tạo nên Spirulina gồm 75% là chất hữu cơ và 25% là

khoáng chất. Vì thế tảo chứa các chất căn bản trong việc trị liệu. Các đặc tính trị liệu

của tảo rất nhiều như tái bổ sung nước, muối khoáng và dinh dưỡng cho cơ thể.

1.6.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong nước

Trong những năm 1985 – 1995, đã có những nghiên cứu cấp Nhà nước thuốc

lĩnh vự công nghệ sinh học như nghiên cứu của GS.TS Nguyễn Hữu Thước và các

cộng sự (Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam)

với đề tài “ Công nghiệp nuôi trồng và sử dụng tảo Spirulina”; hay đề tài cấp thành


13


phố của Bác sĩ Nguyễn Thị Kim Hưng (Tp. Hồ Chí Minh) và cộng sự với tiêu đề

“Nghiên cứu sản xuất và sử dụng thức ăn có tảo Spirulina trong dinh dưỡng điều trị”.

Từ nhiều năm nay, Nhà nước đã chú trọng vào việc nuôi trồng và thử nghiệm

vi tảo Spirulina, bước đầu thành công ở một số nơi như Vĩnh Hảo, Đắc Lắc, Đồng

Nai. Từ nguồn nguyên liệu Spirulina đạt chất lượng cao và ổn định, các nhà khoa học

đã sản xuất thành công một số loại thuốc như: Linavina, Lactogil (Xí nghiệp

Mekophar); Cốm bổ, Bột dinh dưỡng Enalac (Trung Tâm Dinh Dưỡng Trẻ Em Thành

Phố Hồ Chí Minh), Gelule Spilina (Lebo, Helvinam, Trường Đại Học Y Dược).

Nhìn chung, lịch sử nghiên cứu và nuôi trồng tảo Spirulina ở nước ta đã thu

được nhiều kết quả ban đầu đáng khích lệ. Tuy nhiên cho đến nay việc nuôi trồng tảo

vẫn mang tính nhỏ lẻ, lạc hậu, không đáp ứng được nhu cầu sử dụng tảo ngày càng

tăng cao. Vì vậy, trước những giá trị về mọi mặt mà tảo Spirulina mang lại, cần phải

tiến hành cải thiện, thúc đẩy ngành công nghiệp nuôi trồng tảo nhằm đáp ứng nhu cầu

trong nước và xuất khẩu. Thí nghiệm này thực hiện nhằm mục đích khảo sát các yếu

tố dinh dưỡng ảnh hưởng lên khả năng tăng trưởng, xác định hàm lượng protein tổng,

các acid amin và khả năng chống oxy hóa của Spirulina sp.

Khóa luận tốt nghiệp Vật liệu và phương pháp

14


CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Chủng Spirulina sp.

Chủng tảo Spirulina được cung cấp bởi Tiến sĩ Trần Ngọc Đức, Phòng Công

nghệ Tảo, Trường Đại học Quốc tế, Đại học Quốc gia TP. HCM. Spirulina được nuôi

cấy trên môi trường Zarrouk, pH = 8,5 - 9,0 [60].

Pha môi trường Zarouk theo bảng 3.1 và chỉnh pH = 8,5, rồi đem đi hấp tiệt

trùng, chú ý không cho muối bicarbonate. Pha stock muối bicarbonate với nồng độ

1M, pH = 8,5 lọc tiệt khuẩn bằng màng lọc sợi thủy tinh, bổ sung vào môi trường đã

tiệt khuẩn vừa đủ 1L.

Bảng 3.1 Thành phần của môi trường Zarrouk [53]

2.2. Các phương pháp phân tích

2.2.1. Quan sát hình thái tế bào Spirulina sp.

Hình thái tế bào Spirulina sp. được quan sát bằng kính hiển vi quang học với độ

phóng đại 400x sau các ngày nuôi cấy.

Hóa chất Lượng (g/L)

NaNO3

K2HPO4

K2SO4

NaCl

MgSO4.7H2O

CaCl2.2H2O

FeSO4.7H2O

EDTA

NaHCO3

Nguyên tố vi lượng

Nước cất vừa đủ

2,5

0,5

1

1

0,2

0,04

0,01

0,08

16,8

1mL

1L

Dung dịch nguyên tố vi lượng: H3BO3: 2,86; MnCl2.4H2O: 1,81;

ZnSO4.4H2O: 0,222; CuSO4.5H2O: 0,079 (g/L).


15


2.2.2. Xác định sinh khối tế bào Spirulina sp.

Lấy 10 mL dịch nuôi cấy tảo lọc qua màng sợi thủy tinh, với đường kính màng

là 47 mm, đường kính lỗ 0,7 µm. Sau đó tảo được rửa với 20 mL nước cất hấp vô

trùng, và sấy khô ở 103°C suốt 6 tiếng hoặc cho đến khi trọng lượng khô không đổi

[A(g)]. Trọng lượng khô này tiếp tục được đốt ở 550oC để tạo tro [B(g)] (khoáng

chất). Sinh khối [C(g)]: C=A-B (g) [87].

2.2.3. Xác định tốc độ tăng trưởng đặc hiệu

Sinh khối tế bào ở hai thời điểm khác nhau trong quá trình tăng trưởng của mẫu

tảo được dùng để tính tốc độ tăng trưởng đặc hiệu (µ: g/L/ngày) trong khoảng thời

gian đó theo công thức [52]:

µ =𝑙𝑛 (𝐵𝑖𝑜2 / 𝐵𝑖𝑜1)

𝑡2 − 𝑡1

Trong đó: Bio1, Bio2: Sinh khối tế bào tại thời điểm 1 và 2

t1, t2: thời điểm 1 và 2

2.2.4. Xác định hàm lượng protein của Spirulina sp. bằng phương pháp Bradford

Pha thuốc thử: cân 10 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 hòa tan trong 50 mL

ethanol 95%. Thêm 100 mL H3PO4 85%, thêm nước cất vừa đủ 1000 mL [17].

Xác định hàm lượng protein tổng:

Lấy 1,0 mL dung dịch tảo ly tâm 10.000 vòng trong 15 phút, loại bỏ dịch,

cắn được rửa nhiều lần với 1 mL nước cất (hấp vô trùng) bằng cách ly tâm 10.000

vòng trong 15 phút. Thêm 1 mL ethanol tuyệt đối vào cắn, trộn đều, đun cách

thủy 5 phút ở nhiệt độ 50 – 600C, sau đó làm nguội bằng nước lạnh đến nhiệt độ

phòng. Ly tâm 5000 vòng trong 5 phút, loại bỏ dịch lấy cắn. Tiếp tục cho 200 µl

nước cất hấp vô trùng, thêm 1 mL thuốc thử trộn đều và ủ 10 phút. Đo quang ở

bước sóng 595 nm [17].

Đường chuẩn protein:

Sử dụng nồng độ protein chuẩn 10 đến 120 µg/mL được pha từ Bovine serum

albumin và xác định nồng độ protein trong mẫu Spirulina sp. bằng phương trình

y = 0,003x + 0,0124; R² = 0,9951.


16


2.2.5. Xác định hàm lượng phenolic tổng

Xác định hàm lượng phenolic tổng [34], [37], [51]:

Lấy 1,0 mL dung dịch tảo ly tâm 10.000 vòng trong 15 phút, loại bỏ dịch, cắn

được rửa nhiều lần với 1mL nước cất (hấp vô trùng) bằng cách ly tâm 10.000

vòng trong 15 phút. Thêm 1mL methanol tuyệt đối vào cắn, trộn đều. Ly tâm

5000 vòng trong 5 phút, bỏ cắn thu được dịch chiết.

Lấy 0,5 mL dịch chiết cho vào eppendorf 2 mL, cho thêm 0,5 mL thuốc thử

Folin-Ciocalteu’s phenol, tiếp tục cho từ từ 0,5 mL dung dịch Na2CO3 10%.

Ủ 90 phút trong tối.

Đo quang ở bước sóng 750 nm.

Đường chuẩn phenolic:

Sử dụng nồng độ acid gallic chuẩn 10 đến 200 mg/L và xác định nồng độ phenolic

tổng trong mẫu Spirulina sp. bằng phương trình: y = 30,263x – 0,0638; R² = 0,9948.

2.2.6. Xác định hàm lượng chất oxy hóa tổng

Pha thuốc thử DPPH: pha dung dịch thuốc thử DPPH với nồng độ 0,004% trong

methanol [79], [86].

Lấy 1,0 mL dung dịch tảo ly tâm 10.000 vòng trong 15 phút, loại bỏ dịch, cắn

được rửa nhiều lần với 1mL nước cất (hấp vô trùng) bằng cách ly tâm 10.000

vòng trong 15 phút. Thêm 1mL ethanol tuyệt đối vào cắn, trộn đều và ủ 4 tiếng

ở 40C. Ly tâm 5000 vòng trong 5 phút, bỏ cắn lấy dịch chiết.

Lấy 0,5 mL dịch chiết cho vào eppendorf 2 mL, cho thêm 1 mL thuốc thử DPPH

trộn đều. Ủ 30 phút trong tối, ở nhiệt độ phòng. Đo quang ở bước sóng 517nm.

Khả năng chống oxy hóa (I%) được tính theo công thức [13], [79], [86]:

I% = 𝐴𝑀ẫ𝑢 𝑡𝑟ắ𝑛𝑔−𝐴𝑀ẫ𝑢 𝑡ℎử

𝐴𝑀ẫ𝑢 𝑡ℎử 𝑥 100

Trong đó:

I%: Tỷ lệ phần trăm ức chế (Percentage inhibition)

A Mẫu trắng: độ hấp thu của mẫu trắng tại bước sóng 517 nm

A Mẫu thử: độ hấp thu của mẫu thử tại bước sóng 517 nm


17


2.2.7. Xác định hàm lượng các acid amin theo hệ thống Pico – Tag

Sau 5 ngày nuôi cấy, tiến hành thu sinh khối Spirulina bằng cách lọc dịch tảo

qua túi lọc nylon monofilament với đường kính lỗ lọc là 25 µm. Sau đó rửa tảo nhiều

lần với nước cất hấp vô trùng, lấy tảo trải đều trên giấy bạc và sấy khô ở nhiệt độ

600C. Tảo sau khi sấy khô được bảo quản trong falcon có quấn giấy bạc, để vào tủ

đông -200C.

Mẫu Spirulina đã sấy khô sẽ được gửi đến Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh

học và Môi trường (Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh) phân tích các thành

phần và hàm lượng các acid amin thiết yếu bằng phương pháp Pico – Tag.

2.3. Phương pháp thiết kế thí nghiệm

2.3.1. Thí nghiệm 1: Lựa chọn điều kiện ánh sáng nuôi cấy thích hợp

Chất lượng ánh sáng có ảnh hưởng đến sự tăng trưởng, quang hợp và chuyển

hóa carbon ở hai loài tảo biển, Cyclotella nana (Hustedt) và Dunaliella tertiolecta

(Butcher) [27]. Spirulina là một trong những loài sinh vật tự dưỡng bằng cách quang

hợp, chính vì thế ánh sáng ảnh hưởng đến sự phát triển của tảo [81]. Trong tảo

Spirulina có chứa diệp lục tố a và b – sắc tố hấp thu ánh sáng và nhạy với bước sóng

ánh sáng xanh dương và ánh sáng đỏ. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, tảo lam phát

triển tốt hơn ở ánh sáng xanh dương và ánh sáng đỏ. Bên cạnh đó, cường độ ánh sáng

và chu kỳ sáng tối cũng như yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và sinh

khối của tảo [73].

Spirulina sp. Mỹ đạt giai đoạn tăng trưởng sau khoảng 5 ngày nuôi cấy trên môi

trường Zarrouk; pH = 8,5 – 9,0 [60]; được chiếu sáng liên tục với cường độ ánh sáng

30 µmol/phonton/m2/s, nhiệt độ 25 ± 20C sử dụng để bố trí thí nghiệm (hình 2.1).

Thí nghiệm sử dụng bình tam giác 250 mL bao gồm: dịch tảo trong đạt giai đoạn

tăng trưởng và vừa đủ 100 mL môi trường Zarrouk, chiếu sáng ở cường độ ánh sáng

30 µmol photon/m2/s liên tục với ánh sáng trắng, đỏ (600-700 nm), xanh dương (400-

500 nm) bằng hệ thống đèn LED. Sau 5 ngày nuôi cấy, tiến hành phân tích các nghiệm

thức (hình 2.2):

Hình thái tế bào.


18


Sinh khối tế bào.

Tốc độ tăng trưởng đặc hiệu.

Hàm lượng protein tổng.

2.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố nitơ lên sự tăng trưởng và

hàm lượng protein ở Spirulina sp.

Trong nuôi cấy tảo nói chung, nguồn tảo giống, chất dinh dưỡng và điều kiện

môi trường nuôi cấy là những yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến sự tăng trưởng và thành

phần sinh hóa của tảo. Các thành phần dinh dưỡng đa lượng (carbon, nitơ, photpho)

và vi lượng ảnh hưởng rất lớn đến tăng trưởng của tảo, đặc biệt trong điều kiện nuôi

với mật độ cao [26], [67]. Tất cả các quá trình sinh tổng hợp hình thành sản phẩm,

Hình 2.1 Spirulina sp. nuôi cấy trong môi trường Zarrouk

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nuôi cấy Spirulina trong các điều kiện

ánh sáng khác nhau


19


tái tạo và bảo trì tế bào rất cần yếu tố nitơ. Đặc biệt, quá trình sản xuất các sản phẩm

chính (protein và carbohydrate) và các chất chuyển hóa của vi sinh vật bị ảnh hưởng

rất lớn bởi điều kiện tăng trưởng [10].

Spirulina sp. Mỹ đạt giai đoạn tăng trưởng sau khoảng 5 ngày nuôi cấy trên

môi trường Zarrouk; pH = 8,5 – 9,5 [60]; được chiếu sáng liên tục với cường độ ánh

sáng 30 µmol/phonton/m2/s, nhiệt độ 25 ± 20C được sử dụng để bố trí thí nghiệm

(hình 2.1).

Thí nghiệm thực trên các bình nhựa 5L bao gồm: dịch tảo đạt giai đoạn tăng

trưởng và thể tích môi trường Zarruok vừa đủ 3,5L; sục khí liên tục và được chiếu

sáng ở cường độ 100 µmol photon/m2/s (với chu kỳ sáng: tối, 12 giờ: 12 giờ) trong

điều kiện ánh sáng cho hiệu suất tối ưu với 3 nồng độ NaNO3 như sau: 1,25 g/L; 2,5

g/L; 5,0 g/L. Sau mỗi 2 ngày nuôi cấy, tiến hành phân tích các nghiệm thức (hình 2.3

và 2.4):




Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nuôi cấy Spirulina ở các điều kiện

NaNO3 khác nhau


20


2.3.3. Thí nghiệm 3: Nuôi cấy, thu sinh khối và phân tích thành phần acid amin

Spirulina sp. Mỹ và Spirulina sp. Nhật đạt giai đoạn tăng trưởng sau khoảng 5

ngày nuôi cấy trên môi trường Zarrouk; pH = 8,5 – 9,5 [60]; được chiếu sáng liên tục

với cường độ ánh sáng 30 µmol/phonton/m2/s, nhiệt độ 25 ± 20C được sử dụng để bố

trí thí nghiệm (hình 2.1).

Thí nghiệm thực trên các bình nhựa 5L bao gồm: dịch tảo đạt giai đoạn tăng

trưởng và vừa đủ 3,5L môi trường Zarrouk, sục khí liên tục và được chiếu sáng ở

cường độ 100 µmol photon/m2/s (với chu kỳ sáng: tối, 12 giờ: 12 giờ) trong điều kiện

ánh sáng và nồng độ NaNO3 cho hiệu suất tối ưu ở thí nghiệm 1 và 2 (hình 2.5). Vào

ngày nuôi cấy thứ 3,4,5 phân tích các nghiệm thức và các nghiệm thức lặp lại 3 lần:

Hình thái tế bào.




Hàm lượng phenolic tổng.

Hàm lượng chất chống oxi hóa tổng.

Sau 5 ngày nuôi cấy tiến hành thu sinh khối tảo. Lọc dịch tảo qua túi lọc nylon

monofilament với đường kính lỗ lọc là 25 µm. Sau đó rửa tảo nhiều lần với nước cất

hấp vô trùng, lấy tảo trải đều trên giấy bạc và sấy khô ở nhiệt độ 600C. Tảo sau khi

sấy khô được bảo quản trong falcon có quấn giấy bạc, để vào tủ đông -200C.

Hình 2.4 Các bình chứa dịch tảo trong hệ thống thí nghiệm


21


Mẫu Spirulina đã sấy khô sẽ được gửi đến Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh

học và Môi trường (Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh) phân tích các thành

phần và hàm lượng các acid amin thiết yếu bằng phương pháp Pico – Tag.

2.4. Xử lý số liệu

Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Số liệu được xử lý bằng Microsoft office

Excel 2013 và phân tích one way ANOVA bằng phần mềm SPSS 20.0 với sai số ý

nghĩa p < 0,05. Tất cả các số liệu trong thí nghiệm được trình bày dưới dạng: Trung

bình (Mean) ± Sai số chuẩn (SE).

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nuôi cấy các chủng Spirulina sp. ở điều kiện

NaNO3 5 g/L

Khóa luận tốt nghiệp Kết quả và biện luận

22


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1. Kết quả

3.1.1. Lựa chọn điều kiện ánh sáng nuôi cấy thích hợp

3.1.1.1. Hình thái tế bào Spirulina sp.

Kết quả thí nghiệm cho thấy chất lượng ánh sáng ảnh hưởng rõ rệt lên hình thái,

màu sắc và số lượng tế bào. Cụ thể sau 5 ngày nuôi cây, Spirulina ở cả 3 điều kiện

ánh sáng đều giãn xoắn và số lượng tế bào bắt đầu tăng. Ở điều kiện ánh sáng đỏ và

ánh sáng trắng từ ngày nuôi cấy thứ 5 trở đi tế bào chuyển từ màu xanh qua màu vàng

cam; số lượng tế bào giảm sau 10 ngày nuôi cấy. Riêng ánh sáng xanh dương, màu

sắc tế bào hầu như không thay đổi vẫn giữ màu xanh và số lượng tế bào duy trì sau

15 ngày nuôi cấy (hình 3.1).

Hình 3.1 Hình thái tế bào Spirulina sp. trong các điều kiện nuôi cấy ánh sáng đỏ

(I), ánh sáng xanh dương (II) và ánh sáng trắng (III)


23


Dịch nuôi cấy Spirulina sp. chuyển sang màu vàng cam sau 5 ngày nuôi cấy ở

điều kiện ánh sáng đỏ và ánh sáng trắng. Dưới điều kiện ánh xanh dương, dịch tế bào

có màu xanh (hình 3.2).

3.1.1.2. Sự tăng trưởng của Spirulina sp.

Sự tăng trưởng của Spirulina sp. cho thấy ở hình 4.3, ở điều kiện ánh sáng đỏ

và ánh sáng trắng tảo tăng trưởng mạnh với lượng sinh khối tích lũy cực đại sau 5

ngày nuôi cấy. Trong khi đó trong điều kiện ánh sáng xanh dương tảo đạt sinh khối

cực đại vào ngày 10 và có sự tăng trưởng ổn định sau đó. Khối lượng sinh khối cực

đại ở ánh sáng đỏ (0,84g/L) cao hơn 1,4 lần so với điều kiện ánh sáng trắng và gấp 3

lần so với điều kiện ánh sáng xanh dương (0,57 g/L và 0,28g/L) p<0,05 (bảng 3.1).

Hình 3.2 Màu sắc dịch nuôi ngày thứ 10 trong điều kiện nuôi cấy ánh sáng đỏ

(a), ánh sáng xanh dương (b) và ánh sáng trắng (c)

0,84

0,600,57

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

0 5 10 15 20

Sin

h k

hối

(g/L

)

Ngày

Ánh sáng đỏ

Ánh sáng xanh dương

Ánh sáng trắng

Hình 3.3 Sinh khối của Spirulina sp. trong các điều kiện ánh sáng khác nhau


24


Tốc độ tăng trưởng của Spirulina sp. trong điều kiện nuôi cấy ánh sáng đỏ cao

hơn so với các điều kiện ánh sáng khác (p < 0,05). Cụ thể, ở điều kiện ánh sáng đỏ,

tốc độ tăng trưởng đạt 0,32 (g/L/ngày) cao gấp 2,5 lần tốc độ tăng trưởng đặc hiệu ở

điều kiện ánh sáng xanh dương (0,13 g/L/ngày) và gấp 1,3 lần ở điều kiện ánh sáng

trắng (0,25 g/L/ngày). Qua các kết quả trên, ta thấy chất lượng ánh sáng có ảnh hưởng

lên sự tích lũy sinh khối và tốc độ tăng trưởng của tảo Spirulina sp. (hình 3.4).

Các số trung bình trong hàng với các mẫu tự số khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05

Các số trung bình trong cột với các mẫu tự chữ khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05

Điều kiện

ánh sáng

Khối lượng sinh khối khô (g/L) của Spirulina sp.

Ngày 0 Ngày 5 Ngày 10 Ngày 15 Ngày 20

Đỏ 0,16667 ±

0,018561a

0,84000 ±

0,011553c

0,57000 ±

0,1457223a

0,38667 ±

0,0352812a

0,36000 ±

0,0550812a

Xanh

dương

0,16667 ±

0,018561a

0,28000 ±

0,011552a

0,60333 ±

0,017644a

0,50667 ±

0,029633a

0,66000 ±

0,011554b

Trắng 0,16667 ±

0,018561a

0,57000 ±

0,011552b

0,47667 ±

0,056082a

0,48000 ±

0,032152a

0,45000 ±

0,017322a

Bảng 3.1 Khối lượng sinh khối khô Spirulina theo từng loại ánh sáng

Hình 3.4 Tốc độ tăng trưởng đặc hiệu của Spirulina sp. trong các điều kiện

ánh sáng khác nhau

0,32

0,13

0,25

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

Ánh sáng đỏ Ánh sáng xanh

dương

Ánh sáng trắngTốc

độ t

ăng t

rưở

ng đ

ặc h

iệu

(g/L

/ngày

)

Điều kiện ánh sáng


25


3.1.1.3. Hàm lượng protein của Spirulina sp.

Spirulina sp. tích lũy hàm lượng protein (g/L) cực đại sau 10 ngày nuôi cấy sau

đó giảm dần ở điều kiện ánh sáng xanh dương và ánh sáng trắng ( 0,103 g/L và 0,112

g/L). Ở điều kiện ánh sáng đỏ, hàm lượng protein được tích lũy cực đại sau 5 ngày

nuôi cấy (0,109 g/L) và bắt đầu giảm vào ngày thứ 10 sau khi nuôi cấy. Tuy nhiên,

không có sự khác biệt về hàm lượng protein tổng (g/L) được tích lũy cực đại khi nuôi

cấy Spirulina ở 3 điều kiện ánh sáng trên; p>0,05 (hình 3.5.a, bảng 3.2).

0,109

0,103

0,112

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0 5 10 15 20

Hàm

lư

ợng p

rote

in(g

/L)

Ngày

Ánh sáng đỏ


Ánh sáng trắng

a

15,9

40,7

17,4

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

45,0

50,0

0 5 10 15 20

Hàm

lư

ợng p

rote

in

(% /

sinh k

hối

khô)

Ngày

Ánh sáng đỏ


Ánh sáng trắng

b

Hình 3.5 Hàm lượng protein tổng (g/l) (a) và phần trăm (%) (b) của

Spirulina trong các điều kiện ánh sáng khác nhau


26


Mặc khác, quan sát hình 3.5.b cho thấy khả năng tích lũy protein bị ảnh hưởng

bởi các chất lượng ánh sáng khác nhau, tỷ lệ phần trăm protein tổng so với khối lượng

sinh khối khô của Spirulina sp. trong các điều kiện ánh sáng khác nhau đạt cực đại

sau 5 ngày nuôi cấy và giảm dần sau đó. Trong đó, Spirulina tích lũy protein cao

trong điều kiện ánh sáng xanh dương khoảng 40,66% sinh khối khô, cao hơn gấp đôi

trong ánh sáng trắng và đỏ (17,42 và 15,91% ) (p<0,05) (hình 3.5.b, bảng 3.3).





Điều kiện

ánh sáng

Nồng độ protein(g/l) của Spirulina sp.


Đỏ 0,00253 ±

0,000691a

0,10853 ±

0,021412a

0,09198 ±

0,0119612a

0,04298 ±

0,0128312a

0,02487 ±

0,0050112a

Xanh

dương

0,00253 ±

0,000691a

0,09787 ±

0,0063423a

0,10364 ±

0,007063a

0,08664 ±

0,0134523a

0,05287 ±

0,004162b

Trắng 0,00253 ±

0,000691a

0,10964 ±

0,018582a

0.11242 ±

0,011042a

0,07864 ±

0,019682a

0,03909 ±

0,007221ab

Bảng 3.2 Nồng độ protein tổng (g/L) theo từng loại ánh sáng

Bảng 3.3 Hàm lượng protein (%) tổng theo từng loại ánh sáng

Điều kiện

ánh sáng

Hàm lượng protein(%) của Spirulina sp.


Đỏ 2,3899 ±

0,65711a

15,9152 ±

2,72243a

12,0896 ±

1,652323a

7,3112 ±

1,949812a

6,7636 ±

1,444912a

Xanh

dương

2,3899 ±

0,65711a

40,6618 ±

3,36544b

22,7506 ±

2,5002 3b

13,0606 ±

2,212423a

7,3397 ±

0,458112a

Trắng 2,3899 ±

0,65711a

17,4220 ±

2,9817 4a

15,1703 ±

1,0966 23ab

13,0642 ±

2,7835 1a

8,3539 ±

0,894112a


27


Các kết quả về hình thái tế bào, sinh khối, protein cho thấy Spirulina sp. trong

điều kiện ánh sáng đỏ có tốc độ tăng trưởng sau 5 ngày nuôi cấy, tuy nhiên hàm lượng

protein được tích lũy khá thấp. Trong khi đó ở điều kiện ánh sáng trắng và xanh dương

tốc độ tăng trưởng thấp hơn nhưng hàm lượng protein đạt cao nhất sau 5 ngày nuôi

cấy (hình 3.3, 3.4 và 3.5). Như vậy dưới điều kiện ánh sáng đỏ Spirulina sp. tăng hiệu

quả cố định CO2 tốt hơn so với các điều kiện ánh sáng còn lại sau 5 ngày nuôi cấy.

Ngược lại điều kiện ánh sáng trắng và xanh dương kích thích tế bào Spirulina sp. tổng

hợp protein cao và hiệu quả cố định CO2 thấp hơn sau 5 ngày nuôi cấy.

Từ thí nghiệm trên, ta thấy điều kiện ánh sáng xanh dương Spirulina sp. có hiệu

suất tối ưu về hàm lượng protein. Tuy nhiên, để áp dụng với quy mô công nghiệp ánh

sáng trắng phù hợp hơn về sự tiện dụng và chi phí. Vì thế, ánh sáng trắng là điều kiện

nuôi cấy Spirulina cho thí nghiệm 2. Thí nghiệm này, nhằm mục đích xác định lượng

nitơ cần thiết mang lại hiệu xuất tối ưu về hàm lượng protein.


Spirulina sp.

3.1.2.1. Sự tăng trưởng của Spirulina sp.

Kết quả thí nghiệm cho thấy, nồng độ NaNO3 trong môi trường nuôi cấy có ảnh

hưởng lên sự tăng trưởng của quần thể tảo Spirulina sp. Tảo được nuôi cấy trong môi

trường có nồng độ NaNO3 cao (5,0 g/L) cho sinh khối đạt (0,60 g/L) sau 13 ngày nuôi

cấy cao hơn so với khối lượng sinh khối được tạo ra khi nuôi cấy trong điều kiện

nồng độ NaNO3 thấp (1,25 g/L và 2,5 g/L) (0,50 g/L và 0,51 g/L). Sinh khối của

Spirulina trong các điều kiện nuôi cấy có nồng độ NaNO3 khác nhau tại các ngày

nuôi cấy thứ 9, 11, 13 hầu như bằng nhau vì thế có thể tiến hành thu sinh khối vào

các thời điểm này (hình 3.6, bảng 3.4).

Nồng độ nitơ cũng ảnh hưởng lên tốc độ tăng trưởng của Spirulina sp., tốc độ

tăng trưởng đặc hiệu đạt cao nhất (0,21 g/L/ngày) khi nuôi cấy ở điều kiện môi trường

có nồng độ NaNO3 so với 2 điều kiện còn lại có nồng độ NaNO3 thấp hơn (0,20

g/L/ngày và 0,19 g/L/ngày) (hình 3.7).


28


Tuy nhiên, không có sự khác biệt ý nghĩa về sinh khối và tốc độ tăng trưởng đặc

hiệu của Spirulina sp. trong các điều kiện nuôi cấy với những nồng độ NaNO3 khác

nhau (p > 0,05) nhưng ta có thể nhận thấy một xu hướng chung là, khi tăng nồng độ

NaNO3, sinh khối của tảo có khuynh hướng tăng dần (hình 3.6 và 3.7, bảng 3.4.).

Hình 3.6 Sinh khối của Spirulina sp. trong các nồng độ NaNO3 khác nhau

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Sin

h k

hối

(g/L

)

Ngày

1,25 g/L

2,5 g/L

5 g/L

Hình 3.7 Tốc độ tăng trưởng đặc hiệu của Spirulina sp. trong các nồng độ

NaNO3 khác nhau

0,190,20

0,21

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

0,22

0,24

0,26

1,25 g/l 2,5 g/l 5 g/l

Tốc

độ t

ăng t

rưở

ng đ

ặc h

iệu

(g/L

/ngày

)

Nồng độ NaNO3


29


Các số trung bình trong hàng với các mẫu tự chữ khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05.

Các số trung bình trong cột với các mẫu tự số khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05.

3.1.2.2. Hàm lượng protein của Spirulina trong các điều kiện nồng độ NaNO3

khác nhau

Sự tích lũy hàm lượng protein (g/L) của Spirulina ở trong 3 điều kiện nồng độ

NaNO3 khác nhau có xu hướng tăng dần. Sau 13 ngày nuôi cấy, nồng độ protein ở 3

điều kiện NaNO3 1,25 g/L; 2,5 g/L và 5,0 g/L lần lượt là: 0,14 g/L; 0,11 g/L và 0,13

g/L, p>0,05 (hình 3.8.a, bảng 3.5).

Ở nồng độ NaNO3 cao nhất (5 g/L) hàm lượng protein đạt được là lớn nhất

(34,41%) sau 6 ngày nuôi cấy, hai nồng độ NaNO3 thấp hơn (1,25 g/L và 2,5 g/L) có

hàm lượng protein thấp hơn (33,02% sau 11 ngày nuôi cấy và 33, 45% sau 4 ngày

Bảng 3.4. Khối lượng sinh khối khô Spirulina theo từng

nồng độ NaNO3 khác nhau K

hối

lượ

ng

sin

h k

hó

i k

hô

(g/L

) củ

a S

pir

uli

na

sp

.

Điều kiện về nồng độ NaNO3 (g/L)

1,25 2,50 5,0

Ngày 0 0,04000 ±

0,010001a

0,04000 ±

0,010001a

0,04000 ±

0,010001a

Ngày 2 0,06333 ±

0,018561a

0,07667 ±

0,018561a

0,08333 ±

0,018561a

Ngày 4 0,14667 ±

0,024041a

0,13667 ±

0,014531a

0,17667 ±

0,0033312a

Ngày 6 0,32333 ±

0,032832a

0,30333 ±

0,037562a

0,29667 ±

0,0437223a

Ngày 9 0,38000 ±

0,0152823a

0,38000 ±

0,0208223a

0,49000 ±

0,0404134a

Ngày 11 0,40667 ±

0,0466723a

0,40333 ±

0,0290623a

0,50667 ±

0,053644a

Ngày 13 0,50000 ±

0,066583a

0,51000 ±

0,058593a

0,60000 ±

0,072344a


30


nuôi cấy) (hình 3.8.b, bảng 3.5). Tuy không có sự khác biệt ý nghĩa về hàm lượng

protein giữa các nồng độ NaNO3 khác nhau (p > 0,05) nhưng kết quả phân tích hàm

lượng protein của Spirulina nuôi ở các nồng độ nitơ khác nhau cho thấy, hàm lượng

protein phụ thuộc chặt chẽ vào các nồng độ nitơ có trong môi trường nuôi cấy với xu

hướng chung là sự gia tăng các nồng độ NaNO3 tỷ lệ thuận với hàm lượng protein.

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

0 2 4 6 9 11 13

Hàm

lư

ợng p

rote

in (

g/L

)

Ngày

1,25 g/L

2,5 g/L

5 g/L

a

33,0

33,534,4

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

45,0

0 2 4 6 9 11 13

Hàm

lư

ợng p

rote

in

(%/s

inh k

hối

khô)

Ngày

1,25 g/L

2,5 g/L

5 g/L

Hình 3.8 Hàm lượng protein tổng (g/L) (a) và phần trăm protein (%) (b) của

Spirulina trong các nồng độ NaNO3 khác nhau

b


31




Tóm lại, ta có thể thấy nồng độ NaNO3 trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng

khá rõ lên sự tăng trưởng và tích lũy protein của Spirulina. Khi tăng nồng độ NaNO3

trong môi trường Zarrouk từ 1,25 g/L đến 5 g/L thì sinh khối, tốc độ tăng trưởng đặc

hiệu và hàm lượng protein tổng của Spirulina tăng theo. Vì thế, ở thí nghiệm 3 sử

dụng nồng độ NaNO3 5 g/L để nuôi cấy 2 chủng Spirulina sp. Mỹ và Nhật tiến hành

xác định hàm lượng protein tổng, khả chống oxy hóa, thu sinh khối và định lượng các

acid amin thiết yếu sau 5 ngày nuôi cấy.

Bảng 3.5 Khả năng tích lũy protein theo từng nồng độ NaNO3 khác nhau

Điều kiện nồng độ NaNO3

1,25 (g/L) 2,50 (g/L) 5,0 (g/L)

Ngày

Protein/

thể tích

(g/L)

Protein/

sinh khối

(%)

Protein/

thể tích

(g/L)

Protein/

sinh khối

(%)

Protein/

thể tích

(g/L)

Protein/

sinh khối

(%)

0 0,00498 ±

0,000511a

14,60000 ±

4,417191a

0,00498 ±

0,000511a

14,60000 ±

4,417191a

0,00498 ±

0,000511a

14,60000 ±

4,417191a

2 0,01742 ±

0,000511a

22,85450 ±

1,5689812a

0,02342 ±

0,0032812a

28,20423 ±

3,4589512a

0,02109 ±

0,000881a

27,53704 ±

0,7988812a

4 0,03076 ±

0,003601a

22,83879 ±

5,8368012a

0,04464 ±

0,0015323ab

33,45376 ±

3,770792a

0,04742 ±

0,004242b

26,91552 ±

2,7240312a

6 0,07331 ±

0,005752a

23.59100 ±

4,5425012a

0,06909 ±

0,0016634a

23,45816 ±

2,8819212a

0,09709 ±

0,002703b

34,41058 ±

5,813392a

9 0,09953 ±

0,000592a

26,28715 ±

1,1723012a

0,09687 ±

0,0005945a

25,66152 ±

1,5654512a

0,10353 ±

0,007963a

21,35815 ±

2,1608312a

11 0,13398 ±

0,014153b

33,02183 ±

0,736822b

0,10287 ±

0,010705a

25,62498 ±

2,5344212ab

0,11353 ±

0,0041634ab

22,94755 ±

2,6735912a

13 0,14342 ±

0,009793a

29,33401 ±

2,9193512a

0,11220 ±

0,010525a

22,72727 ±

3,5612912a

0,13320 ±

0,003044a

22,90335 ±

3,0400412b


32


3.1.3. Nuôi cấy, thu sinh khối và phân tích thành phần acid amin

3.1.3.1. Hình thái của các chủng Spirulina sp.

Màu sắc và kích thước tế bào của cả 2 chủng Spirulina không thay đổi, vẫn

giữ màu xanh từ ngày nuôi cấy đầu tiên đến ngày thứ 5. Mức độ xoắn của các sợi ở

cả 2 chủng hầu như không thay đổi trong 5 ngày nuôi cấy (hình 3.9).

Dịch nuôi cấy của 2 chủng Spirulina có màu xanh sau 5 ngày nuôi cấy (hình

3.10). Ở điều kiện môi trường có nồng độ NaNO3 5 g/L, cả 2 chủng Spirulina sp. đều

duy trì màu sắc và hình thái tế bào.

Spirulina sp. Mỹ Spirulina sp. Nhật

Ng

ày

1

Ng

ày

2

Ng

ày

3

Ng

ày

4

Ng

ày

5

Hình 3.9 Hình thái của 2 chủng Spirulina sp. Mỹ và Nhật


33


3.1.3.2. Sự tăng trưởng của các Spirulina sp.

Sinh khối của 2 chủng Spirulina sp. tăng dần từ ngày nuôi cấy thứ 3 đến ngày

nuôi cấy thứ 5 và gần như bằng nhau. Chủng Spirulina sp. Nhật cho sinh khối đạt

0,207 g/L và tốc độ tăng trưởng đặc hiệu đạt 0,33 g/L/ngày; chủng Spirulina sp. Mỹ

cho sinh khối 0,183 g/L và tốc độ tăng trưởng đặc hiệu đạt 0,32 g/L/ngày. Tuy không

có sự khác biệt về sinh khối cũng như tốc độ tăng trưởng nhưng kết quả thí nghiệm

cho thấy, cả 2 chủng đểu tăng trưởng tốt trong điều kiện nồng độ NaNO3 5,0 g/L (p

> 0,05) (hình 3.11, bảng 3.6).

Hình 3.10 Màu sắc dịch nuôi cấy ngày thứ 5 trong môi trường Zarrouk chứa

NaNO3 5,0 g/L của 2 chủng Spirulina sp. Nhật (a) và Sprulina sp. Mỹ (b)

Hình 3.11 Sinh khối của 2 chủng Spirulina sp. Mỹ và Nhật

0,1070,117

0,207

0,100

0,127

0,183

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

3 4 5

Sin

h k

hối

(g/l

)

Ngày

Spirulina sp. Nhật

Spirulina sp. Mỹ

b a


34


Các số trung bình trong cột với các mẫu tự chữ khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05.

3.1.3.3. Hàm lượng protein tổng và thành phần acid amin của các chủng

Spirulina

Hàm lượng protein tổng

Hàm lượng protein tổng của cả 2 chủng có nồng độ cao tăng dần cho đến ngày

nuôi thứ 5. Ở chủng Spirulina sp. Mỹ cho hàm lượng protein tổng đạt 0,068 g/L và

37,63% so với sinh khối khô, chủng Spirulina sp. Nhật đạt 0,056 g/L và 27,36% sau

5 ngày nuôi cấy (hình 3.12, bảng 3.7) và kết quả này gần như tương so với thí nghiệm

thứ 2. Điều này cho thấy, cả 2 chủng có thể tích lũy protein cao ở môi trường có nồng

độ NaNO3 5,0 g/L.

Bảng 3.6 Khối lượng sinh khối khô của 2 chủng

Khối lượng sinh

khối khô (g/l) Spirulina sp. Nhật Spirulina sp. Mỹ

Ngày 3 0,10667 ± 0,01155a 0,10000 ± 0,02517a

Ngày 4 0,11667 ± 0,00882a 0,12667 ± 0,00882a

Ngày 5 0,20667 ± 0,00333b 0,18333 ± 0,00000b

0,056

0,068

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

3 4 5

Hàm

lư

ợng p

rote

in (

g/L

)

Ngày


Spirulina sp. Mỹ

Hình 3.12 Hàm lượng protein tổng (g/L) của 2 chủng Spirulina sp. ở

nồng độ NaNO3 5,0 g/L


35



Bảng 3.7 Hàm lượng protein tổng của các chủng Spirulina sp.

Hàm lượng

protein tổng

Spirulina sp. Nhật Spirulina sp. Mỹ

g/L % /sinh khối g/L %/sinh khối

Ngày 3 0,01709 ±

0,00161a

16,17683 ±

1,38535a

0,02431 ±

0,00116a

26,67196 ±

5,67247a

Ngày 4 0,02898 ±

0,00147a

24,89394 ±

1,54978ab

0,03676 ±

0,00404a

29,70774 ±

5,08785a

Ngày 5 0,05576 ±

0,00676b

27,36040 ±

3,151152b

0,06787 ±

0,01100b

37,62956 ±

7,67100a

27,36

37,63

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

3 4 5

Hàm

lư

ợn

g p

rote

in

(%/s

inh k

hối

khô)

Ngày


Spirulina sp. Mỹ

Hình 3.13 Hàm lượng phần trăm protein tổng của 2 chủng Spirulina sp. ở



36


Thành phần acid amin của các chủng Spirulina sp.

Kết quả cho thấy hai chủng Spirulina sp. Mỹ và Nhật được nuôi cấy trong môi

trường Zarrouk có sự đa dạng về thành phần acid amin gồm acid amin thiết yếu, bán

thiết yếu và không thiết yếu. Ở chủng Spirulina sp. Nhật có hàm lượng các acid amin

(%) cao hơn so với chủng Spirulina sp. Mỹ. Ở cả 2 chủng Spirulina sp., hàm lượng

của 2 acid amin: L – Alanine và L – Proline cao nhất (khoảng từ 9,95% đến 15,16%)

(bảng 4.8). Hai acid min này là một trong những loại acid amin không thiết yếu. L –

Alanine có vai trò hỗ trợ quá trình chuyển hóa glucose, phát triển cơ bắp, điều tiết

glycogen và được sử dụng như là nguồn năng lượng khi glycogen bị cạn kiệt chính.

Vì thế L – Alanine thường được tìm thấy trong hầu hết các loại đồ uống trong lĩnh

vực thể thao [31]. L - Proline được cơ thể tổng hợp bởi sự phân hủy của L – Glutamate

và một số acid amin khác. Nó có vai trò sửa chữa mô, hình thành collagen, phòng

ngừa xơ cứng động mạch và duy trì huyết áp [24], [84].

Nhóm acid amin chiếm hàm lượng cao thứ 2 là: L – Isoleucine, L – Leucine, L

– Lysine và L – Phenylalanine (thuộc nhóm acid amin thiết yếu) chiếm hàm lượng

khoảng từ 7,10% đến 10,29% (bảng 4.8). Các acid amin thiết yếu là những loại acid

amin không được tổng hợp bởi cơ thể con người mà được cung cấp bởi thức ăn. L –

Isoleucine và L – Leucine có vai trò rất quan trọng trong qua trình phục hồi sức khỏe

và điều hòa lượng glucose trong máu. L – Phenylaline có chức năng bồi bổ não, tăng

cường trí nhớ và tác động trực tiếp đến mọi hoạt động của não bộ [42]. Cuối cùng là

những acid amin còn lại thuộc nhóm thiết yếu, bán thiết yếu và không thiết chứa hàm

lượng thấp hơn (bảng 3.8).

Vì vậy, hàm lượng nitơ trong nuôi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rõ rệt lên hàm

lượng protein và thành phần acid amin của các chủng Spirulina sp. khác nhau. Trong

đó môi trường nuôi cấy Zarrouk bổ sung NaNO3 5 g/L cả 2 chủng Spirulina sp. Mỹ

và Nhật có hàm lượng protein và thành phần acid amin cao.


37


3.1.3.4. Khả năng chống oxy hóa của các chủng Spirulina sp.

Hàm lượng phenolic tổng của Spirulina sp.

Nồng độ NaNO3 có ảnh hưởng đến khả năng tích lũy phenolic của cả 2 chủng

Spirulina sp. Hình 3.14 cho thấy, khi nuôi cấy cả 2 chủng Spirulina ở môi trường

Zarouk có nồng độ NaNO3 5,0 g/L thì lượng phenolic được tích lũy khá cao. Chủng

Bảng 3.8 Hàm lượng thành phần acid amin của Spirulina sp.

STT Các acid amin Spirulina sp. Mỹ Spirulina sp. Nhật

mg/g % protein mg/g % protein

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

Thiết yếu

L – Isoleucine

L – Leucine

L – Lysine

L – Methionine

L – Phenylalanine

L – Threonine

L – Valine

Bán thiết yếu

L – Arginine

L – Histidine

Không thiết yếu

L – Aspartic acid

L – Alanine

L – Cystine

L – Glutamic acid

Glycine

L – Proline

L – Serine

L – Tyrosine

27,35

27,48

22,40

8,32

26,40

16,93

7,85

4,17

16,70

18,25

38,76

12,87

13,25

12,82

36,97

17,95

24,52

7,36

7,40

6,03

2,24

7,10

4,56

2,11

1,12

4,49

4,91

10,43

3,46

3,57

3,45

9,95

4,83

6,60

27,70

27,84

25,44

9,48

26,73

17,78

8,95

8,14

21,11

21,29

42,98

15,48

15,45

15,44

41,00

21,61

27,96

10,24

10,29

9,40

3,50

9,88

6,57

3,31

3,01

7,80

7,87

15,89

5,72

5,71

5,71

15,16

7,99

10,34


38


Spirulina sp. Mỹ hàm lượng phần trăm phenolic cao sau 3 ngày nuôi cấy (2,79%) và

sau đó giảm dần, chủng Spirulina sp. Nhật cao sau 4 ngày nuôi cấy (2,68%) và cũng

giảm dần (hình 3.14, bảng 3.9).

Kết quả này cao hơn gần 4 lần so với thí nghiệm của Abd El-Baky và cộng sự

(2009) khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ NaNO3 và phenylalanine lên hàm lượng

phenolic và flavonoid của Spirulina maxima. Trong thí nghiệm này, Spirulina được

nuôi cấy trong môi trường Zarrouk với lượng NaNO3 lầm lượt 2,5 g/L; 3,125 g/L;

3,777 g/L cho kết quả phenolic tương ứng 0,45%; 0,52%; 0,65% [11], thấp hơn rất

nhiều so với khi nuôi ở nồng độ NaNO3 5,0 g/L.

0,000

0,001

0,002

0,003

0,004

0,005

3 4 5

Hàm

lư

ợng p

hen

oli

c tổ

ng

(g/L

)

Ngày


Spirulina sp. Mỹ

a

2,68

2,79

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

3 4 5

Hàm

lư

ợng p

hen

oli

c tổ

ng

(%/

sinh k

hối

khô)

Ngày


Spirulina sp. Mỹ

b

Hình 3.14 Hàm lượng phenolic tổng (g/L) (a) và phần trăm phenolic (%) (b)

của 2 chủng Spirulina sp. ở nồng độ NaNO3 5,0 g/L


39



Hàm lượng chất chống oxy hóa tổng

Qua kết quả ở hình 3.15, cho thấy Spirulina sp. có khả năng chống oxy hóa. Cụ

thể, đối với Spirulina sp. Nhật có hàm lượng chất chống oxy hóa tổng cao sau 4 ngày

nuôi cấy (11,04 %), Spirulina sp. Mỹ sau 3 ngày nuôi cấy (11,13 %).

Hàm lượng phenolic và hoạt tính chống oxy hóa (ức chế triệt tiêu gốc tự do của

DPPH) của Spirulina sp. có mối tương quan với nhau (hình 3.14 và hình 3.15).

Bảng 3.9 Hàm lượng phenolic tổng của 2 chủng

Hàm lượng

phenolic tổng

Spirulina sp. Nhật Spirulina sp. Mỹ

g/L %/sinh khối g/L %/ sinh khối

Ngày 3 0,00262 ±

0,00005a

2,50242 ±

0,22172b

0,00257 ±

0,00009a

2,78729 ±

0,55206 a

Ngày 4 0,00313 ±

0,00008b

2,68327 ±

0,06583b

0,00303 ±

0,00020a

2,42637 ±

0,25404a

Ngày 5 0,00286 ±

0,00020ab

1,41569 ±

0,11495a

0,00317 ±

0,00013a

1,74324 ±

0,17169a

Hình 3.15 Hàm lượng chất chống oxy hóa tổng của 2 chủng Spirulina sp. ở


11,04

7,39

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

3 4 5

Hàm

lư

ợng c

hất

chống

ox

y h

óa

tổng (

I%/m

L)

Ngày


Spirulina sp. Mỹ


40



Bảng 3.10. Hàm lượng chất chống oxy hóa tổng của 2 chủng Spirulina sp.

Khả năng chống oxy hóa

(%I/mL) Spirulina sp. Nhật Spirulina sp. Mỹ

Ngày 3 1,62539 ± 0,27907a 7,39099 ± 0,85480a

Ngày 4 11,03690 ± 0,65725b 5,69338 ± 0,93708a

Ngày 5 10,18258 ± 1,73549b 5,44062 ± 0,91922a


41


3.2. Biện luận

3.2.1. Lựa chọn điều kiện ánh sáng nuôi cấy thích hợp

Tế bào và dịch nuôi cấy trong điều kiện ánh sáng đỏ và ánh sáng trắng có màu

vàng điều này chứng tỏ ở điều kiện ánh sáng đỏ và trắng kích thích tế bào Spirulina

sp. tạo carotenoid cao sau 5 ngày nuôi cấy nhiều hơn so với ánh sáng xanh dương.

Theo Olaizola và Duerr (1990), Spirulina platensis (UTEX 1928) có sự thay đổi hàm

lượng carotenoid trong điều kiện ánh sáng khác nhau. Riêng carotenoid, đặc biệt β-

carotene và myxoxanthophyll thể hiện rõ những thay đổi với phổ ánh sáng khác nhau.

Hàm lượng β-carotene và echinenone cao ở cả trong điều kiện cường độ ánh sáng cao

và thấp. Hàm lượng myxoxanthophyll và lutein/zeaxanthin không thay đổi ở trong

các phổ ánh sáng giống nhau. Ở điều kiện ánh sáng đỏ và xanh dương hàm lượng

myxoxanthophyll giảm, trong khi β-carotene tăng, lutein/zeaxanthin và echinenone

thay đổi ít. Hàm lượng diệp lục tố a ở điều kiện ánh sáng đỏ chỉ khoảng 2/3 so với

điều kiện ánh sáng trắng. Kết quả này có thể là do tăng hiệu quả hấp thụ ánh sáng của

phycobiliprotein trong điều kiện ánh sáng đỏ. Ở điều kiện ánh sáng xanh dương, chỉ

có một sự thay đổi trong thời gian ngắn của hàm lượng diệp lục tố a [58].

Ở vi tảo Ulva pertusa sự phát triển cấu trúc màng thylakoid của tế bào thì ánh

sáng xanh dương có hiệu quả cao hơn so với ánh sáng đỏ. Quá trình duy trì cấu trúc

tế bào là cần thiết nhất cho quá trình tăng trưởng và phân chia tế bào, cho thấy ánh

sáng xanh dương là hiệu quả hơn. Hơn nữa, cấu trúc tế bào Ulva phát triển tương đối

tốt trong điều kiện nuôi cấy ánh sáng xanh dương so với ánh sáng đỏ và ánh sáng

trắng. Toàn bộ phần ánh sáng trắng cung cấp năng lượng cho hoạt động của

phytochrome và thụ thể ánh sáng (photoreceptor) tạo ra nguồn năng lượng cao cho

sự duy trì và tăng trưởng tối ưu của tế bào. Điều này cho thấy phần phổ ánh sáng đỏ

không đủ để kích thích tăng trưởng, nhưng không ức chế tăng trưởng hoặc duy trì cấu

trúc tế bào. Tuy nhiên năng lượng này là không đủ cho các quá trình chuyển hóa khác

[55].

Chất lượng ánh sáng có ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của tảo lam. Theo

Hultberg và các cộng sự (2014) đã chỉ ra rằng ở vi tảo Chlorella vulgaris chất lượng


42


ánh sáng ảnh hưởng tương đối lên khả năng sản xuất sinh khối, hàm lượng lipid tổng

và các loại acid béo [40]. Cả cường độ và chất lượng ánh sáng đều ảnh hưởng đến

thành phần và cấu trúc hóa học, tốc độ hấp thu carbon và tổng hợp polymer. Ở tất cả

cường độ ánh sáng hàm lượng diệp lục tố a ở điều kiện ánh sáng xanh dương và trắng

cao hơn ánh sáng đỏ. Tốc độ tổng hợp protein, hấp thu carbon và hô hấp ở điều kiện

ánh sáng xanh dương và đỏ cao hơn ánh sáng trắng trong điều kiện bằng mức năng

lượng [68]. Trong điều kiện nuôi cấy ánh sáng xanh dương tảo tăng trưởng gấp đôi

so với rong điều kiện ánh sáng trắng. Mặt khác, một số loài tảo cũng đáp ứng với phổ

ánh sáng khi được nuôi dưới điều kiện ánh sáng trắng bằng cách tăng sản xuất lượng

diệp lục tố [12]. Theo Niizawa và cs. (2014), ở vi tảo tốc độ hấp thu bức xạ ánh sáng

xanh dương cao hơn ánh sáng đỏ. Tuy nhiên bức xạ ánh sáng đỏ tạo ra hiệu quả năng

lượng cho sản xuất sinh khối cao hơn so với ánh sáng xanh dương [56].

Hàm lượng protein được tích lũy ở điều kiện ánh sáng xanh dương cao gần

gấp 2 lần so với ánh sáng đỏ và trắng. Điều này có thể giải thích do hàm lượng protein

có mối quan hệ âm tính với hàm lượng diệp lục tố. Phycobiliprotein được tổng hợp

nhiều hơn so với diệp lục tố ở các bước sóng đặc hiệu. Vì thế hàm lượng protein trong

điều kiện ánh sáng xanh lục cao hơn ở điều kiện ánh sáng xanh dương và ánh sáng

đỏ. Điều kiện tăng trưởng tối ưu được thể hiện chặt chẽ với hàm lượng protein cao.

Phycobiliprotein ở tảo lam có vai trò như các chất thu nhận ánh sáng trong quang hợp

cũng như chất dự trữ nitơ nội bào [36]. Các loài thực vật tăng trưởng ở điều kiện ánh

sáng xanh dương tổng hợp nhiều acid amin và protein hơn ở điều kiện ánh sáng trắng

hoặc ánh sáng đỏ [82].


Spirulina sp.

Tảo biển là nguồn thực phẩm tiềm năng mang lại giá trị dinh dưỡng và sinh

học cao chẳng hạn như protein, lipid, carbohydrat và carotenoid. Sinh khối và quá

trình tăng trưởng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố hóa lý như chất dinh dưỡng, chất lượng

và cường độ ánh sáng, nhiệt độ, độ pH và độ mặn [14], [47], [88]. Trong số các yếu

tố dinh dưỡng, nitơ được coi là một trong những chất dinh dưỡng quan trọng cho sự


43


tăng trưởng, vì nó là một thành phần trong tất cả các protein cấu trúc và chức năng

như peptide, enzyme, diệp lục tố, phân tử truyền năng lượng và vật chất di truyền

trong tế bào tảo [19]. Đặc biệt nguồn nitơ ảnh hưởng rất lớn đến khả năng tăng trưởng,

tích lũy protein và lipid của tảo [57], [83]. Tảo Tetraselmis sp. được nghiên cứu sử

dụng các nguồn nitơ hữu cơ như dịch chiết nấm men (yeast extract – YE), glycine và

urê cho hiệu suất cao về tăng trưởng tế bào. Tảo được nuôi cấy trong môi trường chứa

nguồn nitơ là nitrat tăng trưởng tốt hơn là amoni. Trong số 9 nguồn nitơ khác nhau

(NaNO3, KNO3, NH4NO3, NH4HCO3, NH4Cl, CH3COONH4, urê, glycine và YE),

YE cho năng suất lipid cao nhất, theo sau là urê và nitrat [48]. Tuy nhiên, khi áp dụng

canh tác đại trà cho sản xuất công nghiệp thì urê và nitrat sẽ phù hợp hơn so với YE

về khả năng kinh tế. Đặc biệt, nguồn nitơ nitrat ít gây độc và bền vững hơn so với urê

và amoni [28].

Các nồng độ nitơ khác nhau trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng lớn đến sự

tăng trưởng của tảo nói chung và tảo Spirulina sp. nói riêng đã được đề cập trong

nhiều nghiên cứu. Dư thừa hay thiếu hụt nitơ đều làm giảm sự tăng trưởng, khả năng

trao đổi chất, chất lượng dinh dưỡng của nhiều loài tảo trong đó có tảo Spirulina sp.

[9],[18],[62]. Trong thí nghiệm này, môi trường nuôi cấy có nồng độ NaNO3 5 g/L

cho sinh khối và tốc độ tăng trưởng cao hơn so với các nồng độ NaNO3 còn lại. Điều

này chứng tỏ, nitơ là một yếu tố thiết yếu cho sự tăng trưởng và năng suất sinh khối

cao.

Ngoài ra, tất cả các quá trình sinh tổng hợp hình thành sản phẩm, tái tạo và

duy trì tế bào rất cần yếu tố nitơ. Đặc biệt, quá trình sản xuất các sản phẩm chính như

protein, carbohydrate và các chất chuyển hóa của vi sinh vật bị ảnh hưởng rất lớn bởi

điều kiện tăng trưởng [10]. Nitơ là thành phần cơ bản cấu tạo các acid amin và các

phân tử protein trong tế bào nên khi cung cấp đầy đủ nitơ, quá trình sinh tổng hợp

protein được tăng cường và tảo tăng trưởng nhanh [76]. Ngược lại, thiếu hụt nitơ

trong môi trường nuôi là nguyên nhân làm giảm sinh khối, chậm tốc độ tăng trưởng

tế bào, tăng hàm lượng lipid hoặc carbohydrate và giảm tổng hợp protein trong tế bào

tảo [62]. Sự gia tăng hàm lượng protein (30,02 - 34,41%) tương ứng với sự gia tăng


44


các mức nitơ (1,25 – 5,0 g/L) trong nghiên cứu này là phù hợp với xu hướng chung

của các kết quả nghiên cứu trước đó [35], [39].

3.2.3. Nuôi cấy, thu sinh khối và phân tích thành phần acid amin

Đối với tảo lam khi được nuôi cấy trong điều kiện thiếu nitơ, số lượng và kích

thước các lục lạp nhỏ hơn so với điều kiện có đủ lượng nitơ. Bởi vì lục lạp thường

chứa một lượng lớn các sắc tố (diệp lục tố a và b, và - carotene) và các glycolipid

(MGDGs – Monogalactosyldiacylglycerol, DGDGs – Digalactosyldiacylglyerols,

SQDGs – Sulfoquinovosyldiacylglycerols) giống như màng thylakoid [78], lượng

chất béo và lipid giảm tương ứng với giảm kích thước lục lạp [41] . Thiếu hụt nitơ là

nguyên nhân làm giảm tốc độ sinh trưởng, sinh khối, thời gian duy trì mật độ cực đại,

hàm lượng sắc tố, protein, lipid, axít béo không no, vitamin, carotenoids, phycocianin,

enzyme,… ở nhiều loài tảo trong đó có tảo Spirulina sp. [59] [80]. Ngoài ra, trong

điều kiện thiếu hụt lượng nitơ, số lượng các chất chuyển hóa giảm đáng kể xuống còn

1/20 hoặc ít hơn so với điều kiện đủ lượng nitơ [41]. Cũng chính vì thế, khi nuôi cấy

Spirulina sp. trong môi trường có nồng độ NaNO3 5,0 g/L sau 5 ngày nuôi cấy, cả 2

chủng duy trì ở pha tăng trưởng và dịch tảo vẫn có màu xanh.

Ở tảo, một số các chất chuyển hóa (Arg, Gln, Asn, Citrulline, Pro, Ornithine và

Asp) đã tham gia vào quá trình đồng hóa nitơ và chuyển hóa N- vận chuyển. Khi môi

trường nuôi cấy bị thiếu hụt dinh dưỡng về nguồn nitơ thì các amin tham gia vào quá

trình tổng hợp de novo acid amin tự do bị giảm mạnh dẫn làm giảm hàm lượng protein

và các acid amin [41]. Vì thế, hàm lượng một số các acid amin thiết yếu có trong

protein của 2 chủng Spirulina được nuôi cấy trong môi trường nồng độ NaNO3 5,0

g/L cao hơn rất nhiều so với môi trường có nồng độ NaNO3 2,5 g/L tương tự như thí

nghiệm thực hiện bởi Choi và cộng sự (2003) [21]. Hàm lượng amino acid thiết yếu

của 2 chủng Spirulina sp. được nghiên cứu trong thí nghiệm cao hơn rất nhiều so với

giá trị tối thiểu theo yêu cầu của FAO với Isoleucine, Leucine, Lysine và

Phenylalanine vượt qua gấp 1,5 lần (Spirulina sp. Mỹ) và 2,4 lần (Spirulina sp. Nhật).

Tuy nhiên, hàm lượng Valine khá thấp đạt 2,11% (Spirulina sp. Mỹ) và 3,31%


45


(Spirulina sp. Nhật), trong khi yêu cầu của FAO hàm lượng Valine cung cấp tối thiểu

là 4,2% [74].

Hệ thống chống oxy hóa của thực vật và tảo lam có hai loại: hệ thống chống

oxy hóa bằng enzyme và không enzyme [77], [85]. Các hệ thống chống oxy hóa bằng

enzyme bao gồm: superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione

peroxidase (GPx) và glutathione reductase (GR); hệ thống chống oxy hóa không

enzyme là các chất chống oxy hóa có trọng lượng phân tử thấp như: acid ascorbic,

glutathione, proline, carotenoid, acid phenolic, flavonoid,… và chất chuyển hóa thứ

cấp có trọng lượng phân tử cao như tannin [44]. Ở tảo Spirulina sp. có chứa các chất

chống oxy hóa như carotenoid và phycobiliprotein [49], [72]. Khả năng chống oxy

hóa của tảo cũng bị ảnh hưởng rất nhiều bởi yếu tố nitơ được cung cấp trong môi

trường nuôi cấy. Theo Miranda và cộng sự (1998), các hợp chất phenolic chính được

tìm thấy trong Spirulina là: salicylic, trans-cinnamic, synaptic, chlorogenic, acid

quimic và caffeic. Tuy nhiên, sự trao đổi chất và con đường cho sự hình thành của

các hợp chất trong tảo lam và tầm quan trọng của chúng vẫn chưa được xác định [54].

Ngoài ra, Spirulina còn chứa 1 số hoạt chất chống oxi hóa khác như: -carotene, α –

ocopherol và các phycobiliprotein. Đối với thực vật, phenylalanine có thể được

chuyển hóa bởi amoniac lyase và acid trans-cinnamic lần lượt thành acid cumaric,

acid caffeic [65]. Những hợp chất này là được sử dụng để sản xuất flavonoid và các

chất chống oxy hóa khác. Các con đường sinh tổng hợp dẫn đến sự hình thành

flavonol và phenylpropanols trong thực vật có liên quan đến chu trình pentose-

phosphate (Calvin) và lượng tổng hợp là đặc tính của mỗi sinh vật [29]. Ở điều kiện

đủ nitơ, các chất chống oxi hóa tăng do Ribose 1,5-bisphosphate và fructose 1,6-

diphosphate trong chu trình cố định carbon (Calvin) hoặc đường pentose phosphate

tăng tương ứng 15 và 11 lần [41].

Hàm lượng phenolic và hoạt tính chống oxy hóa của Spirulina sp. có mối tương

quan với nhau. Theo Sahu và cộng sự (2013) chỉ ra rằng có sự tương quan đáng kể

giữa hàm lượng phenolic và khả năng khử các gốc tự do ở các loài thực vật qua đó


46


cho thấy khả năng khử các gốc tự do có thể liên quan đến nồng độ của nhóm hydroxyl

phenolic. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các polyphenol góp phần đáng kể vào hoạt

động chống oxy hóa và khử gốc tự do, chủ yếu là do đặc tính chống oxy hóa của

chúng, đóng một vai trò quan trọng trong việc hấp phụ và trung hòa các gốc tự do,

dập tắt các oxy hóa trị 1 và hóa trị 3 hoặc phân hủy peroxit [70]. Các hợp chất

phenolic không chỉ làm tăng thời hạn sử dụng của thực phẩm mà còn hoạt động như

chất chống oxy hóa trong nhiều hệ thống sinh học. Phenolic có khả năng chống oxy

hóa và tương tác với các gốc tự do; hợp chất này có thể ức chế sự oxy hóa lipid trong

in vitro bằng cách loại bỏ gốc tự do và hoạt động như chelat kim loại [25]. Estrada

(2001) đã chứng minh phycobiliprotein; phycocyanin và allophycocyanin từ dịch

chiết của Spirulina có hoạt tính chống oxy hóa mạnh và ức chế quá trình oxy hóa

lipid tế bào [61]. Dịch chiết methanol chứa phenol của S. platensis đông khô làm

giảm lượng màu nâu của guayacol gây ra peroxidase . Ngoài ra, số lượng hợp chất

phenolic được sản xuất bởi S. platensis có liên quan đến tiềm năng chống oxy hóa,

họ kết luận rằng nồng độ phenol càng cao thì càng ít có màu nâu và tiềm năng chống

oxy hóa cao hơn [25].

Khóa luận tốt nghiệp Kết luận và kiến nghị

47


CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

Chất lượng ánh sáng có tác động mạnh mẽ lên hình thái, sự tăng trưởng và tích

lũy protein ở Spirulina sp. Ở điều kiện ánh sáng xanh dương, màu sắc và dịch nuôi

cấy tế bào có màu xanh và hàm lượng protein tổng được tích lũy cao hơn so với điều

kiện ánh sáng đỏ và ánh sáng trắng. Tuy nhiên ở hai điều kiện ánh sáng này lại kích

thích tổng hợp carotenoid dẫn đến màu sắc tế bào và dịch nuôi cấy có màu vàng cam,

sinh khối và tốc độ tăng trưởng cao hơn so với ánh sáng xanh dương.

Nồng độ NaNO3 trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng khá rõ lên sự tăng trưởng

và tích lũy protein của Spirulina. Khi tăng nồng độ NaNO3 trong môi trường Zarrouk

từ 1,25 g/L đến 5 g/L thì sinh khối, tốc độ tăng trưởng đặc hiệu và hàm lượng protein

tổng của Spirulina tăng. Ở môi trường nuôi cấy có nồng độ NaNO3 5,0 g/L Spirulina

cho sinh khối và hàm lượng protein tổng nhiều hơn so với 2 nồng độ NaNO3 1,25 g/L

và 2,5 g/L.

Cả hai chủng Spirulina sp. Mỹ và Nhật đều tăng trưởng tốt, tích lũy hàm lượng

protein và thành phần acid amin cao trong môi trường nuôi cấy Zarrouk bổ sung

NaNO3 5 g/L. Ngoài ra, hàm lượng phenolic tổng và khả năng chống oxy của hai

chủng Spirulina sp. này đạt giá trị cao và có mối tương quan dương với nhau.

4.2. Kiến nghị

Nghiên cứu ảnh hưởng của nitơ và photpho khi sử dụng phân bón NPK trong

môi trường nuôi cấy Zarrouk để tăng năng suất và giảm giá thành.

Sử dụng ánh sáng xanh dương trong nuôi cấy để tăng tốc độ tăng trưởng, khả

năng tích lũy protein và các hợp chất chống oxy hóa ở Spirulina sp.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Đặng Đình Kim, Đặng Hoàng Phước Hiền (1999), Công nghệ sinh học vi tảo,

NXB Nông nghiệp, tr. 18-20.

2. PGS.TS Dương Thanh Liêm, ThS Lê Thanh Hải, ThS Vũ Thủy Tiên (2010), Thực

phẩm chức năng và sức khỏe bền vững, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà

Nội, tr. 409-410.

3. Trương Văn Lung (2004), Công nghệ sinh học một số loại tảo kinh tế, Nhà xuất

bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 15-18.

4. Nguyễn Đức Lượng (2002), Công nghệ vi sinh, tập 2 - Vi sinh vật học công

nghiệp, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia, Tp. Hồ Chí Minh, pp. 124-125.

5. Hoàng Nghĩa Sơn (2001), Nghiên Cứu Quy Trình Nuôi Trồng Và Sản Xuất

tảo Spirulina Platensis Ở Quy Mô Gia Đình Sử Dụng Trong Chăn Nuôi, Gia

Súc, Gia Cầm, NXB Khoa học Và Kỹ Thuật, Hà Nội, tr. 70-75.

6. Đặng Thỵ Sy (2005), Tảo học, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội,

tr. 25-29.

7. Mai Ngọc Thảo (2008), Ứng Dụng Spirulina Vào Sản Xuất Bánh Mì Ngọt và

Nhạt, Luận văn Thạc sĩ, Đại học Bách Khoa, tr. 10-12.

8. Nguyễn Hữu Thước (2004), Tảo Spirulia Nguồn Dinh Dưỡng Và Dược Liệu Quý,

NXB Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội, tr. 13-15.

9. Abd El-Baky H H, El-Baz F K, El Baroty G S (2010), "Enhancing antioxidant

availability in wheat grains from plants grown under seawater stress in response

to microalgae extract treatments", Journal of the Science of Food and

Agriculture, 90 (2), pp. 299-303.

10. Abd El Baky H, El baroty G (2016), Optimization of Growth Conditions for

Purification and Production of L-Asparaginase by Spirulina maxima, Hindawi

Publishing Corporation, Evidence-Based Complementary and Alternative

Medicine, pp. 3-4.

11. Adb El Baky H, K. El Baz F, El baroty G (2009), "Production of phenolic

compounds from Spirulina maxima microalgae and its protective effects in vitro

toward hepatotoxicity model", African journal of pharmacy and pharmacology,

3 (4), pp. 133-139.

12. Al-Qasmi M., Talebi S., Al-Rajhi S., Al-Barwani T. (2012), "A Review of Effect

of Light on Microalgae Growth", Proceedings of the World Congress on

Engineering, 1, pp. 608-610.

13. Albayrak S, Aksoy A, Sagdic O, Hamzaoglu E (2010), "Compositions,

antioxidant and antimicrobial activities of Helichrysum (Asteraceae) species

collected from Turkey", Food Chemistry, 119 (1), pp. 114-122.

14. Bartley M L, Boeing W J, Daniel D, Dungan B N, et al (2016), "Optimization

of environmental parameters for Nannochloropsis salina growth and lipid

content using the response surface method and invading organisms", Journal of

Applied Phycology, 28 (1), pp. 15-24.

15. Bashandy S A E, El Awdan S A, Ebaid H, Alhazza I M (2016), "Antioxidant

Potential of Spirulina platensis Mitigates Oxidative Stress and Reprotoxicity

Induced by Sodium Arsenite in Male Rats", Oxidative Medicine and Cellular

Longevity, 2016, pp. 7174351.

16. Bermejo R., Talavera E.M., Alvarez-pez J.M., Orte J.C. ( 1997),

"Chromatographic purification of biliproteins from Spirulina Platensis: High

performance liquid chromatographic separation of their a and b sub units",

Journal of Chromatography A, 778 (1), pp. 441–450.

17. Bradford M M (1976), "A rapid and sensitive method for the quantitation of

microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding",

Anal Biochem, 72, pp. 248-254.

18. Bulut Y. ( 2009), "The investigations on the possibility of increase lipid content

of Chlorella (Master Thesis)", Institute of Science and Technology, pp. 62.

19. Cai T, Park S Y, Li Y (2013), "Nutrient recovery from wastewater streams by

microalgae: Status and prospects", Renewable and Sustainable Energy Reviews,

19 pp. 360-369.

20. Capelli B, Cysewski G R (2010), "Potential health benefits of Spirulina

microalgae", Nutrafoods, 9 (2), pp. 19-26.

21. Choi A, Kim S-G, Yoon B-D, Oh H-M (2003), "Growth and amino acid contents

ofSpirulina platensis with different nitrogen sources", Biotechnology and

Bioprocess Engineering, 8 (6), pp. 368-372.

22. Ciferri O, Tiboni O (1985), "The biochemistry and industrial potential of

Spirulina", Annu Rev Microbiol, 39, pp. 503-526.

23. Ciferri O. (1983), "Spirulina the edible microorganism", Microbiol Rev, 47 (4),

pp. 551 - 578.

24. Clair R W, Toma J J, Jr., Lofland H B (1975), "Proline hydroxylase activity and

collagen content of pigeon aortas with naturally-occurring and cholesterol-

aggravated atherosclerosis", Atherosclerosis, 21 (2), pp. 155-165.

25. Colla L, Badiale-Furlong E, Costa J A (2007), "Antioxidant properties of

Spirulina (Arthospira) platensis cultivated under different temperatures and

nitrogen regimes", Brazilian Archives Of Biology And Technology, 50 (1), pp.

26. Costa J A, Colla L M, Duarte Filho P (2003), "Spirulina platensis growth in open

raceway ponds using fresh water supplemented with carbon, nitrogen and metal

ions", Z Naturforsch C, 58 (1-2), pp. 76-80.

27. D. G. Wallen, G. H. Geen (1971), "Light quality in relation to growth,

photosynthetic rates and carbon metabolism in two species of marine plankton

algae", Marine Biology, 10, pp. 33-34.

28. Donald D B, Bogard M J, Finlay K, Leavitt P R (2011), "Comparative effects of

urea, ammonium, and nitrate on phytoplankton abundance, community

composition, and toxicity in hypereutrophic freshwaters", Limnology and

Oceanography, 56 (6), pp. 2161-2175.

29. Duval B, Shetty K (2001), "The stimulation of phenolics and antioxidant activity

in pea (pisum sativum) elicited by genetically transformed anise root extract",

Journal of Food Biochemistry, 25 (5), pp. 361-377.

30. Eykelenburg, C.V.. (1979), " The ultrastructure of Spirulina platensis in relation

to temperature and light intensity", Antonie van Leeuwenhoek, 45, pp. 369-390.

31. Felig P, Pozefsky T, Marliss E, Cahill G F, Jr. (1970), "Alanine: key role in

gluconeogenesis", Science, 167 (3920), pp. 1003-1004.

32. Gershwin M. E., Amha Belay (2007), Spirulina in Human Nutrition and Health,

CRC Press, Boca Raton, pp. 20 -25.

33. Glazer A N (1994), "Phycobiliproteins — a family of valuable, widely used

fluorophores", Journal of Applied Phycology, 6 (2), pp. 105-112.

34. Goiris K, Muylaert K, Fraeye I, Foubert I, et al (2012), "Antioxidant potential

of microalgae in relation to their phenolic and carotenoid content", Journal of

Applied Phycology, 24 (6), pp. 1477-1486.

35. Guillard RRL. (1973), Culture Methods and Growth Measurements,

Chambridge University Pres, Chambridge, pp. 289-311.

36. H R P, H R D, Claire J-C, Arsène I, et al (2008), "Influence of light quality and

intensity in the cultivation of Spirulina platensis from Toliara (Madagascar) in

a closed system", Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 83 (6), pp.

842-848.

37. Hajimahmoodi M, Faramarzi M A, Mohammadi N, Soltani N, et al (2010),

"Evaluation of antioxidant properties and total phenolic contents of some strains

of microalgae", Journal of Applied Phycology, 22 (1), pp. 43-50.

38. Hanaa H.abd El-Baky, Faouk K. El Baz, Gamal S. El-Baroty (2003), "Spirulina

Species as a Source of Carotenoids and a-Tocopherol and its Anticarcinoma

Factors", Biotechnology,Asian Network for Scientific Information, pp. 222-240.

39. Ho S H, Ye X, Hasunuma T, Chang J S, et al (2014), "Perspectives on

engineering strategies for improving biofuel production from microalgae--a

critical review", Biotechnol Adv, 32 (8), pp. 1448-1459.

40. Hultberg M, Jönsson H L, Bergstrand K-J, Carlsson A S (2014), "Impact of light

quality on biomass production and fatty acid content in the microalga Chlorella

vulgaris", Bioresource Technology, 159, pp. 465-467.

41. Ito T, Tanaka M, Shinkawa H, Nakada T, et al (2013), "Metabolic and

morphological changes of an oil accumulating trebouxiophycean alga in

nitrogen-deficient conditions", Metabolomics, 9 (1), pp. 178-187.

42. Jonker R, Engelen M P, Deutz N E (2012), "Role of specific dietary amino acids

in clinical conditions", Br J Nutr, 108 Suppl 2 pp. S139-148.

43. Kamata K, Piao Z, Suzuki S, Fujimori T, et al (2014), "Spirulina-templated

metal microcoils with controlled helical structures for THz electromagnetic

responses", Sci Rep, 4 (1), pp. 4919.

44. Kasote D M, Katyare S S, Hegde M V, Bae H (2015), "Significance of

Antioxidant Potential of Plants and its Relevance to Therapeutic Applications",

Int J Biol Sci, 11 (8), pp. 982-991.

45. Kawata Y. (2006), "Studies on recombinant DNA techniques for

cyanobacterium Spirulina platensis", Doctoral Thesis Kyoto University, pp. 46.

46. Khan Z, Bhadouria P, Bisen P S (2005), "Nutritional and therapeutic potential

of Spirulina", Curr Pharm Biotechnol, 6 (5), pp. 373-379.

47. Kim D G, Bum Hur S (2013), "Growth and fatty acid composition of three

heterotrophic Chlorella species", Algae, 28 (1), pp. 101-109.

48. Kim G, Mujtaba G, Lee K (2016), "Effects of nitrogen sources on cell growth

and biochemical composition of marine chlorophyte Tetraselmis sp. for lipid

production", ALGAE, 31 (3), pp. 257-266.

49. Konickova R, Vankova K, Vanikova J, Vanova K, et al (2014), "Anti-cancer

effects of blue-green alga Spirulina platensis, a natural source of bilirubin-like

tetrapyrrolic compounds", Ann Hepatol, 13 (2), pp. 273-283.

50. Kulshreshtha A, Zacharia A J, Jarouliya U, Bhadauriya P, et al (2008),

"Spirulina in health care management", Curr Pharm Biotechnol, 9 (5), pp. 400-

405.

51. Lim S N, Cheung P C, Ooi V E, Ang P O (2002), "Evaluation of antioxidative

activity of extracts from a brown seaweed, Sargassum siliquastrum", J Agric

Food Chem, 50 (13), pp. 3862-3866.

52. M. Levasseur M., Thompson P. A., Harrison P. J. (1993), "Physiological

acclimation of marine phytoplankton to different nitrogen sources", J Phycol,

29 (5), pp. 587-595.

53. Madkour F F, Kamil A E-W, Nasr H S (2012), "Production and nutritive value

of Spirulina platensis in reduced cost media", The Egyptian Journal of Aquatic

Research, 38 (1), pp. 51-57.

54. Miranda M S, Cintra R G, Barros S B, Mancini Filho J (1998), "Antioxidant

activity of the microalga Spirulina maxima", Braz J Med Biol Res, 31 (8), pp.

1075-1079.

55. Muthuvelan B., Noro T., K. N (2002), "Effect of light quality on the cell integrity

in marine alga Ulva pertusa (Chlorophyceae)", Indian Journal of Geo-Marine

Sciences, 31 (1), pp. 21-25.

56. Niizawa I, Heinrich J M, Irazoqui H A (2014), "Modeling of the influence of

light quality on the growth of microalgae in a laboratory scale photo-bio-reactor

irradiated by arrangements of blue and red LEDs", Biochemical Engineering

Journal, 90 (15), pp. 214-223.

57. Norici A, Dalsass A, Giordano M (2002), "Role of phosphoenolpyruvate

carboxylase in anaplerosis in the green microalga Dunaliella salina cultured

under different nitrogen regimes", Physiol Plant, 116 (2), pp. 186-191.

58. Olaizola M., Duerr E.O. (1990), "Effects of light intensity and quality on the

growth rate and photosynthetic pigment content of Spirulina platensis", Journal

of Applied Phycology, 2, pp. 97-104.

59. Olguin E J, Galicia S, Angulo-Guerrero O, Hernandez E (2001), "The effect of

low light flux and nitrogen deficiency on the chemical composition of Spirulina

sp. (Arthrospira) grown on digested pig waste", Bioresour Technol, 77 (1), pp.

19-24.

60. Pandey J.P., Tiwari A., R.M. M (2010), "Evaluation of Biomass Production of

Spirulina maxima on Different Reported Media", J Algal Biomass Utln, 1 (3),

pp. 70-81.

61. Pinero Estrada J E, Bermejo Bescos P, Villar del Fresno A M (2001),

"Antioxidant activity of different fractions of Spirulina platensis protean

extract", Farmaco, 56 (5-7), pp. 497-500.

62. Pruvost J, Van Vooren G, Cogne G, Legrand J (2009), "Investigation of biomass

and lipids production with Neochloris oleoabundans in photobioreactor",

Bioresource Technology, 100 (23), pp. 5988-5995.

63. R. H (1994), "Earth Food Spirulina", Ronore Enterprise USA, pp. 25-43.

64. R. Todd Lorenz, D. P (1998), "A Review of Spirulina as a Carotenoid and

Vitamin Source for Cultured Shrimp", Spirulina Pacifica Technical Bulletin,

pp. 3.

65. Rechner A R, Spencer J P, Kuhnle G, Hahn U, et al (2001), "Novel biomarkers

of the metabolism of caffeic acid derivatives in vivo", Free Radic Biol Med, 30

(11), pp. 1213-1222.

66. Richmond A (1986), Outdoor Mass Cultures of Microalgae, CRC Press, INC.

Boca Raton, pp. 285-329.

67. Richmond A, J.U. Grobbelaar (1986), "Factors affecting the output rate of

Spirulina platensis with reference to mass cultivation", Biomass, 10 (4), pp.

253-264.

68. Rivkin R. B. (1989), "Influence of irradiance and spectral quality on the carbon

metabolism of phytoplankton", Marine ecology progress series, 55, pp. 291-

304.

69. Rosa G M d, Moraes L, de Souza M d R A Z, Costa J A V (2016), "Spirulina

cultivation with a CO2 absorbent: Influence on growth parameters and

macromolecule production", Bioresource Technology, 200, pp. 528-534.

70. Sahu R, Kar M, Routray R (2013), "DPPH Free radical scavenging activity of

some leafy vegetables used by tribals of Odisha. India", Journal of Medicinal

Plants Studies, 4 (1), pp. 21-27.

71. Sajilata M G, Singhal R S, Kamat M Y (2008), "Fractionation of lipids and

purification of γ-linolenic acid (GLA) from Spirulinaplatensis", Food

Chemistry, 109 (3), pp. 580-586.

72. Schwartz J., G. S, Suda D. Growth (1988), "Inhibition and destruction of oral

cancer cells by extracts from Spirulina", Cancer & Nutrition, 11 (2), pp. 127-

134.

73. Singh S P, Singh P (2015), "Effect of temperature and light on the growth of

algae species: A review", Renewable and Sustainable Energy Reviews, 50, pp.

431-444.

74. Spies J R (1967), "Determination of tryptophan in proteins", Anal Chem, 39 (12),

pp. 1412-1416.

75. Spolaore P, Joannis-Cassan C, Duran E, Isambert A (2006), "Commercial

applications of microalgae", J Biosci Bioeng, 101 (2), pp. 87-96.

76. Sukenik A, Zmora O, Carmeli Y (1993), "Biochemical quality of marine

unicellular algae with special emphasis on lipid composition. II.

Nannochloropsis sp", Aquaculture, 117 (3), pp. 313-326.

77. Sunda W, Kieber D J, Kiene R P, Huntsman S (2002), "An antioxidant function

for DMSP and DMS in marine algae", Nature, 418 (6895), pp. 317-320.

78. Thompson G A (1996), "Lipids and membrane function in green algae",

Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Lipids and Lipid Metabolism, 1302 (1),

pp. 17-45.

79. Tran D, Doan N, Louime C, Giordano M, et al (2014), "Growth, antioxidant

capacity and total carotene of Dunaliella salina DCCBC15 in a low cost

enriched natural seawater medium", World J Microbiol Biotechnol, 30 (1), pp.

317-322.

80. Uslu L, Isik O, Koç K, Göksan T (2011), "The effects of nitrogen deficiencies

on the lipid and protein contents of Spirulina platensis", African Journal of

Biotechnology, 10 (3), pp. 386-389.

81. Vonshak A, Kancharaksa N, Bunnag B, Tanticharoen M (1996), "Role of light

and photosynthesis on the acclimation process of the cyanobacteriumSpirulina

platensis to salinity stress", Journal of Applied Phycology, 8 (2), pp. 119-124.

82. Wallen D G, Geen G H (1971), "Light quality in relation to growth,

photosynthetic rates and carbon metabolism in two species of marine plankton

algae", Marine Biology, 10 (1), pp. 34-43.

83. Wan M-X, Wang R-M, Xia J-L, Rosenberg J N, et al (2012), "Physiological

evaluation of a new Chlorella sorokiniana isolate for its biomass production and

lipid accumulation in photoautotrophic and heterotrophic cultures",

Biotechnology and Bioengineering, 109 (8), pp. 1958-1964.

84. Williamson M P (1994), "The structure and function of proline-rich regions in

proteins", Biochem J, 297 (Pt 2), pp. 249-260.

85. Yadav P, Kumar S, prathap reddy K, Yadav T, et al (2014). Oxidative Stress and

Antioxidant Defense System in Plants, Biotechnology. Studium Press LLC,

USA, pp. 262-281.

86. Yaltirak T, Aslim B, Ozturk S, Alli H (2009), "Antimicrobial and antioxidant

activities of Russula delica Fr", Food Chem Toxicol, 47 (8), pp. 2052-2056.

87. Zhu C. J., K. L Y (1997), "Determination of biomass dry weight of marine

microalgae", Journal of Applied Phycology, 9 (2), pp. 189-194.

88. Yen H-W, Hu I C, Chen C-Y, Chang J-S (2014). Chapter 2 - Design of

Photobioreactors for Algal Cultivation In: Pandey A, Lee D-J, Chisti Y, et al.,

Biofuels from Algae. Elsevier, Amsterdam, pp. 23-45.

nguyenthibichngoc.pdf - Đại học nguyễn tất thành

Documents