molecular characterization of abc transporter-encoding

13
Genet. Mol. Res. 1 (4): 337-349 (2002) Received October 30, 2002 Published December 12, 2002 Genetics and Molecular Research 1 (4): 337-349 (2002) FUNPEC-RP www.funpecrp.com.br Molecular characterization of ABC transporter-encoding genes in Aspergillus nidulans Adriana Mendes do Nascimento 1 , Maria Helena S. Goldman 2 and Gustavo H. Goldman 1 1 Departamento de Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brazil 2 Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brazil Corresponding author: G.H. Goldman E-mail: [email protected] ABSTRACT. As a preliminary step towards characterizing genes encoding ATP-binding cassette (ABC) transporters that confer pleiotropic drug resistance in Aspergillus, we used a PCR-based approach to isolate four DNA fragments corresponding to different ABC type transporter genes. DNA sequencing and Southern blot analysis confirmed that they were distinct genes, which were designated abcA-D. One of these genes, abcD, was cloned and characterized. It was found to have a predicted 1,452-amino acid translation product with a calculated molecular mass of 147,467 kDa. The abcD gene specifies a single transcript of approximately 5.0 kb; there was a two- to six-fold enhancement of mRNA levels following exposure to miconazole, camptothecin, methotrexate, and ethidium bromide. Key words: ATP-binding cassette transporters, Fungal infections, Aspergillus nidulans, Multidrug resistance

Upload: khangminh22

Post on 27-Jan-2023

0 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

�������������� ������ ����� ����� ���

������������� ��� ��������������������������������������� ��� ���!�"�

����������������� ������������ ������������������������������ ���!���"���#������������

������������� ��� ������������������������������� #$%&'(��&�������� ��� ���!�"�

������������������ ��������������������������������������������������� ��

����������������� ������������������������������

����������������������

�"�$%��%#����� ��� &�'���%�� (%�#%�' ���%��� (%� �%��� ��� &�'���%�(%�#%�' ���%����������)���������*��������%������+)���% ���+)���% ��+���,�%-��(%� �%������(����.�%��&�'���%����/���%����������)���������*��������%�����+)���% ��������)���������+���,�%-�&�����$�����0�% �!������1�����#%�2�#%���00��#%�3 �$���

������������������������� ��� ������������� ���������������������������������� �������� ������� ���� �� ������������ ������������� ������������������������������� ���������������� ������ ������!"�������� ��������������� ��������� ����� ���� ������� �������#�!"����$�����������%�� �������� ����������������� �� � ���������� �� ������������������������ �������!#�&������ �������������!����������������������� �����#�' ����������� ����(��������� ��)�*+,��������� ������ ��������� �� ����������� ������������������)*-�*.-�/!�#�������!���������������������� ������� ���������0� ���+#1�/�2� ����������� ���� ���0��������������� ���� "����(�������������0������� ��������������� � ������� �� ��0� ������� ���������#

��� �������������������� �� ������� �����3���������� �������������� ��������4�� ��������� ����

)����%���!�������� � ���

������������� ��� ��������������������������������������� ��� ���!�"�

������������

�������������������������� ������������ ���������������������� ��������#��������������� ����������� ��������������������� ���������� ����� �� ����� �����������������������(��������(��(����������������������������������������������� �� �#���������� ������������� ��������� ������ ����� ����(���� ������ ��� ���� �������(��(���������������������#�4�� �� ������ �� ����������������������0����(����������� �� ��� �� �� ���� ����������� ���!����������% �(�����)551�#� ���� ����������� ������� ��� �� ��������������� �����������(��� ���� ������������������� �������� ������� ������������� �� �� �� �����(��������� �� ��� �� ��������������� ����������� ����#�� �������0 ����������� ������������������ ����� ���� ���������������$��/������������6��������������� ��������� ������������������� �� ������ ���� ��7'8�������������� �� ���� �� �� ���������������������������������������(��������9� ��� ���#��)55:�#�' ������������ �� ��� ����������� ����������� �������������������� �� ��������������� �� ������������ ��� �� ������ �� ���� �����8��������������� ���#��)55*��)55:2� �0�� ���#��)55+2������ ����� ��#��)55.2�;������ ���#��)55.2�!������� ���#��)55-���2�"�� ��� ���#��)55-2�<������7��������7��������)55-�#

���� �������� ����� ������� ��������� ������4! ������/���� �����������#�#� �����(������ �������� ����� ����������������������� ����� � �0���������������� ������� ��� ������������������� ��������0���� �0����������#�'�� ������ �0 �� ������������� ���������� ������� ���������� ������������(������� �������� ���������� ���� �������������������(���������=� ������������ ����)55>2�=� ������ ���#��)55+�#�&(���0����������� �������4! )��������������������������� ������������������� ������������ �� ������ ��������������������0�������� ������� ���������=� ������������ ����)55>�#���������� �����$������������������ �������� ���� �� �� ���� ��(����� ���� �� ����������������������������� ��������� �� ��������� ��7������)55,�#��������������� �������� ������� ������(��������� ������������(��� �������������������������������� ������� ������������ ��������� ���������� ������(���8��������;�������)55:�#�?�������������� �����������0����������(����������� �����4! �������������� ���������������������������������������� ���#��������������� ��������������� ���������� ���������� ������������������� ������� ����� ��(����� �������������=��������)55)��)55*2�!���%������ ���#�)55-2������� ���#��)55-2�;�����/���/�����=��������)55-2�!��� ���������=��������)55-29� ��� ���#��)55:2�"�/������ ���#��)55:2����%������ ���#��)55:2����������� ���#��)555�#7���(���� � ������/���������������������������������� ����� ���� �����������������������#�!������ � � ��#� �)55-��� ����� ��� ��� ����������� ��� ����������� ���� ����� ������������������(�����(���������� ���������� ����� ��������������(��(������������0����� ���� ������ ��#

�� ���������������� ��������������� �����������(����������� ����� �� �� ��������������������� ������ ���������������� ��������� �������� ����������(������ #�' ������0������ ��������� �������(�� �� ���������� ������ �������������� ������������ �������#���������������� ��� ������������� ������������������������ ������� ���� �� ����������� �������������� ������������������������������� ���������������� ������ ��!"������� �� �� ������������ ������ ������� ����������������#�9������(������������������� ����������� ��������������������4! ��/����� �������� ������#

�������������� ������ ����� ����� ���

������������� ��� ��������������������������������������� ��� ���!�"�

����� �� ������

�������������� ����������������� ������� ��

����� ���������� ��������������(���������������������������� ���������������������0��� ��������������������������� ������ ��� �� ������ ����(��� ���#��)5+>�#������ ��� ,)����)����)����������� �������� � ������/#�������� ����������������@�=A�,B���������1#+B����� ��0 ��� ��,B����������� ���������� ��#���� ����� ���������� ���( �������� �� ����� �����������������;������)5--�#

����������� �� ��������������������� ���� ���� ����������� ������ ��������

'��� ��� ����������� �������� �������������!"����$����������������� �� ���������������������� ������� ������ ������������������������ ��������������������� ������ �� ����$��#�������������������������� ������������������� ����������������������$����������(���������������� ���� ����� �������������(�������� ��� ������������9��/���� ����9��/���� ���#��)5:,����� �������������������������� ����>1������ (����/���� ������ ���� ������� ���#��������������� ������������ ����������������� ��� ������������������������ ��������C���������%������)55)�#�������������)�+D�=�@���=�@=='�����'==�>D��������>��+D�=�@���=�@=='����=@==�>D���������� �������������$�������C8=�%=����������� ������� ���� �����,��+D�=�� �=@�=���@�='��'���>D��� ��� ������� ���� � ����� �� �� � �������==E;E '#�������������*��+D�=�@==���7��7==7�=@==9���>D����������� ������ ���� ��$������ 8=%%=�=;� ���� ����� �� ����� ��� � �� ���+� �+D� ��@���=�!=�!=�!=�@������>D��� ���������� ����� ����� �� �� ��������� ������������$������!?��%�C!#��� ������������������������������ ���0 ��������� �����+1�4�;����)#+�4�4���

���)1�4�����7�����7�:#:��+1�µ4���������������������=���

����������������������)�µ�����������1#+�F������$�!"����������������/��?����������+1������ ���� ��!"�#������� ������������������������)11���������������������� �������4<� ���������'��#�#����������� ������������������ �� ������� ���!"���������� ������� ���������� ������ �����/������� ��� ��#����������� ������������� ��� �����0��� ���� �����$����������#����� ���� ���0 ���������(������� ��+1�µ�� ������������ ������������ ����� ���!"�� �����������#�����!"�������� ������� �������>1������������������A�5*�������,����5*�������*+������ ����������� ������������ ����� ��������*+� �*1�������>1�������*�0����+����������++� ��+1�������>1�������)�0����,��������,�0����>���-,������)�������>1��#��������� ���0 �������������� �*����� ����$����#������������������ �����������(���������� ���������������)B���������������?�������#������� ������� ������������������������4&%�/ �����������������#

� ����!�"����������������

��������������������������������������(������������� ��������3������=��� ��% ��/���� ��������� ������������� ��7������"�������������������������������� ���������0� ����*11������ ������� � �� ������������� �� �����!������������ ������#���������� ����������� (������������������������������ ��������������������G���H�

)����%���!�������� � ���

������������� ��� ��������������������������������������� ��� ���!�"�

�������������#�7������ ���������������� �� �.+�����,I�� �������������� �� ���%%���1#,+B��/���������1#)B������������������� ���%!%������ ��������*1�µ�J������������!"�#������� ����������������� �.+��� ��������)+�����,I�%%������1#1+B�%!%#������� ���������0���������;���/�I� �+�I��������� ��-1��������� ���������������#���������� ���$��������� �����!������������ ��������� �������0������� ���� ���� ��������� ��� ��������������� �� ������������ ���������� �� ������!�������� ���/ �����/��?����#

���#���������$!��� ��

�� �� ������������� ������!"����� �������������������������������� �� ����������D�����������J���������������� ���#�������!"������ ��������� ��������%�� �������� ����������������������� �������������������%�����/�� ���#��)5:5�#�!"�������������������������������������� ����������� �� ��������� ����D���� ��� ��������������#

"�� ����� ��������� ��������� ��������� ��� ������ ��� +#1� 0� )1���� �������������������������������� �����#�������� ��������������� ��������������������/��� �>-�������),������� ���� ������������������ ������ ����������� ��������@=���������� ���������� �����������������#����� ������������� "����������� ��� �� ����� ������� ��� �����,#,�4��������������)B������������������ ���� ����������� ��7������"K������������������ ����(��������1#1+�"�"�&7#����������� �������������� ������������������������� ��%�����/�� ���#��)5:5�#�'������ ���"�� ��������������0����� �� ��� "�������� �� ����������������������� �� �������������� ����������� "������� ����������4�������������������� ���#

�������

����������� �� ����%�"���������������"��%��

����� �� ����� ������� ����������������� ���� ���������������������� ���������!"���������������� ������������ ���������������������� �� �����$��������� ���9��/������������ ��� �� ������������������� �9��/���� ���#��)5:,�#���������������� ��������������� ������� ����(������ ������ ������������ � ����0��� ����������L*11����������� �������� ������������0 ����#�������������������0��������� �����������!"������� ������� ���� ��� ���� ������#� %�$������� ��� ���� �� ��� ������� ���� ���� � )11 ��������� ������������������������������ ���$���������������� �������� ������)�0����,������������,�0����>������ ����������*�0����+2�����4� ���������4� �����#���������������� ���� ����� ������������������0��������������� ������$���������������� ������� ���������������� ��������� �����!��3�����)�#������� � (����� �����$��������������� ��������� ����� �� ������(����������������� �� ������� ��������� ������������������ ���#�)555�#�%������/���� ������ ������� ����������������� ��� ��������%�� �������� ��������������������� ���(�� �� ����� ���� �������� ����������� ��������� ������������ �� ����������#����������������� ������� �������������������������������� ����� �� ������� ������������������!"�#����������������� ������� ������������������ �������� ����� �����3�����,���� ����������� ��� �� � ����������� ������ �� ������������������������ �������!#

�������������� ������ ����� ����� ���

������������� ��� ��������������������������������������� ��� ���!�"�

& !�$!������$��$�� ����� ������� ���������������� ��

��������� �������������!��������� ������������ ������������������������������������4� ���������4� ����#�������!������������ ��������/����������8'''#�����*�>+.������ ������������������ ����� ���������!������� ��� ����� �� �������������� ������$���������� ���+D������>D�����/�����$�������������������3�����>#��������� ������ ������������������������ ������ ������ ��� ���� ��������������� ������� �����$���������� �� � ���������������������������������� �������������� ���#��)55-�#������0��� ��� ������ �������� �����)�*+,����������������� ����������� �������������������)*-�*.-�/!�������

��������������������������������������������������� ���������������������������������������� ��������������������

����� ������ ��������

�������� � ���� ������������������������ ��������������������������������� ������������������������������������ ��������� ��������������������� ����������������������������� � ���� ��� ������������������� � ���� ��� ������������������� � ���� ����������������������� � ���� ���� ������������������� � ���� ���� �����������

��������

������������� ���������������� ��������������� ���������������� ���������������� ���������������� ���������������� �� ������������� �������������������������������������

����������� ����� �������������������!���� ����� ��� ���������� ���������� ����� ������������" �!��!����������#�#��������� ������� ����������� �����$�%!�������������"������ ����" �!��!��� ����� � ����� ���� ��� ��������������� �����&�������� ��������'()*+,,-�% . ������$#��++/0#��������������'()*+,�-�% . ������$#��++/0#����������������������������',))�+-�1 �! ������$#��++*0#���������� �����������������������'()*+*+-�%! ��"���������$#��++/�#����� ���� ������ '�233+/++-� 4������ ��� ��$#� �+++0#� ���������� ��������� '(�/)35-����� �� � ��� ��$#� �++60$

*,$3��.

� � � �7������8 7������8 7������8 7������8

+$9��.

)$6��.

9$,��.

*$,��.*$3��.

3$6��.

��������: ��!���.� ������� �� ���!���������������!���� ����� ��� �������� � ����������� ������ ����� �����������$��������� �! "� �!�� : ��!��� .� ��� !�.� � ;���" �!� ��� ������������#� ������� ����� '7� <��������� ���8� <�����0$

)����%���!�������� � ���

������������� ��� ��������������������������������������� ��� ���!�"�

����������1���� � ������������������ ������� ��� ���������� ���!������ �������������������$�� ��� ��� ��������� ��� �������� ���!���� ��� ���'������*59,)90$

�������������� ������ ����� ����� ���

������������� ��� ��������������������������������������� ��� ���!�"�

������� ����'�(��������+#:,#�������������$��������� �����!��������� ����� ������ ���� ����� ��+)�����+.������� ����� ������� ������ ����*1+�*+.�����>->*�>-51#�?����� ������ ����� �������������� ������������ ���������������$�������+D�=������>D��=�������� (������������������(����������������������������)55)�#�7��������� ������������������������� ���������������������$��������� �������������� �������!�������� ��� ��������������),� ��������������������� ��������� ���������� ������������� �� ���������������(��#�?���������������!������ �������������������������� ���0� ������������������������������ ���������� ���3�����*�#�����������������������$���������������

���������������������� ������ ������� �������������� ����������A�--B���� ��� ����4! )������� ��������+5B���� ��� �����4! )������� ������*.B���� ��� ���� ����������� �������� ����*>B���� ��� ��4! ���� ������������������� ����������*1B���� ��� ������ ������� ������ ����������� ������*1B���� ��� ������������ ������ ����� �����������>5B���� ��� �������������#��3�����+�#

���'����� �� ����� ������������������������ ��

�������� ������ �����!�������� ���������������������� ������������(�� �� ���� ������� ����� ���#�������!���������������������� ������� �������� �+#1�/���3�����.�#"�� ��������������0�� ������������ "����(���������!��� ����0������� ������������0����������� � ����� � ������������� �� ��0� �� � ������������ ���� � ���������� ��������#�7���(�������������� �������������� ������� ��� ������ ��������� "�������������0������ ��/��������������� ����� ������� ���������������� ��������������������������#�������!�������������� � (���� ����������� �������(�����3�����.�#

����������

��� ����� ��� ��� ������������� ������������������������������������(������� ����/���� ���������/���� ����7������)55,2�C�����)55*�#�' ������������ �����4! #�4! ����������������������������������������� ������0���� �0��������������� ����� ���������������������� �� ������ ������ ���������������������������� � ������� ������� �����������������������(�������7������)55,��)55+2�(���8��������;�������)55:�#�'�

� * , 69 ) / 5 + �3 �� �*,$39

3

�,$**

*33 933 )33 533 �333 �*33

���������7��� ���!���� � ��� ���!���� �� ��� ����.�����$�� ���"������� ������� �� ��� ��!����� � �!�� ��=�������� � ����'�+5*0#��� ����" � "�� ;�� ��+��� ��� ����� ����$����� ����������.������� ������ � ������.����.���$

:���������.��

)����%���!�������� � ���

������������� ��� ��������������������������������������� ��� ���!�"�

�������������� ������ ����� ����� ��

������������� ��� ��������������������������������������� ��� ���!�"�

��������� ������� ������� �������� �������������� ���� �� �������� �������������������������� �� �������� (�� ��������������� �� ����������������������������7������)55+�#���� ������� ���������������������� ����������������������������� �������������� ����������������������������������� ������(�������������0�������� ���������#�&(��)11����� ������� ������(���������� �������(������������������������ ��������� ������ ���������������� �����������(���������7������)55+�����(���8��������;������)55:�#������������ �������� ������ ������������ �� ����0� ��������,5���������������� � (������ ������� �������� �����������!��� ���������=��������)55-�#�%������ ����#�#��@�3)���! +��%"E,�����@& )����(������������ �� ��� ������������4! ������ ����������(������������������=��������)55)��)55*�#�9����(��� � ���������������������� �� ����������� ������� ������ �������� ������������� ������#�9����� ����������������������������� ����� ������� ����������� ����������������� ���������� ������������ ��

������� �� ���� � � �� �!�� �� ��� ������������������ ���!������ ������������������ �� �'�.��0�" �!��!��� ����� � ��������� �� �� �!������� ����� �����&������� ��#� �������� '()*+,,-�% . � ��� ��$#�++/0-��������#���������'()*+,�-�% . �����$#� �++/0-� ���������������� �������������',))�+-�1 �! ������$#��++*0#�������������� ��������#� ������� '()*+*+-%! ��"���� ��� ��$#� �++/0#� ����� ���#��������'�233+/++-�4�����������$#��+++0#���������� ����#� >>������ '(�/)35-���� �� ������$#��++60$

)����%���!�������� � ��

������������� ��� ��������������������������������������� ��� ���!�"�

���������1 ��!���.� ������� �� ������ ����������������>����� $�?� ��� �!��� ��!������#������������� "� �@A���� ��'�����#�� �� �0� ��@A���� ���������������" �!�� ������������'�����*���0$

������������� ��������������(������������� ��������������������������������������� �#����������������������������������� ����� ������������ ������� ������� ���������������������� !������� �������� "�������� ������ �� �������������� ������;�������� ��#��)55,2�7���������� ���#��)55,2������� ���#��)55-2�4���������;���/���)55:�#�'���� ������� ���������������������������������� ������� �����!���%������ ���#��)55-�#������� ������� �� ������������� �� ������������������� ���������� ���� �� �������� ������� ���������������������� ���#��)555�#��������� �������� ����� � �� ��������������������� ����� �������0����������$������ ����?%����� �������� �AJJ���#�����#��#�������(������ ��������������� ����� ���� ���� ������� � (����������� ���������� ���������������� ����������#����������� ��� � �������������� � (������ ������� ��������������������� ����������������� � ��� ������ ����� �)>����� ����� ���?%���� ������������������������!�#������������������������� �������� �������!������������ ������/������!�3#�'����� ���� ������ ������� ������(���������� �������� �����������4! )��������4! ,��������������4! )����� ������������ ���#��)55-�#����� ����������������� �� ������� ���� ����� �� �� �����������4! �������� ����� ���������������#

=����� �'�3�µ�B��0

��� .���� �'�3�µ�B��0

��� ��� �'6�µ�B��0

���! ���>����'�3�µ�B��0

����� �; ���'3$*�µ�B��0

����� �!�� �'*6�µ�0

A��� � �'63�µ�B��0

4�! � ���.� � ���'6�µ�B��0

������� �'63�µ�B��0

� � �; ���'�3�µ�B��0

� �� �

��

�3

+

5

/

)

6

9

,

*

�������������� ������ ����� ����� ���

������������� ��� ��������������������������������������� ��� ���!�"�

9����(����������� �������������������� ���� ������������� ��������� ������� ��������������������!�����������!�#����������������������������� �� ������4! )��������� ������#������� � (�������� ���� �������������������������� ������������� ������ ������� ������������#�������!���������������������M��������� �N�4! ��/����� ��� ��),� ���������������������� ��������� ���������� ��#�"�� �������� ��0����� ������ �� ��� �� � �����!�����������������(����������� ���������� ��������� ������������� ���� ��������������������� � ������� �� ��0� �������� ���������#���� ������� ����������������������������� ������������������� ��� �� �� ������������������������ ��������� �0��#��������� ������ ����� ���������������� ������������� ���������������������������� ������������� ����������J�������� � ���� �� ������������ ����� �� ���������������������#����������� � (���� ����������� ���������(����� ������� ���������� ������������������������� � ���#�'������ ��� �� ���������� ������� ���������� ���������0 �� �������� ����� �� ��#���������/���������������������� (����������(���������� � (��0����������� ������������� ������� � ��#�'��������������� ������� �������������� ������������� �� ��������� ��� �� � ������������������� ������#�3��� ����������������� �� ��� �� � ����!"�� �� ������������� ����������������� � ����������������� ( ������� ���� ���! +�������������� �����������!���%������ ���#��)55-�#��������������������������"�� ��������������0����� �� ����(�� �� "���0�����������������)1���������������� ���������0�������������� ���#��)555�#�'����� �����0����������� ������4! )��������� ��������������������������������� ����� �� ����� ����������� �����������C@),)1)5�������������������������������� ���#��)55-�#����� ������� �� �/��� ��� �������� �� �� ������� ������� ������� ������������������������������������������#���������� ��4! �������������� ���� � ��� ������� �������(�����������#

�� ����������(���������(���� ��������� ������� ������4! �������� ���������������� �������������� ����������� ���������������������������� ��#����������� �������� ������� ���� ���/�� �� ������ ���������������0�������� ������� ������������������������������ �������������������� ���������������� ������������� � (���� ��������������������������� �� ������� �� ��������������� ���� ���������������������������� �� �#�������� ��� ���������� ������� ������������������� ����������������������� ���� ��� ��������� ������ ������ ��� ������ ������� �� ������� �0�������� ���� �� �������������������� ����������� ����������4! ����������#

�������������

9�� ���/�3��?%������?%������"�$�������������'�=?��F"'!&��������(����������������� ������!�#�!�(�������������� ����������� ���������� #

����������

���������� � �������� ������ � ������������� � ��������� ��� ����� ��������������������� ����������������������� ������� ����������������� ��������������� �������������� !��"�

���������� �������� ���� ����� ����������� �������#����������������$!�������%������� ����&����� ����'()�&�����%���������� ������������ ���� *� ��������������������� ������������� ����*� �������������� ���������������������+"!��+

!���"��� � �������(���������������*������������ ������������%����������������,�������%� �%�������������-����������������������������������� ���������������� ���!��� ������!������.���/�0'����1��2�/�3�/���������� �4�22��/�5�,�6��2/�56/�70'/�����!��

)����%���!�������� � ���

������������� ��� ��������������������������������������� ��� ���!�"�

!��#��$ ������� ��%�� ��������� ��� ������ �������������%���������������*���������� ���������������"����"�!� �

!��#��$ ������� ��%�� �����"�8������������&����������*����*������� �����%����������������� ���������������#"��� �!���

���������� ��&��� � ��������'��#�� ! ����� �'����� �%��������������� ������ �����%������������%�������������������� *�������������������������������$���������%������� ���������������&'&�����!���

(����%#��� � ������##��� � �������&��� ����(���� � � ��������(���� � �������-�� ������������������������������*� ���������!���������������������������������������������(�����������+!��

�������(�� � �����)�������������� � � �����+�'������%*!������������� ������������������������� �����,� �!�*���������������������� !���������������������������������������)���������� ��)����������� !���

����������� ��(��(��� � �)������������� � � �)������ � * �!��#��$ ������������(�� � ����9��� �����%������������������������������������� �������� �'()!&�����%���������������������������(����(������&����"�9!"��

��"���������� ������� ��%�� �����9�$��� ������������*��������*�����'1$����������*����(������������9!�" ������ � ��������+���� � �����+�'������%� ��������%��� ����������������������������%� �����������,

����/������& ������������+�%���� ����,����&����"9!��+������� � �)������'���%�� �,������� * ��(������ � ������� � ����+���� � �����"�

� � ������������ * �����9��-��������� �������������������������� � ������-������������������������"!����

������ � ���( ��(�� � �,������� * ������* ���&���$ � ���������"��� � � ����9&$���� ������&��,���� ���%�������������&� ��*�������%�������������� ������ ���%�%���������������������� � ����������������-������ ��������� ����������"+�!"�"

$(������ � * ��%"&���� ������&���� $ ��������� ����"���� ������ $ ������%"&����� ������$����/�������2���)!% *���������/����������� �����%��������������������������,������������ �-���������� ���#������!�"�

���������� � �����������- �������1����������*������ �����%���������������������&*������� �����%������������������+�%������� ��&'��������!�����

���������� � ����"���� � ��"&������� ) �������. � �����������- ����� �8���������� *������������ �����%�������������������+�%��(������&.���+9!�"�

��(������ � ��� ���� � ���(������ �����&�� � ���(��"����� �����.�����! ��������� �����%��������������/��� ���������%�����������������&*���� ���������������%�������� �%���������������� ��������%����������������������&���� !���

�������� �������'1$���������������������������%��������������������+�%�������������#���9!����������� ����� �(���'1$���������� ���%� �����������#&�����!�������/&0�����1 �������������� � �����9��� ��� �������������������� �������������������%��!0��

����������/�������.���"�!�"��� ���$ ����99��������������������������&��������������������������������������� ��&������������%�

(�������.����!���������� * �*����� � �������� $ �*�� ����� �����$������� �������3�������������� ������� �����

������������������������������������'-40����������/�������#��� ��!� �"����"#��'����� ������� ��%�� �����9�'��������� ���&*��� �����%����������������������������������%������

�����������������*��������� ��������� ���� ������������*������ �������������%������������)��� ����1�����"'�����!�"�

�%"&����� ���������� � �)��'���&��� � �����1&������ � ������4��������� ���������������������������������������������������� ����������������*����������� ������%�����������������2������� ���3�������������"�� 9�! ��

������ ����������������� � �������'����� ����������������� �*��%������*������&�������������������������-���������������"���+ !���

*�'���� �����"��� �����%���������������������&�������������������������������1���������������������.�����!���*���(�� 1 ������&��/�� � �������$��������%����������������������������(����(������&�������!��"������� �������������� �������-�����������������������'1$�������������%��������1������� �������

����)���������+���#����+�!�������%��� ��(�"&��� ���'����, �1��������� ���%��%�� � ���������1 �������'����� �'()!

&�����%�������������������������� ��������� �����%���������������������*�������%��������%���)�������� �������� �������0�%����������������'�������!����

���&��� �2��&�(��� ����&��%���� ����&���'��� ����&������� ������%"&��� �����!�//%�1 ������'� �����*����1������������%����������4������ ����� ������������������������� �������������� ����)!% *��������������������������'��9��!9��

�������������� ������ ����� ����� ���

������������� ��� ��������������������������������������� ��� ���!�"�

������� � ���������1 ����"����� � ���3�� ����������� ���������� ��������� ��������� ���������(�� � �����9�-�� ������������������������������� ������� �!������������������1!�����������������������������& ��������,�����������,���� ��2��������� ��������������� ��������������!���

����"��+��� ���/���� � ��������* � ���"����(�� � �����!% ���� � � ���� ��(���%������������������������������%��(����������"�!���

��3�� � �����(��� � ������ ������� � ����� �3��������������������������������� ������� ������ �������������� ��������.���!�

���������� ������"&�$ � �������������1 �����������������������5���/�������������������������$� ��0����%�:��&���.�&������*�)����/�$� ��0����%�:��&��/�56/�70'

1&���'����� � �������� ! ����������%(�� * �����9�$ ����%�������������������������$���43���������������� �� ���%�����������%������������� ���������� �����%���������������������(����&������!��

1����� ! �������� ! ����������%(�� * �����9�8������������%��� ��� �����%�����������! �2����������������������� � �������������������� ��%���(����&������!��

+��)���� � ������������ � �������(���'1$����� *������ �����%������������������������%����������� ����������������'�����!��

)�(��!���"&��� �����"&���� � ����,((��� � � ����"��� ��� ��������������������%� ����������� ���� ������������%��1����������������������!"++

)�(��!���"&��� ��������� �-�/��+����- �*�#��0�&�%�� ���3�� � �����������(�� ������'������%� ����%��������������������%��������%��������������'�����!���

�������� $ ���������� ��%�'�"��� � ���������� � �������4������ *��� �������;��������������� ���!����&���!��&���������'()��*������/��*����/�2�����������������'()!��;�����%����*������������������� �������&�����%��� ��0��6�-������" !� �

�&����1 � ������� � �����!�'(��� � �������$ ����� /��� � ��/������� ��� ����������������������&�������������%� ����%����������������������������+�%���������!"+�