immunodeterminazione di un traslocatore di antociani affine alla bilitranslocasi in bacche di vitis...

IMMUNODETERMINAZIONE DI UN TRASLOCATOREDI ANTOCIANI AFFINE ALLA BILITRANSLOCASIIN BACCHE DI Vitis vinifera L.

Enrico BRAIDOT1, Alberto BERTOLINI1, Elisa PETRUSSA1, Carlo PERESSON1, EugenioPITTIONI2, Sabina PASSAMONTI3, Francesco MACRÌ1, Angelo VIANELLO11 Dip.to di Biologia Applicata alla Difesa delle Piante, Università di Udine, Udine, I.

[email protected] Dip.to di Scienze Animali, Università di Udine, Udine, I.3 Dip.to di Biochimica Biofisica e Chimica delle Macromolecole, Università di Trieste, Trieste, I.

Parole chiave: antocianine, bilitranslocasi, trasportatore, bacca, Merlot, Tocai friulanoKey words: anthocyanin, bilitranslocase, carrier, berry, Merlot, Tocai friulano

1. INTRODUZIONE

La bacca dell’uva (Vitis vinifera L.) è un frutto non climaterico la cui crescita involume segue un andamento rappresentabile da una curva a doppia sigmoide (Coombe,1992; Boss et al., 1996). Dopo una prima fase caratterizzata da una moltiplicazionecellulare, la crescita si arresta in coincidenza dell’invaiatura, per poi riprenderea l l ’ i n i z i o della maturazione principalmente a seguito di una distensione cellulare. Apartire dall’invaiatura, lo sviluppo della bacca è contraddistinto anche da un complessodi modificazioni, tra cui l’aumento della sofficità del mesocarpo (polpa), l ’ a c c u m u l odi zuccheri, la diminuzione del contenuto degli acidi organici e, nelle cultivar a baccanera, la progressiva colorazione dell’epicarpo (Famiani et al., 2000). Nel corso dellosviluppo della bacca, inoltre, vengono biosintetizzati ed accumulati composti derivantidal metabolismo secondario dei flavonoidi (antocianine, proantocianidine o t a n n i n icondensati e flavonoli) a partire dalla fenilalanina lungo la via dei fenilpropanoidi( Wi n k e l - S h i r l e y, 2001; Bogs et al., 2006). Nelle uve nere, in particolare, dall’invaiaturavi è un progressivo aumento nella sintesi di antocianine, il cui accumulo avvienep r e v a l e n t e m e n t e nell’epicarpo, determinandone così la colorazione a seguito di unprocesso biosintetico finemente regolato a livello genetico (Boss et al., 1996; Bogset al., 2006).

L’accumulo dei composti derivati dalla via biosintetica dei flavonoidi comportal ’ e s i s t e n z a di un efficiente sistema di trasporto e di compartimentazione sia a livello ditessuto (zone periferiche e tegumenti), sia cellulare (parete cellulare e vacuolo). A taleproposito, Grötewold (2004) ha suggerito che, a partire dall’apparato di Golgi, id i v e r s i antociani siano veicolati nei siti d’accumulo grazie ad un complesso sistema divescicole, al cui interno tali molecole sono accumulate mediante l’azione di trasportatoriQUAD. VITIC. ENOL. UNIV. TORINO, 29, 2007

Quad. 29 - 00) Interno parte 2 ok 2-07-2007 16:21 Pagina 195

specifici. La natura di tali trasportatori resta ancora elusiva (Martinoia et al., 2007);t u t t a v i a sono stati finora ipotizzati due differenti meccanismi di trasporto attivo. Ilprimo è una modalità di tipo primario mediata dalle ABC pro t e i n s (AT P b i n d i n gc a s s e t t e) , famiglia di trasportatori caratterizzati da un comune dominio di legame perl ’ AT P. Questi trasportatori attivano prevalentemente il caricamento di flavonoidig l i c o s i l a t i e agliconi xenobiotici (Klein et al., 1996; Frangne et al., 2002; Goodmanet al., 2004). Il secondo meccanismo sfrutta un trasporto attivo secondario associato adun antiporto (a n t i p o rt e r), come avviene nel caso del caricamento vacuolare di flavonoidiglucosidici (Klein et al., 1996), oppure ad un a n t i p o rt e r del tipo MATE (m u l t i d ru gand toxic efflux), come evidenziato in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh daDebeaujon e coll. (2001).

La notevole variabilità strutturale dei flavonoidi e la molteplicità dei meccanismiproposti per spiegare l’accumulo intracellulare consentono di ipotizzare la presenzac o n t e m p o r a n e a di diversi trasportatori in funzione dello stadio fenologico, del tessutoe della specie vegetale. Recentemente, in plasmalemma e tonoplasto purificati di petalidi garofano, è stata evidenziata la presenza di una proteina omologa alla bilitranslocasi( B LT) di fegato di ratto, in grado di reagire con anticorpi anti-BLT e di mediare untrasporto elettrogenico della bromosulfaleina (Passamonti et al., 2005). La BLT p r e s e n t enei mammiferi svolge un trasporto attivo secondario non solo di cataboliti del plasmasanguigno, ma anche di antocianine, inclusi agliconi e i loro derivati mono e di-glicosilati(Passamonti et al., 2002; 2003). Studi cinetici hanno evidenziato similitudini alivello del trasporto tra la BLT presente nei mammiferi e l’omologo vegetale, sebbenequest’ultimo denoti una differente affinità per i vari substrati, indicando un suoi p o t e t i c o ruolo nel trasporto di membrana di metaboliti secondari (Passamonti et al.,2005). Scopo di questo lavoro era di evidenziare la presenza di una proteina omologaalla BLT nella bacca delle cultivar di V. vinifera ‘ M e r l o t ’ e ‘Tocai friulano’, analizzandoin modo particolare la sua espressione nella buccia (epicarpo) e nella polpa (mesocarpo)d u r a n t e diversi stadi fenologici.

2. MATERIALI E METODI

2.1. Materiale vegetale

Le bacche d’uva (Vitis vinifera L.) di ‘Merlot’ e ‘Tocai friulano’ sono state raccoltedurante le stagioni 2005 e 2006 nell’azienda vitivinicola “Villanova” di Farrad’Isonzo (GO), la campionatura delle bacche è stata effettuata durante vari stadidi sviluppo (1-27 giorni dopo l’antesi; 2- in pre-invaiatura; 3- all’invaiatura; 4- ainizio maturazione; 4 WS-a inizio maturazione in piante sottoposte a stress idrico;5- a piena maturazione; 6 -alla raccolta) ed immediatamente congelate e conservatea -80 °C.

E. BRAIDOT, A. BERTOLINI, E. PETRUSSA, C. PERESSON, E. PITTIONI,S. PASSAMONTI, F. MACRÌ, A. VIANELLO

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2.2. Isolamento di microsomi da buccia e polpa

Circa 30 g di materiale (buccia o polpa privata di semi) sono stati omogeneizzaticon l’utilizzo di un mixer Ultra-turrax in un tampone contenente 0,4 M saccarosio, 20m M Hepes-Tris (pH 7,6), 5 mM EDTA, 1 mM DTE e 1 mM PMSF, a 4 °C.L’omogenato è stato filtrato attraverso una garza di nylon (100 µm), riportato ad unvalore finale di pH pari a 6,5 e centrifugato a 2.800 rpm per 5 minuti. Il surnatante èstato ricentrifugato a 13.000 rpm per 12 minuti. Il nuovo surnatante così ottenuto èstato ultracentrifugato a 100.000 rpm per 36 minuti; il pellet è stato risospeso in untampone contenente 0,25 M saccarosio, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) e nuovamenteultracentrifugato. Le membrane microsomali ottenute sono state risospese in 0,25 Msaccarosio e 20 mM Tris-HCl (pH 7,5).

2.3. Produzione dell’anticorpo

L’anticorpo anti-BLT è stato ottenuto iniettando il peptide EFTYQLT S S P T C ,c o r r i s p o n d e n t e alla sequenza 235-246 della struttura primaria della bilitranslocasi dimammifero, come descritto da Passamonti e coll. (2005).

2.4. Immunolocalizzazione

Le proteine microsomali (circa 20 µg) sono state separate attraverso una elettroforesidenaturante in gel di poliacrilammide (SDS/PAGE) al 12 %. L’immunolocalizzazione èstata realizzata seguendo le procedure descritte da Passamonti e coll. (2005). L’ a n t i c o r p oprimario anti-BLT è stato utilizzato ad una concentrazione pari a 1,5-3 µg IgG · mL- 1 e dincubato a 4 °C per tutta la notte; la reazione immunologica è stata sviluppata attraversola reazione della fosfatasi alcalina coniugata ad un anticorpo anti-IgG di coniglio.

L’entità della reazione incrociata è stata valutata mediante analisi densitometrica,effettuata sulle membrane di nitrocellulosa con l’ausilio del software Quantity Onedella Biorad.

2.5. Analisi immunoistochimica in fluorescenza

Le bacche d’uva prelevate allo stadio di raccolta sono state incubate in una soluzionefissante (50 % etanolo, 35 % acqua, 10 % formaldeide e 5 % acido acetico v/v/v/v) inassenza d’aria per 4 ore; la soluzione è stata rinnovata ad intervalli di un’ora. I tessuticosì fissati sono stati conservati in frigo a 4 °C, successivamente lavati in una soluzionecontenente 63 % (v/v) di etanolo e quindi sezionati al criomicrotomo. Le sezioni

TRASLOCATORE DI ANTOCIANI IN BACCHE DI Vitis vinifera L. 197


o t t e n u t e sono state incubate in un tampone fosfato (NaCl/Pi, pH 7,4) per 10 minuti equindi saturate in una soluzione contenente latte scremato, a 37 °C per 45 minuti. Inseguito le sezioni sono state incubate con l’anticorpo primario anti-BLT (3,3 IgG · mL- 1)a 37 °C per 90 minuti. Le sezioni testimoni sono state incubate con il siero preimmune. Altermine dell’incubazione le sezioni sono state lavate per 3 volte con una soluzionec o n t e n e n t e 1 % (v/v) Tween in NaCl/Pi ed in seguito poste ad incubare per un’ora conl’anticorpo secondario coniugato con FITC. Al termine di tale processo, i preparatisono stati lavati per tre volte in 1 % (v/v) Tween in NaCl/Pi ed infine analizzati almicroscopio ottico mediante luce UV. Le immagini ottenute sono state trattate medianteil software ImageJ per togliere il rumore di fondo.

2.6. Analisi immunoistochimica nel visibile

Le bacche d’uva campionate agli stadi di pre-invaiatura, inizio maturazione e raccoltasono state fissate utilizzando un tampone fosfato (pH 7,2) contenente 20 µg mL-1 d if o r m a l d e i d e e 7,5 µg mL-1 di saccarosio per 24 ore a 25 °C (Walker et al., 1997). Lebacche sono state disidratate attraverso diversi passaggi in soluzioni di etanolo ed infineincluse in paraffina. I blocchetti di paraffina contenenti le bacche sono stati poi tagliatial microtomo con uno spessore di 15 µm e fatti aderire su vetrini da microscopio trattaticon polilisina. Dopo la rimozione della paraffina le sezioni sono state incubate in unasoluzione tampone salina (NaCl/Pi, pH 7,4) per 10 minuti e successivamente saturatea 37 °C per 45 minuti in una soluzione contenente latte scremato. In seguito le sezionisono state incubate con l’anticorpo primario anti-BLT (3,3 IgG mL-1) a 37 °C per 90minuti. Le sezioni testimone sono state incubate con il siero preimmune. Al terminedell’incubazione le sezioni sono state lavate per 3 volte con una soluzione contenente1 % (v/v) Tween in NaCl/Pi ed in seguito poste ad incubare per un’ora con fosfatasialcalina coniugata ad un anticorpo anti-IgG di coniglio. Dopo l’incubazione le sezionisono state lavate per 3 volte con una soluzione contenente 1 % (v/v) Tween in NaCl/Pi eulteriormente incubate a 25 °C per 30 minuti in una soluzione composta da 340 µg mL- 1

N B T, 50 µg mL- 1 B C I P, 100 mM NaCl e 5 mM MgCl2 in 100 mM Tris-HCl (pH 9,5).Le sezioni sono state quindi incubate con la soluzione Aquatex ed analizzate alm i c r o s c o p i o con luce visibile.

3. RISULTATI

Al fine di evidenziare la presenza di un trasportatore simile alla bilitranslocasi dimammifero, è stata effettuata un’indagine immunoistochimica su sezioni di bacca di viteprelevate in corrispondenza di diversi stadi fenologici. La reazione incrociata è stataottenuta utilizzando un anticorpo policlonale prodotto contro la sequenza 235–246


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della bilitranslocasi (BLT) di fegato di mammifero. La presenza di un cromoforofluorescente (FITC), coniugato con l’anticorpo secondario, ha consentito di evidenziarealla luce UV la presenza della proteina allo studio in sezioni di bacche mature di‘Merlot’. In particolare la proteina in esame risulta individuabile a livello dei tessutitegumentali (epicarpo) che circondano la bacca (fig. 1A). L’eventuale presenza di reazioniaspecifiche è stata esclusa utilizzando del siero pre-immune al posto dell’anticorpoa n t i - B LT. Come preventivato la prova non ha manifestato pressoché alcuna fluorescenza(fig. 1B), fatta eccezione per un blando segnale legato alla presenza di cere nello strato diparete cutinizzato a confronto con la medesima sezione di bacca osservata alla lucevisibile (fig. 1C).


Fig. 1 - Analisi mediante immunofluorescenza di un ipotetico trasportatore di antociani in bacche di V. vinifera (‘Merlot’) allo stadio di raccolta. A: sezione di bacca fissata e sottoposta a reazione con un anticorpo anti-BLT. B: sezione sottoposta a reazione con siero preimmune. C: sezione visualizzataalla luce visibile. La barra dimensionale = 100 µm.


Queste prime osservazioni sono state pienamente confermate adottando una diversametodica di rilevamento della reazione anticorpale. Utilizzando, infatti, la colorazioneprodotta dalla fosfatasi alcalina coniugata con l’anticorpo secondario, si è verificata lalocalizzazione del traslocatore allo studio non solo in corrispondenza della maturazione,


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Fig. 2 - Analisi immunoistochimica di un ipotetico trasportatore di antociani in bacche di V.vinifera (‘Merlot’), durante alcune fasi del ciclo fenologico. I frutti sono stati raccolti durante il 2° (A e B), 4° (C e D) e 6° (E e F) stadio. Le immagini A, C ed E si riferiscono a sezioni di bacca sottoposte a reazione con un anticorpo anti-BLT, v i s u a l i z z a t a alla luce visibile. Le immagini B, D e F rappresentano i testimoni negativi.La barra dimensionale = 100 µm


ma anche in stadi precedenti. Le sezioni denotano un’evidente reazione anticorpale,come atteso, a livello dei tessuti tegumentali maturi (fig. 2E), sede di accumulo deip i g m e n t i , nella polpa e a livello dei tessuti di conduzione, a partire dallo stadio di iniziomaturazione (fig. 2C). In particolare, è possibile notare che esiste una più marcatacolorazione per quanto riguarda l’epidermide delle bacche alla raccolta. Invece neitessuti di conduzione che attraversano la polpa la reazione appare più evidente inc o r r i s p o n d e n z a della fase più precoce. Solo ad uno stadio di sviluppo ancora piùimmaturo (pre-invaiatura) si denota l’assenza della proteina, razionalizzabile con lamancanza di pigmentazione della bacca (fig. 2A). I testimoni negativi (figg. 2B, 2D e2F) escludono nuovamente la presenza di reazioni aspecifiche.


Fig. 3 - Analisi mediante immunofluorescenza di un ipotetico trasportatore di antociani in bacche di V. vinifera (‘Tocai friulano’) allo stadio di raccolta. A: sezione di bacca fissata e sottoposta a reazione con un a n t i c o r p o anti-BLT. B: sezione sottoposta a reazione con siero preimmune. C: sezionevisualizzata alla luce visibile. La barra dimensionale = 100 µm.


Analoga indagine è stata condotta nell’anno successivo su di una varietà a bucciabianca (‘Tocai friulano’), per verificare l’eventuale presenza del traslocatore anche inmateriale in cui l’assenza di antocianine comporta la mancanza di pigmentazione. Lareazione immunoistochimica è positiva anche su sezioni di bacche di ‘Tocai friulano’prelevate in corrispondenza delle stesse fasi fenologiche già campionate sulla cv‘Merlot’. In particolare, l’impiego di un anticorpo secondario coniugato con la FITCevidenzia nuovamente una reazione incrociata con l’anticorpo anti-bilitranslocasi insezioni sottili effettuate su bacche prelevate allo stadio di raccolta (fig. 3). Il segnalefluorescente rilevabile alla luce UV è associato allo strato tegumentale della baccacome già verificato nella cv ‘Merlot’.

Tali dati sono supportati anche dall’analisi immunoistochimica effettuata utilizzandoun anticorpo secondario legato alla fosfatasi alcalina. Seguendo tale metodica, la reazioneincrociata dell’ipotetico trasportatore con l’anticorpo anti-BLT è evidenziabile allaluce visibile con una colorazione brunastra del preparato. Viene così confermata (fig. 4)la presenza dell’ipotetico traslocatore in bacche della cv ‘Tocai friulano’ non solo alivello dei tessuti epidermici, ma anche in corrispondenza dei tessuti di conduzionedella polpa, ove i tubi cribrosi esibiscono una chiara reazione anticorpale.

Infine una valutazione quantitativa del grado d’espressione del trasportatore è stataottenuta mediante saggi immunochimici, effettuati su estratti microsomali ottenuti daitegumenti (fig. 5A) e dalla polpa di bacche della cv ‘Merlot’ (fig. 5B), sempre campionatedurante le varie fasi fenologiche. La reazione anticorpale avviene a livello di una bandache corrisponde ad un peso molecolare di circa 31 kDa. Inoltre compare una banda conun peso molecolare pari a circa 20 kDa, la cui presenza è più marcata nei campioniottenuti dalle polpe rispetto a quelli delle bucce, ove è rilevabile solo in corrispondenzadegli ultimi stadi.

L’analisi densitometrica della colorazione sulla membrana di nitrocellulosa,e ffettuata in corrispondenza della proteina di 31 kDa, consente di stimare la suaconcentrazione sulla base dell’area e dell’intensità della macchia relativa alla reazioneanticorpale. Da questi risultati è possibile tracciare un profilo quantitativo del trasportatorenel corso della maturazione, sia a livello dei tessuti epidermici che della polpa (fig. 5C).Appare chiaro che nelle fasi precedenti all’invaiatura i microsomi separati da bucce eda polpa non contengono il trasportatore, la cui comparsa è concomitante all’invaiatura,ovvero alla comparsa della colorazione nell’epidermide. A differenza, però, di quantoaccade sui campioni provenienti dai tegumenti, ove il segnale rilevabile è molto piùmarcato e denota un continuo aumento fino alla raccolta, il picco massimo misuratoper gli estratti ottenuti da polpa si attesta in corrispondenza delle fasi di piena invaiaturae maturazione, per poi calare alla raccolta (fig. 5C).

Infine è stato effettuato un ulteriore campionamento in corrispondenza del 4° stadiosu di un filare sottoposto a stress idrico, instaurato circa un mese prima mediantecopertura della chioma. È già noto dalla letteratura (Do, Cormier, 1990) che la viterisponde alla carenza idrica anticipando la maturazione e conseguentemente anche la


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pigmentazione delle bacche. Questi effetti macroscopici appaiono associati, a livellocellulare, ad un incremento della sintesi del traslocatore, rilevabile sui campioni derivatidalle bucce e su quelli provenienti dalle polpe.

In parallelo la medesima analisi immunologica è stata condotta anche su estrattimicrosomali ottenuti da bacche della cv ‘Tocai friulano’, confermando quanto evidenziato


Fig. 4 - Analisi immunoistochimica di un ipotetico trasportatore di antociani in bacche di V.vinifera (‘Tocai friulano’), durante alcune fasi del ciclo fenologico. I frutti sono stati raccolti durante il 2° (A e B), 4° (C e D) e 6° (E e F) stadio. Le immagini A, C ed E s iriferiscono a sezioni di bacca sottoposte a reazione con un anticorpo anti-BLT, visualizzata alla luce visibile. Le immagini B, D e F rappresentano i testimoni negativi.La barra dimensionale = 100 µm



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Fig. 5 - Immunolocalizzazione delle proteine ottenute da microsomi isolati da tessuti di bacche diV. v i n i f e r a (‘Merlot’) durante diverse fasi del ciclo fenologico. A: i m m u n o l o c a l i z z a z i o n edelle bucce. B: immunolocalizzazione delle polpe. C: analisi densitometrica assistita da computer.Il valore accanto ad A e B rappresenta il peso molecolare della proteina individuata.. I periodi di campionamento (1°, 2°,3°,4°, 4° WS, 5°, 6°) sono descritti in materiale e metodi.



Fig. 6 - Immunolocalizzazione delle proteine ottenute da microsomi isolati da tessuti di bacche di V. v i n i f e r a ( ‘ Tocai friulano’) durante diverse fasi del ciclo fenologico. A: immunolocalizzazione delle bucce. B: immunolocalizzazione delle polpe. C: analisidensitometrica assistita da computer.Il valore accanto ad A e B rappresenta il peso molecolare della proteina individuata.. I periodi di campionamento (1°, 2°,3°,4°, 4° WS, 5°, 6°) sono descritti in materiale e metodi.


in precedenza con le reazioni anticorpali in situ (fig. 6). A seguito di un’elettroforesidenaturante e di una successiva immunolocalizzazione, è possibile osservare unar e a z i o n e anticorpale in corrispondenza dei due ultimi prelievi effettuati (maturazione eraccolta) sia nei tessuti tegumentali (fig. 6A), sia nella polpa (fig. 6B). L’entità delsegnale è chiaramente ridotta rispetto a quanto evidenziato nella cultivar a bucciapigmentata e non denota alcuna differenza di andamento tra la polpa ed i tessutit e g u m e n t a l i , come riscontrabile dall’analisi densitometrica effettuata sulle m e m b r a n edi nitrocellulosa. Il picco d’espressione del trasportatore, infatti, è associato allo stadiodi raccolta per entrambi i tessuti analizzati (fig. 6C).

4. DISCUSSIONE

È già stato ricordato in precedenza che esistono diverse modalità esplicative perdescrivere il trasporto intracellulare dei flavonoidi, ed in questo specifico caso degliantociani (Grötewold, 2004). C’è un’ampia letteratura inerente alle proteine coinvoltein questo specifico fenomeno, a testimonianza del fatto che il meccanismo dicompartimentazione è piuttosto complesso e raffinato. Inoltre la molteplicità dimeccanismi proposti probabilmente sottintende la presenza di più modalità di trasporto,variamente attivate secondo la specie o, all’interno della stessa, diversamente espresse indipendenza del tipo di tessuto, dello stadio di sviluppo e della struttura dell’antociano.

Allo stato delle attuali conoscenze non si può nemmeno escludere la presenzasimultanea di più sistemi di trasporto, vicarianti tra loro (Martinoia et al., 2007). Alcunidi questi comportano un trasporto attivo di tipo primario, in cui la formazione di gradientielettrochimici da parte di enzimi ATP-dipendenti è direttamente associata allat r a s l o c a z i o n e degli antociani (Klein et al., 1996; Frangne et al., 2002; Goodman et al.,2004). In altri casi il trasporto degli antociani è invece definito trasporto attivosecondario, qualora sia richiesta l’attivazione di pompe protoniche per creare ungradiente elettrochimico, sfruttato successivamente per accumulare i pigmentia l l ’ i n t e r n o del vacuolo o a livello di parete cellulare, grazie all’azione di una proteinadi membrana (Debeaujon et al., 2001).

Studi condotti su cellule epatiche di ratto e poi ripetuti su vescicole di plasmalemmae tonoplasto di Dianthus caryophyllus L. (Passamonti et al., 2005), hanno confermatol’esistenza di un trasportatore analogo sia nel regno animale sia in quello vegetale. Leanalogie sono di tipo biochimico, poiché le proteine denotano lo stesso peso molecolaree cinetiche di trasporto analoghe, nonché di tipo immunochimico, vista la reazioneincrociata con entrambi gli anticorpi costruiti contro due sequenze dell’enzima dimammifero.

Ulteriori sviluppi sono stati ora raggiunti attraverso studi più specifici su di unas p e c i e quale la vite, caratterizzata da un’elevata espressione nel frutto delle viem e t a b o l i c h e di sintesi per i flavonoidi (Coombe, 1992). Si è voluto perciò non solo


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individuare il trasportatore in diversi tessuti della bacca di vite, ma si è pure estesal ’ i n d a g i n e , ponendo a confronto una cultivar a bacca pigmentata (‘Merlot’) con una abacca bianca (‘Tocai friulano’).

I dati ottenuti portano a concludere che, analogamente a quanto già dimostrato per ilgarofano, anche la vite possiede una proteina affine alla BLT di fegato di ratto, sebbenecon diverso peso molecolare apparente. Tale proteina può essere riconosciuta, tramitereazione incrociata, dall’anticorpo prodotto contro l’enzima di mammifero. Il traslocatoreè localizzato, com’era lecito attendersi, nei tessuti epidermici delle bacche ed anche alivello dei tessuti di conduzione nella polpa. Tali evidenze suggeriscono un ruolo ancorapiù ampio per la proteina allo studio, non solo quale trasportatore finale degli antocianiverso i siti d’accumulo della buccia, ma anche quale traslocatore di precursori degliantociani sintetizzati nei tessuti parenchimatici del mesocarpo.

L’ipotesi è confermata dal diverso andamento dell’espressione della proteina,r i l e v a t o nel corso del ciclo di maturazione, nei campioni di polpa rispetto a quelli deitegumenti. Questi ultimi, infatti, mostrano un continuo incremento del traslocatoredurante i vari stadi fenologici, fenomeno che culmina alla raccolta in corrispondenzadel massimo accumulo degli antociani. Al contrario, nei campioni di polpa il piccod ’ e s p r e s s i o n e si raggiunge nello stadio di piena invaiatura, probabilmente perché inquesta fase è massima la biosintesi dei precursori metabolici dei pigmenti. In questitessuti è preponderante la funzione d’accumulo temporaneo e trasporto dei metabolitiintermedi verso i siti periferici di deposito. Non a caso negli studi immunoistochimicila reazione anticorpale appare associata ai tessuti floematici, osservazione che consentedi ipotizzare un coinvolgimento del trasportatore nella distribuzione di essenzialim e t a b o l i t i secondari, quali sono gli antociani nella vite.

Nel caso del ‘Tocai friulano’, benché sia rilevabile la presenza del traslocatore sia nellabuccia sia nella polpa, il grado d’espressione è più contenuto e circoscritto alla fase finaledel ciclo di maturazione della bacca, com’è lecito attendersi vista l’assenza di pigmenti.

In parallelo è stato evidenziato l’effetto di una ridotta disponibilità idrica perla pianta, che induce un anticipo del ciclo di maturazione. Tale fenomeno, caratterizzato alivello macroscopico da una più rapida pigmentazione delle bacche e da altre caratteristichequali l’incremento della concentrazione di zuccheri e dell’acidità (Do, Cormier, 1990),è associato ad una più marcata presenza del traslocatore. Questo dato consente dii p o t i z z a r e che il repentino aumento di pigmenti induca anche una maggiore sintesi deltraslocatore, fenomeno che avviene in entrambe le porzioni della bacca allo studio.

Si può dunque concludere che la rilevazione anticorpale del traslocatore evidenziaun’interessante relazione tra il profilo della proteina e la già nota concentrazione deipigmenti, durante le varie fasi del ciclo di maturazione. Inoltre eventuali variazioni nelcontenuto di antociani, quali quelle indotte dalla carenza idrica, paiono modulare inparallelo anche la sintesi del traslocatore allo studio.

Infine tale parallelismo conferma quanto è già stato dimostrato in precedenti lavoriche hanno studiato l’espressione genica d’enzimi coinvolti nella sintesi degli antociani,



durante le diverse fasi fenologiche di maturazione della bacca (Bogs et al., 2006;Castellarin et al., 2006). Anche tali proteine mostrano, infatti, un andamento strettamentecorrelato con l’accumulo degli antociani e tale fenomeno fornisce un’ennesima confermasul coinvolgimento del traslocatore nel trasporto dei pigmenti fenolici.

Ulteriori studi si renderanno necessari per correlare in modo più chiaro il livellod’espressione del trasportatore e possibilmente la sua attività enzimatica con lac o n c e n t r a z i o n e di antociani presente nei diversi compartimenti del frutto.

I flavonoidi, come già ricordato, assolvono un ruolo di basilare importanza nelleinterazioni pianta-ambiente: una più approfondita conoscenza di questi composti e deimeccanismi coinvolti nel loro trasporto è essenziale per chiarire i fenomeni ancoraoscuri che regolano gli equilibri ecologici e le interazioni tra l’ambiente ed i pigmenti(antociani). È essenziale sfruttarne anche le proprietà benefiche: in modo particolareassumono sempre maggiore rilevanza le loro caratteristiche farmacologiche qualiantiossidanti ed antitumorali.

La comprensione dei meccanismi d’accumulo e delle caratteristiche biochimichedegli antociani in V. vinifera riveste così un elevato interesse perché le conoscenzeottenute possono portare al miglioramento della qualità di un prodotto di spicconell’economia friulana. Le possibili ricadute riguardano la messa a punto di vitignie sistemi di coltivazione a basso impatto, nonché una compiuta conoscenza dellecondizioni ambientali idonee ad ottenere un prodotto con elevato contenuto di antociani.Tale obiettivo rappresenta perciò una delle priorità nella coltivazione della vite, sia perincrementare la qualità del prodotto e dei processi di trasformazione, sia per raff o r z a r ela protezione fitosanitaria.

Ringraziamenti

Il presente lavoro è stato effettuato con il sostegno finanziario dell’Azienda vitivinicola“Villanova” di Farra d’Isonzo (GO) e della Regione Autonoma Friuli-Venezia Giulia (L.R.26/2005 art. 17).

Gli autori desiderano ringraziare il dr. Paolo Ermacora ed il sig. Pierluigi Bagatella(Università di Udine) per la collaborazione fornita alle analisi immunoistochimiche.

Riassunto

Nel corso della maturazione le bacche di vite accumulano un’elevata quantità di antocianinenei tessuti tegumentali, mentre i loro precursori e intermedi biosintetici sono sintetizzatiu b i q u i t a r i a m e n t e all’interno del frutto. In un recente lavoro (Passamonti et al., 2005) è statadimostrata la presenza, in microsomi isolati da petali di garofano, di un ipotetico trasportatoredi antociani, omologo alla bilitranslocasi di mammifero (BLT). Al fine di valutare la presenza


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di tale trasportatore in piante note per l’elevato accumulo di antociani, è stata eff e t t u a t aun’analisi immunochimica e immunoistologica in bacche di uva nera e bianca ( ‘Merlot’ e‘Tocai friulano’), mediante l’uso di un anticorpo prodotto contro l’epitopo anti-BLT. È statocosì possibile determinare la localizzazione del trasportatore di antociani nei diversi tessutidella bacca e la sua espressione durante le varie fasi di maturazione. I risultati presentati dimostranola presenza di una proteina che reagisce con l’anticorpo anti-BLT, presente a diverse concentrazioninella buccia e nella polpa, la cui espressione aumenta, in correlazione con la maturazione, ine n t r a m b e le cultivar.

I M M U N O D E T E R M I N ATION OF A BILITRANSLOCASE-LIKE A N T H O C YAN CARRIERIN Vitis vinifera L. BERRIES

Abstract

During maturation, grape berries accumulate a large amount of several anthocyanins in theepidermal tissue, whereas their precursors and intermediates are ubiquitously synthesizedwithin the fruit. In a recent work (Passamonti et al., 2005) it was shown the pre s e n c e of aputative anthocyanin carr i e r, homologue to mammalian bilitranslocase (BLT) in carnationpetal micro s o m e s. An immunochemical and immunohistochemical analysis was performed inblack and white grape berries (cv ‘Merlot’ and cv ‘Tocai friulano’), by mean of an antibodyr a i s e d against a BLT epitope, to further investigate the presence of such a transporter inwell-known anthocyanin accumulating plants. The study was designed to assess the localizationof the putative carrier within berry tissues and its expression changes during differe n tdevelopmental stages. Results show the identification of a protein cross-reacting with anti-BLT, present in grape skin and flesh at different levels, whose expression increases in corre l a t i o nwith ripening in both cultivars.

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immunodeterminazione di un traslocatore di antociani affine alla bilitranslocasi in bacche di vitis...

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