identification of colon tumour-associated antigens by phage antibody selections on primary...

8
Identi®cation of colon tumour-associated antigens by phage antibody selections on primary colorectal carcinoma R.C. Roovers a , E. van der Linden a , A.P. de BruõÈne b , J.-W. Arends a,b , H.R. Hoogenboom b, * a Department of Pathology, University of Maastricht, Maastricht, The Netherlands b Department of Pathology, University Hospital Maastricht, PO Box 5800, 6202 AZ Maastricht, The Netherlands Received 28 July 2000; received in revised form 17 November 2000; accepted 29 November 2000 Abstract Immunotargeting of solid tumours using antibodies has become a valuable tool for the detection of cancer metastases and the treatment of minimal residual disease. However, only few tumour antigens useful for targeting have been described to date. To identify cell-surface targets on colorectal carcinoma (CRC), we selected a large, human phage antibody repertoire on freshly iso- lated colon tumour cells. Two antibodies were identi®ed that reacted with epithelial cell-restricted cell-surface antigens, whereas one clone preferentially reacted with stromal cells. These antigens are tumour-associated antigens, as shown by their uniform expression in tumours of dierent patients and of dierent dierentiation stages and by their limited expression on normal tissues. The pattern of reactivity in immunohistochemistry (IHC) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) suggests that these antigens are dierent from previously identi®ed tumour-associated antigens (e.g. Ep-CAM or c-ERB-2). This phage antibody-based method may lead to the cloning of novel tumour antigens that are useful for the immunotargeting of solid tumours. # 2001 Elsevier Science Ltd. All rights reserved. Keywords: Colon cancer; Phage display; Tumour antigen; Cell selection 1. Introduction Colorectal cancer (CRC) is the second most prevalent cancer in the western world. The principal treatment modality is surgical removal of the primary tumour and adjuvant chemotherapy (at present, 6 months of 5-¯uorouracil (5-FU) plus leucovorin (folinic acid) can be considered standard therapy) for metastatic disease. However, especially for minimal residual disease, immunotherapy using monoclonal antibodies directed to tumour-associated antigens has proven to be a pro- mising new treatment modality [1,2]. However, most of the target antigens described to date for colon cancer (e.g. carcinoembryonic antigen (CEA), c-ERB-2, TAG72, Ep-CAM) are tumour-associated and thus are also expressed on normal colon. This may give rise to toxicity problems when these antigens are used as tar- gets in the treatment of patients [3]. The search for new target antigens expressed on can- cer cells has traditionally involved the immunisation of mice with cancer cells, cell lines or cell-extracts and the subsequent screening of hybridomas for antibodies that bind to the target cell [4]. In addition, tumour antigens have been identi®ed by the cloning of T-cells that recognise major histocompatibility class I (MHC-I)- restricted peptides derived from the antigen [5]. More recently, genetic approaches are increasingly being used to de®ne genes that are associated with malignant transformation [6] or to de®ne distinct genetic subtypes of malignancies [7] at the transcriptional level. Antibody phage display (reviewed in [8]) has also been used as a means to quickly select antibodies speci®c for certain cell types or tissues [9,10] or known tumour antigens [11,12]. This strategy may be used to identify cell-surface structures on cancer cells: novel antigens can then be de®ned by means of the antibodies that recognise them. Although this approach has already 0959-8049/01/$ - see front matter # 2001 Elsevier Science Ltd. All rights reserved. PII: S0959-8049(00)00432-9 European Journal of Cancer 37 (2001) 542±549 www.ejconline.com * Corresponding author. Tel.: +31-43-387-4630; fax: +31-43-387- 6613. E-mail address: [email protected] (H.R. Hoogenboom).

Upload: independent

Post on 09-Dec-2023

0 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

����������� � ��� � � ��������� ������� �� ���������� ��������� � ������ ������� ������

���� ����� � �� �� ��� ������ � ���� �� � !" �� �� #��$� ������ ���%��� %����� ��&

���������� ���� ��� ���������� ����������� ����������� ��� ������ ��������������� ���� ��� ���������� ������ ����������� �� �� �� � !" " #$ ����������� ��� ������ ����

�������� '( # �� ')))* �������� �� ������� ��� +, -������ ')))* ������� '. -������ ')))

��������

��� ��������� � ���� � � �� ���� �������� �� ����� �� ��� �� �� ��� �������� � ����� �������� �� ����������� � ������ ����� � ������� %/����� ��� ��/ � � � ������� ��� � �� �������� ��� ���� ��������� � ���� 0�������� ������ ���� ������ � ������� ������ 1���2� /� �������� ����� � �� ���� ������ ��������� � ������� ������� ��� � � � ������ 0/ �������� /��� ��������� ��� ������ /��� ��������� ��������������� ������ ���� �������� /����� ��

���� ������������� ������ /��� ����� ������ 0���� ������� �� � � ��������� �������� � ��/� �� ����� ����� �3��������� � � �� � ��4����� ������� �� � ��4����� ��4��������� ����� �� �� ����� ������� �3������� � ���� ���� ��� 0�� ������� ��������� �� ��� �������������� 1�%�2 �� ��5�������6�� ��� ������� ��� 1���7�2 � ������ ��� ����� ������� ��

��4����� ��� ����� ��� ��������� � � ��������� ������� 1���� �����8 � ���� �'2� 0��� ���� ����������� ������� ��� � ��� ������ � ���� � � � ������� ��� �� ��� � �� ��� ��� ��������� � ���� � � ���� '))+ �������� 7���������� ��� ������ ���������

%��&���' ��� �����* ���� ������* 0 � � ������* ���� ��������

� ���� ������

������� ����� 1���2 �� ��� ����� ��� ������������� �� ��� /������ /���� 0�� �������� �������������� �� � ����� ����� � ��� ������ � � ��� �9 ��� ���������� 1� �������� : ����� �;�< � ���� 1;�=>2 �� � �� ����� 1������ ���2 ���� ��������� ������ ������2 �� �������� �������%/����� ��������� �� ������ ����� � ���������� ������� ���� ������ �������� ��������� � � ��������� ������� �� ����� � �� ��������� ��/ �������� ������ ?+�'@� %/����� ��� ���� ����� ������� ��������� � ��� �� ��� �����1���� ������������� ������ 1���2� ���� �'�0�A,'� �����82 �� � � ��������� �� �� � ���� �3������� � ���� ���� 0��� �� ���� ���� �

�3����� ������� /��� ����� ������� �� ��� � ������� �� ��� �������� � ������� ?B@�0�� ����� �� ��/ ����� ������� �3������� � ���

��� ����� �� ���������� ������� ��� ��� ������ ����� /��� ����� ������ ���� ����� � ������3����� �� ���� ���C ��� ��������� � �������� �� �������� ������� � ��� ����� ���� ?D@� �� ������� � � � ���������� ���� ��������� �� ��� ������ � 0������ ����������� �9� ��������������� ���� � 18%���2����������� �������� ������� ��� ��� ������ ?;@� 8����������� ������� ������� �� ����������� ����� ���� ����� ����� ��� �� ������� /��� ����������������� ?:@ � � ����� �������� ������� � ������� ���������� ?,@ � ��� ������������ ������������� ���� ������ 1�����/�� �� ?(@2 �� �� ����

��� � ���� � C ��6�� ������ �������� ������� �������� ���� ����� � ���� �� ?.�+)@ � 6�/� � � �������� ?++�+'@� 0��� ������� �� �� ��� � �������������� ���� ��� �� ��� � ����� �����E ���� ��������� ���� �� ������ �� ���� � ��� �������� ����������� ����� ���� �� ���� ����� �� �����

).;.�()D.F)+FG � ��� ���� ����� � '))+ �������� 7������ ���� ��� ������ ���������

�� � E 7).;.�()D.1)) 2))DB'�.

� ���� # ��� � ����� B, 1'))+2 ;D'H;D.

///��9���������

& ����������� ���� 0���E IB+�DB�B(,�D:B)* �3E IB+�DB�B(,�

::+B�

()��� �������' ��J����5���� 1%��� %�����2�

���� � ������ ��� ������ � ����� ?+B@ �� ��� � ������ �3����� � � �� ������ ?+D@� ���� �/� ����� �� �� �� ���� ������� ��� ��������� ��� ��������� �������� ������� /��� ��� ������� ?+;@�0�� � ����� � ���� ����� ������� � ��� ���

������� ���� ���� ��� ���� ������ ������ ��5� ��C ���� �� ����� ���� � ��� �������� ����� ����$� ��� ����� ��� ��������� �� �� � ���� ��������������� � �����3 �������� � �� � ���� � ������ ��/���� /� ����������� ��� �������� ������� ��� ������ � �������� ?+:@� 0���� ����� /��� ��� ������ �������� ������� �� �K����� �������� � /���� � � ������ %���� /� �������� ��� �� � ����� ������� �� ��� �������� � � �� ������ ��������������� /��� ��� ������ � ������ ������ � ����������� ����� ���� ������ ��������� ?+,@ �������� ������ ��� � � � ������ /� ���� � ���������������� ��� �������� �������������� � � � ������� �� ��� �������������� 1�%�2 �������

� ��������� �� ����� �

"*+* ���������� ��� ������

0A+E L+'� �, ��)��-� �.�(� ���� �����F=M����B:����I I� ��/C� ��N�8+;

"*"* 0� ���

0�� ������� ����� ���� ���� ��' /� ��������� ��� ������� 0��� � �� �� �������� 1�0��*� ���� %0 B,2 �� /� � �� ��� �� O �����M� 8������ ����M� 8��� � 1O8�8* O ������ ��- ������� ������ ��� 8��� ��� >7�2 � ���������� /���+)P 1�F�2 ���� ��� ��� � �� ' �8 ���� ������ �����/��� 6��� � B,�� �� � ������� �������� ��������� ;P �Q'�

"*1* ����� ����2�� �� ����� � ������� � ����� ��������

� ����� � ��� � ��� ������ ����� ���� ��������������� ?+,@ /� ��� �� ��������� 0�� ������ /����� �� /��� ������ ���� 8+BL), �� ����� /���� ����� �� ���������� ��� ��� ������� � �� ��� ������� �� ����������� ����� 1��A2 ������������ ��������� �� ?+(@� ����� ��� �������� � ��� ������������ � ������� ����� �������� �������1=�2 ������ /� �� ����������� ����� ��� � ������������� R����� ������� �� ������������� � ���K������������������� � ������ ������ ������� ����� ���� � /�

������ ��� ��� ��������� � ������� 0��� � /�/���� ����� ����� /��� ') �� � ��������� 4��������� 1� 72 1;) �8 ������� � 4�� 1L%'�QDF

-'%�QDE �% ,�D2* +;) �8 -��2� � � �� ���� ������ ���� ������� ������ ���� �� /���� ��� /��� � 7�0��� � ������ /��� ��/�� � ������ �� � 4�� � �������� /� ������� ����� /��� ������� �� ����������� ���� � D�� �� ������ � 4�� 1� 7� �������� +�8 �O0�� + �8 �A0� �� )�; �8 ������������1O002 /��� ������ ��6���� -�3� ��� ����� /��� ��������� �� ������� ���� 1+))�� B ���� D��2� /��������� ����� /��� +) �� � � 7 �� ������� ���� ����� ������� �� �3�� �� ; �� )�';P 1/F�2 ������������� �� � 7 �� ') ��� � D��� ����� /���/���� ����� ����� ��� /��� +) �� � � 7� ��������1+))�� B ���� D��2 �� ��� ������� �� + �� � � 7������ /��� ���6�� �� + � � �� ������� �� �� +�� � DP 1/F�2 8����� 1�6����� ���6 �/���2 �� � 71DP 8� 72� ���� � ��� ���� � ������� �� ��� ������ + +' � � �� ������� �� /��� ������ ��6���� �����/��� /���� ��� ����� /��� ; �� � � 7 �� ������� ����� �� ��� ������� �� ����� /��� �� ��� /��� + ��� +)) �8 ������������� 10��* �%S+'2 �� +) ��� ��� ������� ��� 0�� �� �� /� �� ������� /��� )�;�� + 8 0������ 1�% ,�;2 �� ����� /��� ��/�� ������� �3��������� ��/��� (* � � 0A+ �� ������� ���������� �� ?+(@�

"*3* 0�������������� �� ����� ����2�� �������� 2���# 4������������ ��� ���.��������������

����� ��������� �������������� R������ � �������������� �������� /��� ������� �� �������� ���������� 1���2 ��� ������ ������� ���� ����������� �>��������� 1;���A� AA� 0�� ��� 000��� ��� AA�B�2 �� ���0�0 ��C 1;��000 A0� A0�000 ��� A�� A00 �A0�B�2� 0�� ��������� � �������� ����� �������� ������� 1=�2 ������� /� ��������������� ����� ������� � ����� �������� R����� ������ �� ������������� � ���K����� ���������=������ ������ R������ /��� O-�������������� ���������� �� ?+(@�=� ��� �������������� 1�%�2� ; ���������

���������� � ��4����� ����� � �� ���� ���� ��/��� � � �� � ���� � 7������ ������� 1L��������O ����� 0�� -���������2 ���� ������� 7����� /��� ������������� � �� ������� �� �� ������ /������������ =� ������ �������� ���������� ���������� �� ����������� =� 1��=�2 �� ����� ������� �� ?+.@� %/����� ������ /��� �3�� /��� +P1/F�2 ������������ �� � 7 �� ') ��� � ��������� �� 1������ � /��� �����2 ����� �������/��� ��������� ������ ��������� ���� ���� ���� ���� �� � ������� � �������� ��� /��� ��������� �%� ���� ���������� ���� �� K���� ����������� 1�8��2 �� ��� ������ ��C �� ����������1=���2 /��� � ��������� �� ��=� �� ����� ������� �� ?+.@� =� �������� /��� � ����� �� �������������� ��3��������� ��C ���� �� �������� ��

5*0* 5���� �� � * 6 (.����� 7.��� 0����� 18 ," +- �3"9�3: ;DB

���� � ����� �)����������� ������ ��� ��� �������� ��� ������� ����� ���7+ ?+,@�

"*�* #�� ���� �� �.����)2������ �� ����� ����2���������� 2� ����� ;& ��������

���������� ��/��� ��' ����� /��� �������� �� ���< ���� �� �������F�O0� �������� �� /������� /��� � 7� ����� /��� ������ ��� ��������� � �3��/��� +P 1/F�2 ������������ �� � 7 �� ') ��� ��� ������� ��� 7 ���C ������ ����� /��� /�����/��� /��� 'P 1/F�2 ����� ��� � �� ��� 1 7�2 ��� 7 �� ��C �� � ���3������ ;�+); ����� /������� ��� ��� ����� /��� ������ � �� + � � ��������� �� �� ������ 'P8� 7 �������� )�);P 1/F�2--B 1'P8� 7F-B2 �� ����3�� ������ � �� 'P8� 7�� ��������������3�� ������ ����� /��� /���� �/���/��� )�; �� � ��� ���������� � 4�� ���/��� ����� ��� ����� ����� 7������ /� �������� /��� � ��������������� ������ �������� 1���3������ +))

�82� ��� .�+) ������ 1?')@* ;)P 1�F�2 �������� ������� �� DP 8� 72 �� < ������� ����������� 1=�0�2���9 ���� ����� ����� �� ��� ����� ���� 1O6� A���� �� O����6* 'P 1�F�22� �����/��� ����� ��� ������� �� )�; �� � � 7 �� �������/� ��� ����� �� </ �������� ���� < �������������� ���� ����� 1=��72����� � 1 ���� T O��6������ %���������� A�����2�

� �������

0 �������� ������� ���� ������ ���� ������� ����� /� ��� � � ������ ���� �������� /��� ����������� �� ��� � � � ����� �� ������ ���� ���� =����� ������ ��������� ?+,@ ����� ������� ������� � � ������ =� ������� ������ ��/ � � ������������ ��� � � � � ��4����� ������ /� ��������� �� ����� � �� � ��������* ��������� ���� �� � ����� ��4���� ���/��� ���������� 0��� +

=��� +� ��� ������������ ������� � ���� � ���������� � ��� ������ ���� ��������� =� ������ ��������� �� ������

�������� /��� �������� /��� ��� .�+) ������ ���������� ������������� ������ �� �� ���3������������ ���� �� ��������E 12 �������

����� 1 =� ������ �������� � ���� � �3��2* 1�2 ���� ;* 1�2 ���� (* 1�2 ���� �(�

;DD 5*0* 5���� �� � * 6 (.����� 7.��� 0����� 18 ," +- �3"9�3:

��/� ��� ��� ��� � ���������E ����� /� � ����������� �� ���� ������ � � ���� �� �� �3������ �� �����4������� �� ��� � ���� � ����� ��� �� ���������%/����� ��� ��������� � ����� �������� � ��������� =� ������ ������� ���� �� ���� ���������������� /��� ����� �������� � ��� ������� �/���

� ������ � �������� 10��� +2� ����� � � �� ��� � ���� ��������� ��� ��������� � ��� �������� ���� �������� ���� /� �3����� �� ����� ����� ������������������ ������ 1'; ���� � �� � � �� +, ����� �� ���2 /��� � ���C ����� ������ �� ����� ����������/��� ��� ���� � �� ��� �������������� 1�%�2�

0��� '

Q������/ � R�� O� �� #�������� ��� � �������� ���� ��������

R����� R����� ����� ������ ���� ���� R����� ������� O�������� ��� #�������� ���

<� 1���� ;2 R%B O��,,F$A%+:I O;�; #%D�

<= 1���� ;2 R�B R�FB(6 ��� #�'

<� 1���� (2 R%B R%A�B�,FO��(' O:�'; #%:�

<= 1���� (2 R�' O��',F�'.I ��� ����

<� 1���� �(2 R%B ���(F��B));�B O:�+BFO-+ #%D�

<= 1���� �(2 R�B O��+:FR�B�+ ��� #�'F#�B

���� �� ��������� ����� ���� ��� ��C ���� �������� ���/�� � R����E 1����EFF///�������������� 6F������F����������FO-��

��Q0�����2� ��� ������� � �� �� �� �����������

0��� +

������������� � ���� ������ ��������� �� ��������� � ����� �������� � ��������� ������

7������� � �� ��� � ����� 1�2 Q �� � ����� 12 ��� F� ���������� ����� P � ��������� �����

+ D�'�+)+' '�:�+), :�'�+)�: ��� ����

' '�D�+)+B ;�)�+), '�+�+)�: )�BD ����

B +�(�+)+B B�B�+)( +�(�+)�; (�;, (B

D (�)�+)+' D�.�+), :�+�+)�: )�BD .D

; '�;�+)+B D�+�+)( +�:�+)�; '�:' +))

���� �� ��������* ����� �� ����������� 0����� �� ����� � ����������� ��� 1�� 2F���� ���������� ���� �� ������ �E 1��� F� �������� � �� �I+2F1��� F� �������� � �� �2�

0��� B

�3������� ����� � ������� ��������� �� �������� ���� ������ �������� � ���� � ���� ���� ��

0��� � 7������ �� =� ; 7������ �� =� ( 7������ �� =� �(

���� 8����� � �� ��������� I

� ��������� �����

���� H

��� 8����� � I � ��������� ����� 7��� � ���� ����� ��

��������� ����� �������� I

8����� � I � ��������� �����

��� � 8���� ������ �I

� ��������� ����� ���

H 8����� � �� ���������I

� ��������� ����� ���

L����� Q��� ����� � � �� I

����� �� �H ��3���F����� � � �� I

����� �� �����3 H H H

����� Q��� ���� � ��� ��������I��������� � H ��� � ��� �� ��������� I

� �� ������� � ��� �������� � I H ������� � ��� �������� � I

����� ��� H H H

8 ���� H ��������� ����� �������� I H

Q��� � H H ���� ��������� I

������ �3����� ��� I �������� ��� � ���� �3����� ��� I �������� ��� �76�� H H H

7����� H H H

7����E ��� � 8����� � �� ��������� I

� ��������� �����

R��� ����� I ����� � 8����� � �� ��������� I

� ��������� �����

0����� 1=����2 ���� �������� I 7�� ���� � ���� ����� �������� I 7������ ������ �I/��� ����

����� ���

>��� � � � �������� � � ��� ��� ���� � ��� � � ��� I

I� ��������* �� ��������

5*0* 5���� �� � * 6 (.����� 7.��� 0����� 18 ," +- �3"9�3: ;D;

����� � � � ��� � ���� ��������� � ������� ������� /��� ������� �� ��� ��������� � ��4����� ���������������� �� ���� � �%� ���� ��� � � � ���� �� ��4����� ������� %/����� ���� ��� � ��� ���������� ����� � � +, ��4����� ����/ ����������������� ������� ����� ������� �� �%� 1=��� +2� 0/ ���� �������� �3�� ������ ������ ������� �������������� 1����� ; �� �(2E ��� ������� ������� ������/� ����� ������ �� � � �� ������� ���������1=��� +� �� �2� 0�� �������� ���� 1 (2 ������ ������������ /��� ��������� ������ � � ������� ������ ���������� 1���� ��������* =��� +�2� 0�� R������ � ������������� �������� /��� ��C ����� �� ��/� � �������� ��� ��4������ � � ������ ��� R����� �������10��� '2� <� ����� /��� �� ������� ��� ��� ������1R%B2 ���� ����� �� ����� ���� ����� 1<=2 ����������� ��� 1� �� �2 ������� 1R�' �� B �� R�B�������* 0��� '2� ��� ���� � ��� �������� ��� ��� =� �������� �� (* � � ������� ��� �� ��������� /��� �3������� � ��� �������������� ������������ � ����� �� ���� ����� � ���3������ D;6O� ��� �������� � �� �� � ����� � ��� ��� .)P�� ������� �8�� 1=��� '2� �� ������� =��� ������� � �8���� ����� =� ��/�� ������ ��6 � ����������� ���� �3������ �� ������ � ���3������;) 6O 1=��� '�2� 0�� ����� � � ����� ������ �������� ����� ���/��� :)) �� ()) �� ��� � � �������� �� ���0 ������ ��� ������� ��������� �� ��� ��������

������ �������� � � ����� ��� � � � ������������� �������� � ������ ��4����� ��� � � ��1�S+)2 � ��� � ��4��������� 1O 6��M �H�2 /������� �� �%� ������� ��� ����� ������� /��� �3��������� �� � � �� ������� ������ ��� ��� ������� ������ ���/� �� =��� +� 0 �3���� /������ ��� ����� �������/��� �� �3������� �� ��4����� ���������� ������� ������� � ������� � ��� ������ � �� ������� /� ��������� ���� �( ��/�� ����� ������� � ��������� �� �� � � ��* =� ; ��/������� ��������� �� ����� �� � �� ������� � � /���� ��������� ��� ������� /��� ����� �������� ���� ( ��� ��� ������� ����� �� �� ������ � ��� 0 ���������� ��� ������� � ������ ������3������� ����� � ���� � ��4����� ���� ���� ��/� ���������� �� �%� 10��� B2� ����� ; �� �(�������� ������� �3������� �� ������ ���� ��������E��� ; �� �( ���� /��� ��� � ���� �� � ��� �������������� ���� 1��� �� ��� � �� ���2 �� � ������ �� %/����� ��6�� ��4������� ���/��� ��� ����� ; �� �( /��� �� �������E /����� ������ �(������� ������ ����� �� ��������� ����� �� ��� ���������������� �� ����� �� ��3��� �� ����� � � �� ��6������ ���� ; ��/�� ������ ������� � ��� ������ ������ �� ��� ������ ����� � � �� �� ��� 6����� 10��� B2�= ��������� =� �( ��� �� ���� /��� ����� ��������� �� /����� ���� ; ��/�� ������� ������� � ����

���� �� =������ =� �( � �� � ��� �������� � � ������ ���� � ��� � � ��� �� ��� ��� �� /����� =� ;��� ��� ������� ( ��/�� ��� ���� /�6 ����������/��� ��������� ����� �� � ���� �� ��� �� ����� � ���� ����� �� ��� �� ������� � � ��/������� ������� ������� � ��� ���� �� ������ 10��� B2��� ���� �3�������� � ��������� ��� ���� ��

/����� � ��� ����� �������� � ������ ��������� =������� �������� /��� ��� �� ��� ��������� 0������ �� ������ �3������ ��� ��� ��� ���� ���� ��'/� ������ � �������� ��� �� ���� ����� /��� � ������ =�� -�� � ��� ����� �������� ������ ����������������� ����� ����� ������ �� ���� ����� ��������� ���� ����� �������� �������� ������� ��� ����������� � ���� ���� � ��� ������ 1�� ����/�2� �� ������� ��� ������������ ���� ��� ��� ����� ������ �� �� ��� ��� �� ��� �� �� ��� ������������ � ������� ������ 1�� �� ��/�2� 0����

=��� '� � ������� � ��������� ��������� ������ ���������

������� �������� /��� ��� ��� �� (* � � �� � ����� ��� ���

���������� ���� �� ���� � ���������� ���� �� K���� �����

������ 1�8��2E 12 ��� � � ����� � ����� ����������� ���

������������� 17O7���A�2 � �8���� ����� =�* ������� /���

��� ����� �� ���� � ������ ������ � � �������* 1�2 ��� ���

���� ��C �� ���������� 1=���2 ������ � �8���� ����� =�*

������� 1QO '() ��2 � ��� </���� �� � ��� �� �� /�

��� ��� � � ����� � ��� �������� ����� 8� ��6��* ����00�

������� � �3��* 8$� ���� �� /������

;D: 5*0* 5���� �� � * 6 (.����� 7.��� 0����� 18 ," +- �3"9�3:

��� ��� ��/ ��� ��� ������� ��������� �� ��� ������� �������� � �� /��� �� ��������� � ��������������� � ��� ������ �3������� � ��� ������ ��

���� ������� </ ��������� ������ � ��' ����� ���� =� �������� ; �� �( ��/�� ��� ��������������� /� ������� /��� ����� /��� �� �3�� /��������������� 1=��� B2 � ������ /��� ��� �������� 1O00* �� �� ��/�2� %/����� ��� �������������� ��� ������� ���� ��������������3��/��� ��' ������ ������ ��� ��� ������� ����������� ��� �������� ; �� �( �� ������ ���� ��6����

� ����������

�� ���� ������ /� �������� ��� � ������ � ������ ��������� /��� ���������� �� ������� �3������� �� �������� ������ �� ������ ����� ������ ��������� ������ ������ � ��� � � � ����� ��������� �������������� ���� �� ��������� ; �� �(�������� ��������� ������������ ������� �� ������ ( ������������� ����� /��� ����� ����� �� ���� � �� ���� 0���� ������� �� � ��������� ��� ������ �� �3������� �� ������� � �� 1�S+)2 ���� � �� ������ �� �� ��� � ���� � ���� ������������� ��� 0��� �� �� � � ��������� �� ��� ������ ������� � �� �� �������� � � � ��������� ��������= � �� C �������� �3������� �� ���� �� ������ �� ����� ������ ����� ������� � � � � ��6����0�� �������� ����� ��� �� ���� ������ ������

��� /� �������� � ������ ��� �������� �/��� �������� ���� � ��4����� � � �� �� � ���������� �������� � �������� �������� � ������� ��C � �� ��� � � ���� � ������� 1���� � �� �� ������ ������ 1%��2 ���� ���2� 0�������� �������������� � � � ������ /� ����� � � ������� ���� ������ � � � � ���� ���� �� � � �� ���/��� �� ������ � �������� �� �� ���� � ��4����������� =������ ��� ��������� � �������� �������������� /� �������� � ������� � ���������6��� �������� � � �� ������� ��� ����� ������������ �������� ��/�� ��������� �/��� ��� ����� � � �� ��� ��4����� ������� ������ 1�S+)2� %/�������� � ����� � ����� ��� ��� �� ���� �� �%� 1+D � � +, ��4����� �������� ������ ���� ��� � ��� ���������2 �� ������� ��� � ��� � �������� �������� �� � ���� � ������� /��� ��������� ���������������� �3������� ������ � ����� =�� � � ����� ������������ �� ��� ���� � �/ � ������ � ������ �������� �� �%�� 7���� ��� �������� �� � ������������ ��� �������� � ��� /� ����� ������� �� ��� ������� � ���� � ��� �������� ����� /��� ������� �� ���3������ ��� ��� ��� ������������ �� �� ����������� ������� ����������7�������� /��� �������� � �������������� � � �

������ /���� /� ������ /��� O00 � �3���� � � ������ ��� ��� � �� ����� �3������ �� ����3 ��� � � ����� /��� �3�� /��� ������������ � ��������� ��� ���� � ���� � ���� ��� �������� ����� ���

=��� B� ������ ���� ������� � � ������ ��������� ������ ����

����� ; �� �( � ���������� �� </ ��������� ������ ���� ���

��� ���� ���� ��'� %������ ���� ��/��� ��� � ���� � ����

/��� ����� 1� ���2 � � ����� � ����� < �������� ��������� 1=�+�%2�

����� /��� ������ ����3��� � �3�� /��� +P 1/F�2 ������������

���� � �������� -������ ����� ������� 1� ������ � ��� ������

���� � �3��2 �� ��/� �� �� ����� �� ����� ����E 12 ��� ��� ���

��8 ������ 8Q��B+ 1���� ����2 � ������� �����* 1�2 =� ;

������� � ������� ����� 1���� ����2 �� �3�� ����� 1����6 ����2* 1�2 =�

�( ������� � ������� ����� 1���� ����2 �� �3�� ����� 1����6 ����2�

5*0* 5���� �� � * 6 (.����� 7.��� 0����� 18 ," +- �3"9�3: ;D,

0�������� �� �� � � ������ ��� ��� ������ ����������� �� ����� �������� ������ �������� ������� ��������� � ��� ���� � ����� 0���� ������ ��������� ���������� �� �������� �� ��� � �� �� ����������� � ���� � � �� �� � �� � �� ��� ��������� � ���� �� ���� ������� �� �� ���/���� ������ =� �( 1�� �� ; � (2 ��������� ��� ����������� �� ��������3��� ��K���������� ���� � ��������� /���� �� ������ ��� ��� ����� �� ����������������� 1�� �� ��/�2�0�� �� � ������ �������� ������� /��� � ������

��� � � ������� ��� �� ��� ��� �������� � ��������� ��� ��������� /��� ���� ���� �� � /���������� ��� ��������� � ��� �������� ����� �/��� � ����� ���� ���� �� 10��� B2� 0 ������ ��� ���������/��� � � ��������� �������� �������� ��F�� ������� ��������� �� �� �� ��� ?.�+;�'+@� �� �������� � � �� �3��������� �� �� �� �������� � �� ������ �������� � �������� ������� /��� ������ �������� �� ������ � � ���� � ��4����� �������� ���������� �� �� ���������� ���� ���� ��������� � ����������� ������ � ������� ���������� � ��� �� � ���� ��������� ���� ������ ��������� � ���� � ����������� ������ ������ ��� ����� ���� � ������ ��� ���?''@� = ��������� �� ��� ���� ������ /� ��������� ��?+:@� /� �� ��� � �� ��� ������ ���������� ������ � ������� ���� �� �� ������� ���� ���� � ���� ������� 0�������� /� ��� �� �3����� ���� ��������� ������� �� ��� �������� � �������� � ���� � � �������� %/����� ���� � ������ � ��� ���������� ��� � ���� ����� �������� =� �������/� �������� ��������� ��� ��� �������� ����� �� /��� � K����� �� ��� �������� � ������� ����� 1���� ��/�2� 0��� /� ������ � ��� �� ��� �������� �� � ������ ������� �� ���� � ������������3������� � � � ��������� ������� �� ����

���� � �� � �� �3����� �� ������� /��� ��� ������ �� ��� � ����� �� ��� ������� ?B@� %/����� ��������� ��������� �/������ �3������� �� �������� � �� �� ���� � ������ ?'B�'D@� �� ��� ������������� ���� ������ �� ����� � ������� � ���� �����3����� ������� �� �������������� ���� ���� ������� /��� ��� ������ �� ���� ��� ��� ���� ���� ?';@�0�� ���� ���� �� ��� �� ������� �� �������������3����� �� ��� ����� /��� ������� � ��������1���02 �� ��� ?':@ �� ����� ��� ����� �� 6�����/��� ���9 ���� ������ �� ���� 0�� ��������������� �� �������� ������ ; �� �� ������� ���������� �� ��� � ��� ����� � � �� �� ��� 6������������� ������� ������ � ������� � �� � �3������� �������� %/����� �� � ���� � ������ ��������� �� ��� 6����� /��� ����� ������ � ��� ���������� 1���� ��5� �� �����2 ��� �� �������� �� /����������� �� ������ ������������������� =������ ���� ��� ����� ������� /��� �3������� � ������������ /�������� �� ��� ������ � ������� �� ����� ���

���� �� 0��� ��/� ���� ��� �� ��� �������� ���������� ���� �� �� �� �� ����� �� �� ��� ��� ������ ���������� �������� � ������ ��� �� �������� �������� /��� �������� ���� � ������� ��� �� ��� ���������� � ������Q� ��� ���� � ����� �3������� ������� ��� �������

������� �� ��� �������� ������ �������� ��4�� ������ ����� � � � �� �������� � �� � ��� 6�/���� � � ��������� ���� �' ?',@� ��� ?'(@ � �����8 ?'.@� 0��� /� ������� �� ��5�������6�� ��� �������� ��� 1���7�2 ���� ��� � ����� �������1�� �� ��/�2� $������ ��� �3�� ������ ����������� ��� �������� �������� �� ������ � ���������� ��� �� �� �� �� ��� ���� �������� 0�������� ������ �� �3�� ��� ��� ��� �������� �������� ���������� � ������������� ���������� 1���� 0�A�,'F7�����0� ?B)@2� %/����� ���� ����� ���� ���6��������� ��� ��� ���������� � ��� �������� ��������� �� �� ������� �� �������� /��� ��� ���� ����1�� �� ��/�2� /���� ��� �� 4��� ������������ �� ���� 0� �� ��� ������� ��������� �� ��� ���������������� �� ��� ��6��� ������ � ������� �� ��� ���������� � ��������� ��� �� ��� � ������������� = ����� ������������ � ����� ������� �������������� ������ ���� ��������� �� �3������ ������ ����� ���� �� �� �� � ����� ���������� ���� ���� /� ��� ��/� ��� ���� ������

������ ������� �/��� � ���� � C ��6�� ����������� � � �������� ��� ��/ ������ �������������� /��� ���� ���� �� �� ��� ���� ����� ���� �������� � ����� ������ �� ��� ��������� �����

�������� �������

$� ���6 ������� O� %����� �� O� �� ����� ������� ����� � ���� � �������

����������

+� 7��� 8-� � ��� �=� $������ �%� �� � � � ���� �� ���� �

� ���� ������ ������ +,�+� �� �������������E �����

��� �� ��� ������ ��� 0����� /��.� /��.����� +..)�

��� +(;H+.)�

'� ������ " ���� A� %�5 �� 7�����6 A� �� � � 8����� ������

������ �� �������� O 6��M � ������� �����E ��������� ��

��� � � ��������� �����5�� ����� 7 0 �� ��� +..(� ���

+,((H+,.D�

B� L�3 7#� A��� 8�� 0����� 8� �� � � ���� �� ���� � ����� ��

.)�OQ0������� ���������� �� -���>�+) ������F���������

��� �� ������� /��� �������� ��� ����� 1�� ������ ������2�

0 �� 0����� 5�� ')))� �� D):HD+D�

D� R�����9��� ��� ������ #$� 8��6��6 �0� ��9�� 8� L ������

������� � ��� =0� ����� �������� � ������� ������

��������� ����������� �� ��� ������������ ����5���

� ��� ����� �������� ������������� +.(.� ��� B.,�

;� � 0� ������� � ���� �� % �� � �� ������� ������5��

�� 0 ����������� 7 (�� ��� +..:� � �� ,';H,'.�

;D( 5*0* 5���� �� � * 6 (.����� 7.��� 0����� 18 ," +- �3"9�3:

:� U�� A�� ��� O0� L �� $$� �/� �Q� $����� �#� ���

������ 77% �� �O-� �������� �� ���� ����������� �

��4��������� �3������� ������ �.� ��� #���� 5�� +...� �!� +;+,H

+;'B�

,� ���5��� ��� ����� 8 � O��� ��� �� � � O������� ����� � ��4 ��

���� ����� ������ ��������� �� ���� �3������� ��������

���.�� ')))� �"�� ;)BH;++�

(� %����� %�� �� � !" �� ��� % ��� 7�� %�� �8� ������

#$� ����� ��� ������� ���� ������ �������� �� ���

���������� /��.������ �� +..(� �� +H')�

.� �� L� �� #� 0�������� �� �� �� ��������� 0� ���� ��������

� ���� � ��� ������������ � �� ������ �������� ���

��������� ���� ������ ������� ��� ��� #��� >�� �>#

+..;� ��� B.B(HB.D'�

+)� �� �/�96 $� �� L� �� #� A������ $0R� �� � � 7 ���������

������ � ������������� ����������� �������� � ������

����� ����� �� ���� ����� ������ ��������� ��� ��� #���

>�� �># +..,� ��� B.)BHB.)(�

++� 0����� L�� A������ #� 8��� #�� ������ � �������

����� � � � �������� ��� ����������� ������� ������

>� ����� +..,� �#� ':(7�

+'� 0����� #8� Q����� �A� �������� � � L������ �#�

��� ��� ���� 0-� ������������� ������ �������� � ���

� � ���������� �� ��� ������� � ������� ������

0����� /��.� /��.����� ')))� � � :.+H,)'�

+B� L ���� #8� 0���� -%� L�� -R� �� � � ������ � � ��

� ���������� �������� �� �������� � � ������ ����

������ � ����� ����� 1�� ������ ������2� 0 �� 0����� 5��

+...� #� .';H.B+�

+D� ����/� # � -� �� L��� #�� �� � � ����������� � � ��

�����O;; ����������� =� �� � �������� ������ � ����

������ ���� � �� �� ��� �� ���� ������ 0����� 5�� +...� #��

',+(H','B�

+;� 0����� L�� % �� R�� 8��� #�� A������ #� ������ �

� �� ������� � � � ������� �������� ���� ���� ������

��������� /�� 7 ��� ')))� ��� +(,H+.;�

+:� 8 � ����� �� %����� %�� �� ��� ������ �� �� � !" ��

��� ����� ��� 8��� ������� � �� �� ��� �������� ������

������ ��� � ����� � ���� ������ ��������� � �����3

�������� 7 /��.� ������ +...� ���� :;H(+�

+,� �� %�� %#� �� -��� -� �� �� �� �� � � � ���� ������ �

��5�� � �� =� ������� ���� ������ ��� ������� ���� ���

���� �� 6������ ������ � ���� K���� ��������� 7 �� 0���

+...� �!�� +('+(H+('B)�

+(� 8�6� #O� %����� %�� ����� 0�� 8��4���� #� A����

���� �O� $����� A �������� ��� ��5���* � �� ��������

��� R����� �������� �������� � ����� 7 � �� +..+� ����

;(+H;.,�

+.� ����� ��� %������63 �� %������� $� �� � � %����K����

��������� ���� �������� � ��� ��������� ��6�� ����

������ �����������' �� � � � ��������� �� 7 0����� +..(� ! �

+D),H+D+:�

')� 8 �� 7� ����� %�� �� %��,)���6� ������ �� ��� ��E ��������

/��� ��� ,( 6� �� ������� ���� ������ �� ��� ���� ���

���� ���� ������� ������� 0� +.(:� ��� '.+HB))�

'+� �� V� A��� �� ���������� �������� ��� �����

������� ��� ��5�� /��� ���������� ������ ��� � � ��

�����E �������� � ������� �������� ��� ����������� =� � ���

���� ��������� ��� ��� #��� >�� �># +..;� ��� :;B,H:;D+�

''� 0����� #� �������� �� L���� 0� �9 �� �� ����� �� ����

0� �K����� �������� � ��=� ������ ���� �� ������� � ��

��� �3������� ������� �� ���� � �������� 7 /��.� ������

+..,� ��"� ++H'B�

'B� O� #��� 8$�� L������6 #A$� �� UU� �� � � ����

��� ��������� � � �� ���� ���� � �� ����� 3������� ��

��� � �� �� ���� +++��������� ������ ������ 8Q��B+�

(.� 7 0����� +..B� ���� +((;H+(.)�

'D� ����� �%#� R���� 8#� ������� L�� �� � � ������� �������� �

�K����� � �� �������� ���� � ����������� =� ������

�������� ��� ��������� ������� ��� ��� +..:� �� .,.H.(D�

';� A��K� 0$� ���� � � 7������ 7� �� � � ������ ������� �� �� �

���� ��+++������� ���� ++) ���������������� ������ ����

��� �� ������� /��� ������� ������ 7 0 �� ��� +..+� ��

:B+H:D)�

':� $��� 7� O���� ��� L����� -� �� � � ���� �F�� �� �� � �����

+B+������� ������ ������ �BB �� ������� /��� ������

��� ������ 7 0 �� ��� +..D� ��� +;:+H+;,+�

',� 7�������� ��� 7���� O=� R������� �� �� � � 0�� �� ���

����E � ���� ������� ���� ������� +(;�)))�8� � � � ����

���� ���.�� +.(D� ���� ;+BH;+:�

'(� A� ���� =� �� ������ -� � �6����� A�� �� L����� 7� ����

��� �� ��������5��� � �/ ������� �� ������� /��� �����

��������� ������� �.�.� �� +.(D� #� ''+H'B'�

'.� A�������� %A� = �6� �� #���� #�� A6�� #8� ������ ���� A�

0�� ��������� ���� � ���� ������ +,�+�� ����� �� �������

������� � �� ������E ��� ��������� �� ��� ���� � ������� �

��� �� ��������� �� ��4����� ������ ��������� /�� 7

0����� +.(:� � � D,H;B�

B)� #���� RA� 7���� #� ������ �#� ������ #� 8���� #��

������ O� ������� � � �� � ���������� ����������

10�A�,'2 ��������� �� ������ ������ ,'�B� 0����� 5��

+.(:� ��� (;)H(;,�

5*0* 5���� �� � * 6 (.����� 7.��� 0����� 18 ," +- �3"9�3: ;D.