Analiza promotorów genów

Marcin Łukaszewicz, Jan Szopa*

Instytut Genetyki i Mikrobiologii, *Instytut Biochemii i Biologii Molekularnej Uniwer-sytetu Wrocławskiego, ul. Przybyszewskiego 63/77, 51-148 Wrocław; *

e-mail:szo-

pa@ibmb. uni. wroc.pl

Streszczenie. Aktualnie tworzone organizmy transgeniczne charakteryzują się między innymiwysokim stopniem specjalizacji. Wprowadza się pojedyncze lub wielogenowe konstrukty w ce-lu precyzyjnej regulacji krytycznej reakcji lub całego szlaku metabolicznego. Stopień specjali-zacji konstruktu, a tym samym i organizmu transgenicznego, zwiększa się przez zastosowaniecoraz lepiej poznawanych cis-regulatorowych sekwencji genów. Zatem regulacja poszczególne-go zmienianego szlaku jest precyzyjna nie tylko co do określonej reakcji, ale również kontrolo-wana odnośnie do czasu i miejsca jej zajścia. Tekst zamieszczony w rozdziale opisuje wieloaspek-towy charakter izolacji oraz badania, jak również zastosowania promotora jako sekwencji regu-latorowej genu. Obok odsyłaczy do wielu baz danych, w których można uzyskać informacjeo charakterystyce dowolnej sekwencji, w rozdziale zamieszczono dane pochodzące z badań wła-snych, które weryfikują eksperymentalnie wyniki poszukiwań in silico.

Słowa kluczowe: geny reporterowe, organizmy transgeniczne, promotor genu

Wstęp

Regulacja ekspresji genów jest bardzo skomplikowaną siecią oddziaływań.Otrzymanie kodowanego przez gen aktywnego białka mogącego oddziaływać naprocesy metaboliczne jest procesem wieloetapowym, obejmującym:

- rozpoznanie przez czynniki transkrypcyjne (TF) promotora i regulacją trans-krypcji genu,

- dojrzewanie RNA (wycinanie intronów, tworzenie czapeczki, poliadenyla-cjo),

- transport mRNA z jądra do cytoplazmy,- inicjację translacji, translację i degradację mRNA,- dojrzewanie i transport białka do odpowiednich kompartmentów,- aktywację i dezaktywację białka, degradację białka.Wszystkie te etapy podlegają precyzyjnej regulacji. Ponieważ każdy kolejny

etap zależy od poprzedniego, kluczowym elementem jest rozpoczęcie procesuw ogóle, czyli transkrypcja. Kolejne etapy wpływają na precyzję regulacji, mogą

69

Analiza promotorów genów

su. Badania eksperymentalne sugerują, że najważniejsze elementy rozpoznawaneprzez czynniki transkrypcyjne, wpływające na ekspresję danego genu, znajdująsię najczęściej w regionie od 500 do 2000 par zasad poprzedzających miejsceinicjacji transkrypcji.

W jaki sposób czynniki transkrypcyjne rozpoznają promotor,a polimeraza początek i kierunek transkrypcji?

Przy końcu 3' promotora odpowiedzialnego za transkrypcję (blisko początkutranskrypcji) znajdują się sekwencje rozpoznawane przez kompleks polimerazyRNA II. Analiza sekwencji i zgromadzone dane eksperymentalne pozwoliły naopracowanie tablic częstości występowania jednego z czterech nukleotydóww obrębie konserwowanych sekwencji, na przykład w TATA box (tabela 1). Dotakich konserwowanych sekwencji zaliczamy (tabela 2):

- CAAT box. Sekwencja znajdująca się około -80 nt od początku transkryp-tu (+1). Odpowiedzialna za wydajność transkrypcji i jej orientację, u roślin wy-stępuje jako AGGA box,

Tabela 1. TATA-box HMM na podstawie 134 sekwencji niepowiązanych promotorówroślinnych http://www.epd.isb-sib.ch/promoter elements/:

Pozycja 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

% A 31,6 16,3 2,0 90,8 0

,0 94,9 57,1 100,0 27,6 69,4 11,2 24,5

%C 24,5 60,2 3,0 2

,1 0

,0 0

,0 0

,0 0

,0 0

,0 3

,1 39,8 52,0

% G 15,3 10,2 0,0 2

,0 1

,0 0

,0 0,0 0,0 2

,0 13,3 37,8 21,4

% T 28,6 13,3 94,9 5,

1 99,0 5,

1 42,9 0,0 70,4 14,3 11,2 2

,1

Konsensus T A T A W A W A

Tabela 2. Konserwowane elementy w obrębie promotora

Motyw Sekwencja (konsensus)CAAT box GGCCAATCT

TATA box TATAA

GC box GGGCGG

CAP (czapeczka) TAC

71

Analiza promotorów genów

Otrzymane cDNA można wyznakować, np. radioaktywnie, a następnie me-todą hybrydyzacji z biblioteki genomowej wyłowić klon zawierający sekwen-cję promotora. Celem potwierdzenia, że fragment genomowy rzeczywiście od-powiada sekwencji cDNA, poddaje się go reakcji sekwencjonowania, po czymmożna klonować promotor i zająć się jego analizą.

Najprostszy sposób izolacji promotora genu, gdy znana jest sekwencja cDNA,polega na wykorzystaniu techniki nazywanej RACE (Rapid Amplification ofcDNA Ends) do powielenia szukanego fragmentu przy użyciu PCR z jednymswoistym primerem i drugim homopolimerowym. Sekwencję genomową, uży-waną dalej jako matrycę, przygotowuje się przez wytrawienie DNA restryktaząSau3AI do wielkości około 20 kpz, a następnie wyposażeniu końców fragmen-tów w homopolimer (oligo dC lub dT) w standardowej reakcji z terminalną trans-ferazą. Tak przygotowany DNA genomowy używa się jako matrycę do namno-żenia interesującego fragmentu, stosując swoisty primer, będący sekwencją kom-plementarną do końca 5' cDNA i drugi primer, którym jest homopolimerkomplementarny do końca cząsteczki DNA genomowego (oligo dG lub dA).

Alternatywą do takiego przygotowania matrycy z adaptorem homopolimero-wym jest DNA wytrawiony dowolnym enzymem restrykcyjnym, dającym od-cinki o długości 20-30 kpz, lub fragmentowany do podobnej wielkości mecha-nicznie i użycie do PCR primera nieswoistego (komercyjny 6-10 nukleotydów)o przypadkowej sekwencji. Drugim primerem jest sekwencja swoista dla cDNA.

Sau3AI Sau3AI Sau3AI Sau3AI

ÿ ÿ ORF ÿ ÿ Fragmetacja- ; genomowego DNA

enzymami

Ligacjahomopolimerów

Nested PCR

Weryfikacja produktów na żelu ipoprzez hybrydyzację

Rys. 2. Klonowanie promotora techniką RACERACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) to metoda pozwalająca powielić na matrycy frag-mentów genowego DNA sekwencje poza końcami znanej ORF (ang. open reading frame, otwartejramki odczytu), wcześniej klonowanej np. w cDNA. Po fragmentacji genomowego DNA restryk-tazą np. Sau3 Al przy użyciu ligazy przyłączane są do końców homopolimery (oligo dC lub dT).Tak przygotowane fragmenty służą jako matryca do PCR, w którym używa się jednego primerakomplementarnego dla homopolimeru, a drugiego komplementarnego do ORF badanego genu.

73

M. Łukaszewicz, J. Szopa

Namnożony fragment przed przystąpieniem do sekwencjonowania należy zwe-ryfikować przez hybrydyzację ze znakowanym cDNA. Wielkość uzyskiwanychfragmentów promotorów waha się od 600 do 1000 nukleotydów dla matrycyz adaptorem homopolimerowym i od 400 do 600 nukleotydów, gdy jest nimprzypadkowa sekwencja 6-10-nukleotydowa.

Jeżeli sekwencja promotora jest już znana (np. zsekwencjonowano cały ge-nom badanego organizmu), można go sklonować metodą PCR na matrycy wy-izolowanego DNA genomowego. Ze względu na różną jakość izolowanego DNAgenomowego modyfikacje typu metylacja lub nadmierna obecność metabolitówtakich jak skrobia, kwasy fenolowe i inne, czasami bardzo trudno jest powielićposzukiwany promotor. Warto więc wziąć pod uwagę przeszukanie dostępnychi licznych banków klonów. Jeszcze inną metodą jest zamówienie syntezy se-kwencji, którą zamierzamy badać. W najbliższym czasie najprawdopodobniejbędzie to najczęstsza metoda, ze względu na szybki spadek cen związany z po-stępem technologicznym w zakresie syntezy polinukleotydów o dowolnej długo-ści (obecnie około l$/nt).

Przed rozpoczęciem badań danego promotora warto przeanalizować dokład-niej jego sekwencję. Warunki, w jakich promotor ulega ekspresji, zależą bowiemod czynników transkrypcyjnych, rozpoznających specyficzne sekwencje, którezostały wcześniej scharakteryzowane.

Jak znaleźć sekwencje rozpoznawane przez czynniktranskrypcyjny?

W jądrze komórkowym DNA jest dość gęsto upakowane, tworząc strukturywyższego rzędu, które utrudniają dostęp do sekwencji rozpoznawanych przezczynnik transkrypcyjny (TF). Do dzisiaj nie wiadomo, w jaki sposób czynnikitranskrypcyjne tak szybko znajdują w całym genomie sekwencję docelową. Przy-puszcza się, że transkrybowane geny znajdują się w pobliżu porów jądrowych,czyli miejsca wnikania TF z cytozolu do jądra komórkowego. Wiadomo, że

w zależności od lokalizacji genu w obrębie chromosomu poziom transkrypcjimoże się znacznie różnić.

Różnice w poziomie ekspresji genu w zależności od jego lokalizacji możnazaobserwować, analizując niezależnie transformowane tym samym konstruktemlinie roślin transgenicznych. W wyniku transformacji roślin powszechnie stoso-wanymi metodami (transformacja przy użyciu Agrobacterium, transformacjabiolistyczna, elektroporacja) wprowadzana sekwencja integruje się z genomemw sposób najprawdopodobniej przypadkowy. Otrzymane transformanty, którezawierają jedną kopię tego samego transgenu, zwykle znacznie różnią się po-ziomem ekspresji badanego białka. W związku z tym, badając promotory

74

Analiza promotorów genów

w transformowanych roślinach, należy użyć do ich analizy kilku niezależnychlinii transformantów.

Czynniki transkrypcyjne regulujące aktywność promotora rozpoznają swoiścieokreślone sekwencje. Istnieje kilka metod poszukiwania miejsc wiązania czyn-ników trankrypcyjnych.

Miejsce wiązania nawet nieznanych czynników transkrypcyjnych w obrębiebadanego genu można ustalić przy pomocy metody określanej jako footprinting.Metoda ta polega na radioaktywnym wyznakowaniu badanego DNA, związaniuczynnika transkrypcyjnego, częściowym trawieniu nieswoistą DNazą I lub frag-mentacji DNA w reakcji wolnorodnikowej i rozdziale na denaturującym żelupoliakrylamidowym powstałych fragmentów kwasu nukleinowego. W wynikutrawienia badana cząsteczka DNA jest przecięta w każdym możliwym miejscuoprócz tych chronionych przez oddziałujące białko, co prowadzi do powstaniafragmentów o różnej długości, widocznych na żelu rozdzielającym w postaciprążków. Porównanie wzoru prążków próby kontrolnej (bez związanych czyn-ników transkrypcyjnych) do wzoru prążków próby badanej pozwala dokładnieokreślić miejsce związania czynnika transkrypcyjnego, który chroni cząsteczkęDNA przed DNazą. Na żelu uwidocznione jest to jako miejsce, w którym niema prążków.

Inną metodą jest gel shift. Wykorzystuje ona różnice w prędkości migracjiw żelu niedenaturującym wolnej cząsteczki DNA i cząsteczki DNA w połącze-niu z białkiem. Metoda ta nie pozwala na zlokalizowanie miejsca wiązania,można jednak za jej pomocą przetestować wiele różnych krótkich sekwencji, copozwala precyzyjnie zidentyfikować miejsca wiązania TF do DNA.

Dysponując oczyszczonym czynnikiem transkrypcyjnym można w dość pro-sty sposób poznać całą gamę rozpoznawanych przez niego sekwencji, stosującmetodę SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment).W pierwszym etapie syntetyzuje się całą kolekcję różnych sekwencji. Możliwajest synteza puli zawierającej 1015 sekwencji. Czynnik transkrypcyjny immobi-lizuje się na złożu w kolumnie, którą przemywa się zsyntetyzowaną pulą frag-mentów DNA. Po wymyciu związanych z kolumną fragmentów powiela się jew reakcji PCR, a następnie znowu nanosi na kolumnę. Cykl ten powtarza się aż

do uzyskania czystej puli sekwencji specyficznie wiązanej przez immobilizowa-ny na kolumnie czynnik transkrypcyjny.

Poznanie sekwencji rozpoznawanych przez czynniki transkrypcyjne orazbodźców stymulujących syntezę określonych czynników teoretycznie powinnoumożliwić na podstawie analizy sekwencji promotora identyfikację warunków,w jakich dany gen będzie ulegał ekspresji.

75

Analiza promotorów genów

sekwencji jest bardzo duże. Poza analizowaną sekwencją, definiowanym para-metrem jest wartość progowa (w przedziale od 0 do 1) podobieństwa znalezio-nych motywów do tablic w bazach danych. Od wysokości zadanej wartości pro-gowej zależy liczba znalezionych miejsc potencjalnie rozpoznawanych przezujęte w bazie danych czynniki transkrypcyjne. Niestety dotychczas nie ma sku-tecznych metod wyodrębnienia trafień fałszywie pozytywnych. W rezultaciedysponujemy obszerną listą potencjalnych czynników, których efekt należyweryfikować eksperymentalnie. Dodatkowo lista czynników wzrośnie, jeżelisekwencję poddamy analizie przez różne bazy danych i programy. Matlnspec-tor

, aby zmniejszyć liczbę pokazywanych czynników transkrypcyjnych, pogru-pował bazę czynników w rodziny o podobnych właściwościach (Cartharius i in.2005). Większość programów umożliwia wybór bazy danych czynników trans-krypcyjnych. Należy sobie postawić pytanie, czy analizując promotor roślinny,korzystać wyłącznie z baz danych zawierających roślinne czynniki transkrypcyj-ne? Nasze doświadczenie wskazuje, że mimo konieczności żmudnej selekcjiprzez eksperymentatora ze znacznie obszerniejszej listy, warto przeprowadzićtaką analizę także przy użyciu innych baz. Istnieje wiele przykładów pokazują-cych, że np. niektóre białka drożdży można funkcjonalnie zastąpić ich odpowied-nikami z ludzkiego genomu. Podobnie może być z czynnikami transkrypcyjny-mi. Dobrym przykładem jest znalezienie w obrębie promotora izoformy 20Rbiałka 14-3-3 z ziemniaka funkcjonalnej domeny MRE (ang. Metal ResponsiveElement) z genomu mysiego odpowiedzialnej za regulację odpowiedzi na jonymetali pozytywnie zweryfikowanej eksperymentalnie (Aksamit i in. 2005).

Inną strategią do identyfikacji potencjalnych motywów mających istotnywpływ na regulację ekspresji promotora jest porównanie sekwencji grupy pro-motorów o domniemanej podobnej regulacji. Wykorzystuje się obecnie dwiemetody do identyfikacji grupy koregulowanych promotorów. Jedna z nich opie-ra się na założeniu, że zmiany ilości transkryptów obserwowane na mikrochi-pach odzwierciedlają zmiany w aktywności promotorów (koekspresja = koregu-lacja). Geny łączy się więc w grupy (ang. clusters), jeżeli obserwuje się wysokąkorelację dodatnią między poziomem ich transkryptów. Założenie to nie jest dokońca prawdziwe z wielu względów, np. indukcja dla różnych genów może być

przesunięta w czasie, mRNA może mieć różną stabilność, w wyniku indukcjijednym czynnikiem może dochodzić do kaskady zdarzeń, w której efekcie in-dukowane sąpromotory nie posiadające homologicznych miejsc wiązania czyn-ników transkrypcyjnych. Druga metoda grupowania genów oparta jest na wy-szukiwaniu homologów u innych gatunków na podstawie sekwencji kodujących.Niezależnie od metody grupowania, na podstawie pogrupowanych sekwencjikodujących należy wyszukać w bazie danych odpowiednie promotory. Następ-nie porównuje się sekwencje promotorów celem znalezienia konserwowanychsekwencji. W ten sposób, używając do wyszukiwania sekwencji kodujących

77

Analiza promotorów genów

Jak transformować rośliny?

Wyróżnia się dwa typy transformacji: czasową i stałą. W transformacji cza-sowej wprowadzony do komórek DNA ulega ekspresji, którą bada się w ciągu24-48 h. Zaletą jest szybki wynik oraz brak konieczności selekcji i regeneracjitransformowanych roślin. Najczęściej wykorzystywanymi metodami do transfor-macji czasowej roślin jest transformacja przy użyciu strzelby genetycznej i elek-troporacji. Przy transformacji stałej dochodzi do integracji z genomem (chromo-somem) wprowadzanego konstruktu. Najchętniej stosowana jest metoda przyużyciu Agrobacterium. Metoda ta jest stosunkowo prosta i wydajna. Zwykle dość

czasochłonne jest uzyskanie konstruktu, który przygotowuje się w specjalnymplazmidzie binarnym, wprowadzanym do Agrobacterium. Niestety nie wszyst-kie gatunki roślin można transformować Agrobacterium, dla pozostałych trzebastosować strzelbę genetyczną lub elektroporację.

Najtrudniejszym etapem otrzymywania roślin transgenicznych jest ich rege-neracja z pojedynczych komórek zawierających badany konstrukt. Powstającewśród regenerowanych roślin wariacje somaklonalne utrudniają otrzymaniewyrównanej odmiany o wyjściowym fenotypie. Dotychczas najczęściej wyko-rzystywane metody prowadzone są przez hodowlę tkanki kallusowej na podło-żu selekcyjnym (zawierającym najczęściej antybiotyk - kanamycynę lub neo-mycynę). Pasażowanie komórek w postaci tkanki kallusowej prowadzi jednak domutacji somaklonalnych, co utrudnia otrzymywanie wyrównanej odmiany o wyj-ściowym fenotypie. Dlatego też poszukiwane są metody, w których nie dopusz-cza się do powstania kallusa. U Arabidopsis można transformować pączki kwia-towe i selekcjonować siewki, wysiewając nasiona na podłoże zawierające czyn-nik selekcyjny (najczęściej antybiotyk - kanamycynę).

Jakie geny reporterowe zastosować?

Białka reporterowe mają łatwą do oznaczenia aktywność enzymatyczną w te-ście o wysokim stopniu amplifikacji, a zatem także o wysokiej czułości. W ba-daniach promotorów roślinnych najpowszechniej wykorzystywanym białkiemwciąż jeszcze jest gen kodujący P-glukuronidazę (GUS). W zależności od za-stosowanego substratu możliwe jest albo wybarwienie na ciemnoniebiesko tkan-ki, w której białko uległo ekspresji (analiza jakościowa, histochemiczna lokali-zacja ekspresji), bądź badanie aktywności enzymatycznej ekstraktów bardzo czu-łą metodą fluorescencyjną (analiza ilościowa). W metodzie z GUS ważne jestutrzymanie właściwego, obojętnego odczynu reakcji (pH 7,0), gdyż w środowi-sku kwaśnym substrat ulega rozpadowi pod wpływem endogennych glukozy-daz i daje fałszywie pozytywny.wynik reakcji.

79

Analiza promotorów genów

Aktywność wielu czynników, ze względu na ich specyfikę działania, trudnopotwierdzić eksperymentalnie. Weryfikacja eksperymentalna pokazuje, że mniejniż połowa testowanych czynników modyfikuje ekspresję reportera (tabela 3).

Najtrudniejszym etapem może się okazać analiza znaczenia fizjologicznegootrzymanych wyników. Dzięki badaniom promotorów różnymi metodami, po-zyskujemy informacje dotyczące lokalizacji ekspresji genu oraz warunków, w ja-kich może dojść do indukcji lub represji promotora. W wielu przypadkach eks-presja jednego genu jest powiązana w różny sposób z szeregiem szlaków meta-bolicznych. W dodatku często zdarza się, że istnieje wiele izoform kodującychbiałka o takiej samej aktywności enzymatycznej, których obecność może miećgłównie sens z precyzyjną regulacją. Powiązanie wszystkich wyników w spójnąsieć oddziaływań jest zadaniem trudnym ze względu na bardzo dużą ilość tychpowiązań. Nikt nie jest w stanie śledzić na bieżąco gromadzonej informacji. Abyskorzystać z bazy danych, trzeba wiedzieć ojej istnieniu, a-jak oszacowano -w 2004 roku nowa baza danych powstawała co drugi dzień. Dlatego też kluczo-wym elementem dla dalszego postępu będzie „linkowanie" nowych informacji.Innymi słowy, nowa informacja bez wskazania jak największej ilości powiązańz istniejącymi danymi będzie mało przydatna. Tak jak baza danych czynnikówtranskrypcyjnych jest ściśle powiązana z bazą danych rozpoznawanych przez niesekwencji, kolejnym krokiem będzie połączenie tych baz z regulowanymi przezczynniki transkrypcyjne enzymami i szlakami metabolicznymi. Programy takiesą powoli tworzone, np. www.genomatix.de. Niestety jest to baza komercyjnai nowe programy są udostępniane odpłatnie.

Z tabeli 3 wynika, że pośród 10 sekwencji zidentyfikowanych in silico w pro-motorze 16R genu rodziny 14-3-3 tylko 5 ma najprawdopodobniej znaczeniefizjologiczne. Doświadczalna weryfikacja potencjalnych miejsc wiązania czyn-ników transkrypcyjnych dla promotora 20R potwierdziła tylko 4 miejsca akty-wacji na 12 sekwencji znalezionych in silico. Zatem wiarygodność bazy danychczynników transkrypcyjnych kształtuje się na poziomie 30-50%.

81

Analiza promotorów genów

Literatura

Aksamit A., Korobczak A., Skała J., Łukaszewicz M., Szopa J. 2005. The 14-3-3 geneexpression specificity in response to stress is promoter dependent. Plant Cell Phy-siol. (in press)

Alvarado M.C., Zsigmond L.M., Kovacs I., Cseplo A., Kończ C., Szabados L.M. 2004.Gene Trapping with firefly luciferase in Arabidopsis. Tagging of Stress-ResponsiveGenes. Plant Physiol. 134: 18-27.

Cartharius K., Freeh K., Grote K., Klocke B., Haltmeier M., Klingenhoff A., Frisch M.,Bayerlein M., Werner T. 2005. Matlnspector and beyond: promoter analysis basedon transcription factor binding sites. Bioinformatics. (in press)

Galperin, M.Y. 2005. The Molecular Biology Database Collection: 2005 update. Nucl.Acids Res. 33, Database issue D5-D24.

Grandjean O., Vernoux T., Laufs P., Belcram K., Mizukami Y., Traas J. 2004. In vivoanalysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meri-stem in Arabidopsis. Plant Cell 16: 74-74.

Prestridge D.S. 2000. Computer software for eukaryotic promoter analysis. MethodsMol. Biol. 130: 265-95.

Szabados L., Kovacs I., Abraham E., Oberschall A., Nagy R., Zsigmond L., KrasovskajaI., Kerekes I., Ben-Haim A., Kończ C. 2000. Arabidopsis genome project in Hun-

gary: generating T-DNA tagged Arabidopsis genes. Plant Physiol. Biochem. 38: S98.Wagner A. 1999. Genes regulated cooperatively by one or more transcription factors and

their identification in whole eukaryotic genomes. Bioinformatics 15: 776-784.