dna

10.10.2013.

1

POPRAVAK DNAPOPRAVAK DNA

• oštećenja DNA mogu biti– spontana– inducirana (kemijskim i fizičkim faktorima)

Oštećenja DNA

U se spaja s A

posljedica

tranzicija CG-AT

H se spaja s C tranzicija AT-GC

ne spaja se zastoj sinteze

Ø spontana oštećenja– deaminacija adenina, gvanina i citozina

• spontani gubitak amino-grupe• posljedica: supstitucija baza (dolazi do mutacija) ili zastoj

sinteze

gubitak baze

• depurinacija = gubitak citozina ili timina

• depirimidinizacija = gubitak adenina ili gvanina

– depurinacija i depirimidinizacija• spontani gubitak baze • nastaje tzv. AP (apurinsko/apirimidinsko) mjesto• posljedica: zaustavljanje replikacije ili jednolančani lom u DNA UV zračenje

pogrešna veza

– uzrokuje nastajanje pirimidinskih dimera∼ povezuju se susjedne pirimidinske baze

ciklobutanskim prstenom– narušava se struktura DNA

prije poslije

UV foton

Ø inducirana oštećenja

• UV svjetlo

10.10.2013.

2

Ø inducirana oštećenja

– alkiliranje • adicija metilne ili etilne skupine uslijed djelovanja alkilirajućih

agensa

– adicija velikih kemijskih grupa na DNA• uslijed djelovanja citotoksičnih, mutagenih ili kancerogenih

agensa

• izravni popravak• enzimska fotoreaktivacija• uklanjanje alkil-grupe iz alkilirane baze

• popravak izrezivanjem (ekscizijom)• izrezivanje baza• izrezivanje nukleotida• popravak povezan s transkripcijom

• popravak pogrešno sparenih baza

• translezijska sinteza DNA

• rekombinacijski popravak

Popravak oštećene DNA

UV

nastajanje dimera

vezanje enzimaDNA-fotoliaza

popravljena DNA

vidljiva svjetlost

? enzimska fotoreaktivacija• enzim fotoliaza nakon apsorpcije vidljive svjetlosti cijepa pirimidinskidimer

? uklanjanje alkil grupe s alkilirane baze

• npr. popravak O6 - metilgvanina

∼ enzim O6 -metiltransferaza prenosi metilnu grupu s O6 -metilgvaninana cistein koji se nalazi na njegovom aktivnom mjestu






10.10.2013.

3

oštećena baza

DNA glikozilaza

DNA polimeraza IDNA ligaza

AP endonukleaza

AP mjesto

? popravak izrezivanjem baza

• oštećenu ili pogrešnu bazu prepoznaje DNA-glikozilaza• kida vezu između baze i deoksiriboze• nastaje AP mjesto

∼ nema baze, ostaje samo šećer

• AP mjesto prepoznaje AP endonukleaza • kida lanac DNA hidrolizom fosfodiesterske

vezedeoksiriboza-fosfodiesteraza • deoksiriboza-fosfodiesteraza uklanja

deoskiribozu

• DNA polimeraza I popunjava pukotinu

• DNA ligaza “lijepi” lanac DNA

oštećeni nukleotid

Uvr ABC kompleks

helikaza

DNA polimeraza IDNA ligaza

? popravak izrezivanjem nukleotida - prokarioti

• oštećenu DNA prepoznaje UvrABC kompleks• izrezuje oligonukleotid od 12-13 baza

• helikaza uklanja nukleotid s oštećenim bazama

• DNA polimeraza I popunjava pukotinu

• DNA ligaza “lijepi” lanac DNA

? popravak izrezivanjem nukleotida - sisavci

• prepoznavanje mjesta oštećenja (XPC protein)

• vezanje proteina koji stabiliziraju jednolančanu DNA

• XPA i RPA (replikacijski protein A)

• vezanje helikaza i odmotavanje ∼25pb oko mjesta oštećenja

• TFIIH protein∼ ima helikazne podjedinice XPB i XPD

• vezanje endonukleaza koje cijepaju DNA na 3’ i 5’ kraju mjesta oštećenja

• proteini XPG i XPF/ERCC

? popravak izrezivanjem nukleotida – sisavci

• izrezivanje nukleotida ∼30pb oko mjesta oštećenja

• popunjavanje nastale pukotine• DNA-polimeraza δ• ligaza

? popravak povezan s transkripcijom - prokarioti• specifičan je za popravak oštećenja unutar gena koji se prepisuju

• RNA polimeraza se zaustavlja na mjestu oštećenja

• zaustavljenu RNA polimerazu prepoznaje specifičan protein –faktor povezan s tranksripcijom (Mfd) i uklanja ju

• vezanje UvrABC kompleksa i izrezivanje oštećenja

? popravak povezan s transkripcijom - sisavci• specifičan je za popravak oštećenja unutar gena koji se prepisuju

• RNA polimeraza se zaustavlja na mjestu oštećenja

• vezanje proteina koji prepoznaju zaustavljenu RNA polimerazu • CSA i CSB

• vezanje proteina koji stabiliziraju jednolančanu DNA• XPA i RPA

• vezanje helikaza• TFIIH (XPB i XPD)

10.10.2013.

4

• popunjavanje pukotine • DNA polimeraza δ

• “lijepljenje” lanca DNA • DNA ligaza

• vezanje endonukleaza i cijepanje oštećene DNA • XPG i heterodimer XPF/ERCC1

global genome nucleotideexcision repair (GG-NER)

transcriptional coupled nucleotideexcision repair (TC-NER)

XPC uvijek dolazi u kompleksu sa hHR23B






? popravak pogrešno sparenih baza - prokarioti

• krivo sparenu bazu prepoznaje i na nju se veže protein MutS

• na MutS se veže protein MutL

• na protein MutL se veže protein MutH, koji prepoznaje nemodificirani roditeljski lanac i kida ga

• MutH se zatim otpušta, a MutS i MutL, zajedno s helikazom i egzonukleazom izrezuju dio lanca koji sadrži pogrešno sparenu bazu

• DNA polimeraza popunjava pukotinu

• ligaza zatvara pukotinu

• kod prokariota roditeljski i novosintetizirani lanac se razlikuju, jer je DNA modificirana metilacijom adenina

∼ do metilacije dolazi nakon replikacije, pa novosintetizirani lanci nisu metilirani

• kod eukariota prepoznavanje se temelji na tome što lanac kalup nema nikakav prekid

∼ u vodećem lancu prekid je na rastućem 3’ kraju∼ u zaostajućem lancu prekid je na 3’ i 5’ kraju Okazakijevih

fragmenata

10.10.2013.

5

? popravak pogrešno sparenih baza – sisavci

• krivo sparenu bazu prepoznaje i na nju se veže protein MSH ∼ dimer je MSH2+MSH6

• na kompleks DNA-MSH veže se protein MLH∼ dolazi kao heterodimer

• vezanje egzonukleaze

• izrezivaje dijela lanca s oštećenjem• DNA polimeraza popunjava pukotinu • ligaza zatvara pukotinu






? translezijska sinteza DNA

• specijalizirana DNA polimeraza prepoznaje mjesto oštećenja i veže se na njega, a regularna DNA polimeraza disocira

• specijalizirana DNA polimeraza nastavlja sintezu preko mjesta oštećenja

• regularna DNA polimeraza se zaustavlja na mjestu oštećenja

? translezijska sinteza DNA

• nakon sinteze DNA preko mjesta oštećenja, otpušta se specijalizirana i sintezu nastavlja regularna DNA polimeraza

• oštećenje se uklanja izrezivanjem nakon završene replikacije






? rekombinacijski popravak

10.10.2013.

6

• mehanizam nehomolognog spajanja krajeva ∼ mutagen je, jer se uklanja nekoliko pb oko mjesta loma

DNA s oštećenjem

oštećeni roditeljski lanacnovosintetizirani lanac s prazninom

normalni heliks DNA

normalni novosintetizirani lanacroditeljski lanac s prazninom

oštećeni roditeljski lanacpopravljeni novosintetizirani lanac

DNA s oštećenjem

normalni heliks DNA

∼ praznina u novosintetiziranom lancu koja se nalazi nasuprot dimeru u roditeljskom lancu, popunjava se homolognim segmentom sestrinskog lanca

• mehanizam homologne rekombinacije

REKOMBINACIJAREKOMBINACIJA

v Hollidayev model homologne ili opće rekombinacije

• rekombinacija je cijepanje i ponovno spajanje dvije DNA molekule, pri čemu dolazi do izmjene njihovih genetičkih informacija

• homologna rekombinacija je rekombinacija između dvije homologne molekula DNA

• istovremeni urezi u obje roditeljske molekule

• djelomično razmotavanje lanaca i sparivanje komplementarnih baza između zarezanih roditeljskih lanaca

• nastaje struktura na kojoj se vidi prekriženje (Hollidayeva veza)∼ prolazi niz rotacijskih izmjena

• roditeljske molekule DNA

• Hollidayev model

10.10.2013.

7

dvolančani lom DNA

• novi model s objašnjenjem inicijacije rekombinacije

jednolančani krajevi zalaze u drugu roditeljsku molekulu i spajaju se komplementarne baze

razgradnja nukleazom u 5’-3’ smjeru u oba lanca

pukotine se popunjavaju sintezom i zatvaraju ligacijom

b) vezanje RecA proteina na drugu, dvolančanu DNA

a) vezanje RecA proteina na jednolančanu DNA

c) sparivanje baza jednog lanaca dvolančane DNA s jednolančanom DNA

d) disociranje drugog lanca dvolančane DNA

ü proteini uključeni u izmjenu lanaca

"prokarioti – protein RecA

"eukarioti – proteini Rad51 i Dmc1

V

O

vodoravni rezokomiti rez

ü proteini uključeni u razrješenje Hollidayeve veze

"prokarioti – proteini RuvA, B i C

RuvA prepoznaje Hollidayevu vezu

RuvB potiče migracijuprekriženja

ü proteini uključeni u razrješenje Hollidayeve veze

RuvC cijepa Hollidayevu vezu

"eukarioti – endonukleazni kompleks Mus81-Eme1

"prokarioti – proteini RuvA, B i C ∼ rotacijske izmjene

10.10.2013.

8

∼ crossing-over tokom mejoze

• odvija se između specifičnih kratkih homolognih sljedova u područjima DNA koja nisu potpuno homologna

• kod kralježnjaka ima važnu ulogu u stvaranju imunoglobulinskih gena i gena receptora T-stanica tokom razvoja imunološkog sustava

• za imunoodgovor su važni:– B-limfociti – izlučuju protutijela (imunoglobulini)– T-limfociti – izlučuju proteine stanične površine (receptori T-

stanica)

vmjesno-specifična rekombinacija

PRESLAGIVANJE DNAPRESLAGIVANJE DNA

• imunoglobulini i receptori T-stanica – vrlo raznoliki– kodirani limfocitnim genima

• nastaju tokom razvoja imunološkog sustava uslijed mjesno-specifične rekombinacije između različitih segmenata imunoglobulina i gena za receptore T-stanica

v mjesno-specifična rekombinacija

üimunoglobulini su građeni od lakih i teških lanaca∼lanci imaju varijabilna i konstantna područja∼varijabilna područja su odgovorna za vezanje antigena

• transpozicija = premještanje sljedova unutar genoma– nema homologije između sljedova

• transpozoni – pokretni genetički elementi koji se mogu ubaciti ili izdvojiti iz

molekule DNA neovisno o sustavu rekombinacije stanice– mogu se premještati putem DNA ili RNA intermedijara

• insercijski sljedovi– najjednostavniji transpozoni koji se premještaju putem DNA

intermedijara– sadrže samo gen za enzim transpozazu– na krajevima imaju ponavljajuće sljedove

• baze na jednom kraju sekvence ponavljaju se u obrnutom redoslijedu obzirom na baze na drugom kraju

– premještaju se unutar genoma, ali se pri tome ne repliciraju

v transpozicija posredovana DNA intermedijarima

• retrotranspozoni– premještaju se preko RNA-intermedijara– transpozon se prvo prepisuje u RNA, a zatim se

reverznom transkripcijom RNA prepisuje u DNA– mehanizam je sličan premještanju retrovirusa

v transpozicija posredovana RNA intermedijarima

10.10.2013.

9

• retrovirusi– njihov genom čini jednolančana RNA– kada retrovirus inficira stanicu, RNA ulazi u stanicu i u njoj se

stvara dvolančana DNA kopija molekule DNA djelovanjem enzima reverzne transkriptaze

– na krajevima tako nastale DNA nalaze se ponavljajući sljedovi LTR (duga terminalna ponavljanja)

• retrovirusu slični elementi– imaju LTR sljedove– kodiraju reverznu transkriptazu i integrazu– premještaju se poput retrovirusa

• LINE-elementi (visokoponavljajući dugi raspršeni elementi)

∼ nemaju LTR sljedove∼ kodiraju reverznu transkriptazu i integrazu∼ na 3’ kraju imaju sljedove bogate adeninom

• SINE-elementi (visokoponavljajući kratki raspršeni elementi)∼ nastaju reverznom transkripcijom malih molekula RNA∼ ne kodiraju funkcionalne produkte∼ predstavljaju pseudogene

– inaktivna kopija gena

– nastaju reverznom transkripcijom mRNA

– na krajevima imaju sekvence bogate adeninom

– nemaju introne– nemaju promotore

• dorađeni pseudogeni v amplifikacija gena

• uzastopne replikacije određenog kromosomskog područja

• posljedica: povećan broj kopija gena unutar stanice

dna

Documents