dna-analytik - cpi.uni-freiburg.de · • kurze dna-sonden, die an jeweils einen strang eines...
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3. Vorlesungsstunde:���Die Geheimnisse der PCR
5´
2´
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N
H2N
Guanin
The Polymerase Chain Reaction (PCR)is exponential
Primer annealingat 60-50°C
Melting of DNA at~95°C Polymerisation at
72°C
1. Cycle 2. Cycle
PCR and TaqMan are registered trademarks of Hoffmann La Roche and Perkin Elmer
PCR
Was brauche ich zur PCR
• Eine DNA-Vorlage := Template • Zwei kurze DNA Abschnitte, die an das Template
binden := Primer • Die thermostabile DNA-Polymerase • Desoxyribonukleotidtriphosphate:= dNTPs (dATP,
dCTP, dGTP, dTTP) • Das Gerät zur Durchführung := Thermocycler
Was ist das Template ?
• Das Template ist eine DNA. • Die Template-DNA kann doppelsträngig (Normalfall)
oder einzelsträngig sein. • Die DNA sollte eine Länge von 60-5000 Nukleotiden
haben. • Besondere Enzymgemische (Long-PCR) können auch
bis zu 50000 Nukleotide lange Templates amplifizieren.
Und wie geht die PCR ?
3 Phasen: 1. Denaturierung 2. Annealing 3. Extension
40x
Faustregel: pro Minute werden���in der Extension Phase ca. ���1.000 Nukleotide aufgebaut
Was sind Primer
• Primer sind kurze DNA-Stränge • Die an die Template-DNA binden • Die ca. 20 Nukleotide (nt) Länge aufweisen • Deren Schmelzpunkt bei ca 60° C liegt • Die Primer binden bei geeigneten Temperaturen (z.B. 60°) an je
einen Template-Strang • Bei der Extension baut die Polymerase von den Primern an den
neuen DNA-Strang auf
Was sind PCR-Primerpaare
• Kurze DNA-Sonden, die an jeweils einen Strang eines DNA-Doppelstranges bei gleicher Temperatur binden, so daß der jeweilige Strang von einer Polymerase 5´-3´ verlängert werden kann���und���die beiden Primer maximal 5000 Basenpaare auseinander liegen
• Primerpaare haben annähernd den gleichen Tm
Wieviel DNA brauche ich pro Reaktion ?
• Theoretisch genügt ein Molekül • Aber ein Molekül kann man man nicht gut dispensieren • Um sicher zu sein sollte ich pro Experiment mit
mindestens 10 Kopien meiner Template-DNA arbeiten • Liegt zuviel Template-DNA vor, so kann die PCR nicht
mehr effizient arbeiten ! • Z.T. muss die ideale Template-Menge experimentell
ermittelt werden
Das Geheimnis des Schmelzpunktes
• Der Schmelzpunkt einer doppelsträngigen DNA ist die Temperatur bei der 50% der DNA als Einzelsträge vorliegen!
• Berechnung der Schmelztemperaturen von DNA-Oligonukleotiden:!
• %GC-Methode:!
• tm = 81.5 - 21.59 - (675 / length) + (0.41 * %GC)!
• wobei -21.59 = 16.6 x log10 [K+]!
Nearest Neighbour Methode • tm = (deltaH / (deltaS - 43.9317 - 2.8)) - 273.15 - 21.59!
• wobei: -43.9317 = R x ln(c) mit R = 1.987 cal / K x mol!• und c = 250 pM!
• deltaH = - (1000 * summe(dH))!• deltaS = - summe(dS) - 10.8!
• wobei -10.8 = Entropie der Helix-Initiation!
• -21.59 = 16.6 x log ([K+]) mit [K+] = 50 mM!• !• 2.8 = Korrekturfaktor für nicht-komplementäre Oligos!
• Diesen Berechnungen liegt eine Oligokonzentration von 250 pM und eine K+-Konzentration von 50 mM zugrunde.!
Schmelzpunkt per Hand
• Pro A oder T: 2°C • Pro G oder C: 4°C
• Einfach aufaddieren
• Gilt für kurze DNA-Stränge
Was ist Gelelektrophorese ?
• Das Auftrennen geladener Moleküle im elektrischen Feld
• Die Auftrennung wird durch ein Gel unterstützt, d.h. eine permeable Matrix, die die Moleküle abhängig ihrer Größe zurückhält
• Die Auflösung wird vor allem durch die „Dichte“ des Gels bestimmt
Interkalierende Farbstoffe
• färben Nukleinsäuren unspezifisch an • ändern das Fluoreszenzverhalten bei Bindung an
Nukleinsäuren • Nachweisgrenzen bei ca. 10 ng - 100 fg DNA je nach
Farbstoff • kann in das Gel mit hinzugegeben werden oder aber das
Gel wird nach der Elektrophorese in dem Farbstoff gebadet