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Bibliografische Informationen der Deutschen Bibliothek

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1. Auflage 2006

© 2006 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen

Printed in Germany

ISBN 3-938026-81-2

Verlag: DVG Service GmbH

Frankfurter Straße 89

35392 Gießen

0641/24466

[email protected]

www.dvg.net

Aus dem Institut für Virologie

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

und dem Institut für Virusdiagnostik

des Friedrich-Loeffler-Instituts, Insel Riems

Etablierung, Validierung und praktische Anwendung

einer multiplex real-time RT-PCR zum Nachweis

des Rabbit Haemorrhagic Disease Virus

INAUGURAL-DISSERTATION

Zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Astrid Gall

aus Ibbenbüren

Hannover 2006

Wissenschaftliche Betreuung:

Prof. Dr. med. vet. B. Grummer, Tierärztliche Hochschule Hannover

PD Dr. med. vet. M. Beer, Friedrich-Loeffler-Institut, Insel Riems

1. Gutachterin: Prof. Dr. med. vet. B. Grummer

2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. G. von Samson-Himmelstjerna

Tag der mündlichen Prüfung: 29. Mai 2006

Meinen Liebsten

INHALTSVERZEICHNIS

1 EINLEITUNG......................................................................................... 11

2 LITERATURÜBERSICHT .................................................................... 13

2.1 Die Rabbit Haemorrhagic Disease ............................................................... 13

2.1.1 Ätiologie / Das Rabbit Haemorrhagic Disease Virus...................................... 13

2.1.1.1 Taxonomie........................................................................................................ 13

2.1.1.2 Morphologie und physikalische Eigenschaften................................................ 13

2.1.1.3 Genomorganisation und Proteine ..................................................................... 14

2.1.2 Klinik, Pathologie und Pathogenese................................................................ 16

2.1.3 Epidemiologie und Bekämpfung ..................................................................... 18

2.1.4 Laboratoriumsdiagnose.................................................................................... 21

2.1.4.1 Indirekter Erregernachweis .............................................................................. 21

2.1.4.2 Direkter Erregernachweis................................................................................. 21

2.2 Die quantitative real-time Polymerasekettenreaktion................................ 22

2.2.1 Einleitung......................................................................................................... 22

2.2.2 Detektionssysteme ........................................................................................... 26

2.2.2.1 Detektionssysteme ohne Zuwachs an Spezifität .............................................. 26

2.2.2.2 Detektionssysteme mit Zuwachs an Spezifität................................................. 29

2.2.3 Datenanalyse.................................................................................................... 33

2.2.4 Quantifizierung ................................................................................................ 35

2.2.4.1 Absolute Quantifizierung ................................................................................. 35

2.2.4.2 Relative Quantifizierung .................................................................................. 37

2.2.5 Multiplex real-time PCR.................................................................................. 39

2.2.6 Interne Kontrollen............................................................................................ 40

INHALTSVERZEICHNIS

3 MATERIAL UND METHODEN........................................................... 43

3.1 Virusstämme .................................................................................................. 43

3.2 RNA-Isolierung.............................................................................................. 43

3.2.1 Allgemeines ..................................................................................................... 43

3.2.2 RNA-Isolierung mit dem RNeasy® Mini Kit ................................................. 44

3.2.3 RNA-Isolierung mit dem QIAamp® Viral RNA Mini Kit ............................. 45

3.2.4 RNA-Isolierung mit TRIzol®Reagent ............................................................ 45

3.3 Klonierung und in vitro-Transkription ....................................................... 46

3.3.1 Allgemeines ..................................................................................................... 46

3.3.2 Herstellung einer positiven Kontrolle für die real-time RT-PCR ................... 47

3.3.2.1 Amplifizierung mittels RT-PCR ...................................................................... 47

3.3.2.2 Klonierung........................................................................................................ 48

3.3.2.3 In vitro-Transkription....................................................................................... 50

3.3.3 Herstellung einer positiven Kontrolle für die Formaldehyd-

Agarosegelelektrophorese und den Northern Blot .......................................... 52

3.3.4 Herstellung der RNA-Sonden für den Northern Blot und die In situ-

Hybridisierung ................................................................................................. 53

3.4 Real-time RT-PCR ......................................................................................... 54

3.4.1 Auswahl von Primern und Sonden .................................................................. 54

3.4.2 Reaktionsbedingungen..................................................................................... 55

3.5 Konventionelle RT-PCR ............................................................................... 56

3.6 Agarosegelelektrophorese, Membrantransfer von RNA ........................... 58

3.6.1 Agarosegelelektrophorese (für DNA) ............................................................. 58

3.6.2 Formaldehyd-Agarosegelektrophorese (für RNA).......................................... 59

3.6.3 Dot Blot und Northern Blot ............................................................................. 59

3.7 Antigen-ELISA .............................................................................................. 61

3.8 Antikörper-ELISA......................................................................................... 62

3.9 Zellen und Zellkulturtechnik........................................................................ 62

3.10 Infektion und Transfektion........................................................................... 63

3.11 Indirekter Immunfluoreszenztest ................................................................ 64

3.12 Hämagglutinationstest................................................................................... 64

3.13 Viruskonzentrierung ..................................................................................... 65

3.14 Histologie und Immunhistologie .................................................................. 65

3.15 In situ-Hybridisierung................................................................................... 66

3.16 Untersuchungen zur Viruspersistenz in rekonvaleszenten Tieren ........... 67

3.17 Untersuchungen zum carrier-Status von immunisierten Tieren nach

challenge-Infektion ........................................................................................ 69

3.18 Untersuchungen zur in vitro-Replikation nach Infektion und Transfektion

......................................................................................................................... 70

4 ERGEBNISSE ........................................................................................ 71

4.1 Etablierung einer multiplex real-time RT-PCR für RHDV ....................... 71

4.1.1 Primer- und Sondendesign............................................................................... 71

4.1.2 Optimierung der Reaktionsbedingungen ......................................................... 73

4.1.3 Herstellung einer positiven Kontrolle und externer RNA-Standards.............. 73

4.1.4 Sensitivität ....................................................................................................... 74

4.1.4.1 Analytische Sensitivität.................................................................................... 74

4.1.4.2 Sensitivität des single und multiplex real-time RT-PCR assays ...................... 74

INHALTSVERZEICHNIS

4.1.4.3 Sensitivität im Vergleich zur konventionellen RT-PCR.................................. 77

4.1.4.4 Sensitivität im Vergleich zum Antigen-ELISA ............................................... 79

4.1.5 Spezifität .......................................................................................................... 79

4.2 Untersuchungen zur Viruspersistenz in rekonvaleszenten Tieren ........... 81

4.2.1 Klinik und Pathologie ...................................................................................... 81

4.2.2 Detektion von Antikörpern .............................................................................. 83

4.2.3 Verteilung der Virusgenomlast und Charakterisierung der isolierten RNA ... 84

4.2.4 Detektion von Antigen oder infektiösem Virus............................................... 88


challenge-Infektion ........................................................................................ 88

4.3.1 Detektion von Antikörpern .............................................................................. 88

4.3.2 Verteilung der Virusgenomlast........................................................................ 89

4.4 Kinetik von Replikationsvorgängen in vitro................................................ 91

4.4.1 Kinetik nach Infektion ..................................................................................... 91

4.4.2 Kinetik nach Transfektion ............................................................................... 92

5 DISKUSSION......................................................................................... 95

5.1 Etablierung einer multiplex real-time RT-PCR für RHDV ....................... 95

5.2 Nachweis der Persistenz von Virusgenom in rekonvaleszenten sowie

immunisierten und danach feldvirusexponierten Kaninchen ................... 99

5.3 Kinetik von Replikationsvorgängen des RHDV in vitro .......................... 103

6 ZUSAMMENFASSUNG ..................................................................... 105

7 SUMMARY.......................................................................................... 107

8 LITERATURVERZEICHNIS .............................................................. 109

9 ANHANG ............................................................................................. 135

9.1 Material ........................................................................................................ 135

9.1.1 Virusstämme .................................................................................................. 135

9.1.2 Zellen und Bakterienstämme ......................................................................... 135

9.1.3 Versuchstiere ................................................................................................. 135

9.1.4 Primer, Sonden, Nukleinsäuren und Längenstandards.................................. 136

9.1.5 Enzyme .......................................................................................................... 136

9.1.6 Kommerziell erhältliche Systeme.................................................................. 137

9.1.7 Antigene, Antikörper und Konjugate ............................................................ 137

9.1.8 Puffer, Lösungen, Nährmedien und Wasser.................................................. 138

9.1.8.1 RNA-Isolierung, PCR .................................................................................... 138

9.1.8.2 Klonierung und in vitro-Transkription........................................................... 139

9.1.8.3 Agarosegelelektrophorese, Membrantransfer von RNA................................ 140

9.1.8.4 ELISA............................................................................................................. 143

9.1.8.5 Zellkultur, Hämagglutinationstest, Viruskonzentrierung............................... 144

9.1.8.6 Pathohistologie, Immunhistologie, In situ-Hybridisierung ............................ 144

9.1.9 Sonstige Reagentien....................................................................................... 146

9.2 Geräte und Gebrauchsgegenstände ........................................................... 147

9.3 Verbrauchsmaterialien ............................................................................... 149

9.4 Software........................................................................................................ 150

9.5 Tabellenverzeichnis ..................................................................................... 150

9.6 Abbildungsverzeichnis ................................................................................ 150

9.7 Abkürzungsverzeichnis ............................................................................... 155

11

1 EINLEITUNG

Die Rabbit Haemorrhagic Disease (RHD, syn. Hämorrhagische Krankheit der Kaninchen) ist

eine 1984 erstmals beschriebene und mittlerweile weltweit auftretende Erkrankung adulter

Kaninchen der Species Oryctolagus cuniculus. Sie wird durch das Rabbit Haemorrhagic

Disease Virus (RHDV), ein RNA-Virus aus der Familie Caliciviridae, verursacht.

Die RHD verläuft in den meisten Fällen perakut bis akut, daneben wurden aber auch eine

subakute sowie eine chronische Verlaufsform beschrieben. Starkes Fieber, eine hochgradige

Leberschädigung und Veränderungen im Sinne einer Disseminierten Intravasalen Gerinnung

dominieren das Krankheitsbild. Die Morbidität und die Mortalität können bis zu 100 %

betragen. Die Epidemiologie der Erkrankung ist bisher wenig untersucht. Insbesondere die

Bedeutung von rekonvaleszenten Tieren, immunisierten Tieren nach Kontakt mit Feldvirus

und Jungtieren - die zwar infizierbar sind, aber nicht erkranken - ist noch weitgehend

ungeklärt. In der letzten Zeit wurde eine Viruspersistenz als wichtiger Faktor diskutiert,

bislang gab es aber keine experimentellen Studien zur Klärung dieser Frage.

Die virologische Diagnostik der RHD basierte zunächst auf dem Hämagglutinationstest sowie

dem Antigennachweis mittels Elektronenmikroskopie, ELISA (engl. enzyme linked

immunosorbent assay, Enzym-gekoppelter Immuntest), Immunhistologie und Western Blot.

Seit 1995 wird eine konventionelle RT-PCR (engl. reverse transcriptase-polymerase chain

reaction, Reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion) eingesetzt, die vor allem der

Untersuchung pathogenetischer und epidemiologischer Fragestellungen dient. Da kein

Zellkultursystem zur produktiven Vermehrung des RHDV existiert, war eine hochsensitive

Quantifizierung des RHDV bis dato nicht möglich.

In den letzten Jahren wird vermehrt die real-time PCR als hochsensitive und spezifische

Methode zur Diagnostik und Quantifizierung verschiedener Pathogene eingesetzt. Durch die

simultane Amplifizierung und Detektion der Produkte über Fluoreszenzsignale entfällt hierbei

eine Agarosegelelektrophorese, so daß diese Methode ferner eine geringere

Kontaminationsgefahr aufweist und schnellere Resultate ermöglicht als eine konventionelle

PCR.

Ziel dieser Arbeit war daher, eine real-time RT-PCR als neue Methode zum Nachweis des

RHDV zu etablieren und zu validieren. Durch ihre Anwendung bei tierexperimentellen

Studien zum Genomnachweis bei rekonvaleszenten sowie immunisierten und danach

EINLEITUNG

12

feldvirusexponierten Kaninchen sollten neue Erkenntnisse zu Vorkommen und Bedeutung

von Virus- bzw. RNA-Persistenz in der Epidemiologie der RHD erhalten werden. Der Einsatz

der entwickelten real-time RT-PCR für in vitro Studien zielte darauf, die Replikation des

RHDV auf genomischer Ebene zu analysieren, um mögliche Ursachen für dessen fehlende

produktive Vermehrung in Zellkulturen zu ermitteln.

Die Rabbit Haemorrhagic Disease

13

2 LITERATURÜBERSICHT

2.1 Die Rabbit Haemorrhagic Disease

2.1.1 Ätiologie / Das Rabbit Haemorrhagic Disease Virus

2.1.1.1 Taxonomie

Das RHDV gehört zum Genus Lagovirus innerhalb der Familie Caliciviridae (OHLINGER et

al. 1990; OHLINGER u. THIEL 1991; MEYERS et al. 1991b; MOUSSA et al. 1992). Es ist

eng verwandt mit dem European Brown Hare Syndrome Virus (EBHSV), dem zweiten bisher

beschriebenen Lagovirus. Außerdem existiert ein apathogenes Rabbit Calicivirus (RCV,

CAPUCCI et al. 1996b), welches der Species RHDV zugeordnet ist. Weitere Genera

innerhalb der Familie Caliciviridae sind die humanmedizinisch relevanten Genera Norovirus

und Sapovirus, sowie das veterinärmedizinisch bedeutsame Genus Vesivirus mit den Species

Felines Calicivirus (FCV) und Vesicular exanthema of swine virus (VESV).

2.1.1.2 Morphologie und physikalische Eigenschaften

Beim RHDV handelt es sich um ein unbehülltes Virus mit einem sphärischen Kapsid von

ikosaedrischer Symmetrie. Die Virionen sind mit 32 - 42 nm relativ klein und einfach

aufgebaut. Mittels elektronenmikroskopischer Untersuchung lassen sich die Vertiefungen der

Ikosaederseitenflächen darstellen (GRANZOW et al. 1989, 1996; VALICEK et al. 1990).

Diese „calices“ (lat. Kelch) sind bei allen Caliciviren zu finden, und der Name der Familie

leitet sich von diesen Strukturen ab. Das Kapsid wird von dem Hauptstrukturprotein mit

einem Molekulargewicht von 60 kDa gebildet (VP60). Beim RHDV handelt es sich um ein

hämagglutinierendes Virus, es sind jedoch auch nicht-hämagglutinierende Stämme

beschrieben worden (CAPUCCI et al. 1996a; SCHIRRMEIER et al. 1999).

Eine zweite Art von Viruspartikeln wurde mehrfach beschrieben (CAPUCCI et al. 1991; DU

1991; MOUSSA et al. 1992; ALEXANDROV et al. 1993; BARBIERI et al. 1997). Diese als

„core-like particles (CLPs)" (GRANZOW et al. 1996) bzw. „smooth RHDV (s-RHDV)

particles“ (BARBIERI et al. 1997) bezeichneten Viruspartikel sind mit 25 - 33 nm kleiner als

die üblicherweise gefundenen Virionen und haben eine unstrukturierte Oberfläche. Sie

bestehen aus einem 30 kDa Strukturprotein, sind nicht-hämagglutinierend und werden bei

LITERATURÜBERSICHT

14

einem protrahierten Verlauf der RHD nachgewiesen. Für ihr Auftreten wird eine

unvollständige Expression des Gens für das VP60 bzw. die Expression eines trunkierten

Genoms verantwortlich gemacht (GRANZOW et al. 1996). Als weitere Ursache wird eine

Degradation der Virionen genannt (CAPUCCI et al. 1991; MOUSSA et al. 1992), die als

Folge der Clearance von RHDV-Ig (Immunglobulin)M-Immunkomplexen auftreten soll

(BARBIERI et al. 1997). Ferner werden die beschriebenen Partikel als Core-Partikel ohne

Kapsomere (DU 1991) oder frühes Stadium in der Reifung der RHDV-Partikel

(ALEXANDROV et al. 1993) angesehen.

Das RHDV ist als unbehülltes Virus verhältnismäßig stabil in der Umwelt. Die Infektiosität

des RHDV bleibt in einer Organsuspension bei 4 °C über 225 Tage erhalten, im getrockneten

Zustand bei Raumtemperatur (RT) über 105 Tage und bei 60 °C für 2 Tage sowohl als

Organsuspension als auch im getrockneten Zustand (SMID et al. 1991).

2.1.1.3 Genomorganisation und Proteine

Das Genom der Caliciviren besteht aus einem Molekül linearer einzelsträngiger RNA mit

Plusstrangorientierung und ist nicht segmentiert. Im Falle vom RHDV umfasst es

7437 Nukleotide (ohne Poly A-Schwanz) und ist von nicht-translatierten Regionen (NTR)

flankiert. MEYERS et al. (1991b) bestimmten die vollständige Nukleinsäuresequenz des

RHDV als erste komplette Sequenz eines Calicivirus. Am 5´-Ende ist die RNA kovalent an

das Vpg (virales Protein, genomassoziiert) gebunden, und am 3´-Ende ist sie polyadenyliert

(Abbildung 1).

Abbildung 1: Genom des RHDV. An die 5´NTR schließen sich die codierenden Bereiche für die Nichtstrukturproteine (hellgrau) und die beiden Strukturproteine, das VP60 und das VP10 (dunkelgrau), an (modif. nach MEYERS et al. (2000)).

Das Genom besteht aus zwei offenen Leserahmen (engl. open reading frame, ORF), die um

17 Nukleotide überlappen (MEYERS et al. 1991b). Der ORF1 (Nukleotide 10 - 7044) codiert

für ein 257 kDa Polyprotein, aus welchem durch proteolytische Prozessierung sieben

NTPase Vpg Pro PolVpg

VP10 (A)

VP60

10 7044

7025 7378

ORF2 ORF1


15

Nichtstrukturproteine (p16, p23, p37, p29, p13, p15, p58) und das Hauptstrukturprotein

hervorgehen. Der ORF2 (Nukleotide 7025 - 7378) weist eine Leserasterverschiebung von (-1)

auf und codiert für ein weiteres Strukturprotein mit einem Molekulargewicht von 10 kDa, das

VP10 (MEYERS et al. 1991b, 2003). Neben der genomischen RNA kann eine 2,2 kb große

subgenomische RNA aus Geweben infizierter Kaninchen isoliert werden. Sie ist kolinear mit

dem 3´-Ende der genomischen RNA, ebenfalls proteingebunden und wird in Viruspartikel

verpackt (MEYERS et al. 1991a, 1991b). Beide Strukturproteine können somit auch durch

Translation der subgenomischen RNA entstehen (MEYERS et al. 1991b; PARRA et al.

1993).

Die Gene im ORF1 sind in der Reihenfolge NH2 - p16 - p23 - p37 - p29 - p13 - p15 - p58 -

VP60 - COOH angeordnet. Als größere Vorläuferproteine wurden das p60 (p23 + p37), das

p41 (p29 + p13) und das p72 (p15 + p58) nachgewiesen (WIRBLICH et al. 1996; KÖNIG et

al. 1998; MEYERS et al. 2000). Unter den Nichtstrukturproteinen sind bisher die

Nukleosidtriphosphatase (NTPase, p37), das Vpg (p13), die Protease (Pro, p15) und die

Polymerase (Pol, p58) identifiziert worden; die Funktion der anderen Proteine ist nicht

bekannt.

Das VP60 ist das Hauptstrukturprotein des RHDV und bildet das Kapsid, gegen das sich die

neutralisierenden Antikörper richten (VIAPLANA et al. 1997). Es besteht aus zwei Domänen,

von denen die innere durch die N-terminalen Aminosäuren und die äußere mit den antigenen

Determinanten durch die C-terminalen Aminosäuren gebildet wird (CAPUCCI et al. 1995,

1998; SCHIRRMEIER et al. 1999). Es sind in Analogie zu anderen Caliciviren (NEILL 1992)

die Regionen A - F beschrieben worden, von denen die Aminosäuresequenzen der Regionen

C und E variabel sind und die der restlichen Regionen konserviert (SCHIRRMEIER et al.

1999). Die oberflächenexponierte Region E mit den wichtigsten antigenen Epitopen wird für

phylogenetische Analysen der Nukleotidsequenzen sowohl beim RHDV (MOSS et al. 2002;

FORRESTER et al. 2003; GALL-RECULE et al. 2003) als auch beim FCV (RADFORD et

al. 1997, 1999) genutzt. Basierend auf antigenetischen (Reaktivität mit monoklonalen

Antikörpern im Antigen-ELISA und Western Blot) und genetischen Eigenschaften

(Sequenzanalysen) wurde ein zweiter Subtyp des RHDV nahezu zeitgleich in Italien

(CAPUCCI et al. 1998) und Deutschland (SCHIRRMEIER et al. 1999) beschrieben, der sich

vor allem in der Region E (Aminosäuren 344 - 434) unterscheidet. Serotypen sind beim

LITERATURÜBERSICHT

16

RHDV bislang nicht bekannt, und die beschriebenen Isolate weisen eine geringe genetische

Variabilität mit einem Homologiegrad von 95 - 98 % in der Aminosäuresequenz des VP60

auf (SCHIRRMEIER et al. 1999).

Das vom ORF2 kodierte VP10 ist ein kleines basisches Strukturprotein, dessen Funktion nicht

vollständig geklärt ist. Es wird vermutet, daß es mit der RNA interagiert und bei der

Verpackung des Genoms in die Virionen beteiligt ist (WIRBLICH et al. 1996).

Über die Nichtstrukturproteine ist bekannt, daß die NTPase die Helikaseaktivität beinhaltet.

Das Vpg ist kovalent an die RNA gebunden, seine Funktion ist noch nicht klar. Für das FCV

wurde gezeigt, daß eine proteolytische Entfernung dieses Proteins zu einer herabgesetzten

Translationseffizienz in vitro führte (HERBERT et al. 1997) und RNA-Transkripte eines

cDNA-Klons des kompletten Genoms (engl. full-length cDNA clone) auch ohne Vpg infektiös

sind (SOSNOVTSEV u. GREEN 1995). Die Protease ist verantwortlich für die proteolytische

Prozessierung des Polyproteins. Mittlerweile wurde jedoch eine Spaltstelle im p41

identifiziert, die nur mit sehr geringer Effizienz von dieser Protease gespalten wird. Die

proteolytische Spaltung an dieser Stelle führt zu zwei weiteren Proteinen, dem p23 und p18

(THUMFART u. MEYERS 2002). Bei der Polymerase handelt es sich um die

RNA-abhängige RNA-Polymerase, die während der Virusreplikation den Minusstrang

synthetisiert.

2.1.2 Klinik, Pathologie und Pathogenese

Die RHD ist eine i.d.R. tödliche Erkrankung bei Kaninchen der Species

Oryctolagus cuniculus. Nach oronasaler oder konjunktivaler Aufnahme des Virus verläuft die

RHD meistens perakut bis akut, daneben wurde aber auch eine subakute Verlaufsform

beschrieben (FUCHS u. WEISSENBÖCK 1992; TEIFKE et al. 2002). Die Erkrankung hat

eine hohe Morbidität und Mortalität (bis 100 %) sowie eine Inkubationszeit von 1 - 3 Tagen.

In perakuten Fällen verenden die Kaninchen plötzlich ohne vorherige klinische Symptome.

Die akute Verlaufsform ist gekennzeichnet durch eine Lymphopenie, Fieber, Anorexie und

Apathie. Es können zentralnervöse Störungen (Krämpfe, Opisthotonus) und ein blutiger

Nasenausfluß auftreten, bevor die Tiere innerhalb 24 - 72 h sterben (SCHIRRMEIER et al.

1990; HAAS u. THIEL 1993; NOWOTNY et al. 1993; SHIEN et al. 2000; KIMURA et al.

2001). Eine subakute bzw. chronische Verlaufsform ist selten und kann nach Wochen mit

dem Tod der Tiere enden. Es zeigen sich milde Symptome wie Apathie und Anorexie sowie


17

evtl. ein Ikterus. Dieser protrahierte Verlauf ist mit dem Nachweis von so genannten „CLPs“

(GRANZOW et al. 1996) bzw. „s-RHDV particles“ (BARBIERI et al. 1997) verbunden. Er

wird insbesondere bei jungen Kaninchen, die mit geringen Mengen RHDV infiziert wurden

(TEIFKE et al. 2002), und in endemischen Gebieten beobachtet (FUCHS u. WEISSENBÖCK

1992).

Pathologisch-anatomisch und histologisch dominiert bei der RHD eine Leberschädigung in

Kombination mit Veränderungen im Sinne einer Disseminierten Intravasalen Gerinnung. Der

Ausprägungsgrad variiert zwischen deutlich erkennbaren und fast fehlenden Läsionen. Die

Leber ist lehmfarben verfärbt, brüchig und weist eine verstärkte Läppchenzeichnung auf; sie

kann aber auch dunkelrot verfärbt und geschwollen sein. Es lassen sich eine

Leberzelldegeneration und -nekrose sowie eine Infiltration mit Neutrophilen und Histiozyten

nachweisen. Petechien sowie Hämorrhagien sind in verschiedenen Organen, insbesondere

Milz, Niere, Lunge, Trachea und Thymus, zu finden (SCHIRRMEIER et al. 1990; HAAS u.

THIEL 1993; NOWOTNY et al. 1993). Die Blutgerinnung ist gestört, und es sind

Mikrothromben in den kleineren Gefäßen von Leber, Milz, Lunge, Gehirn und Niere

nachweisbar (PARK et al. 1995, 1997; GUITTRE et al. 1996; PRIETO et al. 2000). Beim

subakuten Verlauf lassen sich neben einer zentrolobulären Lebernekrose mit Kalzifikation

auch Reparation (Fibrose), Regeneration und eine geringgradige entzündliche Reaktion

beobachten, die das Gesamtbild einer Leberzirrhose ergeben (TEIFKE et al. 2002).

Die frühe Phase der Virusreplikation, insbesondere die Ausbreitung des Virus nach der

Aufnahme bis zur Leber, ist wenig untersucht. GUITTRE et al. (1996) wiesen bei einem Tier

virale RNA mittels RT-PCR zum Zeitpunkt der nasalen Infektion in der Tonsille und der

Lunge nach, was auf das Inokulum zurückgeführt wurde. Schon ab 18 h p.i. wurde virales

Genom in der Leber sowie der Milz und der Gallenflüssigkeit nachgewiesen. Bereits nach

36 h p.i. waren alle untersuchten Proben (diverse Organe, Leukozyten, Faeces, Urin) positiv

in der RT-PCR. Ab diesem Zeitpunkt gelang auch der Nachweis von RHDV-Antigen mittels

Hämagglutinationstest in der Leber, der Milz und der Gallenflüssigkeit sowie mittels

Antigen-ELISA in der Leber (GUITTRE et al. 1996; SHIEN et al. 2000).

Durch Anwendung der Immunhistologie und In situ-Hybridisierung wurden die Zielzellen des

RHDV charakterisiert. Virales Antigen wurde schon 12 h p.i. und später in den Hepatozyten

nachgewiesen (PARK et al. 1995; GELMETTI et al. 1998; MIKAMI et al. 1999; JUNG et al.

LITERATURÜBERSICHT

18

2000; PRIETO et al. 2000; TEIFKE et al. 2002). PRIETO et al. (2000) fanden

RHDV-Antigen 36 h p.i. auch in den Makrophagen und Lymphozyten der Milz und erst

72 h p.i. in den Makrophagen der Leber. Sie folgerten, daß der Hepatozyt die einzige Zelle in

der Leber ist, die eine Virusreplikation direkt nach der Infektion ermöglicht. Mittels

Immunhistologie wurde virales Antigen in Makrophagen der Milz und Leber auch von PARK

et al. (1995) und MIKAMI et al. (1999) nachgewiesen. Schon nach 8 h p.i. detektierten

GELMETTI et al. (1998) mittels In situ-Hybridisierung für RHDV-RNA positive

Hepatozyten und folgerten daraus, daß in der Leber als Hauptreplikationsort des RHDV fast

direkt nach der Infektion die Virusreplikation stattfindet. Neben den Hepatozyten waren mit

dieser Methode insbesondere die Makrophagen der Leber, der Milz sowie

Alveolarmakrophagen positiv (KIMURA et al. 2001; TEIFKE et al. 2002). KIMURA et al.

(2001) wiesen dabei mittels In situ-Hybridisierung und RT-PCR sowohl RNA in Plus- als

auch in Minusstrangorientierung nach. Sie postulierten, daß auch in Makrophagen eine aktive

Virusreplikation stattfindet, so daß diesen eine wichtige Rolle bei der Verbreitung des RHDV

zukommt.

Die Entstehung des Hämorrhagischen Syndroms bei der RHD wird sowohl mit der massiven

Lebernekrose als auch mit einer Schädigung des Gefäßendothels erklärt, die zusammen den

primären und sekundären Mangel an Gerinnungsfaktoren bedingen. JUNG et al. (2000) haben

ferner eine Apoptose von Hepatozyten bei der Infektion mit RHDV beschrieben, und auch bei

Monozyten und Endothelzellen wurde eine Apoptose festgestellt (ALONSO et al. 1998). Die

Leberschädigung bewirkt eine verstärkte Fibrinogensynthese und die Freisetzung von großen

Mengen des Gewebsthromboplastins (PARK et al. 1997). Die Clearance der

Gerinnungsfaktoren in der Leber ist gestört. Durch die Endothelschädigung wird ebenfalls

Gewebsthromboplastin freigesetzt, und die Konzentration von gerinnungshemmenden

Substanzen nimmt ab. Das Resultat ist eine Disseminierte Intravasale Gerinnung mit

Verbrauch von Gerinnungsfaktoren und Blutplättchen, die mit Blutungen in diversen Organen

einhergeht.

2.1.3 Epidemiologie und Bekämpfung

Erstmals wurde die RHD 1984 in China beschrieben (LIU et al. 1984), wo sie bei Kaninchen

auftrat, die aus Deutschland importiert wurden. Es sind ausschließlich adulte Kaninchen der

Species Oryctolagus cuniculus empfänglich. Heute ist die Erkrankung nahezu weltweit


19

verbreitet und tritt in Asien, Europa, Afrika, Mittel- und Nordamerika auf (MITRO u.

KRAUSS 1993). Die RHD ist in der Liste B der OIE (frz. Office International des Èpizooties,

internationales Tierseuchenamt) aufgeführt. Aufgrund der hohen Mortalität und der schnellen

Ausbreitung der Erkrankung wurde die Eignung des RHDV zur Bekämpfung der

Wildkaninchenplage in Australien untersucht. Während der Versuche auf einer Insel erreichte

das Virus 1995 das Festland von Australien und wurde zwei Jahre später nach illegaler

Freisetzung auch in Neuseeland nachgewiesen (THOMPSON u. CLARK 1997; KOVALISKI

1998).

Das RHDV hat eine hohe Kontagiosität und Tenazität (SMID et al. 1991), weshalb neben

dem direkten Kontakt der Tiere auch die indirekte Übertragung durch belebte und unbelebte

Vektoren von Bedeutung ist. Die Ausscheidungswege sind nicht vollständig aufgeklärt.

Mittels des Hämagglutinationstestes konnte das RHDV in Gallenflüssigkeit detektiert werden,

Konjunktivaltupferproben und konzentrierte Urinproben waren nur sehr schwach positiv.

Durch RT-PCR wurde virale RNA in Kotproben, Urin und Gallenflüssigkeit nachgewiesen

(NOWOTNY et al. 1993; SHIEN et al. 2000).

Das Auftreten klinischer Erscheinungen ist abhängig vom Alter der Tiere und der

Immunitätslage. Es erkranken ausschließlich adulte Kaninchen. Bis heute ist nicht geklärt,

warum Tiere bis zu einem Alter von 10 - 12 Wochen experimentell infizierbar sind, aber

keine klinischen Symptome zeigen. Bei 4 Wochen alten Tieren wurden eine akute transiente

Neutropenie, ein Anstieg der Aktivität der hepatischen Transaminasen sowie Infiltrate von

Lymphozyten und eine geringgradige Zellschädigung in der Leber nachgewiesen

(FERREIRA et al. 2004, 2005). Mittels Immunhistologie konnten PRIETO et al. (2000) bei

6 Wochen alten Tieren und MIKAMI et al. (1999) bei 2 bzw. 4 Wochen alten Tieren in der

Leber RHDV-Antigen nachweisen. SHIEN et al. (2000) beobachteten bei 4 - 5 Wochen alten

Tieren Fieber und eine Serokonversion. Mittels RT-PCR konnten sie virale RNA in den ersten

Tagen nach der Infektion in diversen Organen und bis zu 47 d.p.i. in der Gallenflüssigkeit und

der Milz nachweisen.

Da in Australien sowohl in Seren gesunder Kaninchen aus dem Jahre 1996 als auch in Seren,

die vor dem Auftreten der RHD auf dem Festland gewonnen wurden, RHDV-spezifische

Antikörper nachgewiesen wurden, wurde die Existenz eines nicht-pathogenen Calicivirus vor

dem Jahre 1995 postuliert (NAGESHA et al. 2000). Das apathogene RCV, das insbesondere

LITERATURÜBERSICHT

20

im Darm vorkommt, wurde als potentieller Vorläufer des RHDV beschrieben (CAPUCCI et

al. 1996b). Die Infektion von Kaninchenpopulationen mit diesem Virus führt zu einer

Seroprävalenz von 100 % in adulten Tieren, die einen Kreuzschutz gegenüber dem RHDV

bewirkt (CAPUCCI et al. 1997).

In letzter Zeit wurde aufgrund serologischer Untersuchungen und der Detektion viraler RNA

in Organen von gesunden Kaninchen eine Viruspersistenz als bedeutender Faktor in der

Epidemiologie diskutiert. FORRESTER et al. (2003) wiesen virales Genom in kompletter

Länge in Lebern mittels nested RT-PCR und Sequenzierung nach und schlossen daraus auf

persistierende RHDV-Infektionen in Neuseeland. Virale RNA wurde weiterhin mittels

nested RT-PCR in Seren aus den Jahren 1955 bis 1980 aus Großbritannien detektiert (MOSS

et al. 2002). Diese Arbeitsgruppe schlußfolgerte, daß ein avirulentes RHDV in der Population

zirkulierte und diskutierte ebenfalls die Persistenz eines virulenten oder genetisch ähnlichen

avirulentem RHDV trotz der Anwesenheit von Antikörpern. Experimentelle Beweise für

diese These fehlen bisher.

Kaninchen, die RHDV-spezifische Antikörper aufweisen, sind vor der Erkrankung geschützt.

Es gibt aber auch serologische Hinweise auf ein RHDV-ähnliches Virus, das keine

Kreuzimmunität bewirkt (MARCHANDEAU et al. 2005). Nach einer Vakzinierung bildet

sich eine schützende Immunität innerhalb eines Zeitraums von ca. einer Woche aus; der

Schutz bleibt für mindestens ein Jahr erhalten (ANONYMUS 2004).

Da die RHD eine i.d.R. akut verlaufende und nicht therapierbare Erkrankung ist, steht bei der

Bekämpfung neben hygienischen Maßnahmen die prophylaktische - und evtl. auch

metaphylaktische - Impfung im Vordergrund. Die kommerziell erhältlichen Vakzinen

basieren auf inaktivierten und mit Adjuvans versetzten Leberhomogenaten von experimentell

infizierten Kaninchen. Zur Zeit sind in Deutschland die Impfstoffe Cunivak RHD

(Impfstoffwerk Dessau-Tornau), Lapimed® RHD (Merial) und RIKA-VACC

(Riemser Arzneimittel) zur RHD-Prophylaxe sowie der Kombinationsimpfstoff Dercunimix®

(Merial) mit zusätzlichem Schutz gegen die Myxomatose erhältlich. Es handelt sich

ausschließlich um monovalente Vakzinen, die aber ebenfalls - wenn auch mit geringerer

Effizienz - einen Schutz gegen den seit 1998/1999 vermehrt nachgewiesenen zweiten Subtyp

des RHDV verleihen. Verschiedene Subunitvakzinen sind in den letzten 15 Jahren entwickelt

und unter experimentellen Bedingungen eingesetzt worden. Sie gewährleisten einen Schutz


21

vor der Infektion mit RHDV, bislang ist aber keine dieser Vakzinen auf dem Markt erhältlich.

Als Expressionssysteme für das VP60 als Hauptimmunogen des RHDV sind Escherichia coli

(BOGA et al. 1994), Saccharomyces cerevisiae (BOGA et al. 1997), Pichia pastoris

(FARNOS et al. 2005) und transgene Pflanzen (CASTANON et al. 1999;

FERNANDEZ-FERNANDEZ et al. 2001) verwendet worden. Weiterhin wurden virale

Expressionssysteme wie Vaccinia- (BERTAGNOLI et al. 1996b), Kanarienpocken-

(FISCHER et al. 1997), Myxoma- (BERTAGNOLI et al. 1996a; BARCENA et al. 2000;

TORRES et al. 2001) und Bakuloviren (LAURENT et al. 1994; MARIN et al. 1995;

NAGESHA et al. 1995; PLANA-DURAN et al. 1996) genutzt. Bei der Expression des VP60

über rekombinante Bakuloviren setzt sich das Protein zu so genannten

„virus-like particles (VLPs)“ zusammen, die ebenfalls immunogen wirken (LAURENT et al.

1994; NAGESHA et al. 1995; SIBILIA et al. 1995; PLANA-DURAN et al. 1996).

2.1.4 Laboratoriumsdiagnose

2.1.4.1 Indirekter Erregernachweis

Serologische Nachweisverfahren zum indirekten Erregernachweis, d.h. zum Nachweis

RHDV-spezifischer Antikörper, spielen bei der zumeist perakut bis akut verlaufenden RHD

eine untergeordnete Rolle. Für die Bestimmung des Antikörperstatus nach der Vakzinierung

oder einer überstandenen Infektion sind sie von Bedeutung, da die humorale Immunantwort

entscheidend ist für den Schutz vor der Erkrankung. Im „Manual of Diagnostic Tests and

Vaccines for Terrestrial Animals“ der OIE (ANONYMUS 2004) ist die Durchführung eines

Hämagglutinationshemmtestes (LIU et al. 1984), eines kompetitiven Antikörper-ELISAs und

eines Isotypen-spezifischen Antikörper-ELISAs beschrieben. Antikörper-ELISAs wurden

z.B. von NAGESHA et al. (2000) und COLLINS et al. (1995) entwickelt und angewendet.

2.1.4.2 Direkter Erregernachweis

Mittels des direkten Erregernachweises wird das Virus oder dessen Nukleinsäure

nachgewiesen. Die Leber enthält die größten Mengen an Virus und wird daher meistens als

Probenmaterial verwendet, alternativ können auch andere Organe, wie z.B. die Milz, genutzt

werden (SCHIRRMEIER et al. 1990).

LITERATURÜBERSICHT

22

Der Hämagglutinationstest mit Humanerythrozyten der Blutgruppe 0 war der erste in der

Routinediagnostik angewandte Test zum Nachweis des RHDV (LIU et al. 1984) und wird

auch heute noch häufig eingesetzt. Das Virus kann auch mittels Elektronenmikroskopie bzw.

Immun-Elektronenmikroskopie (GRANZOW et al. 1989, 1996; VALICEK et al. 1990, 1992;

OHLINGER et al. 1990; OHLINGER u. THIEL 1991), Antigen-ELISA (CAPUCCI et al.

1991, 1995; COLLINS et al. 1996; SCHIRRMEIER et al. 1999), Immunhistologie

(CARRASCO et al. 1991; STOERCKLE-BERGER et al. 1992; PARK u. ITAKURA 1992;

PARK et al. 1992; PRIETO et al. 2000) und Western Blot (PARK u. ITAKURA 1992; PARK

et al. 1992; SHIEN et al. 1998) nachgewiesen werden, wobei mit diesen Techniken ein

Zuwachs an Sensitivität und Spezifität erreicht wurde. Ab dem Jahre 1995 wurden diverse

RT-PCR-Verfahren (GUITTRE et al. 1995; GOULD et al. 1997; ROS et al. 1997; MOSS et

al. 2002; FORRESTER et al. 2003) und auch eine Immunocapture-RT-PCR

(GALL-RECULE et al. 2001) für den Nachweis von RHDV beschrieben. Ferner kann mittels

In situ-Hybridisierung das virale Genom im Gewebe detektiert werden (GELMETTI et al.

1998; KIMURA et al. 2001; TEIFKE et al. 2002). Im „Manual of Diagnostic Tests and

Vaccines for Terrestrial Animals“ der OIE (ANONYMUS 2004) ist die Durchführung der

genannten Testverfahren mit Ausnahme der RT-PCR und der In situ-Hybridisierung

beschrieben. Für diese Methoden zum Nachweis der RNA wird auf entsprechende

Publikationen verwiesen (GUITTRE et al. 1995; GOULD et al. 1997; GELMETTI et al.

1998). Ferner wird die experimentelle Infektion empfänglicher Kaninchen erwähnt, da kein

Zellkultursystem zur produktiven Vermehrung des RHDV existiert.

Differentialdiagnostisch müssen Intoxikationen sowie Infektionen mit Pasteurellen oder

Staphylokokken berücksichtigt werden (MITRO u. KRAUSS 1993).

2.2 Die quantitative real-time Polymerasekettenreaktion

2.2.1 Einleitung

Die PCR wurde 1986/1987 als Technik zur in vitro-Amplifizierung eines spezifischen

DNA-Fragmentes (MULLIS et al. 1986; MULLIS u. FALOONA 1987) durch ein

hitzestabiles Enzym, wie z.B. die Taq-Polymerase des Bakteriums Thermus aquaticus

(CHIEN et al. 1976; SAIKI et al. 1988), eingeführt. Sie ist seitdem zu einer der wichtigsten

Methoden in der Diagnostik und Forschung geworden. Die konventionelle PCR mit der sich

Die quantitative real-time Polymerasekettenreaktion

23

anschließenden Darstellung der Amplifikate über eine Agarosegelelektrophorese ist mit

einem verhältnismäßig großen Arbeits-, Material- und Zeitaufwand verbunden. Außerdem ist

das Risiko von Kreuzkontaminationen und falsch-positiven Ergebnissen erheblich

(MCKILLIP u. DRAKE 2004). Das gilt insbesondere für eine nested PCR (dt. verschachtelte

PCR), bei der das Produkt als template (dt. Matrize) für eine weitere PCR mit innerhalb des

ersten Amplifikates liegenden Primern genutzt wird, und eine two-step RT-PCR

(dt. zweischrittige RT-PCR), da hier die Reaktionsgefäße nach der Reversen Transkription

(RT, cDNA-Synthese) zusätzlich geöffnet werden, um cDNA in den PCR-Ansatz zu

überführen. Ferner handelt es sich bei der Detektion über Agarosegele um eine

Endpunktanalyse, weil hier nur die Bandenstärke, die abhängig sein kann von der Effizienz

der Amplifizierung, berücksichtigt wird (MCKILLIP u. DRAKE 2004).

Daher wurde in der Folgezeit an der Entwicklung von Detektionssystemen gearbeitet, die eine

Analyse der Amplifikatbildung in „real-time“ (dt. Echtzeit) über Fluoreszenzsignale, die

direkt mit der Amplifizierung des Zielgens in Zusammenhang stehen, erlauben. Wenn die

Amplifizierung und die Detektion gleichzeitig ablaufen, ist diese Methode schneller - erlaubt

also einen höheren Probendurchsatz - und birgt ein geringeres Kontaminationsrisiko als die

konventionelle PCR (NAZARENKO et al. 1997; SCHWEIGER et al. 2000; BLACK et al.

2002). Bei der real-time PCR wird bereits am Beginn der exponentiellen Phase der PCR der

so genannte Ct-Wert (engl. threshold cycle) ermittelt und zur Bestimmung der

Ausgangsmenge der Zielsequenz genutzt. Der Ct-Wert zeigt eine bessere Korrelation mit der

tatsächlichen Ausgangsmenge der Zielsequenz als die mittels einer Agarosegelelektrophorese

dargestellte Menge des PCR-Produktes nach der Reaktion, da hierbei zum Zeitpunkt der

Detektion die Plateauphase schon erreicht ist. Die Detektion bei der real-time PCR erfolgte

zunächst mit interkalierenden fluoreszierenden Farbstoffen, später wurden sequenzspezifische

Sonden (engl. probe) entwickelt, die einen Zuwachs an Spezifität gegenüber der

konventionellen PCR ermöglichten (BUSTIN 2000). Die Grundlage dafür bildete das von

CARDULLO et al. (1988) beschriebene Prinzip des Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfers

(FRET, Abbildung 2).

LITERATURÜBERSICHT

24

Abbildung 2: Das FRET-Prinzip. F1 und F2 sind die beiden beteiligten Fluorochrome, die auch als Reporter/Donor und Quencher/Akzeptor bezeichnet werden. Sie haben die Anregungswellenlängen A1 und A2 sowie die Emissionswellenlängen E1 und E2. In den Diagrammen ist die Emission (als Fluoreszenzstärke R) gegen die Wellenlänge aufgetragen.

Der FRET-Effekt tritt auf, wenn zwei Fluorochrome, deren Anregungs- und

Emissionsspektren überlappen, in eine räumliche Nähe von unter etwa 70 Å gebracht werden

(SELVIN u. HEARST 1994). Ein Fluorochrom F1 wird durch eine bestimmte

Anregungswellenlänge A1 zur Emission der Energie mit der Emissionswellenlänge E1

angeregt. Wenn E1 der Anregungswellenlänge A2 des Fluorochroms F2 entspricht, wird die

Energie auf dieses übertragen und in Form der Emissionswellenlänge E2 abgegeben. Wenn

F1 und F2 räumlich getrennt werden, findet diese Energieübertragung nicht mehr statt. Die

Bezeichnung der verwendeten Fluorochrome richtet sich nach der gemessenen Wellenlänge:

Wird E1 gemessen, so ist F1 der Reporterfarbstoff und F2 der Quencher (engl. to quench,

unterdrücken). Die Emissionswellenlänge des Quenchers wird entweder nicht detektiert, oder

es handelt sich um nicht-fluoreszierende Quencher (so genannte „dark quencher“), die die

Energie in Form von Wärme abgeben. Bei Messung von E2 wird F1 als Donor und F2 als

Akzeptor bezeichnet.

Parallel entwickelte sich die Technologie zur Detektion der Fluoreszenzsignale weiter. Um

die Amplifizierung des Produktes in „real-time“ beobachten zu können, wurde in ersten

Versuchen die Reaktion mehrmals gestoppt, ein Aliquot genommen und die Stärke des

Fluoreszenzsignales analysiert. Ferner wurde mit Videokameras bzw. der Kombination eines

klassischen Thermocyclers mit einer Fiberglasoptik und einem Spektrofluorometer

E1 = A2

E2A2 A1 E1

A1 E2

F1

F1

F2

F2

Wellenlänge

Wellenlänge

R

R


25

gearbeitet (HIGUCHI et al. 1992, 1993). Heute sind real-time PCR-Systeme verschiedener

Anbieter (Applied Biosystems, Roche, Stratagene, Bio-Rad, Corbett Research) kommerziell

verfügbar, die einen Thermocycler, eine Lichtquelle (Licht emittierende Dioden, sog. LEDs,

Laser oder Halogenlampe, je nach Modell) und das Detektionsmodul in einem Gerät

kombinieren (ISHIGURO et al. 1995; WITTWER et al. 1997b). Es wurden Geräte für die

simultane Detektion mehrerer Wellenlängen mit entsprechender Filteranzahl (maximal 6)

entwickelt, die eine Koamplifizierung und -detektion mehrerer Zielsequenzen

(engl. multiplexing) ermöglichen. Die neuesten Systeme erlauben eine Messung von

Wellenlängen zwischen 350 und 750 nm. Außerdem können bis zu 384 Proben bei

vollständiger Automatisierung parallel analysiert werden.

Weitere Vorteile der real-time PCR gegenüber der konventionellen PCR sind die i.d.R.

größere Sensitivität, die auf der Amplifizierung sehr kurzer Fragmente basiert (TOOULI et al.

2000), und die Möglichkeit der Quantifizierung der eingesetzten Nukleinsäuremengen (HEID

et al. 1996; BUSTIN 2000; LIVAK u. SCHMITTGEN 2001; FRONHOFFS et al. 2002).

Die genannten Gründe erklären den immer breiteren Einsatz der real-time PCR sowohl für

diagnostische als auch für wissenschaftliche Zwecke. Ein wichtiges Anwendungsgebiet ist die

schnelle Diagnostik von Pathogenen mit einem hohen Probendurchsatz, wie sie z.B. beim

Screening von Blutproben oder Zellkulturen auf Retroviren nötig ist (DE WIT et al. 2000;

DROSTEN et al. 2001). Auch in der veterinärmedizinischen Diagnostik sind diverse

real-time PCR-Protokolle beschrieben worden (MCGOLDRICK et al. 1998; COOK et al.

2002; HUGHES et al. 2004). Weiterhin wird die real-time PCR verwendet zur

Quantifizierung von Nukleinsäuremengen, z.B. zur Bestimmung der Virusgenomlast im

Rahmen von Pathogenesestudien bzw. für prognostische Aussagen (PAS et al. 2000; RYAN

et al. 2003; BRUNBORG et al. 2004; OLVERA et al. 2004; TOWNER et al. 2004) oder zur

Messung der Genexpression für verschiedene Zytokine (STORDEUR et al. 2002). Außerdem

können mit dem Ziel der allelen Diskriminierung Punktmutationen (engl. single nucleotide

polymorphisms, SNPs) mittels real-time PCR detektiert werden (GIESENDORF et al. 1998;

TYAGI et al. 1998; THELWELL et al. 2000; PICKERING et al. 2002).

LITERATURÜBERSICHT

26

2.2.2 Detektionssysteme

2.2.2.1 Detektionssysteme ohne Zuwachs an Spezifität

In doppelsträngige DNA interkalierende Farbstoffe waren die ersten eingesetzten Systeme zur

Detektion der Amplifikatbildung bei einer PCR in „real-time“. Zunächst wurde

Ethidiumbromid verwendet (HIGUCHI et al. 1992, 1993), das nach Anregung durch

ultraviolettes (UV) Licht fluoresziert. Bei der Interkalierung in die PCR-Produkte nimmt die

Fluoreszenz stark zu (Abbildung 3).

Abbildung 3: Funktionsprinzip der interkalierenden Farbstoffe. (a) Denaturierung. (b) Annealing (dt. Anlagerung). (c) Elongation. Es ist jeweils nur der rev-Strang sowie der for-Primer (Pfeil) gezeigt. Der in die doppelsträngige DNA interkalierende Farbstoff ist grün dargestellt.

Es wurde festgestellt, daß die Kinetik der Zunahme der Fluoreszenz mit der Ausgangsmenge

der DNA-Moleküle korreliert. Je weniger Zyklen nötig waren für eine detektierbare

Fluoreszenz, desto größer war die Ausgangsmenge der Zielsequenz (HIGUCHI et al. 1993).

Heute werden außerdem YO-PRO-1 (ISHIGURO et al. 1995) und in den meisten Fällen

3´ 5´

3´

3´

5´

5´

(a)

(b)

(c)


27

SYBR®Green I (Molecular Probes Inc.) eingesetzt (WITTWER et al. 1997a, 1997b). Da diese

Farbstoffe alle unspezifisch in die doppelsträngige DNA, also auch Primerdimere und

unspezifische PCR-Produkte, interkalieren, kann es auch in negativen Proben zu einem

Anstieg der Fluoreszenz kommen (BROWNIE et al. 1997). Eine Quantifizierung auf der

Basis interkalierender Farbstoffe kann nur erfolgreich sein, wenn es keine Primerdimere und

unspezifische PCR-Produkte gibt bzw. wenn nachgewiesen wird, daß diese keinen Einfluß

auf die Quantifizierung haben. Aus diesen beiden Gründen müssen unspezifische

PCR-Produkte und Primerdimere von den spezifischen PCR-Produkten differenziert werden.

Das ist über eine Schmelzkurvenanalyse, die sich der eigentlichen PCR anschließt, möglich

(RIRIE et al. 1997). Dabei wird der Reaktionsansatz von beispielsweise 55 °C auf 95 °C

erhitzt, kontinuierlich die Fluoreszenz R gemessen und gegen die jeweilige Temperatur

aufgetragen. Man erhält Schmelzkurven, deren Verlauf abhängig ist vom GC-Gehalt, der

Länge und der Sequenz des Produktes. Beim Erreichen der Schmelztemperatur kommt es zur

Denaturierung des Produktes, d.h. die doppelsträngige DNA schmilzt, und es ergibt sich ein

Abfall der Fluoreszenzstärke. Wenn auf der x-Achse die Temperatur und auf der y-Achse die

Fluoreszenzstärke als -R (T) aufgetragen wird, resultieren Schmelzpunkt-Peaks, die jeweils

für ein Produkt stehen (Abbildung 4). Ist die Schmelztemperatur des spezifischen Produktes

bekannt, so kann dieses von Artefakten unterschieden werden, und auch verschiedene

spezifische Produkte, die auf unterschiedliche Isolate eines Virus zurückgehen, können

differenziert werden (HELPS et al. 2002). Der Einsatz interkalierender Farbstoffe in der

real-time PCR ist nützlich für einmalige Anwendungen, da die Farbstoffe günstig und

universell verwendbar sind, und außerdem sinnvoll für das Testen verschiedener Primer für

die Optimierung einer PCR-Reaktion.

LITERATURÜBERSICHT

28

Abbildung 4: Schmelzkurvenanalyse mit SYBR®Green I. Die normalisierte Fluoreszenzstärke ist in (a) als Rn und in (b) als -Rn (T), jeweils gegen die Temperatur in °C, aufgetragen. Die schwarzen Kurven gehen auf spezifische PCR-Produkte zurück. Die graue Kurve repräsentiert die negative Kontrolle (engl. no template control, NTC), bei der Primerdimere detektiert werden. Diese lassen sich durch die geringere Schmelztemperatur von spezifischen Produkten differenzieren. Es wurde eine log10-Verdünnungsreihe von RHDV-RNA als template eingesetzt.

(a)

(b)


29

Als weitere Detektionssysteme, die zwar spezifischer sind als interkalierende Farbstoffe, aber

keinen Zuwachs an Spezifität gegenüber der konventionellen PCR ermöglichen, werden

modifizierte Primer angeboten. Das Amplifluor™ Universal Detection System (Chemicon®

international) verwendet den so genannten UniPrimer™ mit Haarnadelstruktur (UEHARA et

al. 1999). Er trägt am 5´-Ende den Reporterfarbstoff, am 3´-Ende einen nicht-fluoreszierenden

Quencher und noch weiter in 3´-Richtung eine sequenzspezifische Primerstruktur. Während

der Elongation wird die Haarnadelstruktur geöffnet und ein komplementärer Strang erzeugt,

so daß der Primer in das PCR-Produkt inkorporiert wird. Dabei wird der FRET-Effekt

aufgehoben und die Reporterfluoreszenz emittiert. Dieses System erwies sich als gut geeignet

für die Automatisierung (PICKERING et al. 2002).

Die LUX™ Fluorogenic Primer (Light Upon eXtension, Invitrogen) stellen ein weiteres

kommerziell erhältliches System von modifizierten Primern dar. Jedes LUX™ Primer Set

besteht aus einem nicht modifizierten Primer sowie einem Fluorochrom-markierten Primer,

die beide spezifisch für die Zielsequenz sind. Der markierte Primer weist durch

4 - 6 selbst-komplementäre Nukleotide eine Haarnadelstruktur auf und trägt nahe dem

3´-Ende den Farbstoff (FAM, JOE, TET, HEX oder Alexa Fluor® 546). Durch diese

Konfiguration kommt ein quenching zustande. Es wird unterbrochen, wenn der Primer in

linearer Form in das PCR-Produkt eingebaut wird, und resultiert in einem Anstieg der Stärke

des Fluoreszenzsignales.

2.2.2.2 Detektionssysteme mit Zuwachs an Spezifität

Die auf dem FRET-Prinzip basierenden sequenzspezifischen Sonden werden als zusätzliche

hybridisierende Oligonukleotide neben den beiden Primern in der real-time PCR eingesetzt,

wodurch ein Zuwachs an Spezifität gegenüber der konventionellen PCR und den bisher

beschriebenen Detektionssystemen gegeben ist (BUSTIN 2000).

Die FRET-Sonden oder Hybridisierungssonden („HybProbe“, Roche Diagnostics GmbH)

wurden für die Verwendung mit dem LightCycler® (Roche) konzipiert (WITTWER et al.

1997a, 1997b). Es handelt sich im Prinzip um zwei Sonden, von denen die eine (Donor) am

3´-Ende mit Fluoreszein und die andere (Akzeptor) am 5´-Ende mit LightCycler Red markiert

ist (Abbildung 5a). In der Annealing-Phase (dt. Anlagerung) hybridisieren beide im Abstand

von 1 - 5 Nukleotiden mit der Zielsequenz. Es kommt zum FRET-Effekt und die Fluoreszenz

des Akzeptors wird emittiert. In der Elongationsphase lösen sich die intakten Sonden wieder.

LITERATURÜBERSICHT

30

Dadurch, daß zwei Sonden neben den beiden Primern eingesetzt werden, ist die Spezifität

besonders hoch, aber auch das Design der Sonden erschwert.

Bereits 1991 wurde von HOLLAND et al. (1991) beschrieben, daß Sonden, die am 5´-Ende

radioaktiv markiert waren, durch die 5´-3´-Exonuklease-Aktivität der Taq-Polymerase

hydrolysiert werden. LEE et al. (1993) entwickelten daraufhin Sonden, die am 5´-Ende mit

einem Reporterfarbstoff und am 3´-Ende mit einem Quencher modifiziert waren

(Applied Biosystems). In beiden Fällen war die simultane Amplifizierung des Zielgens und

Generierung eines Zielgen-spezifischen Signals möglich. Die Auswertung erfolgte jedoch

noch nach der PCR. Die TaqMan®-Sonden (Applied Biosystems/Genentech) basieren auf

dieser Technologie und kommen seit 1995 zum Einsatz (LIVAK et al. 1995; GIBSON et al.

1996; HEID et al. 1996). Sie sind am 5´-Ende mit einem Reporterfarbstoff und am 3´-Ende

mit einem Quencher markiert (Abbildung 5b). Während der Denaturierungs- und Annealing-

Phase kommt es zum FRET-Effekt. In der Elongationsphase wird die Sonde durch die 5´-3´-

Exonuklease-Aktivität der Taq-Polymerase hydrolysiert, der FRET-Effekt aufgehoben und

die Reporterfluoreszenz emittiert.

Bei den minor groove binder (MGB)-Sonden (MGB Eclipse™ Probes, Epoch Bioscience;

QuantiProbe™, Qiagen) befindet sich am 5´-Ende der MGB (KUMAR et al. 1998) sowie ein

nicht-fluoreszierender Quencher und am 3´-Ende der Reporterfarbstoff. Der MGB legt sich in

die kleine Furche der DNA und stabilisiert die Bindung, so daß die Sonde verkürzt werden

kann, was mit einer erhöhten Spezifität einhergeht (KUTYAVIN et al. 2000). Der

FRET-Effekt wird nicht durch die Taq-Polymerase aufgehoben, vielmehr verhindert der MGB

die Hydrolyse der Sonde (AFONINA et al. 2002, MGB Eclipse™ Probes). Die

Reporterfluoreszenz wird hier emittiert, da die Sonde sich während der Annealing-Phase in

eine lineare Form streckt, so daß Reporterfarbstoff und Quencher getrennt werden

(Abbildung 5c). Es sind außerdem TaqMan®-Sonden erhältlich, die mit einem MGB

modifiziert sind (TaqMan® MGB Probes, Applied Biosystems).


31

Abbildung 5: Funktionsprinzip der FRET-Sonden (a), TaqMan®-Sonden (b), minor groove binder (MGB)-Sonden (c) und molecular beacons (d). Es ist jeweils nur der rev-Strang sowie der for-Primer (Pfeil) gezeigt. Das obere Bild zeigt jeweils die Denaturierungsphase, das mittlere die Annealing- und das untere die Elongationsphase. Die Sonden tragen ein Donormolekül „D“ und ein Akzeptormolekül „A“ bzw. den Reporterfarbstoff „R“ sowie einen Quencher „Q“. „MGB“ steht für den minor groove binder.

3´

3´

3´ 5´

5´

5´ 3´ 5´

3´ 5´

3´ 5´

(c) (d)

R

R

R

Q

MGB

MGB

MGB

Q

Q

R

R

Q

Q

R Q

D A

D A

QR

R

R

Q

Q

D

A

3´ 5´

3´

3´

5´

5´

3´

3´

5´

5´

3´ 5´

(a) (b)

LITERATURÜBERSICHT

32

Molecular beacons sind am 5´-Ende mit einem Reporterfarbstoff und am 3´-Ende mit einem

Quencher markiert, wobei i.d.R. nicht-fluoreszierende Quencher wie

Dabcyl (4-(4´-Dimethylaminophenylazo)-Benzoesäure) verwendet werden (TYAGI u.

KRAMER 1996; GIESENDORF et al. 1998; VET et al. 1999). Sie liegen während der

Denaturierung und der Elongation in einer Haarnadelstruktur vor, die aus einer

selbst-komplementären Stammregion und einer loop-Region mit den sequenzspezifischen

Nukleotiden besteht. Durch die räumliche Nähe von Reporterfarbstoff und Quencher findet in

dieser Konfiguration der FRET-Effekt statt (Abbildung 5d). Während der Annealing-Phase

geht die Sonde in eine lineare Struktur über und hybridisiert mit der Zielsequenz. Der FRET-

Effekt wird unterbrochen und die Reporterfluoreszenz emittiert. Bei diesen Sonden haben

mögliche fehlerhafte Basenpaarungen (engl. mismatches) mit der Zielsequenz einen größeren

destabilisierenden Effekt, weil die Haarnadelstruktur im Vergleich zu linearen Sonden stabiler

ist. Daher sind molecular beacons sehr spezifisch und werden z.B. für die Detektion von

SNPs eingesetzt (TYAGI et al. 1998). Der Nachteil ist das schwierige Design der Sonden.

Bei den Scorpions™ (DxS Ltd.) handelt es sich um von WHITCOMBE et al. (1999)

enwickelte Sonden, deren Funktion im Gegensatz zu den bisher genannten auf einem

unimolekularen Mechanismus beruht und die irreversibel in das PCR-Produkt inkorporiert

werden (THELWELL et al. 2000). Sie bestehen aus einer sequenzspezifischen

Haarnadelstruktur, die am 5´-Ende den Reporterfarbstoff und am 3´-Ende einen

nicht-fluoreszierenden Quencher trägt. Diese Haarnadelstruktur ist am 3´-Ende über

Hexethylen-Glykol mit einer sequenzspezifischen Primerstruktur verbunden (Abbildung 6).

Die Primerstruktur hybridisiert im ersten Annealing-Schritt mit der Zielsequenz und dient bei

der Elongation als Startpunkt für die Taq-Polymerase. Bei der folgenden Denaturierung wird

auch die Haarnadelstruktur geöffnet. Im zweiten Annealing-Schritt hybridisiert die

sequenzspezifische Region der Haarnadelstruktur durch ein „Umklappen“ mit einer

komplementären Sequenz des Amplikons, der FRET-Effekt wird aufgehoben und die

Reporterfluoreszenz emittiert. Das Hexethylen-Glykol verhindert als „PCR-Stopper“ die

Synthese eines komplementären Strangs zur Haarnadelstrukur des Scorpions™, so daß die

Haarnadelstruktur nur durch die Hybridisierung mit der Zielsequenz aufgelöst werden kann.


33

Abbildung 6: Funktionsprinzip eines Scorpions™. (a) Annealing/Elongation. (b) Denaturierung. (c) Annealing. Es ist in (a) und (b) jeweils nur ein Strang sowie der Scorpion™ mit der sequenzspezifischen Primerstruktur (Pfeil) gezeigt. Beim zweiten Annealing-Schritt (c) ist nur noch der von der Taq-Polymerase synthetisierte Strang dargestellt. Die Sonde trägt einen Reporterfarbstoff „R“ sowie einen Quencher „Q“. „Stop“ steht für das Hexethylen-Glykol, das die Synthese eines zur Haarnadelstruktur komplementären Strangs verhindert.

2.2.3 Datenanalyse

Die Auswertung der real-time PCR erfolgt Software-gestützt über die Messung und

graphische Darstellung der emittierten Fluoreszenz der Fluorochrome, die proportional ist zur

entstehenden Amplifikatmenge. In jedem Zyklus wird die Fluoreszenzstärke R gemessen, die

für die native Fluoreszenz der Fluorochrome steht. Wird diese korrigiert um den

Fluoreszenzwert der Basislinie, so erhält man den Fluoreszenzwert dR. Wenn R mit der

Fluoreszenz eines Referenzfarbstoffes (z.B. 5-Carboxy-X-Rhodamin, ROX) abgeglichen

(normalisiert) wird, erhält man Rn. Falls sowohl um die Basislinie als auch um die

Fluoreszenz des Referenzfarbstoffes korrigiert wird, wird der Fluoreszenzwert dRn

dargestellt. Die Ergebnisse werden in Form von Amplifikationsgrafiken

5´ 3´

3´ 5´

3´ 5´

Stop

Stop

R

Q

Q R

R

Q

Stop

5´ 3´

3´ 5´

(a)

(b)

(c)

LITERATURÜBERSICHT

34

(engl. amplification plots), bei denen auf der x-Achse der Zyklus und auf der y-Achse die

Fluoreszenzstärke (als R, Rn, dR, dRn) aufgetragen ist, graphisch dargestellt (Abbildung 7).

Der Referenzfarbstoff wird eingesetzt, um Unterschiede in der Fluoreszenz, die nicht mit der

Amplifizierung zusammenhängen (z.B. durch nicht identische Volumina des Mastermixes

oder unterschiedliche Lichtbrechung), auszugleichen bzw. zu normalisieren. Die Basislinie

wird i.d.R. Software-gestützt für jede Probe berechnet und stellt den Bereich dar, in dem noch

kein Anstieg der Fluoreszenzstärke durch entstehende Amplifikate zu verzeichnen ist. Da das

quenching der verwendeten Sonden nicht vollständig ist, wird auch hier eine gewisse

Hintergrundfluoreszenz gemessen.

Abbildung 7: Amplifikationsgrafik. In diesem Fall ist die normalisierte und Basislinien-korrigierte Fluoreszenzstärke (dRn) gegen die Zyklenzahl aufgetragen. Die schwarze Linie stellt den Fluoreszenzschwellenwert (engl. threshold) dar. Der Schnittpunkt zwischen Amplifikationsgraph und Fluoreszenzschwellenwert, projiziert auf die x-Achse, markiert den Ct-Wert (engl. threshold cycle). Es wurden 4 Standards (gefüllte Kästchen), eine unbekannte Probe (nicht gefüllte Kästchen) und eine negative Kontrolle, bei der kein Anstieg der Fluoreszenz zu verzeichnen war, eingesetzt.

threshold

Ct


35

Außerdem wird ein Fluoreszenzschwellenwert (engl. threshold) berechnet, der über der

Hintergrundfluoreszenz in der linearen Phase des Amplifikationsgraphen liegen sollte, die der

log-linearen Phase der PCR entspricht. In manchen Fällen, z.B. bei großen Mengen template,

kann eine manuelle Korrektur der Basislinie sowie des Fluoreszenzschwellenwertes nötig

sein. Der Ct-Wert (engl. threshold cycle) markiert den Zyklus, bei dem der

Amplifikationsgraph einer positiven Probe den Fluoreszenzschwellenwert kreuzt. Er steht in

direktem Zusammenhang mit der Ausgangsmenge der Zielsequenz und bildet so die

Grundlage der Quantifizierung. Der Ct-Wert ist umso kleiner, je mehr Zielsequenz in der

Probe vorhanden ist (HEID et al. 1996).

2.2.4 Quantifizierung

2.2.4.1 Absolute Quantifizierung

Bei der absoluten Quantifizierung wird die absolute Menge der Zielsequenz in einer

unbekannten Probe - meistens ausgedrückt als Kopienzahl pro Reaktion - bestimmt. Dazu

werden mehrere Standards mit bekannten Mengen der Zielsequenz in separaten Reaktionen

mitgeführt (externe Standards). Als DNA-Standards für eine real-time PCR werden

gewöhnlich linearisierte Plasmide mit klonierter Zielsequenz verwendet. Für eine

real-time RT-PCR bieten sich als RNA-Standards in vitro-Transkripte auf der Basis von

Plasmiden an (BUSTIN 2000; FRONHOFFS et al. 2002). Alternativ können genomische

DNA/RNA oder auch PCR-Produkte im Falle der Quantifizierung von DNA genutzt werden.

Für die Standards wird der jeweilig erhaltene Ct-Wert (auf der y-Achse) gegen die initiale

Menge der Zielsequenz (als Kopienzahl auf der logarithmischen x-Achse) aufgetragen,

wodurch eine Standardkurve entsteht (HEID et al. 1996). Der Ct-Wert einer unbekannten

Probe wird mit der Standardkurve verglichen, so daß die absolute initiale Kopienzahl

bestimmt werden kann (Abbildung 8). Dabei sollte die unbekannte Probe in den Bereich

fallen, der mit der Standardkurve abgedeckt wird (BUSTIN 2000). Die Voraussetzung für

eine exakte Quantifizierung ist die korrekte Bestimmung der Kopienzahl der Zielsequenz in

den Standards, die über eine Umrechnung mittels des Molekulargewichtes nach der

photometrischen Bestimmung der Absorption A260nm erfolgt. Außerdem müssen für die

Standards und die Proben die identischen Oligonukleotide zur Amplifizierung und Detektion

verwendet werden, die Sequenzen beider müssen möglichst ähnlich sein, und eine äquivalente

LITERATURÜBERSICHT

36

Effizienz der Amplifizierung muß gegeben sein (NIESTERS 2004). Optimal ist eine

PCR-Effizienz von 100 %, die sich auch in einer Steigung der Standardkurve von -3,322

widerspiegelt. In diesem Fall wird die Amplifikatmenge pro Zyklus exakt verdoppelt. Der

optimale Wert für den Korrelationskoeffizienten RSq, der die Qualität der Standards

beschreibt, beträgt 1.

Dye Well Type Ct (dRn) Quantity (copies)

FAM Standard 18,23 1,00E+07 FAM Standard 25,15 1,00E+05 FAM Standard 31,79 1,00E+03 FAM Standard 38,05 1,00E+01 FAM Unknown 35,17 8,04E+01 FAM NTC No Ct No Ct

Abbildung 8: Standardkurve und tabellarische Darstellung der Ergebnisse bei der absoluten Quantifizierung. Für die Standardkurve wird die Zyklenzahl gegen die initiale Menge der Zielsequenz (als Kopienzahl auf der logarithmischen x-Achse) aufgetragen. Es wurden 4 Standards (gefüllte Kästchen) und eine unbekannte Probe (nicht gefüllte Kästchen) verwendet, die Amplifikationsgrafik ist in der Abbildung 7 dargestellt.

Ct Probe x

Kopienzahl Probe x


37

2.2.4.2 Relative Quantifizierung

Bei der relativen Quantifizierung wird davon ausgegangen, daß Veränderungen in der Menge

der mRNA (engl. messenger RNA, Boten-RNA) den Veränderungen in der Menge des

Proteins entsprechen. Die Menge der Zielsequenz in der Probe wird normalisiert auf ein

endogenes Referenzgen und dann in Relation zu einer Referenzprobe (Kalibrator) gesetzt. Es

werden also zwei Zustände miteinander verglichen, z.B. Zytokinprofile zu unterschiedlichen

Versuchszeitpunkten.

Als erstes wird die Menge des Zielgens auf ein endogenes Referenzgen, das in den Proben

vorhanden ist, normalisiert (HEID et al. 1996). Als Referenzgen werden gewöhnlich so

genannte „housekeeping genes“, z.B. die mRNA für ß-Aktin,

GADPH (Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase) sowie ß-2-Mikroglobulin genutzt

(HEID et al. 1996). Die Voraussetzung für die Verwendung ist eine konstante Transkription

des housekeeping genes unter den experimentellen Bedingungen und in unterschiedlichen

Probenmaterialien. Mittels real-time RT-PCR, Northern Blot und

Ribonuklease protection-assay (BHATIA et al. 1994; ZHONG u. SIMONS 1999;

TRICARICO et al. 2002) wurde gezeigt, daß diese nicht immer gewährleistet ist. Daher muß

das housekeeping gene mit den geringsten Veränderungen ausgewählt oder ein Index aus

mehreren housekeeping genes (VANDESOMPELE et al. 2002) verwendet werden. Eine

Normalisierung auf ribosomale RNA oder totale RNA ist ebenfalls möglich (ZHONG u.

SIMONS 1999; TRICARICO et al. 2002). Alternativ können artifizielle Nukleinsäuren, wie

z.B. Plasmid-DNA, der Probe während der Nukleinsäureisolierung zugesetzt und als

Referenzgen genutzt werden (GRUBER et al. 2001). Die Zielsequenz und das Referenzgen

werden entweder in separaten Reaktionen (single assay) oder zusammen im multiplex assay

amplifiziert. Nachdem ein Kalibrator festgelegt wurde, wird dann für jede Probe die relative

Menge der Zielsequenz in Bezug auf den Kalibrator berechnet, so daß die Proben miteinander

verglichen werden können. Die Berechnungen erfolgen entweder über Standardkurven oder

über die 2-∆∆Ct-Methode (komparative Methode) nach LIVAK u. SCHMITTGEN (2001).

Bei der Standardkurve-Methode wird anhand einer Verdünnungsreihe zunächst eine

Standardkurve für das Referenzgen und das Zielgen abgeleitet und die Mengen von Zielgen

und Referenzgen in der Probe abgelesen (BUSTIN 2000). Wenn die PCR-Effizienzen für

beide gleich sind, erübrigt sich die Standardkurve für das Zielgen. Es ist nicht nötig, die

LITERATURÜBERSICHT

38

absolute Menge der Zielsequenz in den Standards zu kennen, da die Einheiten bei der

Berechnung einer relativen Menge der Zielsequenz in der Probe herausfallen. Im ersten

Schritt wird nämlich die auf das Referenzgen normalisierte Menge des Zielgens bestimmt,

indem die Menge des Zielgens durch die Menge des Referenzgens dividiert wird. Dann wird

eine Probe als Kalibrator festgelegt, der den Wert 1 erhält. Die relative Menge der

Zielsequenz in einer Probe in Bezug auf den Kalibrator wird berechnet, indem die

normalisierte Menge des Zielgens in der Probe durch die normalisierte Menge des Zielgens

des Kalibrators geteilt wird (Tabelle 1).

Tabelle 1: Beispiel der Berechnung über die Standardkurven-Methode zur relativen Quantifizierung.

Bei der Berechnung über die 2-∆∆Ct-Methode (LIVAK u. SCHMITTGEN 2001) sind

Standardkurven nur initial nötig, um zu gewährleisten, daß die nötigen vergleichbaren

PCR-Effizienzen für das Referenzgen und das Zielgen vorhanden sind. Danach können

Ct-Werte direkt miteinander verglichen werden, wobei die folgenden Berechnungen nötig

sind. Als erstes wird der Wert ∆Ct für jede Probe und für den Kalibrator berechnet:

∆Ct (Probe) = Ct Zielgen - Ct Referenzgen

∆Ct (Kalibrator) = Ct Zielgen - Ct Referenzgen

Dann wird ∆∆Ct für jede Probe berechnet:

∆∆Ct = ∆ Ct (Probe) - ∆Ct (Kalibrator)

Unter der Voraussetzung vergleichbarer PCR-Effizienzen kann dann

2-∆∆Ct = relative Menge der Zielsequenz in einer Probe

eingesetzt werden (Tabelle 2).

Probe Ct Zielgen Ct Referenzgen ∆Ct ∆∆Ct Menge Zielgen, relativ zum Kalibrator (2 -∆∆Ct)

Kalibrator 36,5 22,8 13,7 0 1 Probe x 31 23,1 7,9 -5,8 55,7

Tabelle 2: Beispiel der Berechnung über die 2-∆∆Ct-Methode zur relativen Quantifizierung.

Probe Ct Zielgen

Ct Referenzgen

Menge Zielgen

[ng]

Menge Referenzgen

[ng]

Menge Zielgen, normalisiert auf

Referenzgen

Menge Zielgen, relativ zum Kalibrator

Kalibrator 37,01 18,83 1,40E-03 346 4,05E-06 1 Probe x 34,43 18,59 7,20E-03 417 1,73E-05 4,3


39

2.2.5 Multiplex real-time PCR

Der Begriff „multiplex PCR“ steht für die simultane Amplifizierung von zwei oder mehreren

Zielsequenzen durch unterschiedliche Primerpaare in einer Reaktion.

CHAMBERLAIN et al. (1988) verwendeten sechs Primerpaare für die konventionelle PCR,

differenzierten die unterschiedlich großen Fragmente mittels Agarosegelelektrophorese und

beschrieben damit erstmalig eine multiplex PCR. Die „multiplex real-time PCR“ wird

realisiert durch die Verwendung unterschiedlich markierter Sonden zur Differenzierung der

Amplifikate (MACKAY et al. 2002). Anfangs war die Koamplifizierung und -detektion

mehrerer Zielsequenzen (engl. multiplexing) in der real-time PCR aufgrund der verfügbaren

Reporterfarbstoffe und Quencher sowie der Gerätetechnologie noch stark eingeschränkt.

Mittlerweile kann durch die Entwicklung von zahlreichen Reporterfarbstoffen und

nicht-fluoreszierenden Quenchern sowie den Einsatz von Halogenlampen und LEDs ein

breites Wellenlängenspektrum genutzt werden (KREUZER et al. 2001). Die Tabelle 3 gibt

einen Überblick über eine Auswahl möglicher Reporterfarbstoffe und Quencher sowie deren

Anregungs- und Emissionswellenlängen. Da die Emissionsspektren der Reporterfarbstoffe

sich möglichst nicht überlagern dürfen, ist die Anzahl der Zielsequenzen, die sich simultan

detektieren lassen, jedoch begrenzt.

Reporterfarbstoff / Quencher Anregung / Absorption Emission (nm) Reporterfarbstoffe FAM 495 520 TET 521 536 JOE 520 548 HEX 535 556 Cy3 552 570 Cy3.5 581 596 ROX 575 602 Texas Red 583 603 Cy5 643 667 Cy5.5 675 694 Quencher Dabcyl 380-530 - TAMRA 544 576 BHQ-1 480-580 - QS-7 500-600 - BHQ-2 550-650 -

Tabelle 3: Übersicht über häufig verwendete Reporterfarbstoffe und Quencher. Bei Quenchern ohne Angabe der Emissionswellenlänge handelt es sich um nicht-fluoreszierende Quencher, d.h. sie emittieren die aufgenommene Energie in Form von Wärme.

LITERATURÜBERSICHT

40

Problematisch bei einer multiplex PCR ist außerdem die Inhibition der Amplifizierung

derjenigen Zielsequenz, die in der geringeren Menge vorhanden ist (HOFMANN 2003;

PERSSON et al. 2005). Die Vorteile der multiplex real-time PCR liegen in einem geringeren

Arbeits-, Material- und Kostenaufwand und in der Einsparung von Probenmaterial. Es können

sowohl mehrere Zielsequenzen als auch eine Zielsequenz und ein/mehrere housekeeping

genes zur relativen Quantifizierung oder eine interne Kontrolle koamplifiziert werden. In den

letzten Jahren sind diverse multiplex real-time PCR-Protokolle zur Koamplifizierung

und -detektion von bis zu vier Zielsequenzen etabliert worden (VET et al. 1999; PERSSON et

al. 2005).

2.2.6 Interne Kontrollen

Die PCR kann durch eine Reihe von Faktoren biologischen (z.B. Lysozym, Hämoglobin) und

chemischen Ursprungs (z.B. Ethylendiamintetraacetat, EDTA) inhibiert werden. Man

unterscheidet die totale Inhibition, bei der falsch-negative Resultate zustande kommen, und

die partielle Inhibition, die sich in einem Verlust an Sensitivität widerspiegelt. Die Inhibitoren

beeinflussen die Lyse des Probenmaterials, die Isolierung der Nukleinsäure und die Aktivität

des Enzymsystems; ferner kann es zur Degradation der Nukleinsäure kommen (ROSSEN et

al. 1992; WILSON 1997).

Interne Kontrollen (engl. internal control, IC) werden verwendet, um die Funktionalität und

Effizienz der Zell- bzw. Virionenlyse, der RNA-/DNA-Isolierung und der (RT-)PCR in jeder

einzelnen Probe zu überprüfen. Sie dienen somit zum Ausschluß falsch-negativer Resultate

und wurden hierzu auch in der konventionellen (RT-)PCR eingesetzt (CONE et al. 1994;

KOX et al. 1994; ROSENSTRAUS et al. 1998). Bei der real-time (RT-)PCR sind interne

Kontrollen ferner wichtig als Basis zur Quantifizierung unbekannter Nukleinsäuremengen, da

hier eine vergleichbare Effizienz der Isolierung der Nukleinsäure und der (RT-)PCR in den

einzelnen Proben gewährleistet sein muß.

Es können housekeeping genes bzw. single copy genes als interne RNA- bzw.

DNA-Kontrollen genutzt werden (GIBSON et al. 1996; HUGHES et al. 2004). Sie haben den

Vorteil, daß der gesamte Prozeß inkl. der Lyse des Probenmaterials und die Integrität der

Nukleinsäure verifiziert wird. Nachteilig ist, daß ihre Konzentration, insbesondere in

zellfreien Proben, nicht bekannt ist, was unter ungünstigen Bedingungen zu einer Inhibition

der Amplifizierung der Zielsequenz führen kann.


41

Alternativ zu diesen intern in den Probenmaterialien vorkommenden Nukleinsäuren können

externe Nukleinsäuren als interne Kontrollen verwendet werden. Je nachdem, wann sie

zugesetzt werden, kann der Prozeß ab der Lyse (DROSTEN et al. 2001; HOFMANN 2003)

oder der Nukleinsäureisolierung (HOFFMANN et al. 2005) bzw. nur die (RT-)PCR (KOX et

al. 1994) überprüft werden. Einerseits können dabei natürlich vorkommende Viren oder

Nukleinsäuren (virale Nukleinsäure oder mRNA) eingesetzt werden. Wenn z.B. ein nicht

verwandtes Virus (NIESTERS 2004) zugesetzt wird, kann die Lyse der Virionen überprüft

werden. Nachteilig ist, daß diese Art einer IC infektiös ist. Andererseits werden

Viruschimären bzw. artifizielle Nukleinsäuren verwendet. HOFMANN (2003) konstruierte

eine - ebenfalls infektiöse - Viruschimäre. Diese dient auch der Überprüfung der Virionlyse

und hat außerdem den Vorteil gegenüber einem natürlich vorkommenden Virus, daß sie

universell verwendet werden kann. Bei entsprechender Konstruktion und Amplifizierung

können auch artifizielle Nukleinsäuren (in vitro-transkribierte RNA, Plasmid-DNA)

universell eingesetzt werden, wobei sie ferner den Vorteil aufweisen, daß sie nicht infektiös

sind (HOFFMANN et al. 2005). Eine Überprüfung der Virionen- oder Zellyse ist damit

jedoch nicht möglich. Um auch diese kontrollieren zu können, verwendeten DROSTEN et al.

(2001) in Phagen verpackte in vitro-transkribierte RNA als IC.

Die IC kann entweder in einem separaten Reaktionsansatz getrennt von der Zielsequenz

(single assay) oder mit dieser zusammen im multiplex assay amplifiziert und detektiert

werden. Zur Koamplifizierung im multiplex assay wird entweder ein homologes oder ein

heterologes System angewendet. Beim homologen System werden dabei die gleichen Primer

für die Zielsequenz und die IC, aber unterschiedlich markierte Sonden zur Differenzierung

verwendet (DROSTEN et al. 2001). Damit ist die größtmögliche Nähe zur Amplifizierung der

Zielsequenz gegeben. Für die Optimierung des multiplex assays kann die Größe des

amplifizierten Fragmentes der IC variiert werden. Nachteilig ist, daß für jedes Zielgen die IC

sowie die detektierende Sonde neu konstruiert werden müssen. Das heterologe System besteht

aus komplett eigenen Primern und Sonde für die IC (HOFMANN 2003; HOFFMANN et al.

2005). Die Optimierung des multiplex assays kann sowohl über die Größe des amplifizierten

Fragmentes der IC als auch über die Limitierung der Primerkonzentration für die IC erfolgen.

Ein weiterer Vorteil des heterologen Systems ist, daß es universell verwendet werden kann.

Virusstämme, RNA-Isolierung

43

3 MATERIAL UND METHODEN

3.1 Virusstämme

Es wurden insgesamt 13 RHDV-Stämme des Friedrich-Loeffler-Institutes (FLI) für diese

Arbeit verwendet. Sie stammen aus den Jahren 1989 bis 2004 und gehen auf RHD-Ausbrüche

in Deutschland zurück. Die Virusstämme wurden nach experimenteller Infektion von

empfänglichen Tieren mit dem Feldisolat gewonnen und liegen als Lyophilisate von

10 % Leberhomogenaten vor. Desweiteren wurden zwei bei - 70 °C gelagerte Lebern von

Kaninchen verwendet, die experimentell mit den Stämmen

„RHDV Eisenhüttenstadt“ (accession number Y15440) und „RHDV Triptis“

(accession number Y15442) infiziert worden waren. Für Spezifitätstest wurden außerdem

zwei EBHSV-Stämme und ein Myxomatosevirus des FLI (Feldisolate) und ein

FCV (F9-Stamm) der American Type Culture Collection (ATCC) verwendet. Einzelheiten

über die verwendeten Virusstämme sind in der Tabelle 5 (Anhang, 9.1.1) aufgeführt.

Die weiteren verwendeten Materialien, Geräte, Gebrauchsgegenstände,

Verbrauchsmaterialien sowie Software und Herstellerangaben sind ebenfalls dem Anhang zu

entnehmen.

3.2 RNA-Isolierung

3.2.1 Allgemeines

Die RNA-Isolierung wurde an einem separaten Arbeitsplatz durchgeführt, der ausschließlich

diesem Zwecke diente. Alle Protokolle wurden modifiziert durch die Zugabe von 5 µl

in vitro-transkribierter IC2 RNA (2 x 105 Kopien/µl), die als interne Kontrolle verwendet wird

(HOFFMANN et al. 2005), nach der Lyse der Probe und Inaktivierung von vorhandenen

RNasen. Zur Detektion von möglichen Kreuzkontaminationen wurde während jeder

RNA-Isolierung eine weitere Probe, bei der nur Puffer eingesetzt wurde, aufgearbeitet

(RNA-Isolierungskontrolle). Außer der konzentrierten RNA für die Transfektion und den

Northern Blot wurde die aus einer Probe extrahierte RNA jeweils in 50 µl RNase-freiem

Wasser bzw. dem entsprechenden Puffer eluiert. Anschließend wurde die RNA bei - 70 °C

gelagert.

MATERIAL UND METHODEN

44

3.2.2 RNA-Isolierung mit dem RNeasy® Mini Kit

Für die RNA-Isolierung aus Organmaterial, Leberhomogenaten, Lyophilisaten, Leukozyten

und RLI-R-Zellen (engl. rabbit liver immortalized, Anhang, 9.1.2) wurde das

RNeasy® Mini Kit verwendet. Die Vorbereitung der Puffer wurde entsprechend den Angaben

des Herstellers durchgeführt.

Die Homogenisierung und Lyse der Proben in 600 µl Puffer RLT wurde für die einzelnen

Proben wie folgt durchgeführt: 20 mg Organmaterial aus dem Tierversuch 3.16 bzw. 10 mg

aus dem Tierversuch 3.17 wurden im Puffer RLT in einem 2 ml-Reaktionsgefäß mittels einer

Stahlkugel (5 mm) in einem Tissue Lyser (2 min bei 20 Hz) homogenisiert. Lyophilisate

wurden in RNase-freiem Wasser gelöst, um ein 10 % Organhomogenat zu erhalten. Von den

10 % Organhomogenaten wurden 100 µl mit dem Puffer RLT versetzt. Die Leukozyten aus

1 ml EDTA-Blut wurden nach ca. 10 min Erythrozytenlyse bei RT mit 4 ml

Erythrozytenlysispuffer pelletiert (150 g, 8 min, 4 °C). Der Überstand wurde verworfen, die

Leukozytenanzahl wurde mit einer Neubauer-Zählkammer bestimmt, und zu

5 x 106 Leukozyten wurde der Puffer RLT gegeben. RLI-R-Zellen wurden nach der

Bestimmung der Zellzahl mit dem Puffer RLT versetzt.

Alle Lysate wurden im Folgenden für 3 min bei 20000 g zentrifugiert. Die Überstände

wurden in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß gegeben und mit 600 µl 70 % Ethanol vermischt. Sie

wurden dann in zwei Schritten auf eine Säule in einem entsprechenden Auffanggefäß

aufgetragen, wobei anschließend jeweils für 15 s bei 8000 g zentrifugiert und der Durchfluß

verworfen wurde. Danach wurden 700 µl des Waschpuffers RW1 auf die Säule gegeben,

nochmals wie oben zentrifugiert und das Auffanggefäß inklusive Durchfluß verworfen.

Nachdem die Säule in ein neues Auffanggefäß gegeben wurde, folgten zwei weitere

Waschschritte mit je 500 µl des Puffers RPE. Zunächst wurde wie oben beschrieben

zentrifugiert und der Durchfluß verworfen. Die zweite Zentrifugation erfolgte für 2 min bei

8000 g. Die Säule wurde in ein neues Auffanggefäß übertragen und daraufhin nochmals 1 min

bei 20000 g zentrifugiert. Schließlich wurde die Säule in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß gegeben

und die RNA mit RNase-freiem Wasser bei 8000 g für 1 min eluiert.

RNA-Isolierung

45

3.2.3 RNA-Isolierung mit dem QIAamp® Viral RNA Mini Kit

Das QIAamp® Viral RNA Mini Kit wurde für die RNA-Extraktion aus zellfreien Proben wie

Serum, Urin, Galle und Zellkulturüberständen benutzt. Die Vorbereitung der Puffer erfolgte

nach den Angaben des Herstellers.

Jeweils 140 µl Probenmaterial wurden für 15 s mit 560 µl des Lysispuffers AVL durch

vortexen gemischt und dann 10 min bei RT inkubiert. Nach Zugabe von 560 µl

100 % Ethanol und erneutem Mischen wurde die Probe in zwei Schritten auf eine Säule in

einem entsprechenden Auffanggefäß aufgetragen. Es wurde jeweils für 1 min bei 6000 g

zentrifugiert und der Durchfluß verworfen. Dann wurden 500 µl des Waschpuffers AW1 auf

die Säule gegeben und nochmals wie oben zentrifugiert. Nach dem Wechsel des

Auffanggefäßes erfolgte ein weiterer Waschschritt mit 500 µl des Puffers AW2 und

Zentrifugation für 3 min bei 20000 g. Die Säule wurde in ein neues Auffanggefäß übertragen

und daraufhin nochmals 1 min bei 20000 g zentrifugiert. Schließlich wurde die Säule in ein

1,5 ml-Reaktionsgefäß gegeben und die RNA mit dem Puffer AVE bei 6000 g für 1 min

eluiert.

3.2.4 RNA-Isolierung mit TRIzol®Reagent

Die RNA-Isolierung mit TRIzol®Reagent wurde entsprechend den Angaben des Herstellers

mit einigen im Folgenden beschriebenen Modifikationen durchgeführt.

Diese Methode wurde angewendet für eine Konzentrierung von RNA aus größeren Mengen

Gewebe. Dazu wurden je 100 mg Lebergewebe von zwei Kaninchen, die experimentell mit

den Stämmen „RHDV Eisenhüttenstadt“ und „RHDV Triptis“ infiziert worden waren, mit

einem Homogenisator in 1 ml TRIzol®Reagent homogenisiert und dann weiter nach den

Herstellerangaben wie unten beschrieben aufgearbeitet. 1 g Lebergewebe des Tieres Nr. 685

aus dem Tierversuch 3.16 wurde in 20 ml TRIzol®Reagent auf die gleiche Weise

homogenisiert und weiter aufgearbeitet, wobei die RNA in 250 µl RNase-freiem Wasser

gelöst und für den Northern Blot verwendet wurde. Außerdem wurde 0,9 g Milzgewebe des

Tieres Nr. 679 aus dem Tierversuch 3.16 in 20 ml TRIzol®Reagent homogenisiert und weiter

aufgearbeitet, wobei die RNA in 250 µl Diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandeltem PBS

(engl. phosphate buffered saline, Phosphat gepufferte Salzlösung) gelöst und für die

Transfektion von RLI-R-Zellen verwendet wurde.


46

Außerdem wurde die RNA-Extraktion mit TRIzol®Reagent verwendet für Probenmaterial,

bei denen sich nach der Aufarbeitung mit anderen Methoden eine Inhibition der IC zeigte.

Hierbei handelte es sich um die Isolierung von RNA aus 10 mg Lebergewebe aus dem

Tierversuch 3.17 sowie 10 mg Faeces aus dem Tierversuch 3.16. Diese Proben wurden in

1 ml TRIzol®Reagent in einem Tissue Lyser (analog 3.2.2) homogenisiert und anschließend

den Herstellerangaben entsprechend aufgearbeitet. Das RNA-Pellet wurde im Falle des

Lebergewebes in RNase-freiem Wasser aufgenommen. Das aus Kotproben erhaltene Pellet

wurde mit 600 µl Puffer RLT versetzt und danach mit dem RNeasy® Mini Kit wie unter

3.2.2 beschrieben aufgereinigt.

Nach der oben beschriebenen Homogenisierung der einzelnen Proben wurde 10 min bei

12000 g und 4 °C zentrifugiert. Die Überstände wurden in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß

übertragen und für 5 min bei RT inkubiert. Nach Zugabe von 200 µl Chloroform/1 ml

TRIzol®Reagent wurde für 15 s durch Schütteln gemischt und erneut für 2 - 3 min bei RT

inkubiert. Durch eine sich anschließende Zentrifugation (15 min, 12000 g, 4 °C) erfolgte die

Trennung der Phenol-Chloroform-Phase von der wäßrigen Phase. Die sich oben befindende

wäßrige Phase wurde in ein neues 1,5 ml-Reaktionsgefäß gegeben und mit 500 µl

Isopropanol/1 ml TRIzol®Reagent gemischt. Die Präzipitation der RNA erfolgte nach 10 min

Inkubation bei RT durch Zentrifugation für 10 min bei 12000 g und 4 °C. Abweichend wurde

die RNA aus 100 mg Lebergewebe mit einem Gemisch aus 250 µl Isopropanol und 250 µl

hochkonzentrierter Salzlösung (0,8 M Natriumcitrat, 1,2 M Natriumchlorid)/1 ml

TRIzol®Reagent gefällt. Nach der Fällung wurde der Überstand verworfen und das Pellet

durch Zugabe von 1 ml 75 % Ethanol/1 ml TRIzol®Reagent und anschließendes

Zentrifugieren (5 min, 7500 g, 4 °C) gewaschen. Danach wurde der Überstand abgenommen,

und das Pellet wurde für ca. 10 min unter Vakuum getrocknet. Es wurde in RNase-freiem

Wasser aufgenommen und schließlich für 10 min bei 57 °C zur besseren Lösung inkubiert.

3.3 Klonierung und in vitro-Transkription

3.3.1 Allgemeines

Diese Methoden wurden verwendet, um in vitro-Transkripte als positive Kontrollen für die

real-time RT-PCR (engl. positive control, PC), die Formaldehyd-Agarosegelelektrophorese

Klonierung und in vitro-Transkription

47

und den Northern Blot sowie die Digoxigenin (DIG)-markierten RNA-Sonden für den

Northern Blot und die In situ-Hybridisierung herzustellen.

3.3.2 Herstellung einer positiven Kontrolle für die real-time RT-PCR

Es wurde eine positive Kontrolle (PC RNA) durch Klonierung in den Vektor pGEM®-TEasy

und sich anschließende in vitro-Transkription hergestellt. Die interne Kontrolle (IC2 RNA)

wurde auf ähnliche Weise konstruiert (HOFFMANN et al. 2005) und basiert auf einem

Fragment des Standard-Klonierungsvektors pEGFP-1 (BD Biosciences Clontech,

accession number U55761).

3.3.2.1 Amplifizierung mittels RT-PCR

Für die Klonierung wurde zunächst ein 104 bp großes Fragment des VP60-Gens, welches

auch in der real-time RT-PCR nachgewiesen wird, mittels konventioneller RT-PCR

amplifiziert. Der Reaktionsansatz mit einem Endvolumen von 25 µl unter Verwendung des

SuperScript™ III One-Step RT-PCR Systems setzte sich wie folgt zusammen:

Reaction Mix (2x; 0,4 mM je dNTP, 3,2 mM Magnesiumsulfat) 12,5 µl

A. bidest 4 µl

vp60-7_for (20 pmol/µl) 1 µl

vp60-8_rev (20 pmol/µl) 1 µl

Magnesiumsulfat (5 mM) 0,5 µl

SuperScript III™ RT / Platinum® Taq Mix 1 µl

template 5 µl

Endvolumen 25 µl

Als template wurde RNA aus der Leber eines Kaninchens, das experimentell mit

„RHDV Eisenhüttenstadt“ infiziert wurde, in einer 1:100-Verdünnung in RNase-freiem

Wasser verwendet. Die Trennung der Arbeitsplätze für Mastermix und template und die

Verwendung von Kontrollen wurde analog zu 3.4.2 gehandhabt. Die verwendeten

Primersequenzen sind der Tabelle 6 (Anhang, 9.1.4) zu entnehmen.


48

Die Reaktion wurde in einem Primus 96plus-Cycler mit dem folgenden Temperaturprofil

durchgeführt:

30 min bei 50 °C (Reverse Transkription)

2 min bei 94 °C (Inaktivierung der RT, Aktivierung der Taq-Polymerase)

35 Zyklen mit:

30 s bei 94 °C (Denaturierung)

30 s bei 55 °C (Annealing)

90 s bei 70 °C (Elongation)

10 min bei 70 °C (finale Elongation)

Das gesamte PCR-Produkt wurde mit 10 µl Ladepuffer versetzt und mittels Elektrophorese in

einem 1 % Agarosegel dargestellt. Die Banden wurden im durchscheinenden UV-Licht eines

Transilluminators ausgeschnitten, und die DNA wurde unter Verwendung des

QIAquick® Gel Extraction Kits aus dem Gel extrahiert und gereinigt. Die Vorbereitung der

Puffer wurde dabei nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. Zunächst wurden in

einem 2 ml-Reaktionsgefäß 3 Volumen des Bindepuffers QG zu einem Volumen des

abgewogenen Gelstückes gegeben (100 mg Gel entsprechen ca. 100 µl) und für ca. 10 min bei

50 °C inkubiert. Nachdem sich das Gelstück völlig aufgelöst hatte, wurde 1 Volumen

Isopropanol zugesetzt und gemischt. Alle folgenden Zentrifugationsschritte erfolgten für

1 min bei 17900 g. Die Probe wurde in mehreren Schritten auf eine Säule in einem

entsprechenden Auffanggefäß aufgetragen und jeweils zentrifugiert, wobei der Durchfluß

verworfen wurde. Anschließend wurden weitere 500 µl Puffer QG zugegeben, zentrifugiert

und der Durchfluß verworfen. Es folgte ein Waschschritt mit 750 µl Puffer PE und

nochmaliger Zentrifugation. Nach Verwerfen des Durchflusses wurde erneut zentrifugiert.

Danach wurde die Säule in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß übertragen und 30 µl des

Elutionspuffers EB zugegeben. Nach 1 min Inkubation bei RT wurde die DNA durch einen

letzten Zentrifugationsschritt eluiert.

3.3.2.2 Klonierung

Das gereinigte PCR-Produkt wurde mit dem Standard-Klonierungsvektor pGEM®-TEasy

ligiert. Dazu wurden unter Verwendung des pGEM®-TEasy Vector Systems II 5 µl

Ligationspuffer (2x), 3 µl PCR-Produkt (38 ng/µl), 1 µl pGEM®-TEasy Vektor (50 ng/µl)


49

und 1 µl T4 DNA Ligase zu einem Endvolumen von 10 µl gemischt. Die Ligation erfolgte

über Nacht bei 4 °C.

Für die Transformation wurden E. coli XL1blue als kompetente Bakterienzellen verwendet.

5 µl des Ligaseansatzes wurden zu 100 µl der auf Eis aufgetauten E. coli XL1blue gegeben,

gemischt und für 30 min auf Eis gestellt. Es schloß sich eine Inkubation für 90 s bei 42 °C

gefolgt von weiteren 2 min auf Eis an. Nach Zugabe von 400 µl Luria-Bertani (LB)-Medium

wurde für 90 min bei 37 °C unter Schütteln (800 rpm) inkubiert. 300 µl des

Transformationsansatzes wurden unter Zusatz von 60 µl

x-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-galactopyranosid, 20 mg/ml in Dimethylformamid)

und 6 µl IPTG (Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranosid, 200 mg/ml in A. bidest) auf einer

Ampicillin-Selektionsagarplatte ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert.

Die Selektion erfolgte am nächsten Tag über Blau-Weiß-Selektion: verdächtige, d.h. weiße,

Bakterienkolonien wurden für die Plasmid-Mini-Präparation herangezogen. Dazu wurden je

2,5 ml LB-Medium mit 1,5 µl/ml Ampicillin (50 mg/ml) in ein 20 ml-Röhrchen gegeben, mit

einer weißen Bakterienkolonie angeimpft und über Nacht bei 37 °C unter Schütteln (190 rpm)

inkubiert. Aus 1,5 ml dieser Übernachtkultur erfolgte die Plasmid-Isolierung nach dem

Prinzip der alkalischen Lyse (BIRNBOIM 1983). Zunächst wurden die Bakterien durch

Zentrifugation für 1 min bei 2000 g in einem 1,5 ml-Reaktionsgefäß pelletiert. Das Pellet

wurde in 100 µl kalter Lösung I resuspendiert und nach 5 min Inkubation bei RT mit 200 µl

Lösung II versetzt. Anschließend wurde durch Schwenken gemischt und für 5 min auf Eis

inkubiert. Danach wurden 150 µl Lösung III zugesetzt und erneut gemischt sowie auf Eis

inkubiert wie oben beschrieben. Nach 7 min Zentrifugation bei 20000 g wurde der Überstand

in ein neues 1,5 ml-Reaktionsgefäß übertragen, 500 µl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol

(25:24:1) zugegeben und erneut zentrifugiert (7 min, 20000 g). Die sich oben befindende

Phase wurde in ein neues 1,5 ml-Reaktionsgefäß übertragen. Nach Zugabe von 1 ml

100 % Ethanol, Mischen durch vortexen und 2 min Inkubation bei RT wurde erneut

zentrifugiert (5 min, 20000 g). Der Überstand wurde verworfen, und das Pellet wurde durch

Zugabe von 300 µl 70 % Ethanol und folgende Zentrifugation (2 min, 20000 g) gewaschen.

Nach Abnahme des Überstandes wurde das Pellet für 15 min bei 37 °C getrocknet, danach in

35 µl RNase A-haltigem Wasser resuspendiert und nochmals für 30 min bei 37 °C inkubiert.


50

Die isolierte Plasmid-DNA wurde durch Spaltung mit dem Restriktionsenzym NotI überprüft.

Dazu wurden 5,65 µl A. bidest, 3 µl Plasmid-DNA (2,5 µg/µl), 1 µl Puffer 3 (10x), 0,1 µl

bovines Serumalbumin (BSA, 100x, 10 mg/ml) und 0,25 µl NotI (10 u/µl) zu einem

Endvolumen von 10 µl zusammengegeben. Nach 2 h Inkubation bei 37 °C erfolgte die

Darstellung der Fragmente über eine Agarosegelelektrophorese. Weiterhin wurden die

Plasmide durch PCR (analog 3.3.1.1) und anschließende Agarosegelelektrophorese auf das

Vorhandensein des gewünschten DNA-Fragmentes kontrolliert. Um die Orientierung der

inserts zu bestimmen, wurde die Plasmid-DNA aus vier positiven Klonen mit der Methode

nach SANGER et al. (1977) sequenziert, wobei das Thermo Sequenase Fluorescent Labelled

Primer Cycle Sequencing-Kit verwendet wurde. Zunächst wurden pro Probe zwei Mastermixe

aus je 6,15 µl Plasmid-DNA (2,5 µg/µl), 3 µl A. bidest, 0,35 µl Dimethylsulfoxid (DMSO)

und 1 µl des IRD800-markierten M13for- bzw. M13rev-Primers (2 pmol/µl; Tabelle 6,

Anhang, 9.1.4) erstellt. Von dem Mastermix wurden je 2,5 µl mit 0,7 µl G-, A-, T- bzw.

C-Reagenz zusammengegeben. Die Reaktion fand in einem Primus 96plus-Cycler mit dem

folgenden Temperaturprofil statt: 5 min bei 95 °C, gefolgt von 30 Zyklen mit: 30 s bei 95 °C

(Denaturierung), 30 s bei 60 °C (Annealing) und 30 s bei 70 °C (Elongation). Im Anschluß

wurden 1,8 µl Sequenz-Stop-Lösung zugegeben. Die Proben wurden im Labor von

Dipl.-Chem. G. Strebelow auf ein Polyacrylamid-Harnstoffgel aufgetragen, und die

Auswertung erfolgte mit dem LI-Cor DNA-Analyzer GENE READER 4200.

3.3.2.3 In vitro-Transkription

Für die in vitro-Transkription wurde das ausgewählte und als „pGEM-VP60_p7-8for“

bezeichnete Plasmid zunächst mit dem Restriktionsenzym MluI linearisiert, um

T7-„run off“-Transkripte definierter Länge zu erhalten. Hierzu wurden 17 µl A. bidest, 8 µl

Plasmid-DNA (2,5 µg/µl), 3 µl Puffer R+ mit BSA (10x) und 2 µl MluI (10 u/µl) zu einem

Endvolumen von 30 µl zusammengegeben und für 2 h bei 37 °C inkubiert. Die Isolierung und

Aufreinigung der DNA erfolgte analog zu 3.3.1.1 über eine Agarosegelelektrophorese und das

QIAquick® Gel Extraction Kit mit Elution in 50 µl des Puffers EB.

Die linearisierte und gereinigte Plasmid-DNA wurde als template für die

in vitro-Transkription eingesetzt. Unter Verwendung des Riboprobe® Systems - SP6/T7

wurden 10 µl Transkriptionspuffer (5x), 2 µl Dithiothreitol (DTT, 100mM), 1 µl

rekombinanter RNasin® Ribonuklease Inhibitor (40 u/µl), je 2 µl der


51

Ribonukleosidtriphosphate rATP, rCTP, rGTP, rUTP (je 2,5 mM), 6 µl linearisierte

template-DNA (460 ng/µl), 2 µl T7 RNA Polymerase (20 u/µl) und 11 µl

Nuklease-freies Wasser bei RT zu einem Endvolumen von 50 µl zusammengegeben, gemischt

und für 90 min bei 37 °C inkubiert.

Daraufhin wurden 2 µl der im Kit enthaltenen RQ1 RNase-freien DNase (1 u/µl) zugegeben

und nochmals für 15 min inkubiert, um Reste von template-DNA zu entfernen. Die

Aufreinigung der in vitro-transkribierten RNA geschah über das RNeasy® Mini Kit ergänzt

durch einen weiteren DNase-Verdau mit dem RNase-free DNase Set. Die Vorbereitung der

Puffer wurde entsprechend den Herstellerangaben durchgeführt. Als erstes wurde der

Reaktionsansatz mit RNase-freiem Wasser auf ein Volumen von 100 µl aufgefüllt. Dann

wurden 350 µl des Lysispuffers RLT zugegeben und gemischt. Nach Zugabe von 250 µl

100 % Ethanol wurde die Probe auf eine Säule in einem entsprechenden Auffanggefäß

aufgetragen und zentrifugiert (15 s, 8000g). Das Auffanggefäß wurde gewechselt, 350 µl des

Waschpuffers RW1 auf die Säule gegeben und wie oben zentrifugiert. Der Durchfluß wurde

verworfen, und 80 µl einer Lösung von DNase I im Puffer RDD (RNase-Free DNase Set)

wurden auf der Säule für 15 min bei RT inkubiert. Danach wurden 350 µl des Puffers RW1

zugegeben, erneut wie oben zentrifugiert und der Durchfluß verworfen. Nachdem die Säule in

ein neues Auffanggefäß gegeben wurde, folgten zwei weitere Waschschritte mit je 500 µl des

Puffers RPE. Zunächst wurde wie oben beschrieben zentrifugiert. Nach dem Verwerfen des

Durchflusses erfolgte die zweite Zentrifugation für 2 min bei 8000 g. Die Säule wurde in ein

neues Auffanggefäß übertragen und daraufhin nochmals zentrifugiert (1 min, 20000 g).

Daraufhin wurde die Säule in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß gegeben. Schließlich wurde die

in vitro-transkribierte und aufgereinigte RNA in einem Gesamtvolumen von 100 µl eluiert

durch zwei aufeinander folgende Zentrifugationsschritte (1 min, 8000 g) mit jeweils 50 µl

RNase-freiem Wasser.

Um die Menge noch vorhandener DNA zu bestimmen, wurde eine real-time PCR

durchgeführt. Die Trennung der Arbeitsplätze für Mastermix und template sowie das

Mitführen einer negativen Kontrolle erfolgte wie unter 3.4.2 beschrieben. Die aufgereinigte

und DNase-verdaute in vitro-transkribierte RNA wurde als template (1:1000 verdünnt in

RNase-freiem Wasser) in zwei Reaktionsansätzen eingesetzt. Die verwendeten

Oligonukleotide sind der Tabelle 6 (Anhang, 9.1.4) zu entnehmen. Einer der Ansätze enthielt


52

keine RT, so daß hier nur die evtl. noch vorhandene DNA amplifiziert werden konnte. Die

Reaktionsansätze mit einem Endvolumen von 25 µl unter Verwendung des QuantiTect™

Probe RT-PCR Kits setzten sich somit wie folgt zusammen:

mit RT ohne RT

2x QuantiTect Probe RT-PCR Master Mix1 12,5 µl 12,5 µl

RNase-freies Wasser 4,75 µl 5 µl

vp60-7_for (20 pmol/µl) 1 µl 1µl

vp60-8_rev (20 pmol/µl) 1 µl 1 µl

vp60-9_fam (5 pmol/µl) 0,5 µl 0,5 µl

QuantiTect RT Mix2 0,25 µl -

template 5 µl 5 µl

Endvolumen 25 µl 25 µl

Die Reaktionen wurden in einem Mx3000P™ Real-Time PCR System mit dem folgenden

Temperaturprofil durchgeführt:



45 Zyklen mit:


30 s bei 55 °C (Annealing, Messung der Fluoreszenzdaten)


Die Konzentration der in vitro-transkribierten RNA wurde spektrophotometrisch bestimmt,

und die Anzahl der Moleküle wurde anhand der Formel

[x g/µl RNA / (Transkriptlänge in Nukleotiden x 340)] x 6,022 x 1023 = y Moleküle/µl

berechnet.

3.3.3 Herstellung einer positiven Kontrolle für die Formaldehyd-

Agarosegelelektrophorese und den Northern Blot

Als Ausgangsmaterial diente das Plasmid „pGEM-VP60_p7-8for“, das mit dem

Restriktionsenzym MluI linearisiert wurde (3.3.1.3) und dann als template für die

1 HotStarTaq® DNA Polymerase, QuantiTect Probe RT-PCR Puffer [Tris-Cl, KCl, (NH4)2SO4, 8 mM MgCl2, pH 8,7), dNTP mix (dATP, dCTP, dGTP, dUTP), ROX] 2 Omniscript™ Reverse Transkriptase, Sensiscript® Reverse Transkriptase


53

in vitro-Transkription mit dem AmpliScribe™ T7 High Yield Transcription Kit diente. Dabei

wurden 4 µl AmpliScribe T7 Reaktionspuffer (10x), 4 µl DTT (100 mM), je 3 µl ATP, CTP,

GTP, UTP (je 100 mM), 10 µl linearisierte template-DNA (460 ng/µl), 4 µl

AmpliScribe T7 Enzymlösung (mit RNase Inhibitor) und 6 µl RNase-freies Wasser zu einem

Endvolumen von 40 µl zusammengegeben, gemischt und 2 h bei 37 °C inkubiert. Daraufhin

wurden 2 µl der im Kit enthaltenen RNase-freien DNase I (1 u/µl) zugegeben und nochmals

für 15 min inkubiert, um Reste von template-DNA zu entfernen. Die weitere Aufreinigung

und Prüfung auf Reste von template-DNA erfolgte wie unter 3.3.1.3 beschrieben. Die

Kopienzahl/µl wurde durch eine real-time RT-PCR (3.4.2), bei der das in vitro-Transkript

(1:10000 verdünnt in RNase-freiem Wasser) als template eingesetzt wurde, bestimmt.

3.3.4 Herstellung der RNA-Sonden für den Northern Blot und die In situ-

Hybridisierung

Als Ausgangsmaterial diente das Plasmid „pGEM-RHDV_6422-7120R“. Zu dessen

Herstellung war ein 699 bp großes Fragment des ORF1 und ORF2 (mit Teilen der Gene für

VP60 und VP10) des RHDV-Isolates „Bosdorf“ mittels RT-PCR (3.5) mit den Primern

RHDV-6422 und RHDV-7120R (Tabelle 6, Anhang, 9.1.4) amplifiziert und in einen

pGEM®-TEasy Vektor kloniert worden (analog 3.3.1.2). Je 5 µg des Plasmids wurden

zunächst mit dem Restriktionsenzym PstI (für die antisense-Sonde, hier T7-Sonde) bzw.

ApaI (für die sense-Sonde, hier SP6-Sonde) linearisiert (analog 3.3.1.3). Für die

in vitro-Transkription und DIG-Markierung wurden je 20 µl T7 (bzw. SP6) Ribomax

Puffer (5x), 30 µl DIG-RNA Labeling Mix (40 mM/l), 2,5 µl rekombinantem RNasin RNase

Inhibitor (40 u/µl), 1 µl Pyrophosphatase (0,5 u/µl), 9 µl T7 (bzw. SP6) Polymerase (20 u/µl)

sowie 5 µg mit PstI bzw. ApaI linearisierte template-DNA und RNase-freies Wasser ad

100 µl zusammengegeben und für 2 h bei 37 °C inkubiert. Daraufhin wurden nochmals 9 µl

T7 (bzw. SP6) Polymerase (20 u/µl) zugesetzt, gefolgt von einer weiteren Inkubation für 2 h

bei 37 °C. Im Anschluß wurden 5 µl RNase-freie DNase (10 u/µl) zugegeben und erneut bei

37 °C für 15 min inkubiert. Die Fällung der RNA erfolgte über Nacht bei - 70 °C mit 400 µl

Ethanol, 12 µl 4 M Lithiumchlorid (= 100 mM Endkonzentration) und 3 µl 0,5 M EDTA. Am

folgenden Tag wurde für 30 min bei 11000 g und RT zentrifugiert, das Pellet mit

75 % Ethanol gewaschen, getrocknet und in 100 µl RNase-freiem Wasser resuspendiert. Die


54

Sonden wurden auf 150 bp eingekürzt3, indem für 48 min bei 60 °C mit 100 µl

Natriumcarbonatpuffer (pH 10,2) inkubiert wurde. Danach wurden 6 µl 3 M Natriumacetat

(pH 7,2), 10 µl 100 % Essigsäure und 540 µl Ethanol zugegeben und bei - 70 °C über Nacht

gefällt. Am folgenden Tag wurde für 30 min bei 11000 g und 4 °C zentrifugiert, das Pellet mit

75 % Ethanol gewaschen, getrocknet und in 200 µl RNase-freiem Wasser resuspendiert.

3.4 Real-time RT-PCR

3.4.1 Auswahl von Primern und Sonden

Mit den Funktionen Pileup und Pretty des Wisconsin Package

Version 10.2 (Genetics Computer Group, GCG) wurden ein Sequenz-Alignment und eine

Consensus-Sequenz der in der GenBank veröffentlichten RHDV-Sequenzen erstellt. Die

Primer und die Sonde für die Detektion von RHDV wurden darauf basierend entwickelt,

wobei die Software Beacon Designer 2.06 ergänzend verwendet wurde. Die Software

BLASTn wurde benutzt, um die Spezifität der ausgewählten Oligonukleotide für RHDV zu

überprüfen. Primer und Sonde für die Detektion der IC wurden ausgewählt und eingesetzt wie

beschrieben in HOFFMANN et al. (2005). Bei der IC handelt es sich um ein

in vitro-Transkript, das basierend auf dem EGFP (enhanced green fluorescent protein)-Gen

konstruiert wurde (3.3.2), und jeder Probe während der RNA-Isolierung in einer Menge von

1 x 106 Kopien zugesetzt wurde (3.2.1). Alle verwendeten Oligonukleotide sind in der Tabelle

6 (Anhang, 9.1.4) aufgeführt.

3 die zum Einkürzen nötige Zeit berechnete sich nach der Formel: t = (l0 – lf) / (k x l0 x lf). Mit: t = Zeit in Minuten, l0 = Ursprungslänge des inserts (kb), lf = gewünschte Länge (kb), k = Konstante = 0,11.

Real-time RT-PCR

55

3.4.2 Reaktionsbedingungen

Die real-time RT-PCR zum Nachweis von RHDV-Genom wurde unter Verwendung des

SuperScript™ III One-Step RT-PCR Systems durchgeführt. Die optimierten Reaktionsansätze

mit einem Endvolumen von 25 µl setzten sich wie folgt zusammen:

single assay (ohne Koamplifizierung der IC)


A. bidest 4,4 µl

RHDV-spezifischer Primer-Sonden-Mix4 2 µl

ROX Reference Dye (1:200 in 10mM Tris-HCl pH 8) 0,1 µl


template 5 µl

Endvolumen 25 µl

multiplex assay (mit Koamplifizierung der IC)


A. bidest 2,4 µl

RHDV-spezifischer Primer-Sonden-Mix4 2 µl

IC-spezifischer Primer-Sonden-Mix5 2 µl

ROX Reference Dye (1:200 in 10mM Tris-HCl pH 8) 0,1 µl


template 5 µl

Endvolumen 25 µl

Zunächst wurde unter einer UV-Bestrahlungsbox durch Zusammengabe der Reagentien in der

aufgeführten Reihenfolge (exkl. template) auf Eis ein Mastermix für die entsprechende

Anzahl von Reaktionsansätzen erstellt. Hiervon wurden je 20 µl in die einzelnen Vertiefungen

einer 96well-Platte (0,2 ml, Thermo-Fast® 96, Non Skirted; mit Ultra Clear Cap Strips)

gegeben und dann in einem anderen Raum je 5 µl template zu einem Endvolumen von 25 µl

zugegeben.

4 mit: je 10 pmol/µl vp60-7_for und vp60-8_rev, 1,25 pmol/µl vp60-9_fam 5 mit: je 2,5 pmol/µl EGFP-12-F und EGFP-10-R, 1,05 pmol/µl EGFP-HEX


56

Die Reaktionen wurden in einem Mx3000P™ Real-Time PCR System mit den folgenden

Temperaturprofilen durchgeführt:

single assay (ohne Koamplifizierung der IC)



45 Zyklen mit:




multiplex assay (mit Koamplifizierung der IC)



45 Zyklen mit:




Jeder Lauf enthielt eine positive Kontrolle, bei der als template 5 µl PC RNA eingesetzt

wurden, sowie eine negative Kontrolle, bei der anstatt des templates 5 µl A. bidest zugegeben

wurden. Ferner wurden in weiteren Reaktionsansätzen 5 µl der aus den jeweiligen

RNA-Isolierungskontrollen extrahierten RNA als template eingesetzt. Alle Proben aus den

Tierversuchen, bei denen absolute Kopienzahlen bestimmt wurden, wurden in Duplikaten im

multiplex assay untersucht. Hierbei wurden in jedem Lauf mindestens vier externe

RNA-Standards mitgeführt. Die von der Software Mx3000P v2.00 basierend auf der

abgeleiteten Standardkurve berechneten Ergebnisse in Kopien/Reaktion wurden umgerechnet

auf Kopien/mg (Organproben, Faeces), Kopien/µl (Urin, Galle, Serum, Zellkulturüberstände)

oder Kopien/5 x 105 Leukozyten bzw. RLI-R-Zellen.

3.5 Konventionelle RT-PCR

Um die Sensitivität der real-time RT-PCR im Rahmen der Validierung mit einer etablierten

Methode zu vergleichen, wurde eine konventionelle RT-PCR zum Nachweis von

RHDV-Genom nach einem am FLI bestehenden Protokoll durchgeführt. Für die

Vergleichbarkeit der Reaktionsbedingungen wurde allerdings die gleiche Menge von 5 µl

Konventionelle RT-PCR

57

template wie in der real-time RT-PCR eingesetzt. Ferner wurde nach einem ersten Ansatz mit

30 Zyklen die Anzahl der Zyklen auf 40 erhöht.

Die Reaktion wurde mit Reagentien der Firma Promega in einem Endvolumen von 50 µl in

0,5 ml-Reaktionsgefäßen in einem MiniCycler™ durchgeführt. Die Primer sind in Tabelle 6

(Anhang, 9.1.4) aufgeführt. Die Trennung der Arbeitsplätze für Mastermix und template und

die Verwendung von Kontrollen wurde analog zu 3.4.2 gehandhabt. Die Reaktionsansätze

und Temperaturprofile für die einzelnen Schritte des Protokolls sind nachfolgend

zusammengefasst.

A. Annealing des RT-Primers

RNase-freies Wasser 12,5 µl

RHD3-7044 (5 pmol/µl) 1,5 µl

template 5 µl

Gesamtvolumen des Annealing-Ansatzes 19 µl

5 min bei 65 °C, innerhalb 7,5 min abkühlen auf 20 °C

B. Reverse Transkription

Nach dem Schritt A wurden die folgenden Reagentien zu einem Gesamtvolumen von 24 µl

für die RT hinzugegeben.

AMV (Aviäre Myeloblastose-Virus) RT Puffer (5x) 3 µl

dNTP mix (25 mM) 1 µl

rekombinanter RNasin RNase Inhibitor (40 u/µl) 0,5 µl

AMV RT (10 u/µl) 0,5 µl

Gesamtvolumen des RT-Ansatzes 24 µl

60 min bei 42 °C

5 min bei 90 °C


58

C. PCR

5 µl cDNA wurden zu 45 µl vorbereitetem PCR-Mix zugegeben, um ein Endvolumen von

50 µl für die PCR zu erhalten. Anschließend wurde mit 50 µl Mineralöl überschichtet.

RNase-freies Wasser 33,95 µl

Mg-freier DNA Polymerase Puffer (10x) 5 µl

MgCl2 (25 mM) 2,5 µl

dNTP mix (25mM) 0,4 µl

RHD3-6026 (5 pmol/µl) 1,5 µl

RHD5-5727 (5 pmol/µl) 1,5 µl

Taq DNA Polymerase (5 u/µl) 0,15 µl

cDNA 5 µl

Endvolumen 50 µl

4 min bei 91 °C

30 bzw. 40 Zyklen mit:

1 min bei 91 °C (Denaturierung)

1 min bei 54 °C (Annealing)

1 min bei 72 °C (Elongation)

10 min bei 72 °C (finale Elongation)

Die erfolgreiche Amplifizierung des 300 bp großen Fragmentes wurde mittels Elektrophorese

in einem 1,5 % Agarosegel kontrolliert.

3.6 Agarosegelelektrophorese, Membrantransfer von RNA

3.6.1 Agarosegelelektrophorese (für DNA)

Mittels Agarosegelelektrophorese wurden die Produkte der konventionellen RT-PCR sowie

der Spaltung mit Restriktionsenzymen dargestellt. Je nach Größe der erwarteten Fragmente

handelte es sich um 1 - 2 % (w/v) horizontale Agarosegele. Es wurde die nötige Menge

Agarose (z.B. 0,9 g für ein 1 % 90 ml Gel) in einem entsprechenden Volumen

TAE (Tris-Acetat-EDTA)-Puffer bis zur vollständigen Lösung erhitzt. Nach der Zugabe von

1 µl Ethidiumbromidlösung 1 % pro 100 ml wurde die Lösung in eine vorbereitete

Agarosegelelektrophorese, Membrantransfer von RNA

59

Gelkammer mit Kamm gegossen. Nach Polymerisation wurden abhängig von der erwarteten

Produktmenge 2 - 5 µl des Produktes mit 2 µl DNA-Probenpuffer gemischt und in eine

Lasche des Geles aufgetragen. Die verwendeten DNA-Längenstandards (PCR Marker,

Marker VI 0,15 - 2,1 kbp, 1 kb DNA Leiter) wurden in gleicher Weise aufgetragen, wobei

jeweils die vom Hersteller empfohlene Menge verwendet wurde. Die Auftrennung der

Fragmente erfolgte bei 120 V für ca. 1 h in TAE-Puffer. Das Agarosegel wurde im

durchscheinenden UV-Licht eines Transilluminators beurteilt und photographiert.

3.6.2 Formaldehyd-Agarosegelektrophorese (für RNA)

Die elektrophoretische Auftrennung von RNA für den Northern Blot erfolgte in 1,1 % (w/v)

horizontalen Agarosegelen mit 6 % Formaldehyd in MESA-Puffer

(3-(N-morpholino)propansulfonsäure (MOPS)-EDTA-Sodium-Acetat-Puffer). Nach dem

Erhitzen der benötigten Menge Agarose in MESA-Puffer wurde das Formaldehyd zugegeben

und die Lösung in eine vorbereitete Gelkammer mit Kamm gegossen. Je 5 µl der RNA-Probe

bzw. des mitgeführten Längenstandards (0,24 - 9,5 kb RNA Leiter, Konzentration 1 µg/µl)

wurden mit 18 µl RNA-Denaturierungspuffer für 10 min bei 70 °C denaturiert, 5 min auf Eis

abgekühlt, mit 2 µl RNA-Probenpuffer vermischt und in eine Lasche des Geles aufgetragen.

Die Auftrennung der Fragmente erfolgte - nach initialen 5 min bei 100 V - bei 75 V für 2 h.

Das Gel wurde für 20 min mit Ethidiumbromid-Lösung gefärbt, anschließend 3 x für 20 min

mit A. bidest entfärbt und mit angelegtem Lineal im durchscheinenden UV-Licht beurteilt und

photographiert.

3.6.3 Dot Blot und Northern Blot

Die Gebrauchsverdünnung der RNA-Sonden für den Northern Blot und die

In situ-Hybridisierung wurde durch Vergleich mit einer DIG-markierten Kontroll-RNA im

Dot Blot ermittelt. Dazu wurden je 1 µl der DIG-markierten Kontroll-RNA in mehreren

Verdünnungen in RNase-freiem Wasser (entsprechend einer Menge von 10 ng, 1 ng, 100 pg,

10 pg, 5 pg, 2,5 pg und 1,25 pg) sowie die DIG-markierten RNA-Sonden unverdünnt und in

mehreren Verdünnungen in RNase-freiem Wasser (1:10, 100, 200, 400, 800, 1600, 3200,

6400, 12800 und 25600) auf eine positiv geladene Nylonmembran aufgetragen, luftgetrocknet

und durch UV-Bestrahlung mit dieser vernetzt. Nach dem Waschen mit Maleinpuffer (1 min

bei RT) wurden alle folgenden Schritte wie beim Northern Blot durchgeführt.


60

Der Northern Blot diente dem Nachweis viraler RNA aus dem Tierversuch 3.16. Die

elektrophoretisch aufgetrennte RNA wurde mittels Diffusion auf eine positiv geladene

Nylonmembran transferiert. Dazu wurde das Gel auf 8 Lagen mit Blot-Puffer (0,05 N NaOH)

getränktes Gel-Blotting-Papier gelegt, von denen 3 in den Blot-Puffer eintauchten. Auf das

Gel wurden nacheinander die in Blot-Puffer eingeweichte Nylonmembran, weitere 5 Lagen

getränktes Gel-Blotting-Papier und mehrere Lagen Zellstoff gelegt, welche durch ein Gewicht

von ca. 1 kg beschwert wurden. Nach dem Transfer über Nacht wurde die Nylonmembran

2 x für ca. 5 min mit 2 x SSC (engl. sodiumchlorid sodiumcitrate, Natriumchlorid und

Natriumcitrat) gewaschen, luftgetrocknet und die RNA durch UV-Bestrahlung mit der

Nylonmembran vernetzt. Die Prähybridisierung erfolgte in Rollerröhren für 1 h bei 50 °C mit

der Vorhybridisierungslösung (19,5 ml Prähybridisationsmix, 0,2 ml

10 % SDS (engl. sodiumdodecylsulfate, Natriumdodecylsulfat), 0,5 ml RNA aus Kälberleber

(10 mg/ml)). Danach wurde über Nacht bei 50 °C mit 1 ng/µl der sequenzspezifischen

T7-Sonde (antisense-Sonde, Gebrauchsverdünnung 1:200) und

SP6-Sonde (sense-Sonde, 1:800), jeweils in 2 ml Vorhybridisierungslösung, hybridisiert.

Überschüssige Sonde wurde am nächsten Tag durch mehrere aufeinanderfolgende

Waschschritte entfernt. Zunächst wurde 2 x 30 min bei 56 °C mit 2 x SSC/0,1% SDS und

2 x 30 min bei 56 °C mit 0,2 x SSC/0,1 % SDS in den Rollerröhren gewaschen.

Dann wurde die Nylonmembran in eine Plastikschale gegeben, in der alle folgenden

Inkubationen unter Schwenken stattfanden. Als erstes wurde 1 min mit Maleinpuffer bei RT

gewaschen. Für die Färbung wurde zunächst für 30 min bei RT mit der blocking solution

geblockt. Dann wurde ein Alkalische Phosphatase (AP)-konjugiertes anti-DIG-Fab-Fragment

(1:5000 in blocking solution) für 1 h bei RT inkubiert und danach 2 x für 15 min bei RT mit

Maleinpuffer sowie 3 min bei RT mit Puffer 3 gewaschen. Schließlich wurde mit 10 ml der

Färbelösung, die 45 µl Nitro Blue Tetrazolium (NBT, 75 mg/ml) und 35 µl

5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphat (x-Phosphat, 50 mg/ml) in Puffer 3 enthielt, bei RT bis

zur adäquaten Färbung (ca. 2 h bis über Nacht) im Dunkeln inkubiert. Die Reaktion wurde

mit dem Puffer 4 für 10 min bei RT im Dunkeln gestoppt, der Blot mit RNase-freiem Wasser

gewaschen, in Folie verpackt und zur Dokumentation photokopiert. Die Bestimmung der

Größe der Fragmente erfolgte durch Vergleich mit der mit angelegtem Lineal

photographierten Markerspur des Formaldehyd-Agarosegels.

Antigen-ELISA

61

3.7 Antigen-ELISA

Zum Nachweis von Antigen des RHDV in Organhomogenaten, Gallenflüssigkeit und

Zellkulturüberständen wurde ein Antigen-Capture-ELISA verwendet. Zunächst wurden aus

Organproben des Tierversuches 3.16, die in der real-time RT-PCR ein Ergebnis von mehr als

105 Kopien/Reaktion erbrachten, 10 % Homogenate hergestellt. Hierzu wurde das

Organmaterial in einem Verhältnis von 1:10 (w/v) in PBS mittels eines Tissue Lysers

(analog 3.2.2) homogenisiert. Nach 2 h bei RT wurde für 10 min bei 1400 g und 4 °C

zentrifugiert. Die Überstände wurden als 10 % Organhomogenat im Antigen-ELISA

eingesetzt, während Gallenflüssigkeit sowie Zellkulturüberstände direkt verwendet wurden.

Außerdem wurde die Sensitivität des Antigen-ELISAs mit der Sensitivität der

real-time RT-PCR im Rahmen der Validierung verglichen.

Für den Test wurden 100 µl eines polyklonalen anti-RHDV-Hyperimmunserum vom

Meerschweinchen in einer Verdünnung von 1:2000 in Carbonatpuffer (pH 9,6) in die

Vertiefungen einer hochbindenden Mikrotiterplatte (Maxi Sorp™ microtitre plate) gegeben.

Die Adsorption erfolgte über Nacht bei RT. Alle Waschschritte wurden dreimalig mit

PBST (PBS mit Zusatz von 0,05 % Tween) durchgeführt, und als

Antikörperverdünnungspuffer diente PBST mit einem Zusatz von 5 % Pferdeserum. Nach

dem ersten Waschschritt wurden je 100 µl der Probe unverdünnt sowie 1:10 verdünnt in PBS

in je zwei Vertiefungen (Doppelbestimmung) aufgetragen. Ein positives und negatives

Kontrollantigen wurde in gleicher Weise mitgeführt, und es wurde anschließend für 1 h bei

37 °C inkubiert. Die Mikrotiterplatte wurde gewaschen, und 100 µl eines Gemisches aus

3 gegen RHDV gerichteten monoklonalen Antikörpern (mAKs 1G8, 6A12, 10A6) in einer

Verdünnung von 1:500 wurden für 1 h bei 37 °C inkubiert. Nach erneutem Waschen erfolgte

eine Inkubation von 100 µl eines Peroxidase (POD)-konjugierten anti-Maus-IgG in einer

Verdünnung von 1:20000 für 30 min bei 37 °C. Es schloß sich ein letzter Waschschritt an.

Der Nachweis der Bindung geschah über eine Substratinkubation (o-Phenylendiamin, OPD)

mit 100 µl Substratlösung für 15 min lichtgeschützt bei RT, Reaktionsstop mit 50 µl

Schwefelsäure 4 M und Messung der Extinktion bei 492 nm in einem Spectra Mini

Photometer. Die Bewertung erfolgte über den ELISA-index mit einem diagnostischen cut-off

von 0,2.


62

3.8 Antikörper-ELISA

Mit einem indirekten ELISA wurden RHDV-spezifische Antikörper in Seren nachgewiesen.

Als Reaktionsträger wurden mittelgradig bindende Mikrotiterplatten (PS microplate 96 well)

verwendet. Sie wurden mit 100 µl gereinigtem und konzentriertem RHDV-Antigen (Pool aus

S3/98 und S39/00) in einer Verdünnung von 1:4000 in Beschichtungspuffer (pH 7,6) pro

Vertiefung über Nacht bei 4 °C beschichtet. Die Waschschritte erfolgten analog zum

Antigen-ELISA mit PBST, der Antikörperverdünnungspuffer sowie die Substratlösung hatten

die identische Zusammensetzung. 100 µl einer 1:50- sowie einer 1:200-Serumverdünnung

wurden nach einem ersten Waschschritt für 1 h bei 37 °C inkubiert. Alle Proben wurden in

einer Doppelbestimmung untersucht, und es wurden ein positives und ein negatives

Kontrollserum in gleicher Weise mitgeführt. Nach erneutem Waschen erfolgte eine

Inkubation von 100 µl POD-konjugierten anti-Kaninchen-Ig in einer Verdünnung von

1:20000 für 1 h bei 37 °C. Dann wurde die Mikrotiterplatte nochmals gewaschen. Der

Nachweis der Bindung geschah über eine Substratinkubation (OPD) mit 100 µl

Substratlösung für 30 min lichtgeschützt bei 37 °C, Reaktionsstop mit 50 µl Schwefelsäure

4 M und Messung der Extinktion bei 492 nm in einem Spectra Mini Photometer. Die

Bewertung erfolgte über den ELISA-index mit einem diagnostischen cut-off von 0,2.

3.9 Zellen und Zellkulturtechnik

Bei der in dieser Arbeit verwendeten Zellinie RLI-R (engl. rabbit liver immortalized,

Anhang, 9.1.2) handelt es sich um eine immortalisierte Zellinie aus der „Zellbank für

Zellinien in der Veterinärmedizin am Friedrich-Loeffler-Institut“. Die Kultivierung erfolgte

mit dem Zellkulturmedium ZB5 bei 37 °C und 5 % CO2 in 25 cm2-Gewebekulturflaschen. Es

wurden ca. 3 x 106 Zellen in 8 ml Medium eingesät, wobei der Zellrasen nach etwa 3 Tagen

konfluent war. Zur Zellpassage wurde das Medium entfernt, der Zellrasen einmal mit 4 ml

Trypsin (engl. Alfevers Trypsine Versene, ATV) gewaschen, und schließlich wurde mit 1 ml

ATV bei RT bis zum Ablösen der Zellen inkubiert. Die Zellen wurden in 10 ml Medium

aufgenommen und im Verhältnis 1:10 umgesetzt.

Antikörper-ELISA, Zellen und Zellkulturtechnik, Infektion und Transfektion

63

3.10 Infektion und Transfektion

Die Infektion von Zellen wurde durchgeführt, um die in vitro-Replikation des RHDV (3.18)

zu untersuchen. Es wurden ca. 3 x 105 RLI-R-Zellen pro Vertiefung einer

24well-Gewebekulturplatte eingesät. Die Inokulation erfolgte nach 24 h Zellwachstum mit

200 µl eines 10 % Leberhomogenates (Hämagglutinations (HA)-Titer 1:212,

1,321 x 108 Kopien RHDV-RNA/µl Leberhomogenat) von einem Kaninchen, das nach

experimenteller Infektion mit „RHDV Eisenhüttenstadt“ an RHD verstarb. Nach einer

Adsorptionszeit von 2 h wurde das Inokulum entfernt, einmal mit dem Zellkulturmedium ZB5

gewaschen und dann 0,5 ml Medium auf den Zellrasen gegeben und dort belassen.

Die Transfektion wurde einerseits verwendet, um die in vitro-Replikation des RHDV (3.18)

zu untersuchen. Dazu wurden 1,92 x 1011 Kopien RHDV-RNA eingesetzt, die aus der Leber

eines experimentell mit „RHDV Eisenhüttenstadt“ infizierten Kaninchens isoliert wurden.

Andererseits diente die Transfektion dazu, die in vitro-Integrität und -Funktionalität der aus

Organmaterial des Tierversuches 3.16 isolierten RNA zu überprüfen. Hierbei handelte es sich

um konzentrierte RNA (7,47 x 107 Kopien RHDV-RNA) aus der Milz des Tieres Nr. 679. Als

positive Kontrolle diente RNA (1,92 x 1011 Kopien RHDV-RNA), die aus der Leber eines

experimentell mit „RHDV Eisenhüttenstadt“ infizierten Kaninchens isoliert wurde. Als

negative Kontrolle wurde PBS an Stelle von RNA verwendet. Als Transfektionsmethode

wurde die Elektroporation von RLI-R-Zellen gewählt. Die etwa 90 % konfluenten Zellen aus

einer 75 cm2-Gewebekulturflasche (ca. 1 x 107 Zellen) wurden mit ATV abgelöst und dann in

5 ml Zellkulturmedium ZB5 und 5 ml PBS aufgenommen. Sie wurden durch

Zentrifugation (100 g, 7 min, 12 °C) pelletiert, die Überstände wurden abgenommen und die

Pellets in 10 ml PBS resuspendiert. Nach erneuter Zentrifugation wie oben und Abnahme der

Überstände wurden die Zellen in 0,8 ml PBS aufgenommen und in eine

Elektroporationsküvette (4 mm) überführt. Zur Transfektion der Zellen mit der jeweiligen

oben beschriebenen RNA wurde zweimal nacheinander mit 850 V/25 Ω elektroporiert.

Anschließend wurden die Zellen in 16 ml Zellkulturmedium ZB5 aufgenommen. Je 0,5 ml

wurden in die Vertiefungen mehrerer 24well-Gewebekulturplatten gegeben; der Rest wurde in

zwei 25 cm2-Gewebekulturflaschen verteilt.

Ca. 4 h nach der Infektion sowie der Transfektion erfolgte ein Temperaturshift auf 41 °C, und

es wurde für ca. 20 h bei dieser Temperatur kultiviert.


64

3.11 Indirekter Immunfluoreszenztest

Mittels des indirekten Immunfluoreszenztests wurde das Antigen des RHDV an fixierten

Zellkulturen nach Infektion sowie nach Elektroporation nachgewiesen. Die Fixation erfolgte

nach Abnahme der Zellkulturüberstände für 2 h bei 80 °C im Thermocenter. Die Volumina

der für den Test verwendeten Lösungen orientierten sich an der benutzten Gewebekulturplatte

(z. B. 500 µl bei Verwendung einer 24well-Gewebekulturplatte). Nach dem Fixieren wurde

mit PBS rehydriert und mit einem Gemisch aus 4 gegen RHDV gerichteten mAKs (1G8,

3C12, 4D7, 7G3) in einer Verdünnung von 1:20 in PBS für 1 h bei 37 °C inkubiert. Es wurde

zweimal mit PBS gewaschen, und ein Fluoreszeinisothiocyanat (FITC)-konjugiertes

Ziege-anti-Maus-Ig (1:200 in PBS) wurde gleichermaßen inkubiert. Nach erneutem Waschen

wie oben wurde zur Erhaltung der Fluoreszenz Diazobicyclooctan (DABCO)-Puffer mit

Propidiumiodid zugegeben und die Fluoreszenz schließlich mit einem UV-Mikroskop

beurteilt.

3.12 Hämagglutinationstest

Der Hämagglutinationstest diente dem Nachweis des RHDV in Zellkulturüberständen nach

der Infektion und Transfektion. Er wurde in Mikrotiterplatten (U-Form) mit einer

1 % Suspension von Humanerythrozyten der Blutgruppe 0 durchgeführt, welche jeweils frisch

hergestellt wurde. Dazu wurde 1 ml humanes Blut der Blutgruppe 0 mit isotonischem Puffer

(IP; pH 7,2) auf 10 ml aufgefüllt, für 10 min bei 1400 g und 4 °C zentrifugiert und der

Überstand abgenommen. Das Erythrozytensediment wurde erneut wie beschrieben

gewaschen, bis der Überstand klar war. Durch Zugabe eines Volumens IP (pH 7,2) zu einem

Volumen des Erythrozytensedimentes wurde zunächst eine 50 % Suspension von

Humanerythrozyten hergestellt. Diese 50 % Suspension wurde anschließend 1:50 in IP (pH 6)

verdünnt, so daß eine 1 % Suspension von Humanerythrozyten resultierte.

Für den Test wurden die Mikrotiterplatten mit 50 µl IP (pH 6)/Vertiefung beschickt. In zwei

Vertiefungen der ersten Reihe wurden jeweils 50 µl Zellkulturüberstand (Doppelbestimmung)

gegeben, und es wurde eine log2-Verdünnungsreihe (1:21 bis 1:28) hergestellt. Das als positive

Kontrolle mitgeführte Antigen „RHDV Eisenhüttenstadt 73/98 Ethylenimin-inaktiviert,

lyophilisiert 9/02“ wurde bis zu einer Verdünnung von 1:216 ausverdünnt. Ferner enthielt eine

weitere Verdünnungsreihe nur Puffer und die Erythrozytensuspension

Indirekter Immunfluoreszenztest, Hämagglutinationstest, Viruskonzentrierung, Histologie und Immunhistologie

65

(Erythrozytenkontrolle). Nach der Zugabe von 50 µl der 1 % Suspension von

Humanerythrozyten wurde durch seitliches Antippen der Platte gemischt und dann für

ca. 1 - 1,5 h bei 4 °C inkubiert. Die Ablesung der schräg gehaltenen Platte erfolgte, wenn die

Erythrozytenkontrolle vollständig sedimentiert war und die positive Kontrolle eine deutliche

Hämagglutination zeigte.

3.13 Viruskonzentrierung

Eine Viruskonzentrierung wurde mit der Leber eines Tieres aus dem Tierversuch 3.16

durchgeführt, um die Infektiosität oder Antigenität des konzentrierten Materials in einem

Übertragungsversuch zu überprüfen.

Aus der grob zerkleinerten Leber (73,1 g) wurde mittels eines Mörsers und eines Pistills ein

10 % Leberhomogenat (w/v) in IP (pH 7,2) hergestellt und über Nacht bei 4 °C stehen

gelassen. Danach wurde für 30 min bei 5000 rpm (Rotor JA 14, J2-HS Centrifuge, Beckman)

und 4 °C zentrifugiert, der Überstand abgenommen und für 30 min mit 15 % Chloroform

ausgeschüttelt. Nach erneuter Zentrifugation wie oben beschrieben wurde der Überstand zur

Präzipitation bei 4 °C über Nacht mit 10 % Polyethylenglykol 6000 verrührt. Es folgte eine

Zentrifugation für 50 min bei 5000 rpm (Rotor JA 14, J2-HS Centrifuge, Beckman) und 4 °C,

nach der das resultierende Sediment über Nacht bei 4 °C in 60 ml

TEN (Tris-EDTA-Natriumchlorid, pH 7,6) resuspendiert wurde. Anschließend wurde 2 h

durch ein 17 % Saccharosekissen bei 25000 rpm (Rotor SW 28.1, Coulter Optima™ LE-80K

Ultracentrifuge, Beckman) und 4 °C zentrifugiert. Das Pellet wurde über Nacht bei 4 °C in

6 ml TEN (pH 7,6) resuspendiert.

3.14 Histologie und Immunhistologie

Mittels Histologie und HE (Haematoxylin und Eosin)-Färbung sowie Immunhistologie

wurden Organe von Kaninchen des Tierversuches 3.16 im Labor von

Prof. Dr. med. vet. J. P. Teifke untersucht.

Für die histologische Untersuchung wurden aus dem Paraffin-eingebetteten Organmaterial

3 µm dicke Gewebeschnitte hergestellt, auf positiv geladene Objektträger übertragen und mit

Haematoxylin und Eosin gefärbt.

Für die Immunhistologie zum Nachweis des RHDV-Antigens wurden 5 µm dicke

Gewebeschnitte entparaffiniert und anschließend mit A. bidest und


66

TBS (engl. tris buffered saline, Tris-gepufferte Salzlösung) gewaschen. Der mAK 1G8, der

sich gegen das Kapsidprotein des RHDV richtet, wurde für 30 min bei RT (1:50 in TBS)

inkubiert. Danach wurden ein biotinyliertes Ziege-anti-Maus-IgG (1:200 in TBS) und der

POD-konjugierte Avidin-Biotin-Komplex (1:10 in TBS) je 30 min inkubiert. Als Chromogen

wurde AEC (3-Amino-9-Ethylcarbazol)-Substrat verwendet. Nach dem Waschen mit

A. bidest wurde mit Mayer´s Haematoxylin gegengefärbt und mit Aquatex® eingebettet. Als

positive Kontrolle wurde ein Gewebeschnitt einer Leber eines Kaninchens, das an akuter

RHD verstorben ist, mitgeführt.

3.15 In situ-Hybridisierung

Die In situ-Hybridisierung mit DIG-markierten RNA-Sonden (ZURBRIGGEN et al. 1998)

wurde angewendet, um RHDV-RNA an Gewebeschnitten von Lebern aus dem Tierversuch

3.16 nachzuweisen.

Alle Schritte - mit Ausnahme der Hybridisierung und der Inkubation des AP-Konjugats, die

direkt auf den Objektträgern durchgeführt wurden - erfolgten in Glasküvetten. Als positive

Kontrolle wurde ein Gewebeschnitt einer Leber eines Kaninchens, das an akuter RHD

verstorben ist, mitgeführt.

Zunächst wurden 2 µm dicke Gewebeschnitte mittels einer absteigenden Alkoholreihe

(3 x 5 min Xylol, 5 min 100 % Ethanol, 5 min 95 % Ethanol, 5 min 70 % Ethanol, 5 min

RNase-freies Wasser, 3 x 5 min PBS) bei RT entparaffiniert. Danach folgte die

Denaturierung, wozu die Gewebeschnitte für 20 min bei RT in HCl 0,2 M und danach 2 x für

1 min bei RT in 2 x SSC gegeben wurden. Die Permeabilisierung der Zellen erfolgte durch

Verdau mit 50 µg/ml Proteinase K für 15 min bei 37 °C in Proteinase K-Puffer. Dann wurden

die Gewebeschnitte zur Fixierung für 5 min bei RT in 4 % Paraformaldehyd gegeben und

daraufhin 2 x für 1 min bei RT in 2 x SSC gewaschen. Die Acetylierung erfolgte mit einer

frisch angesetzten Lösung von Acetanhydrid in Triethanolamin für 10 min bei RT. Danach

wurden die Gewebeschnitte 2 x für 1 min bei RT in 2 x SSC gegeben. Anschließend wurde

für 2 h bei 50 °C mit der Vorhybridisierungslösung (48,7 ml Prähybridisationsmix, 1,3 ml

RNA aus Kälberleber (10 mg/ml), ergibt 260 µg/ml RNA aus Kälberleber) prähybridisiert.

Die Hybridisierung mit jeweils ca. 2 ng/µl der sequenzspezifischen T7-Sonde

(antisense-Sonde, Gebrauchsverdünnung 1:100) und SP6-Sonde (sense-Sonde, 1:400), jeweils

im Hybridisationsmix (1 ml Prähybridisationsmix, 123 µl Dextransulfat 100 %, 61 µl

In situ-Hybridisierung, Untersuchungen zur Viruspersistenz in rekonvaleszenten Tieren

67

RNA aus Kälberleber (10 mg/ml), ergibt 500 µg/ml RNA aus Kälberleber), erfolgte über

Nacht bei 50 °C in einer feuchten Kammer. Die überschüssige Sonde wurde am nächsten Tag

durch zweimaliges Waschen für 30 min mit 2 x SSC bei RT und anschließende

RNase-Behandlung (30 min bei 37 °C) mit je 10 µl DNase-freier RNase (500 µg/ml) und

RNase T1 aus Aspergillus oryzae (500000 U/ml) in 50 ml Lösung zur RNase-Behandlung

entfernt. Danach wurde bei 55 °C 2 x für 10 min mit 2 x SSC und 2 x für 10 min mit

0,2 x SSC gewaschen. Für die Färbung wurde zunächst für 30 min bei RT mit der

blocking solution geblockt. Dann wurde ein AP-konjugiertes anti-DIG-Fab-Fragment

(1:500 in blocking solution) für 2 h bei RT inkubiert und danach 2 x für 10 min bei RT mit

Maleinpuffer/0,2 % Tween 20 gewaschen. Es schlossen sich weitere Waschschritte, nämlich

2 x 10 min mit Maleinpuffer und 1 x 2 min mit Puffer 3, bei RT an. Schließlich wurde mit

50 ml der Färbelösung, die 225 µl NBT (75 mg/ml), 175 µl x-Phosphat (50 mg/ml) und

1 mM Levamisol in Puffer 3 enthielt, bei RT bis zur adäquaten Färbung (ca. 2 h bis über

Nacht) im Dunkeln inkubiert. Dann wurde die Reaktion mit dem Puffer 4 für 10 min bei RT

gestoppt. Die Gewebeschnitte wurden in kaltes Wasser gegeben, mit Haematoxylin für

ca. 30 s gegengefärbt und mit Glycergel® eingebettet.

3.16 Untersuchungen zur Viruspersistenz in rekonvaleszenten Tieren6

Das Ziel dieses Versuches war es, die Persistenz und Ausscheidung von RHDV in

rekonvaleszenten Kaninchen zu untersuchen. Im Rahmen der Impfstoffproduktion bei der

Riemser Arzneimittel AG wurden 70 seronegative „Zimmermann“-Kaninchen in einem Alter

von 14 Wochen und älter experimentell mit 2 ml „RHDV Eisenhüttenstadt“ i.m. infiziert.

Dort wurde bis zum Tag 11 p.i. täglich die Körpertemperatur der Tiere bestimmt. Die

Mehrzahl der Kaninchen verstarb innerhalb der ersten zwei Tage p.i. an einer akuten RHD.

Ein Tier verendete am Tag 5, zwei weitere am Tag 6 p.i. an einer subakuten Form der

Erkrankung, und drei Kaninchen wurden am Tag 12 p.i. moribund getötet.

Fünf der infizierten Tiere (Nr. 670, 685, 679, 697 und 718) überlebten bis zum Tag 12 p.i.

und wurden für den im Folgenden beschriebenen Tierversuch am FLI verwendet, um sie auf

einen carrier-Status zu untersuchen. Sie wurden ab diesem Zeitpunkt mit drei serologisch

6 Die Genehmigung für die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Tierversuche wurde am 20. August 2003 vom Landesveterinär- und Lebensmitteluntersuchungsamt Mecklenburg-Vorpommern unter dem Aktenzeichen LVL-MV/310-4/7221.3-1.1-031/03 erteilt.


68

negativen Kontrolltieren (Nr. 1, 2 und 3) derselben Herkunft zusammengehalten. Alle acht

Versuchstiere wurden regelmäßig klinisch in Bezug auf RHD kontrolliert, und es erfolgten

Blutentnahmen aus der Vena auricularis. Ab dem Zeitpunkt von 4 Wochen p.i. wurde von

allen Tieren wöchentlich EDTA-Blut für die RNA-Isolierung aus Leukozyten und

nachfolgende real-time RT-PCR entnommen. Für den Antikörper-ELISA und die

real-time RT-PCR wurde zum Zeitpunkt von 5 Wochen p.i. von allen Tieren Serum

gewonnen, danach wöchentlich von den nicht infizierten Kontrolltieren für den

Antikörper-ELISA. Das Blut für die Gewinnung von Seren wurde in Microtainer-Röhrchen

gewonnen, die dann 30 min bei RT stehen gelassen wurden. Die Trennung von Serum und

zellulären Bestandteilen erfolgte durch eine Zentrifugation (3 min, 11000 g, 4 °C).

Anschließend wurde das Serum abgenommen und durch eine Inkubation für 30 min bei 56 °C

inaktiviert. Die Seren wurden bei - 30 °C gelagert, während EDTA-Blut umgehend für die

RNA-Isolierung aus Leukozyten verwendet wurde.

Die infizierten Kaninchen wurden nach 5 (Nr. 670 und 685), 7 (Nr. 679 und 697) und

15 Wochen (Nr. 718) getötet und die nicht infizierten Kontrolltiere nach 9 (Nr. 1 und 2) sowie

15 Wochen (Nr. 3). Es wurde eine Sektion durchgeführt, bei der Proben von diversen

Organen - Milz, Knochenmark, Leber, mesenteriale und mandibuläre Lymphknoten, Niere,

Lunge, Aorta, Herz, Ileum, Caecum, Tonsille, Thymus und Nasenschleimhaut - sowie

Gallenflüssigkeit, Faeces und Urin jeweils mit Einmalbesteck bzw. Kanüle und Spritze

entnommen wurden. Alle Proben wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und

anschließend bei - 70 °C gelagert, bis sie mittels Antigen-ELISA und real-time RT-PCR

untersucht wurden. Ferner wurden Stücke von Milz, Leber, Lymphknoten und Niere für die

histologische und immunhistologische Untersuchung, sowie Stücke der Leber für die

In situ-Hybridisierung, in 4 % Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet.

Mit der Leber (73,1 g) des Tieres Nr. 679 wurde eine Viruskonzentrierung durchgeführt, um

die Infektiosität oder Antigenität der nachgewiesenen viralen RNA zu überprüfen. Das daraus

erhaltene Material wurde zur i.m. Inokulation eines empfänglichen

„Zimmermann“-Kaninchens (Nr. 14) im Alter von 19 Wochen verwendet. Das Tier wurde

täglich klinisch untersucht. Serum für den Antikörper-ELISA wurde sowohl vor der

Inokulation als auch zum Zeitpunkt der Tötung des Tieres (5 Wochen p.i.) gewonnen.

Außerdem wurde das zur Inokulation verwendete konzentrierte Material mittels

Untersuchungen zum carrier-Status von immunisierten Tieren nach challenge-Infektion

69

Antigen-ELISA und im Labor von Dr. rer. nat. habil. H. Granzow mittels

Elektronenmikroskopie untersucht.

Aus der Milz (0,9 g) desselben Tieres wurde RNA isoliert, konzentriert und für die

Transfektion von RLI-R-Zellen verwendet. Nach 24 und 48 h wurde auf eine mögliche

Replikation des RHDV mittels des indirekten Immunfluoreszenztestes und des

Antigen-ELISAs getestet, um so die in vitro-Integrität und -Funktionalität der

nachgewiesenen viralen RNA zu überprüfen.

Aus 1 g Leber des Tieres Nr. 685 wurde RNA isoliert, konzentriert und im Northern Blot

eingesetzt, um die Integrität der nachgewiesenen viralen RNA zu überprüfen.


challenge-Infektion7

Dieser Versuch hatte das Ziel, festzustellen, ob bei immunisierten Kaninchen nach der

challenge-Infektion, d.h. einer Belastungsinfektion mit RHDV, persistierendes Virus bzw.

Virusgenom detektiert werden kann, die Tiere also einen sog. carrier-Status aufweisen.

Außerdem sollte untersucht werden, ob der Antikörper-Status des Tieres einen Einfluß auf

diesen carrier-Status, d.h. sein Auftreten oder die nachweisbaren Virusgenomlasten, hat.

Dazu wurden 8 Kaninchen einer Immunisierungsstudie verwendet, von denen je 4 den

kommerziell erhältlichen Impfstoff RIKA-VACC (Nr. 17, 18, 19, 20) bzw. eine rekombinante

Bakulovirusvakzine in einer 1:64-Verdünnung in A. bidest (Nr. 13, 14, 15, 16) i.m. erhalten

hatten. An den Tagen 0, 10, 15, 20 und 28 p.v. wurde Serum für den Antikörper-ELISA

gewonnen (analog 3.16). Die challenge-Infektion erfolgte i.m. am Tag 28 p.v. mit 1 ml

„RHDV Eisenhüttenstadt, S30/05, 15 % CHCl3, lyophilisiert 09.02.05“. Um das Auftreten

eines carrier-Status zu untersuchen, wurde zum Zeitpunkt von 9, 11, 13 und 15 Wochen nach

der challenge-Infektion je ein Tier pro Gruppe getötet. Es wurden Proben von Milz,

Knochenmark, Leber, mesenterialen Lymphknoten und Gallenflüssigkeit genommen und

mittels real-time RT-PCR untersucht (analog 3.16).

7 Die Genehmigung für die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Tierversuche wurde am 20. August 2003 vom Landesveterinär- und Lebensmitteluntersuchungsamt Mecklenburg-Vorpommern unter dem Aktenzeichen LVL-MV/310-4/7221.3-1.1-031/03 erteilt.


70

3.18 Untersuchungen zur in vitro-Replikation nach Infektion und Transfektion

Bei dieser Untersuchung sollte die in vitro-Replikation des RHDV analysiert werden, um

mögliche Ursachen für dessen fehlende produktive Vermehrung in Zellkulturen zu ermitteln.

Die Infektion und Transfektion wurden durchgeführt wie unter 3.10 beschrieben, wobei die

Zellinie RLI-R (3.9) verwendet wurde.

Zum Zeitpunkt von 2, 24, 48 und 72 h nach der Transfektion bzw. Inokulation wurden die

Zellkulturüberstände abgenommen und bis zur Testung mittels Hämagglutinationstest,

Antigen-ELISA und real-time RT-PCR bei - 70 °C gelagert. Die Zellen einer Vertiefung

wurden jeweils für den indirekten Immunfluoreszenztest verwendet. Aus einer zweiten

Vertiefung wurden sie mittels ATV abgelöst und in Medium resuspendiert. Nach der

Bestimmung der Zellzahl mit einer Neubauer-Zählkammer wurden sie

pelletiert (150 g, 5 min), in 600 µl Puffer RLT aufgenommen und so bei - 70 °C gelagert bis

zur Isolierung der RNA und nachfolgender real-time RT-PCR.

Etablierung einer multiplex real-time RT-PCR für RHDV

71

4 ERGEBNISSE

4.1 Etablierung einer multiplex real-time RT-PCR für RHDV

4.1.1 Primer- und Sondendesign

Für die RHDV-spezifische real-time RT-PCR wurde eine Consensus-Sequenz basierend auf

einem Alignment von 27 VP60-Gensequenzen abgeleitet (Abbildung 9). Bei der Auswahl der

Primer und der Sonde wurde eine fehlerhafte Basenpaarung pro Position innerhalb dieser

27 Sequenzen toleriert. War mehr als eine fehlerhafte Basenpaarung vorhanden, wurde ein so

genanntes „wobble“-Nukleotid an die entsprechende Position gesetzt, d.h. die Synthese der

Oligonukleotide erfolgte mit einem Gemisch aus mehreren Nukleotiden an dieser Position.

Die Primer vp60-7_for und vp60-8_rev, die ein 104 bp großes Fragment amplifizieren, und

eine TaqMan®-Sonde wurden in der hochkonservierten Region F des VP60 ausgewählt

(NEILL 1992). Die verwendete TaqMan®-Sonde vp60-9_fam ist am 5´-Ende mit dem

Reporterfarbstoff FAM (6-Carboxyfluorescein) und am 3´-Ende mit dem Quencher

TAMRA (Tetramethyl-6-Carboxyrhodamin) markiert. Mittels der Software BLASTn wurde

die Möglichkeit einer Hybridisierung der ausgewählten Oligonukleotide mit in Datenbanken

niedergelegten Gensequenzen überprüft. Dabei ergaben sich keine Hinweise auf andere

Organismen oder mRNAs, die mit den verwendeten Oligonukleotiden detektiert werden, so

daß diese als spezifisch für RHDV angesehen werden konnten.

Um die Effizienz der RNA-Isolierung und der RT-PCR in jeder einzelnen Probe überprüfen

zu können, wurde eine IC-spezifische real-time RT-PCR als heterologes System in dem

multiplex assay integriert (HOFFMANN et al. 2005). Hier wurde das Primerpaar

EGFP-12-F/EGFP-10-R und die TaqMan®-Sonde EGFP-HEX verwendet, die mit dem

Reporterfarbstoff HEX (Hexachloro-6-carboxyfluorescein) am 5´-Ende und

BHQ1 (black hole quencher 1), einem nicht-fluoreszierenden Quencher, am 3´-Ende

modifiziert ist. Es wird ein 374 bp großes Fragment der IC amplifiziert und detektiert. Alle

verwendeten Oligonukleotide sind in der Tabelle 6 (Anhang, 9.1.4) aufgeführt.

ERGEBNISSE

72

1 70 x87607 ---------- ---------- --t------- ---------- ---------- ---------- ---------- y15424 ---------- ---------- --t------- ---------- ---------- ---------- ---------- aj006019 ---------- ---------- --t------- ---------- ---------- ---------- ---------- y15441 -----g---- ---------- --t------- ---------- ---------- ---------- ---------- af231353 --c------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- m67473 --c------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- nc001543 --c------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- af402614 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- u54983 --c------- ---t------ ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- u49726 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- af295785 ---------- ---------- ---------- ---------- ------t--- -----g---- ---------- af258618 ---------- ---------- --------c- ---------- ---------g ---------- ---------- af453761 ---------- ---------- --------c- ---------- ---------g ---------- ---------- aj302016 ---------- ---------- --------c- ---------- ---------g ---------- ---------- aj303106 ---------- ---------- --------c- ---------- ---------g ---------- ---------- ay269825 ---------- ---------- --------c- ---------- ---------g ---------- ---------- ay523410 ---------- ---------- --------c- ---------- ---------g ---------- ---------- y15442 ---------- ---------- --------c- ---------- ---------- ---------- ---------- z49271 ---------- ---------- ---------- ---------- ---a-----g ---------- ---------- y15440 ---------- ---------- ---------- ---------- ---a-----g ---------- ---------- l48547 ---------- ---------- ---------- ---------- ---a-----g ---------- ---------- z29514 ------t--- ---------- ---------- ---------- ---a-----g ---------- ---------- aj319594 ---------- ---------- --t------- ---------- ---a-----g ---------- ---------- y15427 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------g ---------- ---------- aj495856 ---------- ---------- --c------- ---------- ---a------ ---------- ---------- y15426 ---------- ---t------ --t------- ---------- ---------- ---------- ------g--- y15425 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -----g---- ---------- Consensus ACTTGACTGA ACTCATTGAC GTACGCCCTG TGGGACCCAG GCCGTCCAAA AGCACACTCG TGTTCAACCT primer/probe ACYTGACTGA ACTYATTGAC G CCAAR AGCACRCTCG TGTTCAACCT vp60-7_for vp60-9_fam 71 104 x87607 ---------- ---------- ---------- ---- y15424 ---------- ---------- ---------- ---- aj006019 ---------- ---------- -c-------- ---- y15441 ---------- ---------- ---------- ---- af231353 ---------- ---------- ---------- ---- m67473 ---------- ---------- ---------- ---- nc001543 ---------- ---------- ---------- ---- af402614 ---------- ---------- ---------- ---- u54983 ---------- ---------- ---------- ---- u49726 ------a--- ---------- ---------- ---- af295785 ---------- ---------- ---------- ---- af258618 ---------- a--------- ---------- ---- af453761 ---------- a--------- ---------- ---- aj302016 ---------- a--------- ---------- ---- aj303106 ---------- ---------- ---------- ---- ay269825 ---------- ---------- ---------- ---- ay523410 -------g-- a--------- ---------- ---- y15442 ---------- ---------- ---------- ---- z49271 ---------- ---------- ---------- ---- y15440 ---------- ---------- ---------- ---- l48547 c--------- ---------- ---------- ---- z29514 ---------- ---------- ---------- ---- aj319594 -------g-- ---------- ---------- ---- y15427 ----a--g-- ---------- ---------- ---- aj495856 -------g-- --------t- ---------- ---- y15426 ---------- a--------- ---------- ---- y15425 ------tgt- --t------- ---------- ---- Consensus GGGGGGCACA GCCAATGGCT TTTCTTATGT CTGA primer/probe GGTTACCGA AAAGAATACA GACT vp60-8_rev

Abbildung 9: Alignment und Consensus-Sequenz von 27 RHDV VP60-Gensequenzen in der Primer/Sonden-Region. Der „single letter code of nucleotides“ wurde verwendet. Die grauen Kästen repräsentieren die von den Primern bzw. der Sonde umfassten Regionen. Striche stehen für identische Nukleotide, während „wobble“-Nukleotide in Fettschrift hervorgehoben sind.


73

4.1.2 Optimierung der Reaktionsbedingungen

Zur Optimierung wurde eine log10-Verdünnungsreihe von RNA (in RNA safe buffer) aus der

Leber eines Kaninchens, das experimentell mit „RHDV Eisenhüttenstadt“ infiziert worden

war, als template verwendet. Es wurde sowohl die Konzentration der Sonde vp60-9_fam

(1,25, 2,5 und 3,75 pmol pro Reaktionsansatz) als auch der Magnesiumionen (1,6, 1,7 und

1,8 mM im Reaktionsansatz) titriert, um so frühe Ct-Werte in Kombination mit maximalen

Fluoreszenzwerten zu erhalten. Dabei erwiesen sich 2,5 pmol vp60-9_fam und 1,6 mM

Magnesiumionen pro Reaktionsansatz als am günstigsten. Ferner wurden die frühesten

Ct-Werte bei einer empirisch ermittelten Konzentration der RHDV-spezifischen Primer von

20 pmol pro Reaktionsansatz erreicht. Der Referenzfarbstoff ROX wurde in einer solchen

Menge eingesetzt, daß Fluroreszenzwerte R von ca. 20000 - 30000 erreicht wurden.

Außerdem wurden Änderungen im Temperaturprofil vorgenommen, wobei sich eine

Annealing-Temperatur von 55 °C als optimal herausstellte. Für den multiplex assay wurden

die Zeiten für die Annealing- sowie die Elongationsphase von je 30 s auf 45 s verlängert. Die

IC-spezifischen Primer wurden hier nur in einer limitierten Konzentration von 5 pmol pro

Reaktionsansatz eingesetzt. Die optimierten Reaktionsansätze und Temperaturprofile für

single und multiplex assay sind 3.4.2 zu entnehmen.

4.1.3 Herstellung einer positiven Kontrolle und externer RNA-Standards

Durch eine RT-PCR mit dem Primerpaar vp60-7_for/vp60-8_rev wurde ein 104 bp großes

Fragment des VP60 des „RHDV Eisenhüttenstadt“ amplifiziert, das dann in den Vektor

pGEM®-TEasy kloniert wurde. Mittels Sequenzierung wurde festgestellt, daß das insert in

forward-Orientierung eingebaut war, so daß das resultierende Plasmid die Bezeichnung

„pGEM-VP60_p7-8for“ erhielt. Aufgrund der forward-Orientierung wurde die

in vitro-Transkription mit der T7 RNA Polymerase durchgeführt. Nach DNase-Verdau wurde

mittels real-time PCR festgestellt, daß der Transkriptase-Ansatz eine zu vernachlässigende

Menge an DNA enthielt, nämlich ca. 106 mal weniger als RNA. Nach spektrophotometrischer

Messung der RNA-Konzentration des 224 nt großen Transkriptes wurde eine Anzahl von

9,88 x 1010 Molekülen/µl berechnet und die in vitro-transkribierte RNA schließlich als

positive Kontrolle (PC RNA) eingesetzt.

ERGEBNISSE

74

Ferner wurden RNA-Standards hergestellt, indem die Anzahl der Moleküle in der PC durch

Verdünnung in RNA safe buffer auf 2 x 109 Moleküle/µl eingestellt wurde. Davon ausgehend

wurde eine log10-Verdünnungsreihe bis zu 2 x 100 Molekülen/µl im gleichen Puffer

hergestellt. Je 5 µl der einzelnen Verdünnungsstufen (mit 1010 bis 101 Molekülen PC RNA)

wurden als template in der real-time RT-PCR eingesetzt und dienten so als externe Standards

zur absoluten Quantifizierung unbekannter Mengen viraler RNA.

4.1.4 Sensitivität

4.1.4.1 Analytische Sensitivität

Durch Verwendung von RNA-Standards mit 1010 bis 101 Molekülen PC RNA wurde eine

analytische Sensitivität von 10 Kopien PC RNA/Reaktion bestimmt, wobei der assay

Linearität über einen dynamischen Bereich von 10 log10-Stufen zeigte. Dabei wurde eine

PCR-Effizienz von 100 % nachgewiesen, die sich auch in einer Steigung der Standardkurve

von -3,322 widerspiegelte. Der Korrelationskoeffizient RSq betrug 1 (Abbildung 10).

4.1.4.2 Sensitivität des single und multiplex real-time RT-PCR assays

Nachdem ein optimierter single real-time RT-PCR assay (Amplifizierung von RHDV-RNA)

entwickelt wurde, wurde ein multiplex assay (Koamplifizierung von RHDV-RNA und IC)

etabliert und dann die Sensitivität beider Protokolle verglichen. Zunächst konnte anhand der

Amplifizierung einer log10-Verdünnungsreihe der PC RNA eine identische analytische

Sensitivität von 10 Kopien PC RNA/Reaktion für beide assays bestimmt werden.

Daraufhin wurde eine log10-Verdünnungsreihe von RNA (in RNA safe buffer) aus Leber eines

Kaninchens, das experimentell mit „RHDV Eisenhüttenstadt“ infiziert worden war, mit und

ohne Koamplifizierung der IC amplifiziert.


75

Abbildung 10: Analytische Sensitivität und dynamischer Bereich der real-time RT-PCR für RHDV. Die Amplifikationsgraphen (a) und die Standardkurve (b), die nach Amplifizierung einer log10-Verdünnungsreihe von 1010 bis 101 Molekülen PC RNA erhalten wurden, sind dargestellt.

(b)

(a)

ERGEBNISSE

76

Abbildung 11: Sensitivität des single und multiplex real-time RT-PCR assays. (a) zeigt die Amplifikationsgraphen für FAM, die durch die Amplifizierung der RHDV-RNA zustande kommen. (b) stellt die Amplifikationsgraphen für HEX dar, die die Amplifizierung der IC repräsentieren. Schwarze Linien stehen jeweils für den multiplex assay und graue Linien für den single assay. Es wurde eine log10-Verdünnungsreihe von RHDV-RNA mit den Verdünnungsstufen von 10-5 bis 10-10 als template eingesetzt.

(a)

(b)


77

Die Amplifikationsgraphen für FAM im multiplex assay (schwarz) - mit Koamplifizierung

der IC - und im single assay (grau) - ohne Koamplifizierung der IC - sind in der Abbildung

11a dargestellt. Es wurden ähnliche Ct-Werte für die jeweiligen Verdünnungen erhalten, und

ein identisches Detektionslimit für den single und den multiplex assay wurde nachgewiesen.

Abbildung 11b zeigt die Amplifikationsgraphen für HEX, die die Koamplifizierung der IC

repräsentieren. HEX-Fluoreszenzsignale wurden ausschließlich bei

real-time RT-PCR-Reaktionen mit Koamplifizierung der IC beobachtet. Bei allen Reaktionen

mit Koamplifizierung der IC wurden HEX-Fluoreszenzsignale mit Ct-Werten von ca. 26

detektiert. Dennoch zeigte sich bei großen Mengen viraler RNA eine kompetitive Inhibition

der Amplifizierung der IC.

4.1.4.3 Sensitivität im Vergleich zur konventionellen RT-PCR

Die Sensitivität der real-time RT-PCR wurde mit der Sensitivität der am FLI etablierten

konventionellen RT-PCR verglichen. Dazu wurde eine log10-Verdünnungsreihe

(in RNA safe buffer) von RNA aus der Leber eines Kaninchens, das experimentell mit

„RHDV Eisenhüttenstadt“ infiziert worden war, mittels beider Methoden

(konventionelle RT-PCR mit 30 Zyklen, entsprechend dem am FLI etablierten Protokoll)

amplifiziert. In einem zweiten Ansatz wurde die Anzahl der Zyklen für die konventionelle

RT-PCR auf 40 erhöht, um eine Vergleichbarkeit mit den Reaktionsbedingungen der

real-time RT-PCR zu erhalten. Ferner wurde dabei auch eine log10-Verdünnungsreihe von

RNA des Subtypes „RHDV Triptis“ eingesetzt.

Die Abbildung 12 zeigt die Ergebnisse in Form der Amplifikationsgrafiken für die

real-time RT-PCR bzw. der Bilder der Agarosegele für die konventionelle RT-PCR. Es wurde

virale RNA des Subtypes „RHDV Eisenhüttenstadt“ (a) bis zu einer Verdünnung von 10-10

mittels real-time RT-PCR detektiert. Die konventionelle RT-PCR mit 30 Zyklen konnte

„RHDV Eisenhüttenstadt“ nur bis zur Verdünnung von 10-5 nachweisen. Nachdem die Zahl

der Zyklen auf 40 erhöht wurde, konnte die Verdünnung von 10-10 detektiert werden, doch ab

10-8 zeigte sich eine schlechte Reproduzierbarkeit der Banden. Beim Subtyp

„RHDV Triptis“ (b) konnte mittels real-time RT-PCR die Verdünnung von 10-11 und mittels

konventioneller RT-PCR die Verdünnung von 10-10 detektiert werden. Somit wurde

nachgewiesen, daß die real-time RT-PCR mindestens eine log10-Stufe sensitiver ist als die

konventionelle RT-PCR.

ERGEBNISSE

78

Abbildung 12: Sensitivität der real-time RT-PCR im Vergleich zur konventionellen RT-PCR. (a) zeigt die Ergebnisse für den Subtyp „RHDV Eisenhüttenstadt“ und (b) für „RHDV Triptis“. Für die konventionelle RT-PCR wurde eine log10-Verdünnungsreihe ausgehend von unverdünnter RNA als template eingesetzt, während für die real-time RT-PCR nur die Verdünnungsstufen ab 10-5 verwendet wurden. Zunächst wurde die konventionelle RT-PCR mit 30 Zyklen durchgeführt (nur für „RHDV Eisenhüttenstadt“, linkes Agarosegel in (a)). In einem zweiten Ansatz wurde die Anzahl der Zyklen auf 40 erhöht und RNA beider Subtypen verwendet.

10-5 10-10

10-5 10-11

10-11

10-10

10-9

10-8

10-7

10-6

10-5

10-4

10-3

10-2

10-1

unverd. M

10-11

10-10

10-9

10-8

10-7

10-6

10-5

10-4

10-3

10-2

10-1

unverd. M

10-11

10-10

10-9

10-8

10-7

10-6

10-5

10-4

10-3

10-2

10-1

unverd. M

(a)

(b)


79

4.1.4.4 Sensitivität im Vergleich zum Antigen-ELISA

Für den Vergleich der Sensitivität von real-time RT-PCR und Antigen-ELISA wurde eine

log4-Verdünnungsreihe (in PBS) ausgehend von 10% Leberhomogenaten von Kaninchen, die

experimentell mit „RHDV Eisenhüttenstadt“ und „RHDV Triptis“ infiziert worden waren,

hergestellt. 100 µl der einzelnen Verdünnungsstufen wurden zum einen im Antigen-ELISA

eingesetzt und zum anderen für die RNA-Isolierung mit nachfolgender

multiplex real-time RT-PCR verwendet.

Die Ergebnisse für „RHDV Eisenhüttenstadt“ und „RHDV Triptis“ sind in der Abbildung 13a

und b dargestellt. Bei beiden Subtypen entsprechen positive ELISA-Ergebnisse - bei einem

cut-off von 0,2 - ca. 107 Kopien/Reaktion.

4.1.5 Spezifität

Für Spezifitätstests wurde aus 13 verschiedenen RHDV-Stämmen extrahierte RNA als

template in der real-time RT-PCR eingesetzt. Alle Stämme wurden mit Ct-Werten zwischen

9 und 18 erkannt. Die verwendeten RHDV-Stämme stammen aus den Jahren 1989 bis 2004

und decken beide Subtypen ab. Nicht detektiert wurden die anderen getesteten Caliciviren

(zwei EBHSV-Stämme und ein FCV) sowie das Myxomatosevirus (Tabelle 4).

Ferner wurde keine FAM-Fluoreszenz oberhalb des Fluoreszenzschwellenwertes beobachtet,

als RNA aus diversen Organen zweier negativer Kaninchen und aus der Leber eines Hasen als

template eingesetzt wurde.

ERGEBNISSE

80

(a)

1,00E+00

1,00E+01

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

1,00E+09

1,00E+10

conc 1:4 1:16 1:64 1:256 1:1024 1:4096Verdünnung

Kop

ien/

Rea

ktio

n

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

ELI

SA

-inde

x

real-time RT-PCRAg-ELISA

(b)

1,00E+00

1,00E+01

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

1,00E+09

1,00E+10

conc 1:4 1:16 1:64 1:256 1:1024 1:4096Verdünnung

Kop

ien/

Rea

ktio

n

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

ELI

SA

-inde

x

real-time RT-PCRAg-ELISA

Abbildung 13: Sensitivität der real-time RT-PCR im Vergleich zum Antigen-ELISA. (a) zeigt die Ergebnisse für den Subtyp „RHDV Eisenhüttenstadt“ und (b) für „RHDV Triptis“. Die Balken stellen die in der real-time RT-PCR erhaltenen Ergebnisse in Kopien/Reaktion dar. Die schwarze Linie repräsentiert die Titration im Antigen-ELISA, wobei die für die einzelnen Verdünnungsstufen erhaltenen ELISA-indices als Punkte dargestellt sind. Die Achsen für die ELISA-indices unterscheiden sich, da „RHDV Triptis“ nur mit einem der 3 zur Detektion verwendeten mAKs reagiert, so daß die ELISA-indices insgesamt geringer ausfallen. Es wurde eine log4-Verdünnungsreihe ausgehend von 10 % Leberhomogenaten resp. die daraus extrahierte RNA verwendet.

Untersuchungen zur Viruspersistenz in rekonvaleszenten Tieren

81

Virusisolat Jahr der Isolierung Real-time RT-PCR RHDV Eisenhüttenstadt 1989 + Hagenow 1990 + Wriezen 1996 + Triptis 1996 + Frankfurt 1996 + Hartmannsdorf 1996 + Wika 1996 + Bala 1998 + Dachswald 2000 + Erfurt 2000 + Rossi 2002 + S 59/04 2004 + S 60/04 2004 + EBHSV D 60/96 1996 - D 70/96 1996 - FCV 1975 - Myxomatosevirus 1998 -

Tabelle 4: Spezifität der real-time RT-PCR.

4.2 Untersuchungen zur Viruspersistenz in rekonvaleszenten Tieren

4.2.1 Klinik und Pathologie

Von den ursprünglich 70 infizierten Kaninchen wurden 3 moribund getötet und 5 haben

überlebt; das entspricht einer Letalität von 89 %. Alle mit RHDV infizierten und für diesen

Versuch verwendeten Kaninchen (Nr. 670, 685, 679, 697 und 718) zeigten zwischen dem Tag

2 p.i. und dem Tag 4 p.i. Fieber bis zu einer maximalen Körpertemperatur von 40,8 °C

(Abbildung 14). Danach fiel die Körpertemperatur der Tiere Nr. 670 und 685 bis zum

Tag 6 p.i. rapide bis auf 37,5 °C bzw. 37,7 °C ab.

ERGEBNISSE

82

37,5

38

38,5

39

39,5

40

40,5

41

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11d.p.i.

Tem

pera

tur [

°C]

Nr. 685Nr. 670Nr. 679Nr. 697Nr. 718

Abbildung 14: Körpertemperatur der überlebenden Kaninchen nach experimenteller Infektion mit RHDV. Die Daten wurden von der Riemser Arzneimittel AG zu Verfügung gestellt.

Darüber hinaus entwickelten weder die infizierten Kaninchen, die nach 5 (Nr. 670 und 685),

7 (Nr. 679 und 697) und 15 Wochen (Nr. 718) getötet wurden, noch die serologisch negativen

Kontrolltiere, die nach 9 (Nr. 1 und 2) sowie 15 Wochen (Nr. 3) getötet wurden, klinische

Symptome.

Bei der pathologisch-anatomischen und histologischen Untersuchung aller acht Tiere wurden

keine für RHD spezifischen Läsionen gefunden. Mittels Immunhistologie konnte in Leber,

Milz, Lymphknoten und Nieren kein RHDV-Antigen und mittels In situ-Hybridisierung in der

Leber keine RHDV-RNA nachgewiesen werden. In der als positive Kontrolle mitgeführten

Leber eines an akuter RHD verstorbenen Tieres konnte mit beiden Methoden eine für den

Nachweis des Antigens bzw. der RNA spezifische Anfärbung der Hepatozyten festgestellt

werden (Abbildung 15).


83

(a) (b)

(c) (d)

Abbildung 15: Detektion von RHDV-Antigen bzw. RHDV-RNA in der Leber eines an akuter RHD verstorbenen Kaninchens und eines rekonvaleszenten Tieres. Der Antigennachweis erfolgte mittels Immunhistologie (oben). Die In situ-Hybridisierung zum Nachweis viraler RNA wurde mit einer sequenzspezifischen T7-Sonde durchgeführt (unten). Zur Kontrolle wurde die entsprechende SP6-Sonde verwendet, die kein Signal erzeugte (kleine Abbildung in (c)). Es handelt sich in (a) und (c) um eine als positive Kontrolle mitgeführte Leber eines an akuter RHD verstorbenen Tieres, bei der jeweils eine spezifische Anfärbung der Hepatozyten (Pfeile) festgestellt wurde. In (b) und (d) ist exemplarisch das Ergebnis für das Tier Nr. 670 gezeigt, hier konnte 5 Wochen p.i. weder RHDV-Antigen noch RHDV-RNA in der Leber detektiert werden. Maßstabsbalken = 100 µm.

4.2.2 Detektion von Antikörpern

Zum Zeitpunkt von 5 Wochen p.i. hatten alle infizierten Tiere RHDV-spezifische Antikörper

gebildet. Bei den nicht infizierten Kontrolltieren wurde bis zum Ende des Versuches keine

Serokonversion beobachtet (Abbildung 16).

100 µm 100 µm

100 µm 100 µm

ERGEBNISSE

84

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2E

LIS

A-in

dex

Nr. 685 Nr. 670 Nr. 679 Nr. 697 Nr. 718 Nr. 1 Nr. 2 Nr. 3Tier

Abbildung 16: Antikörper-Status der infizierten Tiere (Nr. 685, 670, 679, 697, 718) und der nicht infizierten Kontrolltiere (Nr. 1 - 3) 5 Wochen p.i..

4.2.3 Verteilung der Virusgenomlast und Charakterisierung der isolierten RNA

Die Mehrheit der Proben eines jeden infizierten Tieres enthielt RHDV-RNA. In den

Leukozyten wurde virale RNA bis 7 Wochen p.i. nachgewiesen, wobei die Tiere Nr. 670 und

685 die höchsten Virusgenomlasten zeigten (Abbildung 17). Die Leukozyten des Tieres

Nr. 718 waren zum Zeitpunkt von 5 Wochen p.i. negativ für RHDV-RNA. Zu diesem

Zeitpunkt wurde im Serum desselben Tieres ebenfalls keine virale RNA detektiert, während

die Seren der anderen Kaninchen virales Genom enthielten.

In verschiedenen Organen, Galle und Urin wurde RHDV-RNA bis 15 Wochen p.i. - dem

Ende des Versuches - nachgewiesen. Die Virusgenomlasten nahmen während der Dauer des

Versuches ab. Eine Akkumulation viraler RNA wurde insbesondere in Gallenflüssigkeit,

Milz, Knochenmark, Leber und mesenterialen Lymphknoten gefunden. Die höchste

Virusgenomlast wurde mit 4,39 x 106 Kopien/µl in der Gallenflüssigkeit des Tieres Nr. 670

zum Zeitpunkt von 5 Wochen p.i. gefunden (Abbildung 18).


85

1,00E+00

1,00E+01

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

4 5 6 7 8 9 10 ... 15Woche p.i.

Kop

ien/

5,00

E+0

5 Le

ukoz

yten

Nr. 685Nr. 670Nr. 679Nr. 697Nr. 718

Abbildung 17: Virusgenomlast in den Leukozyten rekonvaleszenter Tiere. Die Bestimmung der Virusgenomlast erfolgte wöchentlich, beginnend mit der Woche 4 p.i., bis das jeweilige Tier getötet und der Sektion zugeführt wurde. In den Wochen 11-14 p.i. wurden keine Daten erhoben.

Die Proben der nicht infizierten Kontrolltiere blieben genauso wie die negativen Kontrollen

der einzelnen real-time RT-PCR-Läufe negativ. Die RNA-Isolierungskontrollen, die bei der

RNA-Extraktion aus Organproben des Tieres Nr. 670 bzw. der Gallenflüssigkeit der Tiere

Nr. 670, 685, 679 und 697 erhalten wurden, waren schwach positiv mit Ct-Werten von

37 bzw. 38. Diese geringe Kreuzkontamination wurde toleriert und keine Wiederholung der

RNA-Isolierung durchgeführt, da die parallel aufgearbeiteten Proben Ct-Werte zwischen

19 und 27 (restliche Organproben) bzw. 16 und 22 (Gallenflüssigkeit der anderen Tiere)

hatten. Die Amplifizierung der IC ergab bei allen Proben Ct-Werte für HEX zwischen

26 und 30. Dazu wurden Kotproben mit einer Kombination aus TRIzol®Reagent und

RNeasy® Mini Kit aufgearbeitet, nachdem sich mit den anderen getesteten Methoden

(QIAamp® Viral RNA Mini Kit, RNeasy® Mini Kit, TRIzol®Reagent) eine Inhibition der

Amplifizierung der IC zeigte.

ERGEBNISSE

86

1,00E+00

1,00E+01

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

Kop

ien/

mg

resp

. µl r

esp.

5,

00E+

05 L

euko

zyte

n

MilzKnochenmark

LeberLn. mesenterialis

NiereLungeAortaIleumNasenschleimhaut

CaecumHerzTonsilleThymusLn. mandibularisGalleFaecesUrin

Leukozyten

Nr. 685

Nr. 670

Probe

Nr. 685

Nr. 670

1,00E+00

1,00E+01

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

Kop

ien/

mg

resp

. µl r

esp.

5,

00E+

05 L

euko

zyte

n

MilzKnochenmark




Leukozyten

Nr. 679

Nr. 697

Probe

Nr. 679

Nr. 697

1,00E+00

1,00E+01

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

Kop

ien/

mg

resp

. µl r

esp.

5,

00E+

05 L

euko

zyte

n

MilzKnochenmark




Leukozyten

Nr. 718

Probe

Nr. 718

Abbildung 18: Virusgenomlast in den Organen, Exkreten und Leukozyten rekonvaleszenter Tiere. Es sind die Virusgenomlasten der einzelnen Proben zum Zeitpunkt von 5 Wochen p.i. (a), 7 Wochen p.i. (b) und 15 Wochen p.i. (c) dargestellt.

(a) 5 Wochen p.i.

(b) 7 Wochen p.i.

(c) 15 Wochen p.i.


87

Nach der Elektroporation von RLI-R-Zellen mit konzentrierter RNA (7,47 x 107 Kopien

RHDV-RNA) aus der Milz des Tieres Nr. 679 wurde weder eine spezifische

Immunfluoreszenz noch ein HA-Titer festgestellt. Bei der Verwendung von

1,92 x 1011 Kopien einer positiven Kontroll-RNA wurde eine RHDV-spezifische Fluoreszenz

der Zellen und ein HA-Titer von 23/50µl Zellkulturüberstand nachgewiesen. Diese Tests

blieben negativ, als die positive Kontrolle auf 7,47 x 107 Kopien eingestellt und so für die

Transfektion eingesetzt wurde.

Der Northern Blot mit konzentrierter RNA (1,5 x 1010 Kopien RHDV-RNA) aus der Leber

des Tieres Nr. 685 zeigte keine für RHDV spezifische Anfärbung. Bei der vorangegangenen

Formaldehyd-Agarosegelelektrophorese waren mehrere Banden (zelluläre RNA) erkennbar

(Abbildung 19).

Abbildung 19: Northern Blot (rechts) zum Nachweis von RHDV-RNA in der Leber des Tieres Nr. 685 und vorangegangene Formaldehyd-Agarosegelelektrophorese (links). Die Proben wurden wie folgt aufgetragen: Marker M: 0,24 - 9,5 kb RNA Leiter. Spur 1: positive Kontrolle, 4,94 x 1011 Kopien RHDV-RNA, 224 nt. Spur 2: positive Kontrolle, 1,78 x 1013 Kopien RHDV-RNA, 224 nt. Spur 3: weitere, in diesem Falle irrelevante, Probe. Spur 4: konzentrierte RNA aus der Leber des Tieres Nr. 685, 1,5 x 1010 Kopien RHDV-RNA.

ERGEBNISSE

88

Die für den Northern Blot konstruierte positive Kontrolle (1,78 x 1013 Kopien RHDV-RNA,

224 nt) ergab in beiden Fällen eine deutliche einzelne Bande mit einer Größe von < 0,24 kb.

Bei Verwendung von 4,94 x 1011 Kopien der positiven Kontrolle waren weder bei der

Formaldehyd-Agarosegelelektrophorese noch beim Northern Blot Banden sichtbar.

4.2.4 Detektion von Antigen oder infektiösem Virus

Die Antigen-ELISAs, die mit Proben durchgeführt wurden, die bei der absoluten

Quantifizierung mittels real-time RT-PCR ein Ergebnis von mehr als 105 Kopien/Reaktion

erbrachten, blieben negativ. Einige schwache Signale wurden bei Milz, Knochenmark und

Gallenflüssigkeit der Tiere Nr. 670 und 685 beobachtet. Der höchste nachgewiesene

ELISA-index war jedoch nur 0,035 (Milz des Tieres Nr. 685) bei einem diagnostischen

cut-off von 0,2.

Das aus der Leber des Tieres Nr. 679 konzentrierte Material war sowohl im

Antigen-ELISA als auch in der Elektronenmikroskopie negativ für RHDV. Das empfängliche

Kaninchen (Nr. 14), welches damit i.m. inokuliert wurde, zeigte weder klinische Symptome

noch eine Serokonversion.


challenge-Infektion

4.3.1 Detektion von Antikörpern

Alle Versuchstiere entwickelten nach Immunisierung RHDV-spezifische Antikörper, die sie

vor der challenge-Infektion am Tag 28 p.v. schützten. Dabei wurden bei den Kaninchen, die

den kommerziell erhältlichen Impfstoff RIKA-VACC erhielten (Nr. 17, 18, 19, 20),

erwartungsgemäß höhere und früher über dem cut-off liegende ELISA-indices nachgewiesen

als bei den Tieren, die die rekombinante Bakulovirusvakzine in einer 1:64-Verdünnung in

A. bidest (Nr. 13, 14, 15, 16) erhielten (Abbildung 20).

Untersuchungen zum carrier-Status von immunisierten Tieren nach challenge-Infektion

89

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

0 10 15 20 28d.p.v.

ELI

SA

-inde

xNr. 13Nr. 14Nr. 15Nr. 16Nr. 17Nr. 18Nr. 19Nr. 20

Abbildung 20: Antikörperbildung nach der Immunisierung mit RIKA-VACC und einer rekombinanten Bakulovirusvakzine. In grau dargestellt sind die Ergebnisse für die Tiere, die mit RIKA-VACC immunisiert wurden. Die schwarzen Linien stehen für die Tiere, die eine rekombinante Bakulovirusvakzine in einer 1:64-Verdünnung erhielten.

4.3.2 Verteilung der Virusgenomlast

In der Abbildung 21 sind die in den Proben der einzelnen Tiere ermittelten Virusgenomlasten

dargestellt. In 1 - 5 untersuchten Proben eines jeden Tieres wurde virale RNA in

durchschnittlich nur sehr geringen Mengen zwischen 10 und 100 Kopien/mg resp. µl

nachgewiesen. Die höchste Virusgenomlast wurde in der Gallenflüssigkeit des Tieres Nr. 14

gefunden, welche 1,50 x 104 Kopien/µl RHDV-RNA enthielt. Dieses Tier wies den

schlechtesten Antikörperstatus auf und wurde zum Zeitpunkt von 9 Wochen p.i. getötet. Mit

Ausnahme dieses Tieres sowie des Tieres Nr. 16 wurde bei keinem anderen Kaninchen virale

RNA in der Gallenflüssigkeit nachgewiesen.

Es wurde weder ein Zusammenhang der Höhe der Virusgenomlast mit dem Zeitpunkt der

Probennahme noch mit dem Antikörper-Status der Tiere festgestellt. Die

RNA-Isolierungskontrollen und die negativen Kontrollen waren in allen Läufen negativ. Die

Amplifizierung der IC ergab bei allen Proben Ct-Werte für HEX zwischen 26 und 30. Dazu

wurde die RNA aus Leberproben mit TRIzol®Reagent isoliert.

ERGEBNISSE

90

1,00E+00

1,00E+01

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04K

opie

n/m

g re

sp. µ

l

9 (Nr. 17) 11 (Nr. 18) 13 (Nr. 19) 15 (Nr. 20)

Woche p.i.

GalleLeberMilzLn. mesenterialisKnochenmark

1,00E+00

1,00E+01

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

Kop

ien/

mg

resp

. µl

9 (Nr.14) 11 (Nr. 13) 13 (Nr. 15) 15 (Nr. 16)

Woche p.i.

GalleLeberMilzLn. mesenterialisKnochenmark

Abbildung 21: Virusgenomlast in Organen und Gallenflüssigkeit immunisierter Tiere nach der challenge-Infektion. (a) zeigt die Virusgenomlast bei Tieren, die RIKA-VACC erhielten, und (b) die Virusgenomlast bei Tieren, die mit der rekombinanten Bakulovirusvakzine immunisiert wurden. Es sind die Virusgenomlasten der einzelnen Proben zum Zeitpunkt von 9, 11, 13 und 15 Wochen p.i. dargestellt.

(a)

(b)

Kinetik von Replikationsvorgängen in vitro

91

4.4 Kinetik von Replikationsvorgängen in vitro

4.4.1 Kinetik nach Infektion

In den RLI-R-Zellen wurde 2 h nach der Inokulation die höchste Virusgenomlast gefunden,

die daraufhin im Verlauf des Versuches tendenziell abnahm. Die Virusgenomlast in den

Zellkulturüberständen nahm vom Zeitpunkt von 2 h bis zum Zeitpunkt von 24 h nach der

Inokulation auf das ca. 2,5fache zu. Zu diesem Zeitpunkt wurde die höchste Virusgenomlast

(5,3 x 105 Kopien/µl) im Zellkulturüberstand während des Versuches gefunden, danach nahm

sie wieder kontinuierlich ab (Abbildung 22).

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

1,00E+09

1,00E+10

Kop

ien/

µl re

sp.

5,00

E+0

5 Ze

llen

2 24 48 72h nach Infektion

RLI-R-ZellenZellkulturüberstand

Abbildung 22: Virusgenomlast in RLI-R-Zellen und Zellkulturüberständen nach der Infektion mit RHDV.

Das Inokulum enthielt 1,321 x 108 Kopien RHDV-RNA/µl, das entspricht einer Menge von

2,642 x 1010 Kopien RHDV-RNA pro Vertiefung einer 24well-Gewebekulturplatte, bei der

200 µl Inokulum eingesetzt wurden.

Mittels des indirekten Immunfluoreszenztestes wurde nur vereinzelt RHDV-Antigen

nachgewiesen. Pro Vertiefung einer 24well-Gewebekulturplatte wurden nach 2 h acht Zellen,

nach 24 h sechs, nach 48 h sieben und nach 72 h dreißig positive Zellen gezählt. Der

Hämagglutinationstest und der Antigen-ELISA blieben zu allen Zeitpunkten negativ.

ERGEBNISSE

92

4.4.2 Kinetik nach Transfektion

Vom Zeitpunkt von 2 h bis zum Zeitpunkt von 24 h nach der Transfektion nahm die

Virusgenomlast sowohl in den Zellen als auch in den Zellkulturüberständen um etwa drei

log10-Stufen zu. Die größte Menge viraler RNA (1,2 x 109 Kopien/5 x 105 RLI-R-Zellen)

wurde während dieser Untersuchung nach 24 h in den Zellen gefunden, nahm danach dort

aber kontinuierlich ab. In den Zellkulturüberständen blieb die Virusgenomlast ab dem

Zeitpunkt von 24 h nach Transfektion in etwa gleich (Abbildung 23).

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

1,00E+09

1,00E+10

Kop

ien/

µl re

sp.

5,00

E+0

5 Ze

llen

2 24 48 72h nach Transfektion

RLI-R-ZellenZellkulturüberstand

Abbildung 23: Virusgenomlast in RLI-R-Zellen und Zellkulturüberständen nach der Transfektion mit RHDV-RNA.

Insgesamt wurden für die Elektroporation 1,92 x 1011 Kopien RHDV-RNA eingesetzt. Da die

Zellen in 16 ml Zellkulturmedium resuspendiert wurden, kann pro Vertiefung einer

24well-Gewebekulturplatte (0,5 ml resuspendierte Zellen) maximal eine Menge von

6 x 109 Kopien Input-RHDV-RNA vorhanden sein.

Mittels des indirekten Immunfluoreszenztestes konnte ab 24 h RHDV-Antigen in den Zellen

nachgewiesen werden. Nach 48 h zeigte ein größerer Anteil der Zellen eine brillante grüne

Fluoreszenz als nach 24 h. Dieser Anteil positiver Zellen war nach 72 h etwa gleich groß wie

zum Zeitpunkt von 48 h, doch die Fluoreszenz war flächiger ausgebreitet (Abbildung 24).

Kinetik von Replikationsvorgängen in vitro

93

(a) (b)

(c) (d)

Abbildung 24: Nachweis von RHDV-Antigen in RLI-R-Zellen nach der Transfektion mit RHDV-RNA. Mittels des indirekten Immunfluoreszenztestes wurden die Virusreplikation nach 2 h (a), 24 h (b), 48 h (c) und 72 h (d) überprüft. Für RHDV-Antigen positive RLI-R-Zellen erscheinen grün, während die Zellkerne rot angefärbt sind. Maßstabsbalken = 500 µm.

Nach 2 h waren der Hämagglutinationstest und der Antigen-ELISA noch negativ. Nach 24, 48

und 72 h wurden jeweils 26 HAE (hämagglutinierende Einheiten)/50 µl Zellkulturüberstand

und ELISA-indices um 0,200 (0,194 nach 24 h, 0,208 nach 48 h, 0,213 nach 72 h)

nachgewiesen.


95

5 DISKUSSION

5.1 Etablierung einer multiplex real-time RT-PCR für RHDV

Die real-time RT-PCR hat mehrere Vorteile gegenüber der konventionellen RT-PCR. Sie

erlaubt die Quantifizierung unbekannter RNA-Mengen und ist i.d.R. sensitiver als eine

konventionelle RT-PCR. Wenn die Detektion der Amplifikate mit Hilfe von

fluoreszenzmarkierten Sonden erfolgt, ist außerdem ein Zuwachs an Spezifität gegeben. Da

die Amplifizierung und die Detektion gleichzeitig ablaufen, ist diese Methode schneller und

birgt ein geringeres Kontaminationsrisiko (NAZARENKO et al. 1997; SCHWEIGER et al.

2000; BLACK et al. 2002; MCKILLIP u. DRAKE 2004). Aus den genannten Gründen wurde

im Rahmen dieser Arbeit ein multiplex real-time RT-PCR assay zur Detektion von RHDV

entwickelt und validiert. Sie beinhaltet ein internes Kontrollsystem; und es wurden externe

Standards für die absolute Quantifizierung unbekannter Mengen RHDV-RNA konstruiert und

eingesetzt.

Die Primer und die TaqMan®-Sonde für RHDV wurden basierend auf einer

Consensus-Sequenz aus 27 RHDV-Isolaten in der hochkonservierten Region F des

VP60-Gens (NEILL 1992) ausgewählt. Für die Mehrheit dieser Sequenzen wurde eine

100 % Übereinstimmung der Oligonukleotide mit der Sequenz des VP60-Gens gezeigt, so

daß die Detektion dieser 27 Isolate erwartet werden konnte. Eine TaqMan®-Sonde wurde

ausgewählt, da die Verwendung einer Sonde als zusätzlichem hybridisierenden

Oligonukleotid einen Zuwachs an Spezifität (GIBSON et al. 1996; HEID et al. 1996)

bedeutet. Das ist insbesondere von Bedeutung, wenn die Detektion von genetisch ähnlichen

Viren, wie z.B. dem RCV (CAPUCCI et al. 1996b), ausgeschlossen werden soll. Andere

sequenzspezifische Sonden weisen keine entscheidenden Vorteile auf, während ihr Design

Schwierigkeiten bereiten kann. Besonders bei der Auswahl von FRET-Sonden für

Species- oder Genus-übergreifende real-time PCR assays ist das Auffinden von langen

(ca. 50 Nukleotide) homologen Genomabschnitten nicht einfach oder immer möglich. Eine

IC-spezifische real-time RT-PCR wurde als heterologes System in dem multiplex assay

integriert (HOFFMANN et al. 2005).

In nicht dargestellten Vorversuchen wurden kommerziell erhältliche one-step RT-PCR Kits

(QuantiTect™ Probe RT-PCR Kit, SuperScript™ III One-Step RT-PCR System,

DISKUSSION

96

QIAGEN OneStep RT-PCR Kit) als chemisch-enzymatische Basis für den assay getestet.

Von der Etablierung einer two-step RT-PCR wurde aufgrund des größeren

Kontaminationsrisikos abgesehen - es wurden später sehr hohe Virusgenomlasten bis zu

2 x 1010 Kopien/mg Leber beim an akuter RHD verstorbenen Tier nachgewiesen. Eine

maximale Sensitivität wurde mit dem SuperScript™ III One-Step RT-PCR System erreicht,

weshalb dieses im Weiteren verwendet wurde. Bei diesem Kit besteht die Möglichkeit, die

Konzentration der Magnesiumionen im Reaktionsansatz zu variieren und außerdem einen

Referenzfarbstoff in der gewünschten Konzentration zuzugeben. Die Magnesiumionen stellen

einen Kofaktor der Taq-Polymerase dar (CHIEN et al. 1976), weshalb ihre Konzentration

einen entscheidenden Einfluß auf die Sensitivität und Spezifität einer PCR nimmt. Als

optimale Konzentration wurden 1,6 mM Magnesiumionen im 25 µl-Reaktionsansatz

eingesetzt. Diese Konzentration wurde innerhalb des vom Hersteller empfohlenen Bereiches

ermittelt und ist im Vergleich zu anderen real-time PCR-Protokollen relativ gering. Der

Grund hierfür ist, daß es sich bei dem SuperScript™ III One-Step RT-PCR System um ein

nicht ausschließlich für die real-time RT-PCR entwickeltes Kit handelt. Trotzdem hatte es

sich als am besten geeignet für den zu etablierenden real-time RT-PCR assay erwiesen, wobei

neben der Sensitivität auch die Möglichkeiten der Optimierung (Variation der

Magnesiumionenkonzentration, Zugabe des Referenzfarbstoffes) mit Hinblick auf die

Entwicklung eines multiplex assays berücksichtigt wurden. Der Referenzfarbstoff ROX

wurde zugesetzt, um Unterschiede in den Fluoreszenzwerten, die nicht mit der

Amplifizierung des Zielgens zusammenhängen, zu korrigieren. Ferner wurden für den

single assay 20 pmol der RHDV-spezifischen Primer und 2,5 pmol der Sonde vp60-9_fam

pro Reaktionsansatz verwendet, womit die frühsten Ct-Werte in Kombination mit maximalen

Fluoreszenzwerten erreicht wurden. Empirisch wurde die günstigste Annealing-Temperatur

ermittelt, sie lag bei 55 °C und damit ca. 1 bzw. 2 °C unter der Schmelztemperatur der Primer

(RYCHLIK et al. 1990). Für den multiplex assay wurde sowohl die Annealing- als auch die

Elongations-Phase von 30 s (single assay) auf 45 s verlängert, um so die Synthese der

komplementären Stränge beider Amplifikate zu gewährleisten. Die IC-spezifischen Primer

wurden dabei in einer limitierten Konzentration von 5 pmol pro Reaktionsansatz eingesetzt,

um eine kompetitive Inhibition der Amplifizierung des Zielgens zu vermeiden.


97

Bei der hergestellten positiven Kontrolle (PC) handelt es sich genau wie bei der internen

Kontrolle (IC) um in vitro-transkribierte RNA. Beide Kontrollen sind damit nicht-infektiös,

und ferner kann die IC universell in verschiedenen assays verwendet werden (HOFFMANN

et al. 2005).

Die PC dient der Überprüfung der Funktion von Primern und Sonde. Außerdem wurden aus

einer Verdünnungsreihe externe RNA-Standards hergestellt, die die absolute Quantifizierung

unbekannter RNA-Mengen ermöglichen. Mittels dieser RNA-Standards wurde eine

analytische Sensitivität von 10 Kopien PC RNA/Reaktion und ein dynamischer Bereich des

assays über 10 log10-Stufen nachgewiesen. Somit kann der real-time RT-PCR assay für

RHDV zum einen dort eingesetzt werden, wo hohe Virusgenomlasten erwartet werden,

z.B. in der akuten Phase der Erkrankung, die in anderen Studien mittels konventioneller

RT-PCR untersucht wurde (GUITTRE et al. 1996; SHIEN et al. 2000). Zum anderen ist die

Verwendung bei speziellen Fragestellungen, wie der Untersuchung einer möglichen

Viruspersistenz, bei denen eine hochsensitive Methode benötigt wird, möglich.

Die IC dient der Überprüfung der Effizienz der RNA-Isolierung, der RT und der PCR in jeder

einzelnen Probe. Sie wird während der RNA-Isolierung nach der Lyse der Probe und

Inaktivierung von RNasen zugesetzt und kann so eine Degradation der RNA oder

inhibitorische Effekte, z.B. bei problematischen Proben wie Leber oder Faeces, aufdecken.

Somit ist die Verwendung einer IC eine wichtige Basis zur absoluten Quantifizierung und

darüber hinaus im Hinblick auf den speziellen Tropismus des RHDV als Calicivirus (Leber,

Darm) unabdingbar. Die IC wird im multiplex assay koamplifiziert und detektiert. Ein häufig

beschriebenes Problem von multiplex assays ist eine Inhibition der Amplifizierung der

Zielsequenz, die mit einem Verlust an Sensitivität für das Zielgen einhergeht (HOFMANN

2003; PERSSON et al. 2005). Das konnte vermieden werden, indem die Konzentration der

IC-spezifischen Primer limitiert, für die IC eine deutlich größere Amplifikatlänge als für das

Zielgen gewählt und die IC nur in limitierter Menge eingesetzt wurde (HOFFMANN et al.

2005). Entsprechend konnte eine identische Sensitivität des single und multiplex assays für

RHDV nachgewiesen werden. Bei großen Mengen viraler RNA wurde jedoch eine Inhibition

der Amplifizierung der IC beobachtet. Diese stellt kein Problem dar, weil die IC dazu dient,

falsch negative Ergebnisse auszuschließen (HOFMANN 2003). Außerdem besteht immer die

Möglichkeit, RHDV-RNA und IC in zwei unabhängigen Reaktionen zu amplifizieren.

DISKUSSION

98

Im Rahmen der Validierung der real-time RT-PCR für RHDV wurde deren Sensitivität mit

einer etablierten konventionellen RT-PCR und einem Antigen-ELISA verglichen. Dabei

wurden jeweils die beiden beschriebenen Subtypen des RHDV verwendet. Die

real-time RT-PCR war mehrere log10-Stufen sensitiver als die konventionelle RT-PCR mit

30 Zyklen. Daraufhin wurden 40 Zyklen in der konventionellen RT-PCR verwendet, um eine

Vergleichbarkeit der Reaktionsbedingungen zu erhalten. Nun war die real-time RT-PCR

mindestens eine log10-Stufe sensitiver als die konventionelle RT-PCR. Die höhere Sensitivität

erklärt sich durch die Amplifizierung eines deutlich kürzeren Fragmentes als in der

konventionellen RT-PCR (TOOULI et al. 2000). Es traten Probleme bei der

Reproduzierbarkeit der Ergebnisse der konventionellen RT-PCR in den höchsten

Verdünnungen des templates auf, die sich wahrscheinlich mit einer Kreuzkontamination

zwischen den Proben - bedingt durch ein dreischrittiges Protokoll - begründen lassen. Die

real-time RT-PCR war mehrere Größenordnungen sensitiver als der Antigen-ELISA. Positive

Ergebnisse im Antigen-ELISA entsprachen etwa 107 Kopien/Reaktion und mehr. Da kein

Zellkultursystem für RHDV besteht, ist die real-time RT-PCR somit die zur Zeit sensitivste

Methode zur Detektion des RHDV, die außerdem eine große „Robustheit“, d.h. eine hohe

Reproduzierbarkeit und ein geringes Kontaminationsrisiko, aufweist.

Die Spezifitätstests ergaben eine 100 % Spezifität des assays für RHDV. Alle getesteten

RHDV-Stämme waren positiv, während die anderen verwendeten Viren und Organe negativer

Tiere keine FAM-Fluoreszenz oberhalb des Fluoreszenzschwellenwertes erzeugten. Das in

Italien beschriebene apathogene RCV (CAPUCCI et al. 1996b, accession number X96868)

wurde von der Autorengruppe nicht für die Untersuchung der Spezifität im Rahmen der

Validierung der real-time RT-PCR für RHDV zur Verfügung gestellt. Da die Sonde vp60-

9_fam in der zentralen Region drei fehlerhafte Basenpaarungen mit der RCV-Sequenz

aufweist, der Primer vp60-7_for eine solche am 3´-Nukleotid zeigt und eine weitere

fehlerhafte Basenpaarung im Primer vp60-8_rev vorhanden ist, ist die Detektion des RCV

jedoch höchst unwahrscheinlich.

Zusammenfassend wurde eine real-time RT-PCR als neue Methode zur Detektion des RHDV

etabliert und in Anlehnung an das „Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for

Terrestrial Animals“ der OIE validiert (ANONYMUS 2004). Dabei sind die

Stufe 1 (Durchführbarkeitsstudien - d.h. Auswahl von Methode, Kontrollen und Standards)

Nachweis der Persistenz von Virusgenom in rekonvaleszenten sowie immunisierten und danach feldvirusexponierten Kaninchen

99

sowie im Rahmen der gegebenen Möglichkeiten die Stufe 2 (Etablierung und

Standardisierung - d.h. Auswahl, Optimierung und Standardisierung sowohl der

Konzentration der Reagentien als auch der Protokolle, Bestimmung der analytischen

Sensitivität und Spezifität, vorläufige Wiederholbarkeitsstudien) des 5 Stufen umfassenden

Validierungsprozesses abgeschlossen. Es ist geplant, im Rahmen der sich anschließenden

Stufe 3 (Bestimmung der Testleistung) anhand von Referenzproben sowohl infizierter als

auch nicht infizierter Tiere die diagnostische Sensitivität und Spezifität zu kalkulieren, wobei

der geforderte Vergleich mit einem „Goldstandard“ aufgrund der fehlenden Definition eines

solchen nicht möglich sein wird. Die Wiederholbarkeit, Reproduzierbarkeit, Präzision und

Akkuratheit sollen überprüft werden. Danach sollte die Leistung weiter beobachtet werden

(Stufe 4) und letztendlich die Validierung weitergeführt und ausgeweitet werden (Stufe 5). Im

Moment steht die im Rahmen dieser Arbeit etablierte real-time RT-PCR zum Nachweis des

RHDV für spezifische, hochsensitive und quantitative Untersuchungen im Rahmen von

in vivo- und in vitro-Studien zu Verfügung.

5.2 Nachweis der Persistenz von Virusgenom in rekonvaleszenten sowie

immunisierten und danach feldvirusexponierten Kaninchen

Zwei Jahrzehnte nach dem ersten Auftreten der RHD und ihrer rapiden Verbreitung über die

Kontinente sind Untersuchungen zur Epidemiologie der Erkrankung sowohl aus

wissenschaftlicher als auch aus praktischer Sicht von besonderem Interesse (MITRO u.

KRAUSS 1993). Aufgrund der Ergebnisse serologischer Untersuchungen und der Detektion

viraler RNA in Organen gesunder Kaninchen wurde in der letzten Zeit eine Viruspersistenz

als wichtiger Faktor in der Epidemiologie der RHD diskutiert (MOSS et al. 2002;

FORRESTER et al. 2003). Beide Studien basieren auf Feldproben, und es wurden bisher

keine experimentellen Untersuchungen beschrieben, die eine mögliche Viruspersistenz bzw.

das Auftreten von carrier-Tieren verifizieren.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden erstmalig tierexperimentelle Arbeiten durchgeführt, um eine

Viruspersistenz in rekonvaleszenten Tieren zu untersuchen. Dabei wurde die etablierte und

validierte multiplex real-time RT-PCR neben anderen Methoden zur Detektion des RHDV

eingesetzt. In diesem Tierversuch wurden 70 empfängliche Kaninchen mit RHDV infiziert,

von denen 3 moribund getötet wurden, während 5 die Infektion überlebten. Diese

DISKUSSION

100

Letalitätsrate von 89 % entspricht der, die üblicherweise bei experimentellen Infektionen

gefunden wird. Die 5 überlebenden und für die Studie verwendeten Tiere zeigten als Antwort

auf die Infektion Fieber und eine Serokonversion. Abgesehen von den Veränderungen der

Körpertemperatur wurden keine weiteren klinischen Symptome beobachtet. Auch bei der

pathologisch-anatomischen und histologischen Untersuchung - inkl. Immunhistologie und

In situ-Hybridisierung - der nach 5, 7 und 15 Wochen getöteten Tiere wurden keine für RHD

spezifischen Läsionen gefunden.

Bis zu 7 Wochen p.i. wurde eine Persistenz viraler RNA in den Leukozyten nachgewiesen.

Die höchsten Virusgenomlasten in den Leukozyten wurden bei den Tieren Nr. 670 und 685

nachgewiesen, deren Körpertemperatur bis zum Tag 6 p.i. stark abfiel. Es wurde gezeigt, daß

die Virusgenomlasten in den Leukozyten und im Serum korrelierten. Somit kann Serum als

alternatives Probenmaterial zum EDTA-Blut verwendet werden, was insbesondere für

retrospektive Studien, wie sie MOSS et al. (2002) mittels konventioneller RT-PCR

durchgeführt haben, von Vorteil ist.

Virale RNA wurde in zahlreichen Proben eines jeden infizierten Tieres gefunden. Das stimmt

mit den Resultaten anderer Studien überein, in denen während des akuten Verlaufs der RHD

ab dem Tag 2 p.i. in allen untersuchten Proben virales Genom mittels konventioneller

RT-PCR detektiert wurde (GUITTRE et al. 1996; SHIEN et al. 2000). Die Persistenz von

RHDV-RNA konnte bis zum Ende des Versuches (15 Wochen p.i.) nachgewiesen werden,

wobei die Virusgenomlasten im Laufe des Versuches abnahmen. Eine Akkumulation viraler

RNA wurde in der Leber und der Milz als den bisher beschriebenen primären Zielorganen des

RHDV gefunden (GELMETTI et al. 1998; PRIETO et al. 2000). Aber auch das Knochenmark

und die mesenterialen Lymphknoten enthielten ähnliche Mengen viraler RNA, so daß sie als

weitere relevante Zielorgane anzusehen sind. Die höchste Virusgenomlast wurde bei allen

Tieren außer Nr. 718 in der Gallenflüssigkeit gefunden. Diese Beobachtungen stimmen mit

den Ergebnissen von SHIEN et al. (2000) überein, die mittels konventioneller RT-PCR virale

RNA 47 Tage nach experimenteller Infektion 4 - 5 Wochen alter Kaninchen ausschließlich in

der Gallenflüssigkeit und der Milz finden konnten.

Da virale RNA in zellfreien Proben mit einem hohen Gehalt an RNasen wie Gallenflüssigkeit,

Urin und Faeces nachgewiesen wurde, kann angenommen werden, daß sie geschützt vorlag,

z.B. als Bestandteil kompletter Virionen. Es konnte jedoch mittels Antigen-ELISA oder

Nachweis der Persistenz von Virusgenom in rekonvaleszenten sowie immunisierten und danach feldvirusexponierten Kaninchen

101

Immunhistologie kein RHDV-Antigen detektiert werden. Für den Antigen-ELISA wurde

gezeigt, daß diese Methode eine zu geringe Sensitivität für die untersuchten Proben aufweist,

da positive ELISA-Ergebnisse ca. 107 Kopien/Reaktion in der real-time RT-PCR entsprachen.

Ebenso wird angenommen, daß auch die Immunhistologie zu insensitiv ist. Ferner ist zu

berücksichtigen, daß alle infizierten Tiere hohe Antikörper-Titer aufwiesen, die den Nachweis

von Antigen erschweren können, indem sie maskierend wirken.

Weiterhin konnte mittels Transfektion, Formaldehyd-Agarosegelelektrophorese und

Northern Blot kein virales Genom in kompletter Länge in Proben, die in der

real-time RT-PCR positiv waren, nachgewiesen werden. Anhand der mitgeführten Kontrollen

wurde auch hier gezeigt, daß diese Methoden zu insensitiv sind.

Obwohl RHDV-RNA in diversen Organen und Exkreten der rekonvaleszenten Tiere

nachgewiesen wurde, zeigten am Tag 12 p.i. zugestallte seronegative Kontrolltiere keine

Erkrankung oder Serokonversion. Genausowenig erkrankte oder serokonvertierte ein

Kaninchen, welchem konzentriertes, in der real-time RT-PCR positives, allerdings im

Antigen-ELISA negatives, Organmaterial i.m. appliziert wurde. Folglich konnte nicht gezeigt

werden, daß die detektierte virale RNA auch immunkompetentes oder infektiöses Virus

repräsentiert. Ähnliche negative Ergebnisse erhielten FORRESTER et al. (2003) nach der

i.m. Inokulation von empfänglichen Kaninchen mit in der konventionellen RT-PCR positivem

Lebermaterial. TEIFKE et al. (2002) zeigten, daß mindestens 100 HAE für die Infektion eines

Kaninchens nötig sind, und beobachteten dabei einen subakuten Verlauf der RHD. Da das

Material der Viruskonzentrierung auch im Antigen-ELISA, der eine höhere Sensitivität als ein

Hämagglutinationstest hat, negativ war, konnte eine Infektiosität auch nicht unbedingt

erwartet werden.

Die Detektion des apathogenen RCV (CAPUCCI et al. 1996b) mit der beschriebenen

real-time RT-PCR für RHDV ist aufgrund des Vergleiches der Sequenzen in der

Primer/Sonden-Region nicht zu erwarten. Außerdem ist dieses Virus als potentieller

Vorläufer des RHDV primär im Darm zu finden und führt zu einer 100 % Serokonversion in

infizierten Kaninchenpopulationen (CAPUCCI et al. 1997). Daß alle für den beschriebenen

Versuch verwendeten Kaninchen - sowohl seronegative Kontrolltiere als auch die später

infizierten und rekonvaleszenten Tiere - aus demselben Bestand stammten, spricht also

ebenfalls gegen den Nachweis des RCV.

DISKUSSION

102

Als Ergebnis dieses Tierversuches wurde erstmalig die Persistenz von RHDV-RNA bis zu

einem Zeitpunkt von 15 Wochen nach experimenteller Infektion mit RHDV nachgewiesen

und quantifiziert. Es konnte jedoch kein Antigen oder infektiöses Virus nachgewiesen

werden, wobei sowohl quantitative Effekte - bzw. die zu geringe Sensitivität der verfügbaren

Methoden - als auch inhibitorische Effekte durch die hohen Antikörper-Titer der

rekonvaleszenten Tiere berücksichtigt werden müssen. Daher sind weitere Untersuchungen

nötig, um zum einen festzustellen, ob die Persistenz viraler RNA mit einer Viruspersistenz

einhergeht. Zum anderen sollten die Mechanismen einer möglichen Reaktivierung der

persistierenden RNA untersucht werden, um so die Epidemiologie der RHD weiter

aufzuklären.

Ein zweiter Tierversuch wurde durchgeführt, um einen evtl. carrier-Status bei immunisierten

Kaninchen nach der challenge-Infektion mit RHDV nachzuweisen. Dabei wurde auch

untersucht, ob das Auftreten und die Dauer dieses carrier-Status bzw. die Höhe der

nachweisbaren Virusgenomlast vom Antikörper-Status des einzelnen Tieres beeinflusst wird.

Es wurden diejenigen Proben zur Untersuchung ausgewählt, bei denen basierend auf den

Ergebnissen des ersten Tierversuches die höchsten Virusgenomlasten erwartet werden

konnten.

Virale RNA wurde bei allen Tieren detektiert, allerdings waren die Virusgenomlasten

geringer als bei den rekonvaleszenten Tieren - bei vergleichbaren Probennahmezeitpunkten.

Die Immunisierung der Tiere ist folglich mit einer reduzierten Virusgenomlast gegenüber der

bei rekonvaleszenten Tieren verbunden, ist aber nicht in der Lage, eine „sterile Immunität“ zu

gewährleisten. Auffällig ist, daß bei den immunisierten und danach feldvirusexponierten

Kaninchen nur bei zwei Tieren virale RNA in der Gallenflüssigkeit nachgewiesen werden

konnte, während bei den rekonvaleszenten Tieren mit einer Ausnahme dort die höchsten

Virusgenomlasten gefunden wurden.

Wegen der vergleichsweise niedrigen Mengen detektierter viraler RNA und des daher zu

erwartenden negativen Ergebnisses wurden Antigen-Nachweisverfahren wie ELISAs sowie

die Prüfung einer Virusausscheidung mittels Kontakttieren nicht durchgeführt. Die höchste

Virusgenomlast wurde beim Tier Nr. 14, das den schlechtesten Antikörper-Status hatte und

darüber hinaus zum frühesten Zeitpunkt (9 Wochen p.i.) getötet wurde, nachgewiesen.

Kinetik von Replikationsvorgängen des RHDV in vitro

103

Abgesehen von diesem Einzeltier zeigte sich weder ein deutlicher Zusammenhang der Höhe

der Virusgenomlast mit dem Zeitpunkt der Probennahme noch mit dem unterschiedlichen

Antikörper-Status der Tiere.

Zusammenfassend wurden erstmalig immunisierte Tiere, die eine experimentelle

challenge-Infektion überlebten, als carrier von RHDV-RNA identifiziert. Somit wurde

gezeigt, daß die Immunisierung gegen die RHD - und zwar sowohl mit einem kommerziellen

inaktiviertem Vollvirusimpfstoff als auch mit einer Subunitvakzine - nicht zu einer

„sterilen Immunität“ führt. Vergleichbare Untersuchungen gibt es im Schrifttum bisher nicht.

Auch hier bleibt zu klären, ob und wie das persistierende virale Genom reaktiviert werden

kann, und ob damit vakzinierte Kaninchen eine Bedeutung für Bestandsreinfektionen

besitzen.

5.3 Kinetik von Replikationsvorgängen des RHDV in vitro

Es wurden Studien zur in vitro-Replikation des RHDV nach Infektion und Transfektion

durchgeführt, die das Ziel hatten, mögliche Ursachen für dessen fehlende produktive

Vermehrung in Zellkulturen zu ermitteln. Die RLI-R-Zellen wurden exemplarisch

ausgewählt, da sie sich in nicht dargestellten Vorversuchen als geeignet für eine Transfektion

und Infektion erwiesen hatten. Die Elektroporation stellte sich in Vorversuchen als

effizienteste Transfektionsmethode heraus.

Es wurde festgestellt, daß die RLI-R-Zellen mittels RHDV-RNA effektiv transfiziert werden

können und auch eine geringgradige Infektion möglich ist. Trotz der großen Mengen

eingesetzter RNA bei der Transfektion wurde nach 24 h ein Anstieg der detektierten Menge

viraler RNA um etwa 3 log10-Stufen festgestellt, so daß man von einer aktiven

Virusreplikation ausgehen kann. Diese war aber ein zeitlich begrenztes Ereignis, denn nach

48 h hatten die nachgewiesenen Mengen schon wieder abgenommen und fielen danach

tendenziell weiter. Das wurde durch die Ergebnisse der Antigen-Nachweisverfahren (ELISA,

indirekter Immunfluoreszenztest und Hämagglutinationstest) bestätigt.

Bei der Infektion war der Anstieg der Menge viraler RNA nach 24 h sehr gering und

außerdem nur im Zellkulturüberstand zu verzeichnen. In diesem Fall muß insbesondere die

große Menge des eingesetzten Virus berücksichtigt werden, so daß hier - wenn überhaupt -

nur von einer sehr geringgradigen Virusvermehrung ausgegangen werden darf. Entsprechend

blieben der Antigen-ELISA und der Hämagglutinationstest negativ, während mittels des

DISKUSSION

104

indirekten Immunfluoreszenztestes vereinzelt RHDV-Antigen in den Zellen nachgewiesen

werden konnte.

Die dargestellten Ergebnisse bestätigen die Schlußfolgerungen aus ebenfalls durchgeführten

umfangreichen Studien zur in vitro-Replikation des RHDV mit über 50 etablierten Zellinien,

bei denen vor allem Antigen-Nachweisverfahren eingesetzt wurden. Daher wurden keine

Wiederholungen der Experimente vorgenommen, und es wurde auf die Untersuchung

mehrerer Replikate sowie eine statistische Auswertung verzichtet.

Die festgestellten Unterschiede in den Ergebnissen der Transfektions- und

Infektions- (Inokulations-) experimente weisen daraufhin, daß der in vitro Replikationsblock

in einer sehr frühen Phase der Virus-Zell-Interaktion (attachment, Penetration, uncoating)

liegen muß. In weiteren Untersuchungen, die nicht Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind,

konnte auch gezeigt werden, daß in Zellkulturen nach Transfektion generiertes RHDV

infektiös für Kaninchen ist und damit nach Formulierung als Versuchsvakzine eine protektive

Immunität in Kaninchen induziert werden kann.

105

6 ZUSAMMENFASSUNG

Etablierung, Validierung und praktische Anwendung einer multiplex real-time RT-PCR zum

Nachweis des Rabbit Haemorrhagic Disease Virus

Astrid Gall

Die Rabbit Haemorrhagic Disease (RHD, syn. Hämorrhagische Krankheit der Kaninchen) ist

eine weltweit auftretende, meistens perakut bis akut und tödlich verlaufende Erkrankung von

Kaninchen der Species Oryctolagus cuniculus. Sie wird verursacht durch das Rabbit

Haemorrhagic Disease Virus (RHDV), einen Vertreter der Familie Caliciviridae. Die

Epidemiologie der Erkrankung, insbesondere die Frage einer möglichen Viruspersistenz bei

rekonvaleszenten Tieren sowie immunisierten Tieren nach Kontakt mit Feldvirus, ist bisher

nur wenig und nicht in experimentellen Studien untersucht worden. Bis dato gibt es keine

hochsensitive und quantitative Diagnostik für RHDV, da kein Zellkultursystem zur

produktiven Vermehrung des Virus existiert.

In der vorliegenden Arbeit wurde eine auf der TaqMan®-Technologie basierende

multiplex real-time RT-PCR als neue Methode zur Detektion des RHDV etabliert und

validiert. Sie beinhaltet in vitro-Transkripte als positive sowie interne Kontrollen und

verwendet externe Standards zur absoluten Quantifizierung unbekannter Mengen viraler

RNA. Es wurde eine Spezifität von 100 %, eine analytische Sensitivität von

10 Kopien/Reaktion und Linearität über einen dynamischen Bereich von 10 log10-Stufen

nachgewiesen. Dabei zeigten der single assay und der multiplex assay mit Koamplifizierung

der internen Kontrolle identische Sensitivitäten. Die real-time RT-PCR war eine log10-Stufe

sensitiver als eine konventionelle RT-PCR und mehrere Verdünnungsstufen sensitiver als ein

Antigen-ELISA.

In dieser Arbeit wurde erstmalig eine mögliche Persistenz des RHDV im Rahmen einer

experimentellen Studie untersucht. In zwei Tierversuchen, mit rekonvaleszenten Tieren bzw.

immunisierten und feldvirusexponierten Tieren, konnte mittels real-time RT-PCR die

Persistenz viraler RNA bis zu einem Zeitpunkt von 15 Wochen p.i. nachgewiesen und

quantifiziert werden. Trotz der teilweise beträchtlichen Virusgenomlasten

ZUSAMMENFASSUNG

106

(bis 4,39 x 106 Kopien/µl in der Gallenflüssigkeit eines rekonvaleszenten Tieres

5 Wochen p.i.) gelang es nicht, Antigen bzw. infektiöses Virus nachzuweisen, wofür neben

limitierten Sensitivitäten der Detektionssysteme eine Antigenmaskierung durch hohe

Antikörpertiter in Frage kommt. Auch wenn somit nicht endgültig gezeigt werden konnte, daß

die Persistenz viraler RNA mit einer Viruspersistenz einhergeht, ist der Nachweis von

RHDV-RNA bis zu 15 Wochen nach Infektion mit RHDV sowohl bei rekonvaleszenten als

auch immunisierten und feldvirusexponierten Tieren ein zwingender Hinweis auf das

Vorkommen von carrier-Tieren als einem wesentlichen Faktor in der Epidemiologie der

RHD. Die möglichen Mechanismen einer Reaktivierung des persistierenden viralen Genoms

bedürfen einer weiteren Klärung. Imbalanzen eines sich ausbildenden Gleichgewichtes Virus

versus Antikörper durch zurückliegende Impfungen oder Stressfaktoren wie Gravidität,

Ausstellungen etc. erscheinen nicht unwahrscheinlich.

In den durchgeführten Studien zur Replikation des RHDV in Zellkulturen konnte mittels der

entwickelten real-time RT-PCR gezeigt werden, daß eine produktive in vitro-Vermehrung

nach Transfektion von RNA zeitlich begrenzt auftritt, diese sich jedoch nicht zu einer stabilen

Virusreplikation fortführen läßt. Die wesentliche Ursache dafür liegt vermutlich in einem

Replikationsblock, der in einer Phase vor der Freisetzung viraler RNA in der Zelle liegen

muß.

107

7 SUMMARY

Development, validation and utilization of a multiplex real-time RT-PCR for the detection of

Rabbit Haemorrhagic Disease Virus

Astrid Gall

Rabbit Haemorrhagic Disease (RHD) is a peracute to acute and mostly fatal disease in rabbits

of the species Oryctolagus cuniculus with a worldwide occurence. It is caused by the Rabbit

Haemorrhagic Disease Virus (RHDV), a member of the family Caliciviridae. The

epidemiology of the disease, especially a possible persistence of RHDV in convalescent or

immune rabbits after contact to field virus, is little and furthermore not experimentally

investigated. Until today, a highly sensitive detection and quantification of RHDV is

hampered by the lack of a tissue culture system for the propagation of the virus.

In the presented study, a multiplex real-time RT-PCR using TaqMan®probes was developed

and validated as a new tool for the detection of RHDV. It uses in vitro-transcripts as positive

and internal controls and external standards for absolute quantification of viral RNA. The

assay revealed a specificity of 100 %, an analytical sensitivity of 10 copies/reaction and a

linearity over a range from 1010 to 101 copies. An equivalent detection limit was shown for

the single assay and the multiplex assay with coamplification of the internal control. The

real-time RT-PCR was ten-fold more sensitive than a conventional RT-PCR and several

magnitudes more sensitive than an Antigen-ELISA.

In this study, a possible persistence of RHDV was investigated in an experimental study for

the first time. Within two animal experiments - with convalescent animals and with immune

animals exposed to field virus - persistence of viral RNA for at least 15 weeks was

demonstrated and quantified by real-time RT-PCR. Despite the partial high viral loads

(up to 4,39 x 106 copies/µl in the bile excretion of a convalescent animal 5 weeks p.i.) the

detection of antigen or infectious virus did not succeed. Limited sensitivities of the detection

systems and masking of the antigen by high antibody titres are considered to be the reason.

Even though an association of the persistence of viral RNA with a virus persistence could not

be shown definitively, the detection of RHDV RNA until at least 15 weeks after infection

SUMMARY

108

both in convalescent and immune rabbits exposed to field virus is an urgent evidence for the

existence of carrier animals as an important factor in the epidemiology of RHD. Possible

causes for reactivation of the persistent viral genome have to be investigated in further

studies. Disturbances of the balance between virus and antibodies in animals vaccinated in

distant past or stress factors as gravidity, exhibitions etc. appear to be likely.

In the conducted experiments on the replication of RHDV in tissue culture it was

demonstrated by the developed real-time RT-PCR that a productive in vitro propagation after

transfection of RNA was temporary, but could not be continued as stable replication of the

virus. The main reason is a block of the replication in an early stage before viral RNA is

released in the cell.

109

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Genetic map of the calicivirus rabbit hemorrhagic disease virus as deduced from in vitro

translation studies.

J. Virol. 70, 7974-7983

WITTWER, C. T., HERRMANN, M. G., MOSS, A. A. u. RASMUSSEN, R. P. (1997a):

Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification.


WITTWER, C. T., RIRIE, K. M., ANDREW, R. V., DAVID, D. A., GUNDRY, R. A. u.

BALIS, U. J. (1997b):

The LightCycler: a microvolume multisample fluorimeter with rapid temperature control.


ZHONG, H. u. SIMONS, J. W. (1999):

Direct comparison of GAPDH, beta-actin, cyclophilin, and 28S rRNA as internal standards

for quantifying RNA levels under hypoxia.

Biochem. Biophys. Res. Commun. 259, 523-526

ZURBRIGGEN, A., SCHMID, I., GRABER, H. U. u. VANDEVELDE, M. (1998):

Oligodendroglial pathology in canine distemper.

Acta Neuropathol. (Berl) 95, 71-77

Material

135

9 ANHANG

9.1 Material

9.1.1 Virusstämme

Virusisolat Jahr der Isolierung Phänotyp / accession number8 Herkunft

RHDV Eisenhüttenstadt 1989 „Eisenhüttenstadt-like“ / Y15440 Kaninchen Hagenow 1990 „Triptis-like“ / Y15441 Kaninchen Wriezen 1996 „Eisenhüttenstadt-like“ / Y15427 Kaninchen Triptis 1996 „Triptis-like“ / Y15442 Kaninchen Frankfurt 1996 „Eisenhüttenstadt-like“ / Y15424 Kaninchen Hartmannsdorf 1996 „Hartmannsdorf-like“ / Y15425 Kaninchen Wika (Wildkaninchen) 1996 „Eisenhüttenstadt-like“ Kaninchen Bala 1998 „Triptis-like“ Kaninchen Dachswald 2000 „Triptis-like“ Kaninchen Erfurt 2000 „Hartmannsdorf-like“ Kaninchen Rossi 2002 „Hartmannsdorf-like“ / X87607 Kaninchen S 59/04 2004 n.d. Kaninchen S 60/04 2004 n.d. Kaninchen EBHSV D 60/96 1996 n.d. Hase D 70/96 1996 n.d. Hase FCV (F9-Stamm) 1975 n.d. Katze Myxomatosevirus 1998 n.d. Kaninchen

Tabelle 5: Virusstämme, die für diese Arbeit verwendet wurden. n.d. not determined.

Die verwendeten Virusstämme stammen - mit Ausnahme des FCV der ATCC - aus dem FLI, Insel Riems.

9.1.2 Zellen und Bakterienstämme

E. coli XL1blue Stratagene

RLI-R (Zellbanknummer 750) FLI

9.1.3 Versuchstiere

„Zimmermann“-Kaninchen Riemser Arzneimittel AG und FLI

8 Die RHDV-Stämme wurden aufgrund der Reaktivität mit mAKs phänotypisch charakterisiert und ferner die für das VP60 kodierende Region sequenziert (SCHIRRMEIER et al. 1999). Auf diese Publikation beziehen sich auch die accession numbers Y15440-Y15442 und Y15424-Y15427.

ANHANG

136

9.1.4 Primer, Sonden, Nukleinsäuren und Längenstandards

DIG-markierte Kontroll-RNA Roche

IC2 RNA FLI

1 kb DNA Leiter NEW ENGLAND BioLabs®

0,24 - 9,5 kb RNA Leiter Invitrogen

Marker VI 0,15 - 2,1 kbp Roche

PCR Marker Promega

pGEM-RHDV_6422-7120R FLI

Primer und Sonden MWG Biotech AG (Tabelle 6)

RNA aus Kälberleber Sigma

Oligonukleotid Sequenz (5´-3´) Position (nt)9 RHDV-spezifische real-time RT-PCR vp60-7_for ACY TGA CTG AAC TYA TTG ACG 6941-6961 vp60-8_rev TCA GAC ATA AGA AAA GCC ATT GG 7044-7022 vp60-9_fam FAM-CCA ARA GCA CRC TCG TGT TCA ACC T-TAMRA 6986-7010 IC-spezifische real-time RT-PCR EGFP-12-F TCG AGG GCG ACA CCC TG 439-456 EGFP-10-R CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC 813-794 EGFP-HEX HEX-AGC ACC CAG TCC GCC CTG AGC A-BHQ1 703-724 RHDV-spezifische konventionelle RT-PCR RHD3-7044 TCA GAC ATA AGA AAA GCC ATT GGC 7044-7021 RHD5-5727 CAT CGA GAT TGG ACC AGG 5727-5744 RHD3-6026 CCT GCG GGT GAA ATT GAG TC 6026-6007 Sequenzierung M13-40for-IRD800 GGT TTT CCC AGT CAC GAC G M13-48rev-IRD800 GCG GAT AAC AAT TTC ACA CAG G Herstellung der RNA-Sonden für die In situ-Hybridisierung10 RHDV-6422 TGC AGG CCT ATG AGT TAG 6422-6439 RHDV-7120R TTG TAG TTG CAG CTC TTG CC 7120-7101

Tabelle 6: Primer und Sonden, die für diese Arbeit verwendet wurden.

9.1.5 Enzyme

AMV RT und AMV RT Puffer (5x) Promega

ApaI und Puffer 4 (10x) Gibco

MluI und Puffer R+ mit BSA (10x) MBI Fermentas

9 Die Nukleotidpositionen beziehen sich auf den deutschen RHDV-Referenzstamm (MEYERS et al. (1991b), accession number M67473) bzw. den Standardklonierungsvektor pEGFP-1 (BD Biosciences Clontech, accession number U55761). 10 beschrieben in TEIFKE et al. (2002)

Material

137

NotI und Puffer 3 (10x) NEW ENGLAND BioLabs®

Proteinase K Roche

PstI und Puffer H (10x) TaKaRa

Pyrophosphatase Sigma

Rekombinanter RNasin® Ribonuklease Inhibitor Promega

RNase-freie DNase Roche

RNase T1 aus Aspergillus oryzae Roche

Taq DNA Polymerase und Mg-freier DNA Polymerase Puffer (10x) Promega

T4 DNA Ligase und Ligationspuffer (2x) Promega

T7 (bzw. SP6) Polymerase Roche

9.1.6 Kommerziell erhältliche Systeme

AmpliScribe™ T7 High Yield Transcription Kit Epicentre®Biotechnologies

pGEM®-TEasy Vector System II Promega

Riboprobe® System - SP6/T7 Promega

QIAamp® Viral RNA Mini Kit Qiagen

QIAGEN OneStep RT-PCR Kit Qiagen

QIAquick® Gel Extraction Kit Qiagen

QuantiTect™ Probe RT-PCR Kit Qiagen

RNase-free DNase Set Qiagen

RNeasy® Mini Kit Qiagen

SuperScript™ III One-Step RT-PCR System Invitrogen

Thermo Sequenase Fluorescent Labelled Primer Cycle Sequencing Kit

Amersham Biosciences

9.1.7 Antigene, Antikörper und Konjugate

AP-konjugiertes anti-DIG-Fab-Fragment Roche

Avidin-Biotin-Komplex Vector

Beschichtungsantigen FLI

RHDV-Antigen, gereinigt und konzentriert (Pool aus S3/98 und S 39/00)

Beschichtungsantikörper FLI

anti-RHDV-Hyperimmunserum vom Meerschweinchen

ANHANG

138

biotinyliertes Ziege-anti-Maus-Ig Vector

FITC-konjugiertes Ziege-anti-Maus-Ig, polyklonal DakoCytomation

Gemisch aus 3 gegen RHDV gerichteten mAKs (1G8, 6A12, 10A6)

ehem. BFAV Tübingen

Gemisch aus 4 gegen RHDV gerichteten mAKs (1G8, 3C12, 4D7, 7G3)

ehem. BFAV Tübingen

Kontrollantigene FLI

positiv: RHDV Eisenhüttenstadt 73/98 Ethylenimin-inaktiviert, lyophilisiert 9/02

negativ: negative Kaninchenleber, lyophilisiert 9/02

Kontrollseren FLI

positiv: RHDV-Hyperimmunserum (A862) vom Kaninchen

negativ: Normalserum (F136) vom Kaninchen

POD-konjugiertes anti-Kaninchen-Ig Sigma

POD-konjugiertes anti-Maus-IgG Sigma

9.1.8 Puffer, Lösungen, Nährmedien und Wasser

Alle Puffer und Lösungen für die Verwendung mit RNA wurden mit RNase-freiem Wasser

hergestellt und sofern möglich autoklaviert. Soweit nicht anders erwähnt wurden die

verwendeten Chemikalien von den Firmen Roth, Merck, Serva und Sigma bezogen.

9.1.8.1 RNA-Isolierung, PCR

Erythrozytenlysispuffer

8,29 g/l NH4Cl

1 g/l KHCO3

1mM EDTA

Ethanol 70 %, 75 %

70 bzw. 75 ml Ethanol (100%)

ad 100 ml A. bidest

RNase-freies Wasser

A. bidest

0,1 % DEPC Sigma

schütteln, über Nacht stehen lassen, autoklavieren

Material

139

RNA safe buffer

50 ng/µl Carrier polyA-RNA Amersham Bisosciences

0,05 % Tween 20

0,05 % Natriumazid, Lagerung - 20 °C

Salzlösung, hochkonzentriert

0,8 M Natriumcitrat

1,2 M Natriumchlorid

10mM Tris-HCl pH 8

9.1.8.2 Klonierung und in vitro-Transkription

EDTA 0,5 M

Essigsäure 100 %

Ethanol 75 %

LB-Medium

20 g LB BROTH BASE Invitrogen

ad 1 l A. bidest, autoklavieren

Lithiumchlorid 4 M

Lösung I

50 mM Glukose

25 mM Tris-HCl pH 8

10 mM EDTA pH 8

Lösung II

0,2 N NaOH

1 % SDS (20 %)

Lösung III

3 M Kaliumacetat pH 4,8

Natriumacetat 3 M (pH 7,2)

Natriumcarbonatpuffer (pH 10,2)

ANHANG

140

Ribomax Puffer (5x)

für SP6-Sonde: für T7-Sonde:

100 µl 100 µl Hepes-KOH 1 M (pH 7,5) Sigma

20 µl 15 µl MgCl2 1 M Merck

2,5 µl 2,5 µl Spermidin Sigma

50 µl 50 µl DTT 1 M Merck

ad 250 µl ad 250 µl RNase-freies Wasser

RNase A-haltiges Wasser (mit 20 mg/ml RNase A)

1, 3 ml A. bidest

1 µl RNase A

9.1.8.3 Agarosegelelektrophorese, Membrantransfer von RNA

blocking reagent 10 %

10 g blocking reagent Roche

ad 100 ml Maleinpuffer, autoklavieren, Lagerung - 20 °C

blocking solution

5 ml blocking reagent 10 % (= 1 %) Roche

1 ml Tween 20, 10 % (= 0,2 %) Serva

ad 50 ml Maleinpuffer, frisch herstellen

Blot-Puffer (0,05 N NaOH)

aus 1 N NaOH 1:20 verdünnen

Denhard´s (50x)

5 g Ficoll Sigma

5 g Polyvinylpyrrolidon Sigma

5 g BSA Sigma

ad 500 ml RNase-freies Wasser, sterilfiltrieren, Lagerung - 20 °C

DNA-Probenpuffer

40 % (w/v) Saccharose

1 mM EDTA

0,4 % (w/v) Bromphenolblau Sigma

0,4 % (w/v) Xylencyanol Merck

Material

141

Ethidiumbromid-Lösung

5 ml Ammoniumacetat 4 M (= 0,1 M)

20µl Ethidiumbromidlösung 1 % (= 1 µg/µl) Roth

ad 200 ml RNase-freies Wasser

Formamid, deionisiert

280 ml Formamid Merck

AG-501-X8-Resin Bio-Rad

zugeben, bis keine Orangefärbung mehr; 5 h rühren, filtrieren, Lagerung - 20 °C

Maleinpuffer

11,608 g Maleinsäure Sigma

8,766 g NaCl

ad 1 l RNase-freies Wasser, pH 7,5 einstellen, autoklavieren

MESA-Puffer (1x) Sigma

40 mM MOPS

10 mM Natriumacetat

1 mM EDTA

pH 8,3

NBT (75 mg/ml) Sigma

250 mg in 3,325 ml Dimethylformamid 70 % in A. bidest lösen, Lagerung 4 °C

Prähybridisationsmix

250 ml Formamid, deionisiert (= 50 % Formamid) Merck

100 ml SSC (2x) (= 4 x SSC)

20 ml Denhard´s (50x ) (= 2 x Denhard´s)

117 ml RNase-freies Wasser, Lagerung - 20 °C

Puffer 3 (pH 9,5)

12,1 g Tris (= 100 mM)

5,84 g NaCl (= 100 mM)

pH 9,5 einstellen

10, 16 g MgCl2 x 6 H2O (= 50 mM)

ad 1 l RNase-freies Wasser, sterilfiltrieren, Lagerung 4 °C

ANHANG

142

Puffer 4

5 ml Tris-HCl 1 M (= 10 mM)

1 ml EDTA 0,5 M (= 1 mM)

ad 500 ml RNase-freies Wasser, Lagerung 4 °C

RNA aus Kälberleber 10 mg/ml Sigma

50 mg in 5 ml RNase-freiem Wasser lösen, Lagerung - 70 °C

RNA-Denaturierungspuffer

500 µl Formamid, deionisiert

162 µl Formaldehyd 37 % Merck

100 µl MESA-Puffer (10x) Sigma

283 µl RNase-freies Wasser, frisch herstellen

RNA-Probenpuffer

50 % (w/v) Glycerin

0,4 % (w/v) Bromphenolblau Sigma

0,4 % (w/v) Xylencyanol Merck

2 mM Na2HPO4

8 mM KH2PO4

SDS 10 %

SSC (20x)

175,3 g NaCl (= 3 M)

88,2 g Natriumcitrat x 2 H20 (= 0,3 M)

800 ml RNase-freies Wasser

pH 7 einstellen, ad 1 l RNase-freies Wasser, autoklavieren

TAE

0,04 M Tris-acetat

0,001 M EDTA

Tween 20, 10 % in Maleinpuffer

10 g Tween 20 Serva

ad 100 ml Maleinpuffer

x-Phosphat (50 mg/ml) Sigma

100 mg in 2 ml Dimethylformamid konz. lösen, Lagerung - 20 °C

Material

143

9.1.8.4 ELISA

Antikörperverdünnungspuffer

PBST

5 % Pferdeserum

Beschichtungspuffer (pH 7,6)

0,02 M Tris

0,15 M NaCl

Carbonatpuffer (pH 9,6)

1,59 g Natriumcarbonat

2,93 g Natriumhydrogencarbonat

ad 1 l A. bidest

PBS

8 g NaCl

0,2 g KCl

1,15 g Na2HPO4 x 2 H2O

0,2 g KH2PO4

ad 1 l A. bidest

PBST

PBS

0,05 % Tween 20

Schwefelsäure, 4 M

Substratlösung für ELISA

4 mg OPD Sigma

ad 10 ml Substratpuffer [vor Gebrauch gemischt aus 2,43 ml Lösung A (0,1 M

Citronensäure), 2,57 ml Lösung B (0,2 M Na2HPO4 x 2 H2O) und 5 ml A.dest], 15 µl

H2O2 (30 %) frisch dazugeben

ANHANG

144

9.1.8.5 Zellkultur, Hämagglutinationstest, Viruskonzentrierung

DABCO-Puffer mit Propidiumiodid (pH 8,6)

10 ml PBS

2,5 g Diazobicyclooctan

100 µl Propidiumiodid Sigma

90 ml Glycerin

IP (pH 6, pH 7,2)

8,28 g NaCl

1,186 g Na2HPO4 x 2 H2O

0,2 g KH2PO4

ad 1 l A. bidest

TEN (pH 7,6)

2,42 g Tris

0,037 g EDTA

8,76 g NaCl

ad 1 l A. bidest

Zellkulturmedium ZB5 (pH 7,2) FLI

5,32 g MEM Hanks Sigma

4,76 g MEM Earle GIBCO

1,52 g NaHCO3 Roth

0,12 g Natriumpyruvat Fluka

10 ml NEAS Biochrom

100 ml FKS (=10 %)

ad 1 l A. bidest

9.1.8.6 Histologie, Immunhistologie, In situ-Hybridisierung

CaCl2 0,1 M

1,47 g ad 100 ml RNase-freies Wasser, autoklavieren

Dextransulfat 100 % Sigma

250 mg in 250 µl RNase-freiem Wasser lösen bei 50 °C

Ethanol 100 %, 95 %, 75 %, 70 %

Material

145

Formalin 4 %

HCl 5 M


50 ml HCl 37 %

HCl 0,2 M


2 ml HCl 5 M

Lösung von Acetanhydrid in Triethanolamin

745 mg Triethanolamin Merck

ad 50 ml RNase-freies Wasser, pH 7,5 einstellen

125 µl Acetanhydrid Sigma

frisch herstellen

Lösung zur RNase-Behandlung

8,3 ml NaCl 3 M (=0,5 M)

500 µl Tris 1 M pH 8 (= 10 mM)

100 µl EDTA 0,5 M pH 8 (= 1 mM)

10 µl DNase-freie RNase (500 µg/ml) Roche

10 µl RNase T1 aus Aspergillus oryzae (500000 U/ml) Roche

ad 50 ml RNase-freies Wasser, frisch herstellen

Maleinpuffer/0,2 % Tween 20

2 ml Tween 20, 10 % Serva

ad 100 ml Maleinpuffer, frisch herstellen

NaCl 3 M

17,53 g NaCl

ad 100 ml RNase-freies Wasser, autoklavieren

NaOH 10 M

10 g NaOH-Plätzchen

ad 25 ml RNase-freies Wasser

Paraformaldehyd 4 % Merck

10 g Paraformaldehyd zu 200 ml PBS (60°C), pH 7,35 - 7,4 einstellen mit NaOH 2 M,

ad 250 ml PBS

ANHANG

146

PBS (10x)

40 g NaCl

1 g KCl

7,2 g Na2HPO4 x 2 H2O

1,2 g KH2PO4

ad 500 ml RNase-freies Wasser; für PBS (1x): 1:10 verdünnen aus 10 x PBS, pH 7,4

einstellen, autoklavieren

Proteinase K-Puffer

2,5 ml Tris 1 M pH 8 (=50 mM)

0,75 ml CaCl2 0,1 M (=1,5 mM)

ad 50 ml RNase-freies Wasser, frisch herstellen

TBS (pH 7,4)

50 mM Tris

200 mM NaCl

Tris 1 M pH 8

60,57 g Tris

400 ml A. bidest

pH 8 einstellen, ad 500 ml A. bidest, autoklavieren

Weitere Puffer und Lösungen, die für die In situ-Hybridisierung gebraucht werden, sind in

9.1.8.3 aufgeführt.

9.1.9 Sonstige Reagentien

AEC-Substrat Dako

Agarose Eurogentec

Ampicillin Sigma

Aquatex® Merck

ATV FLI

ß-Mercaptoethanol Merck

BSA (100x) NEW ENGLAND BioLabs®

Chloroform Roth

DIG-RNA Labeling Mix Roche

Geräte und Gebrauchsgegenstände

147

dNTP mix Promega

Ethanol (100%) Roth

Ethidiumbromidlösung 1 % Roth

Formaldehyd 37 % Merck

Glycergel® Dako

IPTG Sigma

Isopropanol Roth

Levamisol Sigma

MgCl2 Promega

Mineralöl Sigma

Phenol/Chloroform/Isomamylalkohol (25:24:1) Roth

Polyethylenglykol 6000 Sigma

rekombinante Bakulovirusvakzine FLI

RIKA-VACC Riemser Arzneimittel AG

ROX Reference Dye Invitrogen

Saccharose Sigma

TRIzol®Reagent Invitrogen

x-Gal Sigma

Xylol Roth

9.2 Geräte und Gebrauchsgegenstände

Analysenwaage SBA41 SCALTEC Gesellschaft für Laborbedarf mbH

Bakterienschüttler New Brunswick Scientific

Brutschränke

für Bakterien VEB MLW Medizinische Geräte

für Zellen, CO2-begast Heraeus Instruments

Elektrophoresesystem Bio-Rad

Elektroporator GenePulser Xcell™ Bio-Rad

Exsikkator Kartell®

Hybridisierungsofen, Rollerröhren MWG Biotech AG, Hybaid

Magnetrührer IKAMAG®RH Janke&Kunkel, IKA®-Labortechnik

ANHANG

148

Mikroskope

Lichtmikrokop TMS-F Nikon

UV-Mikroskop IX51 Olympus

Neubauer-Zählkammer OptikLabor

Photometer

DU®640 Spectrophotometer Beckman

Spectra Mini Photometer Tecan

Pipetten eppendorf

Pipettierhilfe pipetus®-akku Hirschmann Laborgeräte

Sequenzierautomat LI-Cor DNA-Analyzer GENE READER 4200 MWG Biotech AG

Sterilbank Uniflow UVUB 1200 Biohazard Uniequip GmbH

Thermocenter salvisLAB by Renggli

Thermocycler

MiniCycler™ Biozym

Mx3000P™ Real-Time PCR System Stratagene

Primus 96plus MWG Biotech AG

Thermomixer 5436 eppendorf

Tissue Lyser Qiagen

Transilluminator UVT-28 M Herolab

UV-Bestrahlungsbox DNA/RNA UV-CLEANER UVC/T

Vortexer Janke&Kunkel, IKA®-Labortechnik

Wasserbad IKA® TER 2 Janke&Kunkel, IKA®-Labortechnik

Zentrifugen

J2-HS Centrifuge Beckman

Kühlzentrifuge UNIVERSAL 30 RF Hettich

Megafuge 1.0R Heraeus

Tischzentrifuge Centrifuge 5415C eppendorf

Ultrazentrifuge Coulter Optima™ LE-80K Ultracentrifuge Beckman

Verbrauchsmaterialien

149

9.3 Verbrauchsmaterialien

Ampicillin-Selektionsagarplatten

32 g LB Agar Invitrogen

ad 1 l A. bidest, 121 °C 15 min, nach dem Abkühlen auf 56 °C 1,5 µl/ml Ampicillin

(50 mg/ml) zugeben

EDTA-Röhrchen Sarstedt

Einfrierröhrchen greiner

Einmalbesteck Braun, Aesculap AG & CO. KG

Elektroporationsküvetten (4 mm) peqlab Biotechnologie GmbH

Gel-Blotting-Papier Schleicher&Schuell

Gewebekulturflaschen, -platten costar®

Kanülen Braun

Microtainer-Röhrchen Becton Dickinson

Mikrotiterplatten

Maxi Sorp™ microtitre plates nunc™

PS microplate 96 well greiner

U-Form greiner

Nylon membranes, positively charged Roche

Objektträger SuperFrost® Plus microscope slides Menzel

Reaktionsgefäße (0,2 ml, 0,5 ml, 1,5 ml, 2 ml) eppendorf

Spritzen Dispomed Witt oHG

Stainless Steel Beads (5 mm) Qiagen

Sterilfilter Millipore

Zentrifugenröhrchen Sarstedt, greiner

96well-Platten für PCR: Thermo-Fast® 96, Non Skirted; mit Ultra Clear Cap Strips

ABgene®

ANHANG

150

9.4 Software

analySIS® labFlow 5.0 Soft Imaging System GmbH

Beacon Designer 2.06 PremierBiosoft International

BLASTn National Center for Biotechnology Information

easyWIN screening V6.0a TECAN

Mx3000P v2.00 Stratagene

Wisconsin Package Version 10.2 GCG

9.5 Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Beispiel der Berechnung über die Standardkurven-Methode zur relativen

Quantifizierung. ......................................................................................................... 38

Tabelle 2: Beispiel der Berechnung über die 2-∆∆Ct-Methode zur relativen Quantifizierung... 38

Tabelle 3: Übersicht über häufig verwendete Reporterfarbstoffe und Quencher. Bei

Quenchern ohne Angabe der Emissionswellenlänge handelt es sich um nicht-

fluoreszierende Quencher, d.h. sie emittieren die aufgenommene Energie in Form

von Wärme................................................................................................................. 39

Tabelle 4: Spezifität der real-time RT-PCR............................................................................. 81

Tabelle 5: Virusstämme, die für diese Arbeit verwendet wurden. n.d. not determined......... 135

Tabelle 6: Primer und Sonden, die für diese Arbeit verwendet wurden. ............................... 136

9.6 Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Genom des RHDV. An die 5´NTR schließen sich die codierenden Bereiche für

die Nichtstrukturproteine (hellgrau) und die beiden Strukturproteine, das VP60 und

das VP10 (dunkelgrau), an (modif. nach MEYERS et al. (2000)). ........................... 14

Abbildung 2: Das FRET-Prinzip. F1 und F2 sind die beiden beteiligten Fluorochrome, die

auch als Reporter/Donor und Quencher/Akzeptor bezeichnet werden. Sie haben die

Anregungswellenlängen A1 und A2 sowie die Emissionswellenlängen E1 und E2. In

den Diagrammen ist die Emission (als Fluoreszenzstärke R) gegen die Wellenlänge

aufgetragen................................................................................................................. 24

Software, Tabellenverzeichnis, Abbildungsverzeichnis

151

Abbildung 3: Funktionsprinzip der interkalierenden Farbstoffe. (a) Denaturierung. (b)

Annealing (dt. Anlagerung). (c) Elongation. Es ist jeweils nur der rev-Strang sowie

der for-Primer (Pfeil) gezeigt. Der in die doppelsträngige DNA interkalierende

Farbstoff ist grün dargestellt. ..................................................................................... 26

Abbildung 4: Schmelzkurvenanalyse mit SYBR®Green I. Die normalisierte Fluoreszenzstärke

ist in (a) als Rn und in (b) als -Rn (T), jeweils gegen die Temperatur in °C,

aufgetragen. Die schwarzen Kurven gehen auf spezifische PCR-Produkte zurück.

Die graue Kurve repräsentiert die negative Kontrolle (engl. no template control,

NTC), bei der Primerdimere detektiert werden. Diese lassen sich durch die geringere

Schmelztemperatur von spezifischen Produkten differenzieren. Es wurde eine log10-

Verdünnungsreihe von RHDV-RNA als template eingesetzt.................................... 28

Abbildung 5: Funktionsprinzip der FRET-Sonden (a), TaqMan®-Sonden (b), minor groove

binder (MGB)-Sonden (c) und molecular beacons (d). Es ist jeweils nur der rev-

Strang sowie der for-Primer (Pfeil) gezeigt. Das obere Bild zeigt jeweils die

Denaturierungsphase, das mittlere die Annealing- und das untere die

Elongationsphase. Die Sonden tragen ein Donormolekül „D“ und ein

Akzeptormolekül „A“ bzw. den Reporterfarbstoff „R“ sowie einen Quencher „Q“.

„MGB“ steht für den minor groove binder. .............................................................. 31

Abbildung 6: Funktionsprinzip eines Scorpions™. (a) Annealing/Elongation. (b)

Denaturierung. (c) Annealing. Es ist in (a) und (b) jeweils nur ein Strang sowie der

Scorpion™ mit der sequenzspezifischen Primerstruktur (Pfeil) gezeigt. Beim zweiten

Annealing-Schritt (c) ist nur noch der von der Taq-Polymerase synthetisierte Strang

dargestellt. Die Sonde trägt einen Reporterfarbstoff „R“ sowie einen Quencher „Q“.

„Stop“ steht für das Hexethylen-Glykol, das die Synthese eines zur

Haarnadelstruktur komplementären Strangs verhindert. ........................................... 33

ANHANG

152

Abbildung 7: Amplifikationsgrafik. In diesem Fall ist die normalisierte und Basislinien-

korrigierte Fluoreszenzstärke (dRn) gegen die Zyklenzahl aufgetragen. Die schwarze

Linie stellt den Fluoreszenzschwellenwert (engl. threshold) dar. Der Schnittpunkt

zwischen Amplifikationsgraph und Fluoreszenzschwellenwert, projiziert auf die x-

Achse, markiert den Ct-Wert (engl. threshold cycle). Es wurden 4 Standards (gefüllte

Kästchen), eine unbekannte Probe (nicht gefüllte Kästchen) und eine negative

Kontrolle, bei der kein Anstieg der Fluoreszenz zu verzeichnen war, eingesetzt. .... 34

Abbildung 8: Standardkurve und tabellarische Darstellung der Ergebnisse bei der absoluten

Quantifizierung. Für die Standardkurve wird die Zyklenzahl gegen die initiale

Menge der Zielsequenz (als Kopienzahl auf der logarithmischen x-Achse)

aufgetragen. Es wurden 4 Standards (gefüllte Kästchen) und eine unbekannte Probe

(nicht gefüllte Kästchen) verwendet, die Amplifikationsgrafik ist in der Abbildung 7

dargestellt. .................................................................................................................. 36

Abbildung 9: Alignment und Consensus-Sequenz von 27 RHDV VP60-Gensequenzen in der

Primer/Sonden-Region. Der „single letter code of nucleotides“ wurde verwendet.

Die grauen Kästen repräsentieren die von den Primern bzw. der Sonde umfassten

Regionen. Striche stehen für identische Nukleotide, während „wobble“-Nukleotide

in Fettschrift hervorgehoben sind. ............................................................................. 72

Abbildung 10: Analytische Sensitivität und dynamischer Bereich der real-time RT-PCR für

RHDV. Die Amplifikationsgraphen (a) und die Standardkurve (b), die nach

Amplifizierung einer log10-Verdünnungsreihe von 1010 bis 101 Molekülen PC RNA

erhalten wurden, sind dargestellt. .............................................................................. 75

Abbildung 11: Sensitivität des single und multiplex real-time RT-PCR assays. (a) zeigt die

Amplifikationsgraphen für FAM, die durch die Amplifizierung der RHDV-RNA

zustande kommen. (b) stellt die Amplifikationsgraphen für HEX dar, die die

Amplifizierung der IC repräsentieren. Schwarze Linien stehen jeweils für den

multiplex assay und graue Linien für den single assay. Es wurde eine log10-

Verdünnungsreihe von RHDV-RNA mit den Verdünnungsstufen von 10-5 bis 10-10

als template eingesetzt. .............................................................................................. 76

Abbildungsverzeichnis

153

Abbildung 12: Sensitivität der real-time RT-PCR im Vergleich zur konventionellen RT-PCR.

(a) zeigt die Ergebnisse für den Subtyp „RHDV Eisenhüttenstadt“ und (b) für

„RHDV Triptis“. Für die konventionelle RT-PCR wurde eine log10-

Verdünnungsreihe ausgehend von unverdünnter RNA als template eingesetzt,

während für die real-time RT-PCR nur die Verdünnungsstufen ab 10-5 verwendet

wurden. Zunächst wurde die konventionelle RT-PCR mit 30 Zyklen durchgeführt

(nur für „RHDV Eisenhüttenstadt“, linkes Agarosegel in (a)). In einem zweiten

Ansatz wurde die Anzahl der Zyklen auf 40 erhöht und RNA beider Subtypen

verwendet................................................................................................................... 78

Abbildung 13: Sensitivität der real-time RT-PCR im Vergleich zum Antigen-ELISA. (a) zeigt

die Ergebnisse für den Subtyp „RHDV Eisenhüttenstadt“ und (b) für „RHDV

Triptis“. Die Balken stellen die in der real-time RT-PCR erhaltenen Ergebnisse in

Kopien/Reaktion dar. Die schwarze Linie repräsentiert die Titration im Antigen-

ELISA, wobei die für die einzelnen Verdünnungsstufen erhaltenen ELISA-indices

als Punkte dargestellt sind. Die Achsen für die ELISA-indices unterscheiden sich, da

„RHDV Triptis“ nur mit einem der 4 zur Detektion verwendeten mAKs reagiert, so

daß die ELISA-indices insgesamt geringer ausfallen. Es wurde eine log4-

Verdünnungsreihe ausgehend von 10 % Leberhomogenaten resp. die daraus

extrahierte RNA verwendet. ...................................................................................... 80

Abbildung 14: Körpertemperatur der überlebenden Kaninchen nach experimenteller Infektion

mit RHDV. Die Daten wurden von der Riemser Arzneimittel AG zu Verfügung

gestellt. ....................................................................................................................... 82

ANHANG

154

Abbildung 15: Detektion von RHDV-Antigen bzw. RHDV-RNA in der Leber eines an akuter

RHD verstorbenen Kaninchens und eines rekonvaleszenten Tieres. Der

Antigennachweis erfolgte mittels Immunhistologie (oben). Die In situ-

Hybridisierung zum Nachweis viraler RNA wurde mit einer sequenzspezifischen T7-

Sonde durchgeführt (unten). Zur Kontrolle wurde die entsprechende SP6-Sonde

verwendet, die kein Signal erzeugte (kleine Abbildung in (c)). Es handelt sich in (a)

und (c) um eine als positive Kontrolle mitgeführte Leber eines an akuter RHD

verstorbenen Tieres, bei der jeweils eine spezifische Anfärbung der Hepatozyten

(Pfeile) festgestellt wurde. In (b) und (d) ist exemplarisch das Ergebnis für das Tier

Nr. 670 gezeigt, hier konnte 5 Wochen p.i. weder RHDV-Antigen noch RHDV-RNA

in der Leber detektiert werden. Maßstabsbalken = 100 µm. ..................................... 83

Abbildung 16: Antikörper-Status der infizierten Tiere (Nr. 685, 670, 679, 697, 718) und der

nicht infizierten Kontrolltiere (Nr. 1 - 3) 5 Wochen p.i............................................. 84

Abbildung 17: Virusgenomlast in den Leukozyten rekonvaleszenter Tiere. Die Bestimmung

der Virusgenomlast erfolgte wöchentlich, beginnend mit der Woche 4 p.i., bis das

jeweilige Tier getötet und der Sektion zugeführt wurde. In den Wochen 11-14 p.i.

wurden keine Daten erhoben. .................................................................................... 85

Abbildung 18: Virusgenomlast in den Organen, Exkreten und Leukozyten rekonvaleszenter

Tiere. Es sind die Virusgenomlasten der einzelnen Proben zum Zeitpunkt von 5

Wochen p.i. (a), 7 Wochen p.i. (b) und 15 Wochen p.i. (c) dargestellt. .................... 86

Abbildung 19: Northern Blot (rechts) zum Nachweis von RHDV-RNA in der Leber des

Tieres Nr. 685 und vorangegangene Formaldehyd-Agarosegelelektrophorese (links).

Die Proben wurden wie folgt aufgetragen: Marker M: 0,24 - 9,5 kb RNA Leiter. Spur

1: positive Kontrolle, 4,94 x 1011 Kopien RHDV-RNA, 224 nt. Spur 2: positive

Kontrolle, 1,78 x 1013 Kopien RHDV-RNA, 224 nt. Spur 3: weitere, in diesem Falle

irrelevante, Probe. Spur 4: konzentrierte RNA aus der Leber des Tieres Nr. 685, 1,5

x 1010 Kopien RHDV-RNA. ...................................................................................... 87

Abkürzungsverzeichnis

155

Abbildung 20: Antikörperbildung nach der Immunisierung mit RIKA-VACC und einer

rekombinanten Bakulovirusvakzine. In grau dargestellt sind die Ergebnisse für die

Tiere, die mit RIKA-VACC immunisiert wurden. Die schwarzen Linien stehen für

die Tiere, die eine rekombinante Bakulovirusvakzine in einer 1:64-Verdünnung

erhielten...................................................................................................................... 89

Abbildung 21: Virusgenomlast in Organen und Gallenflüssigkeit immunisierter Tiere nach

der challenge-Infektion. (a) zeigt die Virusgenomlast bei Tieren, die RIKA-VACC

erhielten, und (b) die Virusgenomlast bei Tieren, die mit der rekombinanten

Bakulovirusvakzine immunisiert wurden. Es sind die Virusgenomlasten der

einzelnen Proben zum Zeitpunkt von 9, 11, 13 und 15 Wochen p.i. dargestellt. ...... 90

Abbildung 22: Virusgenomlast in RLI-R-Zellen und Zellkulturüberständen nach der Infektion

mit RHDV.................................................................................................................. 91

Abbildung 23: Virusgenomlast in RLI-R-Zellen und Zellkulturüberständen nach der

Transfektion mit RHDV-RNA................................................................................... 92

Abbildung 24: Nachweis von RHDV-Antigen in RLI-R-Zellen nach der Transfektion mit

RHDV-RNA. Mittels des indirekten Immunfluoreszenztestes wurden die

Virusreplikation nach 2 h (a), 24 h (b), 48 h (c) und 72 h (d) überprüft. Für RHDV-

Antigen positive RLI-R-Zellen erscheinen grün, während die Zellkerne rot angefärbt

sind. Maßstabsbalken = 500 µm. ............................................................................... 93

9.7 Abkürzungsverzeichnis

Å Angstrom

A. bidest aqua bidestillata, destilliertes Wasser

AEC 3-Amino-9-Ethylcarbazol

AMV Aviäre Myeloblastose-Virus

AP alkalische Phosphatase

ATCC American Type Culture Collection

ATV Alfevers Trypsine Versene, Trypsin

BFAV Bundesforschungsanstalt für Viruskrankheiten

BHQ black hole quencher

bp base pairs, Basenpaare

BSA bovines Serumalbumin

ANHANG

156

(c)DNA (copy) desoxyribonucleic acid, (komplementäre) Desoxyribonukleinsäure

CLP core like particle

Ct threshold cycle

d Tag(e)

DABCO Diazobicyclooctan

Dabcyl 4-(4´-Dimethylaminophenylazo)-Benzoesäure

DEPC Diethylpyrocarbonat

DIG Digoxigenin

DMSO Dimethylsulfoxid

dNTP desoxy-Nukleosidtriphosphate

DTT Dithiothreitol

EBHSV European Brown Hare Syndrome Virus

EDTA Ethylendiamintetraacetat

EGFP enhanced green fluorescent protein

ELISA enzyme linked immunosorbent assay, Enzym-gekoppelter Immuntest

E. coli Escherichia coli

Fab Antigen-bindendes Fragment eines Antikörpers

FAM 6-Carboxyfluorescein

FCV Felines Calicivirus

FITC Fluoreszeinisothiocyanat

FLI Friedrich-Loeffler-Institut

for forward

FRET Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer

g Gramm, Erdbeschleunigung

GADPH Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase

GCG Genetics Computer Group

h Stunde(n)

HA/HAE Hämagglutination/hämagglutinierende Einheit

HE Haematoxylin und Eosin

HEX Hexachloro-6-carboxyfluorescein

Hz Hertz


157

IC internal control, interne Kontrolle

Ig(G, M) Immunglobulin (G, M)

i.m. intramuskulär

IPTG Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranosid

kDa Kilodalton

l Liter

LB Luria-Bertani

LED Licht emittierende Diode

log Logarithmus

LUX Light Upon eXtension

(m)M (milli)molar, (milli)mol/l

mak monoklonaler Antikörper

MESA 3-(N-morpholino)propansulfonsäure (MOPS)-EDTA-Sodium-Acetat

mg Milligramm

MGB minor groove binder

min Minute(n)

ml Milliliter

mm Millimeter

MOPS 3-(N-morpholino)propansulfonsäure

(m)RNA (messenger) ribonucleic acid, (Boten-) Ribonukleinsäure

µl Mikroliter

µm Mikrometer

NBT Nitro Blue Tetrazolium

nm Nanometer

nt Nukleotid(e)

NTC no template control, negative Kontrolle

NTPase Nukleosidtriphosphatase

NTR non translated region, nicht-translatierte Region

OIE Office International des Épizooties, internationales Tierseuchenamt

OPD o-Phenylenediamin

ORF open reading frame, offener Leserahmen

ANHANG

158

Ω Ohm

PBS phosphate buffered saline, Phosphat gepufferte Salzlösung

PC positive control, positive Kontrolle

p.i. post infectionem, nach Infektion

pmol Picomol

POD Peroxidase

Pol Polymerase

Pro Protease

p.v. post vaccinationem, nach Vakzinierung

RCV Rabbit Calicivirus

rev reverse

RHD(V) Rabbit Haemorrhagic Disease (Virus)

RLI-R rabbit liver immortalized

RNase Ribonuklease

ROX 5-Carboxy-X-Rhodamin

rpm rounds per minute, Umdrehungen/Minute

RSq Korrelationskoeffizient

RT reverse transcriptase, Reverse Transkriptase, reverse transcription, Reverse

Transkription, Raumtemperatur

(RT-) PCR (reverse transcriptase-) polymerase chain reaction, (Reverse Transkriptase-)

Polymerasekettenreaktion

s Sekunde(n)

SDS sodiumdodecylsulfate, Sodiumdodecylsulfat

SNP single nucleotide polymorphism, Punktmutation

s-RHDV smooth RHDV

SSC sodiumchlorid sodiumcitrate, Natriumchlorid und Natriumcitrat

TAE Tris-Acetat-EDTA

TAMRA Tetramethyl-6-Carboxyrhodamin

Taq Thermus aquaticus

TBS tris buffered saline, Tris-gepufferte Salzlösung

TEN Tris-EDTA-Natriumchlorid


159

u units, Enzymeinheit

unverd. unverdünnt

UV ultraviolett

V Volt

VESV Vesicular exanthema of swine virus

VLP virus like particle

Vpg virales Protein, genomassoziiert

VP60/VP10 Strukturproteine des RHDV (60 kDa/10kDa)

w/v weight/volume, Gewicht/Volumen

x-Gal 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-galactopyranosid

x-Phosphat 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphat

161

Tagungsbeiträge auf wissenschaftlichen Kongressen:

GALL, A., HOFFMANN, B., TEIFKE, J. P., LANGE, B. u. SCHIRRMEIER, H. (2005):

Viral load in rabbits that overcome Rabbit Haemorrhagic Disease Virus infection.

Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie, Hannover, 16. - 19. März 2005

HEßMANN, M., GALL, A., WEGE, H., SCHIRRMEIER, H. u. KÖLLNER, B. (2005):

Rabbit hemorrhagic disease (RHD) a model for fulminate liver failure (FLF) syndrom? –

A study on possible immunopathogenesis of RHD.

Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie, Hannover, 16. - 19. März 2005

Folgende Teile dieser Arbeit wurden zur Publikation eingereicht:

GALL, A., HOFFMANN, B., TEIFKE, J. P., LANGE, B. u. SCHIRRMEIER, H. (2005):

Persistence of viral RNA in rabbits which overcome an experimental RHDV infection

detected by a highly sensitive multiplex real-time RT-PCR.

Vet. Microbiol. (submitted)

GALL, A. u. SCHIRRMEIER, H. (2006):

Persistence of rabbit haemorrhagic disease virus genome in vaccinated rabbits after

experimental infection.

J. Vet. Med. B (submitted)

163

Danksagung

Die vorliegende Arbeit wurde unter der Anleitung von Herrn Dr. med. vet. H. Schirrmeier

angefertigt. Ihm danke ich für die Überlassung des interessanten Themas, die kompetente

Betreuung und ganz besonders für das gute Arbeitsklima sowie seine Menschlichkeit.

Herrn PD Dr. med. vet. M. Beer und Frau Prof. Dr. med. vet. B. Grummer danke ich für die

Unterstützung und die wissenschaftliche Betreuung dieser Arbeit.

Herrn Prof. Dr. rer. nat. T. C. Mettenleiter danke ich für die Möglichkeit der Anfertigung

dieser Dissertation am Friedrich-Loeffler-Institut, Insel Riems.

Herrn Dr. med. vet. B. Hoffmann danke ich für sein Engagement und die konstruktiven

Diskussionen.

Herrn Dr. med. vet. B. Lange, Riemser Arzneimittel AG, danke ich für die gute

Zusammenarbeit.

Den Mitarbeitern des Friedrich-Loeffler-Instituts danke ich für die freundliche Aufnahme.

Insbesondere danke ich Frau H. Wege und Frau B. Meinke für die jederzeit gewährte

Hilfestellung bei der praktischen Arbeit und den Doktoranden für die vielen heiteren

Momente.

Meiner Familie und meinen Freunden danke ich für die moralische Unterstützung und das

entgegengebrachte Verständnis.

Dem Impfstoffwerk Dessau-Tornau GmbH danke ich für die finanzielle Förderung der Arbeit.

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