dissertação mestrado richard murdoch...
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RICHARD MURDOCH MONTGOMERY
ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO DA EXPRESSÃO DE EGFR, p53, IDH-1 E MDM2 EM GLIOBLASTOMAS E SUA RELAÇÃO COM
PROGNÓSTICO E RESPOSTA TERAPÊUTICA
CAMPINAS
2014
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Ciências Médicas
RICHARD MURDOCH MONTGOMERY
ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO DA EXPRESSÃO DE EGFR, p53, IDH-1 E MDM2 EM GLIOBLASTOMAS E SUA RELAÇÃO COM PROGNÓSTICO E
RESPOSTA TERAPÊUTICA
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Ciências.
ORIENTADOR: PROF DR. FABIO ROGERIO COORIENTADOR: PROF. DR. ROGER FRIGÉRIO CASTILHO ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO RICHARD MURDOCH MONTGOMERY, E ORIENTADO PELO PROF. DR. FABIO ROGERIO.
CAMPINAS
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RESUMO
Glioblastoma multiforme (GBM) é o tumor cerebral primário mais frequente. Cerca de
90% dos GBMs são classificados como primários. Tais lesões acometem principalmente
idosos, têm rápida evolução e não apresentam evidências de lesão precursora. Por outro
lado, GBMs secundários acometem indivíduos mais jovens e progridem lentamente a
partir de astrocitoma difuso de menor grau. As alterações moleculares apresentadas pelos
tumores astrocitários são várias e seu conhecimento é importante para o melhor
entendimento da fisiopatogênese e possível aferição prognóstica. Neste trabalho,
investigamos a prevalência de casos de GBM tratados no Hospital de Clínicas da
Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas, entre janeiro de
2008 e dezembro de 2012, com informações clínico-radiológicas completas disponíveis
(n=36), e descrevemos as características clínicas e histológicas. Ainda, classificamos a
distribuição tecidual dos seguintes marcadores biológicos através de imunoistoquímica:
forma selvagem do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), formas
mutantes da proteína p53 e isocitrato desidrogenase 1 (IDH-1) e a proteína murina 2
(MDM2). Correlacionamos achados morfológicos e imunoistoquímicos com dados da
evolução clínica e resposta ao tratamento com cirurgia, quimioterapia com
Temozolamida e radioterapia. Observamos que a localização predominante do tumor foi
o lobo frontal, sendo cerca de 97% dos casos primários. Em média, o tempo livre de
doença clinica ou sintomática foi de 7,56 meses e, o tempo livre de doença radiológica
(TLDR), de 7,14 meses. A média do número de figuras de mitose / 10 campos de grande
aumento foi 3,9. A correlação entre a sobrevida total e as classes de imunomarcação para
p53, IDH-1, EGFR e MDM2 não foi significativa para nenhum dos marcadores.
Observou-se relação estatisticamente significativa entre p53 e MDM-2 (p-valor=0,00) e
entre EGFR e MDM2 (p-valor=0,04). Por outro lado, não foi detectada relação
estatisticamente significativa entre p53 e EGFR (p-valor=0,09). Quanto a correlação entre
classes de imunomarcação para p53, MDM2 e EGFR com a sobrevida clínica e com a
radiológica, a única relação estatisticamente significativa foi entre p53 e sobrevida clínica
(p-valor=0,02), sendo observado que quanto maior a classe de p53, menor a sobrevida
clínica. Não houve relação significativa entre imunomarcação para IDH-1, EGFR,
MDM2 e a sobrevida total clínica e radiológica. A correlação entre a expressão de
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MDM2 e do EGFR selvagem também foi positiva (p-valor=0,04). As correlações entre as
sobrevidas clínica, radiológica e total foram significativas (p-valor < 0,0001) e positivas,
ou seja, o aumento de uma sobrevida implica aumento de outra. As correlações do gênero
com as sobrevidas clínica, radiológica e total não foram significativas, assim como a
relação da marcação da p53, MDM2 e EGFR com número de mitose e extensão de
ressecção tumoral. Quanto à correlação das sobrevidas clínica, radiológica e total com a
localização do tumor e a idade, não foram encontradas diferenças estatisticamente
significativas em nenhuma das sobrevidas. Nossos resultados clínicos e morfológicos
refletem parcialmente alguns dados da literatura. Especificamente, o fato de termos
detectado correlação significativa apenas entre a marcação para p53 e sobrevida clínica
pode ser decorrente da limitada amostragem disponível para avaliação.
Palavras-chave: Astrocitoma, Patologia, Neurocirurgia, Marcadores biológicos.
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ABSTRACT
Glioblastoma (GBM) is the most common primary brain tumor. About 90 % of GBMs
are classified as primary. Such lesions occur mostly in the elderly, evolve rapidly and
show no evidence of precursor lesions. However, secondary GBMs affect younger
individuals and progress slowly from lower grade diffuse astrocytomas. Molecular
alterations in astrocytic tumors are diverse and their knowledge is important to
understand the pathophysiology and prognosis of patients with GBM. Here we
investigated the prevalence of GBM treated at the Hospital of the Faculty of Medical
Sciences, State University of Campinas, from January 2008 to December 2012, with
complete radiological and outcome information available (n = 36), and described the
clinical and histopathological findings. Furthermore, we immunohistochemically
classified the tissue distribution of four biomarkers: wild form of the epidermal growth
factor receptor (EGFR), mutated forms of p53 protein and isocitrate dehydrogenase 1
(IDH-1) and murine protein 2 (MDM2). Morphological and immunohistochemical
findings were correlated with data from the clinical course and response to treatment with
surgery, chemotherapy and radiotherapy. We observed that the most common location of
the tumor was the frontal lobe and about 97 % of cases were primary. On average, time
free from clinical or symptomatic disease was 7.56 months and the free time of
radiological disease (TLDR) was 7.14 months. The average number of mitotic figures/10
high power fields was 3.9. The correlation between overall survival and classes of p53,
IDH- 1, MDM2 and EGFR immunostaining was not significant for any of the markers.
There was a statistically significant relationship between p53 and MDM2 (p-value =
0.01) and between EGFR and MDM2 (p-value = 0.04). On the other hand, no significant
relationship was detected between p53 and EGFR (p=0.09). Concerning the correlations
between classes of immunostaining for p53, MDM2 and EGFR with clinical and
radiological survival, the only significant relation was between p53 and clinical survival
(p-value = 0.02), with the higher class of p53, the poorer the clinical survival. There was
no significant relationship between immunostaining for IDH-1, EGFR, MDM2 and the
total clinical and radiological survival. The correlation between the expression of MDM2
and wild type EGFR was also positive (p-value = 0.04). The correlations between
clinical, radiological and overall survival were significant (p-value <0.0001) and positive,
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ie, an increase in one implies an increase in mean survival of another. The correlations of
gender with clinical, radiological and overall survival were not significant, as the ratio of
labeling of p53, MDM2 and EGFR with number of mitosis and extent of tumor resection.
The correlations of clinical, radiological, and total survival with tumor location and age
were not statistically significant. Our clinical and morphological results partially
corroborate previous data by other authors. Specifically, we detected a significant
correlation between staining for p53 and clinical survival only. The other correlations,
expected to be positive but detected as negative, may be due to the limited sample
available for analyses.
Key words: Astrocytoma, Pathology, Neurosurgery, Biological markers.
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SUMÁRIO
RESUMO .........................................................................................................................vii
ABSTRACT ......................................................................................................................ix
AGRADECIMENTOS ..................................................................................................xiii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ....................................................................xv
1. INTRODUÇÃO ...........................................................................................................01
1.1. Definições e epidemiologia ........................................................................................01
1.2. Alterações moleculares em gliomas ...........................................................................03
1.2.1. Fator de crescimento epidérmico (EGFR) ..............................................................04
1.2.2. Proteína p53 ............................................................................................................05
1.2.3. Enzimas isocitrato desidrogenase-1 (IDH-1) ..........................................................06
1.2.4. Proteína dupla murina 2 (MDM2) ..........................................................................07
2. OBJETIVOS ................................................................................................................09
2.1. Geral ...........................................................................................................................09
2.2. Específicos .................................................................................................................09
3. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................11
3.1. Dados clínicos ............................................................................................................11
3.2. Análises histopatológicas ...........................................................................................12
3.2.1. Coloração com Hematoxilina e Eosina (HE) e Critérios Histopatológicos ............12
3.2.2. Reações de imunoistoquímica .................................................................................12
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3.2.2.1. Análise das imunomarcações ...............................................................................15
3.3. Análise Estatística ......................................................................................................15
4. RESULTADOS ...........................................................................................................17
4.1 Dados clínicos .............................................................................................................17
4.2. Avaliação histológica .................................................................................................20
4.3. Imunomarcações.........................................................................................................23
4.4 Correlações entre dados clínicos e morfológicos.........................................................33
5. DISCUSSÃO ................................................................................................................57
6. CONCLUSÕES ...........................................................................................................67
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................69
8. APÊNDICES ...............................................................................................................73
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AGRADECIMENTOS
À minha esposa, amiga, companheira e futura colega, mãe das pessoas mais importantes para mim.
Ao meu orientador Prof. Dr. Fabio Rogerio pela imensa paciência, capacidade didática e generosidade em compartilhar conhecimento. Ao Prof. Dr. Luciano de Souza Queiroz, pela construção, ao meu ver, do mais importante arquivo em neuropatologia de nosso país. Ao meu pai, pois não me esqueço de quando me arrancou a gravata e me atirou numa antiga escola de medicina. Ao Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica, e ao meu co-orientador, Prof. Dr. Roger Frigério Castilho, pela oportunidade. Às técnicas do Laboratório de Pesquisa do Departamento de Anatomia Patológica da Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp, Ana Claudia Sparapani Piaza, Arethuza de Souza e Luzia Aparecida Magalhães, pela dedicação. À Regina, secretária do Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica, pela prontidão em esclarecer todas as dúvidas. A Charles W. Darwin por abrir caminho a todos nós.
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
EGFR: receptor do fator de crescimento epidérmico (do inglês, epidermal growth factor
receptor).
GBM: glioblastoma multiforme.
IDH-1: isocitrato desidrogenase-1 (do inglês, isocitrate dehydrogenase-1).
IDH-2: isocitrato desidrogenase-2 (do inglês, isocitrate dehydrogenase-2).
MDM2: proteína dupla murina 2 (do inglês, murine double protein 2).
NAD+: nicotinamida adenina dinucleotídeo.
NADH: forma reduzida do nicotinamida adenina dinucleotídeo.
NADP+: nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato.
NADPH: forma reduzida do nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato.
OMS: Organização Mundial de Saúde.
p53: proteína 53.
SNC: Sistema Nervoso Central.
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1. INTRODUÇÃO
1.1. Definições e Epidemiologia
Gliomas são os tumores cerebrais mais comuns em adultos, correspondendo a cerca
de 70% das neoplasias primárias do sistema nervoso central (SNC). Estes tumores surgem a
partir de células gliais e apresentam ampla variedade de tipos histológicos, os quais podem
exibir características que remetem às células de origem, isto é, astrócitos, oligodendrócitos
e epêndima. Particularmente, as neoplasias derivadas dos astrócitos são definidas como
astrocitomas.
De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS) (1)
, os astrocitomas podem
ser classificados em quatro graus histológicos (I – IV), os quais guardam relação estreita
com o comportamento biológico da lesão, tempo de sobrevida do paciente e resposta à
abordagem terapêutica. O astrocitoma pilocítico, ao qual é atribuído grau I, é bem
delimitado, de crescimento lento e acomete predominantemente crianças e adultos jovens.
Seu padrão histológico bifásico é característico: áreas compactas, constituídas por células
bipolares associadas a fibras de Rosenthal, que se misturam, em proporções variadas, com
áreas frouxas contendo células multipolares e estruturas microcísticas ou arredondadas
granulares eosinofílicas. Via de regra, a conduta é cirúrgica e o prognóstico, favorável (2)
.
Por sua vez, os astrocitomas graus II, III e IV ocorrem principalmente em adultos e
são considerados gliomas difusos, pois se infiltram de forma irrestrita na substância branca
tornando impossível sua delimitação precisa. A classificação destes tumores baseia-se nos
seguintes achados histológicos: atipias nucleares, mitoses, proliferação microvascular e
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necrose. O astrocitoma grau II (astrocitoma difuso de baixo grau) apresenta apenas um dos
achados, sendo o mais comum atipia nuclear (1)
. O tumor grau III (astrocitoma anaplásico)
exibe dois dos achados microscópicos listados, sendo atipia nuclear e mitoses os mais
frequentes. No astrocitoma grau IV (glioblastoma multiforme; GBM), são observados ao
menos três dos achados histológicos. Além desta classificação, os astrocitomas difusos
podem ser categorizados em baixo (II) ou alto (III e IV) graus, em função do
comprometimento lento ou rápido do parênquima cerebral vizinho, respectivamente. A
excisão cirúrgica apenas, ainda que não permita a retirada completa da lesão, é a
abordagem proposta para os tumores grau II. Os tumores graus III e IV recebem ainda
radioterapia e/ou quimioterapia adjuvante. O tempo de sobrevida dos pacientes é
inversamente proporcional ao grau histológico dos astrocitomas (3)
.
GBM é o tumor cerebral primário mais frequente, correspondendo a
aproximadamente 70% dos astrocitomas e 15% de todas as neoplasias intra-cranianas.
Cerca de 90% dos GBMs são classificados como primários. Tais lesões acometem
principalmente idosos (média de 62 anos), tem rápida evolução (menos de 3 meses) e não
apresentam evidências clínicas ou histopatológicas de lesão precursora. Por outro lado,
GBMs secundários acometem indivíduos mais jovens (média de 45 anos) e progridem de
forma lenta a partir de astrocitoma difuso de menor grau. Histologicamente indistinguíveis
entre si, as duas formas de GBM apresentam prognóstico sombrio. Pacientes com GBM
primário apresentam sobrevida mediana aproximada de 5 meses e aqueles com a forma
secundária, de 8 meses.(2,3)
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A análise histológica tem importância inquestionável para a definição do tipo de
uma neoplasia astrocitária. Porém, dificuldades diagnósticas podem surgir em função da
heterogeneidade do tumor, sobreposição com aspectos morfológicos de outros gliomas ou
amostragem parcial da lesão. Em função disso, nas últimas décadas, foram conduzidos
diversos estudos empregando prioritariamente técnicas moleculares objetivando-se
encontrar marcadores biológicos com relevância diagnóstica e/ou prognóstica. Tais estudos
permitiram não só a identificação de tais marcadores, mas também propiciaram aumento
significativo do conhecimento sobre a fisiopatogênese dos gliomas e o encontro de
potenciais alvos para novas abordagens terapêuticas (4-9)
.
1.2. Alterações Moleculares em Gliomas
Dentre as numerosas alterações moleculares verificadas em gliomas, destacam-se:
(1) superexpressão de fatores de crescimento e/ou mutação dos respectivos receptores
estimulando o crescimento e proliferação celular, (2) perda da regulação de cascatas de
transdução de sinais extracelulares favorecendo a proliferação e inibindo a diferenciação e
morte celular por apoptose e (3) perda do controle do ciclo celular permitindo a
proliferação desordenada (5-10)
. Particularmente, nos últimos anos, alterações moleculares
que se sobressaíram como importantes marcadores biológicos da evolução clínica e/ou da
resposta terapêutica de pacientes com glioblastomas são: a superexpressão do fator de
crescimento epidérmico (do inglês, epidermal growth factor receptor; EGFR), a alteração
da expressão do gene TP53 e da sua proteína correspondente p53, a mutação das enzimas
isocitrato desidrogenase-1 e 2 (do inglês, isocitrate dehydrogenase-1 e 2; IDH1 e IDH2,
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respectivamente) e a alteração da expressão da proteína dupla murina 2 (do inglês, murine
double protein 2; MDM2).
1.2.1. Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico (EGFR)
Sobre a participação de fatores de crescimento e seus receptores na gênese de
gliomas, evidenciou-se que o gene do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR)
é o mais frequentemente amplificado e superexpresso em GBMs primários, afetando 40-
60% destes tumores (11,12)
. Além disso, níveis protéicos elevados de EGFR ocorrem em
cerca de 90% das neoplasias astrocitárias, sugerindo que alterações na transcrição e
tradução deste gene também possam participar da gênese tumoral. Em condições
fisiológicas, o fator de crescimento epidérmico (do inglês, epidermal growth factor – EGF)
liga-se ao domínio extra-celular do EGFR em precursores glioneuronais induzindo
dimerização do receptor e alterações conformacionais em seu domínio citoplasmático.
Estas últimas desencadeiam a atividade tirosina-quinase deste receptor, levando a
fosforilação e ativação de resíduos de tirosina na sua porção citoplasmática e de moléculas
de vias de sinalização envolvidas em diferenciação, proliferação e migração celular.(13-15)
Por sua vez, células de glioma são capazes de sintetizar suas próprias moléculas de
EGF e aumentar o número de EGFR em sua superfície. Assim, devido ao estabelecimento
de uma alça de retroalimentação autócrina positiva, o efeito estimulatório do EGF se
intensifica e as células proliferam independentemente de ligantes exógenos (16,17)
. Além da
amplificação da forma selvagem do EGFR, rearranjos gênicos levando a expressão de
variantes mutantes ativas deste receptor também são comuns em gliomas. A variante gênica
mais frequente é denominada EGFR variante III (EGFRvIII), corresponde a deleção dos
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exons 2-7 e leva a remoção de parte do domínio de ligação extra-celular. Como
consequência, o receptor permanece constitutivamente ativo, independentemente da
presença do ligante, e se torna resistente ao processo de degradação da forma selvagem do
EGFR (13)
.
Amplificações e rearranjos do EGFR são altamente indicativos de glioma de alto
grau, com prognóstico pior que o estimado a partir da graduação histopatológica (18,19)
. Tal
fato tem estimulado a investigação de inibidores da via do EGFR com o objetivo de
favorecer a apoptose das células neoplásicas, aumentado a sensibilidade do tumor a
eventuais terapias adjuvantes. Nesse sentido, têm sido investigados marcadores biológicos
que poderiam predizer melhor resposta a uma abordagem terapêutica, em especial a
presença da mutação EGFRvIII (20)
e superexpressão do EGFR(21)
.
1.2.2. Proteína p53
A oncogênese de glioblastomas também envolve a perda da regulação de vias de
supressão tumoral, como a que envolve a proteína p53 (2)
. Esta proteína atua como fator de
transcrição de genes inibidores da proliferação celular após dano ao DNA, visando a
manutenção da estabilidade genômica. Assim, impede-se a progressão do ciclo celular para
que seja efetuado o reparo do material genético, evitando-se a propagação de mutações.
Caso o reparo não seja possível, a célula entra em processo de morte por apoptose (22,23,34)
.
Além disso, tem sido considerado que a expressão aumentada do próprio gene TP53 seja
uma resposta a agressão ao DNA celular (2)
.
Células com função prejudicada da proteína p53 podem se tornar capazes de
propagar aberrações gênicas e levar ao surgimento de neoplasias malignas (25,26)
.
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Especificamente, o descontrole do ciclo celular decorrente da perda desta proteína é
verificado em aproximadamente 30% dos GBMs, mais comumente na forma secundária
(cerca de 67% dos casos) (2)
. O valor prognóstico da alteração da expressão gênica do TP53
permanece indefinido em GBMs e sua relação com resposta a terapia e sobrevivência
parece variar com a idade (2,27,28)
.
1.2.3. Enzima Isocitrato Desidrogenase-1 (IDH-1)
Além das anormalidades descritas envolvendo as vias celulares do EGFR e TP53,
outras alterações gênicas e epigenéticas que participam da gênese de gliomas difusos foram
identificadas recentemente. Tais alterações, conforme estudos experimentais e clínicos, têm
valor prognóstico e/ou preditivo com relação a resposta a tratamento quimioterápico.
Especificamente, mutações no gene da isoforma 1 da isocitrato desidrogenase (IDH1)
foram identificadas em gliomas de baixo e alto grau, inclusive GBM (29,20,31)
. Neste último,
verificou-se que tais mutações ocorrem predominantemente em indivíduos mais jovens,
com a forma secundária da neoplasia e sobrevida maior. Por sua vez, mutações no gene da
isoforma 2 da IDH (IDH2) foram detectadas em menor freqüência, também associadas com
maior tempo de sobrevida (32,33,34)
.
Os genes IDH1 e IDH2 codificam, respectivamente, as isoformas citosólica e
mitocondrial da IDH, ambas participantes da respiração celular. Em condições fisiológicas,
estas enzimas catalisam a conversão de isocitrato a α-cetoglutarato, processo em que há
síntese de nicotinamida adenina dinucleotídio fosfato (NADPH) a partir da redução de
NADP+. Tanto o α-cetoglutarato quanto o NADPH produzidos são substâncias
consideradas protetoras contra danos oxidativos (35,36,37)
. Todas as mutações do IDH1 e
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IDH2 conhecidas até o presente são somáticas e heterozigóticas. As mutações do IDH1
ocorrem no códon correspondente ao aminoácido da posição 132, o qual se localiza no sítio
de ligação do isocitrato. Neste caso, a alteração mais comum determina a substituição do
aminoácido arginina por histidina. As mutações do IDH2 são identificadas em códon
correspondente a posição análoga àquela afetada no IDH1 (172). A alteração mais
freqüente determina a mudança do aminoácido arginina por lisina (38,39,40)
.
Tais mutações alteram a atividade enzimática normal reduzindo a capacidade de
síntese de α-cetoglutarato e NADPH, o que torna a célula mais suscetível ao estresse
oxidativo. A IDH mutada também apresenta um ganho de função que corresponde à
redução do α-cetoglutarato a D-2-hidroxiglutarato (2HG) (39)
. Essa nova atividade
enzimática leva ao consumo de α-cetoglutarato e NADPH, prejudicando ainda mais a
proteção contra o estresse oxidativo realizada por estas moléculas. O 2HG produzido em
excesso é considerado metabólito oncogênico, pois induz alterações epigenéticas que levam
a regulação aberrante da expressão gênica. Este composto também induz elevação dos
níveis do HIF-1α (do inglês, hypoxia-inducible factor-1 α), fator de transcrição que
favorece angiogênese ao aumentar a expressão do fator de crescimento do endotélio
vascular (VEGF) (36,38,39)
1.2.4. Proteína Dupla Murina 2 (MDM2)
A proteína MDM2 do inglês Murine Double Protein 2 inibe a função da proteína
p53 (supressor oncogênico) de ativar genes responsáveis pela reparação celular ou
apoptose. Atua degradando a proteína p53 e seu papel no ciclo celular está, portanto,
intimamente relacionado a esta última. Inibe tambem a função de genes supressores como o
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pRb, o que, por sua vez, estimula a síntese de DNA na fase S da mitose (40,41)
. Assim,
alterações nos níveis de MDM2 podem causar distúrbio no controle do ciclo celular e
contribuir para a oncogênese (41,42)
. Normalmente associa-se com mutação da proteína p53
com relação direta e proporcional ao grau da neoplasia e índices de proliferação,
especificamente o número de mitoses por campo (2,42,43)
. O gene MDM2 encontra-se
possivelmente amplificado e com aumento de sua expressão em uma importante proporção
dos glioblastomas primários e secundários. Sua relação com o prognóstico e terapêutica
deve ainda ser melhor elucidada.
Conforme exposto, as alterações moleculares apresentadas pelos tumores
astrocitários são várias. Especificamente, o conhecimento destas alterações e de suas
repercussões imunofenotípicas em células de glioblastoma é interessante para o melhor
entendimento da fisiopatogênese destas neoplasias (2,44,45)
. Além disto, a análise de achados
imunoistoquímicos de diferentes marcadores biológicos associada a dados de evolução
clínica e resposta às abordagens terapêuticas protocolares atuais poderia contribuir para
melhor manejo clínico dos indivíduos portadores de glioblastoma (43)
. Sua compreensão
torna-se essencial tendo em vista o desenvolvimento de drogas que tenham como alvo
marcadores celulares que participam ativamente do ciclo celular e capacidade de
proliferação, adesão e invasão das células neoplásicas (46)
.
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2. OBJETIVOS
2.1. Geral
Investigar a prevalência de casos de glioblastoma tratados no Hospital de Clínicas
da Faculdade de Ciências Médicas (FCM) da Universidade Estadual de Campinas
(Unicamp) entre janeiro de 2008 e dezembro de 2012, bem como a expressão tecidual de
marcadores biológicos, correlacionando-os com achados morfológicos, dados de evolução
clínica e resposta terapêutica.
2.2. Específicos
2.2.1. Realizar descrição clínica e morfológica dos casos de glioblastoma tratados no
Hospital de Clínicas da FCM/Unicamp entre janeiro 2008 e dezembro de 2012.
2.2.2. Avaliar a distribuição tecidual, através de técnica imunoistoquímica, de marcadores
biológicos como o fator de crescimento epidérmico (EGFR), proteína p53, forma mutante
da isocitrato desidrogenase 1 e proteína murina 2 (MDM2) - nos casos de glioblastoma
tratados no Hospital de Clínicas da FCM/Unicamp entre janeiro 2008 e dezembro de 2012.
2.2.3. Correlacionar os achados morfológicos e imunoistoquímicos com dados da evolução
clínica e resposta ao tratamento protocolar com cirurgia, quimioterapia com Temozolamida
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e radioterapia nos casos de glioblastoma tratados no Hospital de Clínicas da FCM/Unicamp
entre janeiro 2008 e dezembro de 2012.
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3. MATERIAL E MÉTODOS
O presente estudo se baseou em análise retrospectiva de pacientes que
desenvolveram glioblastoma primário ou secundário entre o período de janeiro de 2008 a
dezembro de 2012. O material analisado foi proveniente do arquivo do Departamento de
Anatomia Patológica da Faculdade de Ciências Médicas (FCM) da Unicamp. A faixa etária
considerada foi de 18 a 81 anos, excluindo-se assim neoplasias na faixa etária pediátrica
com comportamento biológico geralmente diverso daquele apresentado pelas lesões em
adultos. Foram excluídas amostras cujo tratamento não tenha sido o protocolar existente
(ou seja, cirurgia com ressecção total ou subtotal, radioterapia com 60 Gy e quimioterapia
com Temozolamida). O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
FCM – Unicamp (Parecer # 25144; vide Apêndice 3).
3.1. Dados Clínicos
Foram analisados os seguintes dados clínicos: idade, gênero, sobrevida total,
sobrevida radiológica, sobrevida com tempo livre de doença clínica, ressecção total ou
subtotal e uso de outros quimioterápicos ou doses extras de radioterapia.
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3.2. Análises Histopatológicas
Após a recuperação dos blocos de parafina do arquivo do Departamento de
Anatomia Patológica da FCM/Unicamp, cortes de 4 µm foram obtidos para a coloração
com Hematoxilina e Eosina e para as marcações imunoistoquímicas.
3.2.1. Coloração com Hematoxilina e Eosina (HE) e Critérios Histopatológicos
Os cortes de tumores foram corados com HE de acordo com o protocolo padrão do
Serviço de Anatomia Patológica do Hospital de Clínicas da Unicamp, analisados à
microscopia óptica. Os astrocitomas foram classificados segundo as características
morfológicas propostas na última classificação de tumores do SNC publicada pela OMS em
2007: atipias celulares, figuras de mitose, hiperplasia endotelial e necrose.
3.2.2. Reações de Imunoistoquímica
As reações imunoistoquímicas foram realizadas com os anticorpos listados: anti-
p53, EGFR, IDH-1 e MDM2 (Tabela 1). Esses dados foram correlacionados com os dados
clínicos e histopatológicos.
Especificamente, os cortes histológicos foram coletados em lâminas previamente
tratadas com 3-aminopropil-trietoxi-silano (Sigma Chemical Company, EUA).
Inicialmente, os cortes foram desparafinizados com três sequências de xilol por 10 minutos
cada em temperatura ambiente, hidratados em solução de concentrações decrescentes de
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etanol (100%, 80% e 50%) e lavados em água destilada. A atividade da peroxidase
endógena foi inibida utilizando peróxido de hidrogênio a 10% em três incubações de cinco
minutos cada, e posteriormente os cortes foram lavados em água destilada. Após
recuperação antigênica (Tabela 2), os cortes foram lavados em água destilada, e colocados
em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 10mM (pH 7,2-7,6). Os cortes foram
então incubados com os anticorpos primários diluídos (Tabela 1) em albumina sérica
bovina (BSA) 1% diluída em PBS. Após, dilui-se o anticorpo nesta solução, incubando a
lâmina a 37oC por 30 minutos. Depois as lâminas foram mantidas a 4oC.
Após incubação com os anticorpos primários, os cortes foram lavados em PBS (3x 5
minutos). Em seguida, o sistema de detecção contendo o anticorpo secundário e peroxidase
(EnvisionTM+Dual Link System-HRP® - Dako, cat# K4061 ou AdvanceTMHRP® - Dako,
cat# K4068; Tabela 2) foi adicionado por 30 minutos a 37°. A revelação foi feita com o
substrato cromogênico 3,3 diaminobenzidina (DAB). Terminada esta etapa, as lâminas
foram novamente lavadas com agua destilada e contra-coradas com Hematoxilina de Mayer
durante 5 minutos, desidratadas através de dois banhos em solução de etanol a 100%,
diafanizadas em xilol com duas trocas e montadas em resina (Enthellan®). Controles
positivos e negativos da reação de imunoistoquímica foram utilizados em todas as reações.
14
!
Tabela 1. Anticorpos primários, clones, diluições e fabricantes que foram utilizados no
estudo imunoistoquímico.
Anticorpo Primário Clone Diluição Fabricante
EGFR EGFR1(1005) 1:500 Santa Cruz®
MDM2 1B10 1:50 Abnova®
p53 DO-7 1:200 Dako®
IDH-1 HMab-1 1:50 Millipore®
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Tabela 2. Protocolos de recuperação antigênica e revelação para cada anticorpo.
Anticorpo Tampão pH Revelação
EGFR Tris-EDTA 9,0 Envision®
MDM2 Tris-EDTA 9,0 Envision®
p53 Tris-EDTA 9,0 Advance®
IDH-1 Citrato 6,0 Advance®
15
!
3.2.2.1. Análise das Imunomarcações
Os padrões de imunomarcação para p53, EGFR e MDM2 foram avaliados
considerando tanto a distribuição celular (citoplasma e/ou núcleo) quanto a tecidual. Com
relação a esta última, adaptamos as classificações semi-quantitativas propostas por
Giordana(47) e Korkolopoulou (48). Especificamente, a presente avaliação semi-quantitativa
modificada foi feita em 10 campos de grande aumento (40x) aleatoriamente escolhidos em
regiões viáveis (não-necróticas) de um corte histológico do tumor. Para cada campo, uma
classe (1, 2, 3 ou 4) foi atribuída de acordo com a porcentagem estimada de células
imunopositivas (1: 0-25%; 2: 25-50%; 3: 50-75%; e 4: 75 - 100%). O valor médio dos 10
valores estimados para um corte foi apresentado como o percentual de imunopositividade
atribuído para a amostra tumoral. Este percentual foi indicado como uma classe (1: 0-25%;
2: 25-50%; 3: 50-75%; e 4: 75 - 100%). Por sua vez, para a marcação para IDH-1 foi
utilizada a classificação binomial de “positiva” ou “negativa”, de acordo com a presença ou
ausência de células neoplásicas com marcação citoplasmática (32,33).
3.3. Análise Estatística
Para responder aos objetivos do estudo, além de técnicas básicas de análise
exploratória de dados como média, frequência absoluta e relativa, foram utilizados os testes
de Kruskal-Wallis e Qui-Quadrado, além do Coeficiente de Correlação de Pearson.
O teste de Kruskal-Wallis foi utilizado para avaliar a diferença entre as médias de
variáveis quantitativas em diferentes categorias (amostras) de variáveis categóricas. Por sua
vez, o teste de Qui-Quadrado foi utilizado para avaliar a independência entre as categorias
16
!
de duas variáveis categóricas. Por fim, o Coeficiente de Correlação de Pearson foi utilizado
para avaliar a correlação entre duas variáveis quantitativas. Essas três metodologias
possuem, nesse trabalho, o mesmo objetivo: avaliar estatisticamente a relação entre as
variáveis de interesse.
Todos os testes de hipóteses desenvolvidos nesse trabalho consideraram 5% de
significância, isto é, a hipótese nula foi rejeitada quando p-valor foi menor que 0,05.
Detalhes sobre a análise estatística são apresentados no Apêndice 1.
17 !
4. RESULTADOS
4.1. Dados Clínicos
Foram estudados 36 casos de glioblastoma multiforme do arquivo do
Departamento de Anatomia Patológica da FCM - UNICAMP. Os casos ocorreram entre
2008 e 2012. Todos com óbito confirmado (Tabela 3).
4.1.1. Idade
Foram avaliados pacientes com idades entre 22 e 88 anos. A média de idade foi de
57,22 anos, com uma mediana de 58,5 anos. Em 8 dentre os 36 casos, o diagnostico foi
realizado aos 67 anos.
4.1.2. Gênero
Dos 36 casos estudados, 16 (45%) foram do sexo masculino e 20 (55%), do sexo
feminino.
4.1.3. Localização
Dos 36 casos analisados, 2 estavam localizados no diencéfalo, 12 no lobo
temporal, 15 no lobo frontal, 6 no lobo parietal e 1 no lobo occipital.
18 !
4.1.4. Glioblastoma Primário (de novo) ou Secundário
Dos 36 casos analisados, 35 tumores foram diagnosticados como primários e
apenas 1 caso como secundário.
4.1.5. Tratamento
O tratamento dos 36 casos estudados foi padronizado em cirurgia com ressecção
subtotal ou total, quimioterapia inicial com temozolamida (Temodal®) 200 mg/m2 e
radioterapia com 60 Gy. O seguimento com novos ciclos de temozolamida ocorreu de
acordo com a evolução de cada caso. Nestes 36 casos não foram usados outros
quimioterápicos.
4.1.6. Tempo de Livre de Doença Clínica ou Sintomática
Nos 36 casos estudados a média do tempo livre de doença clínica foi de 7,56
meses, com uma mediana de 7 meses. O mínimo foi de 4 meses e o máximo de 11 meses.
4.1.7. Tempo Livre de Doença Radiológica Avaliado por Ressonância Nuclear
Magnética do Crânio (com ou sem contraste) e/ou Tomografia Computadorizada do
Crânio (com ou sem contraste)
O tempo livre de doença radiológica médio foi de 7,14 meses, com uma mediana
de 7 meses. O mínimo foi de 4 meses e o máximo de 10 meses.
19 !
Tabela 3: Informações clínicas dos 36 casos de glioblastoma multiforme. O tempo de sobrevida está indicado em meses. RT: ressecção total; TLDC: tempo livre de doença clinica (meses); TLDR: tempo livre de doença radiológica (meses).
20 !
4.2. Avaliação Histológica
Em todos os casos analisados foram observados os achados histológicos clássicos
de glioblastoma: atipias, figuras de mitose, hiperplasia endotelial (proliferação vascular) e
necrose. Campos microscópicos representativos são apresentados nas Figuras 1 a 4.
4.2.1. Contagem de Figuras de Mitose / 10 Campos de Grande Aumento (CGA)
Em todos os casos avaliados, a média do número de figuras de mitose / 10 CGA
foi de 3,9, com uma mediana de 4,1.
4.2.2. Hiperplasia Endotelial
No presente estudo, a hiperplasia endotelial foi classificada como: leve,
moderada, moderada-acentuada e acentuada. Três casos tiveram a hiperplasia endotelial
classificada como moderada, 10 casos como moderada-acentuada e 23 casos como
acentuada.
4.2.3. Necrose
A extensão de necrose foi classificada como 0 a 100% da superfície de corte
tumoral amostrada na lâmina analisada. A média da extensão estimada de necrose foi
cerca de 40% , com um mínimo de 5% e um máximo de 70%.
21 !
Figura 1. Atipias celulares em corte histológico de glioblastoma (hematoxilina e eosina). Notar pleomorfismo, irregularidade e hipercromasia nucleares. Objetiva 40x.!!
Figura 2. Figura de mitose em corte histológico de glioblastoma (hematoxilina e eosina). Notar, no centro do campo, figura de mitose atípica em célula neoplásica. Objetiva 100x.
22 !
Figura 3. Proliferação endotelial em corte histológico de glioblastoma (hematoxilina e eosina). Notar múltiplos vasos neoplásicos com formato e arquitetura irregulares. Detalhe: vaso anômalo exibindo hiperplasia de células endoteliais, com arranjo em pseudoglomérulo. Objetivas: 4x (panorâmica) e 40x (detalhe).
Figura 4. Área de necrose em corte histológico de glioblastoma (hematoxilina e eosina). Notar, no centro do campo, aspecto em pseudopaliçada da área de necrose tumoral. Objetiva 4x.
23 !
4.3. Imunomarcações
4.3.1 Imunomarcação para EGFR
Com relação à imunomarcação para EGFR, notou-se positividade citoplasmática
com distribuição irregular no tecido e intensidade variando de fraca a forte. Nos casos
analisados neste estudo, a positividade para EGFR foi apresentada em 4 classes com as
seguintes percentagens de células positivas correspondentes: classe 1 (0 a 25%), classe 2
(26 a 50%), classe 3 de (51 a 75%) e classe 4 (76 a 100%). Dentro do total de 36
pacientes, 4 apresentaram classe 1, 12 apresentaram classe 2, 17 apresentaram classe 3 e
3 apresentaram classe 4 (Figuras 5 a 9).
Figura 5. Imunomarcação para EGFR em corte histológico de glioblastoma. Notar marcação citoplasmática nas células neoplásicas. Objetiva 40x.
24 !
Figura 6. Imunomarcação para EGFR em corte histológico de glioblastoma. Campo representativo de área classificada como 1. Objetiva 20x.
Figura 7. Imunomarcação para EGFR em corte histológico de glioblastoma. Campo representativo de área classificada como 2. Objetiva 20x.
25 !
Figura 8. Imunomarcação para EGFR em corte histológico de glioblastoma. Campo representativo de área classificada como 3. Objetiva 20x.
Figura 9. Imunomarcação para EGFR em corte histológico de glioblastoma. Campo representativo de área classificada como 4. Objetiva 20x.
26 !
4.3.2. Imunomarcação para Proteína p53
O padrão de marcação para a proteína p53 foi nuclear, com distribuição irregular
no tecido e intensidade forte. Nos casos analisados neste estudo, a positividade para p53
foi apresentada em 4 classes com as seguintes percentagens de células positivas
correspondentes: classe 1 (0 a 25%), classe 2 (26 a 50%), classe 3 (51 a 75%) e classe 4
(76 a 100%).
Dentro do total de 36 pacientes , nenhum foi alocado na classe 1 (0-25%), 5
apresentaram classe 2 (26-50%), 17 apresentaram classe 3 (51-75%) e 14 apresentaram
classe 4 (75-100%) de positividade (Figuras 10 a 13).
Figura 10. Imunomarcação para proteína p53 em corte histológico de glioblastoma. Campo representativo de área classificada como 1. No entanto, após a análise completa de cada um dos cortes histológicos, nenhuma das lesões foi designada como classe 1. Objetiva 10x.
27 !
Figura 11. Imunomarcação para proteína p53 em corte histológico de glioblastoma. Campo representativo de área classificada como 2. Objetiva 10x.
Figura 12. Imunomarcação para proteína p53 em corte histológico de glioblastoma. Campo representativo de área classificada como 3. Objetiva 10x.
28 !
Figura 13. Imunomarcação para proteína p53 em corte histológico de glioblastoma. Campo representativo de área classificada como 4. Objetiva 10x.
4.3.3. Imunomarcação para a Forma Mutante da Enzima Isocitrato Desidrogenase-1
(IDH-1)
O padrão de marcação para a forma mutante da IDH-1 foi citoplasmático, com
distribuição irregular no tecido e intensidade variando de fraca (predominante) a
moderada. Foi observada positividade para a forma mutante da IDH-1 apenas em 1 tumor
dos 36 casos avaliados. Em paralelo às reações de imunoistoquímica realizadas para
investigar a proteína mutante nos espécimes de alto grau, foi investigada uma amostra de
astrocitoma difuso de baixo grau (OMS grau II) obtido a partir do arquivo do Serviço de
Anatomia Patológica do HC-Unicamp e sabidamente com imunopositividade para esta
29 !
enzima mutante. Tal amostra serviu como controle externo positivo, validando os
resultados que obtivemos com as amostras de alto grau (Figuras 14 e 15).
Figura 14. Imunomarcação para forma mutante da IDH-1 em corte histológico de astrocitoma difuso de baixo grau. Notar positividade citoplasmática em astrócitos neoplásicos. Objetivas: 20x (A) e 40x (B).
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30 !
Figura 15. Imunomarcação para forma mutante da IDH-1 em corte histológico de glioblastoma. Notar marcação citoplasmática das células neoplásicas com distribuição semelhante àquela observada na lesão de menor grau. Porém, no presente espécime, a intensidade de marcação foi leve (predominantemente) a moderada.. Objetiva 20x.
4.3.4. Imunomarcação para Proteína Dupla Murina 2 (MDM2)
O padrão de imunomarcação para a MDM2 foi nuclear, com distribuição irregular
no tecido e intensidade forte. Nos casos analisados neste estudo a positividade para o
MDM2 foi apresentada em 4 classes com as seguintes percentagens de células positivas
correspondentes: classe 1 (0 a 25%), classe 2 (25 a 50%), classe 3 de (50 a 75%) e classe
4 (75 a 100%). Dentro do total de 36 pacientes , 2 casos apresentaram classe 1 (0-25%),
13 casos apresentaram classe 2 (26-50%), 15 casos apresentaram classe 3 (51-75%) e 6
casos apresentaram classe 4 (75-100%) de positividade (Figura 16 a 20).
31 !
Figura 16. Imunomarcação para MDM2 em corte histológico de glioblastoma. Notar marcação nuclear na maior parte das células neoplásicas. Objetiva 40x.
Figura 17. Imunomarcação para MDM2 em corte histológico de glioblastoma. Campo representativo de área classificada como 1. Objetiva 20x.
32 !
Figura 18. Imunomarcação para MDM2 em corte histológico de glioblastoma. Campo representativo de área classificada como 2. Objetiva 20x.
Figura 19. Imunomarcação para MDM2 em corte histológico de glioblastoma. Campo representativo de área classificada como 3. Objetiva 20x.
33 !
Figura 20. Imunomarcação para MDM2 em corte histológico de glioblastoma. Campo representativo de área classificada como 4. Objetiva 20x.
4.4. Correlações entre Dados Clínicos e Morfológicos
4.4.1. Correlação entre Classes de Imunomarcação para Proteína p53, Forma
Mutante da IDH-1, EGFR e MDM2 com a Sobrevida Total
A análise de correlação entre dados clínicos e morfológicos iniciou-se avaliando
estatisticamente a relação das classes de imunopositividade para a proteína p53, forma
mutante da IDH-1, EGFR e MDM2 com a sobrevida total. O teste estatístico utilizado foi
o de Kruskall-Wallis, através do qual foram testadas as diferenças médias da sobrevida
total entre as categorias (classes) de p53, IDH-1, EGFR e MDM2.
Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas, uma vez que o
p-valor para p53 foi de 0,42, para IDH-1 foi de 0,26, para EGFR foi de 0,39 e para
MDM2 foi de 0,06, ou seja, todos p-valores maiores que 0,05. Dessa forma, podemos
concluir que as médias da sobrevida total entre as categorias de p53, IDH-1, EGFR e
34 !
MDM2 são estatisticamente iguais, ou ainda, em outras palavras, podemos concluir que
não há relação estatisticamente significativa entre as classes de imunomarcação aqui
testadas para p53, IDH-1, EGFR, MDM2 e a sobrevida total. As Figuras 21 a 24
apresentam a sobrevida total média para cada categoria de p53, IDH-1, EGFR e MDM2.
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Figura 21. Gráfico representativo da correlação entre as classes de imunopositividade para p53 e a sobrevida total média. No eixo X estão apresentadas as classes de imunomarcação para p53. No eixo Y estão indicados o período de sobrevida média em meses (Teste de Kruskall-Wallis, p=0,42).
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Figura 22. Gráfico representativo da correlação entre a imunopositividade para IDH-1 e a sobrevida total média. No eixo X estão apresentadas as classes de imunomarcação para IDH-1. No eixo Y estão indicados os períodos de sobrevida média em meses.(Teste de Kruskall-Wallis, p=0,26).
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Figura 23. Gráfico representativo da correlação entre as classes de imunopositividade para EGFR e a sobrevida total média. No eixo X estão apresentadas as classes de imunomarcação para EGFR. No eixo Y estão indicados os períodos de sobrevida média em meses (Teste de Kruskall-Wallis, p=0,39).
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Figura 24. Gráfico representativo da correlação entre as classes de imunopositividade para MDM2 e a sobrevida total média. No eixo X estão apresentadas as classes de imunomarcação para MDM2. No eixo Y estão indicados os períodos de sobrevida média em meses (Teste de Kruskall-Wallis, p=0,06).
37 !
4.4.2. Correlação entre Classes de Imunomarcação para p53 e MDM2, p53 e EGFR e EGFR e MDM2
Em seguida, foi avaliado, via teste Qui-Quadrado, a relação entre as classes de
imunomarcção para p53 e MDM2, p53 e EGFR e EGFR e MDM2. Foi detectada
dependência, isto é, uma relação estatisticamente significativa entre p53 e MDM2 (p-
valor=0,00) e entre EGFR e MDM2 (p-valor=0,04). Não foi detectada relação
estatisticamente significativa entre p53 e EGFR (p-valor=0,09). Esses resultados, bem
como a frequência cruzada entre essas variáveis, são apresentados nas Tabelas 4 a 6.
Tabelas 4,5 e 6. Correlação entre classes de imunomarcação para p53 e MDM2, p53 e EGFR e EGFR e MDM2 respectivamente.
38 !
Tabelas 4,5 e 6 (continuação). Correlação entre classes de imunomarcação para p53 e MDM2, p53 e EGFR e EGFR e MDM2 respectivamente.
39 !
4.4.3. Correlação entre Classes de Imunomarcação para p53, MDM2 e EGFR com a
Sobrevida Clínica e com a Sobrevida Radiológica
A análise seguiu avaliando estatisticamente, via teste de Kruskal-Wallis, a relação
das classes de imunomarcação para p53, MDM2 e EGFR com a sobrevida clínica e com a
sobrevida radiológica. A única relação estatisticamente significativa detectada, isto é, o
único caso onde foram detectadas médias estatisticamente diferentes pelo teste de
Kruskal-Wallis, foi entre p53 e sobrevida clínica (p-valor=0,02). Especificamente, quanto
maior a classe de imunomarcação para p53, menor a sobrevida clínica (Figura 25).
As demais relações não foram estatisticamente significativas, sendo a relação de
p53 com sobrevivência radiológica com p-valor igual a 0,13, MDM2 com sobrevivência
clínica com p-valor igual a 0,31, MDM2 com sobrevivência radiológica com p-valor
igual a 0,37, EGFR com sobrevivência clínica com p-valor igual a 0,53 e, por fim, EGFR
com sobrevivência radiológica com p-valor igual a 0,91. As Figuras 26 a 30 mostram as
médias de sobrevivência clínica e/ou radiológica para as diferentes classes de
imunomarcação para p53, MDM2 e EGFR.
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Figura 25. Gráfico representativo da correlação entre as classes de imunopositividade para proteína p53 e sobrevida clínica média. Os valores no eixo X representam a classificação usada para a p53 e, no eixo Y, a sobrevida em meses.
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Figura 26. Gráfico representativo da correlação entre as classes de imunopositividade para proteína p53 e sobrevida radiológica média. . Os valores no eixo X representam a classificação usada para a p53 e, no eixo Y, a sobrevida em meses.
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Figura 27. Gráfico representativo da correlação entre as classes de imunopositividade para MDM2 e sobrevida clínica média. Os valores no eixo X representam a classificação usada para a MDM2 e, no eixo Y, a sobrevida em meses.
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Figura 28. Gráfico representativo da correlação entre as classes de imunopositividade para MDM2 e sobrevida radiológica média. Os valores no eixo X representam a classificação usada para a MDM2 e, no eixo Y, a sobrevida em meses.
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Figura 29. Gráfico representativo da correlação entre as classes de imunopositividade para EGFR e sobrevida clínica média. Os valores no eixo X representam a classificação usada para o EGFR e, no eixo Y, a sobrevida em meses.
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Figura 30. Gráfico representativo da correlação entre as classes de imunopositividade para EGFR e sobrevida radiológica média. Os valores no eixo X representam a classificação usada para o EGFR e, no eixo Y, a sobrevida em meses.
4.4.4. Correlações entre as Sobrevidas Clínica, Radiológica e Total
Para avaliar estatisticamente as relações entre as sobrevidas clínica, radiológica e
total foi utilizado o Coeficiente de Correlação de Pearson, seguido do p-valor resultante
do teste de hipóteses, onde é testado se o coeficiente de correlação calculado é
estatisticamente diferente de zero, ou seja, onde é testada a significância estatística da
correlação. Todas as correlações calculadas foram estatisticamente significativas (todas
com p-valor menor que 0,0001) e positivas, ou seja, o aumento de uma sobrevida implica
aumento da outra sobrevida. A correlação mais forte foi entre sobrevida clínica e
radiológica (0,79), seguida de radiológica e total (0,75) e clínica e total (0,69) (Tabela 7).
43 !
Tabela 7: Correlações entre as Sobrevidas Clínica, Radiológica e Total.
4.4.5. Correlação do Gênero com a Sobrevida Clínica, Sobrevida Radiológica e
Sobrevida Total
Para avaliar a correlação do gênero com a sobrevida clínica, sobrevida radiológica
e sobrevida total, foi utilizado também o teste de Kruskal-Wallis, onde foi testado se a
média de cada uma das sobrevidas é estatisticamente diferente entre os sexos. Não foi
encontrada relação estatisticamente significativa das sobrevidas clínica, radiológica e
total com o gênero, uma vez que as médias são estatisticamente iguais pelo teste de
Kruskal-Wallis, com p-valor igual a 0,36 para a sobrevida clínica, igual a 0,38 para a
radiológica e 0,81 para a total. É possível observar nas Figuras 31 a 33 que, de fato, as
sobrevidas médias são semelhantes entre os sexos.
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Figura 31. Gráfico representativo da correlação entre gênero e sobrevida clínica média. No eixo X está representado o gênero analisado e, no eixo Y, a sobrevida em meses.
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Figura 32. Gráfico representativo da correlação entre gênero e sobrevida radiológica média. No eixo X está representado o gênero analisado e, no eixo Y, a sobrevida em meses.
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Figura 33. Gráfico representativo da correlação entre gênero e sobrevida total média. No eixo X está representado o gênero analisado e, no eixo Y, a sobrevida em meses.
4.4.6. Correlação das Classes de Imunomarcação para Proteína p53, MDM2 e
EGFR com Número de Mitoses e Extensão de Ressecção Tumoral
Em seguida, foi avaliada pelo teste Qui-Quadrado a dependência, ou a relação das
classes de imunopositividade para proteína p53, MDM2 e EGFR com número de figuras
de mitose / 10 CGA e extensão de ressecção tumoral (total ou subtotal). Não foi
encontrada relação estatisticamente significativa, uma vez que todos os p-valores dos
testes Qui-Quadrado observados foram maiores que 0,05. As Tabelas 8 a 13 mostram a
frequência cruzada entre essas variáveis, bem como os resultados dos testes de hipóteses.
46 !
Tabela 8. Correlação entre classes de imunomarcação para proteína p53 e número de figuras de mitose / 10 campos de grande aumento.
Tabela 9. Correlação entre classes de imunomarcação para proteína p53 e extensão de ressecção tumoral (total ou subtotal).
47 !
Tabela 10. Correlação entre classes de imunomarcação para MDM2 e número de figuras de mitose / 10 campos de grande aumento.
Tabela 11. Correlação entre classes de imunomarcação para MDM2 e extensão de ressecção tumoral (total ou subtotal).
48 !
Tabela 12. Correlação entre classes de imunomarcação para EGFR e número de figuras de mitose / 10 campos de grande aumento.
Tabela 13. Correlação entre classes de imunomarcação para EGFR e extensão de ressecção tumoral (total ou subtotal).
49 !
4.4.7. Frequências Cruzadas entre as Classes de Imunomarcação para Proteína p53,
MDM2 e EGFR com a Localização do Tumor
As Tabelas 14, 15 e 16 apresentam, além das frequências cruzadas das classes de
imunomarcação para proteína p53, MDM2 e EGFR com a localização do tumor, os testes
Qui-Quadrado para avaliar estatisticamente a dependência entre essas variáveis. Pode-se
observar que não há relação estatisticamente significativa, uma vez que o p-valor entre
p53 e a localização do tumor foi de 0,59, do p-valor de MDM2 com localização do tumor
foi de 0,93 e do p-valor de EGFR com localização do tumor foi de 0,88, ou seja, todos
maiores que 0,05.
Tabela 14. Frequências cruzadas entre as classes de imunomarcação para proteína p53 e localização do tumor.
50 !
Tabela 15. Frequências cruzadas entre as classes de imunomarcação para MDM2 e localização do tumor.
Tabela 16. Frequências cruzadas entre as classes de imunomarcação para EGFR e localização do tumor.
51 !
4.4.8. Correlação das Sobrevidas Clínica, Radiológica e Total com a Localização do
Tumor
Para avaliar estatisticamente a relação das sobrevidas clínica, radiológica e total
com a localização do tumor, recorremos ao teste de Kruskal-Wallis, através do qual foi
testada a diferença das médias de cada sobrevida entre cada uma das localizações. Não
foram encontradas diferenças estatisticamente significativas em nenhuma das sobrevidas,
uma vez que o p-valor foi igual a 0,58 para a sobrevida clínica, 0,70 para a radiológica e
0,65 para a total. Dessa forma, podemos concluir que, no presente estudo, não houve
relação estatisticamente significativa de nenhuma das sobrevidas com a localização do
tumor (Figuras 34 a 36).
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Figura 34. Gráfico representativo da correlação entre localização do tumor e sobrevida clínica. No eixo X encontra-se representada a localização do tumor e, no eixo Y, a sobrevida em meses.
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Figura 35. Gráfico representativo da correlação entre localização do tumor e sobrevida radiológica. No eixo X encontra-se representada a localização do tumor e, no eixo Y, a sobrevida em meses.
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Figura 36. Gráfico representativo da correlação entre localização do tumor e sobrevida total. No eixo X encontra-se representada a localização do tumor e, no eixo Y, a sobrevida em meses.
53 !
4.4.9. Correlação das Sobrevidas Clínica, Radiológica e Total com a Idade
Em seguida, foi avaliada estatisticamente a relação das sobrevidas clínica,
radiológica e total com a idade. Para tanto, recorremos ao Coeficiente de Correlação de
Pearson seguido do p-valor resultante do teste de hipóteses, onde é testado se o
coeficiente de correlação calculado é estatisticamente diferente de zero, ou seja, onde é
testada a significância estatística da correlação. Não foi detectada correlação
estatisticamente significativa, uma vez que p-valor é maior que 0,05 em todos os casos
(Tabela 17).
Tabela 17. Correlação entre sobrevidas clínica, radiológica e total e idade.
54 !
4.4.10 Correlação das Sobrevidas Clínica, Radiológica e Total com a Extensão de
Ressecção Tumoral
Por fim, foi avaliada, através do teste de Kruskal-Wallis, a relação das sobrevidas
clínica, radiológica e total com a extensão da ressecção tumoral (total ou subtotal). Não
foi detectada relação estatisticamente significativa, uma vez que não foram detectadas
médias estatisticamente diferentes entre ressecção total e subtotal. Para a sobrevida
clínica o p-valor foi de 0,98, para a radiológica foi de 0,87 e para a total foi de 0,57
(Figuras 37 a 39).
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Figura 37. Gráfico representativo da correlação entre extensão de ressecção e sobrevida clínica. No eixo X encontra-se especificado se foi realizada ressecção total (sim) ou subtotal (não).
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Figura 38. Gráfico representativo da correlação entre extensão de ressecção e sobrevida radiológica. No eixo X encontra-se especificado se foi realizada ressecção total (sim) ou subtotal (não).
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Figura 39. Gráfico representativo da correlação entre extensão de ressecção e sobrevida total. No eixo X encontra-se especificado se foi realizada ressecção total (sim) ou subtotal (não).
56 !
57 !
5. DISCUSSÃO
Em geral, o conjunto dos dados clínicos coletados a partir dos prontuários do HC-
UNICAMP aproxima-se dos dados obtidos na literatura (2,49).A média de idade encontrada
dos pacientes avaliados em nossa amostragem foi de 57,7 anos. Particularmente, oito casos
tiveram o diagnóstico anatomopatológico com a idade de 67 anos. Houve um predomínio
do sexo feminino (55%), o que distancia-se um pouco do encontrado em outros trabalhos
(2,49). É possível que o fato de nossa amostra ser relativamente pequena e não multicêntrica
justifique a diferença entre os dados da literatura e aqueles obtidos em nosso estudo.
No presente estudo a localização predominante foi o lobo frontal, o que compara-se
ao descrito em outros trabalhos (49).É importante ressaltar-se que, muitas vezes, a
localização inicial apresenta-se obscura pois a neoplasia e altamente invasiva, ocupando
ordinariamente diversos lobos cerebrais, inclusive, como se sabe, de forma inter-
hemisférica. Isso torna a classificação topográfica, na melhor das hipóteses, apenas uma
estimativa da predominância do tumor em determinado lobo cerebral.
Dentre os 36 casos analisados, apenas 1 mostrou-se secundário, ou seja, ao redor de
3%. Tal percentagem encontra-se próxima ao valor observado por outros autores, em torno
de 5% (2,49).
A escolha do tratamento realizado em nossa instituição segue o que é encontrado em
diversos protocolos de serviços ao redor do mundo. Especificamente, alguns pacientes não
foram submetidos a este tratamento protocolar, seja por efeitos colaterais da radio e/ou
quimioterapia ou condições clínicas que inviabilizaram o tratamento padrão.Desta forma,
selecionamos para este trabalho apenas aqueles pacientes que foram submetidos a
58 !
abordagem protocolar. Estas limitações reduziram o número de pacientes possíveis de
serem incluídos neste estudo. Porém tais limitações uniformizaram nossa amostra para
efeito de comparação de resultados, tornando as correlações mais confiáveis, ou seja, com
mínima interferência de variáveis externas.
O tempo livre de doença clínica ou sintomática caracteriza-se pelo intervalo de
tempo (em meses), após a cirurgia, a partir do qual manifestações clínicas direta ou
indiretamente relacionadas á neoplasia são verificadas, por exemplo, o aparecimento de
crises convulsivas, cefaleia, depressão, infecções secundárias e trombose venosa profunda .
Nesta investigação, a media foi de 7,56 meses. Até onde sabemos, este é um dado original
em uma casuística brasileira, visto que não encontramos tal informação em estudos prévios
para comparação.
O tempo livre de doença radiológica (TLDR) é o intervalo de tempo (em meses)
entre a ressecção cirúrgica e o reaparecimento ou aumento da lesão detectados por métodos
radiológicos, independentemente de manifestações clínicas. Em nosso trabalho tal
intervalo apresentou uma média de 7,14 meses, discretamente menor do que o tempo livre
de doença clínica. Esta diferença poderia ser explicada pelo fato de a lesão aumentar ou
reaparecer usualmente antes das manifestações clinicas. Um TLDR maior seria esperado
caso os pacientes somente realizassem exames radiológicos após manifestações clínicas.
Porém, não é o que acontece no Serviço de Neurocirurgia da Unicamp, no qual ocorrem
visitas e exames regulares pré-estipulados.
59 !
Com relação à análise morfológica, foram encontrados 3 ou 4 dos critérios
histopatológicos estabelecidos pela Organização Mundial de Saúde(OMS)em 2007, ou
seja: atipias, figuras de mitose, proliferação vascular (hiperplasia endotelial) e/ou necrose.
A contagem de figuras de mitose por 10 campos de maior aumento (CGA) foi feita
de forma aleatória em cada lâmina estudada. A média foi de 3,9 figuras de mitose/10 CGA.
Tal média encontra-se um pouco abaixo do valor habitualmente encontrado na literatura
(2,49), o qual situa-se ao redor de 4 a 6 figuras de mitose/10CGA. No entanto, há grande
variação entre os valores encontrados nos trabalhos que relatam este dado
quantitativo.Especificamente, no nosso estudo, o número relativamente pequeno de
pacientes investigados e o fato de termos avaliado uma lâmina por caso pode ter
influenciado no resultado obtido.
Hiperplasia endotelial é um achado comum e exuberante na maioria dos
glioblastomas. Sua quantificação ou classificação não foi realizada neste trabalho pois
consideramos tratar-se de avaliação subjetiva e de difícil reprodutibilidade e correlação
com dados clínicos.
Por sua vez, a extensão de área necrótica em cada lâmina avaliada foi estimada
como percentual da área total do tumor presente no corte histológico. No entanto, ainda que
tal estimativa seja de mais fácil realização do aquela correspondente á hiperplasia
endotelial, a correlação da extensão da área necrótica com dados clínicos ou
imunoistoquímicos não foi realizada por ser informação altamente dependente da área
tumoral ressecada, tempo até a cirurgia e habilidade do cirurgião, fatores que consideramos
potencialmente variáveis e de difícil comparação entre diferentes estudos.
60 !
Com relação a imunomarcação, aquela realizada para o EGFR resultou positiva em
um padrão citoplasmático de distribuição focal, ou seja, algumas áreas da lesão com
marcação forte e evidente, outras com marcação mais fraca até ausentes. É possível que o
padrão de imunomarcação que obtivemos seja decorrente de questões técnicas de fixação
e/ou processamento do material. De fato, a marcação pode variar de acordo com a técnica
usada, os tempos de exposição ao anticorpo durante sua preparação, a representatividade da
lâmina em relação as características da lesão, inclusive com diferentes áreas de extensão de
necrose (usualmente não marcadas) e hiperplasia endotelial (também não marcadas).
Quanto às características próprias dos glioblastomas, em função destas neoplasias
apresentarem áreas heterogêneas, a imunomarcação também pode ser variável. Ainda com
relação ao padrão de imunomarcação para EGFR descrito no presente estudo, este foi
classificado como III e IV em 20 dos 36 casos, o que aproxima-se do observado em outros
estudos com a forma selvagem (12,13,20). Especificamente nestes últimos estudos (13,20),a
marcação foi descrita apenas como positiva ou negativa. A comparação dos dados do
presente estudo com outros da literatura, no entanto, não pode ser exata. Isto porque que
alguns trabalhos (20) empregaram anticorpo monoclonal vIII contra a forma mutante do
EGFR (EGFRvIII), ao passo que detectamos a forma selvagem do mesmo receptor.Porém
acreditamos que as diferenças não são significativas.
Com relação à imunomarcação para a proteína p53, o padrão que observamos foi
nuclear e a distribuição, difusa. Tal distribuição pode ser justificada pelo fato de a mutação
do gene TP53 ser um evento precoce na fisiopatogênese do glioblastoma e os casos que
avaliamos serem constituídos por lesões que já estavam apresentando achados morfológicos
e imunofenotípicos característicos de glioblastoma. Dos 36 casos analisados, 31
61 !
apresentaram positividade para a p53 mutante em pelo menos 50% de cada corte
histológico avaliado (classes III e IV). Este resultado aproxima-se daqueles relatados na
maioria dos trabalhos publicados (21,22,23,25).
A investigação da forma mutante da IDH-1 na nossa casuística permitiu a detecção
de somente um caso positivo, ou seja, cerca de 3% dos indivíduos. Esta proporção
aproxima-se do número encontrado em trabalhos mais recentes (29,30,32), o qual é ao redor de
5%. A mutação da IDH-1 parece apontar para um prognóstico ligeiramente melhor e talvez
seja este o motivo de ser encontrada com maior frequência em tumores secundários (2,33).
No entanto, em nossa amostra de pacientes encontramos apenas um caso de glioblastoma
secundário, o qual foi negativo para a forma mutante da IDH-1. Este resultado pode ser
justificado pelo fato de a probabilidade média de um glioblastoma secundário ser positivo
para esta mutação ser menor do que 20% (2,33).
A imunomarcação para proteína dupla murina 2 (MDM2) foi nuclear e de
distribuição focal, porém com um padrão mais difuso do que o encontrado na
imunoistoquímica para EGFR. A marcação de distribuição focal pode ser explicada pelos
mesmos motivos descritos acima para o EGFR, ou seja, variabilidade da amostra tumoral
nos cortes histológicos e condições técnicas de fixação e reação imunoistoquímica.Com
relação à expressão de MDM2 em glioblastomas, a sua amplificação e aumento de
expressão parecem ser precoces na fisiopatogênese tumoral e se correlacionariam
positivamente com a mutação do geneTP53 (40,41).Especificamente, no presente estudo, dos
36 casos analisados, 21 apresentaram positividade que foi classificada como III e IV. A
detecção desta positividade é corroborada por observações de outros autores, os quais
62 !
descrevem a expressão de MDM2 (simplesmente como positiva) em torno de 50 a 60%dos
casos que avaliaram (41,42,43).
Quanto à análise de correlações entre os dados clínicos e morfológicos,
encontramos que a correlação entre classes de imunomarcação para p53, IDH-1, EGFR e
MDM2 com a sobrevida total não resultou significativa para nenhum dos marcadores. Estes
resultados não são compatíveis com os encontrados na literatura (2,13,24,30,41), principalmente
no que se refere a p53 e EGFR. É possível que tal discrepância entre nossos dados e aqueles
da literatura seja devido ao fato de que a maioria dos trabalhos possui um número de
pacientes significativamente maior que o estudado aqui, além de incorporar indivíduos
originários de vários centros (multicêntrico).
As relações entre as classes de imunomarcação para p53 e MDM2, p53 e EGFR e
EGFR e MDM2 também foram realizadas Foi detectada dependência, isto é, uma relação
estatisticamente significativa entre p53 e MDM2 (p-valor=0,00) e entre EGFR e MDM2 (p-
valor=0,04). Por outro lado, não foi detectada relação estatisticamente significativa entre
p53 e EGFR (p-valor=0,09).
Particularmente, a relação entre a expressão da forma mutante da p53 e a expressão
de MDM2 é bem estabelecida na literatura (42,43). Tal relação corrobora o fato de que tais
eventos biológicos sejam alterações precoces nos astrocitomas de alto grau, aumentando a
sobrevida celular devido a diminuição da capacidade das células de desencadear morte por
apoptose.
Quanto a correlação entre classes de imunomarcação de p53, MDM2 e EGFR com a
sobrevida clínica e com a sobrevida radiológica, a única relação estatisticamente
63 !
significativa detectada, foi entre p53 e sobrevida clínica (p-valor=0,02), onde é possível
observar que quanto maior o nível de p53, menor a sobrevida clínica. Não há relação
estatisticamente significativa entre IDH-1, EGFR, MDM2 e a sobrevida total em meses
clínica e radiológica. Novamente a ausência de relação observada entre estes marcadores e
sobrevida clinica e radiológica pode ser justificada pelo baixo número de pacientes
avaliados, comparado a outros estudos multicêntricos (2,13,24,30,41).
A correlação entre a expressão de MDM2 e aquela da variante selvagem do EGFR
também foi positiva, apesar de menos significativa, com um p-valor de 0,04. Neste caso,
não há uma relação biológica tão linear entre a expressão aumentada dos dois marcadores.
De fato, sabe-se que a superexpressão do EGFR contribui com a indiferenciação,
proliferação, sobrevivência, migração e capacidade invasiva das células neoplásicas, bem
como aumenta a angiogênese tumoral (2,20). Todas estas características diminuem a resposta
à quimioterapia e radioterapia. Por outro lado, o gene MDM2codifica uma enzima nuclear
denominadae3 ubiquitina ligase que promove a formação tumoral por atingir genes
supressores, como o TP53, por degradação proteossomal. Nossos dados de correlação
sugerem que a relação entre a forma selvagem do EGFR e a proteína MDM2 seria indireta
e, provavelmente, intermediada pelo geneTP53 (41,43).
O fato de não termos encontrado correlação entre a proteína mutante p53 e a forma
selvagem do EGFR neste estudo, provavelmente se justifica pelo número pequeno de
pacientes, uma vez que esta correlação é descrita e comprovada em outros trabalhos (2,12).
As correlações entre as sobrevidas clínica, radiológica e total foram todas
estatisticamente significativas, com p-valor menor que 0,0001, e foram correlações
positivas, ou seja, o aumento de uma sobrevida implica no aumento de outra. A correlação
64 !
mais forte foi entre sobrevida clínica e radiológica (R = 0,79), seguida de radiológica e total
(R = 0,75) e clínica e total (R = 0,69). Estes valores são naturalmente esperados e fazem
sentido biológico, já que o aumento do tumor no exame radiológico implica diretamente no
aparecimento de sintomas (sobrevida clínica) e posterior óbito (sobrevida total).
As correlações do gênero com as sobrevidas clínica, radiológica e total não
resultaram em relações estatisticamente significativas, uma vez que as médias são
estatisticamente iguais pelo teste de Kruskal-Wallis, com p-valor igual a 0,36 para a
sobrevida clínica, 0,38 para a radiológica e 0,81 para a total. Estes achados são compatíveis
com a maior parte dos resultados de outros trabalhos (2,49). De fato, poucos autores relatam
sobrevida levemente maior, porém não significativa, em mulheres (2,10,49).
Em seguida, avaliamos a dependência, ou seja a relação, da expressão da proteína
mutante p53, da MDM2 e da forma selvagem do EGFR com mitoses e extensão de
ressecção tumoral. Não foi encontrada relação estatisticamente significativa, uma vez que
todos os p-valores dos testes Qui-Quadrado desenvolvidos foram maiores que 0,05. Apesar
da correlação entre p53, MDM2 e EGFR com o número de mitoses e extensão de ressecção
tumoral fazer sentido biológico, é possível que o número reduzido de pacientes
selecionados para o presente estudo não permitiu significância estatística.
Com relação às frequências cruzadas entre as classes de imunomarcação parap53,
MDM2 e EGFR com a localização do tumor, observamos que não há relação
estatisticamente significativa, pois o p-valor entre p53 e a localização do tumor foi de 0,59,
do p valor entre MDM2 e a localização do tumor foi de 0,93 e do p valor entre EGFR e a
localização do tumor foi de 0,88 (todos maiores que 0,05). Até onde sabemos, estes dados
não foram previamente reportados na literatura.
65 !
Quanto a correlação das sobrevidas clínica, radiológica e total com a localização do
tumor não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas em nenhuma das
sobrevidas, uma vez que o p-valor foi igual a 0,58 para a sobrevida clínica, 0,70 para a
radiológica e 0,65 para a total. Dessa forma, podemos concluir que não há relação
estatisticamente significativa entre nenhuma das sobrevidas e a localização do tumor na
presente investigação. Parte-se do pressuposto de que lesões tumorais em áreas de difícil
acesso cirúrgico (como o diencéfalo) ou com pouco espaço para crescimento (como a fossa
posterior) prejudiquem a ressecção tumoral e, por consequência, diminuem a sobrevida.
Nossos achados, porém, não corroboraram este pressuposto. Isto também pode ser
justificado pelo reduzido número de pacientes avaliados.
A respeito da correlação das sobrevidas clínica, radiológica e total com a idade não foram
detectadas correlações estatisticamente significativas, uma vez que p-valor é maior que
0,05 em todos os casos. A literatura aponta um pior prognóstico para pacientes com idade
superior a 60 anos no momento do diagnóstico (2,10,49). A forma variável e pouco precisa de
mensuração da sobrevida de pacientes com glioblastoma poderia explicar parcialmente a
discrepância entre os presentes dados e aqueles prévios da literatura. Por exemplo, verifica-
se que, em indivíduos com menos de 60 anos, há maior incidência de glioblastoma
secundário, ou seja, de evolução mais prolongada devido ao aparecimento primeiramente
de lesões de menor grau (3). A sobrevida calculada para estes pacientes pode ser maior, pois
o seu cálculo pode se iniciar a partir da biópsia do tumor original de menor grau. De fato,
não se sabe, na evolução da doença, o momento exato do aparecimento do glioblastoma
como um continuum da neoplasia menos agressiva.
66 !
Por último, as correlações das sobrevidas clínica, radiológica e total com a extensão
da ressecção subtotal ou total não foram estatisticamente significativas. Para a sobrevida
clínica, o p-valor foi de 0,98, para a radiológica foi de 0,87 e para a total foi de 0,57. Sabe-
se que na literatura há correlação direta e bem estabelecida entre a extensão de ressecção do
tumor e a sobrevida, sendo, até o momento, o principal fator prognóstico (2,3). Acreditamos
que a ausência de correlação em nosso trabalho decorreu principalmente do restrito número
de pacientes avaliados.
67
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6. CONCLUSÕES
· No presente estudo, a localização predominante dos glioblastomas foi o lobo frontal,
sendo que a maioria (cerca de 97%) apresentou características clínicas, radiológicas e
morfológicas compatíveis com o diagnóstico de glioblastoma primário.
· Foi detectada relação estatisticamente significativa entre a imunomarcação para a
forma mutante da p53 e MDM2 (p-valor=0,00), e entre a expressão do EGFR e MDM2
(p-valor=0,04).
· Foi detectada relação estatisticamente significativa entre marcação para p53 e
sobrevida clínica (p-valor=0,02), sendo que quanto maior a classe de 53, menor a
sobrevida clínica.
· As correlações entre as sobrevidas clínica, radiológica e total foram todas
estatisticamente significativas (p-valor<0,0001) e positivas, ou seja, o aumento de uma
sobrevida implica no aumento de outra.
· Não foram encontradas relações estatisticamente significativas entre outros parâmetros
clínicos e morfológicos correlacionados, possivelmente em decorrência da limitação da
amostra de pacientes avaliados.
68
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69
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73
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APÊNDICES
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Teste de Kruskal-Wallis
O teste Kruskal-Wallis um teste não paramétrico que equivale ao teste F da
ANOVA, ou seja, tem como objetivo detectar se existe diferença significativa entre as
médias (parâmetro de localização das distribuições) de k amostras diferentes. Este teste
não paramétrico tem a vantagem, perante ao teste F da ANOVA, o fato de não supor
normalidade na distribuição da variável de interesse nem homoscedasticidade (igualdade de
variância das k diferentes populações) dependendo apenas que a variável seja de escala
ordinal.
O teste Kruskal-Wallis é baseado na estatística de postos. Em que utilizamos os
números de ordem das observações para obter a estatística do teste. Primeiramente juntam-
se as observações de todos os grupos que queremos comparar (k amostras), e ordenam-se
todas as observações de forma crescente, o número de ordem de cada observação é seu
posto. Quando existem observações iguais (empates), o número de ordem a atribuir a cada
uma das observações empatadas é o número de ordem médio dos números de ordem que
essas observações teriam se não estivessem empatadas.
Sejam k as amostras em análise, cada um com Ni repetições, Pretende-se verificar
se as k amostras têm distribuições idênticas. O teste de hipóteses é:
74
!
H0: As distribuições das k amostras são idênticas;
H1: As distribuições das k amostras diferem na localização.
A estatística de teste é:
onde Ri é a soma dos números de ordem das Ni observações do grupo i.
Se existem números de ordem empatados, a estatística de teste deve ser corrigida
para:
Em que ut é o número de empates em cada grupo e m é o número de grupos de ordem
empatados.
75
!
Teste Exato de Qui-Quadrado para Independência
Para avaliar a dependência (relação) entre as categorias de duas variáveis,
utilizamos o teste de Qui-quadrado, no entanto o p-valor do teste sofre distorções em casos
em que o cruzamento de pelo menos duas categorias apresenta frequência muito baixa:
geralmente utilizamos a frequência de 5 observações como limiar de frequência muito
baixa em uma categoria.
Em caso de baixa frequência de categoria utiliza-se testes exatos como, por
exemplo, o teste exato de Fisher para independência de variáveis com duas categorias.
Quando falamos em tabelas de RxC categorias é bastante comum o uso do teste exato de
Qui-quadrado baseado no método de Radlow e Alf.
O método Radlow e Alf (1975) é baseado na permutação de diversos testes Qui-
quadrado para a tabela de contingência em análise. Primeiramente são simuladas todas as
possibilidades de tabelas de frequência com o número de categorias e observações da tabela
original, e para cada tabela gerada compara-se o valor da estatística Qui-Quadrado com o
valor da estatística da tabela original (tabela observada). Se o valor da estatística Qui-
quadrado na tabela gerada for maior ou igual ao valor da estatística da tabela observada, o
p-valor exato é incrementado pela probabilidade de ocorrência daquela tabela. A hipótese a
ser testada é:
H0: as categorias entre as duas variáveis são independentes
76
!
E a estatística teste é dada por:
Onde o valor estimado eij é dado por :
E nij é a frequência da ocorrência nas categorias i da variável I e categoria j da
variável J.
Dessa forma, rejeitar H0 significa que há dependência entre as categorias das duas
variáveis em estudo, ou seja, há uma relação estatisticamente significativa entre as
variáveis.
77
!
Coeficiente de Correlação de Pearson
O coeficiente de correlação de Pearson é uma medida de associação linear entre
duas variáveis X e Y:
Neste caso a associação é dada por uma medida da variância compartilhada entre
duas variáveis, e o modelo linear supõe que o aumento ou decremento de uma unidade na
variável X gera o mesmo impacto em Y. Em termos gráficos, por relação linear entende-se
que a melhor forma de ilustrar o padrão de relacionamento entre duas variáveis é através de
uma linha reta. Portanto, a Correlação de Pearson (r) exige um compartilhamento de
variância e que essa variação seja distribuída linearmente.
O coeficiente de correlação Pearson (r) varia de -1 a 1. O sinal indica direção
positiva ou negativa do relacionamento e o valor sugere a força da relação entre as
variáveis. Uma correlação perfeita (-1 ou 1) indica que o escore de uma variável pode ser
determinado exatamente ao se saber o escore da outra. Por outro lado, uma correlação de
valor zero indica que não há relação linear entre as variáveis.
!
78
!
79
!
EGFR, p53, IDH-1 and MDM2 immunohistochemical analysis in glioblastoma:
Therapeutic and prognostic correlation.
Análise imunoistoquímica para EGFR, p53, IDH-1 e MDM2 em glioblastoma:
Correlação terapêutica e prognóstica.
Richard Murdoch Montgomery, Luciano de Souza Queiroz, Fabio Rogerio*
Department of Pathology, State University of Campinas – UNICAMP, Campinas, Brazil.
Rua Tessália Vieira de Camargo, 126 Cidade Universitária Zeferino Vaz CEP: 13083-887,
Campinas, São Paulo Brasil.
Emails: R.M. Montgomery: [email protected] ; L.S. Queiroz:
[email protected] ; F. Rogerio: [email protected].
* Corresponding author: Prof. Dr. Fabio Rogerio; email: [email protected]
Universidade Estadual de Campinas – Unicamp
Faculdade de Ciências Médicas – FCM /
Departamento de Anatomia Patológica
Rua Tessália Vieira de Camargo, 126 – Cidade Universitária Zeferino Vaz. CEP 13083-887
– Campinas, SP, Brasil
Telefone: (19) 3521-7541
Fax: (19) 3289-3897
This manuscript has 2,889 words, 2 tables and 5 figures.
80
!
Abstract
We studied glioblastoma cases at HC-UNICAMP from 2008 to 2012, the histopathological
features of the lesions and classified the immunohistochemical distribution of the wild-type
epidermal growth factor receptor (EGFR), mutated forms of p53 protein and isocitrate
dehydrogenase-1 (IDH-1) and murine double protein 2 (MDM2). Immunostaining findings
were correlated with clinical data and response to treatment (surgery, chemotherapy and
radiotherapy). About 97% of the tumors were primary, most of them localized in the frontal
lobe. Mean time free of clinical or symptomatic disease and free time of radiological
disease were 7.56 and 7.14 months, respectively. We observed a significant positive
correlation between expressions of p53 and MDM2, EGFR and MDM2. Clinical,
radiological and overall survivals also showed a significant positive correlation. p53
staining and clinical survival showed a significant negative correlation. The current series
provides clinical and histopathological data and contributes to knowledge on glioblastoma
in Brazilians.
Key words: Glioblastoma, Neurosurgery, Temozolomide, Immunohistochemistry, Clinical
Prognosis.
81
!
Resumo
Estudamos casos de glioblastoma acompanhados no HC-UNICAMP de 2008 a 2012, suas
características histopatológicas e classificamos a marcação imunoistoquímica da forma
selvagem do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), formas mutantes da
proteína p53 e isocitrato desidrogenase-1 (IDH-1) e proteína murina dupla 2 (MDM2). Os
resultados de imunoistoquímica foram correlacionados com dados clínicos e resposta ao
tratamento (cirurgia, quimioterapia e radioterapia). Cerca de 97% dos tumores foram
primários, grande parte localizada no lobo frontal. O tempo médio livre de doença clínica
ou sintomática e o tempo livre de doença radiológica foram de 7,56 e 7,14 meses,
respectivamente. Observou-se correlação positiva entre a expressão das proteínas p53 e
MDM2, EGFR e MDM2. Sobrevivências clínica, radiológica e global também mostraram
correlação positiva e significativa. A expressão para p53 e sobrevivência clínica mostrou
correlação negativa. O estudo fornece dados clínicos e histopatológicos que contribuem
para o conhecimento sobre glioblastoma em brasileiros.
Palavras-chave: Glioblastoma, Neurocirurgia, Temozolomida, Imunoistoquímica,
Prognóstico Clínico.
82
!
Gliomas are the most common brain tumor in adults, accounting for about 70% of
primary neoplasms of the central nervous system (CNS). Glioblastoma (GBM) is the most
common glioma, accounting for approximately 70% of astrocytomas and 15% of all
intracranial neoplasms. About 90% of GBMs are classified as primary. Such lesions affect
mainly the elderly (mean age 62 years), have rapid evolution (less than 3 months) and no
clinical or histopathological evidence of precursor lesions1. On the other hand, secondary
GBMs affect younger individuals (average age 45 years) and progress slowly from a lower
degree of diffuse astrocytoma. Histologically indistinguishable from each other, the two
forms of GBM have poor prognosis. Patients with primary GBM have a median survival of
approximately 5 months and those with a secondary form, 8 months1,2,3
.
Histological analysis defines the type of an astrocytic neoplasm. However,
diagnostic difficulties may arise due to the heterogeneity of the tumor, morphological
overlap with other gliomas or partial sampling of the lesion. As a result, in recent decades,
several studies have used molecular techniques aiming to find biomarkers with diagnostic
and / or prognostic relevance. Such studies not only allowed the identification of such
markers, but also led to a significant increase in knowledge of the pathogenesis of gliomas
and identification of potential targets for new therapeutic approaches1,2,3
.
Particularly in recent years, molecular findings identified as important biological
markers of clinical outcome and/or the therapeutic response are: overexpression of
epidermal growth factor receptor (EGFR), mutation of TP53 gene and its derived protein
(p53), mutation of isocitrate dehydrogenase-1 (IDH-1) and altered expression of murine
double protein 2 (MDM2).
High protein levels of EGFR occurs in about 90% of astrocytic tumors, suggesting
that alterations in transcription and translation of this gene may also participate in
tumorigenesis. Amplifications and rearrangements of EGFR are highly indicative of high-
grade gliomas, with a worse prognosis than estimated from just histopathologic grading4.
This fact has prompted the investigation of EGFR inhibitors aiming to promote apoptosis of
cancer cells and increasing tumor sensitivity to possible adjuvant therapies.
83
!
It has been considered that the increased expression of TP53 is a response to
aggression to DNA5,6
. Cells with impaired function of p53 may develop genetic aberrations
and lead to the development of malignancies1.
Specifically, mutations in the IDH1 gene were identified in gliomas of low and high
grade, including GBM. In the latter, it was found that such mutations occur predominantly
in younger individuals, with the secondary form of cancer and longer survival. The IDH1
gene encodes the cytosolic isoform of IDH that takes part in cellular respiration. Under
physiological conditions, this enzyme catalyzes the conversion of isocitrate to α-
ketoglutarate, a process in which there is synthesis of nicotinamide adenine dinucleotide
phosphate (NADPH) from reduced NADP +. Both α-ketoglutarate as the NADPH are
considered to be protective against oxidative damage. All of the IDH1 mutations known to
date are heterozygous and somatic. The most common alteration in the protein occurs in the
amino acid position 132 and determines the substitution of arginine for histidine
(R132H)8,9,10,11,12,13
. IDH1 mutations alter the normal enzyme activity reducing the
synthesis of α-ketoglutarate and NADPH, which makes the cell more susceptible to
oxidative stress. The mutated IDH also has a gain of function that leads to the reduced α-
ketoglutarate D-2-hydroxyglutarate (2HG). This new enzymatic activity leads to the
consumption of α-ketoglutarate and NADPH, further imparing the protection against
oxidative stress. The 2HG produced in excess is considered an oncogenic metabolite as it
induces epigenetic changes that lead to aberrant regulation of gene expression. This
compound also induces increased levels of HIF-1α (hypoxia-inducible factor-1 α), a
transcription factor that promotes angiogenesis by increasing the expression of vascular
endothelial growth factor (VEGF)4.
The protein Murine Double Protein 2 (MDM2) inhibits the p53 function of
activating genes responsible for apoptosis or cellular repair proteins. MDM2 also inhibits
the function of other suppressor genes such as pRb, which in turn stimulates DNA synthesis
in the S phase of mitosis. Thus, changes in the levels of MDM2 may cause disturbance in
cell cycle control and contribute to oncogenesis. Usually MDM2 is associated with
mutation of the p53 protein with direct and proportional relationship to the degree of
malignancy and proliferation indices, specifically the number of mitoses per field.
84
!
The aim of this study was to investigate the prevalence of GBMs in the General
Hospital of the State University of Campinas (UNICAMP) and correlate the
immunostaining patterns of EGFR, p53, IDH1 and MDM2 with neoplastic morphological
findings, clinical evolution, response to treatment and prognosis.
Method
The present study was retrospective and based on clinical and histopathological
analyses of surgical samples from patients with primary or secondary GBM treated at the
General Hospital of the State University of Campinas (UNICAMP) from January 2008 to
December 2012. This investigation was approved by the Ethical Committee of our
institution (Protocol: CAAE: 03307712.9.0000.5404). The age range considered was from
22 to 81 years of age. Samples from patients who were not treated according to the
mainstream protocol (ie, surgery with total or subtotal resection, radiotherapy with 60 Gy
and chemotherapy with temozolomide) were excluded. Age, gender, overall survival,
radiological survival, with survival time free of clinical disease, total or subtotal resection,
the use of other chemotherapeutic or extra doses of radiation were reviewed and correlated
with histopathological and immunohistochemical findings.
Histopathological analysis was performed in specimens obtained from the
Department of Pathology – UNICAMP. Tumor tissue was previously fixed in 10% neutral
buffered formalin and processed for paraffin embedding. 4 µm thick sections were stained
with hematoxylin and eosin (H&E). According to the last edition of the World Health
Organization (WHO) classification of CNS tumors3, the diagnosis of GMB was confirmed
by identifying at least three of the following features in astrocytic tumors: cellular atypia,
mitotic figures, necrosis and/or endothelial hyperplasia. Immunohistochemical analyses
using streptavidin-biotin peroxidase complex method were performed by using the
antibodies shown in Table 1. Positive and negative controls of the immunohistochemical
reaction were used in all reactions.
The immunostaing patterns for p53, EGFR and MDM2 were evaluated considering
both cellular (cytoplasm and / or nucleus) and tissue distribution (focal or diffuse). We
85
!
adapted the classification proposed by Giordana et al 14
and Korolopoulou et al15
and
classified histological lesions in 4 classes: I (0-25%), II (25-50%), III (50-75%) and IV (75
- 100%), in which the % value corresponds to the estimated distribution of
immunopositivity of the biological marker in the evaluated section. For IDH1 staining, we
adopted the binomial classification of "positive" or "negative", according to the presence or
absence of neoplastic cells with stained cytoplasm11,12,13
. For statistical analysis, mean
absolute and relative frequency, Kruskal-Wallis and Chi-Square methods and the
correlation coefficient of Pearson were used. The Kruskal-Wallis test was used to assess the
difference between the means of quantitative variables in different categories (samples) for
categorical variables. The Chi-Square test was used to assess the independence between
categories of two categorical variables. Pearson correlation coefficient was used to assess
the correlation between two quantitative variables. All tests of hypotheses developed in this
study considered 5% significance level, ie, the null hypothesis was rejected when p-value
was less than 0.05.
Results
In the present study we evaluated 36 patients, whose mean age was 57 years old
with a median of 59 years. In 8 individuals the diagnosis was made after 67 years. Of all
cases studied, 16 (45%) were male and 20 (55%) female. Two tumors were found in the
diencephalon, 9 in the temporal lobe, 17 in the frontal lobe, 6 in the parietal lobe and 1 in
the occipital lobe. Thirty five tumors were clinically diagnosed as primary and only one as
secondary. The treatment of all cases was standardized: surgery with total or subtotal
resection, initial chemotherapy with temozolomide (200 mg/m2) only and radiotherapy with
60 Gy. Follow-up with new cycles of temozolomide occurred according to the progress of
each case. The mean free time of clinical disease was 7.56 months, with a median of 7,56
months (minimum of 4 months and maximum of 11 months).The average free time of
radiological disease was 7.14 months, with a median of 7 months (minimum of 4 months
and maximum of 10 months) (Table 2). In all cases the classic GBM histological findings
were observed: atypia, mitosis, endothelial hyperplasia and necrosis (Figure 1).
86
!
Regarding EGFR immunopattern, cytoplasmic positivity was noted with irregular
distribution in the lesion, intensity ranging from weak to strong. Positivity for EGFR was
categorized in 4 classes with the following corresponding percentage of positive cells: class
1 (0-25%), class 2 (26-50%), class 3 (51-75 %) and class 4 (76 to 100%). Within the total
of 36 patients, 1 was assigned class 1, 7 class 2, 18 class 3 and 10 class 4 (Table 2).
The staining pattern for p53 protein was nuclear, with an irregular tissue distribution
and strong intensity. As used for EGFR, positivity for p53 was described in 4 classes. Thus,
within the total of 36 patients, no one was assigned class 1 (0-25%), 5 were considered
class 2 (26-50%), 17 class 3 (51-75%) and 14 class 4 (75-100 %) (Figure 3).
Immunopositivity for the mutated form of IDH-1 was observed in one case and its
pattern was cytoplasmic, ranging from weak to strong and irregularly distributed. In
parallel, we investigated a sample of low-grade diffuse astrocytoma (WHO grade II)
obtained from our institution files and with known immunopositivity for this mutated
enzyme (positive external control) (Figure 4).
The pattern of immunostaining for MDM2 was nuclear with an irregular tissue
distribution and strong intensity. As used for EGFR and p53, positivity for MDM2 was
described in 4 classes: 2 patients were allocated in class 1, 13 class 2, 16 class 3 and 5 class
4 (Figure 5).
Dependence, ie, a statistically significant relationship, was detected between
immunostaining for p53 and MDM2 (p-value = 0.00) and between EGFR and MDM2 (p-
value = 0.04).
A negative correlation was detected between immunostaining for p53 and clinical
survival (p-value = 0.02). In fact, the higher the class for p53, the lower the clinical survival
in months.
All correlations between mean clinical, radiological and total survivals were
statistically significant and positive (all p-values < 0.0001). The strongest correlation was
between clinical and radiological survivals (0.79), followed by radiological and total (0.75)
and clinical and total survival(0.69).
87
!
Discussion
In general, the set of clinical data collected from the medical records of our
institution approximates the data obtained from the literature1,16,17,18
. Among the 36 cases
we analyzed, only one (around 3%) was considered to be secondary. This percentage is
close to the value observed by other authors, that is, around 5%1,16,18
.
The choice of treatment performed at our institution follows what is found in several
protocols of services around the world. However, some patients were not subjected to this
treatment protocol, as side effects of radiotherapy and / or chemotherapy or clinical
conditions prevented the standard treatment and, consequently, inclusion in the present
study. Thus, we selected only patients who underwent the regular protocol approach. This
limitation reduced the number of patients to be included in this study. On the other hand,
the selection unified our sample for comparison of results, thus allowing more reliable
correlations (with minimal interference from external variables).
The time free from clinical or symptomatic disease is characterized by the interval
(in months) after surgery, from which directly or indirectly related clinical cancer
manifestations are checked, for example, the onset of seizures, headache, depression,
secondary infections and deep vein thrombosis. In this investigation, the average was 7.56
months. To our knowledge, this is an original data in a Brazilian sample, since we did not
find such information in previous studies for comparison.
The free time of radiological disease (FTRD) is the interval (in months) between the
surgical resection and the onset or increase of the lesion detected by radiological methods,
regardless of clinical manifestations. In our work this interval showed an average of 7.14
months, slightly lower than the free time of clinical disease. This difference could be
explained by the fact that the lesion usually increases or reappears before clinical
manifestations. A larger FTRD would be expected if patients only performed radiological
examinations after its clinical manifestations. However, it is not what happens at the
Department of Neurosurgery at Unicamp, where visits and pre-stipulated regular checkups
occur.
88
!
Regarding the immunostaining, positivity for EGFR was cytoplasmic and focally
distributed, ie, some areas of the lesion with strong or weaker labeling. It is possible that
the pattern of immunostaining obtained be the result of technical pre-analytical issues like
fixation and / or processing of the material. Indeed, the labeling may vary according to the
technique used, the exposure time to antibodies and lesion sampling. With respect to the
immunostaining pattern for EGFR that we observed it was assigned class 3 and 4 (from
50% to 100% of the section analyzed) in 28 of 36 cases. Such range of percentage is similar
to that described in other studies in which the wild type of EGFR was studied1,4,19,20
. Thus,
our classification allows a reliable comparison with previous reports.
The immunostaining pattern for p53 that we observed was nuclear and the
distribution, diffuse. Of the 36 cases analyzed, 31 were positive for p53 mutated in at least
50% of each evaluated histological sections (classes 3 and 4). Such distribution could be
explained by the fact that p53 mutation is an early event in the pathogenesis of
glioblastoma and the cases that we evaluated were constituted by tumors in a later stage,
thus harboring a wide distribution of the mutated protein in the tumor section evaluated.
This result is close to those reported by other authors1,6
.
The investigation of the mutated form of IDH-1 in our study allowed the detection
of only one positive case, ie, about 3% of individuals. This ratio is close to the number
found in more recent studies1,8
, which is around 5%. The mutation of IDH-1 seems to point
to a slightly better prognosis and perhaps this is the reason to be found more frequently in
secondary8,9,10
tumors. However, in our sample of patients, we found only one case of
secondary glioblastoma, which was negative for the mutated form of IDH-1. This result can
be explained by the fact that the average probability of a secondary glioblastoma be
positive for this mutation is less than 20%1,8,9
.
The immunostaining for Murine Double Protein 2 (MDM2) was nuclear with an
irregular distribution throughout the section. Similarly to what was observed in the EGFR-
stained specimens, some areas of the lesion showed strong labeling whereas other were
weakly marked. Such focal distribution might be explained by the same reasons described
above for EGFR, ie, variability in histological tumor sample and technical conditions for
fixation and immunohistochemistry. With respect to MDM2 gene expression in
89
!
glioblastomas, their amplification and overexpression in the tumor appear to relate to early
pathogenesis and may be correlated positively with TP53 gene mutations1,2
. Specifically, in
this study 21 cases showed positivity that was categorized as class 3 and 4. MDM2
positivity in GBM was previously reported in a similar proportion of cases1,2
, however the
pattern of distribution in the sample was not specified.
Regarding the analysis of correlations between clinical and morphological data,
dependence was detected, ie, a statistically significant relationship between p53 and MDM2
immunopatterns (p-value = 0.00) and between staining for EGFR and MDM2 (p-value =
0.04). Particularly, the relationship between the expression of the mutated form of p53 and
MDM2 expression is well established in the literature1,2
. This relationship supports the fact
that these biological events are early changes in high-grade astrocytomas, increasing cell
survival due to decreased ability of cells to trigger apoptotic death.
There is also statistically significant positive relationship between p53
immunostaining and clinical survival (p-value = 0.02). The correlation between the
expression of MDM2 and that of the wild variant of EGFR was also positive, (p-value =
0.04). In fact, it is known that overexpression of EGFR contributes to the differentiation,
proliferation, survival, migration and invasiveness of cancer cells and increases tumor
angiogenesis1. All these features reduce the responsiveness to chemotherapy and
radiotherapy. Furthermore, MDM2 gene encodes a nuclear enzyme called E3 ubiquitin
ligase that promotes tumor formation by targeting suppressor genes such as p53, for
proteosomal degradation1,2
. Our correlation data suggest that the relationship between the
wild type EGFR and MDM2 protein would be indirect and probably mediated by TP53
gene1,2
,.
The correlations between clinical, radiological and overall survival rates were all
positive and statistically significant with p value less than 0.0001. The strongest correlation
was between clinical and radiological survival rates (R = 0.79), followed by radiological
and total (R = 0.75) and clinical and total (R = 0.69) rates. These values are naturally
expected as an increase in tumor visualized through imaging techniques directly yields the
appearance of symptoms (clinical survival) and subsequent death (overall survival).
90
!
Our study shows that there is a strong correlation between EGFR and p53 and
between MDM2 and p53 classes of immunostaining patterns. It also points to a negative
relation between p53 and total survival. In addition to corroborating previous studies on the
clinical-radiological and pathological correlations, our study describes for the first time a
casuistic from a Brazilian institution. Although limited by the relative small number of
patients, this work intends to contribute to the advancement of knowledge on GBM in
Brazil.
Acknowledgements: We would like to thank the UNICAMP laboratory personnel,
especially Ana Claudia S. Piaza; Luzia Magalhães Alves and Arethusa de Souza for their
precious work and dedication.
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Primary Antibody Clone Dilution Origin
EGFR EGFR1-NCL 1:500 Santa Cruz
MDM2 1B10 1:50 Abnova
p53 DO-7 1:200 Dako
IDH-1 H09 1:50 Millpore
Table 1: Technical specifications of antibodies used for immunohistochemical
analyses.
93
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PATIENT AGE GENRE LOCALIZATION TR MFCDT MFRDT SURVIVAL CHEMO ADDITIONAL DOSES OTHER DRUGS RADIO OTHER DOSES "#$%& '()* +,- .#./
1 79 M FRONTAL LEFT Y 8 9 15 YES YES NO PROTOCOLNO 0'(12"3' - 4 -
2 81 M DIENCEPHALON N 8 7 12 YES NO NO PROTOCOLNO 0'(12"3' - - -
3 56 F FRONTAL LEFT Y 9 8 13 YES INDETERMINATED NO PROTOCOLNO 0'(12"3' / - /
4 61 M FRONTAL LEFT Y 7 8 12 YES NO NO PROTOCOLNO 0'(12"3' 4 - -
5 41 M FRONTAL LEFT Y 6 5 9 YES YES NO PROTOCOLNO +56"2"3' 4 - /
6 42 M TEMPORAL RIGHT N 4 4 9 YES YES NO PROTOCOLYES 0'(12"3' / - /
7 34 F PARIETAL RIGHT Y 7 6 11 YES YES NO PROTOCOLNO 0'(12"3' - - /
8 47 M TEMPORAL LEFT Y 5 5 9 YES YES NO PROTOCOLNO 0'(12"3' 4 4 -
9 24 F FRONTAL RIGHT Y 8 6 10 YES YES YES PROTOCOLNO 0'(12"3' 4 - /
10 48 M PARIETAL LEFT Y 10 9 15 YES YES NO PROTOCOLNO 0'(12"3' / / &
11 77 F FRONTAL RIGHT N 4 4 6 YES NO NO PROTOCOLNO 0'(12"3' - 4 4
12 52 F PARIETAL RIGHT Y 10 8 12 YES YES NO PROTOCOLNO 0'(12"3' - 4 -
13 67 M TEMPORAL LEFT Y 6 6 10 YES YES YES PROTOCOLNO 0'(12"3' 4 - -
14 57 M FRONTAL RIGHT Y 9 7 12 YES NO NO PROTOCOLNO 0'(12"3' / - -
15 67 F OCCIPITAL LEFT Y 7 7 10 YES NO NO PROTOCOLNO 0'(12"3' - 4 -
16 62 M FRONTAL RIGHT Y 10 8 10 YES NO NO PROTOCOLYES 0'(12"3' - - /
17 67 M TEMPORAL LEFT Y 6 6 9 YES NO NO PROTOCOLNO 0'(12"3' - 4 /
18 38 F FRONTAL LEFT N 9 10 14 YES NO NO PROTOCOLNO 0'(12"3' - - /
19 56 F FRONTA RIGHT Y 7 7 10 YES YES NO PROTOCOLNO 0'(12"3' 4 4 4
20 67 F FRONTAL RIGHT Y 9 10 15 YES NO NO PROTOCOLNO 0'(12"3' - 4 -
21 57 F TEMPORAL LEFT N 7 7 11 YES NO NO PROTOCOLYES 0'(12"3' / 4 -
22 60 F TEMPORAL RIGHT Y 7 7 12 YES YES YES PROTOCOLNO 0'(12"3' - 4 -
23 78 M PARIETAL LEFT N 9 10 13 YES NO NO PROTOCOLNO 0'(12"3' 4 - -
24 22 F DIENCEPHALON (SEC)N 11 7 14 YES YES NO PROTOCOLYES 0'(12"3' / - /
25 67 F FRONTAL LEFT Y 6 7 10 YES NO YES PROTOCOLNO 0'(12"3' / 4 -
26 75 F FRONTAL RIGHT Y 7 8 9 YES NO NO PROTOCOLNO 0'(12"3' 4 4 -
27 50 F TEMPORAL LEFT Y 10 9 10 YES NO NO PROTOCOLNO 0'(12"3' - / /
28 51 M FRONTAL RIGHT Y 5 5 9 YES NO NO PROTOCOLNO 0'(12"3' 4 - /
29 46 F TEMPORAL LEFT Y 9 8 8 YES NO NO PROTOCOLNO 0'(12"3' - / /
30 65 F FRONTAL LEFT Y 6 7 10 YES NO NO PROTOCOLNO 0'(12"3' - 4 4
31 67 F PARIETAL RIGHT Y 6 5 8 YES NO NO PROTOCOLNO 0'(12"3' - 4 4
32 46 F FRONTAL RIGHT Y 8 7 13 YES NO NO PROTOCOLNO 0'(12"3' & / &
33 56 M PARIETAL LEFT Y 7 6 9 YES YES NO PROTOCOLNO 0'(12"3' - - /
34 67 M TEMPORAL LEFT Y 6 6 10 YES NO NO PROTOCOLYES 0'(12"3' - - -
35 67 F FRONTAL RIGHT Y 9 9 14 YES YES YES PROTOCOLNO 0'(12"3' 4 - 4
36 63 M TEMPORAL LEFT Y 10 9 14 YES NO YES PROTOCOLNO 0'(12"3' - / -
Table 2: Clinical and immunohistochemical data from the 36 patients with
glioblastoma whose surgical samples were analyzed in the present study. Age is
indicated in years. Survival is indicated in months after histopathological diagnosis. 2, 3
and 4: Immunhistochemical classification (see Method for details). TR: total resection;
MFCDT: median free clinical disease time; MFRDT: median free radiologic disease time;
CHEMO: chemotherapy; RADIO: radiotherapy; M: male, F: female, Y: yes; N: no; IDH-1:
isocitrate dehydrogenase-1; EGFR: epidermal growth factor receptor: p53: p53 protein;
MDM2: murine double protein 2. ‘Additional doses’ refers to the administration of further
doses of temozolomide. ‘Other drugs’ refers to the administration of chemotherapeutical
drugs other than temozolomide. ‘Other doses’ refers to radiotherapy sessions beyond the
standard protocol.
94
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Legends of Figures
Figure 1. Representative histological sections showing diagnostic features of
glioblastoma (hematoxylin and eosin staining). A) Atypical cells displaying
pleomorphic, irregular and hyperchromatic nuclei (40x). B) Multiple neoplastic vessels
with endothelial hyperplasia (4x; inset: 40x). C) Atypical mitotic figure (100x). D) Necrotic
foci (pseudopalisades) (4x).
Figure 2. Immunostaining for epidermal growth factor receptor (EGFR) in
glioblastoma. Representative fields of areas classified as I (A), II (B), III (C) or IV (D) (all
pictures: 20x).
Figure 3. Immunostaining for p53 protein in glioblastoma. Representative fields of
areas classified as I (A), II (B), III (C) or IV (D). Even though some fields were assigned
class I, no specimen was considered class I after thoroughly analysis of the complete
histological section (all pictures: 10x).
Figure 4. Immunostaining for the mutated form of isocitrate dehydrogenase-1 (IDH-1)
in low-grade diffuse astrocytoma and glioblastoma. A and B) Cytoplasmic positivity in
neoplastic astrocytes (yellow arrows; A: 20x; B: 40x). C) Cytoplasmic staining (yellow
arrow) similar to that observed in lower grade neoplastic cells. The pattern shown was
verified in only one of the glioblastoma specimens evaluated and showed irregular
distribution throughout the lesion (20x).
Figure 5. Immunostaining for Murine Double Protein 2 (MDM2) in glioblastoma.
Representative fields of areas classified as I (A), II (B), III (C) or IV (D) (all pictures: 20x).
95
!
Figure 1
96
!
Figure 2
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!
Figure 3
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!
Figure 4
99
!
Figure 5
Plataforma Brasil - Ministério da Saúde
Faculdade de Ciencias Medicas - UNICAMP
PROJETO DE PESQUISA
Título: ESTUDO IMUNOISTOQUIMICO DA EXPRESSAO DE EGFR, P53, IDH-1, IDH-2 E MDM-2
Área Temática: EM GLIOBLASTOMAS E SUA RELACAO COM PROGNOSTICO E RESPOSTA
Pesquisador: Richard Murdoch Montgomery
Instituição: Faculdade de Ciências Medicas - UNICAMP
Versão:
CAAE:
1
03307712.9.0000.5404
PARECER CONSUBSTANCIADO DO CEP
Número do Parecer: 25144
Data da Relatoria: 22/05/2012
Apresentação do Projeto:
Gliomas são os tumores cerebrais mais frequentes em adultos, sendo aqueles derivados de astrócitos denominados astrocitomas. Glioblastoma é o astrocitoma mais agressivo. Apesar das abordagens terapêuticas atuais, o prognóstico dos pacientes portadores desta neoplasia é sombrio. Nas últimas décadas, estudos moleculares visando a identificação de marcadores biológicos para complementar e/ou definir o diagnóstico dos astrocitomas forneceram
informações importantes sobre sua gênese. Com o presente estudo pretende-se (1) compreender melhor a fisiopatogênese de gliomas e (2) investigar associação de achados imunoistoquímicos para EGFR e MDM2 e para as formas mutadas da p53, IDH1 e IDH2 com dados de evolução clínica e resposta ao tratamento, visando contribuir
para melhor manejo clínico dos indivíduos portadores de glioblastoma.
Objetivo da Pesquisa:
Investigar a prevalência de casos de gliomas de alto grau (glioblastoma) tratados na Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp entre janeiro 2008 e dezembro de 2010 e sua expressão morfológica de marcadores biológicos associados, então, com evolução clínica e resposta terapêutica. Levando-se em conta, no entanto, as limitações dos achados e suas relações biológicas frente aos diversos caminhos moleculares de desenvolvimento tumoral e resposta
terapêutica diversa frente as particularidades da lesão específica e variação individual.
Avaliação dos Riscos e Benefícios:
Não há riscos. Benefícios contribuir para o melhor conhecimento fisiopatologico e molecular dos glioblastomas
Comentários e Considerações sobre a Pesquisa:
Trata-se de estudo retrospectivo de blocos de parafina, do arquivo histopatológico do Departamento de Anatomia Patológica da FCM/Unicamp, que não oferece exposição direta de pacientes, portanto não oferece riscos.
Considerações sobre os Termos de apresentação obrigatória:
Pede dispensa, nao havera exposicao direta de pacientes apenas das laminas arquivadas no depto de anatomia patologica da UNICAMP
Recomendações: Não há
Conclusões ou Pendências e Lista de Inadequações:
Não há
Situação do Parecer:
Aprovado
Necessita Apreciação da CONEP:
Não
Considerações Finais a critério do CEP:
100
Em reunião do colegiado: Esclarecimento ao pesquisador: o item "risco" refere-se aos sujeitos de pesquisa. Na solicitação de dispensa do TCLE não há referência quanto ao uso dos prontuários.
CAMPINAS, 22 de Maio de 2012
Assinado por:
Carlos Eduardo Steiner
101