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Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Centro de Tecnologia
Departamento de Engenharia Química
Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Síntese e caracterização de adsorvente pelicular para
Adsorção em Leito Expandido (ALE)
Cinthia Meirelly de Araújo Elpídio
Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos
Coorientadora: Profª. Drª Gorete Ribeiro de Macedo
Natal/RN
Fevereiro/2016
Cinthia Meirelly de Araújo Elpídio
Síntese e caracterização de adsorvente pelicular para
Adsorção em Leito Expandido (ALE)
Dissertação de mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Engenharia Química da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte, para
obtenção do grau de Mestre em
Engenharia Química, sob a orientação do
Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos e
coorientação da Profª Drª Gorete Ribeiro
de Macedo.
Natal/RN
Fevereiro/2016
Catalogação da Publicação na Fonte.
UFRN / CT / DEQ
Biblioteca Setorial “Professor Horácio Nícolás Sólimo”.
Elpídio, Cinthia Meirelly de Araújo.
Síntese e caracterização de adsorvente pelicular para Adsorção em Leito
Expandido (ALE)/ Cinthia Meirelly de Araújo Elpídio. - Natal, 2016.
89 f.: il.
Orientador: Everaldo Silvino dos Santos.
Coorientador: Gorete Ribeiro de Macedo.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro
de Tecnologia. Departamento de Engenharia Química. Programa de Pós-Graduação
em Engenharia Química.
1. Adsorventes - Dissertação. 2. Cromatografia por afinidade - Dissertação. 3.
Biomoléculas - Dissertação. I. Santos, Everaldo Silvino dos. II. Macedo, Gorete
Ribeiro de. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.
RN/UF/BSEQ CDU 661.18 (043.3)
ELPIDIO, Cinthia Meirelly de Araújo – Síntese e caracterização de adsorvente pelicular
para Adsorção em Leito Expandido (ALE). Programa de Pós-Graduação em Engenharia
Química. Área de Concentração: Engenharia Química, Linha de pesquisa: Processos
químicos, catalíticos e biotecnológicos, Natal/RN, Brasil.
Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos
Coorientadora: Profª Drª Gorete Ribeiro de Macedo
Resumo: O presente trabalho refere-se à síntese e caracterização de um adsorvente pelicular
adequado ao processo de Adsorção em Leito Expandido (ALE).O material sintetizado possui
um núcleo composto de esferas de zircônia estabilizadas com ítria e recobertas por uma
matriz insolúvel de agarose. Nos ensaios para obtenção das partículas revestidas foi utilizado
o método de emulsão usando-se um sistema agitado com temperatura controlada. Uma
triagem dos corantes reativos (ligantes) Azul Brilhante de Remazol RN, Remazol Azul
Turquesa G 133% e Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado foi feita variando-se o pH,
para encontrar o ligante com maior capacidade de adsorção de Soro Albumina Bovina (BSA),
e a melhor condição para operar o processo. O corante Remazol Amarelo Ouro RGB
Concentrado foi selecionado, visto que apresentou um bom desempenho (94,348 mg/mL
adsorvente) e se mostrou mais estável em pH 4,5 a 5,0. A análise morfológica das partículas
revestidas foi realizada por microscopia óptica e mostrou que a espessura do adsorvente
pelicular é aproximadamente 2,5 µm. A distribuição de tamanho realizada em Granulômetro
Cilas mostrou que a maioria das partículas adsorventes possui diâmetro entre 112 – 300 µm,
cujo diâmetro médio foi 197,54 µm e 202,25 µm, para a esfera sem e com cobertura,
respectivamente. A avaliação da densidade ligante mostrou que a quantidade deBSA
adsorvida é maior quando a relação corante/adsorvente (µg/mg) é maior. O estudo cinético
mostrou que o equilíbrio é alcançado em menos de uma hora. O modelo de Langmuir ajustou
bem os dados da isoterma apresentando capacidade de adsorção máxima (qm) igual a 102,328
mg de BSA/mL de adsorvente ao se utilizar o adsorvente pelicular imobilizado com o corante
reativo Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado.Observou-se que a resina sintetizada tem
uma boa característica de expansão e pode ser utilizada a uma velocidade de operação
elevada. Nesse caso, foi possível obter uma capacidade dinâmica de 7,832 mg de BSA/mL de
adsorvente.
Palavras-chave: adsorventes, cromatografia por afinidade, biomoléculas.
ELPIDIO, Cinthia Meirelly de Araújo – Pellicular adsorbent synthesis and characterization
for adsorption in expanded bed. Qualificação de Mestrado, UFRN, Programa de Pós-
Graduação em Engenharia Química. Área de Concentração: Engenharia Química, Linha de
pesquisa: Processos químicos, catalíticos e biotecnológicos, Natal/RN, Brasil.
Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos
Coorientadora: Profª Drª Gorete Ribeiro de Macedo
Abstract: This study deal with the synthesis and characterization of a pellicular adsorbent
appropriate to the EBA process. The synthesized adsorbent has a nucleus of zirconia
stabilized with yttria and coated with an insoluble agarose matrix. In the tests to obtain the
coated particles was used the emulsion method coupled to a stirred system using a
temperature controlled. A screening of reactive dyes (linkers) Brilliant Blue Remazol RN,
Remazol Turquoise G 133% and Remazol Yellow Gold RGB concentrate was made by
changing the pH to find the bind capacity to adsorb Bovine Serum Albumin - BSA during the
tests and the best condition to operate the process. The Remazol Yellow Gold Concentrate
RGB was selected, as it performed well (94,348 mg BSA/mL adsorbent) and was more stable
at pH 4,5 to 5,0. Morphological analysis of the coated particles was performed by light-
scattering microscopy and showed that the agarose thickness of the adsorbent is about 2,5
micrometers. The size distribution of granulometer Cilas performed showed that the majority
of the adsorbent particles have a diameter between 112 - 300 µm, whose average diameter
was 197,54 µm and 202,25 µm, for the adsorbent with and without cover, respectively. The
evaluation of the ligand density showed that the higher the ligand density the higher the
amount of adsorbed BSA (mg of BSA / mg of adsorbent). The kinetic study of the dye
immobilized particle showed that equilibrium is reached before one hour. The adsorption
isotherm showed that the Langmuir model fitted quite well with maximum adsorption
capacity (qm) of BSA - to the pellicular particle with the immobilized reactive dye - Remazol
Golden Yellow Concentrate RGB - is equal to 102,328 mg / mL adsorbent. In this study, the
results showed that the pellicular resin has a good characteristic of expansion and may be used
at a high operating flow rate. In this case, a dynamic capacity of 7,832 mg of BSA/mL of
adsorbent was obtained.
Keywords: adsorbents, affinity chromatography, biomolecules.
A Deus, aos meus pais, Marluce e Canindé, e à
minha irmã, Camilla, que são o alicerce da minha
vida dedico este trabalho.
Sumário
Lista de figuras............................................................................................................................i
Lista de tabelas...........................................................................................................................iv
Lista de abreviaturas e siglas......................................................................................................v
1 Introdução.......................................................................................................................... 15
2 Revisão bibliográfica......................................................................................................... 19
2.1 Purificação de biomoléculas ...................................................................................... 19
2.2 Cromatografia ............................................................................................................ 20
2.3 Cromatografia Líquida ............................................................................................... 21
2.3.1 Cromatografia de troca-iônica ............................................................................ 22
2.3.2 Cromatografia de interação hidrofóbica ............................................................. 22
2.3.3 Cromatografia de imunoafinidade ...................................................................... 23
2.3.4 Cromatografia de afinidade ................................................................................ 23
2.3.4.1 Seleção do suporte ou matriz .......................................................................... 25
2.3.4.2 Matriz de agarose ............................................................................................ 25
2.3.4.3 Corantes reativos (ligantes pseudobioespecíficos) ......................................... 26
2.4 Adsorção em Leito Expandido (ALE) ....................................................................... 31
2.4.1 Fundamentos e operação .................................................................................... 33
2.4.2 Caracterização do leito expandido ...................................................................... 34
2.4.3 Adsorventes ........................................................................................................ 36
2.5 Albumina do Soro Bovino (BSA) .............................................................................. 38
3 Materiais e métodos .......................................................................................................... 41
3.1 Síntese, caracterização e avaliação da capacidade de adsorção do adsorvente
pelicular ................................................................................................................................ 41
3.1.1 Material ............................................................................................................... 41
3.1.2 Métodos .............................................................................................................. 42
3.1.2.1 Síntese do adsorvente pelicular ....................................................................... 42
3.1.2.2 Caracterização física dos adsorventes peliculares .......................................... 43
3.1.2.3 Reticulação química das partículas (cross-linking) e imobilização com corante
reativo ........................................................................................................................ 45
3.1.2.4 Densidade ligante ............................................................................................ 45
3.1.2.5 Determinação da concentração de proteínas totais ......................................... 46
3.1.2.6 Triagem dos corantes reativos ........................................................................ 46
3.1.2.7 Cinética de adsorção ....................................................................................... 47
3.1.2.8 Isoterma de adsorção ...................................................................................... 47
3.2 Adsorção em Leito Expandido .................................................................................. 49
3.2.1 Material ............................................................................................................... 49
3.2.2 Métodos .............................................................................................................. 50
3.2.2.1 Expansão do leito ............................................................................................ 50
3.2.2.2 Curva de ruptura ............................................................................................. 51
4 Resultados e discussão ...................................................................................................... 52
4.1 Síntese do adsorvente ................................................................................................. 52
4.1.1 Morfologia do adsorvente pelicular .................................................................... 52
4.1.2 Reticulação química (cross-linking) e imobilização das partículas.................... 56
4.1.3 Densidade ligante ............................................................................................... 60
4.2 Propriedades físicas da partícula ................................................................................ 61
4.3 Triagem dos corantes e cinética de adsorção ............................................................. 63
4.4 Isoterma de adsorção ................................................................................................. 66
4.5 Adsorção em Leito Expandido .................................................................................. 68
4.5.1 Expansão do leito e efeito da viscosidade .......................................................... 68
4.5.2 Correlação da porosidade do leito e velocidade de operação ............................. 69
4.5.3 Curva de ruptura ................................................................................................. 71
5 Conclusões ........................................................................................................................ 74
Referências bibliográficas........................................................................................................77
Apêndice...................................................................................................................................87
i
Lista de figuras
Figura 2.1 - Princípio da cromatografia por afinidade. Fonte: Gondim (2012).
Figura 2.2 – Estrutura química da Agarose. Fonte: Sigma Aldrich.
Figura 2.3 - Estrutura química do corante reativo Procion Brilliant Blue RS. Fonte: Gondim
(2012).
Figura 2.4 - Grupo antraquinona (esquerda) e agrupamento azo (direita). Fonte: Miquelante
(2011).
Figura 2.5 – Estrutura química do corante Azul Brilhante de Remazol RN. Fonte: Simionato
(2005).
Figura 2.6 – Corante Remazol Amarelo Ouro RGB concentrado. Fonte: Geutbitz et al. (2004);
Cavalcanti (2010b).
Figura 2.7 – (a) Grupo cromóforo ftalocianina de cobre; (b) Grupo reativo sulfatoetilsulfona.
Fonte: Beltrame (2006); Almeida (2013).
Figura 2.8 - Etapas da ALE: (a) leito sedimentado; (b) estabelecimento do equilíbrio
(expansão do leito); (c) aplicação da amostra; (d) lavagem (leito expandido); (e) eluição (leito
empacotado); (f) regeneração (leito empacotado). Fonte: Amersham Pharmacia Biotech
(1997).
Figura 2.9 - Técnicas cromatográficas preparativas. Fonte: Shukla et al.(2007); Padilha
(2013).
Figura 2.10 – Representação do arcabouço protéico da albumina do soro bovino (BSA).
Fonte: Silva et al.(2014).
Figura 3.1 – Representação do sistema para síntese do adsorvente pelicular. 1 = impelidor de
aço inox; 2 = recipiente cilíndrico de polipropileno; 3 = agitador mecânico; 4 = banho
termostatizado.
Figura 3.2 – Representação do sistema para preparação do gel de agarose. 1 = banho
termostatizado; 2 = tubo tipo Falcon.
ii
Figura 3.3 - Aparato experimental para os ensaios de adsorção em leito expandido.
Figura 4.1 – Aparência da partícula zircônia - agarose a partir de microscópio óptico (20x).
Figura 4.2 – Formação de complexo aglomerado.
Figura 4.3- Formação de contínuo homogêneo.
Figura 4.4 – Aparência da partícula zircônia - agarose imobilizada com o corante Azul
Brilhante de Remazol RN, a partir de microscópio óptico (20x).
Figura 4.5 – Aparência da partícula zircônia - agarose imobilizada com o corante Remazol
Azul Turquesa G 133%, a partir de microscópio óptico (20x).
Figura 4.6 – Aparência da partícula zircônia - agarose imobilizada com o corante Azul
Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado, a partir de microscópio óptico (20x).
Figura 4.7 – Distribuição de tamanho das partículas com e sem revestimento.
Figura 4.8 – Triagem dos adsorventes peliculares por adsorção específica e não específica nos
em diferentes pH.
Figura 4.9 – Cinética de adsorção da BSA diluída em tampão acetato 0,05 M e pH 4,5.
Figura 4.10 – Isotermas de adsorção da BSA com o corante Remazol Amarelo Ouro RGB
Concentrado.
Figura 4.11 – Grau de expansão do leito para o adsorvente pelicular em função da velocidade
do fluido.
Figura 4.12 – Correlação de Richardson-Zaki entre a velocidade do fluido e a porosidade do
leito.
Figura 4.13 – Curva de ruptura da BSA ao se utilizar o adsorvente pelicular zircônia - agarose
imobilizado com o corante Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado.
Figura A.1 – Curva padrão do corante Azul Brilhante de Remazol RN.
Figura A.2 – Curva padrão do corante Remazol Azul Turquesa G 133%.
Figura A.3 – Curva padrão do corante Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado.
iii
Figura B.1 – Curva padrão da BSA na faixa de concentração 0,15 a 0,5 mg/mL.
Figura B.2 – Curva padrão da BSA na faixa de concentração 0,05 a 0,125 mg/mL.
iv
Lista de tabelas
Tabela 4.1 – Relação núcleo esférico por agarose encontradas na literatura.
Tabela 4.2 – Referências da literatura sobre dados de propriedades físicas dos adsorventes.
Tabela 4.3 -–Densidade ligante dos corantes reativos testados.
Tabela 4.4 – Dados de capacidade de adsorção experimentais.
Tabela 4.5 – Comparação das constantes das isotermas de Langmuir e Freundlich para a
adsorção da BSA com o adsorvente sintetizado.
Tabela 4.6 – Parâmetros Ut e n correlacionados pela equação de Richardson-Zaki.
Tabela 4.7 - Comparação da velocidade superficial da agarose-zircônica (este trabalho) com
outras matrizes.
v
Lista de abreviaturas e siglas
ALE: Adsorção em Leito Expandido
BSA: Albumina de Soro Bovino
c: Concentração na fase líquida, mg/mL
c0: Concentração inicial da fase líquida, mg/mL
CI: Colour Index
D: Diâmetro da coluna, cm
DEAE: Ethyl-Diethanolamine
dp: Diâmetro da partícula adsorvente, cm
dc: diâmetro do núcleo, cm
GE: Grau de expansão do leito
FP: Fator de purificação
H: Altura de leito expandido, cm
H0: Altura do leito fixo, cm
Kd: Parâmetro da isoterma de Langmuir modificada, mg/mL
K: Parâmetro da isoterma de Freundlich
m: Parâmetro da isoterma de Freundlich
MM: Massa molar, g/mol
n: Coeficiente de Richardson-Zaki/carga
pI: ponto isoelétrico das proteínas
q: Quantidade de adsorbato retida no sólido, mg/mL
q*: Quantidade de adsorbato retida no sólido na condição de equilíbrio, mg/mL
qmax: Capacidade máxima de adsorção do adsorbato, mg/mL
Rc: Raio do núcleo do adsorvente pelicular
Rp: Raio da partícula
U: Velocidade superficial, cm/h
vi
t: Tempo, s
Ut: Velocidade terminal, cm/h
v: Volume do adsorvente usado
ε: Porosidade do leito
μ: Viscosidade da solução, g/cm.s²
ρc: Densidade do núcleo, g/mL
ρp: Densidade da partícula revestida, g/mL
ρgel: Densidade da agarose, g/mL
CAPÍTULO I
INTRODUÇÃO
Introdução 15
__________________________________________________________________________________ Cinthia Meirelly de Araújo Elpídio Fevereiro/2016
1 Introdução
Nos últimos anos, os processos e produtos biotecnológicos têm apresentado um
significativo crescimento. Estão cada vez mais presentes no campo industrial, em diversas
áreas dentre elas, em especial, no segmento de fármacos. Isso se deve a ampla aplicação
desses produtos o que gera um interesse crescente tanto no desenvolvimento de novos
materiais como no aperfeiçoamento de técnicas utilizadas. Nessa perspectiva, a ampliação na
aplicação de seus produtos, os investimentos em técnicas que possam melhorar o rendimento
e a produtividade se tornam cada vez mais estudadas.
O processo de recuperação e purificação de uma biomolécula é composto por várias
etapas como filtração, centrifugação, precipitação, dentre outras, sendo estas operações
unitárias conhecidas como downstream processing. Em geral, busca-se explorar as diferenças
entre a molécula de interesse (alvo) e os contaminantes tais como: tamanho, hidrofobicidade,
sequência de aminoácidos, atividade biológica, dentre outros fatores (Cavalcanti, 2010a).O
número de operações irá variar de acordo com o grau de pureza e a aplicabilidade da proteína
isolada, quanto maior for a exigência, mais etapas são aplicadas e isso faz com que os
processos downstream sejam bastante onerosos, alcançando, em alguns casos, 80% do custo
global (Santos, 2001).É nesse contexto que o processo de adsorção em leito expandido está
inserido, visto que reduz o número de etapas envolvidas uma vez que o leito opera na forma
expandida, favorecendo o uso de material particulado em suspensão que pode ser alimentado
diretamente na coluna, sem prejuízo de bloqueio da mesma,visto que esses passarão
preferencialmente pelos espaços vazios do leito. No processo com ALE, a mistura das
partículas é mínima e o fluxo do líquido através do leito aproxima-se do comportamento
tubular. A operação em leito expandido alterna etapas de fluidização estável e sedimentação
do leito. Dessa forma, as características hidrodinâmicas do leito expandido se assemelham as
propriedades cromatográficas do leito fixo (Oliveira, 2003).
Para assegurar que o processo de adsorção (ALE) seja bem sucedido, se faz necessário
uma escolha minuciosa de matrizes adsorventes visto que diversos fatores importantes devem
ser considerados como, por exemplo, tamanho da molécula alvo, densidade do adsorvente,
afinidade química, dentre outros. Diversos tipos de adsorventes têm sido utilizados para a
recuperação e purificação de bioprodutos por ALE. Esses adsorventes, especialmente
Introdução 16
__________________________________________________________________________________ Cinthia Meirelly de Araújo Elpídio Fevereiro/2016
desenvolvidos para aplicações que usam a ALE, têm sido empregados na recuperação e
purificação de enzimas/proteínas e outras biomoléculas. Dentre estas resinas pode-se destacar
a série Streamline® que foi lançada do mercado na década de noventa, pela Amersham
Pharmacia atualmente GE Life Sciences, sendo até hoje a resina para ALE mais usada. Essas
resinas, a base de agarose, pode ser derivatizada com diferentes grupos ligantes, conferindo-
lhe diferentes propriedades tais como as resinas Streamline® Phenyl que atuam por interações
do tipo hidrofóbicas (Conrado et al., 2005) e as resinas Streamline® DEAE e Streamline
® SP
que atuam por troca iônica, ou seja, aniônica e catiônica, respectivamente, (Santos et al.,
2001).
O crescimento de aplicações para a ALE é limitado pela disponibilidade de fases
sólidas adsorventes adequadas. O adsorvente ideal deve ter: uma densidade relativamente
elevada para facilitar o comportamento de fluidização estável em meios viscosos, uma
estrutura interna porosa para permitir a transferência rápida de massa a uma grande superfície
adsorvente além de uma composição sólida para permitir derivação química e limpeza
rigorosa durante as operações (Lyddiatt et al., 2002; Chi-Wei Lan et al., 1999; Hamilton et
al., 2000).
Além das matrizes comerciais disponíveis para ALE, um grande número denovas
matrizes estão sendo desenvolvidas por alguns grupos de pesquisas (Asghari & Jahanshahi,
2012; Asghari et al., 2012; Xia et al., 2007; Tong & Sun, 2001). Estes adsorventes, chamados
de adsorventes peliculares, foram definidos como sendo adequados para a adsorção em leito
expandido (Lyddiatt & O’Sullivan, 1998) e têm sido amplamente estudados nos processos de
recuperação e purificação de biomoléculas. Atualmente,o aperfeiçoamento da tecnologia
empregada para recuperação de um bioproduto por adsorção em leito expandido é baseado
essencialmente no desenvolvimento de adsorventes adequados com capacidade de equilibrar a
produtividade e eficiência de separação em várias velocidades de operação e viscosidades de
matéria-prima (Rezvani et al., 2014).
Desta forma, o presente trabalho aborda a síntese de um adsorvente pelicular
constituído por um núcleo de esfera de zircônia estabilizada com ítria, cuja densidade é 3,816
g/mL, e coberto por uma camada de agarose produzido a partir do método de emulsificação
água em óleo.O método cromatográfico empregado é o de cromatografia por afinidade ou
pseudo-afinidade, no qual um corante reativo é utilizado como ligante para interagir com a
biomolécula alvo a ser recuperada. Com isso, os adsorventes sintetizados foram imobilizados
Introdução 17
__________________________________________________________________________________ Cinthia Meirelly de Araújo Elpídio Fevereiro/2016
com três corantes reativos das classes azo, antraquinona e ftalocianina a fim de que estes
atuassem como ligantes de pseudo-afinidade. Para a obtenção de dados cinéticos, equilíbrio
de adsorção e ALE foi utilizada a proteína modelo (Albumina do Soro Bovino – BSA) a fim
de avaliar a capacidade de adsorção da BSA para o adsorvente pelicular sintetizado.
A presente dissertação está dividida seis em capítulos. Nesta seção, Capítulo 1, é
apresentada uma introdução aos temas abordados no trabalho. No Capítulo 2, mostra-se uma
revisão da literatura com relação à purificação de biomoléculas, a técnica de cromatografia
por afinidade e o processo de adsorção em leito expandido. O capítulo 3 irá abordar a
metodologia utilizada, enquanto que os resultados e a discussão serão mostrados no capítulo
4. Em seguida, no Capítulo 5, são apresentadas as conclusões do trabalho e, por último, são
mostradas as referências pesquisadas para realização deste trabalho.
CAPÍTULO II
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Revisão bibliográfica 19
__________________________________________________________________________________ Cinthia Meirelly de Araújo Elpídio Fevereiro/2016
2 Revisão bibliográfica
Neste tópico é apresentada uma revisão da literatura com relação à purificação de
biomoléculas, a técnica de cromatografia por afinidade ou pseudo-afinidade e o processo de
adsorção em leito expandido. Dentro deste tema serão abordados assuntos inerentes à
operação ALE como fluidodinâmica e transferência de massa, além das características dos
adsorventes peliculares.
2.1 Purificação de biomoléculas
Bioprodutos, em geral, consistem em um grande número de compostos cuja maioria
das estruturas têm diferentes propriedades físicas e químicas que podem ser derivadas a partir
de uma grande variedade de fontes, tais como animais, vegetais e microbianas. Deste modo,
as estratégias de purificação podem de ser desenvolvidas individualmente e de forma
empírica, a fim de que estejam adequadas as propriedades físico-químicas do produto e aos
modos de operação, adequados aos respectivos passos de processamento, com a finalidade de
atingir altos graus de pureza e elevadas taxas de recuperação, conservando a atividade da
molécula alvo.
Com base nisso, é sabido que a purificação e recuperação de uma biomolécula
produzida por microrganismo não é uma tarefa trivial, uma vez que estão envolvidos diversos
aspectos técnicos e econômicos para tornar o processo viável. Por isso, geralmente, são
envolvidas diversas operações unitárias incluindo filtração, centrifugação, precipitação,
cromatografia e cristalização. Este conjunto de etapas é mais conhecido como downstream
processing e dele dependem a viabilidade econômica do processo de purificação e
recuperação. A redução das etapas do downstream processing a partir da inserção de uma
nova técnica substituinte deve ser vista com grande interesse, pois o emprego correto de
processos de purificação torna-se essencial para que se obtenha êxito na seleção da molécula
alvo. Dentro desse contexto existe interesse pela adsorção em leito expandido (ALE), devido,
principalmente, à redução de etapas, visto que é possível em uma única etapa promover a
captura, recuperação e a purificação da biomolécula, em soluções contendo ou não material
particulado (Cavalcanti, 2010a).
Revisão bibliográfica 20
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No processo de purificação de proteínas, o objetivo é alcançar rendimento máximo
com alta seletividade, considerando os custos das operações empregadas (Silva, 2000). Com
relação aos bioprodutos, especificamente as enzimas, o desempenho de qualquer técnica de
purificação é verificado pelas variáveis rendimento e fator de purificação. A primeira irá
estabelecer o percentual de molécula alvo que foi recuperado durante a etapa, e a última
quantifica o aumento da atividade específica da enzima ao se utilizar etapas que promovam
sua purificação (Padilha, 2013).
2.2 Cromatografia
A descoberta da cromatografia como técnica analítica ocorreu em 1906, e é atribuída ao
botânico russo Mikhael Semenovich Tswett, ao descrever sua experiência cujo propósito era a
separação dos componentes de extrato de folhas (Collins, 1997). Em seu estudo, o botânico
conseguiu isolar pigmentos de cloroplastos em folhas verdes de plantas, usando uma coluna
de vidro recheada com carbonato de cálcio como fase estacionária e éter de petróleo como
fase móvel, visto que a separação de componentes ocorreu em faixas coloridas, deu-se o nome
de cromatografia (chrom = cor e grafie = escrita) embora o processo não dependa da cor
(Collins, 1997; Lázaro de la Torre, 2013).
Até a década de 30, a técnica cromatográfica não foi muito disseminada, sendo
redescoberta por Kuhn e Lederer que aperfeiçoaram a cromatografia em coluna, separando e
identificando as xantofilas da gema de ovo, utilizando um experimento semelhante ao de
Tswett, com carbonato de cálcio como fase estacionária e éter de petróleo como fase móvel.
Desde então, o método cromatográfico foi aperfeiçoado e, em parceria, com os avanços
tecnológicos foi levado a um alto grau de sofisticação que resultou no seu grande potencial de
aplicação em muitas áreas (Collins, 1997; Lázaro de la Torre, 2013).
Vale ressaltar que os métodos cromatográficos são, em geral, baseados em fenômenos
adsortivos; são lentos e totalmente dependentes de investimentos em materiais adsorventes. A
cromatografia divide-se em duas categorias: líquida e gasosa. Sendo a primeira a que
realmente interessa às purificações de metabólitos celulares.
Revisão bibliográfica 21
__________________________________________________________________________________ Cinthia Meirelly de Araújo Elpídio Fevereiro/2016
2.3 Cromatografia Líquida
Na cromatografia líquida, há uma retenção dos solutos (metabólitos celulares) em um leito
contendo material poroso, uma vez que ocorrem fenômenos de adsorção (química ou física),
partição ou exclusão molecular. A fase estacionária é composta por diferentes tipos de
materiais (partículas esféricas), dentre eles: sílica porosa e polímeros orgânicos sintéticos,
cujo diâmetro médio da partícula fica em torno de 100 a 200 µm. Existem alguns métodos
cromatográficos industrialmente utilizados, nos quais ocorre adsorção das diferentes
moléculas sobre a matriz e, em seguida, a dessorção seletiva. Neste grupo, descrevem-se as
adsorções baseadas em troca-iônica, interação hidrofóbica, afinidade e imunoafinidade
(Pessoa Jr. & Kilikian, 2005).
Na cromatografia, as fases móvel e estacionária utilizadas definem o mecanismo
envolvido no processo de separação. Os processos de adsorção e partição são mecanismos de
separação físicos baseados em interações eletrostáticas, incluindo as pontes de hidrogênio.
Quando a fase estacionária trata-se de um sólido, a adsorção ocorre na interface entre as
partículas sólidas e a fase móvel. No processo de partição, a fase estacionária é um líquido
distribuído na superfície de um sólido e, nesta situação, a separação baseia-se na diferença de
solubilidade dos compostos da amostra nas fases móveis e estacionária.
O mecanismo de exclusão é um processo mecânico e a separação é feita com base no
tamanho das moléculas. A fase estacionária é constituída de macromoléculas com ligações
cruzadas que possuem poros de tamanhos específicos. As moléculas do analito maiores não
entram nos poros e eluem mais rapidamente, enquanto as moléculas menores sofrem a difusão
nos poros eluindo com maior tempo de retenção.
Em processos onde ocorre troca-iônica, a separação baseia-se nos diferentes graus de
afinidade eletrostática dos íons. A fase estacionária é altamente carregada, assim os trocadores
aniônicos têm sítios ativos carregados positivamente, retendo ânions, o inverso ocorre para
trocadores catiônicos. Os solutos são eluídos por deslocamentos com outros íons, com mesmo
tipo de carga (Collins et al., 2006; Cunha, 2013).
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2.3.1 Cromatografia de troca-iônica
Esta técnica cromatográfica é geralmente empregada para purificação de proteínas
porque, comparada a outros métodos, ela apresenta facilidade em sua aplicação, alta
resolução, alta capacidade de adsorção e bastante versatilidade (Pessoa Jr. & Kilikian, 2005).
Neste método, a solução contendo a molécula alvo passa através de uma coluna de
troca iônica, na qual a biomolécula se ligará à resina através de interações eletrostáticas. Em
seguida, a coluna é lavada com um tampão de maior força iônica a fim de que haja a liberação
das biomoléculas que ficaram fracamente ligadas e depois daquelas que interagiram mais
fortemente, promovendo dessa forma a separação (Bailey & Ollis, 1986).
Conforme Kawasaki (1991), para que a técnica apresente um desempenho satisfatório
é necessário que o trocador iônico seja um sólido macroporoso com grupos funcionais ligados
a sua estrutura. Como a superfície das biomoléculas pode ter passantes positivas ou negativas,
essas resinas se subdividem em catiônicas (carregada positivamente) e aniônicas
(negativamente), conforme o grupo funcional que apresentam. Esses grupos podem se
associar a contra íons, e os contra íons podem ser reversivelmente trocados por outros íons de
mesma passante sem alteração do adsorvente. Dessa forma, a capacidade dessas resinas
depende da concentração dos grupos iônicos e da porosidade do suporte. Segundo Fonseca
(1995), a capacidade típica de adsorção de biomoléculas para essas resinas é da ordem de 100
mg/mL de adsorvente, sendo também afetada por fatores externos como, por exemplo, pH e
concentração de sal no tampão.
Em um processo de cromatografia de troca-iônica as condições de operação devem ser
bem determinadas uma vez que a capacidade de purificação pode ser afetada caso as
condições experimentais como: pH, força iônica do tampão, temperatura, natureza do íon-
oposto e velocidade de operação não estejam bem ajustadas (Cavalcanti, 2010 a).
2.3.2 Cromatografia de interação hidrofóbica
A cromatografia de interação hidrofóbica é baseada no ganho entrópico do sistema
protéico, devido à remoção de água nos domínios hidrofóbicos presentes na estrutura da
proteína e, adicionalmente, pelo aumento da força iônica no meio, através do efeito da adição
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de sal inerte. Isto faz com que a proteína sofra a influência dos íons do meio sobre sua
estrutura protéica, alterando sua solubilidade, devido à exposição dos grupos apolares
existentes em sua cadeia de aminoácidos. Estes grupos apolares normalmente ficam na parte
interna das estruturas das proteínas quando em meio aquoso (Arruda, 1999).
Segundo Cavalcanti (2010 a), a hidrofobicidade das proteínas está baseada na dos
aminoácidos que tem a tendência de se concentrarem na superfície interna das proteínas
globulares e os hidrofílicos na superfície externa. Com base nisso, ao se executar a técnica de
cromatografia de interação hidrofóbica deve-se atentar para as características da fase
estacionária e da fase móvel uma vez que esses dois fatores podem afetar o processo. A fase
estacionária irá variar de acordo com o ligante imobilizado na matriz. Os ligantes mais
utilizados nesta técnica são os alcanos de cadeia linear com ou sem o grupo amino terminal. A
fase móvel deve apresentar características como pH, temperatura e concentração do sal que
proporcionem a interação da proteína com o adsorvente.
2.3.3 Cromatografia de imunoafinidade
O termo cromatografia de imunoafinidade é usado para o método de cromatografia de
afinidade cuja fase estacionária consiste de um anticorpo relacionado a um antígeno; em
outras palavras, baseia-se no reconhecimento de epítopos antigênicos por anticorpos. Esta
técnica é uma poderosa ferramenta para isolar um determinado composto a partir de amostras
complexas que necessitem de um alto grau de seletividade visto que apresenta elevada
especificidade e afinidade que outros métodos não conseguiriam. Em geral, consiste nas
seguintes etapas: obtenção da amostra contendo o produto de interesse, anticorpos antígenos-
específicos para serem imobilizados em matriz apropriada, eliminação de produtos
indesejados e recuperação por meio de eluição do produto de interesse (Caporale, 2010).
2.3.4 Cromatografia de afinidade
Para identificação, purificação e separação de biomoléculas, a cromatografia de
afinidade é considerada um processo bem consolidado (Denizli & Piskin, 2001; Gondim,
2012). Esse tipo de cromatografia se diferencia dos outros métodos cromatográficos por
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basear-se, sobretudo, nas propriedades biológicas ou funcionais das espécies que interagem: a
biomolécula a ser separada e a fase estacionária. Esta técnica de separação depende de
interações bastante específicas entre os materiais biológicos como: enzima-substrato, enzima-
inibidor, antígeno-anticorpo. É importante destacar que embora classificada como
cromatografia de afinidade, ao se utilizar um corante como ligante para interagir com a
proteína, tem-se de fato uma cromatografia de pseudoafinidade. Neste trabalho, utilizaram-se
corantes reativos como ligantes; eles atuam mimetizando cofatores de interesse da molécula
alvo e, por isso, são chamados de ligantes de pseudoafinidade, pseudoespecíficos ou
pseudobioespecíficos.
Neste processo, um dos componentes da interação é o ligante, um composto
previamente imobilizado em um suporte insolúvel, denominado matriz porosa. Esse ligante
possibilitará a captura da molécula a ser isolada durante a passagem da solução contendo a
molécula alvo através do leito sob condições favoráveis (Hermanson et al., 1992). O princípio
do método se baseia em basicamente três etapas: I – imobilização de um composto químico
ou bioquímico (ligante) na superfície de uma matriz porosa insolúvel; II – estágio da adsorção
durante o qual a solução contendo a molécula alvo a ser adsorvida é colocada em contato com
o adsorvente para permitir que as interações ocorram e estágio de lavagem, onde a coluna é
equilibrada com o tampão inicial no qual os componentes adsorvidos por interações não
específicas são removidos; e por fim, a etapa III – processo de eluição no qual a biomolécula
é recuperada e liberada do complexo adsorvido-ligante. Após estas etapas, ainda ocorre à
regeneração desse adsorvente, processo que irá permitir a reutilização deste adsorvente em um
novo ciclo. A Figura 2.1 ilustra o princípio da cromatografia de afinidade.
Figura 2.1- Princípio da cromatografia de afinidade. Fonte: Gondim (2012).
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2.3.4.1 Seleção do suporte ou matriz
A escolha da matriz sólida para aplicação na cromatografia de afinidade deve seguir
alguns critérios e possuir determinadas características: geralmente, deve ser hidrofóbica e não
ter outros grupos de trocas reativos, uma vez que se deseja a inibição da adsorção não
específica; possuir boas propriedades mecânicas, as quais não sejam afetadas pelo tratamento
químico de modo que ainda possibilite a resistência à vazão e garanta o mesmo fluxo durante
a eluição e lavagem; ter boa porosidade para que a adsorção da molécula alvo ocorra de forma
facilitada; apresentar um número suficiente de grupos ativos que são essenciais nas ligações
cruzadas e ser mecânica e quimicamente estável ao tratamento químico de modificação e
variação das condições de operação (Pessoa Jr. & Kilikian, 2005).
Diversos materiais têm sido adotados para compor as matrizes cromatográficas de
afinidade utilizadas na purificação de biomoléculas. Essas substâncias possuem propriedades
que permitem empregá-las como suportes insolúveis ou matrizes. Entre elas destacam-se:
agarose, celulose, dextrana, poliacrilamida e outros polímeros, partículas porosas de alumina,
sílica de porosidade controlada e algumas associações entre as substâncias citadas. Sendo
assim, o adsorvente usado na cromatografia de afinidade é composto de duas partes: o suporte
ou matriz e o ligante.
2.3.4.2 Matriz de agarose
A agarose é um biopolímero linear extraído das algas. É constituída de unidades de
agarobiose, que é um dissacarídeo composto por D-galactose e 3,6-anidro-L-galactopiranose
unidas por ligações glicosídicas α-1,6 e β-1,4, conforme ilustrado na Figura 2.2. A utilização
da agarose como suporte insolúvel ou matriz, na cromatografia por afinidade requer uma
preparação da estrutura secundária do gel. Para aumentar a estabilidade do composto é
necessário realizar uma reação-cruzada (cross-linking) como, por exemplo, uma reação com
epicloridrina em meio alcalino, visto que tal reação leva à formação de ligações covalentes
cruzadas entre cadeias de agarose, tornando a matriz mecanicamente rígida e mais estável aos
regentes orgânicos e inorgânicos.
Diversas percentagens de agarose são usadas na matriz. No entanto, a matriz contendo
4% desse componente tem sido mais frequentemente utilizada na síntese de adsorventes. Um
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suporte ou matriz com 4% apresenta área total superficial de aproximadamente 5,0 m².mL-1
e
diâmetro médio do poro de 30 nm (Pessoa Jr. & Kilikian, 2005)A agarose é uma boa opção
porque apresenta a maioria das características desejáveis em uma matriz e tem como
vantagem uma estrutura porosa altamente hidrofílica, inerte e quimicamente estável.
Figura 2.2 – Estrutura química da Agarose Fonte: Sigma Aldrich.
2.3.4.3 Corantes reativos (ligantes pseudobioespecíficos)
Os corantes têxteis são compostos orgânicos que possuem estruturas moleculares
complexas, as quais podem ser divididas em duas partes principais, o grupo cromóforo, que
fornece cor a substância, e o grupo funcional, responsável pela fixação à fibra, denominado de
auxocromo (Kunz et al., 2002). Os grupos de corantes conhecidos são: diretos, azóicos,
ácidos, sulforosos, dispersos, pré-metalizados, básicos e reativos.
As estruturas dos corantes são formadas por um ou mais cromóforos: azo - mono, di,
tri e poliazo -, nitrofenol, nitrosofenol, triarilmetano, antraquinônico, pirimidina,
vinilsulfônico e triazina, entre outros (Twardokus, 2004); e por grupos reativos que favorecem
a interação com as moléculas de interesse (Pinheiro, 2011). Dentre a classe dos reativos, os
principais possuem o grupo cromóforo azo e antraquinona e grupos reativos clorotriazinila e
sulfatoetilsulfonila.
As estruturas da maioria dos corantes são muito complexas e, muitas vezes, é de fato
inconveniente nomeá-los por sua fórmula química. Com base nisso, a nomenclatura correta
raramente é usada, sendo preferível utilizar nomes comerciais para nomeá-los. Ainda assim,
os mesmos corantes podem ser comercializados com diferentes denominações. Uma forma de
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classificá-los e, também, de diferenciá-los é utilizar o Colour Index (C.I.), um catálogo da
Associação Americana de Química Têxtil e Coloristas e da Sociedade Britânica de Corantes e
Coloristas (Wesenberg et al., 2003; Miquelante, 2011).
Uma característica dos corantes reativos aplicada à área de bioprocessos é a
possibilidade de atuarem como ligantes pseudobioespecíficos uma vez que apresentam a
capacidade de se ligar a proteínas por meio de interações hidrofóbicas, eletrostáticas ou de
coordenação. Eles surgiram como alternativa aos ligantes bioespecíficos por apresentarem um
bom custo-benefício, baixo custo e disponibilidade comercial, e pela facilidade de
imobilização, principalmente em matrizes contendo grupo hidroxila (Denizli & Piskin, 2001;
Yavuz et al., 2006; Gondim, 2012). Esses corantes são aplicados na cromatografia de
afinidade para purificação de biomoléculas, devido a sua capacidade de ligação a diversas
proteínas de forma seletiva e reversível e por apresentaram um sistema de afinidade composto
por um cromóforo e um grupo reativo. A Figura 2.3 mostra a estrutura do corante reativo
Procion Brilliant Blue RS, na qual o grupo reativo é um anel diclorotriazina e cujo cromóforo
é constituído por um grupo antraquinona e um anel benzênico sulfonado (Gondim, 2012).
Figura 2.3 - Estrutura química do corante reativo Procion Brilliant Blue RS. Fonte:
Gondim (2012).
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De acordo com Miquelante (2011), as duas principais classes, segundo a estrutura
química, agrupam corantes contendo na sua molécula grupos azo e/ou o antraquinona (Figura
2.4).
Figura 2.4 - Grupo antraquinona (esquerda) e agrupamento azo (direita). Fonte: Miquelante
(2011).
A primeira, a dos azos corantes, é uma importante classe de corantes têxteis,
representando cerca de 60 a 80% dos corantes registrados no Colour Index. Seus integrantes
se caracterizam pela presença de um ou mais grupos cromóforos (azo) em suas moléculas (-
N=N-) (Plumb et al., 2001). Possuem estabilidade química frente a agentes externos, como
luz, temperatura, umidade e atmosfera oxidante e facilidade de síntese sendo, por isso, muito
utilizados em indústrias de alimentos, de cosméticos, farmacêuticas e têxteis (Patel& Suresh,
2008).
O segundo grupo de corantes (antraquinônicos) dominou o mercado de corantes
reativos até o final da década de 70. Ele é extremamente eficaz na capacidade de fixação à
fibra, embora seja de alto custo e apresente uma pequena capacidade de coloração. Os mais
comumente usados são os derivados do ácido bromoamínico que, através da variação dos
substituintes do anel aromático, apresentam colorações variando do violeta azulado ao azul
esverdeado (Miquelante, 2011).
Os corantes sintéticos são classificados como ligantes de afinidade devido a sua
interação com os sítios ativos de muitas proteínas e enzimas, visto que mimetizam a estrutura
dos seus substratos, cofatores ou agentes ligantes (Denizli & Piskin, 2001; Yavuz et al., 2006;
Gondim, 2012). Em condições apropriadas, matrizes com corantes imobilizados podem
adsorver as proteínas e estes ligantes, por sua vez, proporcionam diversas oportunidades para
diferentes tipos de interações com outras partes das proteínas. No entanto, muitas proteínas se
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ligam de forma não específica por uma combinação complexa de interações eletrostáticas,
hidrofóbicas, transferência de carga e ligações de hidrogênio, sendo elas todas passíveis de
ocorrer visto a estrutura complexa dos corantes reativos (Denizli & Piskin, 2001; Gondim,
2012).
Como exemplo de corantes reativos que podem ser utilizados na cromatografia por
afinidade tem-se: Azul Brilhante de Remazol RN, Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado,
Remazol Azul Turquesa G 133%. As estruturas químicas desses compostos estão
representadas nas Figuras de 2.5 a 2.7.
O corante Azul Brilhante de Remazol RN pertence ao grupo antraquinona, possui 4
grupos aromáticos e 3 sulfonados e apresenta massa molar igual a 660 g/mol.
Figura 2.5 – Estrutura química do corante Azul Brilhante de Remazol RN. Fonte: Simionato
(2005).
O corante Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado é da família dos azos corantes,
com dois anéis benzênicos sulfonados, sua massa molar é 481 g/mol. Sua estrutura é ilustrada
na Figura 2.6.
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Figura 2.6 – Corante Remazol Amarelo Ouro RGB concentrado. Fonte: Geutbitz et al.(2004);
Cavalcanti (2010b).
O corante Remazol Azul Turquesa possui um grupo cromóforo pouco comum, a
ftalocianina de cobre (Figura 2.7a), e como grupo reativo o sulfatoetilsulfona (Figura 2.7b).
Sua massa molar é 764,5 g/mol. Segundo Beltrame (2006), o grupo ftalocianina é
provavelmente a classe mais estável entre todas as utilizadas, sua tonalidade varia entre verde
e azul, dependendo de seus substituintes sendo que a maior parte destes corantes são
complexos metálicos de cobre e apresentam boas propriedades de cor e resistência, mas
também podem formar a estrutura com o níquel (Almeida, 2013).
Figura 2.7 – (a) Grupo cromóforo ftalocianina de cobre; (b) Grupo reativo sulfatoetilsulfona.
Fonte: Beltrame (2006); Almeida (2013).
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2.4 Adsorção em Leito Expandido (ALE)
A purificação e recuperação de uma biomolécula produzida por microrganismo é uma
atividade desafiadora, visto que há vários aspectos técnicos e econômicos envolvidos.
Os diferentes tipos de operações unitárias utilizadas durante a recuperação ou
purificação de biomoléculas alvo são chamados de downstream processing e dele dependem a
viabilidade econômica da comercialização dessa biomolécula, uma vez que são essas
operações unitárias que demandam um maior investimento. Portanto, qualquer técnica que
permita a redução das etapas do downstream processing deve ser vista com grande interesse,
pois a estratégia correta de protocolos de processos de purificação torna-se essencial para que
se atinja êxito na seleção da molécula alvo (substância ou espécie desejada). Dentro desse
contexto, existe interesse pela adsorção em leito expandido (ALE) devido, principalmente, à
redução de etapas, pois é possível em uma única etapa promover a captura, recuperação e a
purificação da biomolécula, em soluções contendo ou não material particulado (Cavalcanti,
2010a). A técnica de ALE vem sendo de crescente interesse nos últimos anos sendo aplicada
tanto na academia como na indústria (Santos, 2001; Cabanne et al., 2004; Hidayat et al.,
2004; De Lamotte, 2005; Toledo et al., 2007; May & Pohlmeyer, 2011).
A ALE surgiu a partir da cromatografia de proteínas e baseia-se na fluidização do leito de
adsorventes cromatográficos. O acréscimo de interstícios pelo aumento da porosidade do leito
permite a aplicação direta de uma alimentação bruta contendo suspensão de material
biológico (ex: células, detritos, substratos insolúveis, etc.). Isto reduz as etapas de purificação
destes materiais diminuindo também seus custos. O processo de fluidização do leito promove
uma maior interação das matrizes adsorventes e as moléculas alvo, o que pode elevar a
afinidade do meio cromatográfico, por uma maior exposição da área superficial do adsorvente
(Curvelo-Santana et al., 2008).
A ocorrência do fenômeno de segregação, que se refere à tendência das partículas
menores ou menos densas posicionarem-se na parte superior do leito e as partículas maiores
ou mais densas posicionarem-se na parte inferior (Santos, 2001) levando à formação de
múltiplos estágios de adsorção das moléculas-alvo sobre as partículas de adsorvente
fluidizadas, em decorrência da distribuição em camadas distintas pelo tamanho e densidade de
tais partículas. Dependendo dos parâmetros sistemáticos efetivos, tais como tipo e
concentração da biomassa, características do ligante, força iônica da fase fluida e pH, podem-
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se observar diferentes situações hidrodinâmicas durante o processo ideal em plug flow até a
sorção-limite (Fernández-Lahore et al., 2000).
Os métodos tradicionais de purificação de bioprodutos utilizam o processo de
operação em leito fixo o qual contem as resinas cromatográficas compactadas. No entanto,
após o término da etapa de fermentação, tem-se um líquido de elevada viscosidade e com
sólidos suspensos que impossibilitam o uso desse caldo fermentado direto na coluna
cromatográfica empacotada. Em busca de provar a viabilidade econômica dos processos
biotecnológicos, tem-se estudado técnicas de ações integradas, as quais possam remover
material particulado e que ofereçam boa resolução de purificação (Padilha, 2013).
Como a adsorção em leito expandido baseia-se na fluidização, parte-se de um leito
fixo, e aumenta-se a vazão do fluido a fim de atingir uma velocidade na qual a força de arraste
se iguale ao peso das partículas, ou seja, a força de arraste iguala-se à queda de pressão em
uma determinada área transversal. Então, um leito fluidizado estável é formado quando as
partículas adsorventes são suspensas devido ao equilíbrio entre a velocidade de sedimentação
e a velocidade do fluido ascendente. Diferente da técnica de fluidização convencional, que é
caracterizada principalmente pela ocorrência da mistura resultando, assim, em uma baixa
eficiência de ligação adsorvente-proteína, essa técnica opera em condições “suaves” de
fluidização, sendo elas ocasionadas pela segregação das partículas adsorventes e
caracterizadas por um baixo Reynolds da partícula, da ordem de 0,5-1, aumentando, então, a
eficiência da ligação adsorvente-proteína (Santos, 2001; Sierra, 2008).
O emprego da fluidização do leito com os adsorventes convencionalmente utilizados
na adsorção em leito fixo provoca elevada mistura entre o líquido e o adsorvente gerando uma
dispersão axial elevada, diferindo do comportamento desejável de escoamento tubular
apresentado pelo leito fixo e aproximando-se indesejavelmente ao comportamento de tanque
agitado, onde a existência de apenas um estágio de equilíbrio compromete a eficiência do
processo de separação por adsorção. Diante desta situação, soluções foram propostas para
minimizar o grau de mistura das partículas adsorventes, visando o comportamento plug-flow
(Oliveira, 2003).
A companhia Pharmacia Biotech atualmente GE Life Sciences, em 1993, lançou no
mercado novos tipos de adsorventes, produtos estes tem que por finalidade atuar na operação
em leito expandido (McCormick, 1993). As resinas fabricadas foram denominadas
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, as quais permitiram a expansão estável do leito, operando em uma faixa maior
de velocidade (100-300 cm/h) (Padilha, 2013).
2.4.1 Fundamentos e operação
O processo de cromatografia em leito expandido compreende algumas operações que
incluem o equilíbrio das cargas da resina, alimentação da amostra, a lavagem das proteínas
não adsorvidas, a eluição do composto e a regeneração (Moraes et al., 2009). A Figura 2.8
apresenta um esquema dessa sequência. O equilíbrio é alcançado com a alimentação de um
tampão de baixa molaridade, em fluxo ascendente, promovendo a expansão do leito em 2 ou 3
vezes, dependendo da velocidade. Após essa etapa, é usualmente feita a alimentação com
caldo bruto contendo as biomoléculas alvo e partículas em suspensão. A velocidade deve ser
controlada para que seja possível manter o mesmo grau de expansão do leito estabelecido.
Posteriormente, faz a etapa de lavagem, necessária para remoção de partículas e proteínas
fracamente ligadas (adsorvidas). Depois da lavagem, promove-se a eluição com o leito
empacotado, modo no qual a resolução na separação das moléculas adsorvidas é elevada e
permite concentrar a molécula-alvo no eluente. Em geral, é necessário um pequeno volume
para eluir o bioproduto e o uso de gradientes salinos pode ser mais efetivo para separação.
Após essa etapa, é feita a regeneração para que a resina esteja pronta para ser novamente
utilizada (Amersham Pharmacia Biotech, 1997).
Figura 2.8 - Etapas da ALE: (a) leito sedimentado; (b) estabelecimento do equilíbrio
(expansão do leito); (c) aplicação da amostra; (d) lavagem (leito expandido); (e) eluição (leito
empacotado); (f) regeneração (leito empacotado). Fonte: Amersham Pharmacia Biotech,
1997.
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Há algumas particularidades na operação em leito expandido e dentre elas está a
possibilidade da eluição em modo expandido. A vantagem de operar dessa forma é não ter
que mover o adaptador para a posição de leito fixo, o que reduz o risco de problemas em
função da resistência do material. Entretanto, esta eluição resulta na diluição do composto de
interesse. Além do volume, também há um aumento no tempo gasto para eluição em modo
expandido (Anspach et al., 1999).
2.4.2 Caracterização do leito expandido
Para que o processo de adsorção em leito expandido ocorra satisfatoriamente é
necessário o conhecimento do comportamento do leito em função das propriedades físicas das
partículas e do fluido. Essa caracterização ocorre principalmente medindo-se a expansão do
leito em função da velocidade do fluido, ou observando-se a influência do outros fatores como
distribuição de tamanho de partículas, viscosidade do fluido, presença de células, ligação
proteína-adsorvente e concentração da molécula alvo, etc. Segundo Chase & Draeger (1992),
o sucesso da purificação de proteínas depende essencialmente da obtenção de um leito com
expansão estável. Sendo esta condição fundamental, para que se possa realizar um aumento de
escala, partindo-se dos resultados obtidos em laboratório.
O grau de expansão (GE), parâmetro de suma importância para a operação em leito
expandido, representa a razão entre a altura do leito expandido (H) e a altura inicial (H0), para
uma dada velocidade aplicada (Santos, 2001; Cavalcanti, 2010a; Padilha, 2013). A Equação
2.6 representa esta relação.
𝐺𝐸 = 𝐻
𝐻0 (2.6)
Para haver uma fluidização estável, em uma coluna cromatográfica, as forças de
interação partícula - fluido devem equilibrar o peso da partícula. Essa condição é estabelecida
se a velocidade do líquido excede um valor mínimo, chamado velocidade mínima de
fluidização. As propriedades da partícula fluidizada e do líquido fluidizante definem a faixa
de vazão que pode ser utilizada (Kalil, 2000). Como a adsorção em leito expandido baseia-se
na fluidização, uma forma de conhecer o comportamento do leito é através da equação
proposta por Richardson e Zaki (1954), a qual relaciona a velocidade superficial do fluido e a
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velocidade terminal da partícula com a porosidade do leito, conforme a Equação 2.7, que é
válida para fluidos com perfil Newtoniano (Moraes, 2009):
𝑈 = 𝑈𝑡 . 𝜀𝑛 (2.7)
sendo Ut a velocidade terminal de uma partícula única; ε a porosidade do leito e n o expoente
de Richardson-Zaki, que expressa o regime de escoamento.
Esse modelo é fundamental para avaliar a expansão do leito quando este alcança o
equilíbrio. A velocidade terminal da partícula (Ut) é calculada pela linearização por logaritmo,
tendo como coeficiente angular o expoente de Richardson-Zaki (n) (Frej et al., 1997; Li et al.,
2003; Padilha, 2013). O valor do expoente de Richardson-Zaki pode ser obtido através das
seguintes expressões:
𝑛 = 4,65 + 20𝑑𝑝
𝐷 para Ret< 0,1 (2.8)
𝑛 = (4,4 + 18𝑑𝑝
𝐷) 𝑅𝑒𝑡
−0,03 para 0,1 <Ret< 0,2 (2.9)
𝑛 = (4,4 + 18𝑑𝑝
𝐷) 𝑅𝑒𝑡
−0,1 para 1 <Ret< 200 (2.10)
𝑛 = 4,4𝑅𝑒𝑡−0,1
para 200 <Ret< 500 (2.11)
n = 2,4 para Ret< 500 (2.12)
em que D é o diâmetro da coluna do leito expandido e o Ret é o número de Reynolds baseado
na velocidade terminal (Richardson & Zaki, 1954; Padilha, 2013).
No regime de Stokes, em que o Rep< 0,1, a velocidade terminal de uma partícula
isolada Ut é dada por:
𝑈𝑡 =𝑔𝑑𝑝
2(𝜌𝑝− 𝜌𝐿)
18 µ (2.13)
em que g é a aceleração da gravidade, dp é o diâmetro da partícula, μ é a viscosidade do
fluido, ρp e ρL são as densidades da partícula e do fluido.
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2.4.3 Adsorventes
Atualmente, o mercado disponibiliza uma diversidade de adsorventes cromatográficos,
explorando diferentes técnicas que podem ser usadas em escala preparativa, conforme
ilustrado na Figura 2.9. Dessa forma, é necessária uma escolha criteriosa na escolha do
adsorvente uma vez que representa um fator muito importante nas etapas de recuperação e
purificação.
Figura 2.9 - Técnicas cromatográficas preparativas. Fonte: Adaptado de Shukla et al.(2007);
Padilha (2013).
Na década de 1990, Amersham Biosciences desenvolveu a linha de adsorventes
Streamline lançando-a no mercado para uso em bioprocessos. Estes adsorventes são
compostos de 6% de agarose contendo um núcleo de quartzo cristalino, que atua aumentando
a densidade da partícula, com um tamanho de partícula que varia de 100-300µm, com
tamanho médio de 200,0 µm e densidade em torno de 1,2 g/mL (Xia et al., 2007).
Em geral, a ALE emprega adsorventes porosos análogos aos adsorventes utilizados em
leitos fixos convencionais. Matrizes adequadas para o processo ALE são preparadas
utilizando uma variedade de diferentes compostos. Devido à exigência de alta produtividade,
a adsorção em leito expandido deve ser operada a uma velocidade relativamente elevada.
Assim, há maneiras de aumentar a velocidade de operação dos adsorventes em um leito
Cromatografia de adsorção
Técnicas de não-afinidade:
- Fase reversa (RPC)
- Hidroxiapatita (HA)
- Interação hidrofóbica (HIC)
- Troca iônica (IEX)
Técnicas de afinidade:
- Metal imobilizado (IMAC)
- Imunoafinidade
- Ligantes biomiméticos
- Ligantes com peptídeos
- Ligante com corante
- Ligante com Proteína A
Revisão bibliográfica 37
__________________________________________________________________________________ Cinthia Meirelly de Araújo Elpídio Fevereiro/2016
expandido, como: elevar o tamanho e a densidade das partículas, que são formas de aumentar
a velocidade terminal da partícula. O aumento de tamanho de partícula vai certamente
diminuir a transferência de massa e tende a reduzir a capacidade de adsorção dinâmica. Com
base nisso, aumentar a densidade torna-se a melhor opção (Miao et al., 2005).
O aumento da densidade do adsorvente para alcançar de moderadas a elevadas
velocidades de fluido pode ser obtido, quer por utilização de um material poroso de alta
densidade ou através da combinação de um material pesado não poroso com um material
poroso leve. A utilização de esferas porosas de sílica é um exemplo da primeira opção, e a
incorporação de liga de Nd-Fe-B em pó em esferas de agarose é um exemplo da segunda
estratégia (Tong & Sun, 2001). Ao aumentar o tamanho do núcleo, a densidade das partículas
é aumentada consequentemente, a fim de permitir que a velocidade do fluido seja ainda
maior.
Para que as operações com o leito expandido sejam eficientes, adsorventes peliculares
densos de tamanho pequeno são desejados, uma vez que esta configuração beneficiaria o
processo por diminuir a distância do caminho difusivo intrapartícula de macromoléculas e,
por conseguinte, aumentar a taxa de transferência de massa aparente ou a eficiência do
processo na ALE.
Os adsorventes peliculares foram definidos como sendo adequados para adsorção em
leito expandido (Lyddiatt & O’Sullivan., 1998), uma vez que permitem operar em altas
velocidades por serem caracterizados por um núcleo denso, tal como o vidro, aço inoxidável
(Palsson et al., 2000) ou zircônia-sílica (Dainiak et al., 2002; Sun et al., 2001) revestido com
uma camada de material poroso e insolúvel como, por exemplo, agarose. Tais matrizes
prometem altas taxas de adsorção/dessorção devido à ausência de poros convectivos
profundos e às distâncias de difusão curtas dentro da camada porosa fina que compreende a
película (Jahanshahi et al, 2008).
A síntese de adsorventes sólidos adequados tem atraído fortemente a atenção dos
pesquisadores nos últimos anos uma vez que este elemento é essencial na adsorção em leito
expandido (Palsson et al., 2000).Os critérios básicos dos adsorventes da ALE adequados são
propostas a apresentar densidade suficiente e ampla distribuição de tamanho de partícula. É
necessária uma alta densidade dos adsorventes para a operação estável,com maiorvelocidade,
e a distribuição de tamanho de partícula apropriado contribui significativamente para a
Revisão bibliográfica 38
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redução da mistura na coluna. Além disso, a eficiência de adsorção da proteína deve ser
considerada na síntese de adsorventes para leito expandido.
2.5 Albumina do Soro Bovino (BSA)
A albumina do soro bovino (BSA) é uma proteína globular com um bom perfil de
aminoácidos essenciais. Consiste em cadeia polipeptídica simples contendo aproximadamente
582 aminoácidos com dezessete ligações dissulfídicas intramoleculares (Antunes, 2003;
Monteiro et al., 2015). É a proteína mais abundante no sangue bovino, tendo uma
concentração típica de 50 mg/mL, e possui uma estrutura muito similar à estrutura da HSA
(Human Serum Albumin), uma vez que a porcentagem de sequências idênticas de aminoácidos
é de 76% (Ferreira, 2009).
As albuminas possuem uma estrutura complexa, a qual se divide em primária e
secundária; as regiões de ligações preferenciais de analitos são classificadas em três grandes
domínios estruturalmente similares, denominados de I, II e III, e cada domínio contém dois
subdomínios, classificados de A e B. As regiões responsáveis pelo armazenamento dos
compostos nas albuminas estão localizadas nos subdomínios IIA e IIIA, e são conhecidas
como sítios I e II de Sudlow, como mostrado na Figura 2.10 (Silva et al.,2014).
De acordo com Carter & Ho (1994),a massa molecular da BSA é de 66.462 Da (66,462
kDa). A albumina tem uma alta afinidade por ácidos graxos, hematina (hematin), bilirrubina,
e uma grande afinidade por pequenos compostos aromáticos negativamente carregados
(Ferreira, 2009). O seu ponto isoelétrico (pI) é 4,9 (Asgari et al., 2014). O pI da molécula
indica o pH no qual ela se encontra com a mesma quantidade de carga positiva e negativa.
O ponto isoelétrico (PI) da proteína é usado como determinante da carga elétrica na
superfície da proteína. Se o pH < pI a proteína assume carga global positiva, enquanto na
condição em que o pH > pI, a carga global é negativa. Entretanto, é de se ressaltar que as
proteínas são moléculas anfóteras, dada a presença de resíduos de aminoácidos de natureza
básica e ácida (Padilha, 2013).
A Figura 2.10 mostra a representação do arcabouço protéico da albumina do soro
bovino (BSA).
Revisão bibliográfica 39
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Figura 2.10 – Representação do arcabouço protéico da albumina do soro bovino (BSA).
Fonte: Silva et al.(2014).
CAPÍTULO III
MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais e métodos 41
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3 Materiais e métodos
Neste capítulo serão apresentados os materiais e as metodologias empregadas para a
obtenção do adsorvente pelicular enfatizando os métodos utilizados para caracterização e
avaliação da sua capacidade de adsorção, além da técnica de adsorção em leito expandido.
3.1 Síntese, caracterização e avaliação da capacidade de adsorção do
adsorvente pelicular
3.1.1 Material
Para a síntese do adsorvente pelicular, utilizou-se um banho termostático TE-184
(Tecnal) no qual se inseriu um sistema que consiste em um recipiente cilíndrico de
polipropileno, adaptado para ser o reator, cujo diâmetro interno é de 12,0 cm e um agitador
mecânico TE – 139 (Tecnal), o qual possui um impelidor de aço inox de 6,0 cm de diâmetro,
conforme Figura 3.1.
Figura 3.1 – Representação do sistema para síntese do adsorvente pelicular. 1 = impelidor de aço
inox; 2 = recipiente cilíndrico de polipropileno; 3 = agitador mecânico; 4 = banho termostatizado.
Materiais e métodos 42
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Para preparação do gel de agarose, utilizou-se outro banho termostatizado e um tubo
cilíndrico tipo Falcon de 50 mL, conforme ilustrado na Figura 3.2.
Figura 3.2 – Representação do sistema para preparação do gel de agarose. 1 = banho
termostatizado; 2 = tubo tipo Falcon.
O núcleo utilizado para o adsorvente é composto por esferas de zircônia estabilizadas
com ítria (ρc = 3,814 g/mL) cujo diâmetro médio de partícula é aproximadamente 200,0 µm, e
foi adquirido da empresa Soesferas (São Paulo/BR). A matriz insolúvel é a base de pó de
Agarose Tipo VII com baixa temperatura de gelificação adquirida da Sigma Aldrich
(Missouri/USA). O óleo de girassol foi obtido em um supermercado local. O surfactante
utilizado foi o Span 80. Os corantes reativos - Azul Brilhante de Remazol RN, Remazol Azul
Turquesa G 133% e Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado - foram doados pelo
Laboratório de Processos Químicos Têxteis, vinculado ao Departamento de Engenharia Têxtil
da Universidade Federal do Rio Grande do Norte(UFRN).Para as etapas de cross-linking,
imobilização com corante reativo e avaliação da capacidade de adsorção do adsorvente
pelicular foram utilizados frascos Erlenmeyer de 50 mL a agitação foi realizada em incubador
rotativo.
3.1.2 Métodos
3.1.2.1 Síntese do adsorvente pelicular
O método empregado para a síntese do adsorvente pelicular baseia-se no procedimento
descrito por Asgari et al.(2014). Seguiu-se o método com algumas modificações conforme
descrito abaixo:
Materiais e métodos 43
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Os adsorventes peliculares foram sintetizados em escala de laboratório seguindo o
método de emulsificação água em óleo mencionado acima. Neste trabalho, 400 mL de óleo de
girassol foram colocados em um recipiente cilíndrico de polipropileno, conforme Figura 3.1,
juntamente com uma quantidade pré-definida do surfactante Span 80 (12,8 g/L). Ambos
foram aquecidos a 90°C, sob agitação a 1600 rpm durante cerca de 10 min. Um tubo tipo
Falcon foi usado para a preparação do gel de agarose, conforme ilustrado na Figura 3.2. Nesse
tubo, as esferas de zircônia estabilizadas com ítria foram misturadas com 40 mL de solução de
agarose pré-preparada (4%, v/v) a 85 °C sob agitação por cerca de 40 min. A fração do
volume de sólido na suspensão (0,2 v/v) foi mantida constante em todos os ensaios. A
uniformidade da pasta foi visualmente monitorada e mantida pelo ajuste da temperatura e
agitação. Após esse tempo, a suspensão de agarose (40 mL) foi transferida para a fase óleo
(primeiro recipiente, Figura 3.1) obtendo-se 10% (v/v) de dispersão aquosa em óleo e mantida
a 90 °C a 1600 rpm por 30 min. Após esse período, o recipiente contendo o óleo e as
partículas com agarose foi arrefecido até atingir a temperatura de 20 °C, sendo mantida por 30
min sob mesma agitação. As partículas, que compreendem um núcleo de zircônia revestido
com uma camada de agarose, foram deixadas em repouso e a fase de óleo removida. Os
adsorventes foram, subsequentemente, lavados com acetona e água deionizada até que o óleo
residual fosse completamente eliminado. As partículas foram armazenadas em solução
contendo etanol (20% v/v) até serem utilizadas nos experimentos.
3.1.2.2 Caracterização física dos adsorventes peliculares
As principais propriedades físicas do adsorvente como composição, densidade e
geometria foram analisadas.
A forma e aparência dos adsorventes peliculares foram observadas utilizando um
microscópio óptico Olympus, modelo BX51 equipado com uma câmera UC30 e software
Analysis. A distribuição de tamanho de partícula e o diâmetro médio (dm) foram
caracterizados pelo Analisador granulométrico CILAS, modelo 1180.
As propriedades físicas foram definidas e calculadas como segue. A densidade
aparente ρp (g/ml) das partículas de zircônia ítria -agarose foi estimada através da seguinte
equação proposta por Li (2006):
Materiais e métodos 44
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𝜌𝑝 = [𝑅𝑐
3.𝜌𝑐+(𝑅𝑝3−𝑅𝑐
3).𝜌𝑔𝑒𝑙]
𝑅𝑝3 (3.1)
sendo 𝜌𝑝, 𝜌𝑔𝑒𝑙 e 𝜌c (g/mL) a densidade aparente do adsorvente pelicular, a densidade da
agarose e a densidade do núcleo (zircônia ítria), respectivamente. Rp e Rc representam os raios
da partícula e do núcleo, respectivamente.
O teor de água w (%) foi obtido por desidratação a 105 °C por 5 horas, sendo
monitorado até a massa ficar constante, e foi calculado segundo Asgari et al. (2014) como
segue:
𝑤 (%) =𝑚2−𝑚3
𝑚2− 𝑚1 𝑥 100 (3.2)
sendo que 𝑚1, 𝑚2 e 𝑚3 (g) representam a massa do frasco, da matriz e do frasco antes da
secagem e da matriz e do frasco após a secagem, respectivamente. Considerando que todos os
poros nas matrizes adsorventes foram preenchidos com água, a porosidade P (%) representa a
porcentagem do volume de poro por volume de matriz e foi calculada, de acordo com Asgari
et al. (2014), como segue:
𝑃 =𝑤𝜌𝑝
𝜌𝑤 𝑥 100 (3.3)
A fração de volume de agarose (f) no adsorvente sintetizado foi calculada por balanço
de massa, conforme Asgari et al. (2014), usando dados de densidade como a seguir:
𝑓 =𝜌𝑐− 𝜌𝑝
𝜌𝑐− 𝜌𝑔𝑒𝑙 𝑥 100 (3.4)
sendo 𝜌𝑐 a densidade da esfera de zircônia (g/mL), 𝜌𝑝 significa a densidade aparente da
matriz adsorvente e 𝜌𝑔𝑒𝑙 representa a densidade da agarose (1,03 g/mL, de acordo com Zhou
et al. (2004)).
Materiais e métodos 45
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3.1.2.3 Reticulação química das partículas (cross-linking) e imobilização com corante
reativo
O aumento da resistência estrutural e mecânica das partículas adsorventes foi
alcançado pelo emprego de reticulação química, usando-se epicloridrina conforme o
procedimento de Asgari et al. (2014) com modificações.
As partículas (1,5 g) foram suspensas em10 mL de NaOH a 0,5 M com agitação de
150 rpm, a temperatura ambiente, por 30 minutos. Após esse período, 0,2 mL epicloridrina foi
adicionada e a reação prosseguiu durante 6 h na mesma temperatura. As partículas que
reagiram foram lavadas exaustivamente com água deionizada para remover os reagentes que
não reagiram e a estabilidade térmica das partículas reticuladas na presença de NaOH 0,5 M
foi testada visualmente após autoclavagem a 121 °C durante 1 h.
O método utilizado para a imobilização dos corantes reativos foi o mesmo reportado
por He et al. (1997). Uma solução com concentração de 30,0 g/L de cada corante reativo foi
preparada utilizando água deionizada. Um volume de 5,0g de adsorvente pelicular foi
misturado em 5,0 mL da solução corante sob agitação por 15 minutos. Em seguida, foram
adicionados 1,5 g de NaCl e 6,0 mL de Na2CO3 (1,0 M), misturando-se por 30 e 5 minutos,
respectivamente. O frasco foi mantido a 30 °C sob agitação a 150 rpm por 4 horas. Após a
reação, as partículas imobilizadas com o corante foram lavadas diversas vezes com uma
solução de etanol 25% contendo NaCl (1 M) e água destilada a fim de remover o corante não
reagido.
3.1.2.4 Densidade ligante
A densidade ligante foi realizada a partir do método descrito por Chambers (1977)
com alterações. A técnica consiste na liberação do ligante da matriz de agarose por hidrólise
ácida e quantificação do corante liberado por espectrofotometria. Nesse caso, 10,0 mg das
partículas imobilizadas com os três corantes utilizados (Azul RN, Turquesa G e Amarelo
Ouro) foram suspensas em 5,0 mL de HCl 6,0 M. Incubou-se à temperatura ambiente sob
agitação fixa a 150 rpm por 15 minutos. Em seguida, uma alíquota de cada solução foi
retirada e quantificada por espectrofotometria usando os seguintes comprimentos de onda:
Azul Brilhante de Remazol RN, 595 nm; Remazol Azul Turquesa G 133%, 625 nm e
Materiais e métodos 46
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Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado, 410 nm. A faixa de concentração utilizada para a
curva padrão dos corantes foi 2,5 a 100 µg/mL, mantida a mesma para os três corantes
estudados.
3.1.2.5 Determinação da concentração de proteínas totais
A Albumina de Soro Bovino (BSA) foi utilizada como proteína modelo nos ensaios de
adsorção e o método de Bradford (1976) foi utilizado para determinação do conteúdo
protéico. Todas as amostras foram analisadas adicionando-se 1,0 mL do reagente de Bradford
a 250,0 μL de amostra, deixando-se em contato por 15 minutos aproximadamente. Após esse
período, a mistura foi analisada por espectroscopia no comprimento de onda de 595 nm. A
concentração de proteínas foi obtida por análise da curva padrão usando-se a própria BSA; a
faixa usada foi 0,125 a 0,5 mg/mL.
3.1.2.6 Triagem dos corantes reativos
Para determinação das condições iniciais do adsorvente pelicular, antes da operação
em leito expandido, foram realizados ensaios de adsorção em batelada. De modo a conhecer o
comportamento da interação ligante-proteína, fez-se uma triagem utilizando a solução tampão
acetato de sódio na faixa de pH de 3,5 a 6,0, cuja força iônica da solução foi fixada em 0,05
M e as resinas imobilizadas com três corantes reativos: Azul Brilhante de Remazol RN,
Remazol Azul Turquesa G133% e Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado, além disso
avaliou-se a interação não específica (usando partículas não imobilizadas). Em frascos
Erlenmeyer de 50,0 mL, foram adicionados 10,0 mL da solução de acetato de sódio - BSA
com concentração 1,5 mg/mL juntamente com 0,5 g da resina. Os frascos foram mantidos sob
agitação constante de 150 rpm e temperatura ambiente (25 °C + 1) por 6 horas. Em seguida,
as alíquotas retiradas foram quantificadas pelo método de Bradford (1976), conforme descrito
no item anterior.
Materiais e métodos 47
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3.1.2.7 Cinética de adsorção
Com o intuito de analisar o comportamento da interação proteína-resina com o tempo,
avaliou-se a cinética de adsorção. Em Erlenmeyers de 250 mL foram adicionados 100 mL da
amostra, com concentrações 0,25 e 0,5 mg/mL, respectivamente, juntamente com tampão
acetato de sódio 0,05 M e pH 4,5 na qual se adicionou 0,5 g do adsorvente pelicular
imobilizado com o ligante (corante reativo) que apresentou o melhor desempenho na triagem
dos corantes reativos. Retiraram-se alíquotas em intervalos pré-determinados ao longo de 10
h, verificando-se a concentração de proteína final com relação à inicial em função do tempo.
A quantidade de proteína adsorvida na fase sólida foi calculada de acordo com a Equação 3.5.
A quantidade de proteína (BSA) retida na fase sólida foi calculada, por um balanço de
massa, conforme Equação 3.5:
𝑞 = 𝑉(𝑐0−𝑐)
𝑉𝑎𝑑𝑠 (3.5)
sendo q a quantidade de proteína adsorvida na resina (mg), V o volume (mL) da solução de
proteína (BSA), c0 o valor da concentração inicial de proteína (mg.mL-1
), c o valor da
concentração de proteína remanescente na fase líquida e Vads o volume de adsorvente (mL).
3.1.2.8 Isoterma de adsorção
Isotermas de adsorção são curvas que descrevem o comportamento da adsorção de
solutos por sólidos, ou seja, a relação de equilíbrio entre a concentração na fase fluida e a
concentração nas partículas adsorventes, a uma temperatura constante. Uma isoterma de
adsorção mostra a quantidade de um determinado soluto adsorvida por uma superfície
adsorvente, em função da concentração de equilíbrio do soluto. Para gases, a concentração é
dada em porcentagem molar como uma pressão parcial. Para líquidos, a concentração
geralmente é expressa em unidades de massa. A técnica usada para gerar os dados de
adsorção é, a princípio, bastante simples, pois uma quantidade conhecida do soluto é
adicionada ao sistema contendo uma quantidade conhecida de adsorvente. Admite-se que a
diferença entre a quantidade adicionada e a remanescente na solução encontra-se adsorvida na
superfície adsorvente (Alleoni et al., 1998).
Materiais e métodos 48
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Há muitos fatores que influenciam a adsorção de proteínas, os principais são a
afinidade da proteína com o adsorvente, a distribuição desigual do ligante na superfície da
proteína, a competição com outras espécies e as interações entre os solutos adsorvidos ou em
solução (Cano et al., 2005).
Os modelos mais comumente encontrados para descrever as isotermas de adsorção de
bioprodutos são as de Freundlich, a de Langmuir e a linear. Para cada isoterma, a abscissa
mostra a concentração de soluto na solução, geralmente em massa de soluto por volume de
solução, enquanto a ordenada dá a concentração de soluto na superfície do adsorvente, mais
comumente em unidades de massa de soluto por massa de adsorvente.
O modelo de adsorção linear é dado pela Equação 3.6, a seguir:
q*=K C* (3.6)
sendo q* é a concentração da espécie de interesse adsorvida na fase sólida, C* é a
concentração do composto de interesse na solução e K é a constante de equilíbrio. No entanto,
essa isoterma é pouco usual.
O modelo de Freundlich é bastante semelhante ao linear, sendo dado por:
q* = K.C n (3.7)
As constantes K e n são determinadas experimentalmente. Se a adsorção é favorável,
n<1 e se é desfavorável, n>1 (Moraes, 2009).
O modelo de Langmuir é usado para representar a adsorção para a maioria das
proteínas. Este modelo foi originalmente desenvolvido para representar a adsorção em
monocamada sobre uma superfície ideal, onde o calor de adsorção deve ser independente da
cobertura da fase sólida. O modelo de Langmuir pode ser estendido para a adsorção em
sistemas binários ou multicomponentes. O modelo é dado pela Equação 3.8:
𝑞∗ =𝑞𝑚𝐶∗
𝐾𝑑 + 𝐶∗ (3.8)
Sendo q* correspondente à quantidade de proteína adsorvida no adsorvente (mg.mL-1
de
adsorvente), c* é a concentração da proteína em solução (mg.mL-1
), qm é a capacidade
máxima do adsorvente (mg.mL-1
de adsorvente) e Kd é a constante de dissociação (mg.mL-1
).
Materiais e métodos 49
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Preparou-se soluções com diferentes concentrações de BSA em tampão acetato de
sódio pH 4,5 e força iônica 0,05 M, com concentrações iniciais que variaram de 0,15 a 2,5
mg/mL. Colocou-se, em cada Erlenmeyer de 50 mL, 0,25 g da resina e 10,0 mL da solução de
BSA. Ensaios com adição de NaCl nas concentrações 0,5 e 1,0 M também foram realizados.
Os frascos foram vedados e mantidos sob agitação a 25 °C por 6 h. Após este período, a
concentração da proteína no sobrenadante foi quantificada e a quantidade de proteína
adsorvida na fase sólida foi calculada de acordo com a Equação 3.5.
Com os valores da concentração de proteína no equilíbrio, tanto para fase líquida
como para a fase sólida, os modelos de isotermas de Freundlich e Langmuir foram aplicados e
os parâmetros dessas isotermas foram estimados, usando-se um ajuste não linear por meio do
software Origin 6.0 (Microcal, MA/USA).
3.2 Adsorção em Leito Expandido
3.2.1 Material
Uma coluna de vidro com diâmetro interno igual a 1,0 cm e 60,0 cm de altura,
especialmente projetada para este trabalho, foi utilizada para a operação em leito expandido.
A porção inferior da coluna foi preenchida pelo adsorvente sintetizado. O distribuidor
selecionado foi um prato perfurado de 1,5 cm de diâmetro, com 5 furos de 1,0 mm. A
transferência do tampão foi realizada pela bomba peristáltica TE-BP-01 (Tecnal). A Figura
3.3 ilustra o aparato experimental, podendo-se visualizar a coluna e a bomba utilizadas.
Materiais e métodos 50
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Figura 3.3 – Aparato experimental para os ensaios de adsorção em leito expandido.
3.2.2 Métodos
3.2.2.1 Expansão do leito
A análise das características de expansão do leito foi realizada usando a coluna,
projetada para este trabalho, preenchida com 10,0 cm de altura da resina sintetizada e
imobilizada com o ligante que apresentou a melhor capacidade de adsorção na triagem dos
corantes reativos. O tampão acetato de sódio, pH 4,5 e 0,05 M, foi utilizado em todos os
ensaios e alimentado na coluna com uma vazão crescente até que a superfície do leito não
apresentasse alteração na altura ou aspecto instável. Foram realizados ensaios com tampão
bem como na presença de glicerol 10 e 15%.Para permitir a estabilização do leito, manteve-se
um intervalo de 20 minutos antes da alteração da vazão. As medições de altura foram feitas
dentro desse intervalo. Para determinar o coeficiente de Richardson-Zaki e a velocidade
terminal da partícula, fez-se a linearização da velocidade superficial e da porosidade do leito
e, através de regressão linear, os parâmetros foram encontrados (Kalil, 2000). Os ensaios
foram realizados utilizando a proteína modelo, Albumina de Soro Bovino (BSA).
Materiais e métodos 51
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3.2.2.2 Curva de ruptura
Para obtenção da curva de ruptura, manteve-se a altura do leito em 10,0 cm, com a
vazão de alimentação mantida de modo a operar no grau de expansão 1,4. Tampão acetato de
sódio, pH 4,5 e 0,05 M, foi alimentado até equilibrar a resina. Posteriormente, a vazão de
alimentação foi aumentada gradativamente de forma a se obter o grau de expansão desejado.
Em seguida, aplicou-se a solução com a proteína modelo e alíquotas foram retiradas na saída;
a cada 10 mL passante descartava-se 8 mL e recolhia-se 2 mL para análise. O volume foi
quantificado através de proveta graduada. Utilizou-se o método integral da área sob a curva
para calcular a capacidade dinâmica do adsorvente.
CAPÍTULO IV
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Resultados e discussões 52
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4 Resultados e discussão
Neste capítulo são apresentados e discutidos os resultados de síntese e caracterização do
adsorvente pelicular desenvolvido a partir de zircônia e agarose. Avalia-se a capacidade de
adsorção da BSA ao se utilizar ensaios em tanques agitados. Apresentam-se também os
resultados obtidos ao se utilizar diferentes modelos para ajustar os dados da isoterma e
dados obtidos no processo ALE.
4.1 Síntese do adsorvente
4.1.1 Morfologia do adsorvente pelicular
Os adsorventes peliculares foram preparados a partir do método de emulsificação água em
óleo. As partículas são compostas por um núcleo de zircônia estabilizado com ítria e uma
cobertura de agarose. Durante a fase inicial deste trabalho, outros núcleos foram testados, mas
não atenderam os requisitos necessários para o processo: esferas de vidro não apresentaram
bom desempenho uma vez que quebravam ao atingirem a parede do recipiente devido a alta
agitação requerida; pó de aço inoxidável e de zinco também foram testados, mas não foram
utilizados porque não havia uniformidade na superfície da estrutura (não eram esféricos).
Então, a escolha do núcleo foi feita tomando-se como referência os trabalhos de Sun et al.
(2001) e de Jahanshahi et al. (2008) e a disponibilidade do mercado em oferecer micro esferas
com densidade elevada.
A Figura 4.1 mostra a aparência da partícula sintetizada. Pode-se observar claramente que
os adsorventes sintetizados apresentam-se na forma pelicular e possuem diâmetros variados,
característica favorável à operação em leito expandido (Asgari et al., 2014). Destaca-se,
entretanto, que a espessura da película de agarose que reveste a partícula de zircônia não se
apresenta uniforme. Durante o processo para obtenção dos adsorventes peliculares, a agitação
foi mantida a 1600 rpm, e o impelidor foi ajustado bem próximo ao fundo a fim de que todas
as partículas, independente do tamanho, se mantivessem em suspensão nesta etapa,
acarretando em pouca ou nenhuma agregação das partículas, formando poucos complexos
aglomerados, em que se observa a junção de duas ou mais esferas de zircônia ligadas por uma
camada espessa da matriz de agarose. Conforme se pode observar na Figura 4.2.
Resultados e discussões 53
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Figura 4.1 – Aparência da partícula zircônia - agarose a partir de microscópio óptico (20x).
Figura 4.2 – Formação de complexo aglomerado.
Resultados e discussões 54
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Destaca-se, também, que foi observada a formação de pequenas esferas sem o núcleo de
zircônia. A existência dessas partículas, também chamadas de contínuos homogêneos é
reportada na literatura (Sun et al., 2001). Essas pequenas esferas formadas apenas por agarose
foram encontradas em praticamente todas as bateladas e a maior parte delas era eliminada no
processo de lavagem com acetona e água destilada para retirada do óleo. O aspecto dos
contínuos homogêneos é ilustrado na Figura 4.3.
Figura 4.3 – Formação do Contínuo homogêneo
O processo de obtenção de adsorventes peliculares é sensível a alguns fatores como, por
exemplo, a agitação das fases e o preparo da pasta de agarose. Estes dois elementos são
cruciais para uma síntese satisfatória. Na Figura 4.1, pode-se observar que a camada de
agarose apesar de não estar distribuída uniformemente pela superfície das esferas de zircônia
conseguiu revestir praticamente todas as partículas proporcionando assim a possibilidade de
se imobilizar o corante. O aspecto do adsorvente sintetizado neste trabalho e o das resinas
reportadas em Jahanshahi et al. (2008), Aghari et al. (2012) e Asgari et al. (2014) são
semelhantes evidenciando que o processo de obtenção da resina foi satisfatório.
Na Figura 4.1, pode ser observado um deslocamento da camada de polímero em algumas
partículas. Isso ocorreu, provavelmente, devido a dificuldades na operação de mistura do
Resultados e discussões 55
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reator, a não utilização de defletores e a alta velocidade de agitação durante a etapa de
resfriamento. Vale salientar que estas são hipóteses não testadas. Com isso, as possíveis
soluções para que esse efeito seja minimizado podem ser: a inserção de defletores para
melhorar a mistura dentro do reator, a redução da velocidade de agitação durante o processo
de resfriamento, além de um planejamento experimental para avaliar os parâmetros do
processo. A falta de uniformidade da cobertura de agarose nas esferas de zircônia ocasionou a
formação de uma estrutura um pouco fragilizada uma vez que apresentou possibilidades ao
deslocamento da película de agarose, sendo possível o arraste da cobertura caso o adsorvente
pelicular seja submetido a condições mais severas de agitação. Esse efeito é minimizado após
a realização da etapa de reticulação química (cross-linking). Com relação ao núcleo, durante
todo o processo, as esferas de zircônia se mantiveram estáveis não apresentando sinais de
fragmentação.
Para a síntese do adsorvente pelicular utilizou-se uma razão de partículas de zircônia
(núcleo) por agarose (matriz) de 0,20 (v/v). Essa razão foi escolhida a partir da análise dos
dados referenciados em outros trabalhos, conforme exposto na Tabela 4.1.Os valores listados
nesta tabela mostram que o diâmetro médio da partícula utilizada neste trabalho, zircônia
estabilizada com ítria, é semelhante ao diâmetro dos núcleos referenciados em Jahanshahi et
al. (2008), Asghari & Jahanshahi (2012) e Asgari et al. (2014), inclusive em Jahanshahi et al.
(2008) é apresentada uma densidade de núcleo (ρc) igual a 3,8 g/mL semelhante a deste
trabalho (ρc = 3,816 g/mL). Como nesses trabalhos utilizou-se uma razão de 0,22 (v/v), 0,20 e
0,15 (g/g), escolheu-se 0,20 (v/v) por estar dentro da faixa normalmente praticada e também
por proporcionar um bom rendimento por batelada.
Outro ponto relevante para a seleção da relação núcleo/matriz é exposto nos estudos
realizados por Asghari & Jahanshahi (2012), os autores testaram diversas razões de
núcleo/agarose e verificaram que 0,20 (v/v) fornecia melhor resultado durante os ensaios em
leito expandido. Dessa forma, a escolha da razão do núcleo esférico para agarose do presente
trabalho permite comparar às propriedades físicas das partículas obtidas, principalmente com
relação aos que utilizam zircônia, como apresentadas a seguir.
Na Tabela 4.1 estão algumas relações encontradas na literatura que auxiliaram na escolha
da razão núcleo (esferas) por agarose:
Resultados e discussões 56
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Tabela 4.1 – Relação núcleo esférico por agarose encontradas na literatura.
Referência Núcleo
esférico
Diâmetro médio
(dp)
Densidade
do núcleo
Razão
núcleo/agarose
Palsson et al.
(2000) Aço inox 32-50 µm 8,00 g/mL 0,42 (v/v)
Sun et al. (2001) Zircônia-sílica 98,90 µm 3,80 g/mL 0,14 (v/v)
Tong & Sun
(2001) Nd-Fe-B 43,00 µm 7,40 g/mL 0,08 (v/v)
Jahanshahi et al.
(2008) Zircônia-sílica 120,00 µm 3,80 g/mL 0,22 (v/v)
Asghari &
Jahanshahi
(2012)
Pó de zinco 140,54-191,11 µm 7,14 g/mL 0,20 (g/g)
Asgari et al.
(2014) Pó de níquel 126,81-151,47 µm 8,90 g/mL 0,15 (g/g)
4.1.2 Reticulação química (cross-linking) e imobilização das partículas
Segundo reportado por Berger et al. (2004), a reticulação das cadeias poliméricas de
biopolímeros como a agarose, processo também denominado de reação de entrecruzamento, é
um tipo de modificação química que visa unir suas cadeias poliméricas, ou ainda, ligar suas
cadeias às de outros polímeros gerando redes poliméricas híbridas.O processo de reticulação
por epicloridrina (haleto de epóxi-alquila) foi utilizado porque une covalentemente as cadeias
poliméricas da agarose por meio de uma reação de eliminação do haleto, seguida de abertura
do epóxido, com consequente formação do entrecruzamento. Essa reação ocorre unindo de
forma permanente sítios reativos das cadeias poliméricas da agarose através de ligações
intermoleculares, ou regiões distintas de uma mesma cadeia por meio de ligações
intramoleculares.
Resultados e discussões 57
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A etapa de reticulação foi realizada visando principalmente modificar determinadas
propriedades do biopolímero, tais como, estabilidade química e térmica, que são essenciais ao
processo de fabricação de um adsorvente. Como o processo de reticulação sofre influência
tanto de algumas características físico-químicas da agarose quanto das condições reacionais
adotadas, o tempo reacional utilizado foi elevado, a fim de favorecer as reações e
consequentemente promover um bom grau de reticulação (Gonsalves et al., 2011).
Diversos testes foram realizados com o intuito de conseguir a estabilidade mecânica e
térmica das partículas sintetizadas. Inicialmente, foram utilizadas as seguintes condições: 1,0
mL de partículas com igual volume de NaOH 1,0 M contendo 5,0 g/L de boro hidreto de
sódio, adicionando-se 2 % (v/v) de epicloridrina após 30 minutos da reação; testou-se também
essa mesma condição adicionando epicloridrina simultaneamente ao NaOH 1,0 M; outro teste
foi realizado utilizando 1,0 mL de adsorvente com igual volume da solução de NaOH 1,0 M e
boro hidreto de sódio com adição de 0,2 mL de epicloridrina. Durante esses ensaios,
verificou-se a total solubilização da matriz de agarose, retirando o revestimento da partícula e
deixando apenas o núcleo de zircônia ítria, antes mesmo do teste em autoclave. O processo
não foi bem sucedido possivelmente pela não uniformidade da camada de agarose e
concentração elevada do NaOH. Como esta etapa é de suma importância, visto que
proporciona aos adsorventes sintetizados maior estabilidade e resistência durante os ensaios
tanto em batelada quanto em coluna para leito expandido, fez-se uma modificação nas
condições do procedimento de reticulação, alterando-se a concentração do hidróxido de sódio
de 1,0 M para 0,5 M, e estabelecendo-se um volume fixo para a epicloridrina (0,2 mL) para
cada 10 mL de solução de NaOH. Com essas alterações, conseguiu-se obter a resistência
térmica dos adsorventes sendo verificada pelo teste em autoclave e a resistência mecânica foi
observada durante os testes em batelada e em leito expandido.
Após a etapa de cross-linking, imobilizou-se a matriz com os corantes reativos: Azul
Brilhante de Remazol RN, Remazol Azul Turquesa G 133%e Remazol Amarelo Ouro RGB
Concentrado. Conforme Pinheiro (2011), a imobilização ocorre porque os corantes reativos
podem formar ligações covalentes com grupos hidroxilas da fibra celulósica, com grupos
aminos, hidroxila e tióis das fibras protéicas, assim como com grupos aminos das poliamidas,
uma vez que há a presença de um grupo eletrofílico em sua composição; o grupo reativo
presente na estrutura do corante é o que favorece a interação com as moléculas de interesse,
neste trabalho, a interação do grupo funcional ocorre com os grupos hidroxila da agarose.
Resultados e discussões 58
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Nas Figuras 4.4 a 4.6, pode ser observada a aparência dos adsorventes peliculares após
imobilização com os ligantes. Foi verificado que todos os corantes utilizados se ligaram a
agarose de forma bastante satisfatória e não foram evidenciadas partículas revestidas de
agarose sem a ligação com o corante reativo.
Figura 4.4 – Estrutura da partícula zircônia - agarose imobilizada com o corante Azul
Brilhante de Remazol RN, a partir de microscópio óptico (20x).
Resultados e discussões 59
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Figura 4.5 – Estrutura da partícula zircônia - agarose imobilizada com o corante Remazol
Azul Turquesa G 133%, a partir de microscópio óptico (20x).
Figura 4.6 – Estrutura da partícula zircônia - agarose imobilizada com o corante Remazol
Amarelo Ouro RGB Concentrado, a partir de microscópio óptico (20x).
Resultados e discussões 60
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4.1.3 Densidade ligante
Avaliou-se a densidade ligante das partículas imobilizadas com os três corantes reativos:
Azul Brilhante de Remazol RN, Remazol Turquesa G133% e Remazol Amarelo Ouro RGB
Concentrado, a fim de identificar a massa de corante ligada por miligrama do adsorvente. Os
dados da Tabela 4.2 mostram que o corante Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado
obteve o melhor resultado durante a imobilização, ligando-se mais a superfície da agarose, o
que pode favorecer uma maior capacidade de adsorção da proteína modelo. Observa-se
também que a massa molar do corante, conforme estruturas apresentadas nas Figuras 2.5 a 2.7
parece ser o fator mais importante para garantir a imobilização do corante à agarose, uma vez
que a massa molar do Remazol Amarelo Ouro RGB concentrado é menor do que a do
Remazol Turquesa G133% e a do Azul Brilhante de Remazol RN e obteve o melhor
desempenho durante a imobilização, como pode ser observado na Tabela 4.2. Observa-se
também que muito embora a densidade ligante do corante Amarelo Ouro seja 2,3 vezes maior
que a do Remazol Turquesa G 133% sua massa molar não mantém essa proporção, ou seja,
apesar do Turquesa G possuir a maior massa molar, 764,5 g/mol, ele não apresenta o pior
resultado quanto à imobilização, sendo este atribuído ao Azul Brilhante RN com densidade
ligante de 0,25 µg/mg e massa molar de 660,0 g/mol,isto pode ser um indicativo de que além
da massa molar, a distribuição de cargas e o grau de hidrofobicidade do corante também
parecem ser importantes.
Tabela 4.2 – Densidade ligante dos corantes reativos testados
Corante Massa de
corante (µg)
Densidade ligante
(µg/mg)
Massa molar
(g/mol)
Azul Brilhante de
Remazol RN 50,30 0,25 660,00
Remazol Turquesa G
133% 65,70 0,33 764,50
Remazol Amarelo Ouro
RGB Concentrado 151,40 0,76 481,00
Resultados e discussões 61
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4.2 Propriedades físicas da partícula
A Figura 4.7 ilustra a distribuição de tamanho das partículas para o adsorvente pelicular
sintetizado e para as partículas de zircônia sem agarose. A distribuição de tamanho realizada
em Granulômetro Cilas mostra que a maioria das partículas adsorventes possui diâmetro entre
112 – 400 µm, com diâmetro médio de 197,54 µm e 202,25 µm, para partículas de zircônia e
para o adsorvente pelicular, respectivamente. Para formar um leito expandido estável, a
distribuição de tamanho deve estar entre 65 – 300 µm. Dessa forma, com a distribuição de
tamanho e diâmetro médio de partículas verifica-se que o adsorvente pelicular permite sua
aplicação em ALE. Observa-se, também, na Figura 4.7 que as partículas do adsorvente
pelicular apresentam uma distribuição bi-modal, com uma pequena população com diâmetro
médio de aproximadamente 60,0 µm. Entretanto, como as menores partículas de zircônia
possuem tamanho acima de 100,0 µm, logo esse primeiro pico refere-se às partículas de
agarose formadas sem a zircônia, ou seja, os contínuos homogêneos reportados por Sun et al.
(2001), conforme ilustrado na Figura 4.3.
Figura 4.7 – Distribuição de tamanho das partículas com e sem revestimento.
Resultados e discussões 62
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Algumas propriedades físicas importantes de adsorventes peliculares referenciados na
literatura foram listadas na Tabela 4.3. Os valores evidenciados em outros trabalhos mostram
que há uma redução considerável da densidade quando a partícula é revestida pela matriz
insolúvel. Isso ocorre porque a densidade da agarose é baixa (ρgel = 1,03 g/mL) e o
revestimento faz altera o volume total do composto, ocasionando mudança na densidade. Com
isso, observa-se que a fração de agarose influencia na densidade da partícula, uma vez que a
cobertura faz aumentar o volume do composto e, consequentemente, faz diminuir a densidade
do adsorvente pelicular.
Tabela 4.3 – Referências da literatura sobre dados de propriedades físicas dos adsorventes
Referência Matriz
Densidade
do núcleo
(g/mL)
Densidade
úmida /
aparente*
(g/mL)
Teor de
água (%)
Porosidade
(%)
Fração
de
agarose
(%)
Asghari &
Jahanshahi
2012
Pó de zinco-
agarose 7,14 1,33 75,00 95,00 95,00
Asgari et al.
2014
Pó de
níquel-ágar 8,90 1,64 62,74 98,00 92,00
Este
trabalho
Zircônia
ítria-agarose 3,82 3,63* 10,98 40,84 6,30
*A densidade da partícula zircônia – agarose (este trabalho) é a aparente (g/mL) e foi calculada de
acordo com a Eq. 3.1. Para os dois trabalhos referenciados a densidade mensurada é a densidade
úmida realizada por picnometria (g/mL).
O valor da densidade aparente (ρp) do adsorvente pelicular sintetizado neste trabalho
foi calculado de acordo com a Equação 3.1, sendo o valor encontrado igual a 3,626 g/mL, não
muito diferente da partícula sem cobertura (ρc = 3,816 g/mL). Comparando os resultados
obtidos com os de outros trabalhos (Tabela 4.3), verifica-se que os valores encontrados estão
abaixo dos referenciados, principalmente no item fração de agarose, o qual se refere ao
Resultados e discussões 63
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percentual de agarose presente no adsorvente pelicular. As propriedades expostas na Tabela
4.3 estão relacionadas com parâmetros fundamentais como a densidade do núcleo, da
partícula revestida e a espessura da cobertura. Como esta última é pequena, a densidade
encontrada para o composto sintetizado foi baixa e, consequentemente, a fração de agarose, a
porosidade e o teor de água também foram, uma vez que esses fatores são dependentes de
uma relação entre a densidade do núcleo e da matriz revestida. Portanto, atribui-se essa
diferença nos valores a ausência de uma camada mais espessa e ao não revestimento de
partículas de maior diâmetro o que justifica a densidade do adsorvente pelicular tão próxima a
densidade do núcleo, algo que não é evidenciado em outros trabalhos conforme pode ser visto
na Tabela 4.3.
4.3 Triagem dos corantes e cinética de adsorção
Para a realização do estudo cinético de adsorção foi realizada a uma triagem dos
adsorventes peliculares por adsorção específica (imobilização com os três corantes estudados)
e não específica (sem presença de corante) nos pHs de 3,5 a 6,0. Foi utilizada a proteína
modelo BSA e tampão acetato 0,05 M.
Figura 4.8 - Triagem dos adsorventes peliculares por adsorção específica e não específica
em diferentes pH.
Resultados e discussões 64
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A Figura 4.8 mostra que o pH igual 4,5 apresentou melhores resultados tanto para a
adsorção específica quanto para a não específica. O ligante Azul Brilhante de Remazol RN
obteve um melhor resultado quando atuou no pH 4,5 (107,47 mg/mL de adsorvente), uma vez
que possui um grupo SO3- disponível para ligação com a BSA, além de apresentar mais
grupos hidrofóbicos do que o Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado. No entanto, este
último ligante apresentou uma quantidade adsorvida muito próxima ao primeiro (94,49
mg/mL de adsorvente) e se mostrou mais estável na faixa de pH 4,5 a 5,0; o que não ocorre
com os demais. Com base nesse resultado, escolheu-se este último para efetuar os
experimentos em leito expandido. Sendo o pI da BSA igual a 4,9, em pH 4,5 a mesma
apresenta distribuição de carga positiva facilitando sua ligação com o SO3- disponível. Dessa
forma, ao se aumentar o pH (maior que 5,0) reduz-se a capacidade de ligação da BSA ao
corante devido a maior repulsão das cargas da proteínas, pois tem predomínio de cargas
negativas. Comportamento semelhante é reportado por Asgari et al. (2014).
Comparando o resultado obtido com o corante reativo Remazol Amarelo Ouro RGB
Concentrado com os dados disponíveis na literatura para o corante Reativo azul 4, uma vez
que não há registros dos corantes selecionados em outros trabalhos, observa-se que a
quantidade adsorvida pelo adsorvente pelicular sintetizado é superior a obtida com a
Streamline DEAE® e também quando comparado a outro adsorvente pelicular. Com relação à
espessura da camada de agarose do adsorvente pelicular zircônia-ítria-agarose, sintetizado
neste trabalho, evidencia-se que mesmo com uma cobertura significativamente menor do que
a referenciada em Asgari et al. (2014), conforme Tabela 4.4, obteve-se uma quantidade
adsorvida elevada devido a forte interação entre o ligante e a proteína modelo.
Tabela 4.4 – Dados de capacidade de adsorção experimental.
Referência Matriz qexp (mg/mL)
Asgari et al.(2014) Pó de níquel-ágar-Reativo azul 4 64,01
Asgari et al.(2014) Streamline-Reativo azul 4 54,00
Este Trabalho Zircônia ítria – agarose – Amarelo Ouro 94,49
Resultados e discussões 65
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Para alcançar um bom desempenho durante a operação de adsorção em leito
expandido é necessário conhecer as condições iniciais do processo, visto que a interação entre
o adsorvente e o adsorbato é definida por estes fatores. Para as proteínas, o pH e o tipo de
ligante selecionado exercem forte influencia sobre a estrutura da biomolécula, bem como em
sua carga líquida e, por isso, atuam de forma decisiva sobre a adsorção em resinas de
afinidade (Padilha, 2013).
O estudo cinético foi realizado com o corante Remazol Amarelo Ouro RGB
Concentrado uma vez que demonstrou ter melhor desempenho. A Figura 4.9 ilustra as curvas
cinéticas de adsorção para as concentrações iniciais de 0,25 e 0,50 mg/mL de BSA. Observa-
se que o decaimento assumiu comportamento característico a este tipo de ensaio, atingindo o
equilíbrio após 30 minutos, para C0 = 0,25 mg/mL e 60 minutos, C0 = 0,50 mg/mL. Segundo
Hu et al. (2014), concentrações diferentes desencadeiam tempos de equilíbrio diferentes,
quando a concentração inicial é maior o tempo requerido para atingir o equilíbrio é mais
elevado.O conhecimento da cinética de adsorção é uma importante informação para a
concepção de sistemas de adsorção, visto que fornece dados de equilíbrio.
Figura 4.9 – Cinética de adsorção da BSA em tampão acetato 0,05 M e pH 4,5.
Resultados e discussões 66
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4.4 Isoterma de adsorção
Os dados de isoterma de adsorção foram obtidos conforme descrito anteriormente,
utilizando tampão acetato de sódio (0,05 M), pH 4,5 a 25°C.Ensaios com adição de NaCl 0,5
e 1,0 M foram realizados a fim de avaliar o efeito da força iônica na capacidade de adsorção
da proteína modelo. Os dados da isoterma de adsorção sem e com adição de sal, assim como
os ajustes pelos modelos de Langmuir e de Freundlich são mostrados na Figura 4.10. Como
pode ser visto na figura, com o aumento da concentração de sal de 0,0 para 1,0 M, houve um
descrécimo na capacidade de adsorção da BSA pelo adsorvente imobilizado com o ligante
Amarelo Ouro de 88,108 para 21,141 mg/mL de adsorvente. Evidenciando-se que o aumento
da força iônica ocasiona a diminuição da capacidade de adsorção do adsorvente. A capacidade
de adsorção e afinidade da BSA pelo corante ligado a matriz de agarose diminuem com o
aumento da concentração de sal devido a diminuição das interações eletrostáticas entre o
ligante e as moléculas da proteína. Comportamento semelhante pode ser observado em Asgari
et al. (2014).
Figura 4.10 – Isotermas de adsorção da BSA com o corante Remazol Amarelo Ouro RGB
Concentrado.
Resultados e discussões 67
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A Tabela 4.5 mostra os dados encontrados das constantes para as diferentes forças iônicas,
sendo possível observar que a equação de Langmuir se ajustou bem aos valores
experimentais. A variação de qm e Kd é oposta, pois o valor de Kd apresenta um aumento com
a concentração de sal enquanto que o valor da capacidade máxima de adsorção diminui.
Resultados semelhantes são reportados em Zhou et al. (2004) e Asgari et al. (2014). Os
resultados mostram que para um baixo valor da constante de dissociação, o ligante apresenta
maior afinidade e para valores mais elevados de Kd apresentou menor afinidade, indicando
que soluções com alta concentração de sal irão favorer a eluição da proteína modelo.
Observou-se que a quantidade máxima adsorvida de BSA para adsorvente pelicular com
Remazol Amarelo Ouro sem adição de NaCl encontrado pelo ajuste de Langmuir foi de
102,328 mg/mL de adsorvente, ficando próximo ao valor real de 88,108 mg/mL de
adsorvente. Esses valores podem ser evidenciados na Tabela 4.5.
Tabela 4.5 – Comparação das constantes das isotermas de Langmuir e Freundlich para
adsorção da BSA com o adsorvente pelicular sintetizado.
NaCl
(M)
qexp
(mg/mL)
Modelo Langmuir Modelo Freundlich
R² Kd
(mg/mL)
qm
(mg/mL) R² n Kf
0,0 88,108 0,856
0,0956
+ 0,041
102,328
+ 3,012
0,633
0,234
+ 0,101
90,893
+ 3,215
0,5 22,942 0,831
0,658
+ 0,574
40,115
+ 4,850
0,773
1,632
+ 0,588
6,743
+ 1,047
1,0 21,141 0,952
1,784
+ 1,281
39,521
+ 3,971
0,913
1,478
+ 0,461
3,614
+ 0,527
Resultados e discussões 68
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4.5 Adsorção em Leito Expandido
4.5.1 Expansão do leito e efeito da viscosidade
Segundo Jahanshahi et al. (2008), a expansão do leito contribui para a eficiência de
adsorção como uma função da distribuição do líquido, viscosidade do líquido, propriedades
de partícula e a características da coluna em termos de efeitos de parede e do distribuidor.
Características de expansão do leito e a relação entre a velocidade de alimentação e taxa de
expansão do leito os adsorventes peliculares sintetizados foram analisados sob condição
normal de operação para ALE. Os resultados são mostrados na Figura 4.11. Observa-se a
partir da figura que houve uma relação linear relativa entre o grau de expansão e velocidade
de operação para o adsorvente sintetizado. O grau de expansão ideal para aALEsitua-se na
faixa entre 2 e 3, de acordo com os resultados obtidos é possível observar que o adsorvente
alcançou grau 2 com uma velocidade de fluxo de 4.625,1 cm/h (ρp = 3,63 g/mL), sendo
bastante elevada quando comparada ao que foi reportado por Asgari et al. (2014) que obteve
1.517,83 cm/h (ρp = 2,78 g/mL). Essa diferença é justificada uma vez que a resina sintetizada
neste trabalho possui alta densidade, fazendo com que ela se apresente mais estável durante a
operação de ALE e favoreça a utilização de um fluxo elevado da fase móvel.
A viscosidade do fluido passante é um importante parâmetro que afeta as propriedades
de expansão do leito. No presente trabalho, soluções de glicerol, 10% e 15% (v/v), foram
aplicadas na coluna a fim de se analisar o comportamento da dispersão do leito expandido.
Como esperado, verificou-se que os adsorventes expandem-se mais facilmente no fluido com
viscosidade superior uma vez que sua velocidade terminal será menor, conforme Equação
2.13. Dessa forma, uma mesma partícula submetida a uma mesma velocidade supercial porém
em meio mais viscoso se expandirá mais. Com a adição de glicerol, o grau de expansão 2 foi
obtido mais facilmente e com menor velocidade (2.742,75 cm/h para 15% de glicerol e
3.161,05 cm/h para 10% de glicerol). Neste estudo, os resultados mostraram que a resina
sintetizada tem uma boa característica de expansão e pode ser utilizada a uma velocidade de
operação elevada.
Resultados e discussões 69
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Figura 4.11 – Grau de expansão do leito para o adsorvente pelicular em função da velocidade
do fluido.
4.5.2 Correlação da porosidade do leito e velocidade de operação
Para determinar o coeficiente de Richardson-Zaki e a velocidade terminal da partícula,
plotou-se os parâmetros ln (U) versus ln (ε),representado na Figura 4.12. Observa-seque a
porosidade do leitoaumenta com o aumentodavelocidade do fluido. Resultados semelhantes
foram relatados em Asgari et.al. (2014).
Figura 4.12 – Correlação de Richardson-Zaki entre a velocidade do fluido e a porosidade do
leito.
Resultados e discussões 70
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Baseado na relação entre a porosidade do leito expandido (ε) com velocidade
superficial do líquido (U), a velocidade terminal da partícula (Ut) e o coeficiente de expansão
(n) foram calculados. A porosidade do leito pode ser estimada a partir da Equação 4.1.
GE=1− 𝜀0
1− 𝜀 (4.1)
A porosidade do leito sedimentado é comumente assumida como 0,4 (Asghari &
Jahanshahi, 2012).
Os parâmetros de correlaçãoforam encontrados por regressão lineare estão listados na
Tabela 4.6.
Tabela 4.6 – Parâmetros Ut e n correlacionados pela equação de Richardson-Zaki.
Fase líquida Ut exp (cm/h) n R²
Tampão 15.229,660 3,785 0,961
Glicerol 10 % 11.070,070 3,575 0,983
Glicerol 15% 13.932,790 4,765 0,992
Os valores de n estão na faixa de3,575 a 4,765, e os coeficientes de regressão (R²)
foram: 0,961, 0,983 e 0,992. A velocidadde terminal da partícula está na faixa de 11.070,070
a 15.229,660 cm/h. Os valores para Ut foram bem elevados devido à alta densidade da resina;
para a fase com glicerol, a velocidade terminal estimada da resina é menor do que para a
solução contendo apenas tampão, o efeito da viscosidade afeta a velocidade terminal da
partícula favorecendo a sua diminuição quando comparada a fase móvel sem adição de
glicerol, esse comportamento é semelhante ao exposto por Kalil (2000). Com isso, um
adsorvente com maior densidade, como o sintetizado neste trabalho, requer maior velocidade
de operação (Tabela 4.7) e, consequentemente, terá uma velocidade terminal elevada
conforme é visto em Asgari et al. (2014). A Tabela 4.7 relaciona algumas velocidades de
fluxo com a densidade de suas respectivas matrizes para um grau de expansão igual a 2.
Resultados e discussões 71
__________________________________________________________________________________ Cinthia Meirelly de Araújo Elpídio Fevereiro/2016
Tabela 4.7 – Comparação da velocidade superficial da agarose-zircônia (este trabalho) com
outras matrizes.
Referência Matriz U (cm/h) ρp(g/mL)
Este trabalho Agarose-
zircônia 4.625,10 3,63
Asgari et al.
(2014) Agar-níquel 1.517,83 2,78
Asghari et al.
(2012) Agarose-níquel 1.344,60 2,56
Asghari &
Jahanshahi (2012) Agarose-zinco 777,55 2,01
4.5.3 Curva de ruptura
A curva de ruptura permite avaliar a capacidade dinâmica do adsorvente operando em
um determinado leito, seja fixo ou expandido. O experimento foi realizado utilizando-se uma
altura do leito de 10,0 cm e aplicando-se 200 mL da amostra (solução de BSA com
concentração inicial de 1,953 mg/mL). Utilizou-se tampão acetato de sódio a pH 4,5 e 0,05 M
sem adição de NaCl e manteve-se o grau de expansão em 1,4durante o processo (para
alcançar esse grau a velocidade empregada foi 2.724,8 cm/h). A Figura 4.13 ilustra a curva de
ruptura obtida e mostra que ao se operar nessa faixa de velocidade é possível obter uma
capacidade dinâmica de 7,832 mg de BSA/mL de adsorvente, apesar da diminuição da
capacidade dinâmica, pela elevada velocidade usada, o adsorvente sintetizado se mostra
promissor para o processo de ALE. Em Asgari et.al. (2014) também é vista uma diminuição
da capacidade de adsorção quando o adsorvente é submetido a processos dinâmicos.
Resultados e discussões 72
__________________________________________________________________________________ Cinthia Meirelly de Araújo Elpídio Fevereiro/2016
Figura 4.13 – Curva de ruptura da BSA ao se utilizar o adsorvente pelicular zircônia - agarose
imobilizado com o corante Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado.
CAPÍTULO V
CONCLUSÕES
Conclusões 74
__________________________________________________________________________________ Cinthia Meirelly de Araújo Elpídio Fevereiro/2016
5 Conclusões
Neste trabalho, foram sintetizadas partículas esféricas de zircônia estabilizadas com ítria e
revestidas com uma camada de agarose, para utilização como adsorvente no processo de
recuperação e purificação de biomoléculas por ALE. Para avaliar as características do
composto sintetizado foram analisadas algumas propriedades físicas e também o seu
comportamento em leito expandido.
Os adsorventes peliculares foram sintetizados pelo método de emulsificação água em
óleo. O objetivo foi alcançado, mas outros estudos ainda devem ser realizados, uma vez quea
morfologia da partícula pode ser melhorada com a aplicação de planejamento experimental a
fim de verificar a influência dos parâmetros envolvidos no processo como, por exemplo,
agitação e temperatura, assim como a inserção de defletores para melhorar a dispersão das
partículas.
A análise das características físicas do adsorvente pelicular mostrou que a maioria das
partículas possui diâmetro entre 112 e 400 µm, com diâmetro médio de 197,54 µm e 202,25
µm, para as partículas de zircônia e para o adsorvente pelicular, respectivamente. A espessura
da matriz de agarose foi de aproximadamente 5,0µm. A partícula apresentou uma fração de
agarose de 6,3%, conteúdo de água de 10,98% e porosidade de 40,84%. Comparando os
resultados obtidos com os valores referenciados em outros trabalhos, é possível ver que apesar
das condições não ideais do adsorvente pelicular sintetizado, ele obteve bons resultados, visto
que a interação do ligante Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado com a fração de agarose
de apenas 6,3% apresentou uma capacidade de adsorção (em batelada) de 88,108 mg de
BSA/mL de adsorvente, enquanto que Asgari et.al. (2014) relata uma capacidade de adsorção
de 64,01 mg de BSA/mL de adsorvente para uma fração acima de 70% com o corante Reativo
azul 4.
Resultados de cinética e isoterma de adsorção mostraram que o adsorvente pelicular
sintetizado neste trabalho tem comportamento semelhante aos demais adsorventes
referenciados em outros trabalhos. Os dados experimentais indicaram que o equilíbrio de
adsorção segue o modelo de Langmuir fornecendo um qm igual a 102,328 mg/mL de
adsorvente e R² igual a 0,856. Os ensaios com adição de NaCl mostraram que com o aumento
da concentração de sal de 0,0 para 1,0 M, houve um descrécimo na capacidade de adsorção da
Conclusões 75
__________________________________________________________________________________ Cinthia Meirelly de Araújo Elpídio Fevereiro/2016
BSA pelo adsorvente imobilizado com o ligante Amarelo Ouro de 88,108 para 21,141 mg/mL
de adsorvente, sendo evidenciado que a capacidade de adsorção e afinidade da BSA pelo
corante ligado a matriz de agarose diminuem com o aumento da concentração de sal devido a
diminuição das interações eletrostáticas entre o ligante e as moléculas da proteína. Os
resultados também mostraram que para um baixo valor da constante de dissociação, o ligante
apresentou maior afinidade e para valores mais elevados de Kd apresentou menor afinidade,
indicando que soluções com alta concentração de sal irão favorer a eluição da proteína
modelo.
O grau de expansão para o adsorvente alcançou grau 2,0 com uma velocidade de fluxo de
4.625,1 cm/h (ρp = 3,63 g/mL). Com a adição de glicerol, o grau de expansão 2 foi obtido
mais facilmente e com menor velocidade 2.742,75 cm/h. Neste estudo, os resultados
mostraram que a resina sintetizada tem uma boa característica de expansão e pode ser
utilizada a uma elevada velocidade de operação. No entanto, apresentou durante o processo de
operação em leito expandido um decréscimo acentuado da sua capacidade de adsorção de
88,108 para 7,832 mg de BSA/mL de adsorvente, isso se deve a elevada velocidade aplicada
ao processo.Com isso, mais estudos devem ser feitos a fim de analisar melhor esta etapa do
processo e melhorar a sua produtividade.
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APÊNDICE
Apêndice 87
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Apêndice
Apêndice A – Curva padrão dos corantes reativos
As figuras A.1 a A.3 apresentam as curvas padrão para cada corante reativo utilizado
neste trabalho. A faixa de concentração utilizada foi a mesma para todos os corantes 2,5 a 100
µg/mL.
Figura A.1 – Curva padrão do corante Azul Brilhante de Remazol RN
y = 408,0.x – 6,053
R² = 0,999
Apêndice 88
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Figura A.2 – Curva padrão do corante Remazol Azul Turquesa G 133%.
Figura A.3 – Curva padrão do corante Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado.
y= 103,2.x – 2,287
R² = 0,997
y= 117,9.x – 5,282
R² = 0,997
Apêndice 89
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Apêndice B – Curva padrão da BSA
As figuras B.1 e B.2 mostram as curvas padrão para a BSA nas faixas de concentração
indicadas.
Figura B.1 – Curva padrão da BSA na faixa de concentração 0,15 a 0,5 mg/mL.
Figura B.2 – Curva padrão da BSA na faixa de concentração 0,05 a 0,125 mg/mL.
y = 0,5665.x – 0,5039
R² = 0,985
y = 0,178.x – 0,021
R² = 0,971