dirk neu0 gesamt1,2,7,3,4,5,6 - uni kiel · 2019. 11. 10. · 2.3.7.5 vergleichsinkubation von...

ISOLIERUNG EINES PRODRUG-REDUZIERENDEN

ENZYMSYSTEMS AUS DER SCHWEINENIERE

Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades

der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät

der Christian-Albrechts-Universität

zu Kiel

vorgelegt von

DIRK HOLTKAMP

Kiel 2007

Referent: Prof. Dr. B. Clement

Korreferent: HD Dr. T. Kunze

Tage der mündlichen Prüfungen: 26. April; 03. Mai und

07. Mai 2007

zum Druck genehmigt: Kiel, den 10. Mai 2007

Prof. Dr. Jürgen Grotemeyer

(Dekan)

Für meine Eltern

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS


ε spezifischer Absorptionskoeffizient

A Absorption

A. thaliana Arabidopsis thaliana ABA3 Moco Sulfurase (A. thaliana)

ABA3-CT C-Terminus der Moco Sulfurase (A. thaliana)

Abb. Abbildung

ADP Adenosindiphosphat

AMP Adenosinmonophosphat

APS Ammoniumpersulfat

Aqua bidest. Zweifach destilliertes Wasser

ATP Adenosintriphosphat

BCA 2.2’-Bischinolin-4,4’-dicarbonsäure

Bfarm Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte

BSA Bovines Serum Albumin

CM Carboxymethyl

CMC kritische Mizellbildungskonstante

CoA Coenzym A

CT C-Terminus

CYP Cytochrom P450

DEAE Dimethylaminoethyl

d. h. das heißt

DLPC L-α-Dilaurylphosphatidylcholin

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

DTT Dithiothreitol

ECL Enhanced chemoluminiscence

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EGTA Ethylendioxybis(ethylennitrilo)-tetraessigsäure

EM Emission

ESI Elektrospray Inisierung

etc. und so weiter

EX Extinktion

FAD Flavinadenindinukleotid

FMN Flavinmononukleotid

FMO Flavinhaltige Monooxygenase


g Erdbeschleunigung

H. sapiens Homo sapiens HCl Hydrochlorid

HEPES N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-N ’-(2-ethansulfonsäure)

HPLC Hochleistungsflüssigchromatographie

IC50 für eine halbmaximale Hemmung nötige Konzentration

IgG Immunglobulin G

Kap. Kapitel

kDa Kilodalton

Km Michaelis-Menten Konstante

LC Flüssigchromatographie

Lys Lysin

MAO Monoaminoxidase

mg Milligramm

min Minute

Moco Molybdäncofaktor

MOPS 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure

MPT Molybdopterin

MS Massenspektrometrie

MS/MS Massenspektrometrie/Massenspektrometrie

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

µM Mikromolar

N. crassa Neurospora crassa NADH Nicotinamidadenindinukleotid (reduzierte Form)

NADPH Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (reduzierte Form)

nHPLC nano HPLC

nmol nanomol

pH Wasserstoffionenkonzentration

p-HMB p-Hydroxymercuribenzoat

pmol pikomol

ox oxidiert

Q-TOF Quadrupol-Flugzeit

red reduziert

s. siehe

SDS Natriumdodecylsulfat

SDS-PAGE SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese

sek Sekunde


Tab. Tabelle

TEMED N,N,N’,N’ –Tetramethylethylendiamin

TIM Translokase der inneren mitochondrialen Membran

TOM Translokase der äußeren mitochondrialen Membran

Tris Tris(hydroxymethyl)ethylendiamin

U Unit

u. a. unter anderem

UDP Uridin 5’-Diphosphat

UV ultraviolett

Vmax maximale Umsetzungsgeschwindigkeit

z. B. zum Beispiel

INHALTSVERZEICHNIS

I

1 EINFÜHRUNG 1

1.1 BIOTRANSFORMATION 1 1.1.1 Definition und Bedeutung 1 1.1.2 Biotransformationsstudien 2 1.1.3 Enzyme der Biotransformation 4

1.2 METABOLISMUS IN DER NIERE 5 1.2.1 Einführung 5 1.2.2 Renale Biotransformationswege 8

1.2.2.1 Phase I 8 1.2.2.1.1 Cytochrom P450 abhängige Monooxygenasen 8 1.2.2.1.2 Flavinhaltige Monooxygenasen 10 1.2.2.1.3 Alkoholoxidation 11 1.2.2.1.4 Aldehydoxidation 11 1.2.2.1.5 Monoaminoxidase 12 1.2.2.1.6 Aldehyd- und Ketonreduktion 12 1.2.2.1.7 Hydrolytische Mechanismen 13

1.2.2.2 Phase II 13 1.2.2.2.1 Glucuronidierung 13 1.2.2.2.2 Sulfatierung 14 1.2.2.2.3 Methylierung 15 1.2.2.2.4 Acetylierung 17 1.2.2.2.5 Glutathion-Konjugation 18 1.2.2.2.6 Mercaptursäure-Synthese 19 1.2.2.2.7 Aminosäure-Konjugation 19

1.2.3 Lokalisation arzneistoffmetabolisierender Enzyme in der Niere 21 1.2.4 Ergebnisse des renalen Metabolismus 22

1.3 PRODRUGPRINZIP N-HYDROXYLIERTER BASISCHER VERBINDUNGEN 24 1.4 REDUKTION N-HYDROXYLIERTER BASISCHER VERBINDUNGEN 29 1.5 THEMA UND ZIELSETZUNG DER ARBEIT 33

2 GEWINNUNG UND BEARBEITUNG VON SCHWEINENIERENMIKROSOMEN 35

2.1 EINLEITUNG 35 2.1.1 Das Cytochrom P450-Enzymsystem 35

2.1.1.1 Grundlagen und Vorkommen 35 2.1.1.2 Der katalytische Zyklus 38

2.1.2 Gewinnung membranständiger Enzyme 39 2.1.3 Bisherige Untersuchungen 41 2.1.4 Zielsetzung 43

2.2 METHODEN 44 2.2.1 Gewinnung der Enzympräparation 44

2.2.1.1 Materialien und Geräte 44

INHALTSVERZEICHNIS

II

2.2.1.2 Gewinnung von Schweinenierenmikrosomen 44 2.2.1.3 Isolierung des zur Reduktion N-hydroxylierter Verbindungen verantwortlichen

Cytochrom P450 Isoenzyms 45 2.2.1.3.1 Solubilisation 45

2.2.1.3.1.1 Polyethylenglykol 6000 Fällung 45 2.2.1.3.2 Hydrophobe Interaktionschromatographie an Octyl-Sepharose CL-4B® 46

2.2.1.3.2.1 Variation des Detergenzes 46 2.2.1.3.2.2 Variation der Salzkonzentration 47

2.2.1.3.3 Präparative HPLC an Fractogel® EMD TMAE 650 (S) 47 2.2.1.3.4 Anionenaustauschchromatographie an DEAE-Cellulose 49

2.2.1.3.4.1 Solubilisation 49 2.2.1.3.4.2 Protein-Verlaufskontrolle 50 2.2.1.3.4.3 Cytochrom b5-Verlaufskontrolle 50 2.2.1.3.4.4 NADH Cytochrom b5 Reduktase-Verlaufskontrolle 50 2.2.1.3.4.5 Cytochrom P450-Verlaufskontrolle 50 2.2.1.3.4.6 Monoaminoxidase-Verlaufskontrolle 50 2.2.1.3.4.7 Benzamidoxim-Reduktase-Verlaufskontrolle ohne zusätzliche Enzyme 51 2.2.1.3.4.8 Benzamidoxim-Reduktase-Verlaufskontrolle mit zugesetzter gereinigter

NADH Cytochrom b5 Reduktase 51 2.2.1.3.4.9 Benzamidoxim-Reduktase-Verlaufskontrolle mit zugesetztem humanem

rekombinantem Cytochrom b5 51 2.2.1.3.4.10 Benzamidoxim-Reduktase-Verlaufskontrolle mit zugesetzter gereinigter

NADH Cytochrom b5 Reduktase und zugesetztem humanem

rekombinantem Cytochrom b5 51 2.2.1.3.4.11 Dextromethorphan-O-Demethylierung 52 2.2.1.3.4.12 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese 52 2.2.1.3.4.13 Massenspektrometrische Analyse 52 2.2.1.3.4.14 nit-1 Rekonstitutions-Assay 52 2.2.1.3.4.15 FormA Analyse 52 2.2.1.3.4.16 Immunoblot-Analyse 53

2.2.1.3.5 Kationenaustauschchromatographie an CM-Cellulose 53 2.2.1.3.6 Detergenzentfernung 53

2.2.1.3.6.1 Calbiosorb® 54 2.2.1.3.6.2 Hydroxylapatit 54 2.2.1.3.6.3 Detergent OutTM 54

2.2.1.3.7 Stabilität 55 2.2.1.3.8 Lagerung 55

2.2.2 Analytische Methoden zur Charakterisierung der Enzympräparationen 55 2.2.2.1 Proteinbestimmung 55 2.2.2.2 NADPH Cytochrom P450 Reduktase-Aktivitätsbestimmung 56 2.2.2.3 Cytochrom b5-Gehaltsbestimmung 56 2.2.2.4 NADH Cytochrom b5 Reduktase-Aktivitätsbestimmung 57 2.2.2.5 Cytochrom P450-Gehaltsbestimmung 57 2.2.2.6 Monoaminoxidase-Aktivitätsbestimmung 58 2.2.2.7 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese 58

INHALTSVERZEICHNIS

III

2.2.2.8 Massenspektrometrische Analyse 61 2.2.2.9 nit-1 Rekonstitutions-Analyse 61 2.2.2.10 FormA Analyse 62 2.2.2.11 Immunoblot-Analyse 62

2.2.3 Analytische Methoden zur Charakterisierung der Benzamidoxim-Reduktase 64 2.2.3.1 Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin 64

2.2.3.1.1 Synthese von Benzamidoxim 64 2.2.3.1.2 Inkubationsbedingungen 64 2.2.3.1.3 HPLC-Analytik 65 2.2.3.1.4 Anaerobe Inkubationsbedingungen 66 2.2.3.1.5 Hemmstudien 66

2.2.3.1.5.1 Kaliumcyanid 67 2.2.3.1.5.2 Hydroxylamin-HCl 67 2.2.3.1.5.3 p-Hydroxymercuribenzoat 67 2.2.3.1.5.4 Cytochrom c 67 2.2.3.1.5.5 Kohlenmonoxid 68 2.2.3.1.5.6 Natriumvanadat 68

2.2.3.1.6 Rekonstitution des P450-Isoenzyms zur Reduktion von Benzamidin 68 2.2.3.2 O-Demethylierung von Dextromethorphan 69

2.2.3.2.1 Inkubationsbedingungen 69 2.2.3.2.2 HPLC-Analytik 69 2.2.3.2.3 Rekonstitution der DEAE-Fraktionen zur O-Demethylierung von

Dextromethorphan 71 2.3 ERGEBNISSE 72

2.3.1 Solubilisationsstudien 72 2.3.1.1 Polyethylenglykol 6000 Fällung 75

2.3.2 Hydrophobe Interaktionschromatographie an Octyl-Sepharose CL-4B® 75 2.3.3 Präparative HPLC an Fractogel® EMD TMAE 650 (S) 77 2.3.4 Anionenaustauschchromatographie an DEAE-Cellulose 78

2.3.4.1 Solubilisation der Schweinenierenmikrosomen für die Anionen-

austauschchromatographie an DEAE-Cellulose 78 2.3.4.2 Protein-Verlaufskontrolle 79 2.3.4.3 Cytochrom b5-Verlaufskontrolle 80 2.3.4.4 NADH Cytochrom b5 Reduktase-Verlaufskontrolle 81 2.3.4.5 Cytochrom P450-Verlaufskontrolle 81 2.3.4.6 Monoaminoxidase-Verlaufskontrolle 82 2.3.4.7 Benzamidoxim-Reduktase-Verlaufskontrolle ohne zusätzliche Enzyme 82 2.3.4.8 Benzamidoxim-Reduktase-Verlaufskontrolle mit zugesetzter gereinigter NADH

Cytochrom b5 Reduktase 83 2.3.4.9 Benzamidoxim-Reduktase-Verlaufskontrolle mit zugesetztem humanem

rekombinantem Cytochrom b5 84 2.3.4.10 Benzamidoxim-Reduktase-Verlaufskontrolle mit zugesetzter gereinigter NADH

Cytochrom b5 Reduktase und zugesetztem humanem rekombinantem

Cytochrom b5 85 2.3.4.11 Dextromethorphan-O-Demethylierung 86

INHALTSVERZEICHNIS

IV

2.3.4.12 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese 87 2.3.4.13 Massenspektrometrische Analyse 87 2.3.4.14 nit-1 Rekonstitutions-Assay 89 2.3.4.15 FormA Analyse 89 2.3.4.16 Immunoblot-Analyse 90

2.3.5 Kationenaustauschchromatographie an CM-Cellulose 91 2.3.6 Stabilität 91 2.3.7 Charakterisierung der Schweinenierenmikrosomen 92

2.3.7.1 Aktivitäten ausgewählter Enzyme in Schweinenierenmikrosomen 92 2.3.7.1.1 NADPH Cytochrom P450 Reduktase 92 2.3.7.1.2 Cytochrom b5 92 2.3.7.1.3 NADH Cytochrom b5 Reduktase 93 2.3.7.1.4 Cytochrom P450 93 2.3.7.1.5 Monoaminoxidase 94

2.3.7.2 Charakterisierung und Inkubationsoptimierung der N-reduktiven Aktivität von

Benzamidoxim der Schweinenieren-mikrosomen 94 2.3.7.2.1 pH-Wert 95 2.3.7.2.2 Substratabhängigkeit 96 2.3.7.2.3 Cosubstratabhängigkeit und –art 97

2.3.7.3 Sauerstoffabhängigkeit der Reduktion von Benzamidoxim mittels

Schweinenierenmikrosomen 98 2.3.7.4 Hemmstudien 98

2.3.7.4.1 Kaliumcyanid 98 2.3.7.4.2 Hydroxylamin-HCl 100 2.3.7.4.3 p-Hydroxymercuribenzoat 101 2.3.7.4.4 Cytochrom c 102 2.3.7.4.5 Kohlenmonoxid 103 2.3.7.4.6 Natriumvanadat 104 2.3.7.4.7 Zwittergent® 3-14 104

2.3.7.5 Vergleichsinkubation von Schweineleber- und Schweinenierenmikrosomen

bezüglich der Reduktion von Benzamidoxim und O-Demethylierung von

Dextromethorphan 105 2.4 DISKUSSION 107 2.5 ZUSAMMENFASSUNG 119

3 ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON SCHWEINENIERENMITOCHONDRIEN 122

3.1 EINLEITUNG 122 3.1.1 Bisherige Untersuchungen 122 3.1.2 Zielsetzung 123


3.2.1.1 Materialien und Geräte 124 3.2.1.2 Gewinnung von Schweinenierenmitochondrien 124

INHALTSVERZEICHNIS

V

3.2.2 Analytische Methoden zur Charakterisierung der Enzympräparation 125 3.2.2.1 Proteinbestimmung 125 3.2.2.2 NADPH Cytochrom P450 Reduktase-Aktivitätsbestimmung 126 3.2.2.3 Monoaminoxidase-Aktivitätsbestimmung 127




3.3 ERGEBNISSE 133 3.3.1 Charakterisierung der Schweinenierenmitochondrien 133

3.3.1.1 Mikrosomale Kontamination 133 3.3.1.2 Anreicherung der Mitochondrien 133 3.3.1.3 Proteinausbeute der Schweinenierenmitochondrien-Gewinnung 134 3.3.1.4 Charakterisierung und Inkubationsoptimierung der Reduktion von

Benzamidoxim durch Schweinenierenmitochondrien 134 3.3.1.4.1 Proteinabhängigkeit 135 3.3.1.4.2 Inkubationszeit 136 3.3.1.4.3 pH-Wert 137 3.3.1.4.4 Substratabhängigkeit 138 3.3.1.4.5 Cosubstratabhängigkeit und –art 139

3.3.1.5 Sauerstoffabhängigkeit der Reduktion von Benzamidoxim mittels

Schweinenierenmitochondrien 140 3.3.1.6 Hemmstudien 140

3.3.1.6.1 Kaliumcyanid 141 3.3.1.6.2 Hydroxylamin-HCl 142 3.3.1.6.3 p-Hydroxymercuribenzoat 143 3.3.1.6.4 Cytochrom c 144 3.3.1.6.5 Kohlenmonoxid 145 3.3.1.6.6 Natriumvanadat 146

3.4 DISKUSSION 147 3.5 ZUSAMMENFASSUNG 152

4 ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER ÄUßEREN MEMBRAN VESIKEL 153

4.1 EINLEITUNG 153

INHALTSVERZEICHNIS

VI

4.1.1 Aufbau und Funktion der Mitochondrien 153 4.1.2 Methoden zur Gewinnung der Äußeren Membran Vesikel 156 4.1.3 Bisherige Untersuchungen 158 4.1.4 Zielsetzung 158


4.2.1.1 Materialien und Geräte 159 4.2.1.2 Gewinnung von Äußeren Membran Vesikeln aus Schweinenierenmitochondrien 159

4.2.2 Analytische Methoden zur Charakterisierung der Enzympräparation 160 4.2.2.1 Proteinbestimmung 160 4.2.2.2 Succinat Cytochrom c Reduktase-Aktivitätsbestimmung 160 4.2.2.3 Rotenon-insensitive Cytochrom c Reduktase-Aktivitätsbestimmung 161 4.2.2.4 Monoaminoxidase-Aktivitätsbestimmung 161 4.2.2.5 Cytochrom P450-Gehaltsbestimmung 161




4.3 ERGEBNISSE 167 4.3.1 Charakterisierung der Äußeren Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien 167

4.3.1.1 Proteinausbeute der Äußeren Membran Vesikel-Gewinnung 167 4.3.1.2 Enzymatische Charakterisierung der Äußeren Membran Vesikel 167

4.3.1.2.1 Succinat Cytochrom c Reduktase 167 4.3.1.2.2 Rotenon-insensitive Cytochrom c Reduktase-Aktivität 168 4.3.1.2.3 Monoaminoxidase-Aktivitätsbestimmung 169 4.3.1.2.4 Cytochrom P450-Gehaltsbestimmung 169 4.3.1.2.5 N-reduktive Aktivität 169 4.3.1.2.6 Gesamtergebnis der Enzymcharakterisierung 170

4.3.1.3 Charakterisierung und Inkubationsoptimierung der Reduktion von Benzamid-

oxim durch Äußere Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien 171 4.3.1.3.1 Proteinabhängigkeit 171 4.3.1.3.2 Inkubationszeit 173 4.3.1.3.3 pH-Wert 174 4.3.1.3.4 Substratabhängigkeit 175 4.3.1.3.5 Cosubstratabhängigkeit und –art 176

INHALTSVERZEICHNIS

VII

4.3.1.4 Sauerstoffabhängigkeit der Reduktion von Benzamidoxim mittels Äußeren

Membran Vesikeln aus Schweinenierenmitochondrien 177 4.3.1.5 Hemmstudien 177

4.3.1.5.1 Kaliumcyanid 177 4.3.1.5.2 Hydroxylamin-HCl 179 4.3.1.5.3 p-Hydroxymercuribenzoat 180 4.3.1.5.4 Cytochrom c 181 4.3.1.5.5 Kohlenmonoxid 182 4.3.1.5.6 Natriumvanadat 183


5 ISOLIERUNG UND IDENTIFIZIERUNG DER DRITTEN KOMPONENTE AUS ÄUßEREN MEMBRAN VESIKELN 190

5.1 EINLEITUNG 190 5.1.1 Gewinnung membranständiger Enzyme 190 5.1.2 Bisherige Untersuchungen 190 5.1.3 Zielsetzung 190


5.2.1.1 Materialien und Geräte 191 5.2.1.2 Gewinnung der Schweinenierenmitochondrien 191 5.2.1.3 Gewinnung der Äußeren Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien 191 5.2.1.4 Gewinnung der dritten Komponente aus Äußeren Membran Vesikeln von

Schweinenierenmitochondrien 191 5.2.1.4.1 Solubilisation 191 5.2.1.4.2 Anionenaustauschchromatographie an DEAE Cellulose 192

5.2.1.4.2.1 Protein-Verlaufskontrolle 192 5.2.1.4.2.2 Cytochrom b5-Verlaufskontrolle 193 5.2.1.4.2.3 NADH Cytochrom b5 Reduktase-Verlaufskontrolle 193 5.2.1.4.2.4 Monoaminoxidase-Verlaufskontrolle 193 5.2.1.4.2.5 Rotenon-insensitive Cytochrom c Reduktase-Verlaufskontrolle 193 5.2.1.4.2.6 Benzamidoxim-Reduktase-Verlaufskontrolle ohne zusätzliche Enzyme 193 5.2.1.4.2.7 Benzamidoxim-Reduktase-Verlaufskontrolle mit zugesetzter gereinigter

NADH Cytochrom b5 Reduktase 194 5.2.1.4.2.8 Benzamidoxim-Reduktase-Verlaufskontrolle mit zugesetztem

humanem, rekombinantem Cytochrom b5 194 5.2.1.4.2.9 Benzamidoxim-Reduktase-Verlaufskontrolle mit zugesetzter gereinigter

NADH Cytochrom b5 Reduktase und zugesetztem humanem,

rekombinantem Cytochrom b5 194 5.2.1.4.2.10 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese 194 5.2.1.4.2.11 nit-1 Rekonstitutions-Assay 195 5.2.1.4.2.12 Sulfitoxidase-Verlaufskontrolle 195 5.2.1.4.2.13 FormA Analyse 195

INHALTSVERZEICHNIS

VIII

5.2.1.4.2.14 Immunoblot-Analyse 195 5.2.1.5 Cytochrom b5 195 5.2.1.6 Gewinnung von NADH Cytochrom b5 Reduktase 196

5.2.2 Analytische Methoden zur Charakterisierung der Enzympräparation 196 5.2.2.1 Proteinbestimmung 196 5.2.2.2 Cytochrom b5-Gehaltsbestimmung 196 5.2.2.3 NADH Cytochrom b5 Reduktase-Aktivitätsbestimmung 196 5.2.2.4 Monoaminoxidase-Aktivitätsbestimmung 197 5.2.2.5 Rotenon-insensitive Cytochrom c Reduktase-Aktivitätsbestimmung 197 5.2.2.6 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese 197 5.2.2.7 Massenspektrometrische Analyse 197 5.2.2.8 nit-1 Rekonstitutions-Analyse 197 5.2.2.9 Sulfitoxidase-Verlaufskontrolle 197 5.2.2.10 FormA Analyse 198 5.2.2.11 Immunoblot-Analyse 198


5.2.3.1.1 Synthese von Benzamidoxim 198 5.2.3.1.2 Inkubationsbedingungen 198 5.2.3.1.3 HPLC-Analytik 199

5.3 ERGEBNISSE 201 5.3.1 Gewinnung der Enzymfraktion 201

5.3.1.1 Solubilisation der Äußeren Membran Vesikel 201 5.3.1.2 Anionenaustauschchromatographie an DEAE Cellulose 201

5.3.1.2.1 Protein-Verlaufskontrolle 201 5.3.1.2.2 Cytochrom b5-Verlaufskontrolle 203 5.3.1.2.3 NADH Cytochrom b5 Reduktase-Verlaufskontrolle 204 5.3.1.2.4 Monoaminoxidase-Verlaufskontrolle 205 5.3.1.2.5 Rotenon-insensitive Cytochrom c Reduktase-Verlaufskontrolle 206 5.3.1.2.6 Benzamidoxim-Reduktase-Verlaufskontrolle ohne zusätzliche Enzyme 206 5.3.1.2.7 Benzamidoxim-Reduktase-Verlaufskontrolle mit zugesetzter NADH

Cytochrom b5 Reduktase 207 5.3.1.2.8 Benzamidoxim-Reduktase-Verlaufskontrolle mit zugesetztem humanem,

rekombinantem Cytochrom b5 208 5.3.1.2.9 Benzamidoxim-Reduktase-Verlaufskontrolle mit zugesetzter gereinigter


rekombinantem Cytochrom b5 209 5.3.1.2.10 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese 210 5.3.1.2.11 nit-1 Rekonstitutions-Assay 211 5.3.1.2.12 Sulfitoxidase-Verlaufskontrolle 213 5.3.1.2.13 FormA Analyse 213 5.3.1.2.14 Immunoblot-Analyse 214

5.3.1.3 Charakterisierung der N-reduktiven Aktivität der Benzamidoxim-reduzierenden

Proteinfraktion 215 5.3.1.4 Massenspektrometrische Analyse 217

INHALTSVERZEICHNIS

IX


6 REDUKTION VON BENZAMIDOXIM MIT DEM ZWEI- UND DREIKOMPONENTENSYSTEM 229

6.1 EINLEITUNG 229 6.1.1 Cytochrom b5 229 6.1.2 NADH Cytochrom b5 Reduktase 230 6.1.3 Zusammenspiel zwischen Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5 Reduktase 232 6.1.4 Molybdänhaltige Enzyme 234 6.1.5 Reduktion N-hydroxylierter Verbindungen mit molybdänhaltigen Enzymen 237 6.1.6 Bisherige Untersuchungen 238 6.1.7 Zielsetzung 239

6.2 METHODEN 240 6.2.1 Gewinnung der Enzympräparationen 240

6.2.1.1 Materialien und Geräte 240 6.2.1.2 Gewinnung von Schweinelebermikrosomen 240 6.2.1.3 Isolierung von Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5 Reduktase 241

6.2.1.3.1 Solubilisation 241 6.2.1.3.2 Hydrophobe Interaktionschromatographie 241 6.2.1.3.3 Gewinnung von Cytochrom b5 242 6.2.1.3.4 Gewinnung von NADH Cytochrom b5 Reduktase 242

6.2.1.3.4.1 Präparative HPLC an Fractogel® EMD TMAE 650 (S) 242 6.2.1.3.4.2 Bioaffinitätschromatographie an 5’-AMP-Sepharose® 242

6.2.1.4 Umpufferung und Detergenzentfernung 243 6.2.2 Analytische Methoden zur Charakterisierung der Enzympräparationen 243

6.2.2.1 Proteinbestimmung 243 6.2.2.2 NADH Cytochrom b5-Aktivitätsbestimmung 243 6.2.2.3 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese 243

6.2.3 Analytische Methoden zur Charakterisierung der Benzamidoxim-Reduktion durch

Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5 Reduktase 244 6.2.3.1 Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin 244

6.2.3.1.1 Synthese von Benzamidoxim 244 6.2.3.1.2 Inkubationsbedingungen 244 6.2.3.1.3 HPLC-Analytik 245

6.3 ERGEBNISSE 248 6.3.1 Charakterisierung und Inkubationsoptimierung des Zweikomponentensystems 248

6.3.1.1 Inkubationszeit 248 6.3.1.2 Verhältnisabhängigkeit der zwei Proteine bei konstantem Proteingehalt 249 6.3.1.3 Substratabhängigkeit 250

6.3.2 Charakterisierung und Inkubationsoptimierung des Dreikomponentensystems 251 6.3.2.1 Inkubationszeit 251

INHALTSVERZEICHNIS

X

6.3.2.2 Verhältnisabhängigkeit der zwei Elektronentransportproteine bei konstantem

Proteingehalt sowie konstanter Zugabe des gereinigten Moco-bindenden

Enzyms 252 6.3.2.3 pH-Wert 253 6.3.2.4 Substratabhängigkeit 254 6.3.2.5 Cosubstratabhängigkeit 255 6.3.2.6 Verhältnisabhängigkeit des gereinigten Moco-bindenden Enzyms zum

konstanten 1:1 Verhältnis der zwei Elektronentransportproteine 256 6.4 DISKUSSION 257 6.5 ZUSAMMENFASSUNG 261

7 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 262

8 MATERIALIEN UND GERÄTE 266

8.1 SUBSTANZEN UND SONSTIGE MATERIALIEN 266 8.2 GERÄTE 268

9 LITERATURVERZEICHNIS 270

EINFÜHRUNG

1

1 EINFÜHRUNG

1.1 Biotransformation

1.1.1 Definition und Bedeutung

Die Biotransformation ist ein Vorgang im Stoffwechsel von Lebewesen, bei welchem

nicht ausscheidbare Stoffe durch chemische Prozesse in eliminierbare Stoffe

umgewandelt werden [Testai, 2001].

Während des Ablaufs des physiologischen Stoffwechsels des Körpers fallen immer

wieder Substanzen an, die nicht direkt über den Harn oder die Faeces ausgeschieden

werden können. Meist sind diese Stoffe lipophil, d. h. kaum bis gar nicht

wasserlöslich.

Darüber hinaus nimmt der Organismus Fremdstoffe (Xenobiotika) mit der Nahrung

auf. Dieses können Naturstoffe oder vom Menschen synthetisierte Substanzen

(hauptsächlich Medikamente, Drogen, Konservierungsmittel, Pestizide, etc.) sein

[Mutschler et al., 2001].

Eine Ansammlung dieser Substanzen im Körper kann fatal und letztendlich tödlich

sein. Um diese Substanzen in eine eliminierbare Form zu überführen sind viele

Gewebe, vor allem die Leber, aber auch Niere, Lunge, Darm, Haut und Milz zur

Biotransformation fähig [Mutschler et al., 2001].

Die Biotransformationsreaktionen können in zwei Phasen (Phase I und Phase II)

eingeteilt werden. Phase I Reaktionen (Umwandlungsreaktionen) fügen funktionelle

Gruppen (z. B. -OH) in unpolare Moleküle ein. In Phase II Reaktionen

(Konjugationsreaktionen) werden die Moleküle mit wasserlöslichen Molekülen, wie

z. B. Glucuronsäure, Schwefelsäure, Aminosäuren oder Glutathion verbunden und

können dann entweder über die Nieren oder über die Galle ausgeschieden werden

[Testa, 1995]. Oftmals wird erst durch die Phase I Reaktion die Voraussetzung für

eine Phase II Konjugation geschaffen. Sind entsprechende hydrophile Gruppen in der

Substanz schon vorhanden, so können Konjugationen auch direkt ablaufen. Durch

diese Reaktionen wird in der Regel die Lipophilie der Stoffe deutlich herabgesetzt, so

dass sie leichter eliminierbar werden.

Neben solchen Entgiftungsreaktionen (Bioinaktivierung) können aber auch

Aktivierungen stattfinden. Man bezeichnet sie als Bioaktivierung, bei Bildung von

karzinogenen, zytotoxischen, mutagenen oder teratogenen Metaboliten als

Biotoxifizierung oder Giftung [Park et al., 1995].

EINFÜHRUNG

2

Die Bioaktivierung kann aber auch als gewünschtes Prinzip genutzt werden.

Pharmakologisch zunächst unwirksame Arzneistoffe (Prodrugs) werden durch

enzymatische oder nichtenzymatische Reaktionen im Organismus zu therapeutisch

wirksamen Metaboliten (Drugs) umgesetzt. 1935 wurde das Prinzip erstmals

beschrieben [Tréfouel et al., 1935]. Heute wird diese Form der Bioaktivierung

(Prodrug-Prinzip) in der Arzneistoffentwicklung und -therapie häufig ausgenutzt.

Hiermit bietet sich die Möglichkeit, die pharmakodynamischen, pharmakokinetischen

und toxikologischen Eigenschaften eines Arzneistoffes zu beeinflussen.

An der Biotransformation beteiligte Enzyme zeichnen sich in der Regel durch geringe

Substratspezifität aus [Smith und Jones, 1992]. Außerdem können die Enzyme durch

Substrate induziert, das heißt vermehrt gebildet werden. Damit bietet der Körper die

Möglichkeit, der Kumulation eines Xenobiotikums entgegenzuwirken [Donato et al., 1995]. Für eine Arzneistofftherapie kann sich dieses negativ auswirken. Wird ein

Arzneistoff durch ein induzierbares Enzym abgebaut, so kann eine erhöhte Menge an

Enzym zu einem beschleunigten Abbau des Arzneistoffes führen. Dieser kann

dadurch eventuell seine therapeutische Konzentration nicht vollständig oder gar nicht

erreichen.

Zu beachten ist auch die mögliche Interaktion zweier Arzneistoffe. Bei

unterschiedlichen Affinitäten der Stoffe zu einem Enzym kann es zur

Konkurrenzreaktion kommen, wodurch ein Stoff langsamer abgebaut wird als der

andere. Der langsamer abgebaute Stoff kann dadurch im Körper akkumulieren und

eventuell zu einem lebensbedrohlichen Zustand führen. Bei gleichzeitiger Gabe des

CYP3A4 Inhibitors Ketokonazol und dem Antihistaminikum Terfenadin sind z. B.

lebensbedrohliche ventrikuläre Tachyarrhythmien durch den erhöhten Terfenadin-

Plasmaspiegel beschrieben worden [Paakkeri, 2002]. Grapefruitsaft ist als Hemmstoff

für CYP450 Isoenzyme bekannt geworden, während Bohnen und Broccoli als

Induktoren wirken [Guengerich et al., 1994]. Zuletzt sei noch auf genetische

Polymorphismen der an Biotransformationen beteiligten Enzyme hingewiesen, die

dadurch Einfluss auf pharmakologische und toxikologische Eigenschaften der

Arzneistoffe nehmen [Furuta et al., 2005].

1.1.2 Biotransformationsstudien

Pharmaka werden in metabolischen Studien näher untersucht. Die Charakterisierung

ihrer Biotransformation gibt Aufschluss über Pharmakokinetik, unerwünschte

Wirkungen sowie Toxizität. Hiermit wird man den Forderungen des Gesetzgebers

[Arzneimittelgesetz] gerecht, der Wirksamkeit und Unbedenklichkeit eines

EINFÜHRUNG

3

Arzneimittels durch Studien an Mensch und Tier vorschreibt. Die Entwicklung neuer

Arzneistoffe ist sehr teuer. Aus diesem Grunde sind Erkenntnisse über den

Metabolismus potentieller Arzneistoffe von großer Wichtigkeit, um frühzeitig

Konsequenzen ziehen zu können. Außerdem sind in vitro Untersuchungen notwendig,

um für in vivo Untersuchungen die Voraussetzungen zu schaffen.

Pharmakokinetisches Wissen wird vor allem durch in vivo Versuche gewonnen.

Allerdings werden in diesem Zuge die Erkenntnisse der gewonnenen Daten unter

Umständen sehr komplex. Primär gebildete Metabolite können auch allen

pharmakokinetischen Einflüssen wie Verteilung, Speicherung, Proteinbindung und

Metabolismus unterliegen [Forth et al., 2002]. Hiermit können sich aber reaktive oder

instabile Metabolite sowie nur in geringer Konzentration auftretende oder hohe

Eiweißbindung aufweisende Metabolite teilweise oder vollkommen dem Nachweis

entziehen. Hinzu kommt noch die ethische Problematik der Tierversuche. Zu

bedenken ist weiterhin die Übertragbarkeit der gewonnenen Daten auf den

Menschen. Eine Reaktion im Versuchstier muss nicht zwangsläufig auch im Menschen

stattfinden oder eine nachgewiesene Unbedenklichkeit im Versuchstier muss nicht

unbedingt auf den Menschen übertragbar sein.

In vitro Verfahren können in vivo Systemen überlegen sein, wenn gezielt bestimmte

metabolische Schritte nachgewiesen werden sollen. Dadurch haben sich in den

letzten Jahren in vitro Modelle etabliert, die gerade solche metabolische Schritte

nachweisen können. Diese Modelle sind darauf ausgelegt, leicht durchzuführen zu

sein. Außerdem sind sie in der Regel einfach zu validieren. Einzelne Parameter

können gezielt verändert werden, während die Ergebnisse wenig streuen.

Diese in vitro Testsysteme können unterschiedlich aufgebaut sein. Perfundierte

Organe gehören sicherlich zu den ältesten Testsystemen, werden aber nur noch

wenig eingesetzt. Es können komplexe Abläufe in einem Organ untersucht werden,

wobei der Einfluss des restlichen Körpers oder anderer Organe dabei nicht betrachtet

wird [Lohr et al., 1998]. Organschnitte können gerade bei unterschiedlichen

Regionen innerhalb eines Organs Erkenntnisse über die Verteilung von Enzymen

bringen. Außerdem stehen subzelluläre Fraktionen wie Mikrosomen, Mitochondrien

oder Cytosol ebenso zur Verfügung wie die daraus isolierten Enzyme [Constantino et al., 1999]. Diese subzellulären Fraktionen können nur Auskünfte über die

enzymatischen Grundlagen geben. Zuletzt sei noch auf Zelllinien hingewiesen, die

eine dauerhaft gleiche Voraussetzung zur Untersuchung bestimmter Parameter mit

sich bringen. Je nach Anforderung der zu bestimmenden Untersuchung steht somit

eine Vielzahl an in vitro Testsystemen zur Verfügung [Testai, 2001].

EINFÜHRUNG

4

1.1.3 Enzyme der Biotransformation

In vielen Organen sind fremdstoffmetabolisierende Enzyme zu finden. Hierzu zählen

Leber, Niere, Lunge, Gehirn, Haut und Darm [Kuschinsky et al., 1993]. Oral

aufgenommene Xenobiotika gelangen über den Magen-Darm-Trakt in den

Organismus. Resorbierte Substanzen werden mit dem Pfortaderblut direkt zur Leber

geleitet. Hier findet ein erheblicher Teil des Metabolismus statt bevor die Substanzen

in den peripheren Kreislauf gelangen. Somit lässt sich leicht verstehen, warum der

Leber die größte Bedeutung bezüglich der Biotransformation zugesprochen wird. Am

Fremdstoffmetabolismus beteiligte Enzyme zeichnen sich in der Regel durch eine

geringe Substratspezifität aus [Testa, 1995]. Im Gegensatz dazu führen die Enzyme

des Intermediärstoffwechsels oft nur sehr spezifische Reaktionen durch [Forth et al., 2002].

Wie in Kapitel 1.1.1 beschrieben, wird die Biotransformation in zwei Phasen

eingeteilt. Phase I Enzyme lassen sich in lösliche und strukturgebundene Enzyme

unterteilen. Bei den strukturgebundenen Enzymen haben die Cytochrom P450

Monooxygenasen die größte Bedeutung [Guengerich, 2001]. Cytochrom P450

Isoenzyme vermitteln vielfältige Reaktionen. Daneben sind flavinhaltige

Monooxygenasen [Ziegler, 1988] sowie die NADPH Cytochrom P450 Reduktase

[Nebert und Gonzales, 1987] zu nennen. Zu den löslichen Enzymen zählen Alkohol-

und Aldehyddehydrogenase, Xanthinoxidase sowie verschiedene Esterasen und

Monoaminoxidasen [Beedham, 1997; Testai, 2001].

Als wichtige Reaktionen finden in der Phase I Hydroxylierungsreaktionen [Salva et al., 2003] sowie oxidative Desalkylierungen an Stickstoff-, Schwefel- und

Sauerstoffatomen statt [Guengerich, 2001; Obach et al., 2005]. Ferner erfolgen

Oxygenierungen an den Heteroatomen Stickstoff und Schwefel [Hlavica, 2002;

Furnes und Schlenk, 2004]. Ebenso finden oxidative Desaminierungen statt [Yamada

et al., 1997; Obach et al., 2005]. Diese genannten oxidativen Reaktionen spielen im

Fremdstoffmetabolismus am Kohlenstoff die Hauptrolle. Im Falle von

Stickstoffreaktionen sind Reduktionen N-oxygenierter Metabolite, welche durch

Cytochrom P450 Isoenzyme [Guengerich, 2001] oder Aldehydoxidasen [Kitamura et al., 1994] vermittelt werden, von großer Bedeutung. Nitroverbindungen werden

ebenfalls durch Cytochrom P450 Isoenzyme [Guengerich, 2001] sowie durch

Xanthin- und Aldehydoxidase reduziert [Ueda et al., 2005; Dick et al., 2006].

Als Phase II Enzyme sind Methyltransferasen, N-Acetyltransferasen,

Sulfotransferasen, Glutathion-S-Transferasen und Uridindiphosphat-Glucuronyltrans-

ferasen zu nennen. Daneben finden Reaktionen mit Aminosäuren (Glycin,

L-Glutamin) und S-Adenosylmethionin statt [Testai, 2001].

EINFÜHRUNG

5

1.2 Metabolismus in der Niere

1.2.1 Einführung

Die physiologische Rolle der Nieren beinhaltet unter anderem Erhaltung des Wasser-

und Elektrolythaushaltes sowie Synthese, Metabolismus und Exkretion von

Hormonen. Außerdem spielt die Niere eine entscheidende Rolle in der Exkretion von

Arzneistoffen und anderen Xenobiotika [Lohr et al., 1998].

Mechanismen zum Transport von Arzneistoffen im proximalen Tubulus zum

Sekretionsort sind untersucht und bekannt [Bessighir und Roch-Ramel, 1987;

Pritchard und Miller, 1993]. Ebenso sind Resorptionsmechanismen für organische

Substanzen, insbesondere für Aminosäuren [Silbernagl, 1992] und Cholin [Acara und

Rennick, 1973], untersucht worden. Außerdem gibt es pH-abhängige Konzepte über

nichtionische passive Rückdiffusion von Arzneistoffen [Roch-Ramel et al., 1992].

Auch wenn die meisten Erkenntnisse über Arzneistoffmetabolismus aus den Studien

mit der Leber stammen, so ist doch bekannt, dass die Niere Arzneistoffe, Hormone

und weitere Xenobiotika aktiv metabolisiert [Anders, 1980; Bock et al., 1990]. In

einigen Fällen sind in der Niere höhere Biotransformationsraten beschrieben als in

der Leber, wie zum Beispiel die Glycinbindung der Benzoesäure [Poon und Pang,

1995]. Die höchste Konzentration an Histamin N-Methyltransferase [Bowsher et al., 1983] sowie an γ-Glutamyltransferase [Goldbarg et al., 1960] wurde in renalem

Gewebe gefunden.

Da es sich bei der Niere um ein in unterschiedliche Zonen aufgeteiltes Organ handelt,

ist die Kenntnis vom Aufbau wichtig. Beim Menschen zeigen die Nieren - ähnlich der

Form einer Bohne - zwei Pole nach oben und unten, zwei Flächen nach vorne und

hinten (ventral und dorsal) und zwei Ränder nach medial und lateral. Ein Querschnitt

der Niere ist in Abbildung 1.1 dargestellt.

EINFÜHRUNG

6

Abb. 1.1: Niere (Querschnitt) (Quelle: http://www.planet-wissen.de)

Das Nierenparenchym, die eigentliche Organmasse der Niere, wird in die außen

liegende Nierenrinde (Cortex renalis) und das nach innen zum Hilum (Eintrittstelle

von Blutgefäßen und Nerven) gerichtete Nierenmark (Medulla renalis) unterteilt. Das

Mark besitzt dabei die Form von Pyramiden (10 bis 12 Markpyramiden pro Niere), die

mit ihrer Basis nach außen und mit ihrer Spitze nach innen zum Hilum zeigen. Diese

Spitzen, die Papillen, reichen frei in den Hohlraum der Nierenkelche (Calix renalis), die sich in variabler Form zum Nierenbecken (Pelvis renalis) zusammenschließen, aus

dem der Ureter hervorgeht. In dieser Anordnung fließt der Urin aus den Papillen in

Richtung Ureter.

Die Nierenrinde liegt wie eine Kappe zwischen den Basen der Markpyramiden und

der Organkapsel (subkapsulärer Anteil), erreicht aber zwischen den Pyramiden in

säulenförmigen Abschnitten (Columnae renales) den Sinus renalis (Nierenbecken und

Fettgewebe). Der subkapsuläre Anteil der Rinde wird von gut sichtbaren, feinen

Strichen, den Markstrahlen (Radii medullares) durchzogen, die radiär aus den

Markpyramiden in Richtung der Organkapsel ausstrahlen und Teil des Marks sind. Im

Mark selbst lassen sich durch ihre leicht unterschiedliche Farbe ein äußeres Mark,

bestehend aus einem Außen- und einem Innenstreifen, und ein zum Nierenbecken

gelegenes inneres Mark unterscheiden.

EINFÜHRUNG

7

Bei den einzelnen Säugetieren ist die Niere unterschiedlich aufgebaut. In der

einfachsten Form besteht die Niere aus einzelnen, kegelförmigen Nierenlappen (Lobi renales). Diese mehrlappige Niere ist typisch für Meeressäugetiere und Bären. Jeder

Nierenlappen besteht aus einer Rindenkappe und einer Markpyramide, die in einer

Nierenpapille (Papilla renalis, das spitze Ende des Kegels) endet. Bei den meisten

Säugetieren verschmelzen diese Nierenlappen (beim Menschen 6 Lappen) in

unterschiedlichem Ausmaß. Die verschmelzenden Rindenkappen bilden die

Nierenrinde, die Pyramiden das Nierenmark. Bei Rindern verschmelzen nur die

Mittelteile der einzelnen Nierenlappen, wodurch an der Oberfläche Furchen entstehen

und die Nierenpapillen ebenfalls erhalten bleiben. Diese Bauform nennt man

mehrwarziggefurchte Niere. Diese Form tritt zwischenzeitlich auch in der fetalen

Entwicklung der Niere bei den Säugetieren auf, die durch weitere

Verschmelzungsvorgänge gekennzeichnet ist. Auch das menschliche Neugeborene

besitzt noch eine mehrwarziggefurchte Niere. Bei Primaten (einschl. Mensch) und

Schweinen verschmelzen die Rindenanteile nach der Geburt vollständig, so dass die

Organoberfläche glatt erscheint. Die einzelnen Papillen bleiben jedoch erhalten. Man

spricht von einer mehrwarzigglatten Niere. Bei den meisten Säugetieren

verschmelzen nun auch die einzelnen Nierenpapillen zu einer Nierenleiste (Crista renalis), so dass man von einer einwarzigglatten Niere spricht [Netter, 1983].

Zur Untersuchung des Metabolismus in der Niere gibt es viele unterschiedliche

Möglichkeiten. Es gibt in vivo Techniken wie die renale Clearance sowie in vitro

Studien mit Zellorganellen wie Mitochondrien und Mikrosomen. Außerdem identifiziert

die Molekularbiologie spezifische, für den Metabolismus verantwortliche, Enzyme

durch Genkodierung. Jede Technik steuert unterschiedliche Informationen bei.

Historisch gesehen ist die Messung der renalen Clearance die älteste

Untersuchungsmethode [Moller et al., 1928]. Die Clearance wird dabei als das

Plasmavolumen definiert, welches pro Minute komplett von einer Substanz befreit

wird. Diese Definition ist allerdings nicht als eindeutig anzusehen, denn es wird

weder geklärt, wo die Substanz verbleibt, noch auf welchem Wege dies geschieht.

Metabolismus und Resorption sind in dieser Definition nicht berücksichtigt [Acara,

1992]. Die ersten in vivo Untersuchungen zur Quantifizierung der renalen Clearance

fanden Ende der Siebziger Jahre statt und waren damit gleichzeitig die ersten

Metabolismusstudien [Toretti und Weiner, 1976; Tucker, 1981]. Metabolismus wurde

dabei insofern untersucht, als zunächst eine radioaktivmarkierte Substanz per

Infusion gegeben wurden. Anschließend wurde im Urin die Ausscheidung der

Ausgangssubstanz detektiert. Dabei wurden auch andere radioaktivmarkierte

EINFÜHRUNG

8

Metabolite gefunden, welche aber nicht näher untersucht wurden. [Quebbemann und

Rennick, 1969; Acara und Rennick, 1972].

Neben der Messung der Clearance werden sehr häufig Gewebepräparationen zur

Untersuchung des Metabolismus angewandt. Seit Jahrzehnten werden dafür

Nierenschnitte verwendet. Dazu werden Nieren direkt nach der Entnahme gekühlt

gehalten und in kleine Stücke geschnitten. Die Stücke müssen sehr dünn sein, so

dass Luftsauerstoff alle Zellen während einer Inkubation erreichen kann. Sie können

bis zu zwei Stunden inkubiert werden. Hinterher werden die gebildeten Metabolite

aus den Stücken gewonnen. Dadurch konnten sehr spezifische Aktivitäten von

Enzymen im Rindengewebe sowie im äußeren und inneren Mark untersucht werden.

Damit konnte Cholindehydrogenase-Aktivitätszunahme während einer Hypernatriämie

in der Nierenrinde festgestellt werden, während die Aktivität im Nierenmark

unverändert blieb [Grossman und Hebert, 1989].

Außer den Nierenstückchen finden isolierte Tubuli [Schlondorff, 1986] und

Zellkulturen ihre Anwendung [Fry et al., 1978].

Subzelluläre Fraktionen wie Mikrosomen und Mitochondrien werden durch

Homogenisierung des Gewebes und anschließender Zentrifugation erhalten [Kapitel

2.2.1.2 und 3.2.1.2]. Durch Zugabe von Substraten zu den Organellen kann in

Inkubationen die Bildung von Metaboliten studiert werden.

1.2.2 Renale Biotransformationswege

1.2.2.1 Phase I

1.2.2.1.1 Cytochrom P450 abhängige Monooxygenasen

Eine genaue Beschreibung des Cytochrom P450-Enzymsystems ist in Kapitel 2.1.1

dargestellt. An dieser Stelle soll die Bedeutung der Niere für die Biotransformation

sowie bisherige Studien dargelegt werden.

Das Cytochrom P450 Enzymsystem ist, ähnlich wie in der Leber, wohl das am

meisten untersuchte System in der Niere [Lohr et al., 1998]. Seit Beginn der

Sechziger Jahre finden Untersuchungen zum Cytochrom P450 Enzymsystem in der

Niere statt [Anders, 1980]. Dabei ist der renale Beitrag der Monooxygenasen zum

Metabolismus bis auf die Hydroxylierung von Fettsäuren deutlich niedriger als in der

Leber [Oliw, 1994]. Es wurden Isoenzyme unterschiedlicher Familien gefunden:

CYP1A1, CYP1A2 [Ioannides und Parke, 1990], Isoenzyme der Familien CYP2 und

CYP4 [Gonzalez, 1988]. In 80 % der untersuchten humanen Nieren ist auch das

Enzym CYP3A4 gefunden worden [Parkinson, 1996].

EINFÜHRUNG

9

Lokalisiert sind die Cytochrom P450 Isoenzyme hauptsächlich in der Nierenrinde, im

äußeren Mark dagegen kaum. Ein erhöhtes Vorkommen weisen sie dagegen im

inneren Mark auf [Zenser et al., 1978]. Im isolierten Tubulussystem konnten die

höchsten Cytochrom P450 Konzentrationen im proximalen Tubulus gefunden werden

[Cojocel et al., 1983]. Mikrosomale NADPH Cytochrom c Reduktase-Aktivität wurde

von der Rinde zum inneren Nierenmark in abnehmender Konzentration gefunden

[Endou, 1983].

Es sind sehr viele Untersuchungen zur Induktion von Cytochrom P450 Isoenzymen in

der Niere durchgeführt worden. Das Analgetikum Paracetamol führt zu einer

Erhöhung von CYP2E1 [Hoivik et al., 1995]. Phenobarbital induziert gleich mehrere

Isoenzyme: CYP1A1 und CYP1A2 [Ioannides und Parke, 1990], mehrere Enzyme der

CYP2B Familie sowie CYP4B1 [Ryan et al., 1993]. Das in der Chemotherapie

eingesetzte Cisplatin induziert im Speziellen das renale CYP2C23 [Ohishi et al., 1994].

Ethanol induziert sehr selektiv CYP2E1 [Ueng et al., 1987]. Das immunsuppressiv

wirksame Cyclosporin A führt im Gegensatz zur Leber in der Niere zu einer Erhöhung

des Cytochrom P450 Gehaltes [Mayer et al., 1989].

In der Niere sind die typischen Cytochrom P450 Reaktionen gefunden worden.

Aromatische Oxidierung wurde durch die Hydroxylierung von Phenobarbital

nachgewiesen [Smith et al., 1986; Mayer et al., 1989]. Mit Aminopyrin wurde die

N-Desalkylierung gezeigt [Litterst et al., 1975; Orrenius et al., 1973].

O-Desalkylierung wurde mit 7-Ethoxycoumarin nachgewiesen. Hierbei konnte in

einem rekonstituierten System die Reaktion mit dem CYP2C23 durchgeführt werden

[Imaoka et al., 1990]. In geringem Maße wird auch eine oxidative Deshalogenierung

beobachtet. Renale Mikrosomen metabolisieren Dichlormethan, im Vergleich zur

Leber allerdings nur mit einer Rate von etwa fünf Prozent [Kubic und Anders, 1975].

Ergänzend ist in der Niere ein Cytochrom P450 induzierter Metabolismus festgestellt

worden, der nicht auf Arzneistoffe zurückzuführen ist, sondern endogenen

Substraten, Hormonen, Toxinen und metabolischen Krankheiten zuzusprechen ist.

Monooxygenasen spielen eine Rolle im Fettsäure- und Steroidmetabolismus der

Leber. Doch auch die Niere scheint hierfür entsprechende Gene zu exprimieren. So

konnte die CYP3A Unterfamilie, welche für die 6-Hydroxylierung von endogenen

Steroiden verantwortlich ist, nachgewiesen werden [Schuetz et al., 1992]. Schon

frühzeitig wurden zwei Pfade für den Arachidonsäuremetabolismus in der Niere

gefunden. Der eine beschreitet den Prostaglandin Cyclooxygenase Weg, der andere

hingegen ist in das NADPH abhängige P450 System involviert [Zenser et al., 1979].

Eine erhöhte Expression der CYP4A Unterfamilie, welche in der Arachidonsäure

Oxygenase-Aktivität eine Rolle spielt, korreliert mit Hypertonie [Makita et al., 1996].

Ebenso konnte die CYP2A Unterfamilie, die für die Arachidonsäure Epoxygenase

EINFÜHRUNG

10

zuständig ist, mit einem krankhaften Zustand der Niere in Verbindung gebracht

werden [Makita et al., 1996]. Neben den endogenen Substraten führen auch Toxine

zu erhöhter Expression verschiedener Cytochrom P450 Isoenzyme. Xylen führt zu

einer Erhöhung von Cytochrom P450 Isoenzymen [Toftgard und Nilsen, 1982],

während das polychlorierte Biphenylderivat Aroclor 1254 selektiv CYP1A2 [Beebe et al., 1995] und das Pestizid Fenarimol CYP1A1 induziert [Paolini et al., 1996]. Auch

konnte in der Niere eine erhöhte Expression von Cytochrom P450 Enzymen, welche

am Sexualhormonmetabolismus beteiligt sind, festgestellt werden [Hu et al., 1993].

Dieses gilt sowohl für männliche Rattennieren, welche z. B. nach Behandlung mit

dem Lipidsenker Clofibrat vermehrt CYP4A2 bilden [Sundseth und Waxman, 1992],

als auch für weibliche Rattennieren, welche durch Phenobarbital deutlich mehr

CYP2A exprimieren [Pelkonen et al., 1994]. Schließlich können Krankheiten zu einer

Veränderung des Cytochrom P450 Spiegels in der Niere führen. In einer überfetteten

Niere wurden pro Gramm Gewebe etwa 50 % mehr an Cytochrom P450 Gehalt

gefunden als im Normalzustand [Corcoran und Salzar, 1988]. Hingegen führt

Hungern ebenfalls zu einer Erhöhung des Cytochrom P450 Spiegels [Hasumura et al., 1983]. Streptozotozin führt zu Zellschäden an den insulinproduzierenden Inselzellen

der Bauchspeicheldrüse. Mit Streptozotozin vorbehandelte Versuchstiere haben einen

um 50 % reduzierten Cytochrom P450 Gehalt als entsprechende Vergleichstiere [Del

Villar et al., 1995].

1.2.2.1.2 Flavinhaltige Monooxygenasen

Flavinhaltige Monooxygenasen oxidieren nucleophile stickstoff-, schwefel- und

phosphorhaltige funktionelle Gruppen. Hierfür benötigen sie NADPH und Sauerstoff

und katalysieren dabei zum Teil gleiche Reaktionen wie die Cytochrom P450 Enzyme.

Fünf verschiedene flavinhaltige Monooxygenasen wurden bisher geklont und

sequenziert. Jedes dieser Gene wird in einer art- und gewebespezifischen Menge

exprimiert. Vor allem die flavinhaltigen Monooxygenasen 1 und 3 sind in der Niere zu

finden [Dolphin et al., 1991].

N-Oxide sind die häufigsten Metabolite basischer Arzneistoffe, die durch die

flavinhaltigen Monooxygenasen gebildet werden. So werden die N-Oxide von

Trimethylamin [Acara et al., 1973], dem Opiat Meperidin (Pethidin) [Acara et al., 1981], dem Serotonin Antagonisten Tropisetron [Vickers et al., 1996] sowie dem

trizyklischen Antidepressivum Imipramin [Lemoine et al., 1990] durch Enzymquellen

aus der Niere gebildet.

EINFÜHRUNG

11

1.2.2.1.3 Alkoholoxidation

Alkohol wird normalerweise für die Elimination zum Aldehyd und anschließend zur

Carbonsäure oxidiert. Alternativ können Alkohole direkt an Glucuronsäure konjugiert

werden. Auch wenn etwa 90 % des Ethanolmetabolismus in der Leber stattfinden, so

sind die Enzyme ubiquitär vorhanden und der renale Metabolismus spielt hierbei eine

Rolle.

Die Alkoholdehydrogenase ist ein cytoplasmatisches, NAD+ abhängiges Zink

Metalloenzym, welches die Oxidation von Alkohol zum Aldehyd katalysiert. Die

Alkoholdehydrogenase Isoenzyme werden in fünf verschiedene Klassen geteilt. Diese

unterscheiden sich in ihrer Sensitivität für eine Hemmung durch Pyrazole sowie ihrer

Michaelis-Menten-Kinetik für Ethanol [Yasunami et al., 1991]. Vor allem die

Alkoholdehydrogenasen 1 und 2 wurden in der Niere gefunden [Holmes et al., 1986],

wobei die Aktivität etwa einem Drittel der Aktivität der Leber entspricht.

Alkoholdehydrogenasen wurden in Nierenrinde und -mark gefunden [Qulali et al., 1991]. Estradiol wurde als selektiver Induktor für die Alkoholdehydrogenasen in der

Niere entdeckt, während der Enzymspiegel in der Leber konstant blieb [Qulali et al., 1993].

1.2.2.1.4 Aldehydoxidation

Aldehyde treten normalerweise als Intermediate in vielen Reaktionen auf. Der mit

Abstand am häufigsten auftretende Aldehyd ist Acetaldehyd im Metabolismus des

Ethanols. Außerdem entstehen Aldehyde im biogenen Aminstoffwechsel,

Aminosäuremetabolismus sowie bei der Peroxidation von vielfach ungesättigten

Fettsäuren [Ambroziak und Pietruszko, 1993].

Aldehyde werden durch unterschiedliche Enzyme zu ihren korrespondierenden

Carbonsäuren oxidiert. Verantwortlich hierfür sind meistens Aldehyddehydrogenase,

Aldehydoxidase und Xanthinoxidase. Aldehydoxidase-Aktivität wurde in der Niere

erstmals 1966 beschrieben [Deitrich, 1966]. Die Aktivität liegt in der Niere bei etwa

20-80 % im Vergleich zur Leber [Deitrich, 1966; Dipple und Crabb, 1993].

Aldehyddehydrogenasen werden in drei Klassen geteilt. Hierbei tritt nur die Klasse II

in der Niere auf [Agarwal et al., 1989; Dipple und Crabb, 1993]. Es handelt sich bei

dieser Klasse um mitochondriale Enzyme. Sie zeigen einen niedrigen Km-Wert für

Acetaldehyd und haben ihren Schwerpunkt im aliphatischen sowie biogenen

Aminmetabolismus.

EINFÜHRUNG

12

1.2.2.1.5 Monoaminoxidase

Monoaminoxidasen katalysieren den oxidativen Metabolismus von Aminen. Die

Monoaminoxidasen sind auf der äußeren Membran von Mitochondrien lokalisiert. In

der katalysierten Reaktion wird das Substrat oxidiert und gleichzeitig das zugehörige

Flavinadenindinucleotid reduziert. In einer zweiten Reaktion findet eine

Rückoxidation mit Sauerstoff statt, wobei Aldehyd und Wasserstoffperoxid gebildet

wird [Weyler et al., 1990].

Es sind die zwei Isoformen A und B der Monoaminoxidase bekannt. Sie sind nicht

ausschließlich auf endogene Amine fixiert, sondern oxidieren auch aliphatische,

aromatische, primäre, sekundäre und tertiäre exogene Amine. Die beiden Isoformen

konnten durch selektive Hemmung erkannt werden [Johnston, 1968; Knoll und

Magyar, 1972]. Die beiden Formen können immunologisch [Denney et al., 1983]

sowie durch die Sequenzierung der DNA [Bach et al., 1988] unterschieden werden.

Beide Isoformen sind in der Niere in sehr hohen Konzentrationen vorhanden, was für

den Metabolismus filtrierter Amine sehr wichtig ist [Fernandes und Soares-da-Silva,

1990].

1.2.2.1.6 Aldehyd- und Ketonreduktion

Aldehyde und Ketone sind weit verbreitet und haben verschiedene biologische

Funktionen. Neben den Aldehyddehydrogenasen finden sich mehrere Enzyme, die

unter dem Begriff Aldo-Ketoreduktasen zusammengefasst werden und am

Metabolismus von Aldehyden und Ketonen in der Niere teilhaben. Aldosereduktase,

Aldehydreduktase und Carbonylreduktase gehören zu den Aldo-Ketoreduktasen,

kommen in sehr hohen Konzentrationen in der Niere vor und reduzieren Aldehyde

und Ketone zu ihren korrespondierenden Alkoholen.

Die Aldosereduktase metabolisiert nur endogene Stoffe, so dass sie für den

Fremdstoffmetabolismus nicht von Interesse ist.

Die Aldehydreduktasen gehören zu den NADPH-abhängigen Reduktasen, welche am

Metabolismus verschiedener Carbonylfunktionen beteiligt sind [Bohren et al., 1989].

Die Enzyme reduzieren viele Xenobiotika und haben in der Niere die höchste Aktivität

[Bosron und Prairie, 1973].

Die Ketonreduktase reduziert viele aromatische, azyklische und ungesättigte Ketone

zu freien oder konjugierten Alkoholen. Die besten Substrate stellen dabei Chinone

dar [Wermuth et al., 1986].

EINFÜHRUNG

13

1.2.2.1.7 Hydrolytische Mechanismen

Carboxylesterasen und -amidasen katalysieren die Hydrolyse von Carbonsäureestern,

-amiden und -thioestern [Heymann, 1980]. Das Spektrum der zu detoxifizierenden

Substanzen reicht von Organophosphaten und Carbamaten über Herbizide (Ester von

Phenoxysäuren) bis zu den Arzneistoffen Procain, Lidocain oder Acetylsalicylsäure,

um nur einige zu nennen. Fast ausschließlich fanden bisher hierzu Untersuchungen in

der Leber statt.

Die Aktivität der Esterasen in der Niere beträgt etwa 10 % im Vergleich zur Leber

[Ecobichon, 1972]. Esterasen sind sowohl in Mikrosomen [Yan et al., 1994] als auch

in Mitochondrien [Nicot et al., 1984] gefunden worden.

1.2.2.2 Phase II

1.2.2.2.1 Glucuronidierung

Einer der Hauptwege zur Inaktivierung und Elimination von Xenobiotika, aber auch

von endogenen Stoffen, ist die Konjugation mit Uridindiphosphat-Glucuronsäure. Die

Reaktion wird durch die Uridindiphosphat-Glucuronosyltransferase katalysiert. In der

Regel entstehen dabei polare und biologisch weniger aktive Substanzen. Durch die

erhöhte Polarität wird die Exkretion in Galle und Urin erleichtert [Siest et al., 1987].

Viele funktionelle Gruppen wie Alkohole, Carbonsäuren, Thioalkohole oder Phenole

können glucuronidiert werden, auch N-Glucuronide wurden gefunden. Auch wenn die

Annahme, dass viele Phase II Metabolite schnell ausgeschieden werden, richtig ist,

stimmt sie für reaktive Acyl-Glucuronide nicht [Spahn-Langguth und Benet, 1992].

Viele nichtsteroidale, antiinflammatorische Arzneimittel der Aryl-Alkyl-Klasse sind

aufgrund von Nephritis und akutem renalen Versagen vom Markt genommen

worden. Die Bildung der Acyl-Glucuronide wird dabei als ein wesentlicher Grund für

die hohe Toxizität angesehen. Die gebildeten Acyl-Glucuronide agieren dabei als

Elektrophile und können mit Sulfhydryl- und Hydroxylgruppen anderer Zellmoleküle

interagieren [Spahn-Langguth und Benet, 1992].

Die Konzentration von Uridindiphosphat-Glucuronsäure ist in der Niere wesentlich

geringer als in der Leber [Wong, 1977; Cappiello et al., 1991]. Die renale Clearance

von Glucuroniden ist in vielen Spezies untersucht worden. Dabei wurde festgestellt,

dass die Glucuronid-Konjugate aktiv tubulär ausgeschieden werden [Quebbemann

und Rennick, 1969]. Uridindiphosphat-Glucuronosyltransferase-Aktivität konnte in

Mikrosomen gezeigt werden [Sutherland et al., 1993]. Es wurde festgestellt, dass die

EINFÜHRUNG

14

Verteilung der Isoenzyme speziesabhängig ist [Koster et al., 1986; el Mouelhi et al., 1993].

Es sind mittlerweile unzählig viele Uridindiphosphat-Glucuronosyltransferasen

entdeckt worden, so dass man sie als Superfamilie bezeichnet. Eine Einteilung wurde

von einem Nomenklatur Komitee entwickelt [Mackenzie et al., 1997].

Für eine Vielzahl von Arzneistoffen konnte die Glucuronidierung in der Niere

nachgewiesen werden. Die Glucuronidierungsraten der Substrate sind im Vergleich

zur Leber teilweise ähnlich, zum Teil aber auch sehr viel niedriger. Eine

Vergleichbarkeit ist somit kaum gegeben [Rush und Hook, 1984]. Zudem ist die

Rekonstitution der Mikrosomen anders, da zugesetzte Phospholipide

unterschiedlichen Einfluss auf die Glucuronidierung in Leber oder Niere haben

[Yokota et al., 1991].

Lokalisiert sind die Uridindiphosphat-Glucuronosyltransferasen vor allem in der

Nierenrinde [Rush und Hook, 1984] und dort im Lumen des endoplasmatischen

Retikulums [Mulder, 1992] und haben ihre höchste Aktivität in Zellen des proximalen

Tubulus [Hjelle et al., 1986]. Sie gehören zu den membrangebundenen Enzymen.

1.2.2.2.2 Sulfatierung

Xenobiotische Alkohole, Phenole, Amine und Thiole können durch Biotransformation

mit Sulfat konjugiert werden. Weiterhin spielt diese Konjugation im Metabolismus

von endogenen Komponenten wie Neurotransmittern und Steroidhormonen eine

Rolle. Das Resultat ist in der Regel eine weniger aktive, polarere Verbindung, die vor

allem renal eliminiert wird [Lohr et al., 1998].

Anorganisches Sulfat ist zu reaktionsträge und muss zunächst in Adenosin-5’-

phosphosulfat konvertiert werden, welches dann in die aktivierte Form 3’-

Phosphoadenosin-5’-phosphosulfat umgewandelt wird. Für den ersten Schritt ist die

Adenosintriphosphat-Sulfurase zuständig, für den zweiten die Adenosin-5’-

phoshosulfat-Phosphokinase. Beide Enzyme kommen cytosolisch vor. Die Aktivierung

ist in allen bisher untersuchten Säugetieren nachgewiesen worden. Wenn auch die

höchste Konzentration der Enzyme bisher in der Leber beschrieben ist [Hazelton et al., 1985], so findet man doch auch relativ hohe Konzentrationen in Nierenzellen,

wobei der Gehalt in der Nierenrinde den des Nierenmarks überwiegt [Hjelle et al., 1986].

Nach der Aktivierung überträgt dann eine Sulfotransferase das Sulfat auf das

Akzeptormolekül.

EINFÜHRUNG

15

Sulfotransferasen bilden eine Familie löslicher Enzyme mit unterschiedlicher

Substratspezifikation, wie Phenol-Sulfotransferase, Alkohol-Sulfotransferase oder

Arylsulfat-Sulfotransferase. Sie wurden schon aus verschiedenen Geweben isoliert

[Mulder und Jakoby, 1990]. Ihre Aminosäuresequenzen wurden dabei allerdings nicht

identifiziert.

Die Sulfatkonjugation wird durch die vorhandene Sulfatkonzentration, die

Verfügbarkeit von anorganischem Sulfat und die Synthese von 3’-Phosphoadenosin-

5’-phosphosulfat reguliert. Ein Studie zur Sulfat-Konjugation an 7-Hydroxycoumarin

mit isolierten Nierenzellen hat ergeben, dass anorganisches Sulfat das effektivste

Substrat zur Bildung von 3’-Phosphoadenosin-5’-phosphosulfat ist. In geringerem

Maße sind auch Cystein, N-Acetylcystein und Glutathion einsetzbar [Dawson et al., 1983].

Es lassen sich bisher nur wenige Untersuchungen zur renalen Sulfatkonjugation

finden. Die Bindung an Sulfat spielt in der Niere, und genauso auch in der Leber, im

Gegensatz zur Glucuronidierung offenbar nur eine untergeordnete Rolle.

1.2.2.2.3 Methylierung

Methylierungsreaktionen sind primär im Metabolismus kleiner endogener Stoffe wie

Dopamin, Histamin oder Epinephrin involviert; sie spielen aber auch eine Rolle bei

der Biotransformation von Aminosäuren sowie verschiedener Arzneistoffe. Im

Gegensatz zu den meisten anderen Konjugationsreaktionen entstehen bei der

Methylierung weniger polare Substanzen, welche damit meist weniger schnell aus

dem Körper ausgeschieden werden. N-, O- und S-Methyltransferasen sind in der

Niere vorhanden. Der Cofaktor S-Adenosylmethionin wird als Methyl-Donor bei den

Reaktionen benötigt und aus Adenosintriphosphat und L-Methionin gebildet. Er ist in

vielen Geweben vorhanden [Eloranta, 1977]. Die Umsetzungsrate der Niere ist etwa

ein Drittel geringer als in der Leber.

Im Arzneistoffmetabolismus der Niere spielen drei N-Methyltransferasen eine Rolle.

Die Histamin N-Methyltransferase ist ein cytoplasmatisches Enzym und benötigt

S-Adenosylmethionin als Methyl-Donor sowie Histamin bzw. Analoga, die an den

Positionen 1, 2 und 3 unsubstituiert sind, als Methyl-Akzeptor. Eine große Anzahl von

Inhibitoren, wie die H1- und H2-Rezeptor-Antagonisten, Diuretika und lokale

Anästhetika sind bekannt [Tachibana et al., 1988]. Die N-Methyltransferase-

Konzentration hat in der Niere die höchste Konzentration [Bowsher et al., 1983].

Auch in der Nierenarterie wurde eine hohe Konzentration dieses Enzyms gefunden,

EINFÜHRUNG

16

so dass schon frühzeitig daraus geschlossen wurde, dass die Niere die Exkretion von

Histamin regelt [Lindell und Schayer, 1958; Snyder und Axelrod, 1965].

Als weiteres Enzym wurde die Phenylethanolamin N-Methyltransferase gefunden. Sie

ist in den Glomeruli, in den Endothelzellen und im distalen Tubulus lokalisiert

[Kennedy et al., 1995]. Dieses Enzym arbeitet sehr spezifisch, da es als Methyl-

Akzeptoren nur Phenylethanolamine akzeptiert.

Die dritte gefundene N-Methyltransferase katalysiert den Transfer einer

Methylgruppe von S-Adenosylmethionin auf die Aminogruppe von Indolaminen

[Axelrod, 1962; Kennedy et al., 1995].

Die O-Methylierung von phenolischen Gruppen ist wichtig im Metabolismus von

Neurotransmittern. Da hauptsächlich Catecholamine die Akzeptormoleküle bilden,

wird das Enzym Catecholamin O-Methyltransferase genannt. Es gibt sie sowohl

cytosolisch als auch membrangebunden. Die Eigenschaften sind ähnlich, da beide

S-Adenosylmethionin als Methyl-Donor und zur Aktivität Magnesium-Ionen

benötigen. Die beiden Formen unterscheiden sich lediglich im N-Terminus der

Struktur [Tenhunen und Ulmanen, 1993]. Als Substrate sind bisher Catecholamine,

Aminosäuren wie L-Dopa sowie diverse Alkaloide und Steroide gefunden worden

[Thakker und Creveling, 1990]. Die Aktivität ist im Vergleich zur Leber etwas

geringer [Weinshilboum, 1978; Weinshilboum et al. 1979].

Die S-Methylierung ist für den Metabolismus vieler sulfhydrylhaltiger Arzneistoffe wie

Captopril, Azathioprin oder 6-Mercaptopurin wichtig. Für die Detoxifizierung von

giftigen Thiolen sind Thiolmethyltransferasen entscheidend. Die Thiole werden

generell als Sulfoxide oder Sulfone ausgeschieden. Ein weiterer wichtiger

Stoffwechselweg ist der Thiomethylkreislauf. Der Kreislauf startet mit der Addition

von Glutathion und anschließender Umformung zum Cystein-Konjugat. Dieses

Konjugat wird durch die Cystein-Konjugat β-Lyase zu Pyruvat, Ammoniak und Thiol

gespalten. Dieses Thiol wird dann methyliert. Die Cystein-Konjugate werden während

der Mercaptursäure-Synthese (Kap. 1.2.2.2.6) ebenfalls gebildet. Hier werden sie

aber eher N-acetyliert als methyliert [Stevens und Bakke, 1990].

Es gibt drei Enzyme mit unterschiedlichen Charakteristika, die in die S-Methylierung

involviert sind: Die mikrosomale Thiol-Methyl-Transferase, die cytosolische Thioether-

S-Methyltransferase und die lösliche Thiopurin-Methyltransferase. Alle drei Enzyme

wurden in der Niere gefunden und benötigen S-Adenosylmethionin als Cofaktor.

Für die Thioether-S-Methyltransferase wurde die Methylierung von Selen, Tellur und

Thioethern beschrieben, um sie in wasserlöslichere Ionen umzuwandeln. Hierdurch

wird die renale Exkretion möglich [Mozier und Hoffmann, 1990]. Die Aktivität liegt im

EINFÜHRUNG

17

Vergleich zur Leber bei einem Drittel [Mozier und Hoffmann, 1990; Pacifici et al., 1991].

Die Thiopurin-Methyltransferase ist ein cytoplasmatisches Enzym, welches die

S-Methylierung von aromatischen und heterocyclischen Sulfhydrylverbindungen

katalysiert. Die Aktivität ist höher als in der Leber [Remy, 1963]. Zwei Isoenzyme

dieser Transferase sind gereinigt worden [Van Loon und Weinshilboum, 1990; Van

Loon et al., 1992].

1.2.2.2.4 Acetylierung

Xenobiotika, die acetyliert werden, sind entweder Arylamine oder Hydrazide. Die

Acetylierung tritt z. B. auf bei Isoniazid, p-Aminobenzoesäure, Hydralazin,

Procainamid, Aminofluoren und Benzidin [Weber und Glowinski, 1980].

N-Acetylierung von Cystein-S-Konjugaten ist der finale Schritt in der Mercaptursäure-

Synthese. Sie wird in Kapitel 1.2.2.2.6 näher erläutert. Die Übertragung des

Acetylrestes auf die Hydroxylgruppe des Cholins und der Sulfhydrylgruppe des

Coenzym A sind Beispiele endogener Acetylierungen. Bei Xenobiotika ist die

Acetylierung der genannten Gruppen sehr selten. Die Übertragung des Acetylrestes

wird durch die N-Acetyltransferase katalysiert. Im ersten Schritt findet eine

Übertragung der Acetylgruppe von Acetyl-Coenzym A zu einem Acetyl-Enzym-

Komplex statt. Im zweiten Schritt folgt dann die Acetylierung des Arylamins unter

Regeneration des Substrates. Stoffe wie Iodacetat oder p-Chlormercuribenzoat sind

irreversible Inhibitoren, wohingegen strukturähnliche Stoffe wie das Salicylamid

reversible Inhibitoren darstellen.

Es sind zwei Isoformen der N-Acetyltransferase gefunden worden [Blum et al., 1990], die unabhängig voneinander exprimiert werden.

Vor etwa 50 Jahren wurde eine Variabilität der Acetylierung im menschlichen

Arzneistoffmetabolismus entdeckt. Die Menschen wurden fortan als Schnell- oder

Langsamacetylierer definiert. Gemessen wurde die Acetylierung im Blut nach Gabe

von Isoniazid. Es konnte gezeigt werden, dass es sich hierbei um einen genetischen

Polymorphismus handelt [Hein et al., 1987a, b]. Die N-Acetyltransferase 2 ist hierfür

verantwortlich. Doch auch die N-Acetyltransferase 1 scheint einen Polymorphismus

aufzuweisen, der aber nicht so bedeutend ist. Dieser äußert sich in der Acetylierung

von p-Aminobenzoat und p-Aminosalicylat [Vatsis und Weber, 1994].

Die Aktivität der N-Acetyltransferase in der Niere beträgt etwa ein Drittel im Vergleich

zur Leber. Hierbei konnte zwischen der Nierenrinde und dem -mark kein Unterschied

in der Aktivität der N-Acetyltransferase festgestellt werden [Pacifici et al., 1986].

EINFÜHRUNG

18

1.2.2.2.5 Glutathion-Konjugation

Glutathion wird aus den Aminosäuren Glycin, L-Cystein und L-Glutaminsäure

synthetisiert. Der Gehalt in der Niere ist niedriger als in der Leber.

Konzentrationsunterschiede können innerhalb der Niere festgestellt werden. Der

Gehalt in der Nierenrinde ist höher als der im Mark [Mohandas et al., 1984].

Gefunden wurde Glutathion im Cytosol, in den Mitochondrien sowie in den

Zellkernen.

Im Blut korreliert die vorhandene Glutathionkonzentration mit der der Leber

[Anderson und Meister, 1980]. Fast das gesamte gefilterte Glutathion wird vom

Lumen des proximalen Tubulus rückresorbiert.

Glutathion-Konjugation findet zwischen der Thiolgruppe des Glutathions und einer

elektrophilen Komponente statt. Normalerweise bedeutet dieser Prozess

Detoxifizierung und Exkretion. Er kann aber auch bei der Biosynthese endogener

Substanzen eine Rolle spielen wie zum Beispiel bei der Bildung von Leukotrien C4.

Die Übertragung von Glutathion auf die elektrophile Komponente, welche Epoxide,

Halogenalkane, Nitroalkane, Alkene und aromatische Halogen- und Nitrogruppen mit

einschließt, findet durch die Glutathion S-Transferase Familie statt. Es wurden in vivo

viele verschiedene Typen von Reaktionen mit Glutathion festgestellt, aber nicht alle

konnten bisher in der Niere nachgewiesen werden [Ketterer und Mulder, 1990].

Die Bindung zwischen einem Substrat und Glutathion findet über die freie

Thiolgruppe des Cysteins statt. Im Weiteren erfolgt dann die Metabolisierung zu

einem höher polaren und wasserlöslichen Metaboliten. Dieser hat in der Regel eine

geringere biologische Aktivität als die Ausgangsverbindung [Shaw und Blagbrough,

1989]. In Säugetieren führen die wichtigsten Konjugate zur Mercaptursäure-Bildung,

welche dann über Urin und Galle ausgeschieden werden können [Williams, 1967].

Konjugation potenziell toxischer elektrophiler Komponenten mit Glutathion ist ein

wichtiger Detoxifizierungsweg.

Da viele Glutathion S-Transferase Isoenzyme entdeckt worden sind, haben auch

verschiedene Autoren unterschiedliche Nomenklaturen verwendet. Derzeitig wird die

Nomenklatur benutzt, in welcher jede genetisch verschiedene Untereinheit ihre

eigene Bezeichnung hat [Mannervik et al., 1992]. Isoenzyme der Klassen α, μ und π

wurden im Nierengewebe gefunden [Singh et al., 1987; Beckett et al., 1990].

Zwischen den renalen und hepatischen Enzymen sind Unterschiede zu erkennen.

Glutathion S-Transferasen-Genexpression in der Leber kann durch Xenobiotika

reguliert werden. Zudem wurde eine Genüberexpression in Zellen, die resistent

gegen Zytostatika sind, gezeigt [Picket und Lu, 1989]. Eine Regulation der

Genüberexprimierung in der Niere durch Arzneistoffe wurde bisher nicht beobachtet.

EINFÜHRUNG

19

Es wurde aber auch eine Glutathion-abhängige Bioaktivierung nephrotoxischer

Halogenalkene gefunden [Dekant et al., 1988; Anders et al., 1988]. Gründe hierfür

werden zum Einen in der Aktivierung gesehen, die zu höherer molekularer Reaktivität

führen kann, zum Anderen in der Bindung des Konjugates an makromolekulare

Rezeptoren, wodurch die Toxizität ausgelöst wird. Das hierfür verantwortliche Enzym

zur Generierung reaktiver Thiole von Glutathion-Konjugaten vieler Halogenalkane soll

die renale C-S Lyase sein [Blagbrough et al., 1988].

1.2.2.2.6 Mercaptursäure-Synthese

Viele Glutathion-Konjugate unterliegen weiteren enzymatischen Veränderungen

durch Hydrolyse an der γ-Glutamylbindung. Diese Reaktion wird durch die

γ-Glutamyltransferase katalysiert. Neben der Hydrolyse kann die

γ-Glutamyltransferase auch Transpeptidation und Autotranspeptidation katalysieren.

Die γ-Glutamyltransferase ist in Tubuluszellen der Niere lokalisiert. Der Gehalt dieses

Enzyms ist in den bisher untersuchten Säugetieren in der Niere am höchsten

[Goldbarg et al., 1960; Hinchman und Ballatori, 1990].

Die Biosynthese von Mercaptursäure erfolgt im ersten Schritt durch die Konjugation

eines elektrophilen Xenobiotikums mit Glutathion. Im nächsten Schritt findet dann

am Konjugat die Hydrolyse an der γ-Glutamylbindung durch die

γ-Glutamyltransferase statt. Mercaptursäure wird schließlich nach Abspaltung von

Glycin und Addition von Acetat mittels N-Acetyltransferase gebildet. Die Mercapturate

werden dann im Urin durch Filtration und Sekretion ausgeschieden. Alle

verantwortlichen Enzyme zur Bildung der Mercapturate sind in der Niere vorhanden

[Davison et al., 1990].

1.2.2.2.7 Aminosäure-Konjugation

Aminosäure-Konjugation findet in der Regel im Menschen mit den Aminosäuren

Glycin oder seltener L-Glutamin statt [Smith und Williams, 1974]. Die Reaktion kann

mit Substraten stattfinden, die eine Carboxylgruppe tragen. Bevorzugt werden dabei

aromatische Carbonsäuren. Die Bindung findet zwischen der Aminogruppe der

Aminosäure und der Carboxylgruppe des Substrates statt.

Ein Beispiel stellt die Konjugation von Benzoesäure mit Glycin unter Bildung der

Hippursäure dar. Letztere ist polarer als die Benzoesäure, was zu einer höheren

Exkretionsrate führt. Die verantwortlichen Enzyme zur Aminosäure-Konjugation sind

Acyl-CoA Synthetase und N-Acyltransferase. Vertreten sind die Enzyme in Leber und

EINFÜHRUNG

20

Niere, wobei in manchen Spezies die Aktivität in der Niere höher ist als in der Leber

[Krishna und Klotz, 1994].

In der Niere finden die Reaktionen in den Mitochondrien der Nierenrindenzellen statt.

Die Konjugation kann durch die vorhandene Menge an Glycin oder den

entsprechenden an der Reaktion beteiligten Enzymen im Körper limitiert sein. Die

vorhandene L-Glutaminmenge scheint keinen Einfluss auf die L-Glutamin-Konjugation

zu haben. Kleine organische Verbindungen wie Benzoe- und Salicylsäure werden in

der Niere durch Konjugation mit Glycin in Hippur- und Salicylursäure umgewandelt

und ausgeschieden. Ist dieser Biosyntheseweg an seinem Limit angelangt, so werden

die Substrate glucuronidiert [Vree et al., 1992].

Glycin-Konjugation ist der Hauptmetabolismusweg für Salicylsäure. Aber schon bei

einer Verlängerung der Seitenkette um ein Kohlenstoffatom zur Phenylessigsäure

findet keine Konjugation mehr mit Glycin statt. Stattdessen findet eine Konjugation

mit L-Glutamin statt [Wan und Riegelman, 1972].

Man hat in der Vergangenheit angenommen, dass beim Erreichen der maximalen

Umsetzungsrate von Benzoesäure mit Glycin automatisch ein anderer

Konjugationsweg mit Glucuronsäure eingeschlagen wird. Später wurde festgestellt,

dass Glucuronidierung auch bei sehr niedrigen Benzoesäure-Konzentrationen

stattfindet. Die Glucuronidierung von Benzoesäure steigt proportional mit der

vorhandenen Benzoesäure-Konzentration, ist aber unabhängig von der vorhandenen

Glycin-Menge oder der Bildungsrate von Hippursäure. Somit ist die Glucuronidierung

der Benzoesäure keine Reserve, sondern ein komplett eigenständiger

Metabolismusweg [Schachter und Manis, 1958].

Salicylsäure wird auf dem gleichen Weg wie die Benzoesäure als Konjugat an Glycin

eliminiert. Die Konjugation ist in der Niere deutlich höher als in der Leber. Aber im

Gegensatz zur Benzoesäure findet eine Sättigung der Bildung von Salicylursäure nicht

durch Mangel an Glycin statt, sondern durch Sättigung der an der Reaktion

beteiligten Enzyme [Wan und Riegelman, 1972].

L-Glutamin-Konjugationen spielen im Körper nur eine untergeordnete Rolle. Sie

treten vor allem bei Arylessigsäure-Derivaten auf. Ein solches Substrat ist die

Phenylessigsäure, welche in der Niere zu Indolacetylglutamin konvertiert wird [Smith

und Williams, 1974].

EINFÜHRUNG

21

1.2.3 Lokalisation arzneistoffmetabolisierender Enzyme in der Niere

Die beschriebenen Enzyme sollen hier noch einmal zusammengefasst werden (Tab.

1.1, Abb. 1.2). Tabelle 1.1 gibt die Verteilung arzneistoffmetabolisierender Enzyme in

der Niere gemäß Abbildung 1.2A wieder. Es hat den Anschein, dass vor allem das

Rindengewebe reich an metabolisierenden Enzymen ist. Hingegen wurden bisher nur

wenige Enzyme in den unterschiedlichen Zonen des Nierenmarks gefunden.

Tab. 1.1: Verteilung arzneistoffmetabolisierender Enzyme in Nierenbereichen nach Lohr et al., 1998

Enzym Rinde Mark außen innen

N-Acetyltransferase + + ⎯ ⎯

Alkoholdehydrogenase + + ⎯ ⎯

Aldosereduktase ⎯ ⎯ + +

Aldehydreduktase + ⎯ ⎯ ⎯

Aminosäure-Konjugation + ⎯ ⎯ ⎯

Cytochrom P450 +++ ⎯ + ⎯

Carboxylesterase + ⎯ ⎯ ⎯

Glutathion S-Transferase + + ⎯ ⎯

Monoaminoxidase +++ + ⎯ ⎯

NADPH Cytochrom C Reduktase +++ ⎯ ⎯ +

Sulfotransferase + ⎯ + ⎯

Die Abbildung 1.2 zeigt die regional, tubulär und zellulär vorherrschende Verteilung

arzneistoffmetabolisierender Enzyme in der Niere. Man kann sehen, dass der

proximale Tubulus reich an metabolisierenden Enzymen ist, wenn auch in allen

Bereichen des Nephrons Enzyme gefunden wurden (Abb 1.2B). Viele dieser Enzyme

wurden entweder im Cytoplasma oder in Mikrosomen oder sogar in beiden

Kompartimenten gefunden (Abb. 1.2C). Es handelt sich aber hierbei um eine

Momentaufnahme, da die Niere noch nicht systematisch nach Enzymen untersucht

wurde.

EINFÜHRUNG

22

Abb. 1.2: Regionale (A), tubuläre (B) und subzelluäre (C) Lokalisation von arzneistoffmetabolisierenden Enzymsystemen in der Niere nach Lohr et al., 1998

1.2.4 Ergebnisse des renalen Metabolismus

Die Niere metabolisiert endogene und exogene Substanzen normalerweise zu

biologisch weniger aktiven Substanzen. Jedoch wird auch berichtet, dass in der Niere

toxische Zwischenprodukte entstehen, die zu Mutagenität oder Zellnekrose führen

[Spahn-Langguth und Benet, 1992; Anders und Dekant, 1994].

In der Vergangenheit konnte gezeigt werden, dass durch metabolische Aktivierung

positive Effekte erzielt werden können. Als Beispiel sei der Angiotensin Converting

Enzym Inhibitor Enalapril zu nennen. Sein aktiver Metabolit Enalaprilat ist eine polare

Dicarbonsäure. Der intrarenal erzeugte Metabolit wird entweder wieder in den Körper

rückresorbiert oder ins Lumen ausgeschieden [de Lannoy et al., 1990].

Die Erforschung des renalen Metabolismus von Arzneistoffen hat dazu geführt, dass

zielgenaue Systeme entwickelt worden sind, die unerwünschte Wirkungen

vermeiden. So wurde eine hohe β-Lyase Aktivität in der Niere entdeckt. Dieses

Rinde

Mark

innen außen

Distaler Tubulus Glutathion S-Transferase

N-Acetyltransferase

N-Methyltransferase

Steroid-21-Hdyroxylase

Endoplasmatisches Retikulum Carboxylesterase

Cytochrom P450

NADPH Cytochrom C

Reduktase

UDP-Glucuronyltransferase

Mitochondrien Aldehyd-

dehydrogenase

N-Acetyltransferase

Carboxylesterase

Cystein-Konjugat

β-Lyase

Monoaminoxidase

Cytoplasma Aldehyd-

dehydrogenase

Cystein-Konjugat

β-Lyase

Epoxidhydrolase

Ketonreduktase

N-Acetyltransferase

N-Methyltransferase

Sulfotransferase

Proximaler Tubuls Alkohol-

dehydrogenase

Aldehydreduktase

Carboxylesterase

Cytochrom P450

Glutathion S-

Transferase

Ketonreduktase

N-Acetyltransferase

NADPH Cytochrom C

Reduktase

Sulfotransferase

UDP-Glucuronyl-

transferase

Henle’sche Schleife Aldose-

reduktase

Sammelrohr Aldosereduktase

Epoxidhydrolase

Steroid-21-Hydroxylase

Mikrosomen Cystein-Konjugat

β-Lyase

Cytochrom P450

Epoxidhydrolase

Ketonreduktase

Sulfotransferase

EINFÜHRUNG

23

Enzym ist in der Lage, S-(6-Purinyl)-L-cystein in das antitumorale und

immunsuppressive Medikament 6-Mercaptopurin zu verwandeln. Hiermit wird eine

gewünschte Akkumulation erreicht, die zu einer hohen Konzentration direkt am

anzugreifenden Target in der Niere führt. Gleichzeitig wird hiermit die systemische

Toxizität deutlich verringert [Elfarra und Hwang, 1993].

Der Metabolismus von Arzneistoffen und endogenen Substanzen kann zu

Veränderungen führen, die entweder zur Ausscheidung oder zur Resorption führen,

je nachdem, welcher Weg eingeschlagen wird. Aminosäure-Konjugation führt zum

Verlust pharmakologischer Aktivität, und der gebildete Metabolit wird tubulär im Urin

ausgeschieden [Gregus et al., 1993]. Ähnliches wurde beim Arzneistoff Meperidin

festgestellt, dessen N-Oxid zu einer schnelleren Ausscheidung führt [Acara et al., 1981]. Die Aktivität der metabolisierenden Enzyme ist ebenso von Bedeutung. Cholin

wird zu Betain metabolisiert, welches resorbiert wird. Sollte aber das Cholin-Oxidase

Enzym gesättigt sein, so wird Cholin direkt renal ausgeschieden [Acara et al., 1979].

Der am häufigsten genutzte Weg zur erhöhten Ausscheidung einer Substanz erfolgt

durch eine Bindung an Ausscheidungstransporter und/oder über eine erhöhte

Wasserlöslichkeit. Viele Prozesse sind hieran beteiligt [Ullrich et al., 1990]. Die

Hydroxylierung des Benzolrings führt neben einer zusätzlichen elektronenziehenden

Gruppe im Molekül zu einer deutlich besseren Akzeptanz für den

p-Aminohippursäure-Rezeptor. Darüber hinaus wird durch Glucuronidierung die

Wasserlöslichkeit weiter erhöht. Veresterung einer freien Säure führt wiederum zu

einer Erniedrigung der Akzeptanz am genannten Rezeptor. Hingegen werden

Aminosäuren und Oligopeptide wie Glutathion Substrate für den organischen

Kationentransporter, wenn sie verestert sind. Glycin-Konjugation führt bei

Salicylsäure zu einer erhöhten Affinität zum p-Aminohippursäure-Rezeptor [Ullrich et al., 1987].

Insgesamt gesehen ist die Leber der Hauptmetabolismusort. Jedoch kann durch die

dargestellten Angaben die Niere ebenfalls als ein aktives Organ bei dem

Metabolismus von Arzneistoffen angesehen werden. In manchen Fällen kann in der

Niere eine höhere Aktivität gezeigt werden als in der Leber nachgewiesen wurde. In

der Regel wird ein Produkt gebildet, welches leichter über den Urin ausgeschieden

werden kann. In manchen Fällen aber wird der Metabolit resorbiert und kann dabei

aktiver oder toxischer sein als die Ausgangsverbindung.

EINFÜHRUNG

24

1.3 Prodrugprinzip N-hydroxylierter basischer Verbindungen

Stark basische Verbindungen mit Amidin- und Guanidinstruktur liegen unter

physiologischen Bedingungen überwiegend protoniert vor. Das macht sie zu sehr

schlecht resorbierbaren Substanzen im Gastrointestinaltrakt. Die Herabsetzung dieser

starken Basizität ist durch die N-Hydroxylierung des Amidins oder Guanidins möglich,

woraus eine Erniedrigung des pks-Wertes um ca. 6 Einheiten resultiert [Albert et al., 1948]. Hierdurch wird die orale Gabe einer stark basischen Verbindung möglich, da

sie nun als freie Base vorliegt [Clement, 1998; Ettmayer et al., 2004].

Durch eine solche Veränderung am Arzneistoff wird dieser aber unter

physiologischen Bedingungen inaktiv. Man benutzt eine Vorstufe des Arzneistoffes,

ein so genanntes Prodrug. Durch Biotransformation kann dieser Stoff im Körper

wieder aktiviert werden, indem die Hydroxylgruppe reduktiv abgespalten wird. Es

findet eine Bioaktivierung statt und aus dem Prodrug wird das Drug (Arzneistoff)

gebildet. Dieses Prodrug-Konzept trägt zur Verbesserung der oralen Bioverfügbarkeit

bei [Ettmayer et al., 2004] (Abb. 1.3).

RN

NH2

OHR

NH

NH2

RNH2

N+

HH

RN

+

NH2

HH

H+

H+

N-Reduktion

N-Hydroxylierung -

+

Prodrug Drug (Amidoxim) (Amidin)

Abb. 1.3: Prodrug-Prinzip am Beispiel eines Amidoxims

EINFÜHRUNG

25

Amidin- und Guanidinstrukturen sind in vielen Wirkstoffklassen vertreten. Die unter

physiologischen Bedingungen protonierten Kationen gehen häufig Interaktionen mit

deprotonierten Carboxylfunktionen der Targetmoleküle ein. Außerdem ähnelt die

Amidinfunktion einer Teilstruktur des Arginins. Dieses macht sie zu einer bevorzugten

Struktur in peptidomimetischen Hemmstoffen. Daneben treten Amidin-Funktionen in

Arzneistoffen gegen Pneumocystis Pneumonie [Clement, 2002], Trypanosomiasis und

Leishmaniose sowie in Antikoagulantien [Peterlin-Masic et al., 2006] auf.

OO

NH2

NOH

NOH

NH2

O

N

NH2NH2

NO OCH3 CH3

N

NH2NH2

N

O O

O

O CH3

O

OCH3

Pentamidin-Prodrug (N,N'-Dihydroxypentamidin)

Pentamidin-Prodrug (1,5-Bis(4'-acetoamidinophenoxy)pentan)

Furamidin-Prodrug (DB289)

Abb. 1.4: Anitparasitär wirksame Prodrugs

EINFÜHRUNG

26

Ein Patent dieses Prodrug-Konzeptes wurde von Clement [Patent, 1993] für

Pentamidin (Abb. 1.4) entwickelt. Pentamidin wird bei trypanoziden und

leishmaniziden Krankheiten eingesetzt. Durch eine N-Hydroxylierung wird es zum

korrespondierenden Amidoxim-Prodrug umgewandelt.

Neben dem dihydroxylierten Prodrug des Pentamidins (N,N'-Dihydroxypentamidin)

wurde zur weiteren Lipophilierhöhung auch das diacetylierte Prodrug

(1,5-Bis(4’-acetoamidinophenoxy)pentan) (Abb. 1.4) entwickelt, welches die gleiche

Indikation besitzt. Hierzu zählt ebenso das Furamidin-Prodrug DB289 [Saulter et al.,

2005] (Abb. 1.4), bei dem die OH-Gruppe methyliert worden ist.

In der Gruppe der Antikoagulantien sind unter den Glycoprotein IIb/IIIa Rezeptor-

Antagonisten Sibrafiban (Hoffmann-La Roche) [Wittke et al., 1999] (Abb. 1.5) sowie

unter den indirekten Thrombininhibitoren Ximelagatran (Exanta®, AstraZeneca)

[Gustafsson et al., 2001] (Abb. 1.5) besonders hervorzuheben. Hierbei sind nicht nur

die Amidinfunktion durch Hydroxylierung sondern auch die Carbonsäuren verestert

worden, so dass bifunktionelle Prodrugs vorliegen (Abb. 1.5).

NNH

O

O

O

O

O

N

NH2

OH

NH

N NH

O

N

NH2

OH

O

O

O

Sibrafiban

Ximelagatran (Exanta®)

Abb. 1.5: Antikoagulativ wirksame Prodrugs

Als blutdrucksenkenden Arzneistoff mit N-hydroxyliertem Strukturmerkmal fand

Guanoxabenz (ehemals Benzérial®, Frankreich) Anwendung (Abb. 1.6).

EINFÜHRUNG

27

NNH

NH2

Cl

ClNOH

Guanoxabenz (Benzérial®)

Abb. 1.6: Antihypertensiv wirksames Prodrug

Die Breite möglicher Ansätze für Prodrugs ist riesig und erstreckt sich über weit mehr

als N-hydroxylierte oder veresterte Verbindungen. In der praktischen Anwendung

befinden sich u. a. folgende Blockbuster: Simvastatin, Omeprazol, Aciclovir,

Lovastatin und Enalapril [Ettmayer et al., 2004] (Abb. 1.7).

Die weitere Entwicklung von Sibrafiban wurde aufgrund mangelnder Wirksamkeit der

Glykoprotein IIb/IIIa Rezeptorantagonisten gestoppt [Second Symphony

Investigators, 2001].

Exanta® (Ximelagatran) wurde im Februar 2006 inklusive seines wirksamen

Metaboliten Melagatran weltweit vom Markt genommen [BfArm, Pressemitteilung

vom 14.02.2006]. Grund hierfür war eine bei etwa 7 % der Patienten auftretende

Transaminase-Erhöhung [Mitteilung AstraZeneca]. Diese unerwünschte Wirkung

konnte allerdings bisher nicht mit dem Prodrug-Prinzip in Verbindung gebracht

werden. Die Entwicklung vieler anderer Amidoximprodrugs [Peterlin-Masic et al., 2006] wird somit fortgesetzt.

EINFÜHRUNG

28

OO

H

HH

H

H

OOH

HO

H

NHN

O

S

N

O

O

NH

N

NN

O NH2

O

OH

O

HO

O

OOH

HNH

N

OO

HH

O O

H

Simvastatin Omeprazol Aciclovir

Lovastatin Enalapril

Abb. 1.7: Blockbuster Prodrugs [Ettmayer et al., 2004]

EINFÜHRUNG

29

1.4 Reduktion N-hydroxylierter basischer Verbindungen

Die Pharmakokinetik ist der Zweig der Pharmakologie, der sich mit den zeitlichen

Änderungen der Pharmakon-Konzentration in den verschiedenen Kompartimenten

des Organismus befasst [Kuschinsky et al., 1993].

Ein Arzneimittel wird nach den heute gültigen Standards beurteilt. Diese beinhalten

u. a. die Pharmakokinetik, Interaktionen mit anderen Arzneistoffen sowie das Wissen

über genetische Variabilitäten bei Bioaktivierung bzw. Biotransformation.

Dieses Wissen bedingt die Kenntnis der enzymatischen Grundlagen. Die Reduktion

N-hydroxylierter Verbindungen stellt in der Regel eine Entgiftungsreaktion für den

Körper dar. Einigen N-hydroxylierten Substanzen wird ein genotoxisches Potential

zugesprochen, während die reduzierten Metabolite davon nicht betroffen sind

[Clement et al., 1988a; 1996].

Wird im Speziellen die Bioaktivierung N-hydroxylierter Prodrugs betrachtet, so sind

Kenntnisse über die enzymatischen Grundlagen der Reduktion zur Aktivierung des

Pharmakons entscheidend. Im Folgenden werden die bisherigen enzymatischen

Untersuchungen und Erkenntnisse zur Reduktion N-hydroxylierter Verbindungen

stark basischer funktioneller Gruppen dargestellt.

Die Reduktion von Hydroxylamin und seinen N-methylierten Derivaten mit

Mitochondrien wurde 1968 erstmals beschrieben [Bernheim und Hochstein, 1968].

Das reduktive System wurde als mitochondriale Hydroxylaminreduktase bezeichnet

und konnte als ein membranständiges Enzymsystem identifiziert werden (Abb. 1.8).

Die Ergebnisse dieser Untersuchungen waren eine Cosubstratabhängigkeit, wobei

NADH NADPH überlegen war, Sauerstoffinsensitivität und ein neutrales pH-Optimum

[Bernheim und Hochstein, 1968; Bernheim, 1969]. Neben den Hydroxylaminen

konnte auch bei aromatischen Hydroxamsäuren eine mitochondriale Reduktion

festgestellt werden [Bernheim, 1969; 1972]. Es wurde eine Vielzahl von

Hemmstoffen getestet. Während Hemmstoffe der Atmungskette wie Amytal und

Antimycin sowie Kohlenmonoxid keinen Einfluss auf die N-reduktive Aktivität

aufwiesen, zeigte sich mit Quecksilberverbindungen, Phosphat, Cyanid, und Arsenat

eine deutliche Hemmung der Reduktion [Bernheim und Hochstein 1968; Bernheim

1969].

EINFÜHRUNG

30

N OHH

HN H

H

H

Mitochondrien

NADH/NADPH

Abb. 1.8: Reduktion von Hydroxylamin [Bernheim, 1969]

Etwa zur gleichen Zeit konnte aus Schweinelebermikrosomen eine NADH-

Hydroxylaminreduktase isoliert werden [Kadlubar et al., 1973]. Sie wies

Gemeinsamkeiten mit dem mitochondrialen System auf. Sauerstoff und

Kohlenmonoxid zeigten keine Hemmung des reduktiven Systems. Im Unterschied

zum mitochondrialen System fand die Reaktion im leicht sauren pH-Bereich ihr

Optimum und war unempfindlich gegenüber Cyanid. Durch Enzymreinigung konnten

Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5 Reduktase als verantwortliche Enzyme für

diese Reduktion ermittelt werden. Außerdem wurde noch eine weitere Komponente

gefunden, welche in der Kombination mit den anderen Enzymen für die Reduktion

des Hydroxylamins verantwortlich war [Kadlubar und Ziegler, 1974]. Die dritte

Komponente konnte allerdings nicht identifiziert werden (Abb. 1.9). Bei der

Isolierung der Enzyme wurde ein physiologisches Verhältnis von acht Mol

Cytochrom b5 und einem Mol NADH Cytochrom b5 Reduktase gefunden. Eine

Optimierung der Komponenten zur Reduktion im in vitro Ansatz wurde ebenfalls

durchgeführt. Hierbei ergab sich ein Verhältnis, welches aus neun Mol Cytochrom b5

und einem Mol NADH Cytochrom b5 Reduktase bestand [Kadlubar und Ziegler, 1974].

N OHH

HN H

H

H

Cytochrom b5

NADH Cytochrom b5 Reduktasedritte Komponente

NADH

Abb. 1.9: Reduktion von Hydroxylamin [Kadlubar et al., 1973]

Zunächst wurde die Reduktion von Hydroxylaminen untersucht [Clement et al., 1997;

Clement et al., 2000; Clement et al., 2005a]. Neben der mikrosomalen

Hydroxylaminreduktase konnte auch an N-hydroxylierten Amidinen [Clement et al., 1988b; Hauptmann et al., 1988; Clement et al., 1993b; Clement und Jung, 1994],

Guanidinen [Clement et al., 1993a], Amidinohydrazonen [Clement et al., 1996;

Clement und Demesmaeker, 1997, Clement et al., 2005b] und Oximen [Heberling et al., 2006] eine mikrosomale Reduktion gezeigt werden (Abb. 1.10). Bei der

EINFÜHRUNG

31

Isolierung des verantwortlichen Enzymsystems wurde ein der Hydroxylaminreduktase

ähnliches System mit vergleichbaren Charakteristika gefunden. Dieses besteht aus

Cytochrom b5, NADH Cytochrom b5 Reduktase und einer dritten Proteinfraktion.

Diese dritte Fraktion wurde als Cytochrom P450 Enzym der Familie 2D identifiziert

[Clement et al., 1997].

NN NH2

Cl

ClNH

N

Cl

Cl

N NH2

NOH

NH

NH2

N OH

NH2

a,bmembranständig*: Cytochrom b5 NADH Cytochrom b5 Reduktase dritte Komponente

clöslich*: Cytochrom b5 NADH Cytochrom b5 Reduktase

dCytosol#: Aldehydoxidase

*NAD(P)H

a,bmembranständig*: Cytochrom b5 NADH Cytochrom b5 Reduktase dritte Komponente

clöslich*: Cytochrom b5 NADH Cytochrom b5 Reduktase

dCytosol#: Xanthinoxidase

Reduktion von Benzamidoxim

Reduktion von Guanoxabenz

*NAD(P)H

#2-Hydroxypyrimidin

#Xanthin

[aDeters, 2002; bClement et al., 1997; cKurian et al.; 2004; dTatsumi und Ishigai, 1987]

[aDeters, 2002; bClement et al., 1997; cKurian et al.; 2004; dTatsumi und Ishigai, 1987]

Abb. 1.10: Reduktionsbeispiele N-hydroxylierter Verbindungen

In den beschriebenen Untersuchungen wurde membrangebundene Enzyme

gearbeitet. Die rekombinant gewonnenen löslichen Enzyme Cytochrom b5 und NADH

Cytochrom b5 Reduktase reduzieren auch ohne Zugabe einer weiteren Komponente

Hydroxylamine sowie Amidoxime [Kurian et al., 2004; Saulter et al., 2005]. Das

optimale Verhältnis der eingesetzten Enzyme im in vitro Ansatz wurde mit acht zu

eins bis zehn zu eins zu Gunsten des Cytochrom b5 beschrieben [Kurian et al., 2004]

(Abb. 1.10).

Membrangebundene Enzyme zeigen keine [Kadlubar und Ziegler, 1974] oder nur

eine geringe Reduktionsrate [Clement et al., 1997]. Erst die Zugabe der dritten

EINFÜHRUNG

32

Komponente führt zu einem deutlichen Anstieg der Reduktionsrate [Kadlubar und

Ziegler, 1974; Clement et al., 1997; Clement et al., 2005a] (Abb. 1.10).

Neben der mikrosomalen Reduktion konnte auch eine mitochondriale Präparation die

Reduktion von Benzamidoxim und N-Hydroxymelagatran katalysieren [Clement et al., 2005b; Andersson et al., 2005]. Die Umsetzungsraten in Mitochondrien sind in der

Regel höher als in Mikrosomen [Deters, 2002]. Außerdem wurde in vielen

unterschiedlichen Geweben eine Reduktion N-hydroxylierter Verbindungen

nachgewiesen. Die Niere zeigte in diesen Untersuchungen stets die höchsten

Umsetzungsraten [Mau, 2002].

Weiterhin konnte die cytosolische Reduktion N-hydroxylierter Verbindungen gezeigt

werden. Die verantwortlichen Enzyme sind Aldehyd- sowie Xanthinoxidase (Abb.

1.10). Beide Oxidasen gehören den molybdäncofaktorabhängigen Enzymen an. Die

Reduktionen finden nur anaerob statt [Tatsumi und Ishigai, 1987; Clement und

Kunze, 1992; Dambrova et al., 1998].

Die Reduktion von Sulfamethoxazolhydroxylamin wurde in verschiedenen Systemen

beschrieben. Es wurden Lebermikrosomen von Ratten, die unbehandelt oder mit

Induktoren vorbehandelt worden waren, für die Reduktion verwendet. Hierbei

wurden nach Induktion höhere Reduktionsraten beobachtet. Als Induktionsmittel

wurden Dexamethason und Phenobarbital verwendet. Diese induzieren vor allem

Cytochrom P450 Isoenzyme der Familien CYP2B und CYP3A. Es wurde damit auf die

Beteiligung von Cytochrom P450 Isoenzymen an der Reduktion geschlossen (Abb.

1.11). Die Reduktion fand bevorzugt unter anaeroben Bedingungen statt [Cribb et al., 1995]. Später konnte die Reduktion durch das Dreikomponentensystem bestätigt

werden [Clement et al., 2005a] (Abb 1.11). Die gleiche Reduktion konnte mit den

löslichen Enzymen Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5 Reduktase durchgeführt

werden [Kurian et al., 2004] (Abb 1.11).

NH

OHSO

O

ON

NH2SOO

ON

amembranständig: Cytochrom b5 NADH Cytochrom b5 Reduktase dritte Komponente

blöslich: Cytochrom b5 NADH Cytochrom b5 Reduktase

cCytochrom P450

NAD(P)H

[aClement et al., 2005a; bKurian et al., 2004; cDambrova et al., 1998]

Abb. 1.11: Reduktion von Sulfamethoxazolhydroxylamin

EINFÜHRUNG

33

1.5 Thema und Zielsetzung der Arbeit

Der Metabolismus N-hydroxylierter Verbindungen wurde in der Vergangenheit

ausführlich untersucht. Es wurden in vivo und in vitro Studien mit Geweben aus

Kaninchen, Ratte, Schwein und Mensch durchgeführt. In den unterschiedlichen

Organen Leber, Niere, Darm und Gehirn konnte dabei die Reduktion N-hydroxylierter

Verbindungen gezeigt werden [Hauptmann et al., 1988; Clement et al., 1988a;

Clement et al., 2000; Clement 2002; Clement et al., 2005b; Heberling et al., 2006].

Innerhalb der Organe konnte die Reduktion von Hydroxylamin in Mikrosomen und

Mitochondrien festgestellt werden [Bernheim und Hochstein, 1968; Kadlubar et al., 1973]. Im Laufe der Zeit wurde das Spektrum der enzymatisch reduzierbaren,

N-hydroxylierten Verbindungen immer größer. Durch Teilreinigung und

Rekonstitution von Proteinfraktionen konnte die Beteiligung der zwei

Elektronentransportproteine Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5 Reduktase an

der N-Reduktivität bewiesen werden. In den Untersuchungen wurde mit

membranständigen Enzymen gearbeitet. Durch weitere Teilreinigung konnte in

Lebermikrosomen eine zusätzliche Proteinfraktion gewonnen werden, die zu einer

verstärkten Aktivität im N-hydroxylierenden System führte. In Sequenzanalysen

dieser Fraktion wurde ein Cytochrom P450 Isoenzym gefunden [Lomb, 1995].

Daneben wurde in Lebermitochondrien ebenfalls eine Proteinfraktion gefunden, die

zu einer Verstärkung der N-reduktiven Aktivität des Zweikomponentensystems

bestehend aus Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5 Reduktase führte. Die

Sequenzanalyse dieser Fraktion ergab den C-Terminus der

molybdäncofaktorabhängigen Sulfurase [Havemeyer, 2006]. Mit den löslichen

Enzymen Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5 Reduktase konnte die

N-Reduktivität auch allein dargestellt werden [Kurian et al., 2004; Saulter et al., 2005]. In weiteren Arbeiten wurde die Beteilung einer dritten Komponente bestätigt

[Andersson et al., 2005]. Hier wird allerdings die Beteiligung eines Cytochrom P450

Isoenzyms ausgeschlossen. Es wurden cytosolisch vermittelte N-reduktive Aktivitäten

gefunden, die nicht auf das Elektronentransportproteinsystem Cytochrom b5 und

NADH Cytochrom b5 Reduktase zurückgeführt werden konnten. Auch die Ergebnisse

von Cribb et al. [1995] führen zu der Annahme, dass es mehrere Enzymsysteme

innerhalb einer Zelle geben muss, die für die Reduktion N-hydroxylierter

Verbindungen verantwortlich sind.

Die bisherigen Ergebnisse leiten zu der Fragestellung, welche Enzymsysteme in der

Niere für die Reduktion N-hydroxylierter Verbindungen verantwortlich sind. In der

EINFÜHRUNG

34

vorliegenden Arbeit waren die enzymatischen Grundlagen in der Niere anhand des

Modellsubstrates Benzamidoxim aufzuklären.

Die Untersuchungen sollten sich auf Mikrosomen und Mitochondrien aus

Schweinenieren konzentrieren. Hierzu war die Gewinnung der jeweiligen

Präparationen und ihre Charakterisierung notwenig. Eine Beteiligung der

Elektronentransportproteine Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5 Reduktase war

sowohl in den Nierenmikrosomen als auch in den Nierenmitochondrien zu klären, um

die bisherigen Untersuchungen zu bekräftigen [Lomb, 1995; Mau, 2002; Deters,

2002].

Im Fall der Nierenmikrosomen sollte gezielt nach Cytochrom P450 Isoenzymen

gesucht werden, da in Lebermikrosomen bisher nur Cytochrom P450 Isoenzyme als

verantwortliche dritte Komponente für das Reduktionssystem N-hydroxylierter

Verbindungen gefunden wurden.

Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Gewinnung der äußeren mitochondrialen

Membran inklusive ihrer Charakterisierung. Dieses sollte die Ergebnisse aus den

Untersuchungen der Lebermitochondrien bestätigen [Deters, 2002; Havemeyer,

2006]. Der weitere Schritt bestand darin, die äußere Membran zu solubilisieren und

chromatographisch aufzutrennen, um die an der Reaktion beteiligten Enzyme

identifizieren zu können.

Aufgrund des Ergebnisses, dass die löslichen Elektronentransportproteine

Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5 Reduktase allein die Reduktion

N-hydroxylierter Verbindungen katalysieren können [Kurian et al., 2004; Saulter et al., 2005], sollten in dieser Arbeit die membrangebundenen Enzyme für die

Modellsubstanz Benzamidoxim weiter charakterisiert werden. Diese Untersuchungen

waren ebenfalls für das Dreikomponentensystem bestehend aus Cytochrom b5,

NADH Cytochrom b5 Reduktase und gereinigten Enzymen aus Schweinenieren-

mitochondrien durchzuführen.

GEWINNUNG UND BEARBEITUNG VON SCHWEINENIERENMIKROSOMEN

35

2 GEWINNUNG UND BEARBEITUNG VON

SCHWEINENIERENMIKROSOMEN

2.1 Einleitung

2.1.1 Das Cytochrom P450-Enzymsystem

2.1.1.1 Grundlagen und Vorkommen

Das Cytochrom P450-Enzymsystem ist ein Multienzymsystem. Es umfasst eine breit

gefächerte Superfamilie hämhaltiger Proteine. Es gehört zu den am meisten

untersuchten Enzymsystemen überhaupt [Ruckpaul, 1993].

Bei Säugetieren gibt es in den meisten Organen und Geweben P450 Enzyme, wobei

die Enzyme entweder als lösliche Enzyme im Cytosol niederer Organismen

vorkommen [Testa, 1995] oder als membrangebundene Enzyme sowohl im

Endoplasmatischen Retikulum als auch in Mitochondrien vorliegen [Testa, 1995]. Die

einzelnen Isoenzyme wurden nach ihren Aminosäuresequenzen in verschiedene

Klassen eingeteilt. Hierauf beruht die heutige Nomenklatur. Bei mindestens 40 %iger

Homologie der Aminosäuresequenz findet eine Einteilung in Familien statt, die mit

einer arabischen Ziffer gekennzeichnet sind. Subfamilien werden bei mindestens

59 %iger Homologie mit einem Großbuchstaben charakterisiert. Die einzelnen

Isoenzyme werden durch nachstehende arabische Ziffern gekennzeichnet, z. B.

CYP2A6 [Nelson et al., 1996].

Sie bestehen aus einem Häm als prosthetische Gruppe und einem Apoprotein. Bei

dem Hämrest handelt es sich um ein Porphyrin-Ringsystem (Eisen-Protoporphyrin IX)

mit Eisen als Zentralatom, welches in verschiedene Oxidationsstufen übergehen

kann. Das Häm ist über hydrophobe Wechselwirkungen und eine koordinative

Bindung mit einer Cysteinseitenkette an das Apoprotein gebunden [Porter und Coon,

1991; Testa 1995]. Der Schwefelligand an der 5. Koordinationsstelle des Eisens ist

für die katalytischen und spektralphotometrischen Eigenschaften von entscheidender

Bedeutung [Rein et al., 1984]. Die Namensgebung dieser Enzymfamilie beruht auf

dem Absorptionsmaximum des reduzierten Cytochrom P450-Kohlenmonoxid-

Komplexes bei 450 nm.

Wahrscheinlich ist das Hämeisen im dreiwertigen Zustand an der

6. Koordinationsstelle durch Wasser belegt, welches im zweiwertigen Zustand durch

ein Sauerstoffmolekül ersetzt werden kann [Porter und Coon, 1991]. Außerdem


36

P450

P450

P450

können an die 6. Koordinationsstelle des Eisens Kohlenmonoxid, Cyanid, N-, S- und

O-haltige Verbindungen koordinieren.

Cytochrom P450 Enzyme verhalten sich wie Monooxygenasen. Sie fügen einzelne

Sauerstoffatome in verschiedene Substrate ein, während sie das andere

Sauerstoffatom aus dem molekularen Sauerstoff zu Wasser reduzieren. [Oritz de

Montellano, 1986]. Guengerich [1991] konnte zeigen, dass das Enzymsystem unter

bestimmten Voraussetzungen auch Oxidase- und Peroxidaseaktivität zeigt (Abb. 2.1).

(1) R-H + NADPH + H+ + O2 R-OH + H2O + NADP+

(2) NADPH + H+ + O2 NADP+ + H2O2 (via O2-)

(3) R-H + XOOH R-OH + XOH

Abb. 2.1: Cytochrom P450-katalysierte Reaktionen [Guengerich, 1991]. Cytochrom P450 Enzyme können als (1) Monooxygenasen, (2) Oxidasen sowie (3) Peroxidasen fungieren.

Die herausragende Aufgabe der Cytochrom P450 Enzyme sind die Monooxygenase-

Eigenschaften. Dabei werden nicht nur Fremdstoffe metabolisiert, sondern auch

körpereigene Stoffe wie Steroide, Prostaglandine, Eicosanoide, fettlösliche Vitamine

und Fettsäuren [Goeptar et al., 1995].

An das Endoplasmatische Retikulum gebundene Isoenzyme können in zwei Klassen

unterteilt werden. Die eine Klasse ist am Steroidhormon- und Cholesterinstoffwechsel

beteiligt, die andere Klasse am Fremdstoffmetabolismus. Hierbei sind

Überschneidungen möglich. Neben diesen Isoenzymen katalysieren die

mitochondrialen Enzyme Reaktionen in der Steroidhormon- und Gallensäure-

Biosynthese [Wikvall, 2001].

Cytochrom P450 Enzyme akzeptieren in einem Reaktionsschritt nur ein Elektron. Die

zugehörigen Reduktionsäquivalente NADPH und NADH stellen aber zwei Elektronen

zur Verfügung. Aus diesem Grund wird ein weiteres Enzym für die Reaktion benötigt,

welches die Elektronen aufnimmt und nacheinander über Semichinonintermediate an

seine prosthetischen Gruppen (FAD und FMN) abgibt. Hierbei handelt es sich

normalerweise um die NADPH Cytochrom P450 Reduktase [Testa, 1995]. Bei

Bereitstellung der Elektronen durch NADH ist die Übertragung beider Elektronen oder

des zweiten Elektrons durch die NADH Cytochrom b5 Reduktase und das

Cytochrom b5 möglich [Hildebrandt und Estabrook, 1971]. Mitochondriales


37

Cytochrom P450 überträgt Elektronen mit Hilfe des Flavoproteins Ferredoxin-

Reduktase und des Eisen-Schwefel-Proteins Ferredoxin. Die Elektronenübergänge

sind in Abb. 2.2 veranschaulicht.

P450- NADPH + H+ Reduktase Cytochrom R-H + O2 (ox) P450 (red) (1) P450- NADP+ Reduktase Cytochrom R-OH + H2O (red) P450 (ox) Ferredoxin NADPH + H+ Reduktase Ferredoxin Cytochrom R-OH + H2O (ox) (red) P450 (ox) (2)

Ferredoxin NADP+ Reduktase Ferredoxin Cytochrom R-H + O2 (red) (ox) P450 (red)

Abb. 2.2: Mechanismen von mikrosomalen (1) und mitochondrialen (2) Cytochrom P450-abhängigen Hydroxylierungen [Wikvall, 2001].

Im Allgemeinen besitzen Cytochrom P450 Isoenzyme keine hohe Substratspezifität.

Dieses ist in den metabolisierenden Organen, vor allem Leber und Niere, von großem

Vorteil. Dadurch werden Xenobiotika verstoffwechselt, ohne dass das Organ jemals

Kontakt zu diesen hatte [Bonse und Metzler, 1978]. Allerdings gibt es eine

Gewichtung der Beteiligung der einzelnen Isoenzyme am Fremdstoffmetabolismus.

Zu den wichtigsten Cytochrom P450 Isoenzymen zählen u. a. CYP1A2, CYP2C9,

CYP2C19, CYP2D6 und CYP3A4 [Guengerich, 2001]. Die einzelnen Isoenzyme

unterscheiden sich hauptsächlich in ihrer Aminosäuresequenz. Zudem werden

einzelne Isoenzyme durch so genannte Markeraktivitäten unterschieden. Es lassen

sich anhand von Korrelationsanalysen mit typisierten Mikrosomen Beteiligungen

bestimmter P450 Isoenzyme am Arzneistoffmetabolismus nachweisen.

Cytochrom P450 Enzyme können in ihrer Funktionalität und/oder Expression sehr

stark variieren. Die Expression wird durch Enzyminduktion oder Enzyminhibition

beeinflusst. Eine Enzyminduktion liegt vor, wenn Xenobiotika die Bildung

metabolisierender Enzyme erhöhen. Daraus resultiert eine Erhöhung der absoluten

Aktivität und damit der Biotransformationsrate. Für alle Substanzen, die durch das

induzierte Enzym metabolisiert werden, verkürzt sich dadurch die

Plasmahalbwertszeit und die Wirkdauer. Im Gegensatz dazu werden


38

Biotransformationen durch Enzyminhibition vermindert. Arzneistoffe unterliegen dann

Wirkungsverlängerungen einhergehend mit einer Wirkungssteigerung.

Für einige Isoenzyme (z. B. CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6) sind Polymorphismen

bekannt. Ein oder mehrere Isoenzyme können interindividuell sehr stark variieren,

was zu einer verstärkten Expression oder zu einem völligen Fehlen des Isoenzyms

führen kann. Fehlt einem Menschen ein solches Isoenzym, so ist dieser nicht oder

nur deutlich langsamer dazu in der Lage, Substrate zu verstoffwechseln (poor

metabolizer). Liegt bei einem Menschen hingegen eine extrem hohe Aktivität eines

Isoenzyms vor, so werden Substrate sehr schnell metabolisiert (ultra-rapid

metabolizer) [Ingelmann-Sundberg et al., 1999].

2.1.1.2 Der katalytische Zyklus

Der Mechanismus einer durch das Cytochrom P450 Enzymsystem katalysierten

oxidativen Substratumwandlung ist in Abbildung 2.3 wiedergegeben. Das

umzuwandelnde Substrat (RH) muss zunächst an einer Substratbindungsstelle in der

Nähe des aktiven Zentrums an das Apoprotein gebunden werden (1). Wasser wird

von der 6. Koordinationsstelle verdrängt, woraufhin das Fe(III) des Häms vom low spin in den high spin Zustand wechselt. Das Redoxpotential erhöht sich und ein

Substrat lässt sich dadurch schneller reduzieren. In einer Elektronentransferkette

wird ein Elektron von NADPH (bzw. NADH) unter Beteiligung der NADPH Cytochrom

P450 Reduktase auf das Eisen übertragen, wodurch das Eisen in den zweiwertigen

Zustand übergeht (2). Molekularer Sauerstoff wird angelagert (3), welcher in der

Lage ist, ein Elektron vom Eisen zu übernehmen (4). Eisen wird dadurch wieder in

seinen dreiwertigen Zustand oxidiert. Der entstandene Komplex nimmt in der Folge

das zweite Elektron, welches wiederum durch die Reduktase zur Verfügung gestellt

wird, auf (5). Mit Hilfe zweier Protonen des oxidierten Flavoproteins kommt es zur

Abspaltung eines Sauerstoffatoms unter Bildung von Wasser (6). Der dabei

entstandene Oxokomplex ist sehr reaktiv und überträgt sein Sauerstoffatom auf das

Substrat (7). In diesem Zuge wird das hydroxylierte Substrat wieder abgespalten und

das Cytochrom P450 Enzymsystem steht für einen neuen katalytischen Zyklus zur

Verfügung.

Falls der Enzym-Sauerstoff-Komplex zu instabil ist oder kein Substrat zur Verfügung

steht, kann es zu einer Entkopplung des katalytischen Zyklus kommen. Spaltet sich

der Sauerstoff nach Übertragung des ersten Elektrons ab, so entsteht ein

Superoxidradikalanion (O2·-). Spaltet sich der Sauerstoff hingegen nach Übertragung


39

des zweiten Elektrons ab, so entsteht Peroxid (O2·2-) und anschließend mit zwei

Wasserstoffatomen Wasserstoffperoxid (H2O2) [Coon et al., 1992].

Fe(III)

OH H

Fe(III)

Fe(II)

Fe(II)

O2

Fe(III)

O2

Fe(III)

O2-

Fe(IV)

O

O2

Protein

Protein

Protein

ProteinProtein

Protein

Protein

RH

RH

RH RH

RH

RH

RHROH

+.

2

-.

Fpox

Fpred

e-

e-

NADPH+H+

NADP+

2H+

H2O

O2

H2O2

. -

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

Abb. 2.3: Katalytischer Zyklus der oxidativen Substratumsetzung durch Cytochrom P450 (modifiziert nach Coon et al., 1992) Fe = Hämeisen im katalytischen Zentrum; RH = Substrat; ROH = Produkt; Fp = NADPH-Cytochrom P450 Reduktase

2.1.2 Gewinnung membranständiger Enzyme

Die Molekularbiologie ist in der Lage, Proteine zu klassifizieren und zu identifizieren.

Sie erlaubt, isolierte Proteine zu klonen und zu sequenzieren. Gerade bei in geringen

Mengen vorliegendem Material ist es leichter, genetisches Material zu untersuchen


40

als das Protein selbst. Nichtsdestotrotz werden biochemische Untersuchungen

sicherlich nie von molekularbiologischen Untersuchungen verdrängt. Voraussetzung

für eine Untersuchung ist die Isolierung des Enzyms aus dem Gewebe [Kornberg,

1990].

Liegt ein Enzym isoliert vor, kann es nach verschiedenen Gesichtspunkten

charakterisiert werden. Dieses beinhaltet die verschiedensten zur Verfügung

stehenden Methoden, beginnend mit dem Bestimmung des Molekulargewichts [Laue

und Rhodes, 1990], der Identitätsbestimmung [Judd, 1990], führt weiter über die

Erhebung biotransformatorischer Daten [Bjornsson et al., 2003] bis hin zur

Genklonierung [Wozney, 1990] und Bildung spezifischer Antikörper [Dunbar und

Schwoebel, 1990].

Die Reinigung eines Enzyms sollte möglichst spezifische Enzymaktivitätskontrollen zur

Überprüfung der Reinigung beinhalten [Smith et al., 1994; Clement et al., 1997].

Immunoblot-Analysen mit spezifischen Antikörpern stellen eine weitere Möglichkeit

dar [Linn, 1990]. Das Enzym sollte im Gewebe in hoher Konzentration vorliegen, um

eventuelle Verluste während der Aufarbeitung ausgleichen zu können. Zudem sollte

das Gewebe leicht zugänglich sein [Linn, 1990].

Die membranständigen Enzyme sind in intrinsische und extrinsische Proteine zu

unterteilen. Erstere sind über Transmembranhelices fest mit der Membran

verbunden. Um sie zu reinigen, ist eine Herauslösung aus der Membran mittels

Detergentien notwendig. Zudem kann eine Rekonstitution die zusätzliche

Anwesenheit von Lipiden bedingen, um eine katalytische Aktivität zu erhalten

[Banerjee et al., 1995]. Extrinsische Proteine hingegen sind nur locker mit der

Membran verbunden. Eine Veränderung des pH-Wertes oder der Ionenstärke reicht

in der Regel aus, um sie von der Membran abzulösen. Meistens sind sie frei von

Lipiden.

Zur Solubilisation der intrinsischen Proteine werden Detergentien eingesetzt. Diese

haben ionischen oder nichtionischen Charakter. Die ionischen Detergentien können in

anionisch, kationisch oder zwitterionisch unterteilt werden. Ionische Detergentien

besitzen in der Regel eine hohe Solubilisationskraft, während nichtionische

Detergentien sich weniger stark auf die Enzymaktivität auswirken [Thomas und

McNamee, 1990]. In der Regel werden ambiphile Detergentien in wässriger Lösung

eingesetzt [Thomas und McNamee, 1990]. Die Auswahlmöglichkeit des

einzusetzenden Detergenzes ist groß und muss unter vielen Gesichtspunkten

abgewogen werden. Darunter fällt u. a. das „in Lösung halten“ solubilisierter

Proteine, da sie häufig aggregieren und ausfallen. Das Detergenz sollte dem


41

vorbeugen können. Dafür darf es aber die Struktur oder Funktion des Proteins nicht

beeinträchtigen [Hjelmeland, 1990; le Maire et al., 2000].

Schließlich sollte das Detergenz der geplanten Reinigung angepasst werden, damit es

nicht zu Interaktionen der einzelnen Schritte kommt. Anionische Detergentien

interagieren häufig mit Anionenaustauschern. Digitonin und Polyoxyethylen-

abkömmlinge bilden große Einschlussverbindungen und sind damit für eine

Gelfiltration schlecht geeignet [Thomas und McNamee, 1990]. Phenylhaltige

Detergentien absorbieren bei 280 nm und überlagern die UV-Kontrolle der

Proteinelution. Auf der anderen Seite kann diese Eigenschaft zur Kontrolle der

Detergentienentfernung ausgenutzt werden [Funae und Imaoka, 1985].

Eine gute Solubilisation ist des Weiteren vom vorliegenden Membrantyp, der

Detergenzkonzentration und dem Protein-/Detergenzverhältnis abhängig. Somit

müssen die idealen Reinigungsbedingungen für das zu untersuchende Enzym

empirisch ermittelt werden [Helenius und Simons, 1975].

Die Solubilisationslösung wird in der Regel eine Stunde bei 100.000 g zentrifugiert,

um nicht-solubilisierte Proteine vom Solubilisat abzutrennen. Anschließend steht eine

Vielzahl chromatographischer Methoden, wie Affinitäts-, Hydrophobe Interaktions-

und Ionenaustauschchromatographie sowie Gelfiltration zur weiteren Auftrennung

des Solubilisats zur Verfügung [Pingoud und Urbanke, 1997]. Dabei führt die

Kombination mehrerer Methoden häufig zum gewünschten Erfolg. Die gesuchte

Enzymaktivität sollte in Bezug auf das Gesamtprotein gesteigert werden [Kornberg,

1990].

Die Reinheit der gewonnenen Enzympräparation kann nicht direkt bestimmt werden.

Stattdessen können mit Hilfe der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und

anschließender Silberfärbung Verunreinigungen bzw. andere Proteine detektiert und

quantifiziert werden [Rhodes und Laue, 1990].

2.1.3 Bisherige Untersuchungen

In früheren Studien wurde die Reduktion N-hydroxlierter Verbindungen untersucht.

Dabei wurden sowohl verschiedene Spezies und innerhalb dieser auch

unterschiedliche Organe verwendet. Ebenso erstreckt sich die Variabilität der

eingesetzten Substrate über einen weiten Bereich.

Clement [1988a] und Hauptmann et al. [1988] konnten die N-Reduktion von

Amidoximen zu Amidinen nachweisen. Im Jahre 1994 zeigte Jung mit humanen


42

Lebermikrosomen die Reduktion des N-Dihydroxy-Pentamidins zum Pentamidin.

Kurze Zeit später wurde mit der Modellsubstanz Benzamidoxim eine Korrelation zum

N-Dihydroxy-Pentamidin reduzierenden System aufgestellt [Lomb 1995]. Somit lag es

nahe, dass es sich um ein ähnliches, vielleicht sogar das gleiche reduzierende System

handeln muss. Lomb konnte weiterhin nachweisen, dass die Reduktion auch mit

Schweinelebermikrosomen stattfand. Eine analoge Reduktion des N-Hydroxyamidino-

hydrazons Guanoxabenz durch Kaninchen-, Schweine- und Rattenlebermikrosomen

konnte gezeigt werden [Clement und Jung, 1994; Clement et al. 1993b; 1996].

Dieses wurde u. a. durch Arbeiten von Mau [2002], Deters [2002] und Lopian [2002]

ergänzt, die die Reduktion in verschiedenen Organen (Niere, Gehirn, Lunge, Darm),

Organellen (Mikrosomen und Mitochondrien) sowie verschiedenen Spezies (Mensch,

Schwein) nachweisen konnten.

Die Reduzierbarkeit anderer N-hydroxylierter Verbindungen wie N-Hydroxyisothio-

harnstoffe und N-Hydroxyguanidine [Clement und Wissel, 1991; Clement und Kunze,

1992; Clement et al., 1993a] wurde in vitro nachgewiesen.

In weiterführenden Studien gelang erstmals die Isolierung und Identifizierung eines

für die Reduktion verantwortlichen Enzymsystems in Schweinelebermikrosomen.

Dieses besteht aus Cytochrom b5, NADH Cytochrom b5 Reduktase und einem bislang

nicht vollständig identifizierten Cytochrom P450 Enzym der Subfamilie CYP2D

[Clement et al., 1997]. Das einzig humane Enzym der Subfamilie CYP2D, welches

bisher identifiziert werden konnte, ist das CYP2D6. Durch Testung mit CYP2D6-

defekten Mikrosomen konnte die Beteilung von CYP2D6 an der Reduktion von

Amidoximen ausgeschlossen werden. Zudem zeigten Hemmstudien mit Chinidin,

einem spezifischen Hemmstoff für CYP2D6, sowie mit einem polyklonalen Antikörper

gegen CYP2D6 keinen hemmenden Einfluss auf die Reduktion vom Benzamidoxim

zum Benzamidin [Möller, 1997].

Neben den in vitro-Studien fanden auch in vivo-Studien statt. Hierbei wurden die

N-dehydroxylierten Metabolite nach Applikation im Plasma von Kaninchen und Ratte

nachgewiesen [Clement et al. 1992; 1993b]. Behrens [1999] und Rieckert [1999]

isolierten aus humanen Lebermikrosomen ein der Schweineleber analoges

Enzymsystem. Durch Sequenzierung und Markeraktivitätsbestimmungen wurde es als

CYP2A6 identifiziert. Dies konnte durch die Arbeiten von Karhan [2002] und Lopian

[2002] bestätigt werden, die aber eine Beteiligung weiterer P450-Isoenzyme als

wahrscheinlich ansahen.

Möller [1997] zeigte durch Inhibitorstudien mit polyklonalen Antikörpern gegen

CYP2E1 und monoklonalen Antikörpern gegen CYP3A4, dass eine Beteiligung dieser

Isoenzyme an der Reduktion als unwahrscheinlich anzusehen ist. In der weiteren

Arbeit wurden rekombinante, in Lymphoblasten exprimierte Cytochrom P450


43

Isoenzyme (CYP1A1, CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6-Val,

CYP2D6-Met, CYP2E1, CYP3A4, CYP4A11) auf ihre Benzamidoxim-

Reduktaseeigenschaften hin untersucht. Diese Isoenzyme sind häufig an

Biotransformationen verschiedener Xenobiotika beteiligt, wiesen aber keine

metabolische Aktivität in Bezug auf die Reduktion der Modellsubstanz Benzamidoxim

auf.

Des Weiteren wurde festgestellt, dass Cytochrom b5 und die NADH Cytochrom b5

Reduktase im Zweikomponentensystem auch zu einer Reduktion von Benzamidoxim

führen. Die Umsetzungsrate ist mit dem Faktor 0,1 deutlich niedriger als nach

Zugabe der dritten, aus Schweinelebermikrosomen isolierten, Enzymkomponente.

Havemeyer et al. [2006] konnten eine aktive dritte Komponente aus der äußeren

Membran von Schweinelebermitochondrien gewinnen und als „Moco sulphurase C-terminal domain containing 2 “ identifizieren.

2.1.4 Zielsetzung

Lomb [1995] und Möller [1997] identifizierten die mikrosomale Benzamidoxim-

Reduktase aus der Schweineleber als Cytochrom P450 Isoenzym der Subfamilie 2D,

welches zusammen mit Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5 Reduktase die

N-Reduktion katalysiert. Behrens und Rieckert [beide 1999] untersuchten

Mikrosomen der humanen Leber im Hinblick auf die Reduktion N-hydroxylierter

Verbindungen und fanden das Cytochrom P450 2A6 als die verantwortliche dritte

Komponente. Dieses Ergebnis bestätigten Lopian und Karhan [beide 2002] durch ihre

Arbeiten, schlossen aber eine Beteiligung weiterer P450 Isoenzyme nicht aus.

Deters und Mau [beide 2002] fanden durch ihre Untersuchungen heraus, dass das

N-reduktive System nicht allein auf die Leber beschränkt ist, sondern auch in

extrahepatischen Geweben wie Niere, Gehirn oder Darm vorkommt. Dabei wurde in

der Niere eine höhere Umsetzungsrate der Benzamidoxim Reduktion festgestellt als

in der Leber.

Aufbauend auf diese bekannten Ergebnisse (Kapitel 2.1.3) sollte die verantwortliche

mikrosomale dritte Komponente aus der Niere isoliert und charakterisiert werden.

Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5 Reduktase sind dabei als zusätzliche

Komponenten für das verantwortliche Enzymsystem der Schweineniere zu

bestätigen. Die Reinigung sollte anhand der in der Literatur-beschriebenen Methoden

zur Gewinnung von Cytochrom P450 Isoenzymen angepasst oder gegebenenfalls

modifiziert werden.


44

2.2 Methoden

2.2.1 Gewinnung der Enzympräparation

2.2.1.1 Materialien und Geräte

Sofern nicht angegeben, befindet sich eine Übersicht über die verwendeten

Materialien und Geräte in Kapitel 8 der vorliegenden Arbeit.

2.2.1.2 Gewinnung von Schweinenierenmikrosomen

Die Schweinenieren zur Gewinnung der Mikrosomen stammten von einem ortsnahen

Schlachter aus Einzelschlachtungen. Die Tiere wurden per Elektroschock getötet,

durch Öffnen der Halsschlagader ausgeblutet und anschließend einem Brühbad

unterworfen. Danach wurden den Schweinen die Nieren entnommen und in einem

4 °C kalten Transportpuffer (20 mM Kaliumphosphat, 250 mM Saccharose, 1 mM

EDTA, pH 7,4) zum Labor transportiert. Pro Aufarbeitung wurden 8-12 Nieren,

sowohl weiblicher Tiere als auch männlicher Kastrate verwendet.

Die folgenden Reinigungsschritte fanden bei 4 °C oder unter Eiskühlung statt.

Zunächst wurden die Nieren gehäutet und von ihrer bindegewebsartigen Kapsel

entfernt. Eine Perfusion der Nieren wurde mit 50 mM Phosphatpuffer (250 mM

Saccharose, 1 mM EDTA, pH 7,4) durchgeführt. Die Gefäße in den Nieren waren sehr

klein, so dass die Perfusion nicht ausreichend war. Von den Nieren wurden nur die

Rinde sowie das Mark verwendet, Fettgewebe und Sammelbecken wurden

verworfen. Die klein geschnittenen Nierenstücke wurden so lange mit 50 mM

Phosphatpuffer gespült bis das Waschwasser nahezu farblos blieb. Die gut gespülten

Nierenstückchen wurden durch einen handelsüblichen Fleischwolf gegeben. Dieser

Vorgang musste zweimal durchgeführt werden, da das Nierengewebe sehr hart und

fest war und eine weitere Zerkleinerung sonst nicht möglich gewesen wäre. Die so

erhaltene Masse wurde mit gleichem Volumen an 20 mM Phosphatpuffer (250 mM

Saccharose, pH 7,4) gemischt und zweimal durch einen Durchflusshomogenisator

gegeben [Ziegler und Pettit, 1966]. In den folgenden Schritten wurde nur noch der

letztgenannte EDTA freie Puffer verwendet, da das zu verarbeitende Material zu

diesem Zeitpunkt blutfrei war. Der Verlust an Volumen durch das Homogenisieren

wurde durch Auffüllen mit Puffer wiederhergestellt. Anschließend wurde das

entstandene Nierenhomogenat mit Kaliumhydroxid-Lösung auf pH 7,4 eingestellt.


45

Das Homogenat wurde 30 Minuten bei 9.000 g (Rotor JA 10) zentrifugiert. Der

erhaltene Überstand wurde zur Abtrennung von Fetten durch Verbandmull koliert.

Die vereinigten Überstände wurden für 60 Minuten bei 100.000 g (Rotor 45 Ti) der

Ultrazentrifugation unterzogen. Der cytosolische Überstand konnte aliquotiert und bei

-80 °C eingefroren werden, das erhaltene Pellet wurde mit Puffer in einem Teflon-

Glas-Homogenisator resuspendiert und zur weiteren Aufreinigung erneut 60 Minuten

bei 100.000 g ultrazentrifugiert. Das entstandene mikrosomale Pellet wurde wieder in

Puffer resuspendiert, mit Kaliumhydroxid-Lösung auf pH 7,4 eingestellt, aliquotiert

und bei -80 °C eingefroren.

2.2.1.3 Isolierung des zur Reduktion N-hydroxylierter Verbindungen verantwortlichen Cytochrom P450 Isoenzyms

2.2.1.3.1 Solubilisation

Die Solubilisation wurde mit unterschiedlichen Detergenzkonzentrationen sowie

einem Kontrollansatz ohne zugesetztem Detergenz durchgeführt und parallel

aufgearbeitet. Sofern nicht anders angegeben, ergab sich folgende

Zusammensetzung der Solubilisationsansätze: Schweinenierenmikrosomen wurden

mit Solubilisationspuffer (100 mM Kaliumphosphat, 2 mM EDTA, 2 mM Dithiothreitol,

1 M Natriumchlorid, 40 % (w/v) Glycerol, pH 7,4) und Detergenz so verdünnt, dass

die entstandene Proteinlösung 5 mg/ml Mikrosomen enthielt. Die Ansätze wurden

eine Stunde im Eisbad mit einem Flügelrührer gerührt und anschließend eine Stunde

bei 100.000 g zentrifugiert, um die solubilisierten Proteine abzutrennen. Das

erhaltene Pellet wurde mit detergenzfreiem Standardpuffer (100 mM

Kaliumphosphat, 20 % (w/v) Glycerol, pH 7,4) resuspendiert, aliquotiert und bei

-80 °C gelagert. Auch der jeweilige Überstand wurde aliquotiert und bei -80 °C

gelagert.

2.2.1.3.1.1 Polyethylenglykol 6000 Fällung

Nach Solubilisation (Kapitel 2.2.1.3.1) der Schweinenierenmikrosomen wurde die

Zentrifugation bei 100.000 g nicht durchgeführt. Stattdessen wurde eine 50 %ige

Stammlösung von Polyethylenglykol 6000 tropfenweise zugegeben bis das Solubilisat

6 % Polyethylenglykol 6000 enthielt. Dieses Gemisch wurde 20 Minuten im Eisbad

mit einem Flügelrührer gerührt und anschließend 10 Minuten bei 5.000 g

zentrifugiert, um die nicht solubilisierten Proteine abzutrennen. Anschließend wurde


46

wieder Polyethylenglykol 6000 Lösung zugefügt bis das Solubilisat 9 %

Polyethylenglykol 6000 enthielt, das Solubilisat 20 Minuten im Eisbad gerührt und

wiederum 10 Minuten bei 5.000 g zentrifugiert. Polyethylenglykol 6000 wurde in

3 %-Schritten, bis 24 % erreicht waren, weiter zugeführt. Jede gefällte Fraktion

wurde aliquotiert und bei -80 °C gelagert.

Anschließend wurde von jeder Fraktion Proteingehalt und Benzamidoxim-Reduktase

Aktivität bestimmt. Die Methode wurde nach Andersson et al. [2005] durchgeführt.

2.2.1.3.2 Hydrophobe Interaktionschromatographie an Octyl-Sepharose CL-4B®

Die Hydrophobe Interaktionschromatographie erfolgte an Octyl-Sepharose CL-4B®

(Fa. Pharmacia, 2,6 x 35,5 cm, Gelvolumen 190 ml) in Anlehnung an die Methode

von Clement et al. [1997]. Nach Auftrag des Solubilisats erfolgte die Elution durch

einen positiven Stufengradienten der Detergenzkonzentration sowie einen negativen

Stufengradienten der Ionenstärke. Die Flussrate betrug 0,83 ml*min-1 und das

Volumen der aufgefangenen Fraktionen jeweils 15 ml.

Mittels eines Durchflussphotometers wurde die Elution bei 280 nm (NADH Cytochrom

b5 Reduktase) verfolgt. Ein zusätzliches Elutionsprofil ist durch Vermessen der

einzelnen Fraktionen bei 417 nm (Cytochrom b5) erstellt worden. Außerdem wurden

spezielle Aktivitätstests auf Cytochrom b5, NADH Cytochrom b5 Reduktase,

Cytochrom P450 Enzyme, NADPH Cytochrom P450 Reduktase (siehe Kapitel

2.2.2.2-5) durchgeführt. Alle aktiven Fraktionen wurden in Pools vereinigt, mittels

Amicon-Zellen eingeengt, umgepuffert und bei -80 °C eingefroren.

2.2.1.3.2.1 Variation des Detergenzes

Die Hydrophobe Interaktionschromatographie wurde mit unterschiedlichen

Detergentien (Thesit®, Natriumcholat, Emulgen® 911, Zwittergent® 3-14) sowie

unterschiedlichen Detergenzkonzentrationen (0-2 % (v/v)) durchgeführt. Verwendet

wurden die bei 100.000 g gewonnenen Überstände, wie unter Kapitel 2.2.1.3.1

beschrieben.

Als Puffer wurde ein 100 mM Phosphatpuffer (1 mM EDTA, 0,5 mM Dithiothreitol,

20 % (w/v) Glycerol, 0-500 mM Natriumchlorid, pH 7,4) verwendet. Aufgrund der

komplexen Wechselwirkungen zwischen Säulenmaterial, Detergentien,

Salzgradienten und solubilisierter Proteine war eine Erfolgskontrolle nur durch sich

wiederholende Aufträge solubilisierter Mikrosomen möglich.


47

2.2.1.3.2.2 Variation der Salzkonzentration

Die Hydrophobe Interaktionschromatographie wurde mit unterschiedlichen

Salzkonzentrationen (0-500 mM Natriumchlorid) durchgeführt. Verwendung fanden

die bei 100.000 g gewonnenen Überstände, wie unter 2.2.1.3.1 beschrieben.

Als Puffer wurde ein 100 mM Phosphatpuffer (1 mM EDTA, 0,5 mM Dithiothreitol,

20 % (w/v) Glycerol, 0-2 % (v/v) Detergenz, pH 7,4) verwendet. Aufgrund der

komplexen Wechselwirkungen zwischen Säulenmaterial, Detergentien,

Salzgradienten und solubilisierter Proteine war eine Erfolgskontrolle nur durch sich

wiederholende Aufträge solubilisierter Mikrosomen möglich.

2.2.1.3.3 Präparative HPLC an Fractogel® EMD TMAE 650 (S)

Die präparative HPLC-Analytik wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Hierbei

wurde die Säule mit einem Kühlaggregat auf 4 °C gekühlt und die entstandenen

Proben in einem mit Eiswasser gekühlten Fraktionssammler gesammelt. Die Puffer

wurden ebenfalls in Eiswasser gekühlt. Zuvor wurde der pH-Wert auf pH 7,4

eingestellt und vor der Verwendung entgast.

Die Trennung wurde mit folgendem Chromatographie-System durchgeführt:

HPLC-System: Biokompatible HPLC-Pumpe, L-6210, Fa. Merck-

Hitachi, Darmstadt

Detektor: UV/VIS-Detektor L-4200, Fa. Merck-Hitachi,

Darmstadt

Fraktionssammler: LKB Frac 200, Fa. Pharmacia

Integrator: Integrator D-2500, Fa. Merck-Hitachi, Darmstadt

Stationäre Phase: Superformance®-Glaskartuschen-Grundeinheit,

Superformance®-Glaskartusche gefüllt mit

Ionenaustauscher Fractogel® EMD TMAE-650 (S)

25-40 µm, 150 x 10 mm

Kühlaggregat: Julabo F 20, Fa. Julabo Labortechnik, Seelbach


48

Mobile Phase 1, pH 7,4 (4 °C): 20 mM Tris-Acetat

20 % (w/v) Glycerol

0,4 % (w/v) Emulgen 911®

Mobile Phase 2, pH 7,4 (4 °C): 20 mM Tris-Acetat

20 % (w/v) Glycerol

0,4 % (w/v) Emulgen 911®

1 M Natriumacetat

Laufzeit: 90 min

Flussrate: 1 ml/min

Fraktionsgröße: 1 ml

Gradient: Zeit (min) % Puffer 1 % Puffer 2

0-15 100 0

15-30 90 10

30-45 80 20

45-60 70 30

60-75 60 40

75-90 20 80

Injektionsvolumen: 1 ml

Detektion: UV, 280 nm

Das zu trennende Proteingemisch wurde auf die mobile Phase 1 umgepuffert und vor

Auftrag durch eine Membranfiltration von partikulären Verunreinigungen befreit. In

1 ml Aliquots wurde die Probe anschließend mittels Probenschleife aus inertem PEEK-

Material (Fa. ERC, Altegolfsheim) auf die äquilibrierte Säule aufgetragen. Nach

erfolgter Reäquilibrierung wurde die Elution des gebundenen Proteins anschließend

über mehrere Stufengradienten durch Erhöhung der Salzkonzentration durchgeführt.

Die eluierten Fraktionen wurden anhand des bei 280 nm aufgenommenen

Elutionsprofils, des parallel bestimmten Proteinprofils oder durch Aktivitätstest (NADH

Cytochrom b5 Reduktase (s. Kapitel 2.2.2.4)) gepoolt. Diese gepoolten Fraktionen

wurden in Amicon-Zellen einkonzentriert, umgepuffert und bei -80 °C eingefroren.


49

2.2.1.3.4 Anionenaustauschchromatographie an DEAE-Cellulose

Folgende Pufferlösungen wurden verwendet:

Äquilibrierpuffer, pH 7,4 (4 °C): 20 mM Tris-Base

0,1 mM EDTA

0,1 mM DTT

0,9 mM Zwittergent® 3-14

20 % (w/v) Glycerol

Elutionspuffer, pH 7,4 (4 °C): 1 M Natriumchlorid in

Äquilibrierpuffer, pH 7,4

Alle Puffer wurden durch einen Sartorius® Membranfilter (0,45 µm) per

Vakuumfiltration von Partikeln befreit. Vor der Verwendung wurde der Eluent 15

Minuten im Ultraschallbad entgast.

Das erhaltene Solubilisat wurde auf eine DEAE 52-Cellulose SERVACEL® Säule (Fa.

Serva, 2,5 x 10 cm, 50 ml Gelvolumen) aufgetragen. Zuvor wurde die Säule mit

ausreichend Äquilibrierpuffer konditioniert. Nach Auftrag des Solubilisats mit

0,8 ml*min-1 wurde mit weiteren 100 ml Äquilibrierpuffer nachgewaschen. Danach

wurde über einen Gradientenformer ein linearer Gradient von 0-1 M Natriumchlorid in

einem Volumen von 250 ml erzeugt. Das Eluat wurde in 4 ml Fraktionen

aufgefangen, wobei die Pumpe weiterhin mit 0,8 ml*min-1 lief. Alle Arbeitsschritte

erfolgten bei 4 °C.

Die erhaltenen DEAE-Fraktionen wurden mittels der in Kapitel 2.2.1.3.4.2-15

angegebenen Methoden untersucht. Alle erhaltenen Fraktionen wurden aliquotiert


2.2.1.3.4.1 Solubilisation

Die Solubilisation der Mikrosomen fand in folgender Lösung statt: 50 mg

Mikrosomen, 0,45 mM Zwittergent® 3-14, 20 mM Tris-Base, 0,1 mM Dithiothreitol,

0,1 mM EDTA, 20 % Glycerol in einem Endvolumen von 25 ml mit Aq. bidest.. Das

Protein-/Detergenzverhältnis belief sich dabei auf den Faktor vier. Die Lösung wurde

auf pH 7,4 mittels Phosphorsäure eingestellt. Danach wurde der Ansatz eine Stunde

im Eisbad mit einem Magnetkern gerührt. 200 µl des Solubilisats wurden zu

Kontrollzwecken entnommen und bei -80 °C gelagert. Das restliche Solubilisat wurde


50

auf die Anionenaustauschchromatographie-Säule aufgetragen (Kapitel 2.2.1.3.4).

Eine Zentrifugation zur Abtrennung nicht solubilisierter Proteine fand nicht statt.

2.2.1.3.4.2 Protein-Verlaufskontrolle

Die Absorption der eluierten Fraktionen wurde bei 280 nm vermessen. Da der

Äquilibrierpuffer eine geringe Eigenabsorption aufwies, wurde dieser Wert von den

gemessenen Werten abgezogen.

Zudem wurde der Proteingehalt nach der in Kapitel 2.2.2.1 beschriebenen Methode

bestimmt.

2.2.1.3.4.3 Cytochrom b5-Verlaufskontrolle

Die einzelnen Fraktionen wurden auf ihren Cytochrom b5 Gehalt untersucht. Dabei

fand die Cytochrom b5-Bestimmung nach der in Kapitel 2.2.2.3 beschriebenen

Methode statt.

2.2.1.3.4.4 NADH Cytochrom b5 Reduktase-Verlaufskontrolle

Alle Fraktionen der Anionenaustauschchromatographie wurde der NADH

Cytochrom b5 Reduktase Bestimmung unterzogen. Die Methode ist in Kapitel 2.2.2.4

wiedergegeben.

2.2.1.3.4.5 Cytochrom P450-Verlaufskontrolle

Zur Bestimmung der Cytochrom P450-Aktivität wurde die in Kapitel 2.2.2.5

beschriebene Methode verwendet.

2.2.1.3.4.6 Monoaminoxidase-Verlaufskontrolle

Zur Bestimmung der Monoaminoxidase-Aktivität wurde die in Kapitel 2.2.2.6

beschriebene Methode verwendet.


51

2.2.1.3.4.7 Benzamidoxim-Reduktase-Verlaufskontrolle ohne zusätzliche Enzyme

Die N-reduktive Aktivität wurde über die Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin

bestimmt. Benzamidoxim wurde hierbei als Modellsubstanz verwendet. Das

rekonstituierte System bestand aus 10 µl der entsprechenden DEAE-Fraktion. Die

weitere Durchführung der Inkubation sowie Aufarbeitung der Inkubationsansätze

sind in Kapitel 2.2.3.1.2 angegeben.

2.2.1.3.4.8 Benzamidoxim-Reduktase-Verlaufskontrolle mit zugesetzter gereinigter

NADH Cytochrom b5 Reduktase



rekonstituierte System bestand aus 10 µl der entsprechenden DEAE-Fraktion und

0,05 U NADH Cytochrom b5 Reduktase. Die weitere Durchführung der Inkubation

sowie Aufarbeitung der Inkubationsansätze sind in Kapitel 2.2.3.1.2 angegeben.

2.2.1.3.4.9 Benzamidoxim-Reduktase-Verlaufskontrolle mit zugesetztem humanem

rekombinantem Cytochrom b5




170 pmol Cytochrom b5. Die weitere Durchführung der Inkubation sowie

Aufarbeitung der Inkubationsansätze sind in Kapitel 2.2.3.1.2 angegeben.


NADH Cytochrom b5 Reduktase und zugesetztem humanem




rekonstituierte System bestand aus 10 µl der entsprechenden DEAE-Fraktion, 0,05 U

NADH Cytochrom b5 Reduktase und 170 pmol Cytochrom b5. Die weitere

Durchführung der Inkubation sowie Aufarbeitung der Inkubationsansätze sind in

Kapitel 2.2.3.1.2 angegeben.


52

2.2.1.3.4.11 Dextromethorphan-O-Demethylierung

Die CYP2D Markeraktivität wurde mittels der O-Demethylierung von

Dextromethorphan zu Dextrorphan bestimmt. Das rekonstituierte System bestand

aus 20 µl der entsprechenden DEAE-Fraktion und 0,5 U NADPH Cytochrom P450

Reduktase. Die weitere Durchführung der Inkubation sowie Aufarbeitung der

Inkubationsansätze sind in Kapitel 2.2.3.2.3 beschrieben.

2.2.1.3.4.12 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese

Die Überprüfung der Proteinreinigung in den einzelnen Fraktionen wurde mittels der

SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese dargestellt. Die verwendete Methode ist in

Kapitel 2.2.2.7 beschrieben.

2.2.1.3.4.13 Massenspektrometrische Analyse

Zur Identifizierung der Proteinbanden im SDS-Gel wurden diese der massenspektro-

metrischen Analyse unterzogen. Die Methode ist in Kapitel 2.2.2.8 beschrieben.

2.2.1.3.4.14 nit-1 Rekonstitutions-Assay

Die nit-1 Rekonstitutionsanalyse diente der Bestimmung der Molybdäncofaktor-

aktivität. Die Rekonstitution wurde mittels der Nitratreduktaseaktivität der nit-1

Mutante [Nason et al., 1971] bestimmt und freundlicherweise von Tanja Otte

(Technische Universität Braunschweig) durchgeführt. Die Methode ist in Kapitel

2.2.2.9 beschrieben.

2.2.1.3.4.15 FormA Analyse

Die FormA Analyse wies spezifisch das Molybdopterin-Grundgerüst nach. Die

Bestimmung wurde nach der in Kapitel 2.2.2.10 beschriebenen Methode

durchgeführt.

Die Bestimmung wurde freundlicherweise von Tanja Otte (Technische Universität

Braunschweig) durchgeführt.


53

2.2.1.3.4.16 Immunoblot-Analyse

Die Immunoblot-Analyse wurde nach der in Kapitel 2.2.2.11 beschriebenen Methode

durchgeführt. Die im nit-1 Rekonstitutions-Assay positiv getesteten Fraktionen

wurden von Tanja Otte (Technische Universität Braunschweig) der Immunoblot-

Analyse unterzogen.

2.2.1.3.5 Kationenaustauschchromatographie an CM-Cellulose

Die Kationenaustauschchromatographie erfolgte an CM 52-Cellulose SERVACEL® (Fa.

Serva, 2,5 x 18 cm, Gelvolumen 88 ml).


Äquilibrierpuffer, pH 7,4 (4 °C): 20 mM Tris-Acetat

20 % (w/v) Glycerol

Detergenz

Elutionspuffer, pH 7,4 (4 °C): 1 M Natriumacetat in Äquilibrierungspuffer

Nach Auftrag des Solubilisats erfolgte die Elution durch einen linearen Gradienten

von 0-1 M Natriumacetat. Die Flussrate betrug 48 ml*min-1 und das Volumen der

aufgefangenen Fraktionen jeweils 4 ml.


b5 Reduktase) verfolgt. Ein zusätzliches Elutionsprofil wurde durch Vermessen der

einzelnen Fraktionen bei 417 nm (Cytochrom b5) erstellt. Außerdem wurden spezielle

Aktivitätstests auf Cytochrom b5, Cytochrom b5 Reduktase, Cytochrom P450 Enzyme,

NADPH Cytochrom P450 Reduktase (s. Kapitel 2.2.2.2-5) durchgeführt. Alle aktiven

Fraktionen wurden in Pools vereinigt, mittels Amicon-Zellen eingeengt, umgepuffert


2.2.1.3.6 Detergenzentfernung

Die Enzympräparationen wurden zur Entfernung niedermolekularer Bestandteile der

eingesetzten Puffer auf einer Sephadex® G-25 Säule (NAPTM 10, NAPTM 25)

aufgetragen und mit einem Neutralpuffer (100 mM Kaliumphosphat, 20 % (w/v)


54

Glycerol, pH 7,4) eluiert. Das Eluat wurde einem der nachstehenden Verfahren zur

Entfernung des Detergenzes unterzogen.

2.2.1.3.6.1 Calbiosorb®

Das Eluat aus Kapitel 2.2.1.3.6 wurde mit ca. 1 ml des Adsorptionsmaterials

Calbiosorb® (EMD Biosciences, San Diego, CA, USA) versetzt und eine Stunde mittels

eines Überkopfschüttlers vorsichtig geschüttelt. Nach Sedimentation des

Adsorptionsmaterials wurde die Enzympräparation wieder abpipettiert. Zur

vollständigen Entfernung der Detergentien musste dieser Vorgang mehrfach

wiederholt werden.

2.2.1.3.6.2 Hydroxylapatit

Die Detergenzentfernung an Hydroxylapatit erfolgte an Hydroxylapatit, High

Resolution (Fa. Calbiochem, 1,6 x 3,5 cm, Gelvolumen 7 ml). Das Eluat aus Kapitel

2.2.1.3.6 wurde in einem 5 mM Phosphatpuffer (20 % (w/v) Glycerol, 0,05 %

Natriumcholat, pH 7,4) umgepuffert. In 1,0 ml Aliquots wurde diese Proteinlösung

auf die Hydroxylapatit-Säule aufgetragen. Die Elution wurde bei 280 nm

(Absorptionsmaximum des Detergenzes Emulgen 911®) mit einem

Durchflussphotometer verfolgt. Die Säule wurde so lange mit einem 5 mM

Phosphatpuffer gespült, bis das Durchflussprofil bei 280 nm keine Absorption mehr

zeigte. Mittels eines 500 mM Phosphatpuffers (20 % (w/v) Glycerol, 0,05 %

Natriumcholat, pH 7,4) konnten die Proteine von der Säule gespült werden. Durch

Umpuffern auf Neutralpuffer (100 mM Kaliumphosphat, 20 % (w/v) Glycerol, pH 7,4)

wurde das restliche Natriumcholat aus dem Auftrags- und Gradientenpuffer entfernt.

2.2.1.3.6.3 Detergent OutTM

Das Eluat aus Kapitel 2.2.1.3.6 wurde auf die Detergent OutTM (EMD Biosciences, San

Diego, CA, USA) Säule aufgetragen. Die Detergenzentfernung wurde nach

Herstelleranweisung durchgeführt. Nach Entfernung des Detergenzes konnte die

detergenzfreie Proteinlösung eluiert werden. Zur vollständigen Entfernung der

Detergentien musste dieser Vorgang wiederholt werden.


55

2.2.1.3.7 Stabilität

Die Gewinnung von Mikrosomen und anschließende Reinigung der Enzympräparation

ist ein langer und zeitaufwendiger Prozess. Aus diesem Grund wurden folgende

Parameter bezüglich der Stabilität hinsichtlich der zu bestimmenden Reduktase-

Aktivität untersucht:

Stabilität bei Lagerung in -80 °C Tiefkühltruhe

Stabilität bei Lagerung im 4 °C Kühlschrank

Stabilität bei Lagerung im 4 °C Kühlschrank nach Solubilisation.

2.2.1.3.8 Lagerung

Sämtliche Enzympräparationen wurden in einer glycerolhaltigen Pufferlösung

(100 mM Kaliumphosphat, 20 % (w/v) Glycerol, pH 7,4) bei -80 °C gelagert.

2.2.2 Analytische Methoden zur Charakterisierung der Enzympräparationen

2.2.2.1 Proteinbestimmung

Die Proteinbestimmung wurde mittels der BCA-Methode [Smith et al., 1985]

durchgeführt. Das Arbeitsreagenz (bestehend aus Natriumcarbonat,

Natriumhydrogencarbonat, 2,2’-Bichinolin-4,4’-dicarbonsäure, Natriumtartrat und

Kupfersulfat in 0,1 N Natronlauge) von Fa. Pierce (Rockford, IL, USA) wurde laut

Anleitung für jede Bestimmung frisch hergestellt. 900 µl BCA-Reagenz wurden zu

100 µl Proteinlösung (Verdünnung 1:50 bis 1:100 mit Aq. bidest.) gegeben und

abweichend von der Firmenvorschrift 20 Minuten bei 60 °C inkubiert. Mittels

Eiswasser wurde die Reaktion gestoppt. Innerhalb von drei Minuten wurden die

Proben bei 562 nm kolorimetrisch gegen den Blindwert (100 µl

Standardphosphatpuffer pH 7,4 als Ersatz für die Proteinlösung) vermessen. Die

Auswertung erfolgte durch Erstellung einer Kalibriergeraden mit Rinderserumalbumin

in bekannter Konzentration. Diese wurde stets in einem parallelen Ansatz mit dem

BCA-Reagenz erstellt.

War der Proteingehalt der Probe sehr gering oder waren Störungen der Bestimmung

durch Detergentien oder reduzierende Bestandteile wie Dithiothreitol zu vermuten, so

wurde der Proteinbestimmung eine Säurefällung mit Trichloressigsäure vorgeschaltet.

Das Arbeitsreagenz (bestehend aus UPPATM - I Reagenz und UPPATM – II Reagenz)

von Fa. Pierce (Rockford, IL, USA) wurde laut Arbeitsanweisung verwendet. 250 µl


56

Reagenz 1 wurden zu 50 µl Proteinlösung gegeben, kurz gemischt und fünf Minuten

bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach Zufügen von 250 µl Reagenz 2 und

kurzem Mischen wurde fünf Minuten bei 10.000 U*min-1 zentrifugiert. Der Überstand

wurde vollständig entfernt. Anschließend wurde das gefällte Protein in 300 µl BCA-

Reagenz durch kräftiges Mischen wieder gelöst. 200 µl dieser Lösung wurden im

Microplatereader 20 Minuten bei 44 °C inkubiert. Im Anschluss wurden die Proben

bei 562 nm kolorimetrisch gegen den Blindwert vermessen. Die Auswertung erfolgte

durch Erstellung einer Kalibriergeraden mit Rinderserumalbumin in bekannter

Konzentration. Die Kalibriergerade wurde stets in einem parallelen Ansatz mit dem

BCA-Reagenz erzeugt, wobei die einzelnen Standards unter den gleichen

Bedingungen aufgearbeitet und inkubiert wurden, wie die zu untersuchenden

Proben.

2.2.2.2 NADPH Cytochrom P450 Reduktase-Aktivitätsbestimmung

Die NADPH Cytochrom P450 Reduktase-Aktivitätsbestimmung erfolgte mit

Modifikationen nach der Methode von Sottocasa et al. [1967]. Hierbei wurde die

Reduktion von Cytochrom c spektralphotometrisch vermessen, indem die

Absorptionsänderung bei 550 nm verfolgt wurde, da das reduzierte Cytochrom c hier

sein Absorptionsmaximum besitzt. Zur Berechnung der Enzymaktivität wurde der

Absorptionskoeffizient ε=21 mM-1*cm-1 für die reduzierte Form des Cytochrom c

herangezogen [Kamin et al., 1965].

Die Zusammensetzung des Enzymassays stellte sich wie folgt dar: 2-25 µg Protein,

100 µM NADPH, 40-100 µM Cytochrom c, 0,05 % (v/v) Triton® X-100 und 300 µM

Kaliumcyanid in 50 mM Phosphatpuffer pH 7,5. Alle Reagentien wurden stets frisch

hergestellt. Präparationsabhängig wurden unterschiedliche Proteinmengen

eingesetzt. Die Messzeit betrug 20 Sekunden bei 30 °C. Die Enzymaktivität ist im

Folgenden in Units (U) angegeben, wobei 1 U als diejenige Enzymmenge definiert ist,

die pro Minute 1 µmol Cytochrom c umsetzt.

2.2.2.3 Cytochrom b5-Gehaltsbestimmung

Cytochrom b5 wurde anhand des Differenzspektrums der reduzierten und oxidierten

Form von Cytochrom b5 bestimmt. Die Methode wurde modifiziert durchgeführt nach

Estabrook und Werringloer [1978]. Die Bestimmung beruht auf der Reduktion des

Cytochrom b5, die durch eine Absorptionszunahme bei ~ 426 nm und eine -abnahme

bei ~ 409 nm charakterisiert ist. Die Probe wurde entweder unverdünnt oder mit


57

100 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,5 verdünnt. Nach Aufnahme des ersten

Absorptionsspektrums (400-500 nm) wurde eine gewisse Menge einer 60 mM NADH-

Lösung (in 100 mM Kaliumphosphatpuffer) zugesetzt, bis die erhaltenen Daten im

linearen Bereich lagen. Im Abstand von 60 Sekunden wurde das zweite Spektrum der

NADH-reduzierten Präparation aufgenommen. Durch Subtraktion beider Spektren

erhielt man ein Differenzspektrum. Die resultierende Absorptionsdifferenz zwischen

dem Absorptionsmaximum bei ~ 426 nm und dem -minimum bei ~ 409 nm wurde

zur Berechnung des Cytochrom b5-Gehaltes herangezogen.

Hierbei wurde nach und nach so viel NADH-Lösung zugegeben, bis die

Absorptionsdifferenz zwischen 426 nm und 409 nm maximal war.

Zur Berechnung diente der empirisch ermittelte Absorptionskoeffizient

ε=185 nM-1*cm-1 [Estabrook und Werringloer, 1978].

2.2.2.4 NADH Cytochrom b5 Reduktase-Aktivitätsbestimmung

NADH Cytochrom b5 Reduktase wurde nach der Methode von Mihara und Sato

[1978] spektrophotometrisch bestimmt. Die Bestimmung erfolgte durch die

Absorptionsabnahme bei 420 nm von Kaliumhexacyanoferrat(III) zu

Kaliumhexacyanoferrat(II) nach Zugabe des Cosubstrates. Die Messzeit betrug

60 Sekunden bei 25 °C.


0,1 mM NADH und 1 mM Kaliumhexacyanoferrat(III) in 100 mM

Kaliumphosphatpuffer pH 7,5. Alle Reagenzien wurden stets frisch hergestellt, die

Kaliumhexacyanoferrat(III)-Lösung wurde zudem lichtgeschützt gelagert.

Durch die Reduktion des Eisenkomplexes und der dabei auftretenden

Absorptionsabnahme bei 420 nm konnte über den Absorptionskoeffizienten

ε=1,02 mM-1*cm-1 die Aktivität der Reduktion bestimmt werden [Mihara und Sato,

1978]. Die Enzymaktivität ist im Folgenden in Units (U) angegeben, wobei 1 U als

diejenige Enzymmenge definiert ist, die pro Minute 1 µmol

Kaliumhexacyanoferrat(III) umsetzt.

2.2.2.5 Cytochrom P450-Gehaltsbestimmung

Der Cytochrom P450-Gehalt wurde in modifizierter Form nach der Methode von

Omura und Sato [1964] spektrophotometrisch mittels des Differenzspektrums

zwischen reduziertem Komplex aus Cytochrom P450 und Kohlenmonoxid sowie

reduziertem Cytochrom P450 bestimmt. Die Proteinprobe wurde mit 100 mM


58

Kaliumphosphatpuffer pH 7,4 verdünnt. Hatte die Proteinlösung eine zu starke

Streuung, so wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,02 % (v/v) Triton® X-100

zugesetzt. Die Proteinlösung wurde mit einer Spatelspitze Natriumdithionit versetzt.

Nach zwei Minuten wurde das erste Absorptionsspektrum (400-500 nm) der

dithionitreduzierten Präparation aufgenommen. Nach weiteren zwei Minuten wurde

30 Sekunden lang Kohlenmonoxid in die Probe eingeleitet. Das zweite

Differenzspektrum wurde nach zwei Minuten aufgezeichnet. Von diesem Spektrum

wurde das erste Spektrum abgezogen, um das Cytochrom P450 Differenzspektrum

zu erhalten.

Das Messprinzip beruht auf der Zunahme der Absorption bei 450 nm des

dithionitreduzierten Komplexes bestehend aus Cytochrom P450 und Kohlenmonoxid.

Zur Berechnung des Gehaltes wurde der Absorptionskoeffizient ε=91 mM-1*cm-1 des

reduzierten P450-Kohlenmonoxid-Komplexes verwendet [Omura und Sato, 1964].

2.2.2.6 Monoaminoxidase-Aktivitätsbestimmung

Die Monoaminoxidase-Aktivitätsbestimmung wurde modifiziert nach der Methode von

Kline et al. [1986] bestimmt.

Folgende Zusammensetzung wurde für den Enzymassay genutzt: in 500 µl

Gesamtvolumen waren etwa 80 µg mikrosomales Protein, 10 mM Benzylamin-HCl,

0,05 % (v/v) Triton X-100 in 50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,4 enthalten. Alle

Reagenzien wurden stets frisch hergestellt. Durch Zugabe des Benzylamin-HCl wurde

die Reaktion gestartet. Die Absorptionszunahme bei 250 nm wurde über eine

Messzeit von einer Minute bei 30 °C bestimmt.

Das Messprinzip beruht auf der enzymatisch katalysierten Bildung von Benzaldehyd.

Zur Berechnung der Enzymaktivität wurde der Absorptionskoeffizient ε=13 nM-1*cm-1

für Benzaldehyd [Tabor et al., 1954] verwendet.

Die Enzymaktivität ist im Folgenden in Units (U) angegeben, wobei 1 U als diejenige

Enzymmenge definiert ist, die pro Minute 1 µmol Benzylamin-HCl umsetzt.

2.2.2.7 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese

SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese wurde nach der von Laemmli [1970]

beschriebenen diskontinuierlichen Methode durchgeführt. Als Trenngele kamen

normalerweise 12 %ige Gele, als Sammelgele 5 %ige Gele zum Einsatz. Die Proben

und Standards wurden durch Erhitzen mit SDS und β-Mercaptoethanol vorbehandelt.

Die Detektion der Proteine erfolgte durch Anfärbung mit Coomassie-Blau oder Silber.


59

Verwendete Lösungen:

Alle Lösungen wurden stets frisch mit bidestilliertem Wasser hergestellt.

Stammlösungen wurden innerhalb kurzer Zeit aufgebraucht und während dieser Zeit

im Kühlschrank gelagert.

Die folgenden Lösungen, Puffer, Gele und Materialien wurden verwendet:

Elektrophoresepuffer, pH 8,3: 25 mM Tris-Base

192 mM Glycin

0,1 % (w/v) SDS

Sammelgelpuffer, pH 6,8: 250 mM Tris-Base

0,2 % (w/v) SDS

Trenngelpuffer, pH 8,8: 750 mM Tris-Base

0,2 % (w/v) SDS

Probenauftragspuffer: 25 % (w/v) Trenngelpuffer, pH 8,8

2 % (w/v) SDS

10 % (w/v) Glycerol

5 % (w/v) β-Mercaptoethanol

0,001 % (w/v) Bromphenolblau

Acrylamidlösung: 30 % (w/v) Acrylamid

0,8 % (w/v) Bisacrylamid

APS-Lösung: 2 % (w/v) Ammoniumpersulfat

12 %iges Trenngel: 15 ml Trenngelpuffer

12,3 ml Acrylamidlösung

2,7 ml Aq. bidest. 0,1 ml APS-Lösung

0,03 ml TEMED 30

5 %iges Sammelgel: 5 ml Sammelgelpuffer

1,7 ml Acrylamidlösung

3,3 ml Aq. bidest. 0,03 ml APS-Lösung

0,01 ml TEMED 30


60

Durchführung:

Zwei Glasplatten wurden durch zwei Abstandshalter (Dicke 1,5 mm) getrennt in den

Gießstand eingebaut. Das Trenngel wurde nach Vorschrift hergestellt und in den

Gießstand eingefüllt, so dass 11 cm Trennstrecke entstanden. Dieses Gel wurde mit

etwa 2 ml Aq. bidest. überschichtet und eine Stunde zur Polymerisation

stehengelassen. Danach wurde das Wasser wieder vollständig entfernt und der

Taschenkamm eingebaut. Je nach Probenaufkommen wurde ein Zehn- oder

Fünfzehn-Taschenkamm verwendet. Das Sammelgel konnte nun zwischen die

Glasplatten bis zur Oberkante eingefüllt werden. Hiernach polymerisierte auch dieses

Gel für eine Stunde, bevor der Kamm wieder vorsichtig entfernt werden konnte. Die

Probentaschen wurden mehrfach mit Elektrophoresepuffer gespült.

Die Proteinproben wurden mit Probenauftragspuffer verdünnt, so dass sie einen

Proteingehalt von 1-20 µg je nach Reinheitsgrad hatten. Diese Proteinverdünnungen

wurden etwa fünf Minuten bei 95 °C denaturiert und vor dem Probenauftrag fünf

Minuten bei 10.000 U*min-1 zentrifugiert.

Als Molekulargewicht-Marker wurde ein Low Molecular Weight Standard (Amersham

Biosciences, Freiburg) verwendet: Phosphorylase (Mr=98 kDa), Albumin

(Mr=66 kDa), Ovalbumin (Mr=45 kDa), Carboanhydrase (Mr=30 kDa), Trypsin

Inhibitor (Mr=20,1 kDa) und α-Lactalbumin (Mr=14,4 kDa).

Das Gel wurde in eine vertikale Elektrophoresekammer gehängt und mit

Elektrophoresepuffer überschichtet.

Laufbedingungen:

Während der Laufzeit im Sammelgel wurde eine konstante Stromstärke von 25 mA

angelegt. Nach Übergang ins Trenngel wurde diese Stromstärke auf 50 mA erhöht.

Die Trennung wurde beendet, wenn der Marker Bromphenolblau das Ende des

Trenngels erreicht hatte (ca. vier Stunden). Durch Kühlung konnte die Temperatur

konstant bei 10 °C gehalten werden.

Coomassie-Blau-Färbung:

Coomassie-Blau-Lösung: 2 % (w/v) Coomassie® Brilliant blue R 250

10 % (v/v) Eisessig

25 % (v/v) Isopropanol

Entfärbelösung: 12,5 % (v/v) Eisessig

12,5 % (v/v) Isopropanol


61

Das Gel wurde vorsichtig aus den Platten herausgelöst und für zwei Stunden in der

Coomassie-Blau-Lösung gefärbt. Danach wurde das Gel in der Entfärbelösung so

lange entfärbt, bis der Hintergrund weitestgehend farblos wurde und die Banden gut

zu erkennen waren.

Silberfärbung :

Zur Färbung wurde ein Bio-Rad Silver Stain Kit (Bio-Rad, München) verwendet. Die

Durchführung erfolgte nach den Angaben des Herstellers.

Trocknen der Gele:

Das gefärbte Gel wurde auf ein dafür vorgesehenes Filterpapier überführt und mit

einer Cellophan-Folie bündig abgedeckt. Danach wurde das Gel im Geltrockner bei

70 °C und Vakuum vier Stunden getrocknet.

2.2.2.8 Massenspektrometrische Analyse

Die Proteinbanden der SDS-PAGE wurden ausgeschnitten und der ESI-Analyse

zugeführt. Die reduzierten und alkylierten Proben wurden über Nacht durch Trypsin

hydrolysiert. Nach Einstellen eines sauren pH-Wertes wurden die Peptide des

Hydrolyse-Überstandes durch die nano-HPLC getrennt und mit ESI in der Q-TOF

MS/MS analysiert. Zuvor wurde das Massenspektrometer mit Renin kalibriert.

Die massenspektrometrischen Untersuchungen wurden freundlicher Weise von

Richard Jones, Ph. D. (Division of Systems Toxicology, FDA/NCTR, Jefferson, AR

72079) durchgeführt.

2.2.2.9 nit-1 Rekonstitutions-Analyse


Aktivität. In der nit-1 Mutante wird kein Molybdäncofaktor gebildet. Deshalb kann die

Nitratreduktaseaktivität nur durch extern zugegebenen Molybdäncofaktor

rekonstituiert werden. Entstehendes Nitrit wird über eine Azokupplungsreaktion

nachgewiesen.

Die Rekonstitution wurde mittels der Nitratreduktaseaktivität der nit-1 Mutante

(N. crassa) [Nason et al., 1971] bestimmt und freundlicherweise von Tanja Otte

(Technische Universität Braunschweig) nach folgendem Protokoll durchgeführt:


62

Die mikrosomalen Proteinproben wurden jeweils mit 20 µl nit-1 Extrakt, 5 mM

Molybdat und 2 mM Glutathion versetzt. Der Ansatz wurde fünf Minuten entgast und

in einem stickstoffgefüllten Exsikkator für zwei Stunden bei 25 °C dunkel inkubiert.

Anschließend wurde dem Reaktionsgemisch 0,1 mg NADPH zugefügt und für

10-15 Minuten bei Raumtemperatur unter Lichtausschluß inkubiert. Durch Zugabe

des 1,5-fachen Volumens der Reaktionslösung (100 mM KNO3/0,1 mM FAD (im

Verhältnis 2:1)) wurde die rekonstitutierte Nitratreduktase induziert und für 30

Minuten bei Raumtemperatur weiter inkubiert. Das Abstoppen der Induktion erfolgte

durch fünfminütiges Denaturieren bei 95 °C. Das Messprinzip beruht auf der

enzymatisch katalysierten Nitritbildung und deren Nachweis über eine

nachgeschaltete Azokupplung.

Das gebildete Nitrit wurde durch Zugabe von je 250 µl 1 %igem (w/v) Sulfanilamid

(in 3 M HCl) und 0,02 % (w/v) Naphthyl-Ethylendiamin bei 540 nm photometrisch

über eine zuvor erstellte Kalibriergerade quantifiziert.

Die Molybdäncofaktor-Aktivität wird in der vorliegenden Arbeit in

nmol Nitrit*min-1*µg-1 angegeben.

2.2.2.10 FormA Analyse

Die FormA Analyse wurde nach der Methode von Johnson und Rajagopalan [1982]

freundlicherweise von Tanja Otte (Technische Universität Braunschweig)

durchgeführt.

Die aufwendige Nachweisreaktion wurde für die Benzamidoxim-reduktaseaktiven

Fraktionen der Anionenaustauschchromatographie (Kapitel 2.2.1.3.4) durchgeführt.

Dabei wurden sowohl die molybdänhaltige als auch die molybdänfreie Form (Kap.

6.1.4) detektiert.

Der nachgewiesene Molybdopteringehalt ist in pmol FormA*mg-1 Protein angegeben.

2.2.2.11 Immunoblot-Analyse

Die Immunoblot-Analysen wurden freundlicherweise von Tanja Otte (Technische

Universität Braunschweig) nach folgendem Protokoll durchgeführt. Dabei wurden

nachstehende Pufferlösungen stets frisch hergestellt:


63

Transferpuffer: 10 % (v/v) Methanol

25 mM Tris-HCl

190 mM Glycin

(pH-Wert nicht eingestellt)

TBS-Puffer, pH 7,5: 10 mM Tris-HCl

150 mM NaCl

PonceauS-Lösung: 5 % (w/v) in TBS-Puffer

Blockierungslösung: 2 % (w/v) BSA in TBS-Puffer

TBSTXS-Puffer: 0,1 % (w/v) BSA

0,05 % (v/v) Triton® X-100

0,05 % (w/v) SDS

in TBS-Puffer

Das SDS-Gel mit den aufgetrennten SDS-Banden wurde für etwa zehn Minuten in

Transferpuffer äquilibriert. Für den Transfer der Proteine in einem diskontinuierlichen

semi-dry-Blot auf die Trägermembran (HybondTM-P, Amersham Biosciences, Freiburg;

Roti®-PVDF, Roth GmbH Co. KG, Karlsruhe) wurden vier Lagen

transferpuffergetränktes Whatman-Papier luftblasenfrei auf die Apparatur gelegt,

bevor die Membran (zuvor mit Methanol benetzt, mit Wasser gewaschen und in

Transferpuffer äquilibriert), das Gel mit der Oberseite nach unten und weiteren vier

Lagen Whatman-Papier aufgebracht wurden. Das Blotten erfolgte bei 32 mA mit

0,8 mA*cm-2 für zwei Stunden. Nach Waschen des Blots in TBS-Puffer wurden die

transferierten Proteine reversibel mit PonceauS-Lösung angefärbt.

Für den immunologischen Nachweis der transferierten Proteine wurde die Membran

für eine Stunde bei Raumtemperatur in Blockierlösung inkubiert, bevor der 1:7000 in

Blockierungslösung verdünnte Antikörper (gerichtet und aufgereinigt gegen den

rekombinanten C-Terminus der Molybdäncofaktor-Sulfurase ABA3 aus A. thaliana)

zugegeben wurde. Um unspezifisch gebundene Antikörper zu entfernen, wurde nach

zweistündiger Inkubation bei Raumtemperatur unter Schwenken die Membran

dreimal acht Minuten mit TBSTXS-Puffer und anschließend einmal zehn Minuten mit

0,8 % (w/v) NaCl-Lösung gewaschen. An eine erneute fünfminütige Blockierung

schloss sich die Inkubation mit dem sekundären horseradish-peroxidase-linked

Antikörper Anti-Rabbit-IgG (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Verdünnung

1:10000) für weitere 90 Minuten bei Raumtemperatur unter Schwenken an. Nach


64

erneutem Waschen mit TBSTXS-Puffer und 0,8 % NaCl-Lösung erfolgte die ECL

Detektion nach dem Standardprotokoll des Herstellers (Amersham Biosciences,

Freiburg).

2.2.3 Analytische Methoden zur Charakterisierung der Benzamidoxim-Reduktase

2.2.3.1 Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin

Die N-reduktive Aktivität wurde in der vorliegenden Arbeit über die Reduktion von

Benzamidoxim zu Benzamidin bestimmt. Benzamidoxim wurde hierbei als

Modellsubstanz verwendet.

2.2.3.1.1 Synthese von Benzamidoxim

Benzamidoxim wurde nach der Methode von Krüger [1885] aus Benzonitril und

Hydroxylamin synthetisiert und nach den üblichen Methoden auf Identität und

Reinheit geprüft.

2.2.3.1.2 Inkubationsbedingungen

Die Inkubationen wurden in verschlossenen 1,5 ml Reaktionsgefäßen in einem

Schüttelwasserbad bei 37 °C durchgeführt. Ein typischer Inkubationsansatz für die

mikrosomalen Biotransformationsstudien setzte sich aus 100 µg mikrosomalem

Protein, 500 µM NADH und 800 µM Benzamidoxim in 300 µl eines 100 mM

Kaliumphosphatpuffers pH 6,3 zusammen.

Zunächst wurden die Mikrosomen bei 37 °C zwei Minuten vorinkubiert, dann das

Benzamidoxim zugegeben und nach weiteren drei Minuten Vorinkubation die

Reaktion durch Zugabe von NADH gestartet. Nach 20 Minuten wurde die Reaktion

durch Zugabe von 300 µl Methanol gestoppt. Die Proben wurden fünf Minuten

geschüttelt und danach für mindestens 60 Minuten bei -20 °C eingefroren. Eine

anschließende Zentrifugation bei 12.000 g trennte das denaturierte Protein ab.

Gebildetes Benzamidin wurde mittels der unter Kapitel 2.2.3.1.3 beschriebenen

Analytik quantifiziert.


65

2.2.3.1.3 HPLC-Analytik

In Anlehnung an die von Friedrich [2003] entwickelte Methode wurde gebildetes

Benzamidin mittels HPLC-Analytik bestimmt.

Der Eluent wurde durch einen Sartorius® Membranfilter (0,45 µm) per

Vakuumfiltration von Partikeln befreit. Vor der Verwendung wurde der Eluent

15 Minuten im Ultraschallbad entgast.

HPLC-Pumpe und Controller: Waters 600 E Multisolvent Delivery System

Detektor: Waters 486 TAD UV

Autosampler: Waters 700 Satellite WISP

Integrator: EZChrom Client Chromatography Software Version

2.8.3 (Scientific Software Inc., San Ramon, CA)

Stationäre Phase: LiChroCART 250-4 HPLC-Kartusche mit LiChrospher®

60 RP-select B (5 µm), Vorsäule RP-select B,

4 x 4 mm (Merck, Darmstadt)

Mobile Phase: 10 mM 1-Octylsulfonat in Aq. bidest./Acetonitril

82,5:17,5 (v/v) (pH-Wert nicht eingestellt)

Laufzeit: 28 min

Flussrate: 1 ml/min

Injektionsvolumen: 20 µl


Die Retentionszeiten lagen bei 8,0 ± 0,2 Minuten (Benzamidoxim) und 24,2 ±

0,2 Minuten (Benzamidin).

Die Kalibrierung zur Validierung der quantitativen Bestimmung des Metaboliten

Benzamidin erfolgte mit sieben verschiedenen Konzentrationen im Bereich 0-250 µM

in Fließmittel gelöst und wurde mittels der beschriebenen HPLC-Analytik vermessen.

Für jede Konzentration wurden zwei Ansätze parallel pipettiert, die jeweils doppelt


66

vermessen wurden. In diesem Bereich verlief die Kalibrierung linear mit einem

Korrelationskoeffizienten von r2=0,9997. Zur Bestimmung der Wiederfindungsrate

wurde den Inkubationsansätzen die für die Kalibrierung verwendeten Benzamidin-

Konzentrationen zugesetzt. In Abwesenheit des Cosubstrates NADH sowie nach

Denaturierung der Proteinpräparation wurden die Proben analog zur Methode

2.2.3.1.2 vermessen. Benzamidin konnte im angegebenen Konzentrationsbereich (bis

250 µM) quantifiziert werden. Die Wiederfindungsrate betrug 98±9 %.

2.2.3.1.4 Anaerobe Inkubationsbedingungen

Der Inkubationsansatz entsprach der in Kapitel 2.2.3.1.2 beschriebenen

Standardzusammensetzung.

Für die Durchführung wurden Modifikationen vorgenommen. Protein und Substrat

wurden in einem mit Argon begasten Exsikkator mit 37 °C warmen

Kaliumphosphatpuffer vorinkubiert. Während dieser Vorinkubationszeit wurde der

Exsikkator dreimal evakuiert und erneut mit Argon befüllt. Nach Starten der Reaktion

durch Zugabe des Cosubstrates wurden die Reaktionsgefäße in der Argonatmosphäre

verschlossen und im 37 °C Schüttelwasserbad inkubiert. Nach 20 Minuten wurde die

Reaktion durch Zugabe von 300 µl Methanol gestoppt. Die Proben wurden fünf

Minuten geschüttelt und danach für mindestens 60 Minuten bei -20 °C eingefroren.

Eine anschließende Zentrifugation bei 12.000 g trennte das denaturierte Protein ab.



2.2.3.1.5 Hemmstudien


Schüttelwasserbad bei 37 °C durchgeführt. Sofern nicht anders angegeben, wurde

die für die mikrosomale Fraktion gültige Standardzusammensetzung (s. Kapitel

2.2.3.1.2) unter Standardbedingungen verwendet.

IC50 Inhibitorkonzentrationen wurden mit dem Programm Sigma Plot 8.0 (SPSS Inc.,

Chicago, USA) berechnet.

Je nach Hemmstoff wurden einzelne Modifikationen durchgeführt. Um allen

Hemmstoffen ausreichend Zeit zu bieten mit den Enzymen wechselwirken zu können,

ohne dabei durch das Substrat gestört zu werden, wurden die Reaktionen nicht wie

üblich durch das Cosubstrat gestartet, sondern mit dem Substrat selbst.


67

2.2.3.1.5.1 Kaliumcyanid

Es wurde eine 30-minütige Vorinkubation des Proteins mit Kaliumcyanid und NADH

im 37 °C Schüttelwasserbad durchgeführt. Danach wurde die Reaktion durch Zugabe

des Substrates Benzamidoxim gestartet. Die Reaktion wurde nach 20 Minuten durch

Zugabe von 300 µl Methanol gestoppt. Die Proben wurden fünf Minuten geschüttelt,

mindestens 60 Minuten bei -20 °C eingefroren, fünf Minuten bei 12.000 g

zentrifugiert und anschließend nach der unter Kapitel 2.2.3.1.3 beschriebenen

Methode quantifiziert.

2.2.3.1.5.2 Hydroxylamin-HCl

Es wurde eine fünfminütige Vorinkubation des Proteins mit Hydroxylamin-HCl und

NADH im 37 °C Schüttelwasserbad durchgeführt. Danach wurde die Reaktion durch

Zugabe des Substrates Benzamidoxim gestartet. Die Reaktion wurde nach

20 Minuten durch Zugabe von 300 µl Methanol gestoppt. Die Proben wurden fünf

Minuten geschüttelt, mindestens 60 Minuten bei -20 °C eingefroren, fünf Minuten bei

12.000 g zentrifugiert und anschließend nach der unter Kapitel 2.2.3.1.3

beschriebenen Methode quantifiziert.

2.2.3.1.5.3 p-Hydroxymercuribenzoat

Es wurde eine fünfminütige Vorinkubation des Proteins mit p-Hydroxymercuribenzoat

und NADH im 37 °C Schüttelwasserbad durchgeführt. Danach wurde die Reaktion

durch Zugabe des Substrates Benzamidoxim gestartet. Die Reaktion wurde nach





2.2.3.1.5.4 Cytochrom c

Es wurde eine fünfminütige Vorinkubation des Proteins mit Cytochrom c und NADH






68



2.2.3.1.5.5 Kohlenmonoxid

Die Inkubationen wurden in verschlossenen 15 ml Reaktionsgefäßen in einem



Protein, 500 µM NADH, 800 µM Benzamidoxim in 2 ml eines 100 mM


Zunächst wurden die Mikrosomen bei 37 °C mit Benzamidoxim zwei Minuten

vorinkubiert, dann 30 Sekunden mit Kohlenmonoxid begast und nach weiteren fünf

Minuten Vorinkubation die Reaktion durch Zugabe von NADH gestartet. Nach

20 Minuten wurde die Reaktion durch Zugabe von 2 ml Methanol gestoppt. Die

Proben wurden fünf Minuten geschüttelt und danach für mindestens 60 Minuten bei

-20 °C eingefroren. Eine anschließende Zentrifugation bei 12.000 g trennte das

denaturierte Protein ab. Gebildetes Benzamidin wurde mittels der unter Kapitel

2.2.3.1.3 beschriebenen Analytik quantifiziert.

2.2.3.1.5.6 Natriumvanadat

Es wurde eine fünfminütige Vorinkubation des Proteins mit Natriumvanadat und







2.2.3.1.6 Rekonstitution des P450-Isoenzyms zur Reduktion von Benzamidin

Die Zusammensetzung und Durchführung erfolgte modifiziert nach Clement et al. [1997] sowie Clement und Lopian [2003]. Die Inkubationen wurden in

verschlossenen 1,5 ml Reaktionsgefäßen in einem Schüttelwasserbad bei 37 °C

durchgeführt. Ein typischer Inkubationsansatz für die rekonstituierten mikrosomalen

Biotransformationsstudien setzte sich aus 10 µg gereinigter mikrosomaler

N-reduktiver Enzymfraktion, 0,05 U NADH-Cytochrom b5 Reduktase, 100 pmol


69

Cytochrom b5, 1000 µM NADH und 500 µM Benzamidoxim in 150 µl eines 100 mM


Zunächst wurde das rekonstituierte System bei 37 °C zwei Minuten vorinkubiert und

dann das Benzamidoxim zugegeben. Nach weiteren drei Minuten Vorinkubation

wurde die Reaktion durch Zugabe von NADH gestartet und nach 20 Minuten durch

Zugabe von 150 µl Methanol gestoppt. Die Proben wurden fünf Minuten geschüttelt

und danach für mindestens 60 Minuten bei -20 °C eingefroren. Eine anschließende

Zentrifugation bei 12.000 g trennte das denaturierte Protein ab. Gebildetes

Benzamidin wurde mittels der unter Kapitel 2.2.3.1.3 beschriebenen Analytik

quantifiziert.

2.2.3.2 O-Demethylierung von Dextromethorphan

Die Markeraktivität für CYP2D6 wurde in der vorliegenden Arbeit über die

O-Demethylierung von Dextromethorphan zu Dextrorphan bestimmt.





Protein, 200 µM NADPH und 100 µM Dextromethorphan in 300 µl eines 40 mM

Kaliumphosphatpuffers pH 7,4 mit 3,3 mM Magnesiumchlorid zusammen.

Zunächst wurden die Mikrosomen bei 37 °C zwei Minuten vorinkubiert und dann das

Dextromethorphan zugegeben. Nach weiteren drei Minuten Vorinkubation wurde die

Reaktion durch Zugabe von NADPH gestartet und nach 30 Minuten durch Zugabe

von 300 µl Methanol gestoppt. Die Proben wurden fünf Minuten geschüttelt und

anschließend einer Zentrifugation bei 12.000 g unterzogen, die das denaturierte

Protein abtrennte. Gebildetes Dextrorphan wurde mittels der unter Kapitel 2.2.3.2.2

beschriebenen Analytik quantifiziert.


In Anlehnung an die von Harsdorf [1998] entwickelte Methode wurde gebildetes

Dextrorphan mittels HPLC-Analytik bestimmt.


70




HPLC-Pumpe und Controller: Waters 600

Detektor: Waters 474 Fluorescence Detector

Autosampler: Waters 717 plus



Stationäre Phase: Symmetry C18, 250 x 4,6 mm, Partikelgröße 5 µm

(Waters), Vorsäule Phenomenex C18, 4 x 3 mm

Mobile Phase: 1 % Essigsäure in Aq. bidest. (pH 4,5, eingestellt mit

konz. Ammoniak)/ Acetonitril 70:30 (v/v)

Laufzeit: 15 min

Flussrate: 0,9 ml/min


Detektion: Fluoreszenz: Ex 227 nm, Em 311 nm

Detektoreinstellung: Gain: 100; Attenuation: 128

Die Retentionszeiten lagen bei 8,3 ± 0,2 Minuten (Dextrorphan) und 11 ±

0,2 Minuten (Dextromethorphan).


Dextrorphan erfolgte mit vier verschiedenen Konzentrationen im Bereich 0-10 µM in

Fließmittel gelöst und wurde mittels der beschriebenen HPLC-Analytik vermessen. Für

jede Konzentration wurden zwei Ansätze parallel pipettiert, die jeweils doppelt



wurde den Inkubationsansätzen die für die Kalibrierung verwendeten Dextrorphan-


71

Konzentrationen zugesetzt. In Abwesenheit des Cosubstrates NADPH sowie nach


2.2.3.2.2 vermessen. Dextrorphan konnte im angegebenen Konzentrationsbereich

(0-10 µM) quantifiziert werden. Die Wiederfindungsrate betrug 115±4 %.

2.2.3.2.3 Rekonstitution der DEAE-Fraktionen zur O-Demethylierung von

Dextromethorphan

Die Zusammensetzung und Durchführung erfolgte modifiziert nach der Methode von

Möller [1997]. Die Inkubationen wurden in verschlossenen 1,5 ml Reaktionsgefäßen

in einem Schüttelwasserbad bei 37 °C durchgeführt. Ein typischer Inkubationsansatz

für die rekonstituierten mikrosomalen Biotransformationsstudien setzte sich aus 20 µl

DEAE-Fraktion (Kapitel 2.2.1.3.4), 0,5 U NADPH Cytochrom P450 Reduktase, 200 µM

NADPH, 100 µM Dextromethorphan und 40 µM DLPC in 150 µl eines 40 mM

Kaliumphosphatpuffers pH 7,4 mit 3,3 mM Magnesiumchlorid zusammen

Zunächst wurde das rekonstituierte System bei 37 °C zwei Minuten vorinkubiert,

dann das Dextromethorphan zugegeben und nach weiteren drei Minuten

Vorinkubation die Reaktion durch Zugabe von NADPH gestartet. Nach 60 Minuten

wurde die Reaktion durch Zugabe von 150 µl Methanol gestoppt. Die Proben wurden

fünf Minuten geschüttelt und anschließend einer Zentrifugation bei 12.000 g

unterzogen, die das denaturierte Protein abtrennte. Gebildetes Dextrorphan wurde

mittels der unter Kapitel 2.2.3.2.2 beschriebenen Analytik quantifiziert.


72

2.3 Ergebnisse

2.3.1 Solubilisationsstudien

Wie bereits in Kapitel 2.1.2 gezeigt, war die Solubilisation der Mikrosomen der

Ausgangsschritt zur Isolierung membrangebundener Proteine. Bezüglich ihrer

Solubilisationseffizienz wurden vier Detergentien verglichen. Dazu gehörten die für

die mikrosomale Benzamidoximreduktase aus Schweineleber bereits etablierten

Detergentien Thesit®, Cholat [Clement et al., 1997] sowie Emulgen 911®, welches

sehr häufig speziell zur Gewinnung von Cytochrom P450 Isoenzymen verwendet

wurde [Yoshimoto et al., 1986; Imaoka und Funae, 1986; Kastner und Neubert,

1991]. Zusätzlich wurde Zwittergent® 3-14 untersucht, dessen zwitterionischer,

ambiphiler Aufbau dem Phosphatidylethanolamin und Lecithin [Gonenne und Ernst,

1978] ähnelt und somit die natürlich vorkommende Membran am besten imitiert.

Es ist allgemein gültig, dass ein Protein als solubilisiert gilt, wenn es sich nach

Detergenzbehandlung im 100.000 g Überstand befindet [Hjelmeland, 1990].

Detergentien bringen oftmals ein falsch positives Ergebnis bei der Protein-

bestimmung nach der BCA-Methode [Brown et al., 1989] sowie einen nicht

vorhersehbaren Einfluss auf die Enzymaktivität. Daher wurde der nicht solubilisierte

Anteil des resultierenden 100.000 g Pellets hinsichtlich der Enzymaktivität

quantifiziert und gegen einen Kontrollansatz ohne Detergenz vermessen.

Die Solubilisationseffizienz der untersuchten Detergentien war teilweise

unterschiedlich. Thesit® und Emulgen® 911 zeigten sehr ähnliche Eigenschaften, so

dass die Daten stellvertretend an Thesit® gezeigt werden (Abb. 2.4).

Das anionische Tensid Cholsäure sowie das zwitterionische Tensid Zwittergent® 3-14

zeigten einen geringen Einfluß auf die N-reduktive Aktivität (Abb. 2.5-6) unter den

angegebenen Bedingungen.

Des Weiteren wurde für die einzelnen Detergentien neben der Effizienz auch der

Einfluss auf die Benzamidoxim-Reduktase untersucht. Dieses wurde durch Zugabe

steigender Mengen Detergenz zum Standardinkubationsansatz (Kapitel 2.2.3.1.2)

überprüft.

Die nichtionischen Detergentien Thesit® und Emulgen® 911 zeigten schon bei

geringen Konzentrationen im Standardinkubationsansatz eine starke Hemmwirkung

auf die Benzamidoxim-Reduktase-Aktivität (Abb. 2.4, Daten Emulgen® 911 nicht

gezeigt).


73

Hingegen war die Wirkung auf die Benzamidoxim-Reduktase-Aktivität der ionischen

Detergentien eher mild, im Fall des Zwittergent® 3-14 zu Beginn sogar aktivierend

(Abb. 2.5-6).

0,00

4,00

8,00

12,00

16,00

0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0

Thesit® [mM]

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1] Mikrosomenpellet

Mikrosomen

Abb. 2.4: Thesit® Solubilisation mit Schweinenierenmikrosomen: Die Solubilisation wurde nach der in Kapitel 2.2.1.3.1 beschriebenen Methode für die einzelnen Detergentien durchgeführt. Mittels des jeweils resuspendierten Proteinpellets wurde gebildetes Benzamidin nach der in Kapitel 2.2.3.1.4 beschriebenen HPLC-Analytik quantifiziert. Die hemmende Wirkung der Detergentien auf die N-reduktive Wirkung wurde in den angegebenen Konzentrationen nach der Methode in Kapitel 2.2.1.3.1 durchgeführt und mit der HPLC-Analytik in Kapitel 2.2.3.1.4 quantifiziert. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, die jeweils doppelt vermessen wurden.


74

0,002,004,006,008,00

10,0012,00

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Cholsäure [%]

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

MikrosomenpelletMikrosomen

Abb. 2.5: Cholsäure Solubilisation mit Schweinenierenmikrosomen: Die Solubilisation wurde nach der in Kapitel 2.2.1.3.1 beschriebenen Methode für die einzelnen Detergentien durchgeführt. Mittels des jeweils resuspendierten Proteinpellets wurde gebildetes Benzamidin nach der in Kapitel 2.2.3.1.4 beschriebenen HPLC-Analytik quantifiziert. Die hemmende Wirkung der Detergentien auf die N-reduktive Wirkung wurde in den angegebenen Konzentrationen nach der Methode in Kapitel 2.2.1.3.1 durchgeführt und mit der HPLC-Analytik in Kapitel 2.2.3.1.4 quantifiziert. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, die jeweils doppelt vermessen wurden.

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Zwittergent® 3-14 [mM]

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1] Mikrosmenpellet

Mikrosomen

Abb. 2.6: Zwittergent® 3-14 Solubilisation mit Schweinenierenmikrosomen: Die Solubilisation wurde nach der in Kapitel 2.2.1.3.1 beschriebenen Methode für die einzelnen Detergentien durchgeführt. Mittels des jeweils resuspendierten Proteinpellets wurde gebildetes Benzamidin nach der in Kapitel 2.2.3.1.4 beschriebenen HPLC-Analytik quantifiziert. Die hemmende Wirkung der Detergentien auf die N-reduktive Wirkung wurde in den angegebenen Konzentrationen nach der Methode in Kapitel 2.2.1.3.1 durchgeführt und mit der HPLC-Analytik in Kapitel 2.2.3.1.4 quantifiziert. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, die jeweils doppelt vermessen wurden.


75

2.3.1.1 Polyethylenglykol 6000 Fällung

Die Polyethylenglykol 6000 Fällung diente der selektiven Isolierung der

Benzamidoxim-Reduktase aus den solubilisierten Mikrosomen. In Abbildung 2.7 ist zu

sehen, dass mit dieser Methode keine selektive Fällung der Benzamidoxim-Reduktase

aus solubilisierten Schweinenierenmikrosomen zu erreichen ist.

0

4

8

12

16

0-6 6-9 9-12 12-15 15-18 18-21 21-24

Polyethylenglycol 6000 Konzentration [%]

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

0

10

20

30

40

50

60

Prot

eink

onze

ntra

tion

[mg*

ml-1

]

Abb. 2.7: Polyethylenglykol 6000 Fällung nach Solubilisation von Schweinenierenmikrosomen: Die Solubilisation wurde nach der in Kapitel 2.2.1.3.1 beschriebenen Methode durchgeführt, die Polyethylenglykol 6000 Fällung nach Kapitel 2.2.1.3.1.1. Mittels des jeweils resuspendierten Proteinpellets wurde gebildetes Benzamidin nach der in Kapitel 2.2.3.1.4 beschriebenen HPLC-Analytik quantifiziert. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, die jeweils doppelt vermessen wurden. Die Proteingehälter sind nach der Methode in Kapitel 2.2.2.1 bestimmt worden.

2.3.2 Hydrophobe Interaktionschromatographie an Octyl-Sepharose CL-4B®

In Anlehnung an die Methode von Clement et al. [1997] wurde nach der

erfolgreichen Solubilisation eine Hydrophobe Interaktionschromatographie an Octyl-

Sepharose CL-4B® angeschlossen. Mit dieser Chromatographie sollten die zwei

Elektronentransportproteine Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5 Reduktase sowie

die weitere gesuchte dritte Komponente in Fraktionen abgetrennt werden. Die

etablierte Methode zur Auftrennung des Solubilisationsansatzes der

Schweinelebermikrosomen war auf die Schweinenierenmikrosomen nicht zu


76

übertragen, da die Enzyme auf der Säule nicht voneinander getrennt werden

konnten.

Aufbauend auf die Ergebnisse aus den Leberuntersuchungen wurde eine neue

Methode zur Auftrennung der Schweinenierenmikrosomen an Octyl-Sepharose

CL 4B® entwickelt. Durch eine stufenweise Erniedrigung der Salzkonzentration und

gleichzeitige Erhöhung der Detergenzmenge konnten die solubilisierten Proteine in

unterschiedliche Fraktionen aufgetrennt werden. 1000 mg Mikrosomen wurden

zunächst eine Stunde auf Eis solubilisiert (Endkonzentrationen nach

Mikrosomenzugabe: 100 mM Kaliumphosphat, 1 mM EDTA, 0,5 mM Dithiothreitol,

0,5 M Natriumchlorid, 20 % (w/v) Glycerol, 0,6 % Cholsäure, pH 7,4) und

anschließend eine Stunde bei 100.000 g zentrifugiert, um nicht-solubilisiertes Protein

abzutrennen. Der Überstand aus der Zentrifugation wurde mit einer Flussrate von

0,313 ml*min-1 auf die äquilibrierte Säule aufgetragen. Danach folgte ein Spülen der

Säule mit Eluent 1 (gleiche Bedingungen wie Solubilisationslösung) bis zur deutlichen

Abnahme der Absorption bei 244 nm. Die Flussrate wurde ab Eluent 2 (100 mM

Kaliumphosphat, 1 mM EDTA, 0,5 mM Dithiothreitol, 0,4 M Natriumchlorid, 20 %

(w/v) Glycerol, 0,5 % Cholsäure, 0,1 % Emulgen® 911, pH 7,4) auf 0,83 ml*min-1

erhöht. Da in den eingesetzten Eluenten Emulgen® 911 enthalten war, welches bei

280 nm (Verfolgung NADH Cytochrom b5 Reduktase) eine starke Eigenabsorption

besaß, wurde das Absorptionsminimum des Detergenzes (244 nm) zur Vermessung

genutzt. Durch Wechsel auf Eluent 2 konnte eine Fraktion von der Säule gespült

werden, die unter anderem Cytochrom b5 enthielt. Anschließend wurde der

Salzgehalt mit Eluent 3 (100 mM Kaliumphosphat, 1 mM EDTA, 0,5 mM Dithiothreitol,

20 % (w/v) Glycerol, 0,2 % Cholsäure, 0,4 % Emulgen® 911, pH 7,4) weiter

erniedrigt und gleichzeitig die Detergenzkonzentration erhöht, so dass eine Fraktion

von der Säule eluiert wurde, welche mit NADH Cytochrom b5 Reduktase und

Cytochrom P450 Isoenzymen angereichert war. Schließlich wurden mit Eluent 4

(100 mM Kaliumphosphat, 1 mM EDTA, 0,5 mM Dithiothreitol, 20 % (w/v) Glycerol,

1,0 % Emulgen® 911, pH 7,4) alle noch verbliebenen Proteine von der Säule gespült

(Abb. 2.8).

Die jeweiligen Identitäten der Enzyme wurden mittels SDS-Polyacrylamid-

gelelektrophorese bestätigt. Testinkubationen waren mit diesen Fraktionen nicht

sofort möglich. Es musste zunächst eine Entfernung des Detergenzes erfolgen

(Kapitel 2.2.1.3.6), da die eingesetzten Tenside in schon sehr geringen

Konzentrationen die Reduktion von Benzamidoxim hemmten (Kapitel 2.3.1).


77

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

0 20 40 60 80 100 120 140

Fraktion

Abs

orpt

ion

244 nm417 nm

Eluent 1

Eluent 2Eluent 3

Eluent 4

Abb. 2.8: Elutionsprofil von Schweinenierenmikrosomen nach Hydrophober Interaktionschromatographie an Octyl-Sepharose CL-4B®. Die chromatographischen Bedingungen sind in Kapitel 2.3.2 beschrieben.

2.3.3 Präparative HPLC an Fractogel® EMD TMAE 650 (S)

Aufbauend auf die Ergebnisse von Lomb [1995] wurde eine Methode entwickelt,

welche die gebundenen Proteine mit einem Stufengradienten wieder von der

Fractogel® EMD TMAE 650 (S) Säule eluierte (Kapitel 2.2.1.3.3). Das typische

Elutionsprofil einer Trennung an dem Anionenaustauscher ist in Abbildung 2.9

dargestellt. Das Profil wurde bei 244 nm aufgenommen, dem Absorptionsminimum

des verwendeten Detergenzes.

Cytochrom P450 wurde nach der in Kapitel 2.2.2.5 beschriebenen Methode

vermessen und konnte in den ersten zwei Fraktionen detektiert werden. NADH

Cytochrom b5 Reduktase konnte nach der in Kapitel 2.2.2.4 beschriebenen Methode

in der Fraktion, welche mit 200 mM Natriumacetat eluiert wurde, bestimmt werden.

Testinkubationen der Fraktionen waren mit diesen Fraktionen nicht sofort möglich. Es

musste zunächst eine Entfernung des Detergenzes erfolgen (Kapitel 2.2.1.3.6), da

das eingesetzte Tensid in schon sehr geringer Konzentration die Reduktion von

Benzamidoxim hemmte (Kapitel 2.3.1).


78

Abb. 2.9: Trennung der NADH Cytochrom b5 reduktasehaltigen Fraktion durch präparative HPLC an Fractogel® TMAE 650 (S). Die Elution erfolgte durch Verwendung eines Natriumacetat-Stufengradienten. Die chromatographischen Bedingungen sind in Kapitel 2.2.1.3.3 beschrieben.

2.3.4 Anionenaustauschchromatographie an DEAE-Cellulose

2.3.4.1 Solubilisation der Schweinenierenmikrosomen für die Anionen-austauschchromatographie an DEAE-Cellulose

In der vorliegenden Arbeit wurden die Erkenntnisse von Havemeyer [2006], dass bei

einem Protein-/Detergenzverhältnis von zwei mit Zwittergent® 3-14 eine effiziente

Solubilisation von äußeren Membranvesikeln der Schweinelebermitochondrien vorlag

zu Grunde gelegt und für die Schweinenierenmikrosomen getestet. Es konnte

ebenfalls kein anderer Effekt festgestellt werden (Daten nicht gezeigt). Ein

Protein-/Detergenzverhältnis von 4 reichte für eine effektive Solubilisation schon aus.

Die eingesetzte Detergenzkonzentration hatte keinen Einfluss auf die N-reduktive

Aktivität. Selbst eine Verminderung der Proteinmenge bei konstanter

Detergenzmenge hatte kaum einen inhibitorischen Effekt.

Zeit [min]

800

400

300

200

100

0

Natriumacetat [mM]


79

2.3.4.2 Protein-Verlaufskontrolle

Schweinenierenmikrosomen wurden nach der Solubilisation auf die Ionenaustausch-

Säule aufgetragen.

Dabei wurde nicht-bindendes Protein durch Spülen mit dem zweifachen

Säulenvolumen mit Äquilibrierpuffer eluiert. Die Fraktionen 10-28 bildeten hierbei die

nicht-bindende Fraktion. Dieses war durch den Absorptionsanstieg bei 280 nm zu

verfolgen (Abb. 2.10). Anschließend wurde in einem linearen Gradienten mittels

Gradientenmischer der Elutionspuffer zugemischt. Natriumchlorid konnte somit in der

Konzentration 0-1 M stetig zugefügt werden. Die Fraktionen 40-68 und 70-80

bildeten die bindenden Proteinfraktionen. Die Fraktionen wurden aliquotiert und bei

-80 °C gelagert. Eine Minderung der enzymatischen Aktivität war nach dem Auftauen

nicht festzustellen.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 20 40 60 80

Fraktion

Abs

orpt

ion

0,0

0,5

1,0

Nat

rium

chlo

rid

[M]

NaCl-Konzentration280 nm

Abb. 2.10: Elutionsprofil der solubilisierten Mikrosomen aus Schweinenieren nach Anionenaustauschchromatographie an DEAE. Die Mikrosomen wurden nach der in Kapitel 2.2.1.3.4.1 beschriebenen Methode solubilisiert. Auftrag und Elution erfolgten nach der in Kapitel 2.2.1.3.4 beschriebenen Methode.


80

2.3.4.3 Cytochrom b5-Verlaufskontrolle

Von jeweils 200 µl Cytochrom b5 wurde ein dithionitreduziertes Differenzspektrum

aufgenommen und nach der in Kapitel 2.2.2.3 beschriebenen Methode ausgewertet

[Estabrook und Werringloer, 1978]. In den Fraktionen 19-25 und 48-50 konnte

Cytochrom b5 detektiert werden (Abb. 2.11). Die Enzymaktivität wurde auf den in

den jeweiligen Fraktionen vorliegenden Proteingehalt bezogen. Die Messungen sind

stets Einzelmessungen.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 20 40 60 80

Fraktion

Abs

orpt

ion

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

Enzy

mak

tivitä

t [n

mol

*mg-1

]

Cytochrom b5280 nmCytochrom b5

Abb. 2.11: Elutionsprofil der solubilisierten Mikrosomen aus Schweinenieren von Cytochrom b5 nach Anionenaustauschchromatographie an DEAE. Die Mikrosomen wurden nach der in Kapitel 2.2.1.3.4.1 beschriebenen Methode solubilisiert. Auftrag und Elution erfolgten nach der in Kapitel 2.2.1.3.4 beschriebenen Methode.


81

2.3.4.4 NADH Cytochrom b5 Reduktase-Verlaufskontrolle

Jeweils 50 µl der Fraktionen wurden auf NADH Cytochrom b5 Reduktase-Aktivität hin

untersucht und nach der in Kapitel 2.2.2.4 beschriebenen Methode ausgewertet

[Mihara und Sato, 1978]. Vor allem in den Fraktionen 45-59 konnte NADH Cytochrom

b5 Reduktase detektiert werden (Abb. 2.12). Die Enzymaktivität wurde auf den in

den jeweiligen Fraktionen vorliegenden Proteingehalt bezogen. Die Messungen sind

stets Einzelmessungen.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 20 40 60 80

Fraktion

Abs

orpt

ion

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Enzy

mak

tivitä

t [U

*mg-1

]280 nmNADH Cytochrom b5 Reduktase

Abb. 2.12: Elutionsprofil der NADH Cytochrom b5 Reduktase von solubilisierten Mikrosomen aus Schweinenieren nach Anionenaustauschchromatographie an DEAE. Die Mikrosomen wurden nach der in Kapitel 2.2.1.3.4.1 beschriebenen Methode solubilisiert. Auftrag und Elution erfolgten nach der in Kapitel 2.2.1.3.4 beschriebenen Methode.

2.3.4.5 Cytochrom P450-Verlaufskontrolle

Jeweils 300 µl der Fraktionen wurden auf Cytochrom P450-Aktivität nach der in

Kapitel 2.2.2.5 beschriebenen Methode hin untersucht [Omura und Sato, 1964]. Es

konnte keine Cytochrom P450-Aktivität detektiert werden (Daten nicht gezeigt).


82

2.3.4.6 Monoaminoxidase-Verlaufskontrolle

Jeweils 50 µl der Fraktionen wurden auf Monoaminoxidase-Aktivität hin untersucht

und nach der in Kapitel 2.2.2.6 beschriebenen Methode ausgewertet [Kline et al., 1986]. Vor allem in den Fraktionen 46-57 konnte Monoaminoxidase detektiert

werden (Abb. 2.13). Die Enzymaktivität wurde auf den in den jeweiligen Fraktionen

vorliegenden Proteingehalt bezogen. Die Messungen sind stets Einzelmessungen.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 20 40 60 80 100

Fraktion

Abs

orpt

ion

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

Enzy

mak

tivitä

t [U

*mg-1

]

Monoaminoxidase

280 nm

Abb. 2.13: Elutionsprofil der Monoaminoxidase nach Anionenaustauschchromatographie an DEAE. Die Mikrosomen wurden nach der in Kapitel 2.2.1.3.4.1 beschriebenen Methode solubilisiert. Auftrag und Elution erfolgten nach der in Kapitel 2.2.1.3.4 beschriebenen Methode.

2.3.4.7 Benzamidoxim-Reduktase-Verlaufskontrolle ohne zusätzliche Enzyme


bestimmt. Die weitere Durchführung der Inkubation sowie die Aufarbeitung der

Inkubationsansätze sind in Kapitel 2.2.3.1.2 angegeben. Gebildetes Benzamidin

wurde mittels der unter Kapitel 2.2.3.1.3 beschriebenen Analytik quantifiziert. Ohne

Zugabe weiterer Enzyme wurde keine Aktivität in den Fraktionen gefunden (Daten

nicht gezeigt).


83

2.3.4.8 Benzamidoxim-Reduktase-Verlaufskontrolle mit zugesetzter gereinigter NADH Cytochrom b5 Reduktase


bestimmt. Das rekonstituierte System bestand aus 10 µl der entsprechenden DEAE-

Fraktion und 0,05 U NADH Cytochrom b5 Reduktase. Die weitere Durchführung der

Inkubation sowie die Aufarbeitung der Inkubationsansätze sind in Kapitel 2.2.3.1.2

angegeben. Gebildetes Benzamidin wurde mittels der unter Kapitel 2.2.3.1.3

beschriebenen Analytik quantifiziert. In den Fraktionen 42-57 konnte Benzamidoxim-

Reduktase-Aktivität (42-49 und 52-57) detektiert werden (Abb. 2.14). Der

Proteingehalt der zugesetzten DEAE-Fraktion bildete die Grundlage zur Berechnung

der Aktivität. Die Inkubationen sind stets Einzelinkubationen, die doppelt vermessen

wurden.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 20 40 60 80

Fraktion

Abs

orpt

ion

0

5

10

15

20

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

Benzamidoxim-Reduktase Aktivität

280 nm

Abb. 2.14: Elutionsprofil der Benzamidoxim-Reduktase mit zugesetzter gereinigter NADH Cytochrom b5 Reduktase nach Anionenaustauschchromatographie an DEAE. Die Mikrosomen wurden nach der in Kapitel 2.2.1.3.4.1 beschriebenen Methode solubilisiert. Auftrag und Elution erfolgten nach der in Kapitel 2.2.1.3.4 beschriebenen Methode. Die Durchführung der Inkubation sowie Aufarbeitung der Inkubationsansätze sind in Kapitel 2.2.3.1.2 angegeben. Gebildetes Benzamidin wurde mittels der unter Kapitel 2.2.3.1.3 beschriebenen Analytik quantifiziert. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus einem Reaktionsansatz, welcher doppelt vermessen wurde.


84

2.3.4.9 Benzamidoxim-Reduktase-Verlaufskontrolle mit zugesetztem humanem rekombinantem Cytochrom b5



Fraktion und 170 pmol Cytochrom b5. Die weitere Durchführung der Inkubation

sowie die Aufarbeitung der Inkubationsansätze sind in Kapitel 2.2.3.1.2 angegeben.


Analytik quantifiziert. In den Fraktionen 42-57 konnte Benzamidoxim-Reduktase-

Aktivität (42-50 und 52-57) detektiert werden (Abb. 2.15). Der Proteingehalt der

zugesetzten DEAE-Fraktion bildet die Grundlage zur Berechnung der Aktivität. Die

Inkubationen sind stets Einzelinkubationen, die doppelt vermessen wurden.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 20 40 60 80

Fraktion

Abs

orpt

ion

0

5

10

15

20

25

30

35

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]


280 nm

Abb. 2.15: Elutionsprofil der Benzamidoxim-Reduktase mit zugesetztem humanem rekombinantem Cytochrom b5 nach Anionenaustauschchromatographie an DEAE. Die Mikrosomen wurden nach der in Kapitel 2.2.1.3.4.1 beschriebenen Methode solubilisiert. Auftrag und Elution erfolgten nach der in Kapitel 2.2.1.3.4 beschriebenen Methode. Die Durchführung der Inkubation sowie Aufarbeitung der Inkubationsansätze sind in Kapitel 2.2.3.1.2 angegeben. Gebildetes Benzamidin wurde mittels der unter Kapitel 2.2.3.1.3 beschriebenen Analytik quantifiziert. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus einem Reaktionsansatz, welcher doppelt vermessen wurde.


85

2.3.4.10 Benzamidoxim-Reduktase-Verlaufskontrolle mit zugesetzter gereinigter NADH Cytochrom b5 Reduktase und zugesetztem humanem rekombinantem Cytochrom b5



Fraktion, 0,05 U NADH Cytochrom b5 Reduktase und 170 pmol Cytochrom b5. Die

weitere Durchführung der Inkubation sowie die Aufarbeitung der Inkubationsansätze

sind in Kapitel 2.2.3.1.2 angegeben. Gebildetes Benzamidin wurde mittels der unter

Kapitel 2.2.3.1.3 beschriebenen Analytik quantifiziert. In den Fraktionen 41-59

konnte Benzamidoxim-Reduktase-Aktivität (42-51 und 53-59) detektiert werden

(Abb. 2.16). Der Proteingehalt der zugesetzten DEAE-Fraktion bildet die Grundlage

zur Berechnung der Aktivität. Die Inkubationen sind stets Einzelinkubationen, die

doppelt vermessen wurden.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 20 40 60 80

Fraktion

Abs

orpt

ion

0

100

200

300

400

500

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]


280 nm

Abb. 2.16: Elutionsprofil der Benzamidoxim-Reduktase mit zugesetzter gereinigter NADH Cytochrom b5 Reduktase und zugesetztem humanem rekombinantem Cytochrom nach Anionenaustauschchromatographie an DEAE. Die Mikrosomen wurden nach der in Kapitel 2.2.1.3.4.1 beschriebenen Methode solubilisiert. Auftrag und Elution erfolgten nach der in Kapitel 2.2.1.3.4 beschriebenen Methode. Die Durchführung der Inkubation sowie Aufarbeitung der Inkubationsansätze sind in Kapitel 2.2.3.1.2 angegeben. Gebildetes Benzamidin wurde mittels der unter Kapitel 2.2.3.1.3 beschriebenen Analytik quantifiziert. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus einem Reaktionsansatz, welcher doppelt vermessen wurde.


86

2.3.4.11 Dextromethorphan-O-Demethylierung

Die CYP2D6 Aktivität wurde mittels der O-Demethylierung von Dextromethorphan zu

Dextrorphan bestimmt. Das rekonstituierte System bestand aus 20 µl der

entsprechenden DEAE-Fraktion und 0,5 U NADPH Cytochrom P450 Reduktase. Die

weitere Durchführung der Inkubation sowie die Aufarbeitung der Inkubationsansätze

sind in Kapitel 2.2.3.2.3 angegeben. Gebildetes Dextrorphan wurde mittels der unter

Kapitel 2.2.3.2.2 beschriebenen Analytik quantifiziert. In den Fraktionen 41-46

konnte eine Dextromethorphan-O-Demethylierung Aktivität detektiert werden (Abb.

2.17). Der Proteingehalt der zugesetzten DEAE-Fraktion bildet die Grundlage zur

Berechnung der Aktivität. Die Inkubationen sind stets Einzelinkubationen, die doppelt

vermessen wurden.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 20 40 60 80

Fraktion

Abs

orpt

ion

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

Dex

tror

phan

[nm

ol*m

in-1*m

g-1]

Dextromethorphan O-Demethylierung Aktivität

280 nm

Dextromethorphan-O -Demethylierung Aktivität

Abb. 2.17: Elutionsprofil der Dextromethorphan-O-Demethylierung mit zugesetzter gereinigter NADPH Cytochrom P450 Reduktase nach Anionenaustauschchromatographie an DEAE. Die Mikrosomen wurden nach der in Kapitel 2.2.1.3.4.1 beschriebenen Methode solubilisiert. Auftrag und Elution erfolgten nach der in Kapitel 2.2.1.3.4 beschriebenen Methode. Die Durchführung der Inkubation sowie Aufarbeitung der Inkubationsansätze sind in Kapitel 2.2.3.2.3 angegeben. Gebildetes Dextrorphan wurde mittels der unter Kapitel 2.2.3.2.2 beschriebenen Analytik quantifiziert. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus einem Reaktionsansatz, welcher doppelt vermessen wurde.


87


Die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese wurde als Proteinverlaufskontrolle

durchgeführt. In Abbildung 2.18 sind die Fraktionen 42-57 dargestellt, welche

Benzamidoxim-Reduktase-Aktivitäten besaßen. Die umrahmten Banden in

Abbildung 2.18 wurden der massenspektrometrischen Analyse (Kapitel 2.3.4.11)

unterzogen.

Std. 42 43 44 45 Std. 46 47 48 49 50 51 52 Std. 53 54 55 Std. 56 57

Abb. 2.18: SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese-Profil von solubilisierten Mikrosomen aus Schweinenieren nach Anionenaustauschchromatographie an DEAE. Dargestellt sind die Fraktionen 42-57 und vier Molekulargewichtstandards (Std.) (97 kDa, 66 kDa, 45 kDa, 30 kDa, 20,1 kDa, 14,4 kDa). Das Gel wurde nach der in Kapitel 2.2.2.7 beschriebenen Methode hergestellt sowie aufgearbeitet. Das Gel zeigt die detektierten Banden nach Silberfärbung. Auftragen wurden jeweils 5 µg der jeweiligen Fraktion.


Die mittels SDS-PAGE aufgetrennten Proteinbanden der Benzamidoxim-Reduktase aktivsten Fraktion 46 wurden ausgeschnitten und der ESI-Analyse zugeführt. Die

Proben wurden über Nacht durch Trypsin hydrolysiert. Nach Einstellen eines sauren

pH-Wertes wurden die Peptide des Hydrolyse-Überstandes durch die nano-HPLC

getrennt und mit ESI in der Q-TOF MS/MS analysiert. Zuvor wurde das

Massenspektrometer mit Renin kalibriert.

Die so erhaltenen Peptidfragmente wurden mit Fragmenten einer elektronischen

Datenbank verglichen. Dabei wurden die in Tabelle 2.1 aufgeführten Enzyme mit

hoher Wahrscheinlichkeit den erhaltenen Peptidfragmenten zugeordnet.


88

Tab. 2.1: Sequenzanalyse der Proteinbanden aus Fraktion 46

66 kDa Bande

Phenylalanin-tRNA Synthetase-ähnliches Protein Isoform 1

Carboxylesterase Precursor

55 kDa Bande

Aldehyddehydrogenase Familie 3, Subfamilie A2

UDP-Glucuronosyltransferase

50 kDa Bande

Annexin VII Isoform 1

Betain-Homocystein Methyltransferase

35 kDa Bande

hypothetisches Protein

MOCO sulphurase C-terminal domain containing 2

ähnlich dem Mg87 Protein

32 kDa Bande

γ-Glutamyltranspeptidase

30 kDa Bande

mitochondrialer ADP-ATP Carrier

16 kDa Bande

Trypsin Precursor

Glutathion S-Transferase

Das hypothetische Protein der 35 kDa Bande konnte auf Grund der Peptidfragmente

mittels Datenbankrecherche (BlastP) als MOCO sulphurase C-terminal domain

containing 2 (Accession Nummer NP_060368) identifiziert werden. Weitere

Peptidfragmente konnten das MOCO sulphurase C-terminal domain containing 2

(Accession Nummer NP_598445) Protein identifizieren. Das Mg87 Protein der 35 kDa

Bande konnte ebenfalls der Familie der Molybdäncofaktor-bindenden Proteine

zugeordnet werden (Accession Nummer XP_536125). Im Stammbaum der Proteine


89

konnte mittels Datenbackrecherche (BlastP) eine eindeutige Zughörigkeit festgestellt

werden.

2.3.4.14 nit-1 Rekonstitutions-Assay


Aktivität. Die Rekonstitution wurde mittels der Nitratreduktaseaktivität der nit-1

Mutante (Neurospora crassa) [Nason et al., 1971] bestimmt und freundlicherweise

von Tanja Otte (Technische Universität Braunschweig) durchgeführt. Die Methode ist

in Kapitel 2.2.2.9 beschrieben. Die Enzymaktivität wurde auf den in den jeweiligen

Fraktionen vorliegenden Proteingehalt bezogen. Die Messungen sind stets

Mittelwerte aus Doppelbestimmungen. Hierbei wurden nicht alle Fraktionen der

Anionenaustauschchromatographie untersucht, sondern nur die Fraktionen, die eine

hohe Benzamidoxim-Reduktase-Aktivität aufwiesen.

In Tabelle 2.2 sind die nit-1 Aktivitäten der Mikrosomen und der Benzamidoxim-

Reduktase aktiven Fraktionen 45-47 dargestellt.

Tab. 2.2: nit-1 Aktivität von Schweinenierenmikrosomen sowie DEAE-Fraktionen 45-47

Fraktion nit-1 Aktivität

[nmol Nitrit*min-1*µg-1] Anreicherungsfaktor

Mikrosomen 0,22 ± 0,00 1

Fraktion 45 1,81 ± 0,13 8

Fraktion 46 1,86 ± 0,13 8

Fraktion 47 0,96 ± 0,06 4 Gebildetes Nitrit wurde über eine Azofarbstoffreaktion quantifiziert. Die ermittelten Daten sind Mittelwerte aus mindestens zwei Einzelmessungen.


Die FormA Analyse wurde nach der in Kapitel 5.2.2.10 beschriebenen Methode


durchgeführt. Hierbei wurden nicht alle Fraktionen der Anionenaustausch-

chromatographie untersucht, sondern nur die Fraktionen, die eine hohe

Benzamidoxim-Reduktase-Aktivität aufwiesen. Die erhaltenen Daten sind in Tabelle

2.3 dargestellt.


90

Tab. 2.3: FormA Analyse von Schweinenierenmikrosomen sowie DEAE-Fraktionen 45-47

Fraktion FormA

[pmol*mg-1] Anreicherungsfaktor

Mikrosomen 756 ± 22 1

Fraktion 45 15528 ± 334 21

Fraktion 46 8244 ± 412 11

Fraktion 47 6883 ± 111 9 Die ermittelten Daten sind Mittelwerte aus mindestens zwei Einzelmessungen.


Der gereinigte und gegen den rekombinanten C-Terminus der Mocosulfurase ABA3

aus A. thaliana gerichtete Antikörper erkannte spezifisch das identifizierte Enzym

Moco Sulfurase C-Terminus domain containing 2 in den Fraktionen 45-48

(Abb. 2.19).

45 46 47 48 Mikro Std. CT Std.

Abb. 2.19: Western Blot der solubilisierten Schweinenierenmikrosomen nach Anionenaustauschchromatographie an DEAE. Dargestellt sind die Fraktionen 45-48, Schweinenierenmikrosomen (Mikro), zwei Molekulargewichtstandards (Std.) (116 kDa, 66 kDa, 45 kDa, 35 kDa, 25 kDa) und eine C-terminale Domäne der humanen Mocosulfurase (CT) als Positivkontrolle. Aufgetragen wurden 1,5 µg der Fraktion 45, 2,4 µg der Fraktionen 46-48 und der Mikrosomen sowie 2,0 µg der C-terminalen Domäne der humanen Mocosulfurase (CT).


91

2.3.5 Kationenaustauschchromatographie an CM-Cellulose

Es wurden Mikrosomen nach der beschriebenen Methode [Havemeyer, 2006]

solubilisiert. Diese Methode wurde schon für die Anionenaustauschchromatographie

(Kapitel 2.3.4) getestet, eine weitere Optimierung war daher nicht erforderlich.

Es wurde die in Kapitel 2.2.1.3.5 beschriebene Methode durchgeführt. Dabei wurden

Veränderungen des Salzes (Tris-Acetat, Natriumchlorid), der Salzkonzentration

(jeweils 0-1 M), des Grundpuffers (Tris-Acetat, Natriumphosphat) sowie des pH-

Wertes durchgeführt. Eine Bindung des N-reduktiven Systems konnte unter keiner

der genannten Bedingungen erreicht werden.

2.3.6 Stabilität

Die Gewinnung von Mikrosomen und anschließende Reinigung der Enzympräparation

ist ein langer und zeitaufwendiger Prozess. Aus diesem Grund wurden Mikrosomen

unter unterschiedlichen Bedingungen gelagert und zu gleichen Zeitpunkten anhand

ihrer N-reduktiven Aktivität miteinander vergleichen (Abb. 2.20).

Die Lagerung bei -80 °C führte nach 35 Tagen zu keinem erkennbaren

Aktivitätsverlust. Bei einer Lagerungstemperatur von 4 °C hingegen nahm die

Aktivität der Mikrosomen innerhalb weniger Tage ab. Die solubilisierten Mikrosomen

zeigten bei der Lagerungstemperatur von 4 °C ebenfalls einen Aktivitätsverlust.

Dieser war allerdings wesentlich schwächer ausgeprägt als der Aktivitätsverlust der

unsolubilisierten Mikrosomen.


92

0

10

20

30

40

0 10 20 30

Tag

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

Mikrosomen bei -80 °Csolubilisierte Mikrosomen bei 4 °C gelagertMikrosomen bei 4 °C gelagert

Abb. 2.20: Stabilitätsuntersuchung der Schweinenierenmikrosomen unter unterschiedlichen Bedingungen. Schweinenierenmikrosomen wurden bei -80 °C, 4 °C sowie nach Solubilisation bei 4 °C gelagert und zum gleichen Zeitpunkt auf ihre N-reduktive Aktivität hin untersucht. Die Durchführung der Inkubation sowie die Aufarbeitung der Inkubationsansätze sind in Kapitel 2.2.3.1.2 angegeben. Gebildetes Benzamidin wurde mittels der in Kapitel 2.2.3.1.3 beschriebenen Analytik quantifiziert. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei Reaktionsansätzen, welche doppelt vermessen wurden.

2.3.7 Charakterisierung der Schweinenierenmikrosomen

2.3.7.1 Aktivitäten ausgewählter Enzyme in Schweinenieren-mikrosomen

2.3.7.1.1 NADPH Cytochrom P450 Reduktase

Die in dieser Arbeit gewonnenen Mikrosomen hatten einen mittleren NADPH

Cytochrom P450 Reduktase Gehalt von 0,464 ± 0,118 U*mg-1 (Kapitel 3.3.1.1). Die

Bestimmung erfolgte nach der Methode in Kapitel 2.2.2.2.

2.3.7.1.2 Cytochrom b5

Die mikrosomale Cytochrom b5 Bestimmung aus Schweinenieren ergab im Mittel

0,12 ± 0,03 nmol*mg-1. Die Bestimmung erfolgte nach der Methode in Kapitel

2.2.2.3.


93

2.3.7.1.3 NADH Cytochrom b5 Reduktase

Die mikrosomale NADH Cytochrom b5 Reduktase Bestimmung aus Schweinenieren

ergab im Mittel 3,25 ± 0,53 U*mg-1. Die Bestimmung erfolgte nach der Methode in

Kapitel 2.2.2.4.

2.3.7.1.4 Cytochrom P450

Die mikrosomale Cytochrom P450 Bestimmung aus Schweinenieren ergab im Mittel

0,19 ± 0,06 nmol*mg-1. Die Bestimmung erfolgte nach der Methode in Kapitel

2.2.2.5.

Außerdem wurde der spezifische Cytochrom P450 Gehalt unter Zugabe steigender

Konzentrationen des Detergenzes Zwittergent® 3-14 bestimmt. Hierbei wurde eine

stetige Abnahme des Cytochrom P450 Gehalts festgestellt, während gleichzeitig die

Zunahme eines Peaks bei 420 nm detektiert wurde. Die Abnahme des Cytochrom

P450 Gehaltes bei gleichzeitiger Zunahme des Peaks bei 420 nm ist in Abbildung 2.21

dargestellt.

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0 1 2 3 4 5


spez

. Cyt

ochr

om P

450

Geh

alt [n

mol

*mg-1

]

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05sp

ez. Pe

akhö

he b

ei42

0 nm

Cytochrom P450 Peakhöhe

Abb. 2.21: Korrelation der Cytochrom P450 Abnahme bei gleichzeitiger Zunahme des Peaks bei 420 nm nach Zugabe definierter Mengen Zwittergent® 3-14 zu Schweinenierenmikrosomen. Schweinenierenmikrosomen wurden nach der Methode in Kapitel 2.2.2.5 auf den spezifischen Gehalt von Cytochrom P450 untersucht. Gleichzeitig wurde das Detergenz Zwittergent® 3-14 in definierten Konzentrationen zugesetzt. Die ermittelten Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei Reaktionsansätzen.


94

2.3.7.1.5 Monoaminoxidase

Die in dieser Arbeit gewonnenen Mikrosomen hatten einen mittleren

Monoaminoxidase Gehalt von 6,0 ± 2,7 mU*mg-1 (Kapitel 3.3.1.2). Die Bestimmung

erfolgte nach der Methode in Kapitel 2.2.2.6.

2.3.7.2 Charakterisierung und Inkubationsoptimierung der N-reduktiven Aktivität von Benzamidoxim der Schweinenieren-mikrosomen

Die gewonnenen Schweinenierenmikrosomen wurden nach den Gesichtspunkten

Proteinkonzentration, Inkubationszeit, Cosubstratabhängigkeit und -art, pH-Wert und

Substratabhängigkeit für das Substrat Benzamidoxim untersucht. Es ergab sich dabei

der folgende, optimierte Inkubationsansatz (Kapitel 2.2.3.1.2): 100 µg mito-

chondriales Protein, 500 µM NADH und 800 µM Benzamidoxim in 300 µl eines

100 mM Kaliumphosphatpuffers pH 6,3 bei 20 Minuten Inkubationszeit.


95

2.3.7.2.1 pH-Wert

Die pH-Wertabhängigkeit ergab in einem Bereich von pH 4,0 bis pH 8,0 ein Optimum

bei pH 6,3 (Abb. 2.22).

0

5

10

15

20

4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8

pH-Wert

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

Abb. 2.22: pH-Wertabhängigkeit der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch Schweinenierenmikrosomen. Die Inkubationsansätze setzten sich wie folgt zusammen: 100 µg Protein, 1 mM NADH und 1 mM Benzamidoxim in 300 µl eines 100 mM Kaliumphosphatpuffers pH 4,0 8,0. Die Inkubationszeit betrug 20 Minuten. Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 2.2.3.1.2 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand nach der in Kapitel 2.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.


96

2.3.7.2.2 Substratabhängigkeit

Die Substratabhängigkeit des Benzamidoxims folgte einer Michaelis-Menten-Kinetik

(Abb. 2.23). Im Lineweaver-Burk-Plot betrug die Substratkonzentration bei

halbmaximaler Sättigung (Km) 2,3 mM und die maximale Reaktionsgeschwindigkeit

(Vmax) 84,0 nmol*min-1*mg-1. Die sich daraus ergebende katalytische Effizienz lag bei

3,62*10-5 min-1*mg-1.

0

5

10

15

20

0 1000 2000 3000

Benzamidin [µM]

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

Abb. 2.23: Substratabhängigkeit der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch Schweinenierenmikrosomen. Die Inkubationsansätze setzten sich wie folgt zusammen: 100 µg Protein, 1 mM NADH und 0-3 mM Benzamidoxim in 300 µl eines 100 mM Kaliumphosphatpuffers pH 6,3. Die Inkubationszeit betrug 20 Minuten. Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 2.2.3.1.2 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand nach der in Kapitel 2.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.


97

2.3.7.2.3 Cosubstratabhängigkeit und –art

Die Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin benötigte die Zugabe eines

Cosubstrates. NADH wurde hierbei gegenüber NADPH bevorzugt (Abb. 2.24). Ab

einer NADH-Konzentration von 800 µM kam es zu keiner nennenswerten Steigerung

der Umsetzungsrate.

Kontrollinkubationen ohne Cofaktor zeigten keine detektierbaren Mengen an

gebildetem Benzamidin.

0

5

10

15

20

25

0 500 1000 1500 2000

Cosubstrat [µM]

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

NADH-Abhängigkeit

NADPH-Abhängigkeit

Abb. 2.24: Cosubstratabhängigkeit und -art der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch Schweinenierenmikrosomen. Die Inkubationsansätze setzten sich wie folgt zusammen: 100 µg Protein, 0-2 mM Cosubstrat (NADH oder NADPH) und 800 µM Benzamidoxim in 300 µl eines 100 mM Kaliumphosphatpuffers pH 6,3. Die Inkubationszeit betrug 20 Minuten. Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 2.2.3.1.2 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand nach der in Kapitel 2.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.


98

2.3.7.3 Sauerstoffabhängigkeit der Reduktion von Benzamidoxim mittels Schweinenierenmikrosomen

Die Sauerstoffabhängigkeit der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin mittels

Schweinenierenmikrosomen wurden unter aeroben und anaeroben Bedingungen

getestet. Dabei war keine Abhängigkeit der Benzamidoxim-Reduktase von Sauerstoff

festgestellt (Abb. 2.25).

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

aerob anaerob

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

Abb. 2.25: Sauerstoffabhängigkeit der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch Schweinenierenmikrosomen. Die Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 2.2.3.1.2 und 2.2.3.1.4 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand nach der in Kapitel 2.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.

2.3.7.4 Hemmstudien

2.3.7.4.1 Kaliumcyanid

Der Cyanidioneneinfluss auf die Reduktion von Benzamidoxim durch

Schweinenierenmikrosomen wurde nach der in Kapitel 2.2.3.1.5.1 beschriebenen

Methode durchgeführt. Hierbei konnte eine Hemmung festgestellt werden

(Abb. 2.26). Es blieb eine Restaktivität von etwa 40 % der Ausgangsaktivität

erhalten. Die ermittelte IC50 ergab 419 µM.


99

0

5

10

15

0 500 1000 1500 2000

Cyanid [µM]

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

Abb. 2.26: Hemmung der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch Schweinenierenmikrosomen in Gegenwart von Kaliumcyanid. Die Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 2.2.3.1.5.1 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand nach der in Kapitel 2.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.


100

2.3.7.4.2 Hydroxylamin-HCl

Mit Hydroxylamin-HCl konnte eine Hemmung detektiert werden. Es blieb eine

Restaktivität von etwa 5 % der Ausgangsaktivität erhalten (Abb. 2.27). Die ermittelte

IC50 ergab 114 µM.

Diese kompetitive Hemmung wurde bereits von Andersson et al. [2005] und

Havemeyer [2006] untersucht.

0

5

10

15

20

25

0 500 1000 1500 2000

Hydroxylamin [µM]

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

Abb. 2.27: Hemmung der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch Schweinenierenmikrosomen in Gegenwart von Hydroxylamin-HCl. Die Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 2.2.3.1.5.2 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand nach der in Kapitel 2.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.


101

2.3.7.4.3 p-Hydroxymercuribenzoat

Eine Beteiligung der NADH Cytochrom b5 Reduktase an der Reduktion von

Benzamidoxim konnte durch den Zusatz des selektiven, kompetitiven Inhibitors

p-Hydroxymercuribenzoat eindeutig gezeigt werden (Abb. 2.28). Ab 300 µM

p-Hydroxymercuribenzoat war keine Restaktivität der Benzamidoxim-Reduktase mehr

detektierbar (Abb. 2.28). Die ermittelte IC50 ergab 46 µM.

0

2

4

6

8

10

12

0 50 100 150 200

p-Hydroxymercuribenzoat [µM]

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

Abb. 2.28: Hemmung der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch Schweinenierenmikrosomen in Gegenwart von p-Hydroxymercuribenzoat. Die Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 2.2.3.1.5.3 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand nach der in Kapitel 2.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.


102

2.3.7.4.4 Cytochrom c

Cytochrom c ist ein potentieller Elektronenakzeptor des Cytochrom b5 [Bernardi und

Azzone, 1981]. Er führt ab einer Konzentration von 100 µM zu einem vollständigen

Verlust der N-reduktiven Aktivität der Schweinenierenmikrosomen (Abb. 2.29). Die

ermittelte IC50 ergab 17 µM.

0

5

10

15

20

25

0 20 40 60 80 100

Cytochrom c [µM]

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

Abb. 2.29: Hemmung der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch Schweinenierenmikrosomen in Gegenwart von Cytochrom c. Die Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 2.2.3.1.5.4 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand nach der in Kapitel 2.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.


103

2.3.7.4.5 Kohlenmonoxid

Kohlenmonoxid hemmt das Eisen der Oxidationsstufe +2 hämhaltiger Enzyme.

Der Kohlenmonoxideinfluss auf die Reduktion von Benzamidoxim durch

Schweinenierenmikrosomen wurde nach der in Kapitel 2.2.3.1.5.5 beschriebenen

Methode durchgeführt. Hierbei konnte keine Hemmung festgestellt werden (Abb.

2.30).

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

ohne Kohlenmonoxid mit Kohlenmonoxid

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

Abb. 2.30: Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch Schweinenieren-mikrosomen in Gegenwart von Kohlenmonoxid. Die Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 2.2.3.1.5.5 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand nach der in Kapitel 2.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.


104

2.3.7.4.6 Natriumvanadat

Es konnte durch den Zusatz des Inhibitors Natriumvanadat eine Hemmung gezeigt

werden (Abb. 2.31). Ab 200 µM Natriumvanadat lag die Restaktivität unter 5 %. Die


0

5

10

15

20

0 200 400 600 800

Natriumvanadat [µM]

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

Abb. 2.31: Hemmung der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch Schweinenierenmikrosomen in Gegenwart von Natriumvanadat. Die Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 2.2.3.1.5.6 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand nach der in Kapitel 2.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.

2.3.7.4.7 Zwittergent® 3-14

Das zwitterionische Detergenz Zwittergent® 3-14 zeigte in den Untersuchungen

zunächst eine aktivierende, in höheren Konzentrationen eine hemmende Wirkung auf

die Benzamidoxim-Reduktase. Dieser Effekt wurde nochmals näher untersucht. Da in

Kapitel 2.3.7.1.4 schon festgestellt wurde, dass Zwittergent® 3-14 einen negativen

Effekt auf die Cytochrom P450 Aktivitätsbestimmung ausübte, wurde unter den

gleichen Bedingungen die N-reduktive Aktivität bestimmt. Abbildung 2.32 zeigt die

Abnahme des spezifischen Cytochrom P450 Gehalts und gleichzeitig die Aktivität der

Benzamidoxim-Reduktase. Diese wird bei kleinen Detergenzmengen zunächst erhöht,

in höheren Mengen erniedrigt.


105

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0 1 2 3 4 5


spez

. Cyt

ochr

om P

450

Geh

alt

[nm

ol*m

g-1]

0,0

10,0

20,0

30,0

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

Cytochrom P450


Abb. 2.32: Korrelation der Cytochrom P450 Abnahme bei gleichzeitiger Bestimmung der Benzamidoxim-Reduktase-Aktivität nach Zugabe definierter Mengen Zwittergent® 3-14 zu Schweinenierenmikrosomen. Schweinenierenmikrosomen wurden nach der Methode in Kapitel 2.2.2.5 auf den spezifischen Gehalt von Cytochrom P450 untersucht. Gleichzeitig wurde das Detergenz Zwittergent® 3-14 in definierten Konzentrationen zugesetzt. Die ermittelten Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei Reaktionsansätzen. Die Durchführung und Aufarbeitung der Inkubationsansätze sind in Kapitel 2.2.3.1.2 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand nach der in Kapitel 2.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.

2.3.7.5 Vergleichsinkubation von Schweineleber- und Schweinenieren-mikrosomen bezüglich der Reduktion von Benzamidoxim und O-Demethylierung von Dextromethorphan

Die gewonnenen Schweinenierenmikrosomen wurden in ihrer Aktivität bezüglich der

Reduktion von Benzamidoxim und der O-Demethylierung von Dextromethorphan mit

Schweinelebermikrosomen verglichen. Für die Reduktion von Benzamidoxim durch

Schweinenierenmikrosomen wurde der optimierte Ansatz verwendet (Kapitel

2.2.3.1.2), für die Reduktion durch Schweinelebermikrosomen der nach Mau [2002]

optimierte Ansatz bestehend aus 200 µg mikrosomalem Protein, 500 µM NADH und

1000 µM Benzamidoxim in 300 µl eines 100 mM Kaliumphosphatpuffers pH 6,3. Für


106

die O-Demethylierung von Dextromethorphan durch die zwei Mikrosomenarten

wurde der in Kapitel 2.2.3.2.1 beschriebene Ansatz verwendet.

Die Abb. 2.33 zeigt, dass die Nierenmikrosomen etwa dreimal mehr Benzamidoxim

reduzieren als die Lebermikrosomen. Dagegen O-demethylieren die Lebermikro-

somen etwa viermal mehr Dextromethorphan als die Nierenmikrosomen.

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

Leber Niere

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

Leber Niere

Dex

tror

phan

[nm

ol*m

in-1*m

g-1]

Abb. 2.33: Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin und Dextromethorphan-O-Demethylierung durch Schweineleber- und Schweinenierenmikrosomen. Die Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze für die Reduktion von Benzamidoxim ist in Kapitel 2.2.3.1.2 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand nach der in Kapitel 2.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze für die O-Demethylierung von Dextromethorphan ist in Kapitel 2.2.3.2.1 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand nach der in Kapitel 2.2.3.2.2 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.


107

2.4 Diskussion

In dieser Arbeit sollte das verantwortliche Cytochrom P450 Isoenzym aus

Schweinenierenmikrosomen gewonnen werden, welches zusammen mit den beiden

Elektronentransportproteinen Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5 Reduktase für

die Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin verantwortlich ist. Die Beteiligung

der zwei Elektronentransportproteine sollte gleichzeitig untersucht werden. Da die

bisherige Isolierung in Lebermikrosomen zu dem Ergebnis führte, dass im Schwein

ein Isoenzym der CYP2D Subfamilie [Lomb, 1995] und in humanen Lebermikrosomen

das Isoenzym CYP2A6 [Behrens, 1999; Rieckert, 1999] die verantwortlichen dritten

Komponenten waren, lag die Vermutung nahe, in den Schweinenierenmikrosomen

ebenfalls ein Cytochrom P450 Isoenzym zu finden, welches die Reduktion des

Modellsubstrates Benzamidoxim in Kombination mit den zwei Elektronentransport-

proteinen durchführen kann.

Die Herstellung der Schweinenierenmikrosomen wurde nach der von Mau [2002]

beschriebenen Methode durchgeführt. Das Nierengewebe war deutlich härter als das

Lebergewebe und musste somit stärker mechanisch vorbehandelt werden. Aus

diesem Grund wurde das Gewebe besonders klein geschnitten und zweimal durch

den Fleischwolf gegeben. Eine stärkere Zerkleinerung hat aber auch immer die

Zerstörung von Zellen und Zellkompartimenten zur Folge, einhergehend mit dem

Verschleppen der Kompartimente in die untersuchten subzellulären Fraktionen.

Deshalb wurde trotz der invasiveren Methode auf die größtmögliche Schonung des

Gewebes Wert gelegt.

Lomb [1995] entwickelte eine Methode zur simultanen Gewinnung von Cytochrom b5,

NADH Cytochrom b5 Reduktase und dem dritten Protein. Die in der Literatur [Kling et al., 1985] beschriebene Methode wurde von Lomb [1995] teilweise modifiziert, da

einzelne Chemikalien nicht mehr kommerziell erhältlich waren. Der erste Schritt

seiner Reinigung sah nach der Solubilisation der Mikrosomen eine Hydrophobe

Interaktionschromatographie vor. Diese chromatographische Trennung baut auf dem

Prinzip der hydrophoben Wechselwirkung in Kombination mit dem Aussalzeffekt von

Proteinen auf [Pingoud und Urbanke, 1997]. Eine Übertragung dieser Methode auf

die Nierenmikrosomen war nicht möglich, da die Enzyme Cytochrom b5, NADH

Cytochrom b5 Reduktase und das dritte Enzym unter den angegebenen Bedingungen

zeitgleich von der Säule eluiert wurden und sich nicht durch unterschiedliche Puffer

mit verschiedenen Salz- und Detergenzkonzentrationen trennen ließen (Daten nicht

gezeigt).


108

Zur Entwicklung einer neuen Methode zur Trennung der mikrosomalen Enzyme durch

Hydrophobe Interaktionschromatographie wurden zunächst Solubilisationsstudien mit

verschiedenen Detergentien durchgeführt. Dabei wurden das von Lomb [1997]

genutzte nichtionische Thesit®, das in der Literatur beschriebene und oft speziell zur

CYP450 Isoenzymisolierung verwendete Emulgen® 911 [Yoshimoto et al., 1986;

Imaoka und Funae, 1986; Kastner und Neubert, 1991] sowie die zwei ionischen

Detergentien Cholsäure [Clement et al., 1997] und Zwittergent® 3-14 [Gonenne und

Ernst, 1978] hinsichtlich ihrer Solubilisationskraft und ihres Einflusses auf die

Benzamidoxim-Reduktase Aktivität untersucht. Das Polyoxyethylenderivat Thesit®

und das Nonoxynol-9 Emulgen® 911 zeigten ähnliche Eigenschaften. Sehr geringe

Mengen des jeweiligen Detergenzes führten zum vollständigen Verlust der

Benzamidoxim-Reduktase Aktivität (Abb. 2.4). Die Solubilisation mit Thesit® fand erst

im höhermolaren Bereich fast vollständig statt (Abb. 2.4), während Emulgen® 911

hier schon in geringeren Mengen zum gleichen Ziel führte (Daten nicht gezeigt). Die

steroidbasierte Cholsäure zeigte einen geringen Einfluss auf die Reduktion von

Benzamidoxim, es wurden allerdings sehr große Mengen dieses Detergenzes

benötigt, um eine vollständige Solubilisation zu erhalten (Abb. 2.5). Das

Sulfobetainderivat Zwittergent® 3-14 zeigte gute Solubilisationseigenschaften bei

geringen Konzentrationen unter zunächst vollständigem Erhalt der Benzamidoxim-

Reduktase Aktivität. Erst in höheren Konzentrationen fand auch hier eine Hemmung

der Enzymaktivität statt (Abb. 2.6; 2.32). Somit brachte das zwitterionische

Detergenz Zwittergent® 3-14 die meisten Vorteile mit sich. Cholsäure und Emulgen®

911 zeigten hinsichtlich ihrer Solubilisation gute Eigenschaften, ihr Einfluss auf die

Benzamidoxim-Reduktase ist aber als negativ anzusehen. Thesit® hingegen zeigte in

beiden Punkten negative Eigenschaften.

Die eingesetzten Detergentien können nur unter erheblichem Aufwand wieder aus

der Proteinlösung unter Erhalt der enzymatischen Aktivität entfernt werden. Die

Methoden sind in Kapitel 2.2.1.3.6 beschrieben. Lomb [1997] benutzte das

Adsorptionsmaterial Calbiosorb®. Diese Methode ist zwar schonend, aber schlecht

kontrollierbar (Kapitel 2.2.1.3.6.1). Bei unzureichender Detergenzentfernung bleibt

die Benzamidoxim-Reduktase weiterhin gehemmt. Wird hingegen zu viel Detergenz

entfernt, fallen die Proteine aus oder werden an den Adsorber gebunden. Das sehr

enge Fenster, in dem die Enzyme aktiv sind, ist nicht vorhersehbar und muss ständig

überprüft werden.

Detergent OutTM arbeitet nach dem gleichen Prinzip, nur dass hier die Proteinlösung

mittels Zentrifugation durch eine Säule gepresst wird. Die Säulen sind zum einen

sehr teuer, zum anderen muss dieser Detergenzentfernungsschritt mehrfach


109

wiederholt werden, da häufig nicht alles Detergenz entfernt wird. Die dauerhafte

Benutzung ist somit nicht ökonomisch (Kapitel 2.2.1.3.6.3).

Die Entfernung von Emulgen® 911 (Kapitel 2.2.1.3.6.2), wie sie in der Literatur

beschrieben steht, wird üblicherweise mit Hilfe einer Hydroxylapatitsäule durch-

geführt [Yoshimoto et al., 1986; Imaoka und Funae, 1986; Kastner und Neubert,

1991]. Dabei binden die Proteine in einem gering konzentrierten Salzpuffer an den

starken Ionenaustauscher, während das Detergenz mit einem detergenzfreien Puffer

von der Säule gespült werden kann. Anschließend werden die Proteine mit einem

hochmolaren Salzpuffer eluiert. Emulgen® 911 absorbiert bei 280 nm. Die voll-

ständige Detergenzentfernung war somit bei 280 nm kontrollierbar. Die Methode

erwies sich gerade für Cytochrom P450 Isoenzyme als gut geeignet.

Im Anschluss an die Solubilisation wurde eine Polyethylenglykolfällung getestet.

Andersson et al. [2005] beschrieben eine gezielte Fällung der Benzamidoxim-

Reduktase mit solubilisierten Rattenlebermikrosomen im Konzentrationsbereich

15-18 %. Für die Schweinenierenmikrosomen brachte dieser Schritt keinen Vorteil,

da keine selektive Fällung erzielt werden konnte (Abb. 2.7).

Die mit unterschiedlichen Detergentien solubilisierten Schweinenierenmikrosomen

wurden auf eine Hydrophobe Interaktionschromatographie Matrix aufgetragen. Das

zunächst gut solubilisierende Zwittergent® 3-14 interagierte mit der Säule und fiel

nach kurzer Zeit aus. Laut Herstellerangabe ist das Detergenz bei 4 °C in Wasser

unlöslich. Sämtliche Versuche, Zwittergent® 3-14 in Lösung zu halten, misslangen.

Der Einsatz von Zwittergent® 3-14 für eine Hydrophobe Interaktionschromatographie

ist in der Literatur bisher nicht beschrieben. Außerdem werden für Hydrophobe

Interaktionschromatographien nichtionische Detergentien bevorzugt [Pingoud und

Urbanke, 1997].

Cholsäure hat eine gute Solubilisationskraft und wurde von Lomb [1997] auch dafür

eingesetzt. Zur vollständigen Elution aller Enzyme von der interaktionschromato-

graphischen Säule war Cholsäure nicht in der Lage. Deshalb fügte Lomb [1997]

Thesit® hinzu, was aber bei den Schweinenierenmikrosomen nicht zum Erfolg führte.

Das nichtionische Detergenz Emulgen® 911 konnte schließlich sämtliche Enzyme

wieder von der Säule eluieren (Abb. 2.8) und war somit das beste der getesteten

Detergentien für diesen Arbeitsschritt zur selektiven Abtrennung der CYP450

Isoenzyme. Nachteilig war allerdings, dass die N-reduktive Aktivität nicht sofort

bestimmt werden konnte. Die Cytochrom P450 Bestimmung wurde mit dem

Differenzspektrum nach Omura und Sato [1964] durchgeführt. Der Gehalt vor und

nach der Interaktionschromatographie war nahezu identisch, so dass kaum ein

Verlust an Cytochrom P450 Isoenzymen bei diesem Schritt zu verzeichnen war. Die


110

Entfernung des Detergenzes mit Hydroxylapatit (Kapitel 2.2.1.3.6.2) führte im

rekonstituierten System (Kapitel 2.2.3.1.6) zu einer Reduktion von Benzamidoxim

(Daten nicht gezeigt). Allerdings führte dieser Schritt, ebenso wie bei Lomb [1997],

nicht zu einer Anreicherung des Enzyms, sondern nur zur Abtrennung von

Cytochrom b5 und weiteren, nicht analysierten Enzymen.

Als nächster Schritt zur Anreicherung des Enzyms wurde eine Anionenaustausch-

chromatographie an Fractogel® EMD TMAE 650 (S) durchgeführt. Da die nach Lomb

[1997] durchgeführte Methode wiederum Thesit® enthielt und sich dieses schon in

der Hydrophoben Interaktionschromatographie als nachteilig herausgestellt hatte,

wurde die Elution wiederum mit Emulgen® 911 durchgeführt. Laut Literatur wurden

Cytochrom P450 Isoenzyme analog dieser Methode an einem Anionenaustauscher

gewonnen [Bansal et al., 1984; Funae und Imaoka, 1985; Imaoka et al., 1990]. Es

konnten vor allem in der Durchgangsfraktion sowie dem ersten Stufengradienten

Cytochrom P450 Aktivitäten detektiert werden (Abb. 2.9). Trotz Detergenzentfernung

bei den einzelnen Fraktionen konnte keine N-reduktive Aktivität gemessen werden.

Dabei konnte eine Hemmung durch das Detergenz ausgeschlossen werden, da diese

Fraktionen die Aktivität von Mikrosomen nicht hemmten. Das verwendete Detergenz

hingegen hemmte die Mikrosomen schon bei geringster Konzentration in ihrer

Reduktion von Benzamidoxim (Kapitel 2.3.1). Eine zusätzliche Aktivierung der

Mikrosomen konnte auch nicht gezeigt werden. Lomb [1997] hatte in der

Durchgangsfraktion seiner Säulenchromatographie ein CYP2D Isoenzym gefunden,

welches im rekonstituierten System N-reduktive Aktivität zeigte.

Mehrere Gründe können diskutiert werden, warum die Rekonstitution der erhaltenen

Cytochrom P450-Fraktionen nicht funktioniert hat. Wie schon bei der Hydrophoben

Interaktionschromatographie erwähnt, wurde mit dem ersten chromatographischen

Schritt keine Anreicherung des Enzyms erzielt. Die geringe Aktivität könnte eventuell

bei der weiteren Auftrennung durch Interaktion mit einzelnen Proteinen oder mit

dem Säulenmaterial zum kompletten Aktivitätsverlust geführt haben. Über ein

solches Phänomen wurde bereits berichtet [Szymona und Szumilo, 1966]. Zudem

wurden die von Imaoka et al. [1990] oder Bansal et al. [1984] gewonnenen

Cytochrom P450 Isoenzyme nicht aufgrund der Beteiligung an einer enzymatischen

Reaktion isoliert, sondern nur unter dem Focus der Feststellung, dass Cytochrom

P450 Isoenzyme in der Niere vorhanden sind. Somit sind Aktivitäten und damit

Aktivitätsverluste nicht beschrieben.

Ein Ausbleiben der Aktivität könnte auch damit erklärt werden, dass in der Niere

möglicherweise ein ganz anderes Enzym für die Reduktion verantwortlich ist. Das

Cytochrom P450 Isoenzym der Subfamilie 2D aus dem Schwein weist sehr viel


111

Ähnlichkeit [Berger, 2002] zum literaturbeschriebenen CYP2D25 auf [Postlind et al., 1997]. Das CYP2D25 wurde als die Vitamin D3 25-Hydroxylase identifiziert und ist ein

hepatisches Enzym. Auch in der Schweineniere konnte ein CYP Isoenzym isoliert

werden, welches die 25-Hydroxylierung von Vitamin D3 durchführen konnte [Postlind

und Wikvall, 1988]. Hierbei wurde aber nur eine 20 %ige Aktivität der Niere

gegenüber der Leber für die 25-Hydroxylierung von Vitamin D3 gefunden. Zudem

gibt es bisher keine Hinweise, dass das CYP2D25 an der renalen Reduktion von

Benzamidoxim beteiligt ist.

Im Menschen ist bisher nur das CYP2D6 als Mitglied der 2D Subfamilie entdeckt

worden. Für das CYP2D6 und das CYP2D25 wurden 77 % Sequenzhomologie

festgestellt [Myers et al., 2001]. Das CYP2D25 metabolisiert dabei typische CYP2D6

Substrate, wie Bufuralol oder Dextromethorphan [Myers et al., 2001]. Dies konnte

ebenso für das mikrosomale Enzym der Schweineleber gezeigt werden [Friedrich,

2003]. Der mRNA Gehalt des CYP2D6 beträgt aber in der humanen Niere nur etwa

1 % der Menge, die in der Leber gefunden wurde [Nishimura et al., 2003]. Ähnliches

stellten Miksys et al. [2005] bei einem Organvergleich zwischen Mensch und Maus in

Leber und Niere fest. Im Vergleich zur Leber wurde nur ein Zehntel der Menge an

CYP2D6 des Menschen sowie CYP2D der Maus in der Immunoblotanalyse der Niere

detektiert. Aus diesem Grund wurde eine Vergleichsinkubation von Schweineleber-

mikrosomen und -nierenmikrosomen hinsichtlich ihrer Benzamidoxim-Reduktase

Aktivität sowie Dextromethorphan-O-Demethylierung als CYP2D Markerreaktion

durchgeführt (Abb. 2.33). Dabei reduzierten die Schweinenierenmikrosomen etwa

dreimal mehr Benzamidoxim als die Schweinelebermikrosomen, während die

Lebermikrosomen etwa vierfach mehr Dextromethorphan O-demethylierten als die

Nierenmikrosomen (Abb. 2.33).

Aufgrund dieser Ergebnisse muss angenommen werden, dass das CYP2D aus den

Lebermikrosomen nicht das verantwortliche Enzym zur Reduktion von Benzamidoxim

in der Niere sein kann.

Parallel zur Anionenaustauschchromatographie wurde eine Auftrennung der durch die

Hydrophoben Interaktionschromatographie erhaltenen Enzymfraktion an einem

Kationenaustauscher mit Carboxymethylcellulose getestet. Die Enzymfraktion konnte

nicht zur Bindung an den Kationenaustauscher gebracht werden. Somit war der

Kationenaustauscher ungeeignet (Kapitel 2.3.5).

Da die Anionenaustauschchromatographie bei Lomb [1997] zu einem Ergebnis

führte, mit welchem das CYP2D Enzym als verantwortliches Enzym charakterisiert

werden konnte, wurden die solubilisierten Mikrosomen direkt auf einen

Anionenaustauscher aufgetragen. Verwendet wurde dafür DEAE-Material. Dazu


112

wurde die von Havemeyer [2006] entwickelte Methode zur Auftrennung

solubilisierter äußerer mitochondrialer Vesikel auf die Mikrosomen übertragen. Die

gute Solubilisation der Nierenmikrosomen mit Zwittergent® 3-14 wurde bereits

diskutiert. Ein Elutionsprofil der solubilisierten Enzyme ist in Abbildung 2.10 zu sehen.

Ein vorhergehender Aufreinigungsschritt fand nicht statt. Die in der Leber beteiligten

Elektronentransportproteine Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5 Reduktase

konnten detektiert werden. Ihre Elutionsprofile sind in den Abbildungen 2.11 und

2.12 dargestellt. Inkubationen der einzelnen Fraktionen mit Benzamidoxim zur

Kontrolle der Benzamidoxim-Reduktase zeigte keine Aktivität (Kapitel 2.3.4.7). Der

isolierte Zusatz von Cytochrom b5 bzw. NADH Cytochrom b5 Reduktase zu den

Fraktionen zeigte jeweils eine geringe Aktivität (Abb. 2.14 und 2.15). Erst die Zugabe

beider Elektronentransportproteine führte zu einer 20-fachen Steigerung der

reduktiven Aktivität (Abb. 2.16) gegenüber den eingesetzten Mikrosomen. Da

Zwittergent® 3-14 in der eingesetzten Konzentration die Reduktion nicht störte,

konnte auf die aufwendige Entfernung des Detergenzes verzichtet werden, wie sie

ehemals durchgeführt werden musste [Clement et al., 1997]. Dieses bestätigt die

bisher beschriebenen Ergebnisse über N-reduktive membrangebundene

Enzymsysteme [Kadlubar und Ziegler, 1974; Clement et al., 1997; Havemeyer,

2006], welchen es zufolge sich bei der Benzamidoxim-Reduktase um ein

Dreikomponentensystem handelt. Zum ersten Mal konnte mit diesem Schritt ein

Aufreinigungsfaktor der Benzamidoxim-Reduktase in Mikrosomen erzielt werden.

Zur Kontrolle wurde die O-Demethylierung von Dextromethorphan als Markerreaktion

des CYP2D [Myers et al., 2001] mit bestimmten Fraktionen der DEAE-Säule

durchgeführt. In einem Teil der Fraktionen konnte die O-Demethylierung von

Dextromethorphan detektiert werden (Abb. 2.17). Die Fraktionen der höchsten

Reduktionsrate von Benzamidoxim sowie die Fraktionen der höchsten

O-Demethylierungsrate von Dextromethorphan korrelieren nicht miteinander (Abb.

2.16; 2.17). Dies gibt einen weiteren Hinweis darauf, dass das in der Niere

enthaltende Enzymsystem zur Reduktion von Benzamidoxim vermutlich nicht mit

dem in der Leber entdeckten CYP2D korreliert. Die Benzamidoxim-reduktaseaktiven

Fraktionen zeigten zudem im Differenzspektrum nach Omura und Sato [1964] keinen

CYP450-Gehalt (Daten nicht gezeigt). In den isolierten Proteinfraktionen von Lomb

[1997] sowie Rieckert und Behrend [beide 1999] konnte in den aktiven

Enzymfraktionen aus porciner und humaner Leber, die das dritte Enzym enthielten,

Cytochrom P450 nachgewiesen werden.

Um einem Verlust der N-reduktiven Aktivität vorzubeugen, wurden die gewonnenen

Enzymfraktionen stets bei -80 °C eingefroren. Trotzdem wurde ein Langzeittest

durchgeführt, der zeigte, dass solubilisierte Mikrosomen auch nach über 30 Tagen


113

Lagerung bei 4 °C noch eine 50 %ige Restaktivität zur Reduktion von Benzamidoxim

besaßen (Abb. 2.20), während unsolubilisierte Mikrosomen schon nach wenigen

Tagen keinerlei Aktivität mehr aufwiesen. Damit kann eine kurze Haltbarkeit des

Enzyms ausgeschlossen werden, wie es von Andersson et al. [2005] beschrieben

wurde. Zudem konnte damit ausgeschlossen werden, dass die Enzymfraktionen ihre

Aktivitäten zu schnell verlieren und sich damit einem positiven Nachweis der

Markerreaktionen entziehen.

Wie schon vorher erwähnt, wurden die Mikrosomen nach Solubilisation ohne weitere

Vorreinigung auf den Anionenaustauscher aufgetragen. Die SDS-Gele zeigten für die

einzelnen Fraktionen mehrere Banden (Abb. 2.18). Auffallend ist, dass im 45-55 kDa

Bereich, in dem typischerweise Cytochrom P450 Isoenzyme zu finden sind [Imaoka

und Funae, 1986; Yoshimoto et al., 1986; Kastner und Neubert, 1991; Myers et al., 2001], kaum Banden im silbergefärbten SDS-Gel zu detektieren waren. SDS-Gele der

dritten Enzymfraktion aus der Leber zeigten typischerweise im 50 kDa Bereich eine

deutliche Bande [Clement et al., 1997]. Das isolierte CYP2D25 aus Schweinenieren

zeigte im SDS-Gel ebenfalls eine Detektion bei 50 kDa [Bergman und Postlind, 1990].

Auch diese Untersuchung lässt die Beteiligung des CYP2D Enzyms an der Reduktion

von Benzamidoxim in den Schweinenieren fragwürdig erscheinen.

Die eingekreisten Banden der SDS-Gele in Abb. 2.18 wurden der

massenspektrometrischen Analyse unterzogen. Die identifizierten Proteine sind in

Tab. 2.1 dargestellt. Wie aus Abbildung 2.18 ersichtlich ist, waren in Fraktion 46

noch mehrere Proteinbanden enthalten. Die 66 kDa Bande zeigte ihre stärkste

Detektion in den Fraktionen 48-52 und korreliert damit nicht mit der Benzamidoxim-

reduzierenden Fraktion (Abb. 2.16). Die 55 und 50 kDa Banden waren durchgehend

in allen Fraktionen identisch intensiv detektierbar (Abb. 2.18). Hingegen zeigt die

35 kDa Bande eine Anfärbung, die in ihrer Intensität mit den Aktivitäten der

Benzamidoxim-reduzierenden Fraktionen korreliert (Abb. 2.16; Abb. 2.18). Im

Vergleich dazu nehmen die Farbdetektionen der 32 und 30 kDa Banden über

mehrere Fraktionen zu und haben in den Fraktionen 50 und 51 ihre stärkste

Intensität (Abb. 2.18). Diese korrelieren nicht mit der Aktivität der Benzamidoxim-

Reduktase (Abb. 2.16). Die zusätzlich detektierbare Bande bei 16 kDa konnte in den

Fraktionen 43-57 durchgehend angefärbt werden (Abb. 2.18). Auch hier ist keine

Korrelation zur Aktivität der Benzamidoxim-Reduktase feststellbar (Abb. 2.16).

Die identifizierten Enzyme der 35 kDa Bande entstammen dem Menschen bzw. dem

Affen, da das Genom des Schweins noch nicht vollständig bekannt ist, jedoch in

vielen Fällen hohe Homologien zum Menschen vorhanden sind. Es kann davon

ausgegangen werden, dass es sich um ein identisches Enzym handelt. Damit konnte


114

erstmals in Nierenmikrosomen des Schweins ein molybdäncofaktorhaltiges Enzym

detektiert werden.

Das Ergebnis konnte durch den nit-1 Rekonstitutions-Assay (Tab. 2.2), welcher

spezifisch den Molybdäncofaktor nachweist, sowie der FormA-Analyse (Tab. 2.3),

welche das Molybdopterin-Grundgerüst nachweist, bestätigt werden. Die erhaltenen

Anreicherungsfaktoren sind vergleichbar mit der Anreicherung der Benzamidoxim-

Reduktase im rekonstituierten System. Der gegen den rekombinanten C-Terminus

der Mocosulfurase gerichtete Antikörper erkannte im Western Blot in den

Benzamidoxim-Reduktase aktiven Fraktionen das 35 kDa Protein (Abb. 2.19). Eine

Beteiligung des Molybdäncofaktor-haltigen Proteins am Benzamidoxim-Reduktase

Enzymsystem ist somit als wahrscheinlich anzusehen.

Zusätzlich zur Reinigung wurden die Mikrosomen anhand einiger Enzyme

charakterisiert. Da Cytochrom b5 am hepatischen Enzymsystem beteiligt ist [Clement

et al., 1997], wurde die Aktivität in den Nierenmikrosomen ebenfalls bestimmt. Der

ermittelte Wert von 0,25 nmol*mg-1 (Kapitel 2.3.7.1.2) entsprach ungefähr dem von

Mau [2002] bestimmten Wert. NADH Cytochrom b5 Reduktase wurde in den

Schweinelebermikrosomen und -mitochondrien als weitere verantwortliche

Komponente der Benzamidoxim-Reduktase identifiziert [Lomb, 1995; Havemeyer,

2006]. Die Aktivität von 3,25 U*mg-1 (Kapitel 2.3.7.1.3) war mit der von Mau [2002]

vergleichbar. Ein Cytochrom P450 Enzym der Subfamilie 2D wurde bisher in den

Schweinelebermikrosomen als die dritte verantwortliche Komponente der

Benzamidoxim-Reduktase angenommen [Lomb, 1995]. Der Cytochrom P450 Gehalt

unterschied sich ebenfalls nicht wesentlich von dem von Mau [2002] ermittelten

Daten (Kapitel 2.3.7.1.4).

NADPH Cytochrom P450 Reduktase ist ein membrangebundenes Enzym und gehört

zum endoplasmatischen Monooxygenasesystem [Ruckpaul, 1993]. Es wird häufig als

Markerenzym für eine mikrosomale Verunreinigung der Mitochondrien verwendet

[Sottocasa et al., 1967; Borgese und Longhi, 1990]. In dieser Arbeit wurde eine

deutlich höhere Menge des Enzyms detektiert als Deters [2002] sie für

Schweinenierenmikrosomen bestimmt hat (Kapitel 2.3.7.1.1). Bei den vorgenannten

Enzymen konnte kein Unterschied in den Aktivitäten zu früheren Daten festgestellt

werden, während das mikrosomale Enzym NADPH Cytochrom P450 Reduktase aber

in dieser Arbeit eine deutlich erhöhte Aktivität zeigte. Das lässt vermuten, dass die

gewonnenen Mikrosomen stärker angereichert und somit weniger stark verunreinigt

waren, als die Mikrosomen von Deters [2002]. Die in dieser Arbeit gemessene

Benzamidoxim-Reduktase Aktivität in den Schweinenierenmikrosomen war hingegen

niedriger (Kapitel 2.3.7.2) verglichen mit den Daten von Mau [2002]. Somit führte


115

die stärkere Anreicherung der Mikrosomen zu einem geringeren Gehalt an

Benzamidoxim-Reduktase. Ein Zusammenhang zwischen diesen Daten lässt den

Schluss zu, dass das zu untersuchende Enzymsystem sich eventuell nicht

vornehmlich in den Mikrosomen der Schweinenieren befindet, sondern trotz

vorsichtiger Gewinnung von einem anderen Zellkompartiment verschleppt wurde.

Mikrosomen sind Trümmerteile des endoplasmatischen Retikulums, die häufig an

Mitochondrien assoziiert sind oder diese sogar vollkommen umgeben. Hierbei finden

auch Membranfusionen statt [Ardail et al., 1993]. Der Aufbau des Mitochondriums ist

in Kapitel 4.1.1 näher erläutert. An dieser Stelle sei erwähnt, dass Mitochondrien aus

einer inneren und einer äußeren Membran aufgebaut sind. Da während der

Gewinnung von Schweinenierenmikrosomen eine stärkere mechanische Belastung

auf das Gewebe wirkt als bei der Gewinnung von Lebermikrosomen (Kapitel 2.2.1.2),

ist die Zerstörung anderer Zellkompartimente eher möglich, im speziellen Fall der

Mitochondrien eine Abtrennung der äußeren mitochondrialen Membran. Deters

[2002] und Havemeyer [2006] konnten die Beteiligung der äußeren mitochondrialen

Membran am Benzamidoxim-Reduktase System in der Schweineleber zeigen. Frühere

Untersuchungen konnten einen kleinen mitochondrialen Anteil von unter 3 % in

Mikrosomen nachweisen [Deters, 2002]. Dazu wurde ein typischer mitochondrialer

Marker der inneren Membran gewählt.

In dieser Arbeit wurden die Schweinenierenmikrosomen auf ihren

Monoaminoxidasegehalt hin untersucht (Kapitel 2.3.7.1.5). Die Monoaminoxidase ist

ein typisches Markerenzym der äußeren mitochondrialen Membran. In den

Mikrosomen wurde eine Aktivität von etwa 2 % im Vergleich zu der äußeren

mitochondrialen Membran ermittelt (Tab. 3.2 und 4.3). Dieses Ergebnis bestätigt die

Vermutung einer Verschleppung von Fragmenten der äußeren mitochondrialen

Membran in die Mikrosomen. Es sei angemerkt, dass auch in einigen Fraktionen der

solubilisierten und am DEAE-Material aufgetrennten Mikrosomen die

Monoaminoxidase detektiert werden konnte (Abb. 2.13). Dabei konnten in den

Mikrosomen etwa 10 % der Monoaminoxidase-Aktivität detektiert werden, die in den

DEAE-Fraktionen der solubilisierten äußeren Membran der Schweinenieren-

mitochondrien festgestellt wurde (Abb. 2.13; 5.4). Dieses entspricht dem Ergebnis

der Benzamidoxim-Reduktase Aktivität, welche in den DEAE-Fraktionen der

solubilisierten Mikrosomen auch etwa 10 % der Aktivität besitzt, die in den DEAE-

Fraktionen der solubilisierten äußeren mitochondrialen Membran detektiert wurde

(Abb. 2.16; 5.8). Diese Untersuchung sollte Gegenstand weiterer Arbeiten zur

Klärung der Verunreinigung von Mikrosomen mit äußerer mitochondrialer Membran

sein. Möglicherweise hilft hier ein spezifischer Fluoreszenztest zur selektiven

Detektion von Monoaminoxidase weiter. Ebenso können rasterelektronen-


116

mikroskopische Aufnahmen der Enzympräparationen einen genauen Aufschluss über

die Zusammensetzung bieten.

Die Enzymverteilung der in dieser Arbeit gewonnenen Schweinenierenmikrosomen

differierte teilweise von den Daten, die Mau und Deters [beide 2002] ermittelt

hatten. Außerdem zeigten die hier beschriebenen Mikrosomen eine deutlich geringere

Benzamidoxim-Reduktase Aktivität von 18 nmol Benzamidin*min-1*mg-1. Deshalb

wurden die Mikrosomen in dieser Arbeit nochmals bezüglich ihrer N-reduktiven

Aktivität charakterisiert (Kapitel 2.3.7.2).

Zusätzlich konnte erstmalig die Sauerstoffinsensitivität des Enzymsystems in

Schweinenierenmikrosomen gezeigt werden (Abb. 2.25), wie sie vorher schon für das

mikrosomale und mitochondriale Enzymsystem der Schweineleber demonstriert

werden konnte [Clement et al., 1997; Clement et al., 2005].

Eine Beteiligung der Elektronentransportproteine Cytochrom b5 und NADH

Cytochrom b5 Reduktase an der Benzamidoxim-Reduktase wird beschrieben und gilt

in der Leber als gesichert [Kadlubar und Ziegler, 1974; Clement et al., 1997;

Andersson et al., 2005]. Inhibitoren hemmen oder verzögern biochemische

Enzymreaktionen. Hiermit können Hinweise auf die Identität eines an einer

bestimmten Katalyse beteiligten Enzyms gewonnen werden. In dieser Arbeit wurden

zur Charakterisierung der N-reduktiven Aktivität Hemmstudien durchgeführt.

Der selektive Inhibitor p-Hydroxymercuribenzoat hemmt die NADH Cytochrom b5

Reduktase [Lostanlen et al., 1978], was für die Schweinenierenmikrosomen bestätigt

werden konnte (Abb. 2.28). Ebenso konnte die Beteiligung von Cytochrom b5 durch

Hemmung mittels Cytochrom c bewiesen werden (Abb. 2.29), wobei der kompetitive

Hemmstoff Cytochrom c als Elektronenakzeptor des Cytochrom b5 fungiert [Bernardi

und Azzone, 1981].

Ähnlichkeiten zur beschriebenen Hydroxylaminreduktase [Bernheim und Hochstein,

1968; Kadlubar et al., 1973] führten zu der Annahme, dass Hydroxylamin ein

kompetitiver Hemmstoff von Benzamidoxim sein könnte. Havemeyer [2006]

bestätigte das in ihrer Arbeit. Die starke Hemmung der Benzamidoximreduktion

durch Hydroxylamin konnte auch in dieser Arbeit gezeigt werden (Abb. 2.27). Das

Ergebnis lässt den Schluss zu, dass auch in Schweinenierenmikrosomen ein der

Hydroxylaminreduktase vergleichbares Enzymsystem vorhanden sein kann.

Neben den membranständigen Enzymen Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5

Reduktase wurde die Beteiligung einer dritten Komponente an der Reduktion

N-hydroxylierter Verbindungen beschrieben [Kadlubar und Ziegler, 1974; Clement et


117

al., 1997; Andersson et al., 2005], durch die die Umsetzungsraten deutlich erhöht

werden konnten.

Clement et al. [1997] beschrieben ein Cytochrom P450 Isoenzym im mikrosomalen

Enzymsystem der Schweineleber als verantwortliche Komponente zur Erhöhung der

Umsatzratensteigerung. Die Schweinenierenmikrosomen hatten allerdings einen sehr

viel geringeren Cytochrom P450-Gehalt als die Schweinelebermikrosomen [Clement

et al., 2005b].

Cytochrom P450 Isoenzyme werden durch den unspezifischen Hemmstoff

Kohlenmonoxid inhibiert. Der Hemmstoff hatte bei der in dieser Arbeit

durchgeführten Untersuchung keinen Einfluss auf die Enzymaktivität (Abb. 2.30).

Kohlenmonoxid hemmt die Oxidationsstufe +2 des im Hämgerüst enthaltenen Eisens.

Zur Übertragung der Protonen während der Reduktion muss aber im postulierten

Mechanismus [Clement, 2002] das Eisen der Oxidationsstufe +3 vorliegen, so dass

eine Nichthemmung durch Kohlenmonoxid nicht die Beteiligung von P450 an der

Reduktion ausschließt.

Dieses wurde durch den Hemmstoff Kaliumcyanid überprüft (Abb. 2.26). Es konnte

eine Empfindlichkeit des Enzymsystems für Cyanidionen festgestellt werden. Dabei

wurde die Umsetzungsrate auf 40 % des Anfangswertes reduziert. Die in der

Literatur beschriebenen Daten sind diesbezüglich sehr unterschiedlich. Während

Bernheim und Hochstein [1968] eine vollständige Hemmung erreichen konnten,

beschrieben Kadlubar und Ziegler [1974] sowie Clement et al. [1997] eine

Insensitivität des untersuchten Enzymsystems gegenüber Cyanidionen. Lopian

[2002], Andersson et al. [2005] und Havemeyer [2006] konnten eine partielle

Hemmung feststellen. Die inhibitorische Wirkung von Kaliumcyanid auf die Reduktion

von Benzamidoxim wurde mit Schweinenierenmikrosomen bisher noch nicht

untersucht. Da Cytochrom P450 Enzyme vollständig durch Cyanid gehemmt werden,

muss der nur teilweise inhibitorische Effekt in dieser Untersuchung auf einem

anderen Mechanismus beruhen. Auf der einen Seite könnten mehrere Enzymsysteme

an der Reduktion von Benzamidoxim beteiligt sein, welche sich nur partiell durch

Cyanidionen hemmen lassen. Andererseits ist aber auch eine nur partielle Hemmung

des Cytochrom b5 denkbar. Das Hämgerüst dieses Enzyms ist fast vollständig vom

umgebenden Medium abgeschirmt [Durley und Mathews, 1996; Strittmatter und

Dailey, 1982], was die geringe Bindungsfähigkeit von Cyanid erklärt (Kapitel 6.1.1).

Havemeyer [2006] fand in der äußeren Membran von Schweinelebermitochondrien

ein den Molybdäncofaktor enthaltendes Enzym als das verantwortliche Coenzym für

die Reduktion von Benzamidoxim. Aufbau und Funktionsweise dieses Coenzyms sind

in Kapitel 6.1.4 beschrieben. Molybdänhaltige Enzyme sind durch Vanadationen


118

hemmbar [Ramadoss, 1980]. Die Immunoblot-Analyse detektierte den

Molybdäncofaktor spezifisch in den Benzamidoxim-Reduktase aktiven Fraktionen der

DEAE-Säule (Abb. 2.19).

Eine Hemmung des in den Schweinenierenmikrosomen befindlichen Enzymsystems

fand schon bei geringer Vanadatkonzentration statt (Abb. 2.31). Die Beteiligung des

Molybdäncofaktors enthaltenen Enzyms am Benzamidoxim-reduzierenden

Enzymsystem ist somit in den Schweinenierenmikrosomen nicht auszuschließen. Da

aber mehrere Enzyme durch Vanadationen gehemmt werden, ist eine Bestätigung

der Verantwortlichkeit zu diesem Zeitpunkt noch nicht möglich. Dennoch deutet auch

dieser Nachweis darauf hin, dass ein Cytochrom P450 Isoenzym, für das eine

Vanadathemmung bisher noch nicht beschrieben wurde, an der Reduktion von

Benzamidoxim eher nicht beteiligt ist. Außerdem ist fraglich, ob der positive

Nachweis des Molybdäncofaktor enthaltenen Enzyms tatsächlich originär aus den

Mikrosomen stammt oder, ähnlich wie die Monoaminoxidase, bei der Herstellung der

Mikrosomen als Verunreinigung eingeschleppt wurde, denn Havemeyer [2006] hat

die Benzamidoxim-Reduktase spezifisch auf der äußeren mitochondrialen Membran

der Schweineleber beschrieben.

Das Detergenz Zwittergent® 3-14 wirkt sich, wie bereits beschrieben, nur in

geringem Umfang auf die N-Reduktivität der Schweinenierenmikrosomen aus.

Zwittergent® 3-14 inaktiviert Cytochrom P450 Isoenzyme, erkennbar am Auftreten

eines Maximums bei 420 nm in Gegenwart von Kohlenmonoxid. Ein Vergleich dieser

„Hemmung“ von Cytochrom P450 durch Zwittergent® 3-14 zeigte deutlich, dass hier

keine Korrelation zu finden war (Abb. 2.32). Während der Cytochrom P450-Gehalt

stetig abnahm, hatte Zwittergent® 3-14 zunächst einen aktivierenden Effekt, wie

auch Havemeyer [2006] ihn nachweisen konnte, und erst im höhermolaren Bereich

eine hemmende Wirkung. Die Abnahme des CYP450-Gehaltes korrelierte dabei mit

der Zunahme des Peaks bei 420 nm, der nicht-aktives Protein zeigte. Diese Reaktion

war irreversibel (Daten nicht gezeigt). Die Beteiligung eines CYP450 Isoenzyms an

der Reduktion von Benzamidoxim in den Schweinenierenmikrosomen wird auch

hierdurch eher unwahrscheinlich.


119

2.5 Zusammenfassung

In dieser Arbeit sollte das verantwortliche Enzymsystem zur Reduktion von

Benzamidoxim zu Benzamidin aus Schweinenierenmikrosomen isoliert und

charakterisiert werden. Das Enzymsystem zur Benzamidoxim-Reduktion der

Schweinelebermikrosomen besteht aus Cytochrom b5, NADH Cytochrom b5

Reduktase und einem Cytochrom P450 Isoenzym der Subfamilie 2D. Der Ablauf der

Isolierung des Enzymsystems aus Schweinelebermikrosomen war nicht auf die

Reinigung der Nierenmikrosomen übertragbar. Da in der humanen Leber ein

Cytochrom P450 Isoenzym isoliert wurde, welches Benzamidoxim zu reduzieren

vermochte, wurde eine an die Literatur angepasste Reinigung entwickelt, welche

speziell zum Ziel hatte, Cytochrom P450 Isoenzyme zu isolieren. Dieses führte zu

einer CYP450 Fraktion, welche nicht in der Lage war Benzamidoxim zu reduzieren.

Dabei konnte ein störender Einfluss der Detergentien ausgeschlossen werden, da die

isolierte Enzymfraktion keinen Einfluss auf die Reduktion von Benzamidoxim bei

Zugabe zu unbehandelten Schweinenierenmikrosomen hatte, während schon die

Zugabe geringer Mengen des verwendeten Detergenzes die Reduktion von

Benzamidoxim hemmte.

Das bisher aus Schweinelebermikrosomen isolierte CYP450 Isoenzym weist

Ähnlichkeiten zur Vitamin D3 25-Hydroxylase des Schweins auf und wurde als

CYP2D25 klassifiziert. Das CYP2D25 wiederum hat 77 % Sequenzhomologie zu

CYP2D6 [Myers et al., 2001], welches das bisher einzige im Menschen gefundene

CYP2D Enzym darstellt. Neuere Untersuchungen zur mRNA Verteilung von Cytochrom

P450 Isoenzymen im Menschen haben ergeben, dass das CYP2D6 in der Niere nur

1 % der Menge entspricht, die in der Leber gefunden wurde [Nishimura et al., 2003].

Immunoblotuntersuchungen haben dieses Verhältnis für Mensch und Maus bestätigt

[Miksys et al. 2005]. Des weiteren wurde das CYP2D25 sowohl aus der

Schweineleber als auch aus der Schweineniere isoliert. Dabei wurde eine nur

20 %ige Aktivität des Enzyms der Niere gegenüber der Leber festgestellt [Postlind

und Wikvall, 1988].

Diese Daten waren Grundlage für Vergleichsuntersuchungen von Leber- und

Nierenmikrosomen bezüglich Benzamidoxim-Reduktion und einer typischen CYP2D

Markerreaktion, der O-Demethylierung von Dextromethorphan. Die Schweineleber-

mikrosomen O-demethylierten etwa viermal mehr Dextromethorphan als die

Schweinenierenmikrosomen. Die Enzymverteilung in den Organen zeigt klar, dass

das CYP2D Isoenzym in wesentlich geringerem Umfang in der Niere zu finden ist,

was durch die O-Demethylierung von Dextromethorphan bestätigt wurde.


120

Dahingegen zeigten die Nierenmikrosomen dreifach höhere Aktivität in der Reduktion

von Benzamidoxim als die Schweinelebermikrosomen.

Aus der äußeren mitochondrialen Membran der Schweineleber wurde von Havemeyer

[2006] ebenfalls ein Enzymsystem isoliert, welches Benzamidoxim zu reduzieren

vermag. Dieses setzt sich aus Cytochrom b5, NADH Cytochrom b5 Reduktase und

einem Protein, welches den Molybdäncofaktor enthält, zusammen. Da Mikrosomen

und Mitochondrien aneinander gelagert und teilweise sogar miteinander

verschmolzen sind, wurden die Schweinenierenmikrosomen hinsichtlich ihrer

Verunreinigung mit äußerer mitochondrialer Membran anhand des Markerenzyms

Monoaminoxidase untersucht. Dieses Enzym wurde zu einem geringen Anteil in den

Mikrosomen gefunden, so dass eine Verunreinigung der Mikrosomen mit äußerer

mitochondrialer Membran angenommen werden muss. Zudem ist damit unklar, ob

die Aktivität der Mikrosomen überhaupt originär aus diesen stammt oder die

Verunreinigung mit der äußeren mitochondrialen Membran dafür verantwortlich ist.

Wahrscheinlich handelt es sich bei der Benzamidoxim-Reduktase eher um ein

mitochondriales Enzymsystem, welches eventuell im endoplasmatischen Retikulum

co-exprimiert wird.

Aus diesem Grund wurden die Mikrosomen analog der mitochondrialen Isolierung aus

der Schweineleber über eine Anionenaustauschchromatographie aufgetrennt. Dabei

wurde eine aktive N-reduktive Fraktion isoliert. In dieser Fraktion konnte mittels

Immunoblotanalyse die Anwesenheit des Molybdäncofaktors detektiert werden. Auch

in der Massenanalyse konnte ein Molybdäncofaktor bestimmt werden. Außerdem

wurde durch diesen Reinigungsschritt eine Anreicherung sowohl der Benzamidoxim-

Reduktase als auch des Molybdäncofaktors gegenüber den Mikrosomen erreicht. Die

O-Demethylierung von Dextromethorphan als CYP2D Markerkontrolle fiel in den

Benzamidoxim-Reduktase aktiven Fraktionen negativ aus und gab einen weiteren

Hinweis darauf, dass das CYP2D Enzym der Leber eher nicht das verantwortliche

Enzym in der Niere sein kann.

Da bisher noch nicht gezeigt wurde, dass Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5

Reduktase tatsächlich auch an der Reduktion von Benzamidoxim in der Niere beteiligt

sind, wurde dieses durch Hemmstudien belegt. Außerdem konnte gezeigt werden,

dass das mikrosomale Enzymsystem der Nieren gut durch Vanadationen hemmbar

war, welche einen typischen Hemmstoff von Molybdäncofaktor enthaltenen Enzymen

darstellen. Kohlenmonoxid und Kaliumcyanid, typische Inhibitoren von Cytochrom

P450 Isoenzymen, zeigten hingegen keinen bzw. nur einen partiellen Einfluss auf die

Enzymaktivität. Zusätzlich konnte für das Detergenz Zwittergent® 3-14 zunächst ein

aktivierender Einfluss auf die Benzamidoxim-Reduktase demonstriert werden, bevor

es im höhermolaren Bereich zu einer Hemmung kam. Gleichzeitig zeigte es aber eine


121

inhibitorische Wirkung auf den Cytochrom P450 Nachweis, der hinsichtlich des

Cytochrom P450-Gehaltes nicht mit der Benzamidoxim-Reduktase Aktivität

korrelierte.

Aufgrund dieser Ergebnisse ist die Beteiligung des CYP2D Isoenzyms der

Schweineleber am mikrosomalen Enzymsystem der Schweineniere unwahrscheinlich.

Die Verunreinigung der Mikrosomen mit äußerer mitochondrialer Membran sollte

Anlass zur näheren Untersuchung geben, um eindeutig feststellen zu können, ob die

originäre Benzamidoxim-Reduktase Aktivität allein durch die Verunreinigung mit

äußerer mitochondrialer Membran hervorgerufen wird. Unabhängig davon zeigen die

dargestellten Daten, dass die Niere einen hohen Stellenwert für die Reduktion

N-hydroxylierter Verbindungen hat, der vergleichbar mit dem der Leber ist. Eine

Isolierung und Identifizierung des Enzymsystems zur Reduktion von Benzamidoxim

aus den Schweinenierenmitochondrien kann vielleicht dazu beitragen, die originäre

Exprimierung dieses Enzymsystems zu lokalisieren.

ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON SCHWEINENIERENMITOCHONDRIEN

122

3 ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON

SCHWEINENIERENMITOCHONDRIEN

3.1 Einleitung

Der Metabolismus von endogenen und exogenen Substanzen erfolgt in vielen

Geweben des Körpers. Innerhalb dieser Gewebe findet man in unterschiedlichen

Bereichen und Zellbestandteilen biotransformatorisch wirksame Enzyme. Der

Metabolismus in Nieren wurde in Kapitel 1.2 ausführlich dargestellt. Insbesondere in

Mitochondrien konnte eine hohe N-reduktive Aktivität nachgewiesen werden

[Andersson et al., 2005; Clement et al., 2005b].

Bei der Gewinnung der Schweinenierenmitochondrien ist darauf zu achten, dass sie

unversehrt, metabolisch aktiv und möglichst frei von mikrosomalen Membran-

fragmenten sein sollten. Die Unversehrtheit wird aus dem physiologischen Aufbau

der Zellorganelle gefordert. Die Doppelmembran der Mitochondrien muss als

Permeationsbarriere erhalten bleiben, um in vivo Verhältnisse beizubehalten [Stryer

et al., 2003]. Zur näheren Untersuchung der Organelle muss metabolische Aktivität

vorliegen. Mikrosomale Fragmente können die Katalyse der zu untersuchenden

Biotransformation falsch positiv vortäuschen (s. Kap. 2). Aus diesem Grunde sollte

die Gewinnung möglichst schonend ablaufen, um eine Kontamination der

Schweinenierenmitochondrien mit mikrosomalen Fragmenten zu vermeiden.

Die Charakterisierung der Mitochondrien ist anhand der oben genannten Punkte

durchzuführen. Dabei können verschiedene Methoden wie enzymatische, immuno-

chemische und analytische Testverfahren oder auch elektronen-mikroskopische

Aufnahmen eingesetzt werden.


Das Ausmaß der Kontamination und Intaktheit der Organellen wird wesentlich durch

die Gewinnungsmethode bestimmt [Blume, 1979].

Neben einer möglichst schonenden Methode erfolgt die Gewinnung der

Mitochondrien mittels Auftrennung der Zellorganellen mit differentieller Zentri-

fugation, da diese bei unterschiedlichen g-Zahlen sedimentieren [Ozols, 1990; Arinc

et al., 1992].

Deters [2002] und Havemeyer [2006] haben in ihren Arbeiten Mitochondrien

gewonnen. Deters [2002] hat dabei die Organe Leber und Niere verwendet. Sie hat


123

die Mitochondrien mittels konventioneller Differentialzentrifugation gewonnen. Die in

der Literatur beschriebene Methode [Beattie, 1968; Kline et al., 1986] wurde leicht

modifiziert angewandt.

Havemeyer [2006] hat in Ihrer Arbeit die von Deters [2002] angewandte Methode

mit der in der Literatur beschriebenen Methoden nach Hovius et al. [1990]

(kontinuierliche Dichtezentrifugation) und einer Kombination aus beiden verglichen.

Ihre Untersuchungen fanden mit Schweinelebermitochondrien statt. Die Ergebnisse

zeigen eine Gleichwertigkeit der Methoden. Einzig der Zeitfaktor zur Gewinnung der

Organellen spricht für die Gewinnungsmethode nach Hovius et al. [1990].

3.1.2 Zielsetzung

In dieser Arbeit sollten Schweinenierenmitochondrien nach der Methode von Hovius

et al. [1990] gewonnen werden. Eine Übertragbarkeit der Gewinnungsmethode von

Schweinelebermitochondrien auf Schweinenierenmitochondrien sollte überprüft und

gegebenenfalls modifiziert werden. Als Ausmaß für eine mikrosomale Kontamination

war die NADPH Cytochrom P450 Reduktase-Aktivität zu bestimmen. Aus diesem

Grund sollten gleichzeitig Schweinenierenmikrosomen gewonnen werden. Außerdem

war ein typischer Marker (Monoaminoxidase) für die Mitochondrien als

Aufreinigungsfaktor zu bestimmen.

Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung der Mitochondrien, welche

Proteinbestimmung, Reinheit, N-reduktive Aktivität und Hemmstudien beinhaltete.


124

3.2 Methoden





3.2.1.2 Gewinnung von Schweinenierenmitochondrien

Die Schweinenieren zur Gewinnung der Mitochondrien stammten von einem

ortsnahen Schlachter aus Einzelschlachtungen. Die Tiere wurden per Elektroschock

getötet, durch Öffnen der Halsschlagader ausgeblutet und anschließend einem

Brühbad unterworfen. Danach wurden den Schweinen die Nieren entnommen und in

einem 4 °C kaltem Standardpuffer (10 mM Kaliumphosphat, 250 mM Saccharose,

1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,1 % (w/v) BSA, pH 7,4) zum Labor transportiert. Pro

Aufarbeitung wurden 8 Nieren sowohl weiblicher Tiere als auch männlicher Kastrate

verwendet.

Die Gewinnung der Schweinenierenmitochondrien erfolgte in Anlehnung an die

Methode von Hovius et al. [1990]. Die folgenden Reinigungsschritte fanden bei 4 °C

oder unter Eiskühlung statt. Zunächst wurden die Nieren gehäutet und von ihrer

bindegewebsartigen Kapsel getrennt. Eine Perfusion der Nieren wurde mit

Standardpuffer durchgeführt. Die Gefäße in den Nieren sind sehr klein, so dass die

Perfusion nicht ausreichend war. Von den Nieren wurden nur die Rinde sowie das

Mark verwendet, Fettgewebe und Sammelbecken wurden verworfen. Die klein

geschnittenen Nierenstücke wurden so lange mit Standardpuffer gespült, bis das

Waschwasser nahezu farblos blieb. Die gut gespülten Nierenstückchen wurden durch

einen handelsüblichen Fleischwolf gegeben. Dieser Vorgang musste zweimal

durchgeführt werden, da das Nierengewebe sehr hart und fest war und eine weitere

Zerkleinerung sonst nicht möglich gewesen wäre. Die so erhaltene Masse wurde mit

gleichem Volumen Standardpuffer gemischt und zweimal durch einen

Durchflusshomogenisator gegeben [Ziegler und Pettit, 1966]. Der Verlust an

Volumen durch das Homogenisieren wurde durch Auffüllen mit Standardpuffer

wiederhergestellt. Anschließend wurde das entstandene Nierenhomogenat mit

Kaliumhydroxid-Lösung auf pH 7,4 eingestellt.


125

Das Homogenat wurde 15 Minuten bei 600 g (Rotor JA 10) zentrifugiert, um

Zellkerne, Zelltrümmer und Erythrozyten abzutrennen. Dieser Schritt wurde so oft

durchgeführt, bis das Pellet nicht mehr rot gefärbt war. In der Regel lief dieser

Zentrifugationsschritt fünf- bis siebenmal ab. Der erhaltene Überstand wurde zur

Abtrennung von Fettsäuren durch Verbandmull koliert. Die vereinigten Überstände

wurden für 20 Minuten bei 10.300 g (Rotor JA 10) zentrifugiert. In diesem Schritt

wurde die Mikrosomenfraktion abgetrennt. Das erhaltene Pellet wurde mit wenig

Standardpuffer resuspendiert. Es handelte sich hierbei um Mitochondrien, die noch

nicht rein waren. Sie werden deshalb als rohe Mitochondrienfraktion bezeichnet.

In einer Dichtegradientenzentrifugation wurde die rohe Mitochondrienfraktion mit

einem Gradientenpuffer (30 % Percoll®, 225 mM Saccharose, 1 mM EGTA, 25 mM

HEPES, 1 mM DTT, 0,1 % (w/v) BSA, pH 7,4) weiter gereinigt. Etwa drei bis vier

Milliliter der Fraktion wurden vorsichtig auf 62 ml Gradientenpuffer geschichtet und

40 Minuten bei 95.000 g (Rotor 45 Ti) zentrifugiert. Die erhaltene dunkle

Mitochondrienfraktion wurde abpipettiert und mit 1,5 Liter Standardpuffer zweimal

gewaschen. Der Waschschritt fand 20 Minuten bei 6.300 g (Rotor JA 10) statt. Das

erhaltene Pellet wurde in Standardpuffer resuspendiert, mit Kaliumhydroxid-Lösung

auf pH 7,4 eingestellt, aliquotiert und bei -80 °C eingefroren.

Zur gleichzeitigen Nierenmikrosomengewinnung wurde mit dem 10.300 g Überstand

nach der unter Kapitel 2.2.1.2 beschriebenen Methode weiter verfahren: Die

vereinigten Überstände wurden 60 Minuten bei 100.000 g (Rotor 45 Ti) der

Ultrazentrifugation unterzogen. Das erhaltene Pellet wurde mit Standardpuffer in

einem Teflon-Glas-Homogenisator resuspendiert und zur weiteren Aufreinigung

erneut 60 Minuten bei 100.000 g ultrazentrifugiert. Das entstandene mikrosomale

Pellet wurde wieder in Standardpuffer resuspendiert, mit Kaliumhydroxid-Lösung auf

pH 7,4 eingestellt, aliquotiert und bei -80 °C eingefroren.

3.2.2 Analytische Methoden zur Charakterisierung der Enzympräparation


Die Proteinbestimmung wurde mittels der BCA-Methode [Smith et al., 1985]

durchgeführt. Das Arbeitsreagenz (bestehend aus Natriumcarbonat,

Natriumhydrogencarbonat, 2,2’-Bichinolin-4,4’-dicarbonsäure, Natriumtartrat und

Kupfersulfat in 0,1 N Natronlauge) von Fa. Pierce (Rockford, IL, USA) wurde laut

Anleitung für jede Bestimmung frisch hergestellt. 900 µl BCA-Reagenz wurden zu


126

100 µl Proteinlösung (Verdünnung 1:10 bis 1:50 mit Aq. bidest.) gegeben und

abweichend von der Firmenvorschrift 20 Minuten bei 60 °C inkubiert. Mittels

Eiswasser wurde die Reaktion gestoppt. Innerhalb von 3 Minuten wurden die Proben

bei 562 nm kolorimetrisch gegen den Blindwert (100 µl Standardphosphatpuffer

pH 7,4 als Ersatz für die Proteinlösung) vermessen. Die Auswertung erfolgte durch

Erstellung einer Kalibriergeraden mit Rinderserumalbumin in bekannter

Konzentration. Diese wurde stets in einem parallelen Ansatz mit dem BCA-Reagenz

erstellt.

War der Proteingehalt der Probe sehr gering oder waren Störungen der Bestimmung

durch Detergentien oder reduzierende Bestandteile wie Dithiothreitol zu vermuten, so

wurde der Proteinbestimmung eine Säurefällung mit Trichloressigsäure vorgeschaltet.

Das Arbeitsreagenz (bestehend aus UPPATM - I Reagenz und UPPATM – II Reagenz)

von Fa. Pierce (Rockford, IL, USA) wurde laut Arbeitsanweisung verwendet. 250 µl

Reagenz 1 wurden zu 50 µl Proteinlösung gegeben, kurz gemischt und fünf Minuten

bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach Zufügen von 250 µl Reagenz 2 und

kurzem Mischen wurde fünf Minuten bei 10.000 U*min-1 zentrifugiert. Der Überstand

wurde vollständig entfernt. Anschließend wurde das gefällte Protein in 300 µl BCA-

Reagenz durch kräftiges Mischen wieder gelöst. 200 µl dieser Lösung wurden im

Microplatereader 20 Minuten bei 44 °C inkubiert. Im Anschluss wurden die Proben

bei 562 nm kolorimetrisch gegen den Blindwert vermessen. Die Auswertung erfolgte

durch Erstellung einer Kalibriergeraden mit Rinderserumalbumin in bekannter

Konzentration. Die Kalibriergerade wurde stets in einem parallelen Ansatz mit dem

BCA-Reagenz erzeugt, wobei die einzelnen Standards unter den gleichen

Bedingungen aufgearbeitet und inkubiert wurden, wie die zu untersuchenden

Proben.

3.2.2.2 NADPH Cytochrom P450 Reduktase-Aktivitätsbestimmung

Die NADPH Cytochrom P450 Reduktase-Aktivitätsbestimmung erfolgte mit

Modifikationen nach der Methode von Sottocasa et al. [1967]. Hierbei wurde die

Reduktion von Cytochrom c spektralphotometrisch vermessen, indem die

Absorptionsänderung bei 550 nm verfolgt wurde, da das reduzierte Cytochrom c hier

sein Absorptionsmaximum hat. Zur Berechnung der Enzymaktivität wurde der




100 µM NADPH, 40-100 µM Cytochrom c, 0,05 % (v/v) Triton® X-100 und 300 µM


127

Kaliumcyanid in 50 mM Phosphatpuffer pH 7,5. Alle Reagentien wurden stets frisch

hergestellt. Präparationsabhängig wurden unterschiedliche Proteinmengen

eingesetzt. Die Messzeit betrug 20 Sekunden bei 30 °C. Die Enzymaktivität ist im

Folgenden in Units (U) angegeben, wobei 1 U als diejenige Enzymmenge definiert ist,

die pro Minute 1 µmol Cytochrom c umsetzt.

Zur Berechnung der mikrosomalen Kontamination wurde die spezifische

Enzymaktivität der zugehörigen Mikrosomenfraktion des selben Gewebepools gleich

100 % gesetzt.


Die Monoaminoxidase-Aktivitätsbestimmung wurde modifiziert nach der Methode von

Kline et al. [1986] bestimmt.

Folgende Zusammensetzung wurde für den Enzymassay genutzt: in 500 µl

Gesamtvolumen waren etwa 80 µg mitochondriales Protein, 10 mM Benzylamin-HCl,

0,05 % (v/v) Triton X-100 in 50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,4 enthalten. Alle

Reagentien wurden stets frisch hergestellt. Durch Zugabe des Benzylamin-HCl wurde

die Reaktion gestartet. Die Absorptionszunahme bei 250 nm wurde über eine

Messzeit von einer Minute bei 30 °C bestimmt.

Das Messprinzip beruht auf der enzymatisch katalysierten Bildung von Benzaldehyd.

Zur Berechnung der Enzymaktivität wurde der Absorptionskoeffizient ε=13 nM-1*cm-1

für Benzaldehyd [Tabor et al., 1954] verwendet.


Enzymmenge definiert ist, die pro Minute 1 µmol Benzylamin-HCl umsetzt.







128




Reinheit geprüft.




mitochondrialen Biotransformationsstudien setzte sich aus 75 µg mitochondrialem



Zunächst wurden die Mitochondrien bei 37 °C zwei Minuten vorinkubiert, dann das


















129





4*4 mm (Merck, Darmstadt)



Laufzeit: 28 Minuten

Flussrate: 1 ml/min







gelöst in Fließmittel und wurde mittels der beschriebenen HPLC-Analytik vermessen.

Für jede Konzentration wurden zwei Ansätze parallel pipettiert, die jeweils doppelt




Konzentrationen zugesetzt. In Abwesenheit des Cosubstrates NADH sowie

Denaturierung der Proteinpräparation wurden Zusammensetzung, Inkubations-

bedingungen und Aufarbeitung entsprechend der beschriebenen Methode unter

3.2.3.1.2 gewählt. Benzamidin konnte im angegebenen Konzentrationsbereich (bis






130


wurden in einem mit Argon begasten Exsikkator mit 37 °C warmem




verschlossen und im 37 °C Schüttelwasserbad inkubiert. Nach 15 Minuten wurde die

Reaktion durch Zugabe von 150 µl Methanol gestoppt. Die Proben wurden fünf








die für die mitochondriale Fraktion gültige Standardzusammensetzung (s. Kapitel




Je nach Hemmstoff wurden einzelne Modifikationen durchgeführt.














131
























mitochondrialen Biotransformationsstudien setzte sich aus 1000 µg mitochondrialem

Protein, 400 µM NADH, 500 µM Benzamidoxim in 2000 µl eines 100 mM


Zunächst wurden die Mitochondrien bei 37 °C mit Benzamidoxim zwei Minuten

vorinkubiert, dann 30 Sekunden mit Kohlenmonoxid begast und nach weiteren fünf

Minuten Vorinkubation die Reaktion durch Zugabe von NADH gestartet. Nach

15 Minuten wurde die Reaktion durch Zugabe von 2000 µl Methanol gestoppt. Die

Proben wurden fünf Minuten geschüttelt und danach für mindestens 60 Minuten bei


132

-20 °C eingefroren. Eine anschließende Zentrifugation bei 12.000 g trennte das

denaturierte Protein ab. Gebildetes Benzamidin wurde mittels der unter Kapitel

3.2.3.1.3 beschriebenen Analytik quantifiziert.










133

3.3 Ergebnisse

3.3.1 Charakterisierung der Schweinenierenmitochondrien

3.3.1.1 Mikrosomale Kontamination

Die Bewertung der mikrosomalen Kontamination der gewonnenen

Schweinenierenmitochondrien erfolgte mittels des mikrosomalen Markers NADPH

Cytochrom P450 Reduktase. Zur Vergleichbarkeit wurden parallel zur Gewinnung der

Mitochondrien aus dem gleichen Nierenpool auch Mikrosomen gewonnen. Tabelle 3.1

zeigt die gemessenen Enzymaktivitäten und die daraus berechnete mikrosomale

Kontamination der nach der Methode von Hovius et al., [1990] gewonnenen

Schweinenierenmitochondrien.

Tab. 3.1: NADPH Cytochrom P450 Reduktase-Aktivität der mittels Dichtegradientenzentrifugation gewonnenen Schweinenierenmitochondrien und der korrespondierenden Schweinenierenmikrosomen (Kapitel 3.2.1.2)

Zellbestandteil spezifische Enzymaktivität

[U*mg-1]

Kontamination

[%]

Mikrosomen 0,464 ± 0,118 100

rohe Mitochondrien 0,116 ± 0,048 25

reine Mitochondrien 0,012 ± 0,005 3 Die Enzymaktivität wurde als Mittelwert aus mindestens drei separaten Bestimmungen ermittelt. Die Bestimmung wurde nach der in Kapitel 3.2.2.2 beschriebenen Methode durchgeführt. Die mikrosomale Aktivität wurde als 100 % gesetzt.

3.3.1.2 Anreicherung der Mitochondrien

Die Kontrolle der erfolgreichen Anreicherung der Mitochondrien wurde anhand des

mitochondrialen Markers Monoaminoxidase bestimmt. Aus der Anreicherung wurde

der Anreicherungsfaktor errechnet. Zur Vergleichbarkeit wurden parallel zur

Gewinnung der Mitochondrien aus dem gleichen Nierenpool auch Mikrosomen

gewonnen. Tabelle 3.2 zeigt die gemessenen Enzymaktivitäten und den daraus

berechneten Anreicherungsfaktor nach der Methode von Kline et al. [1986].


134

Tab. 3.2: Monoaminoxidase-Aktivität der mittels Dichtegradientenzentrifugation gewonnenen Schweinenierenmitochondrien und der korrespondierenden Schweinenierenmikrosomen (Kapitel 3.2.1.2)

Zellbestandteil spezifische Enzymaktivität

[U*mg-1]

Anreicherung

[%]

Mikrosomen 0,0060 ± 0,0027 100

rohe Mitochondrien 0,0157 ± 0,0015 262

reine Mitochondrien 0,0525 ± 0,0084 875 Die Enzymaktivität wurde als Mittelwert aus mindestens drei separaten Bestimmungen ermittelt. Die Bestimmung wurde nach der in Kapitel 3.2.2.3 beschriebenen Methode durchgeführt. Die mikrosomale Aktivität wurde als 100 % gesetzt.

3.3.1.3 Proteinausbeute der Schweinenierenmitochondrien-Gewinnung

Zur Bestimmung des Proteingehaltes mittels der BCA-Methode sind jeweils

mindestens zwei Einzelmessungen durchgeführt worden. Die daraus gebildeten

Mittelwerte wurden für die weiteren Bestimmungen eingesetzt. Die prozentualen

Standardabweichungen wurden berechnet und lagen stets unter 4 %. Eventuell

störende Substanzen (EDTA, DTT) aus den zur Gewinnung verwendeten Puffern

zeigten bei den eingesetzten Probeverdünnungen 1:10 bis 1:50 keinen Einfluss auf

die Messergebnisse (Daten nicht gezeigt).

Der mittlere Proteingehalt einer Mitochondriencharge lag bei 27 mg/ml (Mittelwert

aus fünf Mitochondrienchargen). Die dabei gewonnene Gesamtproteinmenge lag

chargenabhängig zwischen 170 und 1300 mg (Vergleich der fünf

Mitochondrienchargen).

3.3.1.4 Charakterisierung und Inkubationsoptimierung der Reduktion von Benzamidoxim durch Schweinenierenmitochondrien

Die nach der Methode von Hovius et al. [1990] gewonnenen Schweinenieren-

mitochondrien wurden nach den Gesichtspunkten Proteinkonzentration,

Inkubationszeit, Cosubstratabhängigkeit und -art, pH-Wert und Substratabhängigkeit

für das Substrat Benzamidoxim untersucht. Es ergab sich dabei folgender optimierter

Inkubationsansatz (Kapitel 3.2.3.1.2): 75 µg mitochondriales Protein, 400 µM NADH

und 500 µM Benzamidoxim in 150 µl eines 100 mM Kaliumphosphatpuffers pH 6,2

bei 15 Minuten Inkubationszeit. Die erhaltenen Daten sind in den Abbildungen

3.1-3.5 dargestellt.


135

3.3.1.4.1 Proteinabhängigkeit

Aus den erhaltenen Signalflächen wurden mit Hilfe der Wiederfindung die

Umsetzungsraten berechnet. Dabei ergaben die Umsetzungsraten der Inkubationen

in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration im Bereich von 0 bis 200 µg je 150 µl

Inkubationsansatz einen linearen Verlauf. Höhere Proteinkonzentrationen führten zu

einer Hemmung der Umsetzungsraten (Abb. 3.1).

0123456

0 100 200 300 400 500

Protein [µg]

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1]

Abb. 3.1: Proteinabhängigkeit der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch Schweinenierenmitochondrien. Die Inkubationsansätze setzten sich wie folgt zusammen: 0-500 µg Protein, 1 mM NADH und 1 mM Benzamidoxim in 150 µl eines 100 mM Kaliumphosphatpuffers pH 6,0. Die Inkubationszeit betrug 15 Minuten. Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 3.2.3.1.2 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand mit der in Kapitel 3.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.


136

3.3.1.4.2 Inkubationszeit

Die Inkubationszeit für die Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin verlief über

einen Zeitraum bis 20 Minuten linear. Wurde noch länger inkubiert, so nahm die

Reaktionsgeschwindigkeit ab (Abb. 3.2). Gebildetes Benzamidin war bereits nach

wenigen Minuten gut quantifizierbar.

0

100

200

300

400

0 20 40 60 80 100 120

Zeit [min]

Benz

amid

in[n

mol

*mg-1

]

Abb. 3.2: Zeitabhängigkeit der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch Schweinenierenmitochondrien. Die Inkubationsansätze setzten sich wie folgt zusammen: 75 µg Protein, 1 mM NADH und 1 mM Benzamidoxim in 150 µl eines 100 mM Kaliumphosphatpuffers pH 6,0. Die Inkubationszeit betrug 0-120 Minuten. Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 3.2.3.1.2 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand mit der in Kapitel 3.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.


137

3.3.1.4.3 pH-Wert


bei pH 6,2 (Abb. 3.3).

0

5

10

15

20

25

30

4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8

pH-Wert

nmol

Ben

zam

idin

[n

mol

*min

-1*m

g-1]

Abb. 3.3: pH-Wertabhängigkeit der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch Schweinenierenmitochondrien. Die Inkubationsansätze setzten sich wie folgt zusammen: 75 µg Protein, 1 mM NADH und 1 mM Benzamidoxim in 150 µl eines 100 mM Kaliumphosphatpuffers pH 4,0-8,0. Die Inkubationszeit betrug 15 Minuten. Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 3.2.3.1.2 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand mit der in Kapitel 3.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.


138




halbmaximaler Sättigung (Km) 75 µM und die maximale Reaktionsgeschwindigkeit

(Vmax) 19,2 nmol*min-1*mg-1. Die sich daraus ergebende katalytische Effizienz lag bei

2,56*10-4 min-1*mg-1.

0

5

10

15

20

25

0 1000 2000 3000

Benzamidoxim [µM]

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

Abb. 3.4: Substratabhängigkeit der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch Schweinenierenmitochondrien. Die Inkubationsansätze setzten sich wie folgt zusammen: 75 µg Protein, 1 mM NADH und 0-3 mM Benzamidoxim in 150 µl eines 100 mM Kaliumphosphatpuffers pH 6,2. Die Inkubationszeit betrug 15 Minuten. Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 3.2.3.1.2 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand mit der in Kapitel 3.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.


139



Cosubstrates. NADH wurde hierbei gegenüber NADPH bevorzugt (Abb. 3.5). Ab einer

NADH-Konzentration von 300 µM kam es zu keiner nennenswerten Steigerung der

Umsetzungsrate.



0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

0 500 1000 1500 2000

Cosubstrat [µM]

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

NADH-Abhängigkeit

NADPH-Abhängigkeit

Abb. 3.5: Cosubstratabhängigkeit und -art der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch Schweinenierenmitochondrien. Die Inkubationsansätze setzten sich wie folgt zusammen: 75 µg Protein, 0-2 mM Cosubstrat (NADH oder NADPH) und 500 µM Benzamidoxim in 150 µl eines 100 mM Kaliumphosphatpuffers pH 6,2. Die Inkubationszeit betrug 15 Minuten. Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 3.2.3.1.2 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand mit der in Kapitel 3.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.


140

3.3.1.5 Sauerstoffabhängigkeit der Reduktion von Benzamidoxim mittels Schweinenierenmitochondrien

Die Sauerstoffabhängigkeit der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin mittels

Schweinenierenmitochondrien wurde unter aeroben und anaeroben Bedingungen

getestet. Dabei war keine Abhängigkeit festzustellen (Abb. 3.6).

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

aerob anaerob

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

Abb. 3.6: Sauerstoffabhängigkeit der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch Schweinenierenmitochondrien. Die Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 3.2.3.1.2 und 3.2.3.1.4 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand nach der in Kapitel 3.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.

3.3.1.6 Hemmstudien

Inhibitoren hemmen oder verzögern biochemische Enzymreaktionen. Hiermit können

Hinweise auf die Identität eines an einer bestimmten Katalyse beteiligten Enzyms

gewonnen werden. In dieser Arbeit wurden zur Charakterisierung der N-reduktiven

Aktivität Hemmstudien durchgeführt.

Wie in Kapitel 1.4 beschrieben, ist Hydroxylamin ein Modellsubstrat der

mikrosomalen und mitochondrialen Hydroxylaminreduktase [Bernheim und

Hochstein, 1968; Kadlubar und Ziegler, 1974]. Hydroxylamin wurde als kompetitiver

Inhibitor für die Schweinenierenmitochondrien eingesetzt.

Kohlenmonoxid und Cyanidionen sind bekannte Inhibitoren hämhaltiger Enzyme.

Cyanidionen hemmen Eisen der Oxidationsstufe +3. Kohlenmonoxid hingegen ist ein

Inhibitor des Eisens der Oxidationsstufe +2 [Stryer et al., 2003].


141

NADH Cytochrom b5 Reduktase wird durch p-Hydroxymercuribenzoat gehemmt

[Lostanlen et al., 1978]. Ein bekannter potentieller Elektronenakzeptor des

Cytochrom b5 ist Cytochrom c [Bernardi und Azzone, 1981]. Eine Hemmung der

Reduktion mittels Cytochrom c bedeutet eine Elektronenübertragung dieser beiden

Enzyme untereinander und beweist indirekt die Beteiligung von Cytochrom b5 an

dieser Reaktion.

Natriumvanadat ist ein Hemmstoff molybdänhaltiger Enzyme [Ramadoss, 1980].

Um allen Hemmstoffen ausreichend Zeit zu bieten mit den Enzymen wechselwirken

zu können ohne dabei Einflüssen des Substrates zu unterliegen, wurden die

Reaktionen, nicht wie üblich durch das Cosubstrat gestartet, sondern mit dem

Substrat selbst.


Cyanidionen hemmen das Eisen der Oxidationsstufe +3 hämhaltiger Enzyme.

Der Cyanidioneneinfluss auf die Reduktion von Benzamidoxim durch

Schweinenierenmitochondrien wurde nach der in Kapitel 3.2.3.1.5.1 beschriebenen

Methode durchgeführt. Hierbei konnte eine Hemmung festgestellt werden (Abb. 3.7).

Es blieb eine Restaktivität von etwa 40 % der Ausgangsaktivität erhalten. Die


0

5

10

15

20

0 500 1000 1500 2000

Cyanid [µM]

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

Abb. 3.7: Hemmung der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch Schweinenierenmitochondrien in Gegenwart von Kaliumcyanid. Die Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 3.2.3.1.5.1 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand mit der in Kapitel 3.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.


142


Mit Hydroxylamin-HCl konnte eine Hemmung detektiert werden. Es blieb eine


IC50 ergab 31 µM.

Die kompetitive Hemmung wurde bereits von Andersson et al. [2005] und

Havemeyer [2006] untersucht.

0

5

10

15

0 500 1000 1500

Hydroxylamin [µM]

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

Abb. 3.8: Hemmung der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch Schweinenierenmitochondrien in Gegenwart von Hydroxylamin-HCl. Die Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 3.2.3.1.5.2 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand mit der in Kapitel 3.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.


143


Eine Beteiligung der NADH Cytochrom b5 Reduktase an der Reduktion von

Benzamidoxim konnte durch den Zusatz des selektiven, kompetitiven Inhibitors

p-Hydroxymercuribenzoat eindeutig gezeigt werden (Abb. 3.9). Ab 300 µM

p-Hydroxymercuribenzoat war keine Restaktivität mehr detektierbar (Abb. 3.9). Die


0

5

10

15

20

25

0 100 200 300


Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

Abb. 3.9: Hemmung der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch Schweinenierenmitochondrien in Gegenwart von p-Hydroxymercuribenzoat. Die Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 3.2.3.1.5.3 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand mit der in Kapitel 3.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.


144



Azzone, 1981]. Es führt ab einer Konzentration von 25 µM zu einem vollständigen

Verlust der N-reduktiven Aktivität der Schweinenierenmitochondrien (Abb. 3.10). Die


05

10152025303540

0 5 10 15 20 25

Cytochrom c [µM]

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

Abb. 3.10: Hemmung der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch Schweinenierenmitochondrien in Gegenwart von Cytochrom c. Die Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 3.2.3.1.5.4 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand mit der in Kapitel 3.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.


145



Der Kohlenmonoxideinfluss auf die Reduktion von Benzamidoxim durch

Schweinenierenmitochondrien wurde nach der in Kapitel 3.2.3.1.5.5 beschriebenen

Methode durchgeführt. Hierbei konnte keine Hemmung festgestellt werden (Abb.

3.11).

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0


Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

Abb. 3.11: Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch Schweinenieren-mitochondrien in Gegenwart von Kohlenmonoxid. Die Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 3.2.3.1.5.5 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand mit der in Kapitel 3.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.


146


Die Beteiligung eines molybdänhaltigen Enzyms an der Reduktion von Benzamidoxim

ist möglich. Dieses konnte durch den Zusatz des hochwirksamen Inhibitors

molybdänhaltiger Enzyme Natriumvanadat gezeigt werden (Abb. 3.12). Ab 200 µM

Natriumvanadat lag die Restaktivität unter 5 %. Die ermittelte IC50 ergab 75 µM.

0

5

10

15

20

0 50 100 150 200 250

Natriumvanadat [µM]

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

Abb. 3.12: Hemmung der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch Schweinenierenmitochondrien in Gegenwart von Natriumvanadat. Die Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 3.2.3.1.5.6 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand mit der in Kapitel 3.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.


147

3.4 Diskussion

Deters [2002] hat in ihrer Arbeit mit menschlichem und porcinem Gewebe gearbeitet.

Ihr Fokus lag dabei auf den Organen Leber und Niere. In ihrer Arbeit konnte sie

Ähnlichkeiten zwischen Nieren- und Lebermitochondrien des Menschen und des

Schweins feststellen.

Diese große Ähnlichkeit ist schon seit langem bekannt [Douglas, 1972]. Da die

Zugänglichkeit von porcinem Gewebe weitaus größer ist als von humanem Gewebe,

fanden die in vitro Untersuchungen mit Schweinenieren statt.

Havemeyer [2006] konnte zeigen, dass zur Gewinnung von Schweineleber-

mitochondrien eine möglichst sanfte Methode zum besten Ergebnis führte. Dieses

umfasste Methoden, die keine oder zumindest nur eine minimale Beanspruchung für

die Mitochondrien bedeutete [Hovius et al., 1990]. Dabei wurde auf die Verwendung

eines Potter-Elvehjem-Homogenisators sowie eines Ultraturrax verzichtet. Lediglich

ein handelsüblicher Fleischwolf sowie Messer-Homogenisator nach Ziegler (Eigenbau

der Universität Austin, Texas, USA) kamen zum Einsatz. Auch die Puffer waren auf

größtmögliche Schonung des aufzubereitenden Materials ausgelegt. Als Oxidations-

schutz vor Enzyminaktivierung wurde das reduzierende Reagenz Dithiothreitol, als

Komplexierungsschutz vor enzyminaktivierenden Schwermetallen EDTA zugesetzt

[Bernheim, 1969]. Die Mitochondrienmembran wurde durch den Zusatz von

Rinderserumalbumin vor freien Fettsäuren geschützt [Lehninger und Remmert,

1959].

Eine Übertragbarkeit der Methode von Leber auf Niere war im Zerkleinerungsschritt

des Gewebes nicht absolut möglich. Das Gewebe musste zweimal durch den

Fleischwolf sowie den Messer-Homogenisator gegeben werden, da das

Nierengewebe sehr viel härter ist als das Lebergewebe. Dieses führte unweigerlich zu

einer erhöhten Zerstörung von Zellen und ihren Bestandteilen [Ziegler und Pettit,

1966].

Zur Kontrolle der Gewinnung von Schweinenierenmitochondrien wurde die Aktivität

der NADPH Cytochrom P450 Reduktase als mikrosomaler Marker verfolgt (Tab. 3.1).

Gleichzeitig wurde die Monoaminoxidase als mitochondrialer Marker für die

Aufreinigung bestimmt (Tab. 3.2). Zur Gewinnung der Schweinenierenmitochondrien

wurde stets ein Pool aus 8 Nieren verwendet. Dieses mittelte interindividuelle

Enzymaktivitätsunterschiede heraus, wie sie von Mau [2002] und Havemeyer [2006]

in der Leber festgestellt wurden. Um dennoch unvorhergesehenen Problemen oder

außergewöhnlichen Enzymaktivitäten vorbeugen zu können, wurden neben der

Mitochondriengewinnung auch jeweils in geringen Mengen Schweinenieren-


148

mikrosomen gewonnen. Diese wurden anschließend in ihrer Enzymaktivität mit den

Mitochondrien verglichen [Stasiecki et al., 1980].

Aufgrund der Assoziation der mikrosomalen Membran mit der äußeren

mitochondrialen Membran [Ardail et al., 1993] lässt sich eine Kontamination nicht

vollkommen vermeiden (Tab. 3.1). Zudem wird die Lokalisation der NADPH

Cytochrom P450 Reduktase auf der äußeren Membran von Mitochondrien

beschrieben [Brunner und Bygrave, 1969; Comte und Gautheron, 1978; Kulkoski et al., 1979]. Eine Restaktivität von 5 % für die NADPH Cytochrom P450 Reduktase ist

in der Literatur bekannt [Ohashi und Omura, 1978; Ramanadham und Kaplay, 1978].

Die in dieser Arbeit gefundene Restkontamination liegt unterhalb der in der Literatur

beschriebenen Daten. Somit kann die Präparation als vergleichbar rein angesehen

werden. Die gleichzeitige Steigerung des mitochondrialen Markers Monoaminoxidase

zeigt deutlich die Anreicherung der Mitochondrien in diesem Reinigungsschritt.

Eine Vergleichbarkeit mit den von Deters [2002] gewonnenen Ergebnissen ist nur

bedingt gegeben. Sie hatte ihre Schweinenierenmitochondrien mit der

konventionellen Differentialzentrifugation [Beattie, 1968; Kline et al., 1986]

gewonnen und konnte in den Mitochondrien kein Cytochrom b5 detektieren, während

das Enzym in den nach der Methode von Hovius et al. [1990] gewonnenen

Mitochondrien bestimmbar war (Daten nicht gezeigt). Hingegen konnte Deters

[2006] einen zehnfach höheren Wert an Cytochrom P450 Isoenzymen bestimmen als

in dieser Arbeit festgestellt wurde (Daten nicht gezeigt).

Die N-reduktive Aktivität der gewonnenen Schweinenierenmitochondrien wurde

anhand des Modellsubstrates Benzamidoxim charakterisiert. Die Schweinenieren-

mitochondrien sind für diese Reaktion sauerstoffinsensitiv (Abb. 3.6). Das schwach

saure pH-Optimum (Abb. 3.3) sowie die Cosubstratabhängigkeit mit einer

Bevorzugung von NADH gegenüber NADPH (Abb. 3.5) stimmen mit den bisher

gefundenen Ergebnissen (Kapitel 1.4) überein.

Der Verlauf der Bestimmung des pH-Optimums entspricht der Vorstellung der

Interaktion von Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5 Reduktase [Strittmatter und

Dailey, 1982; Durley und Mathews, 1996]. Im niedrigen und hohen pH-Bereich sind

die Carboxylgruppen des Cytochrom b5 jeweils nicht in der Lage, mit der Reduktase

zu interagieren (Kapitel 6.1.1). Im leicht sauren Milieu hingegen findet die

Übertragung der Protonen optimal statt.

Havemeyer [2006] konnte zeigen, dass in Mitochondrien endogen gebildetes NADH

zur Reduktion von Benzamidoxim befähigt ist. Dieses stammte aus dem Citratzyklus,


149

dessen Enzyme im Matrixraum lokalisiert sind. Zudem hatte Havemeyer [2006] für

ihre in vitro Untersuchungen exogen zugesetztes NADH verwendet, da hiermit

höhere Umsetzungsraten erzeugt werden konnten. Die erhöhten Umsetzungsraten

durch exogen zugesetzte Stoffe gegenüber denen durch endogene Stoffe

hervorgerufenen sind schon lange für die Niere bekannt [Weidemann et al., 1969].

Die bisherigen Untersuchungen zum Benzamidoxim reduzierenden Enzymsystem

ergaben eine Michaelis-Menten-Kinetik mit Km-Werten im zwei- bis dreistelligen

mikromolaren Bereich für Benzamidoxim [Lomb, 1995; Möller, 1997; Mau, 2002;

Deters, 2002]. Die in dieser Arbeit gezeigte Kinetik mit einem Km-Wert von 75 µM

entspricht somit den vorgenannten Arbeiten (Kapitel 3.3.1.4.4). Lediglich Deters

[2002] hat für Schweinenierenmitochondrien einen Km-Wert von 12,8 mM bestimmt.

Diese Daten differieren um den Faktor 170. Eine mögliche Begründung liegt in der

anderen Methode der Mitochondriengewinnung. Wie vorher angeführt, variieren

einzelne Enzym-Aktivitätsbestimmungen auch sehr stark.

Die ansonsten sehr ähnlichen Km-Werte weisen auf ein zumindest ähnliches

Enzymsystem zur Reduktion von Benzamidoxim hin. Die Übereinstimmung findet sich

dabei nicht nur in den Mitochondrien sondern auch in den bisher untersuchten

Mikrosomen. Folgt man der Endosymbiontentheorie, dass Mitochondrien eine

Endosymbiose mit prokaryotischen Zellen eingegangen sind, erklären sich die

ähnliche Enzymverteilung auf der äußeren Membran von Mitochondrien und

Mikrosomen und die damit ähnlichen Eigenschaften der Enzymaktivitäten [Margulis,

1971; Uzzell und Spolsky, 1973].

Eine Beteiligung der Enzyme Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5 Reduktase wird

beschrieben und gilt als gesichert [Kadlubar und Ziegler, 1974; Clement et al., 1997;

Andersson et al., 2005]. Der selektive Inhibitor p-Hydroxymercuribenzoat hemmt die

NADH Cytochrom b5 Reduktase [Lostanlen et al., 1978], was bestätigt werden

konnte (Abb. 3.9). Ebenso konnte die Beteiligung von Cytochrom b5 durch Hemmung

mittels Cytochrom c bewiesen werden (Abb. 3.10), wobei der kompetitive Hemmstoff

Cytochrom c als Elektronenakzeptor des Cytochrom b5 fungiert [Bernardi und Azzone,

1981].

Die gefundenen Ähnlichkeiten zur beschriebenen Hydroxylaminreduktase [Bernheim

und Hochstein, 1968; Kadlubar et al., 1973] führten zu der Annahme, dass

Hydroxylamin ein kompetitiver Hemmstoff von Benzamidoxim sein könnte. Diese

wurde in der Arbeit von Havemeyer [2006] bestätigt. Auch in dieser Arbeit konnte

die starke Hemmung der Benzamidoximreduktion durch Hydroxylamin belegt werden


150

(Abb. 3.8). Dieses bedeutet, dass auch in Schweinenierenmitochondrien ein der

Hydroxylaminreduktase vergleichbares Enzymsystem vorhanden sein muss.

Neben den Elektronentransportproteinen Cytochrom b5 und Cytochrom b5 Reduktase,

welche in der löslichen Form allein dazu in der Lage sind Benzamidoxim zu

reduzieren [Kurian et al., 2004; Saulter et al., 2005], wurde bei den

membranständigen Enzymen die Beteiligung einer dritten Komponente beschrieben

[Kadlubar und Ziegler, 1974; Clement et al., 1997; Andersson et al., 2005], durch die

die Umsetzungsraten deutlich erhöht werden konnten.

Ein Cytochrom P450 Isoenzym soll im mikrosomalen Enzymsystem für diese

Umsatzratensteigerung verantwortlich sein [Clement et al., 1997]. Der Cytochrom

P450-Gehalt der in dieser Arbeit gewonnenen Schweinenierenmitochondrien war

allerdings sehr gering und lag in der Nähe der Detektionsgrenze (Daten nicht

gezeigt). In der äußeren Membran von Schweinelebermitochondrien hingegen konnte

die Beteiligung des Molybdäncofaktors gezeigt werden [Havemeyer, 2006].



durchgeführten Untersuchung keinen Einfluss (Abb. 3.11). Kohlenmonoxid hemmt

die Ferroform des im Hämgerüst enthaltenen Eisens. Zur Übertragung der Protonen

während der Reduktion muss aber im postulierten Mechanismus [Clement, 2002] die

Ferriform vorliegen.

Dieses wurde durch den Hemmstoff Kaliumcyanid überprüft (Abb. 3.7). Es konnte

eine Empfindlichkeit des Enzymsystems für Cyanidionen festgestellt werden. Dabei

wurde die Umsetzungsrate auf 40 % des Anfangswertes reduziert. Die in der

Literatur beschriebenen Daten sind sehr unterschiedlich. Während Bernheim und

Hochstein [1968] eine vollständige Hemmung erreichen konnten, beschrieben

Kadlubar und Ziegler [1974] sowie Clement et al. [1997] eine Insensitivität des

untersuchten Enzymsystems gegenüber Cyanidionen. Lopian [2002], Andersson et al. [2005] und Havemeyer [2006] konnten die partielle Hemmung feststellen. Die

Deutung dieser Feststellung kann unterschiedlich ausgelegt werden. Auf der einen

Seite können mehrere Enzymsysteme an der Reduktion von Benzamidoxim beteiligt

sein, welche sich nur partiell durch Cyanidionen hemmen lassen. Andererseits ist

aber auch eine nur partielle Hemmung des Cytochrom b5 denkbar. Das Hämgerüst

dieses Enzyms ist fast vollständig vom umgebenden Medium abgeschirmt

[Strittmatter und Dailey, 1982; Durley und Mathews, 1996]. Durch diese

Abschirmung des Hämgerüstes wird unter anderem die geringe Bindungsfähigkeit

von Liganden wie Kohlenmonoxid und Cyanid erklärt (Kapitel 6.1.1), was auch zu

einer geringeren Hemmung des Enzyms führen könnte.


151

Havemeyer [2006] hat in der äußeren Membran von Schweinelebermitochondrien

den Molybdäncofaktor als verantwortliches Coenzym für die Reduktion von

Benzamidoxim gefunden. Aufbau und Funktionsweise sind in Kapitel 6.1.4

beschrieben. Molybdänhaltige Enzyme sind durch Vanadationen hemmbar

[Ramadoss, 1980].

Eine Hemmung des in den Schweinenierenmitochondrien befindlichen Enzymsystems

fand schon bei niedriger Konzentration von Vanadationen statt (Abb. 3.12). Die

Beteiligung des Molybdäncofaktors am Benzamidoxim reduzierenden Enzymsystem

ist somit in den Schweinenierenmitochondrien nicht auszuschließen. Da aber neben

den molybdänhaltigen Enzymen noch weitere Enzyme wie Tyrosinphosphatase

[Swarup et al., 1982], Phospholipase C [Tan und Roberts, 1996], Glucose-6-

Phosphatase [Singh et al., 1981] und Succinyl-CoA Ligase [Krivanek und Novakova,

1991] durch Vanadationen gehemmt werden, ist eine Bestätigung der

Verantwortlichkeit zu diesem Zeitpunkt noch nicht möglich.


152

3.5 Zusammenfassung

Es wurden Schweinenierenmitochondrien nach der Methode von Hovius et al. [1990]

mittels kontinuierlicher Dichtegradientenzentrifugation über Percoll® gewonnen. Die

Übertragbarkeit dieser Methode von Leber auf Niere war dabei größtenteils gegeben.

Das relativ harte Nierengewebe musste zu Beginn maschinell stärker bearbeitet

werden, wodurch die Möglichkeit einer Zellbeschädigung erhöht wurde. Während der

Zentrifugationsschritte waren die abzutrennenden Nierenfraktionen im Vergleich zu

den Leberfraktionen deutlich schlechter sichtbar. Die untersuchten Marker zur

Anreicherung der Mitochondrien und zum Kontaminationsnachweis durch

mikrosomale Fragmente zeigten aber trotzdem eine gute Isolierung der

Mitochondrien, weshalb die Methode nicht weiter verändert werden musste.

Die Schweinenierenmitochondrien zeigten die typischen in der Literatur

beschriebenen Charakteristika N-reduzierender Reaktionen. Diese beinhalten das

schwach saure Milieu sowie Kohlenmonoxid- und Sauerstoffinsensitivität. Die

Beteiligung der Elektronentransportproteine Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5

Reduktase konnte bestätigt werden. Die Hydroxylaminreduktase beinhaltet auch

Cytochrom b5 und seine Reduktase als verantwortliche Enzyme. Da Hydroxylamin als

kompetitiver Hemmstoff der Benzamidoximreduktion fungiert, wurde eine

Gemeinsamkeit zur Hydroxylaminreduktase gezeigt. Die Hemmbarkeit der Reaktion

durch Vanadationen lässt die Möglichkeit einer Beteiligung vom Molybdäncofaktor zu,

da Vanadat als Inhibitor von Molybdoenzymen beschrieben ist.

Im Gegensatz zu bisherigen Untersuchungen wurden, eventuell bedingt durch die

unterschiedliche Art der Gewinnung, andere Enzymverhältnisse in den

Schweinenierenmitochondrien gefunden. Zudem ergab sich ein wesentlich

niedrigerer Km-Wert, welcher in einem vergleichbaren Rahmen zu den bisherigen

Ergebnissen aus Leber, Darm und Gehirn lag.

Eine Cytochrom P450 Isoenzym Beteiligung konnte zu diesem Zeitpunkt weder

bestätigt noch ausgeschlossen werden. Der niedrige Cytochrom P450-Gehalt bei

gleichzeitig hoher N-reduktiver Aktivität sowie Insensitivität gegenüber

Kohlenmonoxid und nur partielle Sensitivität gegenüber Cyanidionen lässt eine

Beteiligung am mitochondrialen N-reduktiven System der Schweineniere unsicher

erscheinen.

ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER ÄUßEREN MEMBRAN VESIKEL

153

4 ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER

ÄUßEREN MEMBRAN VESIKEL

4.1 Einleitung

4.1.1 Aufbau und Funktion der Mitochondrien

Das Mitochondrium ist ein von einer Doppelmembran umschlossenes Organell, das

als „Kraftwerk“ der eukaryotischen Zelle fungiert (Abb. 4.1). Die Hauptfunktion des

Mitochondriums ist, im Rahmen der Zellatmung unter Sauerstoff-Verbrauch ATP zu

generieren. Mitochondrien kommen verteilt im Cytosol der meisten Eukaryoten vor.

Ihre Größe beträgt etwa 0,5 bis 10 µm in der Länge [Stryer et al., 2003].

Besonders viele Mitochondrien finden sich in Zellen, die viel Energie verbrauchen

(z. B. Muskelzellen, Nervenzellen, Eizellen). Mitochondrien werden über das Plasma

der Eizelle nur von der Mutter vererbt, was Anlass zur Erforschung mütterlicher

Verwandtschaftslinien war. Es hat sich mittlerweile herausgestellt, dass auch durch

das Spermium einige männliche Mitochondrien in das Plasma der befruchteten Eizelle

importiert werden. Diese „männlichen“ Mitochondrien werden jedoch wahrscheinlich

recht schnell eliminiert, denn sie sind, so wird inzwischen angenommen, schon von

vornherein als potentiell gefährlicher „Zellabfall“ markiert worden.

Der Transport von Proteinen in die Mitochondrien erfolgt über die äußere Membran

durch den TOM-Komplex (translocase of outer mitochondrial membrane) und über

die innere Membran durch den TIM-Komplex (translocase of inner mitochondrial

membrane). Auf der äußeren Membran sind Rezeptorproteine für den

Proteintransport [Lill und Neupert, 1996], Porenproteine [Benz, 1994] sowie

morphologisch wirksame Proteine [Sogo und Yaffe, 1994] zu finden. Zudem spielt die

äußere Membran der Mitochondrien beim programmierten Zelltod eine Rolle [Reed,

1997]. Die regulatorischen Mechanismen sind im Intermembranraum lokalisiert

[Parone et al., 2002]. Die innere Membran ist im Gegensatz zur äußeren Membran

nicht für kleine Moleküle und Ionen permeabel [Stryer et al., 2005]. Durch eine

defekte Mitochondrien-Funktion (Mitochondriopathien) können Krankheiten

hervorgerufen werden. Mitochondrien vermehren sich durch Teilung, wobei die

Anzahl der Mitochondrien einer Zelle deren Energiebedarf angepasst werden kann.

Eine eukaryotische Zelle, die alle ihre Mitochondrien verliert, ist nicht in der Lage

diese zu regenerieren.


154

Mitochondrien sind häufig an das Endoplasmatische Retikulum assoziiert oder sogar

vollkommen davon umgeben. Hierbei entstehen auch Membranfusionen [Ardail et al., 1993].

Abb. 4.1: Aufbau eines Mitochondriums (Quelle: http://en.wikipedia.org/wiki/Mitochondria)

Die äußere Membran umschließt das gesamte Mitochondrium und enthält Kanäle aus

Proteinkomplexen, welche den Austausch von Molekülen und Ionen zwischen dem

Mitochondrium und dem Cytosol ermöglichen. Große Moleküle können die Membran

nicht passieren. Die innere Membran besteht entweder beim Christae-Typ aus

Christae genannten Einstülpungen, wodurch die Oberfläche, an der die chemischen

Reaktionen stattfinden können, erheblich vergrößert wird [Karlson et al., 1994]. Sie

umschließt die Matrix, die interne Flüssigkeit des Mitochondriums. Die Membran

enthält große Proteinkomplexe, welche für die eigentliche Energiegewinnung

zuständig sind sowie spezielle Ionenkanäle und Transportproteine [Karlson et al., 1994; Da Cruz et al., 2003]. Außerdem ist der größte Teil des mitochondrialen

Proteoms auf der inneren Membran lokalisiert [Schnaitman et al., 1967; della-Cioppa

et al., 1986]. Cytochrom P450 Isoenzyme sind fast ausschließlich auf der inneren

Membran lokalisiert [Sottocasa und Sandri, 1970; Comte und Gautheron, 1978; della-

Cioppa et al., 1986]. Der andere Membran-Typ heißt Tubuli-Typ und findet sich z. B.

Granulum Ribosom

Christae

Intermembranraum

Matrix

ATP Synthase Partikel

DNA

Innere Membran

Äußere Membran


155

in steroidproduzierenden Zellen. Der Intermembranraum zwischen den beiden

Membranen enthält Enzyme, die Nukleotide unter ATP-Verbrauch phosphorylieren

können [Karlson et al., 1994]. Zwischen den beiden mitochondrialen Membranen

existieren zudem Kontaktstellen [Speer et al., 2005]. Die Matrix und die innere

Membran bilden den Mitoplasten.

Die wichtigste Funktion der Mitochondrien ist die Beteiligung an der Atmungskette.

Dabei wird mit Hilfe von Elektronen-Transportvorgängen und durch Anreicherung von

Wasserstoffionen ein elektrochemischer Gradient zwischen dem Intermembranraum

und der mitochondrialen Matrix aufgebaut, der dazu dient, mittels einer speziellen

ATPase, der ATP-Synthase, ATP herzustellen. Die zum Aufbau des Gradienten

benötigten Elektronen und Wasserstoffatome werden durch oxidativen Abbau aus

den vom Organismus aufgenommenen Nährstoffen (z. B. Glucose) gewonnen.

Zunächst läuft im Cytoplasma die Glykolyse ab. Hierbei entsteht Pyruvat, welches in

die mitochondriale Matrix eingeschleust wird. Durch die Pyruvat-Dehydrogenase wird

dann Pyruvat zu Acetyl-CoA decarboxyliert. Eine andere Quelle des Acetyl-CoA ist der

Fettsäureabbau, so dass sich hier katabole Wege vereinigen. Aus Acetyl-CoA wird im

Citrat-Zyklus in der Mitochondrien-Matrix der überwiegende Teil der

Reduktionsäquivalente gewonnen, die dann in der Mitochondrienmembran innerhalb

der Atmungskette in Zellenergie umgewandelt werden.

Nach der Endosymbiontentheorie geht man davon aus, dass sowohl die

Mitochondrien als auch die Chloroplasten aus einer Symbiose von aeroben Bakterien

mit Eukaryoten hervorgegangen sind. Hinweise darauf sind der Besitz eigener

genetischer Information, eine eigene Proteinsynthese und das Vorhandensein einer

inneren Membran, die sich deutlich vom Bau der äußeren Membran unterscheidet

und die der Erzeugung von ATP aus ADP dient. Die Mitochondrien sind jedoch so

spezialisiert, dass sie allein nicht lebensfähig sind. Zuletzt wurde auch

herausgefunden, dass die Mitochondrien relativ eng mit anderen, seltener

auftretenden Organellen, den Hydrogenosomen verwandt sind. Ein Verbindungsglied

stellt das Wasserstoff-synthetisierende Mitochondrium dar [Boxma et al., 2005].

Die Mitochondrien besitzen ein eigenes Genom, das etwa 1 % der genetischen

Information des Menschen ausmacht. Deshalb werden Mitochondrien als

semiautonom bezeichnet. Die mitochondriale DNA ist ein ringförmiges DNA-Molekül,

welches in der Matrix der Mitochondrien lokalisiert ist.

Die mitochondriale DNA erlaubt den Mitochondrien nicht, sich unabhängig von der

Zelle, in der sie sich befinden, zu teilen und zu vermehren. Allerdings ist die


156

Teilungsfrequenz der Mitochondrien nur indirekt von derjenigen der Zelle abhängig.

Auf der mitochondrialen DNA befinden sich einige Gene für die Enzyme des Citrat-

Zyklus sowie Gene, die für die Struktur und Reproduktion der Mitochondrien

verantwortlich sind [Karlson et al., 1994]. Jedoch sind die Gene von mehr als 90 %

der Proteine, aus denen ein Mitochondrium besteht, im Zellkern lokalisiert und

werden im Cytoplasma der Zelle synthetisiert. Die Proteine werden im Anschluss an

die Transkription und Translation mit Hilfe einer komplexen Translokationsmaschi-

nerie über die beiden mitochondrialen Membranen ins Innere der Mitochondrien

importiert [Westermann et al., 2001; Rehling et al., 2003].

Ende der Siebziger Jahre wurde erstmalig die Beteiligung der Mitochondrien am

Fremdstoffmetabolismus beschrieben [Blume und Oelschläger, 1978]. N-reduktive

Reaktionen wurden allerdings bereits vorher gefunden [Bernheim, 1969]. In jüngster

Zeit werden vor allem Untersuchungen zur Reduktion von Benzamidoximen in

Lebermitochondrien untersucht [Kurian et al., 2004; Andersson et al., 2005; Clement

et al, 2005b].

4.1.2 Methoden zur Gewinnung der Äußeren Membran Vesikel

Erste Hinweise zur Lokalisation des N-reduktiven Enzymsystems innerhalb der

Mitochondrien sind von Deters [2002] beschrieben worden. Deters [2002] konnte

eine N-reduktive Aktivität auf der äußeren Membran der Mitochondrien feststellen.

Havemeyer [2006] konnte diese These in ihrer Arbeit bestätigen. Beide haben ihre

Untersuchungen mit Lebermitochondrien durchgeführt. Havemeyer [2006] hat dabei

verschiedene in der Literatur beschriebene Methoden zur Gewinnung der „Äußeren

Membran Vesikel“ miteinander verglichen.

Die wohl bekannteste Methode ist das Digitonin-Stripping [Schnaitman et al., 1967].

Hierbei wird die Komplexbildung zwischen Digitonin und Cholesterol ausgenutzt. Da

Cholesterol nur in der äußeren, nicht aber in der inneren Membran der Mitochondrien

vorkommt [Karlson et al., 1994], soll hiermit eine selektive Ablösung der äußeren

Membran möglich sein. Allerdings greift Digitonin in Abhängigkeit der

Inkubationsdauer auch die innere Membran an [Hovius et al., 1990]. Zudem hemmt

Digitonin die zu untersuchende N-reduktive Aktivität [Havemeyer, 2006].


157

Kurze Zeit später wurde die hypoosmotische Lyse beschrieben [Parsons und

Williams, 1967]. Mittels einer hypotonen Lösung werden die Mitochondrien zum

Schwellen gebracht. Dadurch bricht die äußere Membran und trennt sich ab.

Die hypoosmotische Lyse wurde in den folgenden Jahren zur Grundlage weiterer

Gewinnungsverfahren angewandt und modifiziert [Decker und Greenawalt, 1977]. Im

French-pressure-cell Verfahren werden die Mitochondrien ebenfalls vorgequollen.

Nach Überführung in eine hydraulische Presse und plötzlich durchgeführtem

Druckausgleich platzt die äußere Membran ab. Diese Methode wird vornehmlich zur

Gewinnung von Mitoplasten angewendet.

Die Swell-Shrink Methode benutzt als Grundlage ebenfalls die hypoosmotische Lyse.

Zusätzlich werden ATP und Magnesiumsalze zugefügt, um ein selektives Schrumpfen

der inneren Membran zu erzeugen. Hiermit wird das Aufbrechen der inneren

Membran verhindert [Sottocasa et al., 1967; Murthy und Pande, 1987].

Die neueste Methode setzt zunächst auch die hypoosmotische Lyse als ersten Schritt

voraus. Danach wird die äußere Membran mechanisch mittels eines Potter-Elvehjem-

Homogenisators abgeschilfert [de Kroon et al., 1999]. Aus diesem Grunde wird die

Methode auch als Swell-Disruption bezeichnet. Ursprünglich fand sie Anwendung bei

der Gewinnung äußerer mitochondrialer Membran aus Schimmelpilzen [Mayer et al., 1993].

Nach Abspaltung der äußeren Membran muss diese im folgenden Schritt von den

Mitoplasten abgetrennt werden. Die äußere Membran lagert sich dabei

typischerweise zu kleinen Vesikeln zusammen, so dass man dann von „Äußeren

Membran Vesikeln“ spricht [Schnaitman et al., 1967; della-Cioppa et al., 1986].

Genutzt wird hierzu die Zentrifugation, wobei zwei unterschiedliche

Zentrifugationsschritte, Dichtegradientenzentrifugation oder Differential-

zentrifugation, möglich sind. Letztere fällt die Mitoplasten mit 9.500 g und die

Äußeren Membran Vesikel mit 144.000 g [Schnaitman und Greenawalt, 1968].

Ähnlich der Charakterisierung von Mitochondrien (s. Kapitel 3.1) sind die Äußeren

Membran Vesikel auf ihre Reinheit hin zu untersuchen. Dabei können verschiedene

Methoden, wie enzymatische [Schnaitman und Greenawalt, 1968],

immunochemische [de Kroon et al., 1999] und analytische Testverfahren oder auch

elektronenmikroskopische Aufnahmen [Parsons und Williams, 1967] eingesetzt

werden.

Enzymatische Untersuchungen setzen die Anreicherung von Leitenzymen der

jeweiligen Kompartimente voraus. Hierbei sollte das Leitenzym selektiv nur in der zu

untersuchenden Subfraktion vorkommen. Bezogen auf die Mitochondrien gelten

Monoaminoxidase und Rotenon-insensitive Cytochrom c Reduktase für die äußere


158

Membran als Leitenzyme. Die innere Membran wird durch Cytochrom c Oxidase und

Succinat Cytochrom c Reduktase charakterisiert. Schließlich gelten für die Matrix

Malat Dehydrogenase und Glutamat Dehydrogenase und für den Intermembranraum

Adenylyl Kinase als Markerenzyme [Schnaitman und Greenawalt, 1968; Decker und

Greenawalt, 1977].


Havemeyer [2006] hat in ihrer Arbeit die oben genannten Methoden zur Gewinnung

der Äußeren Membran Vesikel miteinander verglichen. Das beste Ergebnis zur

Gewinnung der Subfraktion besteht dabei aus der Swell-Disruption Methode

kombiniert mit anschließender Zweischritt-Dichtezentrifugation. Diese besteht aus

einem Sedimentations- und einem Flotationsschritt. Die Kontamination der Äußeren

Membran Vesikel mit innerer Membran war bei dieser Methode am geringsten.

Zudem konnte gezeigt werden, dass die N-reduktive Aktivität in den Äußeren

Membran Vesikeln wieder zu finden ist [Havemeyer, 2006]. Alle Arbeiten wurden mit

Schweinelebermitochondrien und ihren Äußeren Membran Vesikeln durchgeführt.

4.1.4 Zielsetzung

In dieser Arbeit sollten Äußere Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien

nach der Swell-Disruption Methode mit anschließender Zweischritt-

Dichtezentrifugation [de Kroon et al., 1999] gewonnen werden. Eine Übertragbarkeit

der Methode auf Schweinenierenmitochondrien sollte überprüft und die Methode

gegebenenfalls modifiziert werden. Die erhaltenen Vesikel waren anschließend,

basierend auf enzymatische Testverfahren, mit Markeraktivitäten zu bewerten. Die

Lokalisation der N-reduktiven Aktivität in den Äußeren Membran Vesikeln sollte

überprüft werden.

Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung der Äußeren Membran

Vesikel, welche Proteinbestimmung, Reinheit, N-reduktive Aktivität und Hemmstudien

mit einschloss.


159

4.2 Methoden





4.2.1.2 Gewinnung von Äußeren Membran Vesikeln aus Schweine-nierenmitochondrien

Die Gewinnung der Äußeren Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien

wurde modifiziert nach de Kroon et al. [1997] durchgeführt. Es handelt sich dabei

um die Swell-Disruption Methode mit wiederholter Dichtegradientenzentrifugation.

Die folgenden Reinigungsschritte fanden bei 4 °C oder unter Eiskühlung statt.

Die aufgereinigten Mitochondrien, welche mittels Dichtegradientenzentrifugation

gewonnen wurden (Kapitel 3.2.1.2), sind mit 500 ml Standardpuffer (10 mM

Kaliumphosphat, 250 mM Saccharose, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,1 % (w/v) BSA,

pH 7,4) pro 1 g Mitochondrien versetzt und 20 Minuten bei 10.000 g (Rotor JA 10)

zentrifugiert worden.

Das erhaltene Pellet wurde in einem hypotonen Puffer (2,5 mM Kalium-

dihydrogenphosphat, 2,5 mM Dikaliumhydrogenphosphat, 5 mM EDTA, pH 7,2) zu

5 mg/ml resuspendiert und 20 Minuten unter Kühlung gerührt. Die erhaltene

Suspension wurde mit einem Potter-Elvehjam-Homogenisator (Potter 940 S

Glaszylinder, 20 Auf- und Abbewegungen des Zylinders, 500 Umdrehungen/min des

Teflonhomogenisators) homogenisiert.

Das erhaltene Homogenat wurde auf einen diskontinuierlichen Saccharose-

Dichtegradienten geschichtet. Dabei bestand der Gradient aus 15 ml 1,1 M

Saccharoselösung (1,1 M Saccharose, 10 mM MOPS, 2,5 mM EDTA, pH 7,2), 25 ml

0,25 M Saccharoselösung (0,25 M Saccharose, 10 mM MOPS, 2,5 mM EDTA, pH 7,2)

und 30 ml Homogenat. Die Zentrifugation wurde 70 Minuten bei 142.000 g (Rotor

45 Ti) durchgeführt. In diesem Sedimentationsschritt reicherten sich die Äußeren

Membran Vesikel in der Grenze 0,25 M/1,1 M Saccharose an. Diese Schicht wurde

abgetrennt und mit 1,1 M Saccharoselösung zu 240 ml verdünnt.

Im nachfolgenden Flotationsschritt wurde eine weitere diskontinuierliche Saccharose-

Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt. Der Gradient bestand aus 40 ml Lösung


160

des Sedimentationsschrittes, 10 ml 1,065 M Saccharoselösung (1,065 M Saccharose,

10 mM MOPS, 2,5 mM EDTA, pH 7,2) und 20 ml Basispuffer (10 mM MOPS, 2,5 mM

EDTA, pH 7,2). Die Zentrifugation wurde 16 Stunden bei 142.000 g (Rotor 45 Ti)

durchgeführt. Die Äußeren Membran Vesikel reicherten sich in der Grenzschicht

Basis-/Saccharoselösung an. Diese Schicht wurde abgetrennt und mit Basispuffer zu

420 ml verdünnt.

Die gewonnenen Äußeren Membran Vesikel wurden abschließend 70 Minuten bei

235.000 g (Rotor 45 Ti) gefällt. Das resultierende Pellet wurde mit 4-6 ml

Lagerungspuffer (220 mM Mannitol, 70 mM Saccharose, 2 mM HEPES, pH 7,4) zu

1 mg/ml resuspendiert, aliquotiert und bei -80 °C eingefroren.



Die Methode zur Proteinbestimmung ist in Kapitel 3.2.2.1 beschrieben.

4.2.2.2 Succinat Cytochrom c Reduktase-Aktivitätsbestimmung

Die Bestimmung der Succinat Cytochrom c Reduktase-Aktivität wurde nach der

Methode von Sottocasa et al. [1967] durchgeführt. Hierbei wurde die Reduktion von

Cytochrom c spektralphotometrisch vermessen. Es wurde die Absorptionsänderung

bei 550 nm verfolgt, da das reduzierte Cytochrom c hier sein Absorptionsmaximum

hat. Zur Berechnung der Enzymaktivität wurde der Absorptionskoeffizient

ε=21 mM-1*cm-1 für die reduzierte Form des Cytochrom c herangezogen [Kamin et al., 1965].

Die Zusammensetzung des Enzymassays war wie folgt: etwa 20 µg Protein, 3000 µM

Succinat, 100 µM Cytochrom c, 300 µM Kaliumcyanid in 50 mM Phosphatpuffer

pH 7,5. Alle Reagenzien wurden stets frisch hergestellt. Präparationsabhängig

wurden unterschiedliche Proteinmengen eingesetzt. Succinat wurde als

Reaktionsstarter zum Schluss zugesetzt. Die Messzeit betrug 60 Sekunden bei 30 °C.


Enzymmenge definiert ist, die pro Minute 1 µmol Cytochrom c umsetzt.


161

4.2.2.3 Rotenon-insensitive Cytochrom c Reduktase-Aktivitätsbestimmung

Die Bestimmung der Rotenon-insensitive Cytochrom c Reduktase-Aktivität wurde

nach der Methode von Sottocasa et al. [1967] durchgeführt. Hierbei wurde die

Reduktion von Cytochrom c spektralphotometrisch vermessen. Es wurde die

Absorptionsänderung bei 550 nm verfolgt, da das reduzierte Cytochrom c hier sein

Absorptionsmaximum hat. Zur Berechnung der Enzymaktivität wurde der



Die Zusammensetzung des Enzymassays war wie folgt: 2-5µg Protein, 100 µM NADH,

100 µM Cytochrom c, 300 µM Kaliumcyanid, 1,5 µM Rotenon in 50 mM

Phosphatpuffer pH 7,5. Alle Reagenzien wurden stets frisch hergestellt.

Präparationsabhängig wurden unterschiedliche Proteinmengen eingesetzt. Das

Rotenon musste aufgrund seiner geringen Löslichkeit zunächst in einer 3,75 mM

Stammlösung in Dimethylsulfoxid gelöst werden. In einer 1:50 Verdünnung wurde

durch vorsichtige Zugabe des Phosphatpuffers eine 75 µM Lösung geschaffen, die im

Enzymassay eingesetzt werden konnte. NADH wurde als Reaktionsstarter zum

Schluss zugesetzt. Die Messzeit betrug 60 Sekunden bei 30 °C. Die Enzymaktivität ist

im Folgenden in Units (U) angegeben, wobei 1 U als diejenige Enzymmenge definiert

ist, die pro Minute 1 µmol Cytochrom c umsetzt.


Die Methode der Monoaminoxidase-Aktivitätsbestimmung ist in Kapitel 3.2.2.3

beschrieben.

4.2.2.5 Cytochrom P450-Gehaltsbestimmung

Die Methode der Cytochrom P450-Gehaltsbestimmung ist in Kapitel 2.2.2.5

beschrieben.


162









Reinheit geprüft.




Biotransformationsstudien der äußere Membran setzte sich aus 4 µg mitochondrialem



Zunächst wurde die äußere Membran bei 37 °C zwei Minuten vorinkubiert, dann das


Reaktion durch Zugabe von NADH gestartet. Nach zehn Minuten wurde die Reaktion










163











4*4 mm (Merck, Darmstadt)



Laufzeit: 28 Minuten

Flussrate: 1 ml/min



Die Retentionszeiten lagen bei 8,0±0,2 Minuten (Benzamidoxim) und 24,2±0,2

Minuten (Benzamidin).




Für jede Konzentration wurden 2 Ansätze parallel pipettiert, die jeweils doppelt



wurden den Inkubationsansätzen die für die Kalibrierung verwendeten Benzamidin-



164


4.2.3.1.2 vermessen. Benzamidin konnte im angegebenen Konzentrationsbereich (bis






wurden in einem mit Argon begasten Exsikkator mit 37 °C warmem




verschlossen und im 37 °C Schüttelwasserbad inkubiert. Nach zehn Minuten wurde

die Reaktion durch Zugabe von 150 µl Methanol gestoppt. Die Proben wurde fünf








die für die mitochondriale Fraktion gültige Standardzusammensetzung (s. Kapitel




Je nach Hemmstoff wurden die nachfolgend aufgeführten Modifikationen

durchgeführt. Um allen Hemmstoffen ausreichend Zeit zu bieten mit den Enzymen

wechselwirken zu können, ohne dabei durch das Substrat gestört zu werden, wurden

die Reaktionen, nicht wie üblich durch das Cosubstrat gestartet, sondern mit dem

Substrat selbst.


165




des Substrates Benzamidoxim gestartet. Die Reaktion wurde nach zehn Minuten


geschüttelt, mindestens 60 Minuten bei -20 °C eingefroren, fünf Minuten bei






Zugabe des Substrates Benzamidoxim gestartet. Die Reaktion wurde nach zehn

Minuten durch Zugabe von 150 µl Methanol gestoppt. Die Proben wurden fünf








zehn Minuten durch Zugabe von 150 µl Methanol gestoppt. Die Proben wurden fünf







des Substrates Benzamidoxim gestartet. Die Reaktion wurde nach zehn Minuten


geschüttelt, mindestens 60 Minuten bei -20 °C eingefroren, fünf Minuten bei


166






Biotransformationsstudien setzte sich aus 53 µg Äußeren Membran Vesikeln, 300 µM

NADH und 400 µM Benzamidoxim in 2000 µl eines 100 mM Kaliumphosphatpuffers

pH 5,9 zusammen.

Zunächst wurden die Äußeren Membran Vesikel bei 37 °C zwei Minuten mit

Benzamidoxim vorinkubiert, dann 30 Sekunden mit Kohlenmonoxid begast, und nach

weiteren fünf Minuten Vorinkubation wurde die Reaktion durch Zugabe von NADH

gestartet. Nach zehn Minuten wurde die Reaktion durch Zugabe von 2000 µl

Methanol gestoppt. Die Proben wurden fünf Minuten geschüttelt und danach für

mindestens 60 Minuten bei -20 °C eingefroren. Eine anschließende Zentrifugation bei

12.000 g trennte das denaturierte Protein ab. Gebildetes Benzamidin wurde mittels

der unter Kapitel 4.2.3.1.3 beschriebenen Analytik quantifiziert.




Zugabe des Substrates Benzamidoxim gestartet. Die Reaktion wurde nach zehn

Minuten durch Zugabe von 150 µl Methanol gestoppt. Die Proben wurden fünf





167

4.3 Ergebnisse

4.3.1 Charakterisierung der Äußeren Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien

4.3.1.1 Proteinausbeute der Äußeren Membran Vesikel-Gewinnung

Zur Bestimmung des Proteingehaltes mittels der BCA-Methode sind jeweils

mindestens zwei Einzelmessungen durchgeführt worden. Die daraus gebildeten

Mittelwerte wurden für die weiteren Bestimmungen eingesetzt. Die prozentualen

Standardabweichungen wurden berechnet und lagen stets unter 5 %. Eventuell

störende Substanzen (EDTA, DTT) aus den zur Gewinnung verwendeten Puffern

zeigten bei den eingesetzten Probeverdünnungen 1:2 bis 1:5 keinen Einfluss auf die

Messergebnisse (Daten nicht gezeigt).

Der mittlere Proteingehalt einer Mitochondriencharge lag bei 1-1,5 mg/ml. Die dabei

gewonnene Gesamtproteinmenge lag chargenabhängig zwischen 7 und 10 mg.

Damit wurde eine Ausbeute von etwa 0,5-0,6 % erzielt.

4.3.1.2 Enzymatische Charakterisierung der Äußeren Membran Vesikel

4.3.1.2.1 Succinat Cytochrom c Reduktase

Die Kontrolle der erfolgreichen Abscheidung der Matrix, der inneren Membran und

des Intermembranraums von der äußeren Membran wurde anhand des inneren

Membranmarkers Succinat Cytochrom c Reduktase bestimmt. Aus der spezifischen

Aktivität des Enzyms in der äußeren Membran im Verhältnis zur spezifischen Aktivität

in den Mitochondrien wurde die relative spezifische Aktivität errechnet. Tabelle 4.1

zeigt die spezifische und relative Aktivität nach der Methode von Sottocasa et al. [1967].


168

Tab. 4.1: Succinat Cytochrom c Reduktase-Aktivität der mittels Swell-Disruption Methode gewonnenen Äußeren Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien und der korrespondierenden Schweinenierenmitochondrien (Kapitel 4.2.1.2)

Fraktion spezifische Enzymaktivität

[U*mg-1]

relative spezifische

Aktivität

Mitochondrien 0,118 ± 0,015 1

Äußere Membran Vesikel 0,003 ± 0,000 0,025 Die Enzymaktivität wurde als Mittelwert aus mindestens drei separaten Bestimmungen ermittelt. Die Succinat Cytochrom c Reduktase-Aktivität wurde nach der Methode von Sottocasa et al. [1967] bestimmt. Hierbei wurde die Reduktion von Cytochrom c spektralphotometrisch vermessen (Kap. 4.2.2.2).

4.3.1.2.2 Rotenon-insensitive Cytochrom c Reduktase-Aktivität

Die Kontrolle der erfolgreichen Anreicherung der Äußeren Membran Vesikel wurde

anhand des äußeren Membranmarkers Rotenon-insensitive Cytochrom c Reduktase

bestimmt. Aus der spezifischen Aktivität des Enzyms in der äußeren Membran im

Verhältnis zur spezifischen Aktivität in den Mitochondrien wurde die relative

spezifische Aktivität errechnet. Tabelle 4.2 zeigt die spezifische und relative Aktivität

nach der Methode von Sottocasa et al. [1967].

Tab. 4.2: Rotenon-insensitive Cytochrom c Reduktase-Aktivität der mittels Swell-Disruption Methode gewonnenen Äußeren Membran Vesikel aus Schweine-nierenmitochondrien und der korrespondierenden Schweinenierenmitochondrien (Kapitel 4.2.1.2)


[U*mg-1]


Aktivität


Äußere Membran Vesikel 1,560 ± 0,298 8 Die Enzymaktivität wurde als Mittelwert aus mindestens drei separaten Bestimmungen ermittelt. Die Rotenon-insensitive Cytochrom c Reduktase-Aktivität wurde nach der Methode von Sottocasa et al. [1967] bestimmt. Hierbei wurde die Reduktion von Cytochrom c spektralphotometrisch vermessen (Kap. 4.2.2.3).


169

4.3.1.2.3 Monoaminoxidase-Aktivitätsbestimmung

Die zusätzliche Kontrolle der erfolgreichen Anreicherung der Äußeren Membran

Vesikel wurde anhand des äußeren Membranmarkers Monoaminoxidase bestimmt.

Aus der spezifischen Aktivität des Enzyms in der äußeren Membran im Verhältnis zur

spezifischen Aktivität in den Mitochondrien wurde die relative spezifische Aktivität

errechnet. Tabelle 4.3 zeigt die spezifische und relative Aktivität nach der Methode

von Kline et al. [1986].

Tab. 4.3: Monoaminoxidase-Aktivität der mittels Swell-Disruption Methode gewonnenen Äußeren Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien und der korrespondierenden Schweinenierenmitochondrien (Kapitel 4.2.1.2)


[U*mg-1]


Aktivität


Äußere Membran Vesikel 0,353 ± 0,008 7 Die Enzymaktivität wurde als Mittelwert aus mindestens drei separaten Bestimmungen ermittelt. Die Monoaminoxidase-Aktivität wurde modifiziert nach der Methode von Kline et al. [1986] bestimmt. Hierbei wurde die enzymatisch katalysierte Bildung von Benzaldehyd vermessen (Kap. 4.2.2.4).

4.3.1.2.4 Cytochrom P450-Gehaltsbestimmung

Cytochrom P450 konnte in der nach Omura und Sato [1964] modifizierten Methode

in den Äußeren Membran Vesikeln nicht detektiert werden. Es konnte somit aus dem

aufgenommenen Differenzspektrum kein Gehalt errechnet werden.

4.3.1.2.5 N-reduktive Aktivität

Die Kontrolle der Lokalisation der N-reduktiven Aktivität in den Äußeren Membran

Vesikeln wurde anhand der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin bestimmt.

Aus der spezifischen Aktivität des Enzyms in der äußeren Membran im Verhältnis zur

spezifischen Aktivität in den Mitochondrien wurde die relative spezifische Aktivität

errechnet. Tabelle 4.4 zeigt die spezifische und relative Aktivität nach der Methode

von Friedrich [2003].


170

Tab. 4.4: N-reduktive Aktivität der mittels Swell-Disruption Methode gewonnenen Äußeren Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien und der korrespondierenden Schweinenierenmitochondrien (Kapitel 4.2.1.2)

Fraktion spezifische Aktivität

[nmol*min-1*mg-1]


Aktivität


Äußere Membran Vesikel 210,55 ± 6,11 10 Die Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 4.2.3.1.2 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand mit der in Kapitel 4.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.

4.3.1.2.6 Gesamtergebnis der Enzymcharakterisierung

Die Gewinnung der Äußeren Membran Vesikel dient dem Zweck, den Rest des

Mitochondriums möglichst vollständig zu entfernen. Die Fraktion enthält bestenfalls

nur noch Enzyme, die auch in der äußeren Membran vorkommen. Das heißt,

spezifische Enzyme der Matrix, der inneren Membran und des Intermembranraumes

sollten in den Äußeren Membran Vesikeln nicht mehr zu finden sein. Der Grad der

Reinheit der gewonnenen Vesikel wird über Quotienten relativer, spezifischer

Aktivitäten eines äußeren Membranmarkers im Verhältnis zur relativen, spezifischen

Aktivität intramitochondrialer Marker in diesen Vesikeln berechnet. Die relative,

spezifische Aktivität ist der Quotient aus der spezifischen Aktivität eines Enzyms und

der spezifischen Aktivität des Homogenats bzw. der Mitochondrien. Das Homogenat

stellt dabei die nach der Behandlung mit hypotonem Puffer erhaltene

Mitochondrienfraktion dar (Kap. 4.2.1.2). Die Literatur verwendet üblicherweise die

Aktivität von Mitochondrien als Vergleich, so dass in dieser Arbeit die relativen

spezifischen Aktivitäten auf Mitochondrien bezogen wurden.

Wird der Quotient der äußeren Membran ins Verhältnis zur inneren Membran gesetzt,

so erhält man die in Tabelle 4.5 aufgeführten Werte.


171

Tab. 4.5: Verunreinigung der mittels Swell-Disruption Methode gewonnenen Äußeren Membran Vesikel mit innerer Membran

Marker der äußeren

Membran

Marker der inneren

Membran


Aktivitäten Quotient

Rotenon-insensitive

Cytochrom c

Reduktase

Succinat

Cytochrom c

Reduktase

8 / 0,025 320

Monoaminoxidase

Succinat

Cytochrom c

Reduktase

7 / 0,025 280

Die relativen spezifischen Aktivitäten sind auf die unfraktionierten Mitochondrien bezogen.

4.3.1.3 Charakterisierung und Inkubationsoptimierung der Reduktion von Benzamidoxim durch Äußere Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien

Die nach der Methode von de Kroon et al. [1997] gewonnenen Äußeren Membran

Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien wurden nach den Gesichtspunkten

Proteinkonzentration, Inkubationszeit, Cosubstratabhängigkeit und -art, pH-Wert und

Substratabhängigkeit für das Substrat Benzamidoxim untersucht. Es ergab sich dabei

folgender optimierter Inkubationsansatz (Kapitel 4.2.3.1.2): 4 µg Äußere Membran

Vesikel, 300 µM NADH und 400 µM Benzamidoxim in 150 µl eines 100 mM

Kaliumphosphatpuffers pH 5,9 bei 10 Minuten Inkubationszeit. Die erhaltenen Daten

sind in den Abbildungen 4.1-4.5 dargestellt.

4.3.1.3.1 Proteinabhängigkeit

Aus den erhaltenen Signalflächen wurden mit Hilfe der Wiederfindung die

Umsetzungsraten berechnet. Dabei ergaben die Umsetzungsraten der Inkubationen

in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration im Bereich von 0 bis 20 µg je 150 µl

Inkubationsansatz einen linearen Verlauf. Eine weitere Erhöhung der

Proteinkonzentration führte zu einer Hemmung der Umsetzungsraten (Abb. 4.1).


172

0

1

2

3

4

5

6

0 20 40 60 80 100

Protein [µg]

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1]

Abb. 4.1: Proteinabhängigkeit der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch Äußere Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien. Die Inkubationsansätze setzten sich wie folgt zusammen: 0-100 µg Protein, 1 mM NADH und 1 mM Benzamidoxim in 150 µl eines 100 mM Kaliumphosphatpuffers pH 6,0. Die Inkubationszeit betrug 15 Minuten. Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 4.2.3.1.2 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand mit der in Kapitel 4.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.


173

4.3.1.3.2 Inkubationszeit

Bis zu einem Inkubationszeitraum von 20 Minuten verlief die Reduktion von

Benzamidoxim zu Benzamidin linear. Wurde noch länger inkubiert, so nahm die


wenigen Minuten gut quantifizierbar.

0

2000

4000

6000

8000

10000

0 50 100

Zeit [min]

Benz

amid

in[n

mol

*mg-1

]

Abb. 4.2: Zeitabhängigkeit der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch Äußere Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien. Die Inkubationsansätze setzten sich wie folgt zusammen: 4 µg Protein, 1 mM NADH und 1 mM Benzamidoxim in 150 µl eines 100 mM Kaliumphosphatpuffers pH 6,0. Die Inkubationszeit betrug 0-120 Minuten. Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 4.2.3.1.2 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand mit der in Kapitel 4.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.


174

4.3.1.3.3 pH-Wert


bei pH 5,9 (Abb. 4.3).

0

50

100

150

200

4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8

pH-Wert

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

Abb. 4.3: pH-Wertabhängigkeit der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch Äußere Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien. Die Inkubationsansätze setzten sich wie folgt zusammen: 4 µg Protein, 1 mM NADH und 1 mM Benzamidoxim in 150 µl eines 100 mM Kaliumphosphatpuffers pH 4,0-8,0. Die Inkubationszeit betrug 10 Minuten. Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 4.2.3.1.2 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand mit der in Kapitel 4.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.


175




halbmaximaler Sättigung (Km) 26 µM und die maximale Reaktionsgeschwindigkeit

(Vmax) 128,2 nmol*min-1*mg-1. Die sich daraus ergebene katalytische Effizienz lag bei

5*10-3 min-1*mg-1.

0

40

80

120

160

0 1000 2000 3000

Benzamidoxim [µM]

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

Abb. 4.4: Substratabhängigkeit der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch Äußere Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien. Die Inkubationsansätze setzten sich wie folgt zusammen: 4 µg Protein, 1 mM NADH und 0-3 mM Benzamidoxim in 150 µl eines 100 mM Kaliumphosphatpuffers pH 5,9. Die Inkubationszeit betrug 10 Minuten. Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 4.2.3.1.2 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand mit der in Kapitel 4.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.


176


Zur Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin war die Zugabe eines Cosubstrates

nötig. NADH wurde hierbei gegenüber NADPH bevorzugt (Abb. 4.5). Ab einer NADH-

Konzentration von 100 µM kam es zu keiner nennenswerten Steigerung der

Umsetzungsrate.



0

40

80

120

160

200

0 500 1000 1500 2000

Cosubstrat [µM]

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

NADH-Abhängigkeit

NADPH-Abhängigkeit

Abb. 4.5: Cosubstratabhängigkeit und -art der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch Äußere Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien. Die Inkubationsansätze setzten sich wie folgt zusammen: 4 µg Protein, 0-2 mM Cosubstrat (NADH oder NADPH) und 400 µM Benzamidoxim in 150 µl eines 100 mM Kaliumphosphatpuffers pH 5,9. Die Inkubationszeit betrug 10 Minuten. Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 4.2.3.1.2 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand mit der in Kapitel 4.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.


177

4.3.1.4 Sauerstoffabhängigkeit der Reduktion von Benzamidoxim mittels Äußeren Membran Vesikeln aus Schweinenieren-mitochondrien

Mittels Äußeren Membran Vesikeln aus Schweinenierenmitochondrien wurde die

Sauerstoffabhängigkeit der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin unter

aeroben und anaeroben Bedingungen getestet. Eine Abhängigkeit war nicht

festzustellen (Abb. 4.6)

0

50

100

150

200

250

aerob anaerob

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

Abb. 4.6: Sauerstoffabhängigkeit der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch Äußere Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien. Die Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 4.2.3.1.2 und 4.2.3.1.4 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand mit der in Kapitel 4.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.

4.3.1.5 Hemmstudien

Die Hemmergebnisse der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin mit Äußeren

Membran Vesikeln aus Schweinenierenmitochondrien werden in diesem Kapitel

zusammengestellt.


Hämhaltige Enzyme werden durch Cyanidionen gehemmt, wenn die Oxidationsstufe

des Eisens +3 beträgt. Der Cyanidioneneinfluss auf die Reduktion von Benzamidoxim

durch Äußere Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien wurde nach der in


178

Kapitel 4.2.3.1.5.1 beschriebenen Methode durchgeführt. Hierbei konnte eine

Hemmung festgestellt werden (Abb. 4.7). Es blieb eine Restaktivität von etwa 45 %

der Ausgangsaktivität erhalten. Die ermittelte IC50 ergab 423 µM.

0

50

100

150

200

250

0 500 1000 1500 2000

Cyanid [µM]

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

Abb. 4.7: Hemmung der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch Äußere Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien in Gegenwart von Kaliumcyanid. Die Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 4.2.3.1.5.1 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand mit der in Kapitel 4.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.


179


Hydroxylamin-HCl konnte die Reduktion von Benzamidoxim hemmen. Es blieb eine


IC50 ergab 95 µM.

Die kompetitive Hemmung wurde bereits von Havemeyer [2006] und Andersson et al. [2005] untersucht.

0

50

100

150

200

250

0 500 1000 1500 2000

Hydroxylamin [µM]

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

Abb. 4.8: Hemmung der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch Äußere Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien in Gegenwart von Hydroxylamin-HCl. Die Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 4.2.3.1.5.2 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand mit der in Kapitel 4.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.


180


Mit dem selektiven, kompetitiven Inhibitor p-Hydroxymercuribenzoat konnte die

Beteiligung der NADH Cytochrom b5 Reduktase an der Reduktion von Benzamidoxim

eindeutig gezeigt werden (Abb. 4.9). Ab 10 µM p-Hydroxymercuribenzoat war keine

Restaktivität mehr detektierbar (Abb. 4.9). Die ermittelte IC50 ergab 4 µM.

0

40

80

120

160

0 5 10 15 20 25


Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

Abb. 4.9: Hemmung der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch Äußere Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien in Gegenwart von p-Hydroxy-mercuribenzoat. Die Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 4.2.3.1.5.3 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand mit der in Kapitel 4.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.


181


Ab einer Konzentration von 3000 µM war eine fast vollständige Hemmung der

N-reduktiven Aktivität der Äußeren Membran Vesikeln aus

Schweinenierenmitochondrien mittels Cytochrom c zu detektieren (Abb. 4.10).


Azzone, 1981]. Die ermittelte IC50 ergab 257 µM.

0

50

100

150

200

0 1000 2000 3000

Cytochrom c [µM]

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

Abb. 4.10: Hemmung der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch Äußere Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien in Gegenwart von Cytochrom c. Die Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 4.2.3.1.5.4 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand mit der in Kapitel 4.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.


182



Der Kohlenmonoxideinfluss auf die Reduktion von Benzamidoxim durch Äußere

Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien wurde nach der in Kapitel

4.2.3.1.5.5 beschriebenen Methode durchgeführt. Hierbei konnte keine Hemmung

festgestellt werden (Abb. 4.11).

0,0

50,0

100,0

150,0

200,0

250,0


Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

Abb. 4.11: Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch Äußere Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien in Gegenwart von Kohlenmonoxid. Die Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 4.2.3.1.5.5 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand mit der in Kapitel 4.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.


183


Die Beteiligung eines molybdänhaltigen Enzyms an der Reduktion von Benzamidoxim

ist möglich. Dieses konnte durch Natriumvanadat, einem hochwirksamen Inhibitor

molybdänhaltiger Enzyme, gezeigt werden (Abb. 4.12).

Ab 40 µM Natriumvanadat war keine Restaktivität mehr detektierbar. Die ermittelte

IC50 Konzentration ergab 14 µM.

0

50

100

150

200

250

0 10 20 30 40 50

Na-vanadat [µM]

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

Abb. 4.12: Hemmung der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch Äußere Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien in Gegenwart von Natriumvanadat. Die Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 4.2.3.1.5.6 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand mit der in Kapitel 4.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden.


184

4.4 Diskussion

In dieser Arbeit sollten Äußere Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien

nach der Swell-Disruption Methode mit anschließender Zweischritt-

Dichtezentrifugation nach de Kroon et al. [1999] gewonnen werden. Die erhaltenen

Äußeren Membran Vesikel sollten hinsichtlich ihrer enzymatischen Aktivität

untersucht und beurteilt werden. Anschließend sollte die N-reduktive Aktivität in

diesen Vesikeln bestätigt und charakterisiert werden.

Die Subfraktionierung von Schweinelebermitochondrien wurde von Havemeyer

[2006] anhand verschiedener Methoden beschrieben. Das Hauptkriterium zur

Beurteilung der besten Methode war das Ausmaß der Kontamination der Äußeren

Membran Vesikel mit innerer Membran. Havemeyer [2006] bezog ihre gewonnenen

Daten dabei auf Ergebnisse der Subfraktionierung von Rattenlebermitochondrien.

Üblicherweise werden in der Literatur Aufreinigungsfaktoren zwischen 10 und 200

angegeben. Ausnahme bildet die oben genannte Methode von de Kroon et al. [1999]

mit einem Faktor größer 800. Während Deters [2002] in ihrer Arbeit mit

Schweinelebermitochondrien mittels Digitonin-Stripping und anschließender

Differentialzentrifugation einen Aufreinigungsfaktor von sechs beschrieben hat,

wurde von Havemeyer [2006] für Schweinelebermitochondrien mittels Swell-

Disruption Methode mit anschließender Zweischritt-Dichtezentrifugation ein

Aufreinigungsfaktor zwischen 120 und 210 beschrieben.

Daten für die Subfraktionierung von Nierenmitochondrien sind in der Literatur nicht

vorhanden. Die Leber stellt hier das dominante Organ für derartige Untersuchungen

dar. Daher beziehen sich die in dieser Arbeit ermittelten Daten auf die Ergebnisse

von Havemeyer [2006], um innerhalb der Spezies zu bleiben.

Dementsprechend wurden in dieser Arbeit die Äußeren Membran Vesikel

enzymatischen Testungen unterzogen (Tab. 4.1-4.4). Dabei wurde ein

Aufreinigungsfaktor zwischen 280 und 320 erhalten (Tab. 4.5).

Zusätzlich wurde der Gehalt der mikrosomalen NADPH Cytochrom P450 Reduktase

bestimmt (Daten nicht gezeigt). Dabei wurde eine Anreicherung dieses Enzyms um

den Faktor acht im Verhältnis zu den „reinen“ Mitochondrien (Tab. 3.1) festgestellt.

Dieses deckt sich mit dem Ergebnis von Havemeyer [2006].

Die NADPH Cytochrom P450 Reduktase wird normalerweise als mikrosomale

Verunreinigung der mitochondrialen Subfraktion angesehen. Da die „reinen“


185

Mitochondrien lediglich zu 3 % mit NADPH Cytochrom P450 Reduktase verunreinigt

waren (Tab. 3.1), kann das erhöhte Auftreten dieses Enzyms nicht mit einer neu

hinzugekommenen Verunreinigung begründet werden. Vielmehr handelt es sich um

eine relative Steigerung des Enzyms im Verhältnis zum Gesamtprotein, da die innere

Membran in diesem Arbeitsschritt abgetrennt wurde, welche den größten Teil des

Mitochondriums ausmacht. Wie schon in Kapitel 4.1.1 erwähnt, haftet immer

Endoplasmatisches Retikulum an den Mitochondrien oder ist sogar mit den

Mitochondrien verschmolzen [Ardail et al., 1993]. Schon in den Siebziger Jahren

wurden Reinigungen dieses Enzyms aus der äußeren mitochondrialen Membran

beschrieben [Comte und Gautheron, 1978; Kulkoski et al., 1979]. Somit scheint die

NADPH Cytochrom P450 Reduktase kein exklusives Enzym der Mikrosomen zu sein.

Somit ist bei der gezielten Anreichung der äußeren mitochondrialen Membran eine

Anreicherung dieses Enzyms verständlich. Der dabei erzielte Anreicherungsfaktor

acht ist zudem vergleichbar mit den Anreicherungsfaktoren der Monoaminoxidase

sowie Rotenon-insensitive Cytochrom c Reduktase (Tab. 4.2-4) für die Äußeren

Membran Vesikel.

Die N-reduktive Aktivität der Schweinenierenmitochondrien und der Äußeren

Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien ist in Tabelle 4.4 dargestellt. Der

Anreicherungsfaktor der Reduktionsrate beträgt 10. Damit ist auch hier eine den

anderen Markerenzymen vergleichbare Anreicherung erzielt worden. Zudem kann die

Lokalisation des zu isolierenden Enzymsystems erstmalig auf der Äußeren Membran

in Schweinenierenmitochondrien bestätigt werden und stimmt mit den bisher

gefundenen Daten in Lebermitochondrien überein [Andersson et al., 2005;

Havemeyer, 2006].

Eine Übertragbarkeit der Methode von Schweinelebermitochondrien auf

Schweinenierenmitochondrien war somit gegeben. Vergleichend zur Gewinnung der

Mitochondrien stellte sich auch hier heraus, dass sich die einzelnen Fraktionen in der

Zentrifugation nicht so klar voneinander trennten (Kap. 3.5), wie es bei den

Schweinelebermitochondrien der Fall war. Da die erhaltenen Aufreinigungsfaktoren

wiederum mit denen von Havemeyer [2006] übereinstimmten, wurde die etwas

schlechtere Trennung im Zentrifugenglas als organspezifisch angesehen.

Die Charakterisierung der N-reduktiven Aktivität der gewonnenen Äußeren Membran

Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien wurde mit Benzamidoxim als

Modellsubstanz durchgeführt. Die Äußeren Membran Vesikel sind für diese Reaktion

sauerstoffinsensitiv (Abb. 4.6). Zudem bevorzugen sie ein schwach saures


186

pH-Optimum (Abb. 4.3). Bei der Cosubstratabhängigkeit überwiegt die N-reduktive

Aktivität bei Einsatz von NADH im Vergleich zu NADPH (Abb. 4.5). Diese Ergebnisse

stimmen mit denen der bisher durchgeführten Untersuchungen (Kapitel 1.4; 3.4)

überein.

Im niedrigen und hohen pH-Bereich sind die Carboxylgruppen an der Oberfläche des

Hämproteins des Cytochrom b5 jeweils nicht oder zumindest nur erschwert in der

Lage, mit der NADH Cytochrom b5 Reduktase zu interagieren (Kapitel 6.1.1). Im

leicht sauren Bereich hingegen findet die Übertragung der Protonen optimal statt.

Der Verlauf der Bestimmung des pH-Optimums entspricht der Vorstellung der

Interaktion von Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5 Reduktase [Strittmatter und

Dailey, 1982; Durley und Mathews, 1996].

Der in dieser Arbeit ermittelte Km-Wert bezogen auf Benzamidoxim für die Äußeren

Membran Vesikel betrug 26 µM (Kapitel 4.3.1.3.4). Der Km-Wert ist erstmalig für

diese Reaktion in den Äußeren Membran Vesikeln aus Schweinenierenmitochondrien

bestimmt worden. Im Vergleich dazu liegt der Km-Wert der Äußeren Membran Vesikel

aus Schweinelebermitochondrien bei 70 µM und ist damit nur unwesentlich höher.

Die katalytische Effizienz, welche sich aus dem Quotienten Vmax und Km ergibt, betrug

5*10-3 min-1*mg-1. Die Äußeren Membran Vesikel der Lebermitochondrien besitzen

eine katalytische Effizienz von 4,3*10-3 min-1*mg-1 und sind damit nur unerheblich

weniger effizient.

Diese sehr ähnlichen kinetischen Eigenschaften zeugen von einem zumindest

vergleichbaren Enzymsystem zur Reduktion von Benzamidoxim. Dabei ist zu

bedenken, dass in der Vergangenheit viele gewebeabhängige Unterschiede in

Mitochondrien gefunden worden sind. Die ersten Unterschiede wurden histochemisch

und mikroskopisch festgestellt [Hackenbrock, 1966; Goyer und Krall, 1969; Ernster

und Schatz, 1981]. Mit zunehmender und besserer Technik konnten aber auch in der

jüngeren Vergangenheit enzym-, transporter- und reaktionsspezifische Unterschiede

in den Mitochondrien unterschiedlicher Gewebe innerhalb einer Spezies festgestellt

werden [Rossignol et al., 2000; Karahalil et al., 2002; Raza et al., 2004].

Eine Beteiligung der NADH Cytochrom b5 Reduktase konnte mit dem selektiven

Inhibitor p-Hydroxymercuribenzoat [Lostanlen et al., 1978] bestätigt werden (Abb.

4.9). Cytochrom c ist ein Elektronenakzeptor des Cytochrom b5 und wirkt als

kompetitiver Hemmstoff. Erstaunlicherweise konnte eine Hemmung mittels

Cytochrom c erst im hohen mikromolaren Bereich gezeigt werden (Abb. 4.10),

obwohl Mitochondrien durch geringste Mengen Cytochrom c keine N-reduktive


187

Aktivität mehr besaßen (Abb. 3.10). Cytochrom c ist als Elektronenvermittler

zwischen der äußeren und inneren Membran der Mitochondrien tätig [Bernardi und

Azzone, 1981]. Dabei ist das Cytochrom c nur locker an die Membran assoziiert. Die

elektronenübertragende Domäne des Cytochrom b5 ist außerhalb der Mitochondrien

auf der äußeren Membran lokalisiert [Durley und Mathews, 1996]. In der

Untersuchung mit den Mitochondrien war diese Domäne somit frei und gut

zugänglich für das exogen zugesetzte Cytochrom c, welches ein Molekulargewicht

von circa 12 kDa besitzt.

In diesem Hemmversuch hingegen war die äußere Membran vom Rest des

Mitochondriums abgelöst und zu kleinsten Vesikeln zusammengelagert. Cytochrom b5

war dabei weiterhin durch seinen Membrananker in diesen Vesikeln fest gebunden

und konnte somit nicht frei agieren. Eine Möglichkeit zur Erklärung der geringen

Hemmwirkung von Cytochrom c ist, dass sich bei der Ausbildung der Äußeren

Membran Vesikel die zunächst vorliegende Außenseite der Mitochondrien nach innen

kehrt. Damit klappt die elektronenbindende Domäne des Cytochrom b5 nach innen

und ist nicht mehr für ein solch großes Molekül wie das Cytochrom c erreichbar. Eine

andere mögliche Erklärung liegt in der Größe der gebildeten Vesikel. Möglicherweise

sind die Äußeren Membran Vesikel so klein, dass sie nicht mehr mit Cytochrom c

interagieren können.

Die kompetitive Hemmwirkung von Hydroxylamin ist schon in Kapitel 3.4 beschrieben

worden. Auch mit den Äußeren Membran Vesikeln konnte eine starke Hemmung der

Benzamidoximreduktion durch Hydroxylamin bestätigt werden (Abb. 4.8). Dieses

bedeutet, dass in den Äußeren Membran Vesikeln aus Schweinenierenmitochondrien

ein der Hydroxylaminreduktase vergleichbares Enzymsystem vorhanden sein muss.

Zusätzlich zu den Enzymen Cytochrom b5 und Cytochrom b5 Reduktase, welche in

der löslichen Form allein dazu in der Lage sind, Benzamidoxim zu reduzieren [Kurian

et al., 2004; Saulter et al., 2005], wurde bei den membranständigen Enzymen die

Beteiligung einer dritten Komponente beschrieben [Kadlubar und Ziegler, 1974;

Clement et al., 1997; Andersson et al., 2005], die die Umsetzungsraten deutlich

erhöht.

Die Beteiligung eines Cytochrom P450 Isoenzyms wurde bereits beschrieben (Kapitel

2.1.3 und 3.4). In dieser Arbeit konnte in den Äußeren Membran Vesikeln aus

Schweinenierenmitochondrien kein charakteristisches Absorptionsspektrum bei

450 nm detektiert werden. In der äußeren Membran von Schweineleber-

mitochondrien konnte die Beteiligung des Molybdäncofaktors gezeigt werden

[Havemeyer, 2006], Cytochrom P450 war ebenfalls nicht detektierbar.


188



durchgeführten Untersuchung keinen Einfluss (Abb. 4.11). Kohlenmonoxid hemmt

die Ferroform des im Hämgerüst enthaltenen Eisens. Im postulierten Mechanismus

[Clement, 2002] muss aber die Ferriform zur Übertragung der Protonen vorliegen.

Die Hemmbarkeit der Ferriform wurde durch den Hemmstoff Kaliumcyanid

kontrolliert (Abb. 4.7). Es konnte eine Empfindlichkeit des Enzymsystems für

Cyanidionen festgestellt werden. Dabei wurde die Umsetzungsrate auf 45 % des

Anfangswertes reduziert. Die in der Literatur beschriebenen Daten sind sehr

unterschiedlich. Diese sind in Kapitel 3.4 ausgeführt. Havemeyer [2006] konnte in

den Äußeren Membran Vesikeln aus Schweinelebermitochondrien eine Aktivierung

der Benzamidoxim-Reduktase feststellen. Sie deutet ihr Ergebnis als

Cyanidaktivierung. Die schon oben beschriebene geringe Hemmung der Reduktion

mittels Cytochrom c und das Ergebnis von Havemeyer [2006] deuten sehr stark auf

eine Veränderung der Interaktion der einzelnen an der Reduktion beteiligten Enzyme

hin. Die Untersuchung dieser neuen Verhältnisse sollte in weiterführenden Arbeiten

zur genauen Erforschung des Mechanismus durchgeführt werden.

Elektronmikroskopische Aufnahmen können hier sicherlich hilfreich sein.

Havemeyer [2006] hat in der äußeren Membran von Schweinelebermitochondrien

den Molybdäncofaktor als verantwortliches Coenzym für Reduktion von

Benzamidoxim gefunden. Aufbau und Funktionsweise sind in Kapitel 6.1.4

beschrieben. Molybdänhaltige Enzyme sind durch Vanadationen hemmbar

[Ramadoss, 1980], wobei sie auch andere Enzyme hemmen (Kapitel 3.4).

Eine niedrige Konzentration an Vanadationen führte in den Äußeren Membran

Vesikeln aus Schweinenierenmitochondrien bereits zu einer Hemmung der

Benzamidoxim-Reduktase (Abb. 4.12). Die Beteiligung des Molybdäncofaktors am

Benzamidoxim reduzierenden Enzymsystem ist somit in den Äußeren Membran

Vesikeln aus Schweinenierenmitochondrien nicht ausgeschlossen. Da aber mehrere

Enzyme durch Vanadationen gehemmt werden, ist eine Bestätigung der

Verantwortlichkeit zu diesem Zeitpunkt noch nicht möglich.


189

4.5 Zusammenfassung

Es wurden Äußere Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien nach der

Swell-Disruption Methode mit anschließender Zweischritt-Dichtezentrifugation nach

de Kroon et al. [1999] gewonnen. Die Übertragbarkeit dieser Methode von Leber auf

Niere war dabei größtenteils gegeben. Die gemessenen Marker zeigten im Vergleich

zur Leber niedrigere Aktivitäten. Trotzdem wurde eine gute Isolierung der Äußeren

Membran Vesikel erzielt worden, was durch die sehr hohen Aufreinigungsfaktoren

bestätigt wurde. Die Methode musste deshalb nicht weiter verändert werden.

Typische und literaturbeschriebene Charakteristika der N-reduktiven Reaktion

konnten in den Äußeren Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien gezeigt

werden. Ein schwach saures Milieu sowie Kohlenmonoxid- und

Sauerstoffinsensitivität waren dabei mit den bisherigen Untersuchungen vergleichbar.

Die Beteiligung von NADH Cytochrom b5 Reduktase konnte bestätigt werden. Da

Hydroxylamin als kompetitiver Hemmstoff der Benzamidoximreduktion fungiert,

wurde eine Gemeinsamkeit zur Hydroxylaminreduktase gezeigt. Die Hemmbarkeit der

Reaktion durch Vanadationen lässt die Möglichkeit einer Beteiligung von

Molybdäncofaktor zu. Lediglich die geringe Hemmbarkeit mit Cytochrom c ist

überraschend und gibt Anlass zu weiteren Untersuchungen.

Die Michaelis-Menten Kinetik und die katalytische Effizienz für das Substrat

Benzamidoxim sind vergleichbar mit den vorliegenden Daten der Leber.

Der nicht messbare Cytochrom P450-Gehalt bei gleichzeitig sehr hoher N-reduktiver

Aktivität sowie Insensitivität gegenüber Kohlenmonoxid und nur partielle Sensitivität

gegenüber Cyanidionen lässt die Beteiligung eines Cytochrom P450 Isoenzyms an

dieser Reduktion unwahrscheinlich erscheinen.

ISOLIERUNG UND IDENTIFIZIERUNG DER DRITTEN KOMPONENTE AUS ÄUßEREN MEMBRAN VESIKELN

190

5 ISOLIERUNG UND IDENTIFIZIERUNG DER DRITTEN

KOMPONENTE AUS ÄUßEREN MEMBRAN VESIKELN

5.1 Einleitung

5.1.1 Gewinnung membranständiger Enzyme

Es gelten die gleichen Bedingungen, die in Kapitel 2.1.2 beschrieben sind.


In Schweinelebermikrosomen konnte ein Enzymsystem, verantwortlich für die

Reduktion N-hydroxylierter Verbindungen, isoliert werden. Daran beteiligt sind

Cytochrom b5, NADH Cytochrom b5 Reduktase sowie ein Cytochrom P450 Isoenzym

der Subfamilie 2D [Clement et al., 1997].

In Schweinelebermitochondrien konnte auch die Beteiligung von Cytochrom b5 sowie

NADH Cytochrom b5 Reduktase gezeigt werden [Deters, 2002]. Deters [2002]

postulierte eine dritte Komponente, die möglicherweise in der äußeren Membran der

Mitochondrien zu finden ist.

Die Isolierung der äußeren mitochondrialen Membran führt zu Vesikeln, die im

Folgenden Äußere Membran Vesikel genannt werden. Havemeyer [2006] konnte

zeigen, dass das N-reduzierende Enzymsystem in den Äußeren Membran Vesikeln der

Schweinelebermitochondrien zu finden ist. In ihrer Arbeit wurde die Beteiligung von

Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5 Reduktase am N-reduzierenden Enzymsystem

bestätigt. Zudem konnte sie den C-Terminus der Mocosulfurase als dritte beteiligte

Komponente identifizieren.

5.1.3 Zielsetzung

In dieser Arbeit war die Übertragbarkeit der Methode zur Gewinnung und

Identifizierung der dritten Komponente auf Schweinenierenmitochondrien zu

kontrollieren, zu testen und gegebenenfalls zu modifizieren. Des Weiteren sollte die

gewonnene Enzymfraktion für die in vitro Studien charakterisiert werden.

Immunoblot-Analysen sowie massenspektrometrische Analysen sollten zur

Identifizierung der dritten Komponente herangezogen werden.


191

5.2 Methoden





5.2.1.2 Gewinnung der Schweinenierenmitochondrien

Die Gewinnung der Schweinenierenmitochondrien mittels Percoll® ist in Kapitel


5.2.1.3 Gewinnung der Äußeren Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien

Die Gewinnung der Äußeren Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien

mittels der Swell-Disruption Methode mit anschließender Zweischritt-

Dichtezentrifugation ist in Kapitel 4.2.1.2 beschrieben.

5.2.1.4 Gewinnung der dritten Komponente aus Äußeren Membran Vesikeln von Schweinenierenmitochondrien


Die Solubilisation der Äußeren Membran Vesikel fand in folgender Lösung statt:

13 mg Äußere Membran Vesikel, 0,9 mM Zwittergent® 3-14, 20 mM Tris-Base,

0,1 mM Dithiothreitol, 0,1 mM EDTA, 20 % Glycerol in einem Endvolumen von

20,0 ml mit Aq. bidest.. Das Protein/Detergenzverhältnis belief sich dabei auf den

Faktor zwei. Die Lösung wurde auf pH 7,4 mittels Phosphorsäure eingestellt. Danach

wurde der Ansatz eine Stunde im Eisbad mit einem Magnetkern gerührt. 200 µl des

Solubilisats wurden zu Kontrollzwecken entnommen und bei -80 °C gelagert. Das

restliche Solubilisat wurde auf die Anionenaustauschchromatographie-Säule

aufgetragen (Kapitel 5.2.1.4.2). Eine Zentrifugation zur Abtrennung nicht

solubilisierter Proteine fand nicht statt.


192

5.2.1.4.2 Anionenaustauschchromatographie an DEAE Cellulose


Äquilibrierpuffer, pH 7,4 (4 °C): 20 mM Tris-Base

0,1 mM EDTA

0,1 mM DTT

0,9 mM Zwittergent® 3-14

20 % (w/v) Glycerol

Elutionspuffer, pH 7,4 (4 °C): 1 M Natriumchlorid in

Äquilibrierpuffer, pH 7,4

Alle Puffer wurden durch einen Sartorius® Membranfilter (0,45 µm) per



Das erhaltene Solubilisat wurde auf eine DEAE 52-Cellulose SERVACEL® Säule (Fa.

Serva, 2,5 x 10 cm, 50 ml Gelvolumen) aufgetragen. Zuvor wurde die Säule mit

ausreichend Äquilibrierpuffer konditioniert. Nach Auftragen des Solubilisats mit

0,8 ml*min-1 wurde mit weiteren 100 ml Äquilibrierpuffer nachgewaschen. Danach

wurde über einen Gradientenformer ein linearer Gradient von 0-1 M Natriumchlorid in

einem Volumen von 250 ml erzeugt. Das Eluat wurde in 4 ml Fraktionen

aufgefangen. Dabei lief die Pumpe weiterhin mit 0,8 ml*min-1. Alle Arbeitsschritte

erfolgten bei 4 °C.

Die erhaltenen DEAE-Fraktionen wurden mittels der in Kapitel 5.2.1.4.2.1-13

angegebenen Methoden untersucht. Alle erhaltenen Fraktionen wurden aliquotiert


5.2.1.4.2.1 Protein-Verlaufskontrolle

Die Absorption der eluierten Fraktionen wurde bei 280 nm und 417 nm vermessen.

Da der Äquilibrierpuffer eine geringe Eigenabsorption aufwies, wurde dieser Wert von

den gemessenen Werten abgezogen.

Zudem wurde der Proteingehalt nach der in Kapitel 5.2.2.1 beschriebenen Methode

bestimmt.


193

5.2.1.4.2.2 Cytochrom b5-Verlaufskontrolle

Die einzelnen Fraktionen wurden auf ihren Cytochrom b5 Gehalt untersucht. Dabei

fand die Cytochrom b5-Bestimmung nach der in Kapitel 5.2.2.2 beschriebenen

Methode statt.

5.2.1.4.2.3 NADH Cytochrom b5 Reduktase-Verlaufskontrolle

Alle Fraktionen der Anionenaustauschchromatographie wurden der NADH

Cytochrom b5 Reduktase Bestimmung unterzogen. Die Methode ist in Kapitel 5.2.2.3

wiedergegeben.

5.2.1.4.2.4 Monoaminoxidase-Verlaufskontrolle

Zur Bestimmung der Monoaminoxidase-Aktivität wurde die in Kapitel 5.2.2.4

beschriebene Methode verwendet. Alle Fraktionen der

Anionenaustauschchromatographie wurden auf Monoaminoxidase-Aktivität hin

untersucht.

5.2.1.4.2.5 Rotenon-insensitive Cytochrom c Reduktase-Verlaufskontrolle

Die Bestimmung der Rotenon-insensitiven Cytochrom c Reduktase-Aktivität wurde

nach der Methode in Kapitel 5.2.2.5 durchgeführt. Die Untersuchung fand mit allen

gesammelten Fraktionen statt.

5.2.1.4.2.6 Benzamidoxim-Reduktase-Verlaufskontrolle ohne zusätzliche Enzyme



rekonstituierte System bestand aus 10 µl der entsprechenden DEAE-Fraktion. Die


sind in Kapitel 5.2.3.1.2 angegeben.


194






0,05 U NADH Cytochrom b5 Reduktase. Die weitere Durchführung der Inkubation


5.2.1.4.2.8 Benzamidoxim-Reduktase-Verlaufskontrolle mit zugesetztem humanem,





100 pmol Cytochrom b5. Die weitere Durchführung der Inkubation sowie

Aufarbeitung der Inkubationsansätze sind in Kapitel 5.2.3.1.2 angegeben.






rekonstituierte System bestand aus 10 µl der entsprechenden DEAE-Fraktion, 0,05 U

NADH Cytochrom b5 Reduktase und 100 pmol Cytochrom b5. Die weitere

Durchführung der Inkubation sowie Aufarbeitung der Inkubationsansätze sind in

Kapitel 5.2.3.1.2 angegeben.

5.2.1.4.2.10 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese

Die Überprüfung des Proteinverlaufs in den einzelnen Fraktionen wurde mittels der

SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese dargestellt. Die verwendete Methode ist in

Kapitel 5.2.2.6 beschrieben.


195

5.2.1.4.2.11 nit-1 Rekonstitutions-Assay


aktivität. Die Rekonstitution wurde mittels der Nitratreduktaseaktivität der nit-1

Mutante [Nason et al., 1971] bestimmt und freundlicherweise von Tanja Otte

(Technische Universität Braunschweig) durchgeführt. Die Methode ist in Kapitel


5.2.1.4.2.12 Sulfitoxidase-Verlaufskontrolle

Zur Bestimmung der Sulfitoxidaseaktivität wurde die in Kapitel 5.2.2.9 beschriebene

Methode verwendet. Viele Fraktionen der Anionenaustauschchromatographie wurden

auf Sulfitoxidaseaktivität hin untersucht.

Die Bestimmung wurde freundlicherweise von Tanja Otte (Technische Universität


5.2.1.4.2.13 FormA Analyse

Die FormA Analyse wies spezifisch das Molybdopterin-Grundgerüst nach. Die

Bestimmung wurde nach der in Kapitel 5.2.2.10 beschriebenen Methode

durchgeführt.

Die Analyse wurde freundlicherweise von Tanja Otte (Technische Universität


5.2.1.4.2.14 Immunoblot-Analyse

Die Immunoblot-Analyse wurde nach der in Kapitel 5.2.2.11 beschriebenen Methode

durchgeführt. Die im nit-1 Rekonstitutions-Assay positiv getesteten Fraktionen

wurden von Tanja Otte (Technische Universität Braunschweig) der Immunoblot-

Analyse unterzogen.

5.2.1.5 Cytochrom b5

Humanes, rekombinantes Cytochrom b5 [Holmans et al., 1994] wurde von der Firma

MoBiTec (Göttingen) bezogen.


196

5.2.1.6 Gewinnung von NADH Cytochrom b5 Reduktase

Die Gewinnung der NADH Cytochrom b5 Reduktase aus Schweinelebermikrosomen ist

in Kapitel 6.2.1.3 beschrieben.




5.2.2.2 Cytochrom b5-Gehaltsbestimmung

Cytochrom b5 wurde anhand des Differenzspektrums von reduzierter und oxidierter

Form von Cytochrom b5 bestimmt. Die Methode wurde modifiziert durchgeführt nach

Estabrook und Werringloer [1978]. Die Bestimmung beruht auf der Reduktion des

Cytochrom b5, die durch eine Absorptionszunahme bei ≈ 426 nm und eine -abnahme

bei ≈ 409 nm charakterisiert ist. Die Probe wurde entweder unverdünnt eingesetzt

oder mit 100 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,5 verdünnt. Nach Aufnahme des ersten

Absorptionsspektrums (400-500 nm) wurde etwa 1 mg Natriumdithionit zugesetzt.

Im Abstand von 60 Sekunden wurde das zweite Spektrum der reduzierten

Präparation aufgenommen. Durch Subtraktion beider Spektren erhielt man ein

Differenzspektrum. Die resultierende Absorptionsdifferenz zwischen dem

Absorptionsmaximum bei ≈ 426 nm und dem -minimum bei ≈ 409 nm wurde zur

Berechnung des Cytochrom b5-Gehaltes herangezogen.

Die dithionitvermittelte Reduktion war mit dieser Proteinpräparation bestimmbar, da

die Äußeren Membran Vesikel frei von detektierbarem Cytochrom P450 waren

(Kapitel 4.3.1.2.4).

Zur Berechnung diente der ermittelte Absorptionskoeffizient ε=185 nM-1*cm-1

[Estabrook und Werringloer, 1978].

5.2.2.3 NADH Cytochrom b5 Reduktase-Aktivitätsbestimmung

Die Methode der NADH Cytochrom b5 Reduktase-Aktivitätsbestimmung ist in Kapitel



197


Die Methode der Monoaminoxidase-Aktivitätsbestimmung ist in Kapitel 3.2.2.3

beschrieben.

5.2.2.5 Rotenon-insensitive Cytochrom c Reduktase-Aktivitätsbestimmung

Die Methode zur Rotenon-insensitive Cytochrom c Reduktase-Aktivitätsbestimmung

ist in Kapitel 4.2.2.3 beschrieben.


Die Methode zur Herstellung und Durchführung der SDS-Polyacrylamid-

gelelektrophorese ist in Kapitel 2.2.2.7 beschrieben.

Silberfärbung :




Die Methode der massenspektrometrischen Analyse ist in Kapitel 2.2.2.8 beschrieben.

5.2.2.8 nit-1 Rekonstitutions-Analyse

Die Methode der nit-1 Rekonstitutions-Analyse ist in Kapitel 2.2.2.9 beschrieben.

5.2.2.9 Sulfitoxidase-Verlaufskontrolle

Die Sulfitoxidaseaktivitäts-Bestimmung wurde nach der Methode von Lee et al. [2002] freundlicherweise von Tanja Otte (Technische Universität Braunschweig)

durchgeführt. Zunächst wurde das Protein in einer Lösung aus 0,1 M Tris-HCl und

0,1 mM EDTA, pH 8,5 homogenisiert. Anschließend wurde die Enzymaktivität in

einem 300 µl Ansatz, bestehend aus 0,5 M Tris-HCl, 0,16 mM Natriumdeoxy-

cholinsäure, 2 mM Kaliumcyanid, 0,25 mg Cytochrom c und 1 mM Natriumsulfit

bestimmt.


198


Enzymmenge definiert ist, die benötigt wird, um die Absorption bei 550 nm und

25 °C um 1,0 zu erhöhen.


Die Methode der FormA Analyse ist in Kapitel 2.2.2.10 beschrieben.


Die Methode der Immunoblot-Analyse ist in Kapitel 2.2.2.11 beschrieben.









Reinheit geprüft.




äußere Membran Biotransformationsstudien setzte sich aus 10 µl der jeweiligen

DEAE-Fraktion, 100 pmol Cytochrom b5, 0,05 U NADH Cytochrom b5 Reduktase,

500 µM NADH, 500 µM Benzamidoxim in 150 µl eines 100 mM



199

Zunächst wurden die Enzyme bei 37 °C zwei Minuten vorinkubiert, dann das





















4x4 mm (Merck, Darmstadt)



Laufzeit: 28 min

Flussrate: 1 ml*min-1


200



Die Retentionszeiten lagen bei 8,0 ± 0,2 Minuten (Benzamidoxim) und 24,2 ± 0,2

Minuten (Benzamidin).






Korrelationskoeffizienten von r2 = 0,9998. Zur Bestimmung der Wiederfindungsrate




5.2.3.1.2 vermessen. Für jede Konzentrationsstufe wurden 2 Ansätze parallel

pipettiert, die jeweils doppelt vermessen wurden. Benzamidin konnte im

angegebenen Konzentrationsbereich (bis 250 µM) quantifiziert werden. Die

Wiederfindungsrate betrug 95 ± 5 %.


201

5.3 Ergebnisse

5.3.1 Gewinnung der Enzymfraktion

Die Gewinnung und Charakterisierung der Schweinenierenmitochondrien ist in

Kapitel 3 beschrieben. Die Subfraktionierung mit Charakterisierung von Äußeren

Membran Vesikeln ist in Kapitel 4 dargestellt.

Zur Isolierung der dritten Komponente wurde in dieser Arbeit eine

chromatographische Auftrennung der Äußeren Membran Vesikel an einem

Anionenaustauscher durchgeführt. Um membrangebundene Enzyme mittels

Ionenchromatographie trennen zu können, ist eine Herauslösung aus der Membran

notwendig (Kapitel 2.1.2). Die Solubilisation wurde mittels Zwittergent® 3-14

durchgeführt.

5.3.1.1 Solubilisation der Äußeren Membran Vesikel

Bei einem Protein-/Detergenzverhältnis von zwei mit Zwittergent® 3-14 lag eine

effiziente Solubilisation vor (Daten nicht gezeigt). Dieses entsprach den Ergebnissen

von Havemeyer [2006].

Die eingesetzte Detergenzkonzentration hatte keinen Einfluss auf die N-reduktive

Aktivität. Selbst eine Verminderung der Proteinmenge bei konstanter

Detergenzmenge hatte kaum einen inhibitorischen Effekt (unterhalb 5 %).

5.3.1.2 Anionenaustauschchromatographie an DEAE Cellulose

5.3.1.2.1 Protein-Verlaufskontrolle

Äußere Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien wurden nach der

Methode von Havemeyer [2006] nach Solubilisation auf die Ionenaustausch-Säule

aufgetragen.

Dabei wurde nicht bindendes Protein durch Spülen mit dem zweifachen

Säulenvolumen mittels Äquilibrierpuffer eluiert. Die Fraktionen 8-19 bildeten hierbei

die nichtbindende Fraktion. Dieses war durch den Absorptionsanstieg bei 280 nm zu

verfolgen (Abb. 5.1). Anschließend wurde in einem linearen Gradienten mittels

Gradientenmischer der Elutionspuffer zugemischt. Natriumchlorid konnte somit in der

Konzentration von 0-1 M stetig zugefügt werden. Die Fraktionen 40-62 bildeten eine

zweite Proteinfraktion, welche an dem Säulenmaterial gebunden hatte. Die 4 ml


202

Fraktionen wurden aliquotiert und bei -80 °C gelagert. Eine Minderung der

enzymatischen Aktivität war nach dem Auftauen nicht festzustellen.

Die Elution der Proteine konnte durch die Messung bei 280 nm gut verfolgt werden.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0 20 40 60 80 100

Fraktion

Abs

orpt

ion

0,0

0,5

1,0

Nat

rium

chlo

rid

[M]

NaCl-Konzentration

280 nm

417 nm

Abb. 5.1: Elutionsprofil der solubilisierten Äußeren Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien nach Anionenaustauschchromatographie an DEAE. Äußere Membran Vesikel wurden nach der in Kapitel 5.2.1.4.1 beschriebenen Methode solubilisiert. Auftrag und Elution erfolgten nach der in Kapitel 5.2.1.4.2 beschriebenen Methode.


203

5.3.1.2.2 Cytochrom b5-Verlaufskontrolle

Von jeweils 200 µl dithionitreduzierter Proteinlösung wurde ein Differenzspektrum

aufgenommen und nach der in Kapitel 5.2.1.4.2.2 beschriebenen Methode

ausgewertet [Estabrook und Werringloer, 1978]. Nur in den Fraktionen 53 bis 55

konnte Cytochrom b5 detektiert werden (Abb. 5.2). Die Enzymaktivität wurde auf den

in den jeweiligen Fraktionen vorliegenden Proteingehalt bezogen. Die Messungen

sind stets Einzelmessungen.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0 20 40 60 80 100

Fraktion

Abs

orpt

ion

0,000,050,100,150,200,250,300,350,400,450,50

Enzy

mak

tivitä

t [n

mol

*mg-1

]

Cytochrom b5280 nm417 nm

Cytochrom b5

Abb. 5.2: Elutionsprofil von Cytochrom b5 nach Anionenaustauschchromatographie an DEAE. Äußere Membran Vesikel wurden nach der in Kapitel 5.2.1.4.1 beschriebenen Methode solubilisiert. Auftrag und Elution erfolgten nach der in Kapitel 5.2.1.4.2 beschriebenen Methode.


204

5.3.1.2.3 NADH Cytochrom b5 Reduktase-Verlaufskontrolle

Jeweils 50 µl der Fraktionen wurden auf NADH Cytochrom b5 Reduktase-Aktivität hin

untersucht und nach der in Kapitel 5.2.1.4.2.3 beschriebenen Methode ausgewertet

[Mihara und Sato, 1978]. Vor allem in den Fraktionen 46-51 konnte NADH Cytochrom

b5 Reduktase detektiert werden (Abb. 5.3). Die Enzymaktivität wurde auf den in den

jeweiligen Fraktionen vorliegenden Proteingehalt bezogen. Die Messungen sind stets

Einzelmessungen.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0 20 40 60 80 100

Fraktion

Abs

orpt

ion

0

5

10

15

20

25

Enzy

mak

tivitä

t [U

*mg-1

]

280 nm417 nm


Abb. 5.3: Elutionsprofil der NADH Cytochrom b5 Reduktase nach Anionenaustauschchromatographie an DEAE. Äußere Membran Vesikel wurden nach der in Kapitel 5.2.1.4.1 beschriebenen Methode solubilisiert. Auftrag und Elution erfolgten nach der in Kapitel 5.2.1.4.2 beschriebenen Methode.


205

5.3.1.2.4 Monoaminoxidase-Verlaufskontrolle

Jeweils 50 µl der Fraktionen wurden auf Monoaminoxidase-Aktivität hin untersucht

und nach der in Kapitel 5.2.1.4.2.4 beschriebenen Methode ausgewertet [Kline et al., 1986]. Vor allem in den Fraktionen 41-47 konnte Monoaminoxidase detektiert

werden (Abb. 5.4). Die Enzymaktivität wurde auf den in den jeweiligen Fraktionen

vorliegenden Proteingehalt bezogen. Die Messungen sind stets Einzelmessungen.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0 20 40 60 80 100

Fraktion

Abs

orpt

ion

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Enzy

mak

tivitä

t [U

*mg-1

]

Monoaminoxidase280 nm417 nm

Abb. 5.4: Elutionsprofil der Monoaminoxidase nach Anionenaustauschchromatographie an DEAE. Äußere Membran Vesikel wurden nach der in Kapitel 5.2.1.4.1 beschriebenen Methode solubilisiert. Auftrag und Elution erfolgten nach der in Kapitel 5.2.1.4.2 beschriebenen Methode.


206

5.3.1.2.5 Rotenon-insensitive Cytochrom c Reduktase-Verlaufskontrolle

Jeweils 50 µl der Fraktionen wurden auf Rotenon-insensitive Cytochrom c Reduktase-

Aktivität hin untersucht und nach der in Kapitel 5.2.1.4.2.5 beschriebenen Methode

ausgewertet [Kamin et al., 1965]. Vor allem in den Fraktionen 7-14, 38-42 und 45-52

konnte Rotenon-insensitive Cytochrom c Reduktase detektiert werden (Abb. 5.5). Die

Enzymaktivität wurde auf den in den jeweiligen Fraktionen vorliegenden

Proteingehalt bezogen. Die Messungen sind stets Einzelmessungen.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0 20 40 60 80 100

Fraktion

Abs

orpt

ion

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Enzy

mak

tivitä

t [U

*mg-1

]

Rotenon-insensitive Cytochrom c Reduktase280 nm417 nm

Abb. 5.5: Elutionsprofil der Rotenon-insensitiven Cytochrom c Reduktase nach Anionenaustauschchromatographie an DEAE. Äußere Membran Vesikel wurden nach der in Kapitel 5.2.1.4.1 beschriebenen Methode solubilisiert. Auftrag und Elution erfolgten nach der in Kapitel 5.2.1.4.2 beschriebenen Methode.

5.3.1.2.6 Benzamidoxim-Reduktase-Verlaufskontrolle ohne zusätzliche Enzyme


bestimmt. Gebildetes Benzamidin wurde mittels der unter Kapitel 5.2.3.1.3

beschriebenen Analytik quantifiziert. Ohne Zugabe weiterer Enzyme außer der

jeweiligen DEAE-Fraktion wurde keine Aktivität in der Fraktionen gefunden (Daten

nicht gezeigt).


207

5.3.1.2.7 Benzamidoxim-Reduktase-Verlaufskontrolle mit zugesetzter NADH

Cytochrom b5 Reduktase



Fraktion und 0,05 U NADH Cytochrom b5 Reduktase. Die weitere Durchführung der

Inkubation sowie Aufarbeitung der Inkubationsansätze sind in Kapitel 5.2.3.1.2

angegeben. Gebildetes Benzamidin wurde mittels der unter Kapitel 5.2.3.1.3

beschriebenen Analytik quantifiziert. In den Fraktionen 12-13, 39-44 und 47-54

konnte Benzamidoxim-Reduktase-Aktivität detektiert werden (Abb. 5.6). Der

Proteingehalt der zugesetzten DEAE-Fraktion bildete die Grundlage zur Berechnung


wurden.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0 20 40 60 80 100

Fraktion

Abs

orpt

ion

0

20

40

60

80

100

120

140

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]


280 nm

417 nm

Abb. 5.6: Elutionsprofil der Benzamidoxim-Reduktase mit zugesetzter gereinigter NADH Cytochrom b5 Reduktase nach Anionenaustauschchromatographie an DEAE. Äußere Membran Vesikel wurden nach der in Kapitel 5.2.1.4.1 beschriebenen Methode solubilisiert. Auftrag und Elution erfolgten nach der in Kapitel 5.2.1.4.2 beschriebenen Methode. Die Durchführung der Inkubation sowie Aufarbeitung der Inkubationsansätze sind in Kapitel 5.2.3.1.2 angegeben. Gebildetes Benzamidin wurde mittels der unter Kapitel 5.2.3.1.3 beschriebenen Analytik quantifiziert. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus einem Reaktionsansatz, welcher doppelt vermessen wurde.


208

5.3.1.2.8 Benzamidoxim-Reduktase-Verlaufskontrolle mit zugesetztem humanem,




Fraktion und 100 pmol Cytochrom b5. Die weitere Durchführung der Inkubation



Analytik quantifiziert. In den Fraktionen 14-15 und 42-53 konnte Benzamidoxim-

Reduktase-Aktivität detektiert werden (Abb. 5.7). Der Proteingehalt der zugesetzten

DEAE-Fraktion bildet die Grundlage zur Berechnung der Aktivität. Die Inkubationen

sind stets Einzelinkubationen, die doppelt vermessen wurden.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0 20 40 60 80 100

Fraktion

Abs

orpt

ion

0

2

4

6

8

10

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]


280 nm

417 nm

Abb. 5.7: Elutionsprofil der Benzamidoxim-Reduktase mit zugesetztem humanem rekombinantem Cytochrom b5 nach Anionenaustauschchromatographie an DEAE. Äußere Membran Vesikel wurden nach der in Kapitel 5.2.1.4.1 beschriebenen Methode solubilisiert. Auftrag und Elution erfolgten nach der in Kapitel 5.2.1.4.2 beschriebenen Methode. Die Durchführung der Inkubation sowie Aufarbeitung der Inkubationsansätze sind in Kapitel 5.2.3.1.2 angegeben. Gebildetes Benzamidin wurde mittels der unter Kapitel 5.2.3.1.3 beschriebenen Analytik quantifiziert. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus einem Reaktionsansatz, welcher doppelt vermessen wurde.


209

5.3.1.2.9 Benzamidoxim-Reduktase-Verlaufskontrolle mit zugesetzter gereinigter





Fraktion 0,05 U NADH Cytochrom b5 Reduktase und 100 pmol Cytochrom b5. Die


sind in Kapitel 5.2.3.1.2 angegeben. Gebildetes Benzamidin wurde mittels der unter

Kapitel 5.2.3.1.3 beschriebenen Analytik quantifiziert. In den Fraktionen 9-15 und

39-48 konnte Benzamidoxim-Reduktase-Aktivität detektiert werden (Abb. 5.8). Der

Proteingehalt der zugesetzten DEAE-Fraktion bildet die Grundlage zur Berechnung


wurden.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0 20 40 60 80 100

Fraktion

Abs

orpt

ion

0

1000

2000

3000

4000

5000

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]


280 nm

417 nm

Abb. 5.8: Elutionsprofil der Benzamidoxim-Reduktase mit zugesetzter gereinigter NADH Cytochrom b5 Reduktase und zugesetztem humanem rekombinantem Cytochrom b5 nach Anionenaustauschchromatographie an DEAE. Äußere Membran Vesikel wurden nach der in Kapitel 5.2.1.4.1 beschriebenen Methode solubilisiert. Auftrag und Elution erfolgten nach der in Kapitel 5.2.1.4.2 beschriebenen Methode. Die Durchführung der Inkubation sowie Aufarbeitung der Inkubationsansätze sind in Kapitel 5.2.3.1.2 angegeben. Gebildetes Benzamidin wurde mittels der unter Kapitel 5.2.3.1.3 beschriebenen Analytik quantifiziert. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus einem Reaktionsansatz, welcher doppelt vermessen wurde.


210

5.3.1.2.10 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese

Die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese ist als Proteinverlaufskontrolle durchgeführt

worden. Hierbei konnte in den Fraktionen nach der Anionenaustausch-

chromatographie eine deutlich geringere Zahl an Proteinspots gegenüber den

Mitochondrien sowie den Äußeren Membran Vesikeln festgestellt werden. In

Abbildung 5.9 sind die Fraktionen 37-49 dargestellt.

39 38 40 37 Standard 41 42 43 44 45 Standard 46 47 48 49

Abb. 5.9: SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese-Profil der solubilisierten Äußeren Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien nach Anionenaustausch-chromatographie an DEAE. Dargestellt sind die Fraktionen 37-49 sowie zwei Molekular-gewichtstandards (97 kDa, 66 kDa, 45 kDa, 30 kDa, 20,1 kDa, 14,4 kDa). Das Gel wurde nach der in Kapitel 5.2.2.6 beschriebenen Methode hergestellt sowie aufgearbeitet. Das Gel zeigt die detektierten Banden nach Silberfärbung. Aufgetragen wurden jeweils 0,5 µg der jeweiligen Fraktion.

Zur besseren Erkennbarkeit wurden die Fraktionen 40-42, welche in der Abbildung

5.8 die höchsten Benzamidoxim-Reduktase-Aktivitäten besaßen, in einem weiteren

SDS-Gel aufgetragen (Abb. 5.10). Zu erkennen ist, dass die Fraktion 40 nur noch

zwei detektierbare Banden im silbergefärbten Gel bei 35 kDa besitzt. Die Fraktionen


211

41 und 42 hingegen besitzen noch zusätzlich Banden bei 100 kDa, 60 kDa und

16 kDa. Die 35 kDa Doppelbande ist auch in diesen Fraktionen vorhanden.

40 40 Standard 41 41 Standard 42 42

Abb. 5.10: SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese der solubilisierten Äußeren Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien nach Anionenaustauschchromatographie an DEAE. Die Fraktionen 40-42 sind jeweils doppelt sowie zwei Molekulargewichtstandards (97 kDa, 66 kDa, 45 kDa, 30 kDa, 20,1 kDa, 14,4 kDa) dargestellt. Das Gel wurde nach der in Kapitel 5.2.2.6 beschriebenen Methode hergestellt sowie aufgearbeitet. Die detektierten Banden im Gel sind mit Silber angefärbt. Aufgetragen wurden jeweils 0,5 und 1,0 µg der jeweiligen Fraktion.

5.3.1.2.11 nit-1 Rekonstitutions-Assay


Aktivität. Die Rekonstitution wurde mittels der Nitratreduktaseaktivität der nit-1

Mutante (Neurospora crassa) [Nason et al., 1971] bestimmt und freundlicherweise

von Tanja Otte (Technische Universität Braunschweig) durchgeführt. Die Methode ist

in Kapitel 5.2.2.9 beschrieben. In der nit-1 Mutante wird kein Molybdäncofaktor

gebildet. Deshalb kann die Nitratreduktaseaktivität nur durch extern zugegebenen

Molybdäncofaktor rekonstituiert werden. Entstehendes Nitrit wird als Indikator über

eine Azokupplung nachgewiesen. Nur in den Fraktionen 8-14 und 40-65 konnte eine

nit-1 Aktivität detektiert werden (Abb. 5.11). Dabei wurde in den Fraktionen 8-14


212

eine höhere Aktivität detektiert als in den Fraktionen 40-65. Die Enzymaktivität

wurde auf den in den jeweiligen Fraktionen vorliegenden Proteingehalt bezogen. Die

Messungen sind stets Mittelwerte aus Doppelbestimmungen.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0 20 40 60 80 100

Fraktion

Abs

orpt

ion

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

Nitr

it[µ

mol

*min

-1*m

g-1]

nit-1 Aktivität280 nm417 nm

Abb. 5.11: Elutionsprofil der nit-1 Aktivität nach Anionenaustauschchromatographie an DEAE. Äußere Membran Vesikel wurden nach der in Kapitel 5.2.1.4.1 beschriebenen Methode solubilisiert. Auftrag und Elution erfolgten nach der in Kapitel 5.2.1.4.2 beschriebenen Methode.

Im Vergleich dazu sind in Tabelle 5.1 die nit-1 Aktivitäten in Mitochondrien und der

Äußeren Membran Vesikel dargestellt.

Tab. 5.1: nit-1 Aktivität von Schweinenierenmitochondrien, den daraus gewonnenen Äußeren Membran Vesikeln sowie Fraktion 41

Fraktion nit-1 Aktivität

[Nitrit*min-1*mg-1] Anreicherungsfaktor

Mitochondrien 0,040 1

Äußere Membran Vesikel 0,177 4,4

Fraktion 41 1,767 44 Gebildetes Nitrit wurde über den gebildeten Azofarbstoff quantifiziert. Die ermittelten Daten sind Mittelwerte aus mindestens zwei Einzelmessungen.


213

5.3.1.2.12 Sulfitoxidase-Verlaufskontrolle

Die Messung der Sulfitoxidaseaktivität wurde nach der in Kapitel 5.2.2.9

beschriebenen Methode freundlicherweise von Tanja Otte (Technische Universität

Braunschweig) durchgeführt. Vor allem in den Fraktionen 52-60 konnte Sulfitoxidase

detektiert werden (Abb. 5.12). Die Enzymaktivität wurde auf den in den jeweiligen

Fraktionen vorliegenden Proteingehalt bezogen. Die Messungen sind stets

Mittelwerte aus Doppelbestimmungen.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0 20 40 60 80 100

Fraktion

Abs

orpt

ion

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

Sulfi

toxi

dase

-Akt

ivitä

t[U

*mg-1

]

Sulfitoxidase-Aktivität280 nm417 nm

Abb. 5.12: Elutionsprofil der Sulfitoxidase-Aktivität der solubilisierten Äußeren Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien nach Anionenaustauschchromatographie an DEAE. Äußere Membran Vesikel wurden nach der in Kapitel 5.2.1.4.1 beschriebenen Methode solubilisiert. Auftrag und Elution erfolgten nach der in Kapitel 5.2.1.4.2 beschriebenen Methode.

5.3.1.2.13 FormA Analyse

Die FormA Analyse wurde nach der in Kapitel 5.2.2.10 beschriebenen Methode


durchgeführt. Hierbei wurden nicht alle Fraktionen der Anionen-

austauschchromatographie untersucht, sondern nur die besonders aktiven Fraktionen

im nit-1 Rekonstitutions-Assay. Zusätzlich wurden die Mitochondrien sowie Äußeren

Membran Vesikel untersucht. Die erhaltenen Daten sind in Tabelle 5.2 dargestellt.


214

Tab. 5.2: FormA Analyse von Schweinenierenmitochondrien, den daraus gewonnenen Äußeren Membran Vesikeln sowie DEAE-Fraktionen 8 und 41

Fraktion FormA

[pmol*mg-1] Anreicherungsfaktor

Mitochondrien 684 1

Äußere Membran Vesikel 2103 3

Fraktion 8 4702 7

Fraktion 41 32380 47 Die ermittelten Daten sind Mittelwerte aus mindestens zwei Einzelmessungen.

5.3.1.2.14 Immunoblot-Analyse

Der gereinigte und gegen den rekombinanten C-Terminus der Mocosulfurase ABA3

aus A. thaliana gerichtete Antikörper erkannte spezifisch das identifizierte Enzym

Moco Sulfurase C-Terminus domain containing 2 in den Fraktionen 9-12 sowie 41-47

(Abb. 5.13-14).

Standard 9 10 11 12 13 14 15 16

Abb. 5.13: Western Blot der solubilisierten Äußeren Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien nach Anionenaustauschchromatographie an DEAE. Dargestellt sind die Fraktionen 9-16 sowie ein Molekulargewichtstandard (116 kDa, 66 kDa, 45 kDa, 35 kDa, 25 kDa, 18 kDa, 14 kDa). Eine C-terminale Domäne der humanen Mocosulfurase (CT) als Positivkontrolle ist vorhanden, wurde jedoch wegen zu starker Färbung in dieser Abbildung nicht gezeigt.

116 66

45

35

25

18 14


215

CT Standard 41 42 43 44 45 46 47 48

Abb. 5.14: Western Blot der solubilisierten Äußeren Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien nach Anionenaustauschchromatographie an DEAE. Dargestellt sind die Fraktionen 41-48, ein Molekulargewichtstandards (116 kDa, 66 kDa, 45 kDa, 35 kDa, 25 kDa) und eine C-terminale Domäne der humanen Mocosulfurase (CT) als Positivkontrolle.

5.3.1.3 Charakterisierung der N-reduktiven Aktivität der Benzamidoxim-reduzierenden Proteinfraktion

Auf die Optimierung der Inkubationsbedingungen wurde zunächst verzichtet und

anlehnend an die Inkubationsbedingungen von Havemeyer [2006], Clement et al. [1997] sowie Clement und Lopian [2003] mit kleinen Änderungen inkubiert. Im Zuge

weiterer Untersuchungen wurde eine Optimierung durchgeführt. Die Ergebnisse sind

in Kapitel 6.3.2 zu finden. Die nach der Methode von Havemeyer [2006] gewonnenen

Fraktionen zur Reduktion von Benzamidoxim wurden nach der in Kapitel 5.2.3.1.2

beschriebenen Vorschrift inkubiert. Alle erhaltenen Ergebnisse wurden nach der in

Kapitel 5.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik quantifiziert.

Ohne Zusatz der Elektronentransportproteine Cytochrom b5 oder NADH Cytochrom b5

Reduktase war keine Reduktion detektierbar (Kapitel 5.3.1.2.6). Unter Zusatz von

gereinigter NADH Cytochrom b5 Reduktase konnten Umsetzungsraten im Bereich von

bis zu 130 nmol*min-1*mg-1 gebildetem Benzamidin erzielt werden (Abb. 5.6). Unter

Zusatz von humanem rekombinantem Cytochrom b5 wurden Umsetzungsraten von

bis zu 10 nmol*min-1*mg-1 gebildetem Benzamidin erreicht (Abb. 5.7). Das fehlende

Volumen in den Inkubationsansätzen durch nicht zugesetzte Enzyme wurde jeweils

durch Kaliumphosphatpuffer ergänzt.


216

Bei Zusatz der beiden Elektronentransportproteine Cytochrom b5 und NADH

Cytochrom b5 Reduktase konnten unter den gewählten Bedingungen

Umsetzungsraten im Bereich von etwa 4500 nmol*min-1*mg-1 gebildetem

Benzamidin erreicht werden (Abb. 5.8).

In Tabelle 5.3 sind die erhaltenen Daten nochmals als Übersicht für die Fraktion 41

dargestellt.

Tab. 5.3: N-reduktive Aktivität der Benzamidoxim-reduzierenden Proteinfraktion unter Variation der Enzyme

Inkubationsansatz der Fraktion 41 N-reduktive Aktivität

[nmol Benzamidin*min-1*mg-1]

ohne zugesetzte Enzyme nicht detektierbar

nur NADH Cytochrom b5 Reduktase

zugesetzt 122,1 ± 0,1

nur Cytochrom b5 zugesetzt 2,1 ± 0,2

Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5

Reduktase zugesetzt 4106,2 ± 58,3

Der Inkubationsansatz setzte sich aus 10 µl Fraktion 41 (0,49 µg Protein), 1000 µM NADH, 500 µM Benzamidoxim in 150 µl eines 100 mM Kaliumphosphatpuffer pH 5,9 zusammen. Die zusätzlichen Enzyme wurden in folgenden Mengen zugesetzt: 50 pmol Cytochrom b5 und 0,05 U NADH Cytochrom b5 Reduktase. Die Inkubation wurde nach der in Kapitel 5.2.3.1.2 beschriebenen Methode durchgeführt. Gebildetes Benzamidin wurde mit der in Kapitel 5.2.3.1.3 beschriebenen Analytik quantifiziert. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus einem Reaktionsansatz, welcher doppelt vermessen wurde.

Zusätzlich wurden noch einzelne Komponenten des Inkubationsansatzes

weggelassen um weitere Abhängigkeiten darzustellen (Tab. 5.4).


217

Tab. 5.4: N-reduktive Aktivität der Benzamidoxim-reduzierenden Proteinfraktion unter Variation des Inkubationsansatzes

Inkubationsansatz N-reduktive Aktivität

[nmol Benzamidin*min-1*mg-1]

ohne Fraktion 41 2,6 ± 0,6

ohne NADH nicht detektierbar Der Inkubationsansatz setzte sich aus 50 pmol Cytochrom b5 und 0,05 U NADH Cytochrom b5 Reduktase, 500 µM Benzamidoxim in 150 µl eines 100 mM Kaliumphosphatpuffer pH 5,9 zusammen. Zusätzlich wurden im ersten Ansatz 1000 µM NADH und im zweiten Ansatz 10 µl Fraktion 41 (0,49 µg Protein) zugegeben. Die Inkubation wurde nach der in Kapitel 5.2.3.1.2 beschriebenen Methode durchgeführt. Gebildetes Benzamidin wurde mit der in Kapitel 5.2.3.1.3 beschriebenen Analytik quantifiziert. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus einem Reaktionsansatz, welcher doppelt vermessen wurde.

In Tabelle 5.5 sind die N-reduktiven Aktivitäten und der Anreicherungsfaktor für die

Benzamidoximreduktion in Mitochondrien, den Äußeren Membran Vesikeln sowie der

Fraktion 41 dargestellt.

Tab. 5.5: Spezifische Benzamidoxim-Reduktase-Aktivität von Schweinenieren-mitochondrien, den daraus gewonnenen Äußeren Membran Vesikeln sowie Fraktion 41

Fraktion N-reduktive Aktivität

[nmol Benzamidin*min-1*mg-1] Anreicherungsfaktor

Mitochondrien 17 1

Äußere Membran Vesikel 180 11

Fraktion 41 4106 242 Die N-reduktive Aktivität der Mitochondrien ist ein Mittelwert aus den Aktivitätsbestimmungen von fünf Mitochondrienchargen. Die N-reduktive Aktivität der Äußeren Membran Vesikel ist ein Mittelwert aus den Aktivitätsbestimmungen von vier Äußeren Membran Vesikel Chargen. Beide dargestellten Aktivitäten beziehen sich auf das eingesetzte Gesamtprotein. Die N-reduktive Aktivität der Fraktion 41 ist eine Einzelbestimmung. Die dargestellte Aktivität bezieht sich auf die eingesetzte Proteinmenge der Fraktion 41.


Die mittels SDS-PAGE aufgetrennten Proteinbanden (Fraktion 40-42) wurden

ausgeschnitten und der ESI-Analyse zugeführt. Die Proben wurden über Nacht durch

Trypsin hydrolysiert. Nach Einstellen eines sauren pH-Wertes wurden die Peptide des


218

Hydrolyse-Überstandes per nano-HPLC getrennt und mit ESI in der Q-TOF MS/MS

analysiert. Zuvor wurde das Massenspektrometer mit Renin kalibriert.

Die so erhaltenen Peptidfragmente wurden mit Fragmenten einer elektronischen

Datenbank verglichen. Dabei wurden die in Tabelle 5.6 aufgeführten Enzyme mit

hoher Wahrscheinlichkeit zugeordnet.

Tab. 5.6: Sequenzanalyse der Proteinbanden aus Fraktion 41 und 42

100 kDa Bande

Dipeptidylpeptidase IV

60 kDa Doppel-Bande

Monoaminoxidase B

Monoaminoxidase A

35 kDa Doppel-Bande

MOCO Sulfurase C-terminal domain containing 2

Hypothetisches Protein

16 kDa Bande

Hypothetisches Protein LOC531444

Wie in Abbildung 5.10 ersichtlich ist, war in Fraktion 40 lediglich die 35 kDa

Doppelbande zu sehen. In den Fraktionen 41 und 42 konnten zusätzlich noch die in

Tabelle 5.6 aufgeführten Banden detektiert werden. Da die Fraktionen 40-42 aber

etwa vergleichbare Aktivitäten in ihren Benzamidoxim-reduzierenden Eigenschaften

besaßen (Abb. 5.8), konnte die Aktivitätssteigerung gegenüber dem

Inkubationsansatz ohne der zugesetzten 3. Komponente nur auf die detektierte

35 kDa Doppelbande zurückgeführt werden.

Die Anreicherung der Dipeptidylpeptidase IV war in Abbildung 5.9 gut sichtbar. Die

stärkste Detektion fand in den Fraktionen 42-44 statt, korrelierte jedoch nicht mit

den Benzamidoxim-reduzierenden Fraktionen (Abb. 5.8). Dieses Protein konnte somit

als verantwortliches Enzym ausgeschlossen werden. Gleiches gilt für die

Monoaminoxidase sowie für das hypothetische Protein der 16 kDa Bande.


219

Die beiden aus der 35 kDa Doppelbande detektierten Enzyme waren auf Grund eines

Sequenz-Alignments als identische Enzyme anzusehen. In beiden Fällen ist es als

MOCO Sulfurase C-terminal domain containing 2 erkannt worden.


220

5.4 Diskussion

In dieser Arbeit sollte die Übertragbarkeit der Methode zur Gewinnung und

Identifizierung der dritten Komponente [Havemeyer, 2006] auf

Schweinenierenmitochondrien kontrolliert, getestet und gegebenenfalls modifiziert

werden. Im Weiteren sollte die gewonnene Enzymfraktion für die in vitro Studien

charakterisiert werden. Immunoblot-Analysen sowie massenspektrometrische

Analysen sollten zur Identifizierung der dritten Komponente herangezogen werden.

Die Gewinnung der Schweinenierenmitochondrien wurde in Kapitel 3 dieser Arbeit

beschrieben und diskutiert. Die Subfraktionierung dieser Mitochondrien führte zur

gezielten Gewinnung der Äußeren Membran Vesikel der Mitochondrien (Kapitel 4).

Wie schon Havemeyer [2006] beschrieb, war in diesem Schritt mit großen

Ausbeuteverlusten zu rechnen. Dieses wurde auch im Rahmen dieser Arbeit bestätigt

(Daten nicht gezeigt). Dem gegenüber stand allerdings der hohe Anreicherungsfaktor

der Benzamidoxim-Reduktase Aktivität (Tab. 5.5). Die Lagerungsfähigkeit der

Äußeren Membran Vesikel bei -80 °C ohne Verlust der Aktivität wurde von

Havemeyer [2006] beschrieben. Durch mehrmaliges Gewinnen dieser Äußeren

Membran Vesikel konnte die erforderliche Proteinmenge gewonnen werden, die zur

weiteren Anreicherung des gesuchten Enzyms benötigt wurde.

Da das gesuchte Enzymsystem in der äußeren Membran verankert ist, mussten für

die weitere Arbeit diese membrangebundenen Enzyme solubilisiert werden. In

umfangreichen Untersuchungen konnte Havemeyer [2006] das Sulfobetainderivat

Zwittergent® 3-14 als das am besten geeignete Detergenz für diesen Arbeitsschritt

zeigen. Dabei optimierte sie sowohl die zu verwendende Detergenzmenge als auch

das Verhältnis zwischen Protein und Detergenz. Diese Daten konnten zur

Solubilisation der Äußeren Membran Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien

übernommen werden. Es wurde auch in dieser Arbeit eine effektive Extraktion der

Enzyme aus der Membran erreicht, wobei Zwittergent® 3-14 in der eingesetzten

Konzentration keinen störenden Einfluss auf die N-reduktive Aktivität ausübte (Daten

nicht gezeigt). Dieses lässt sich am ehesten mit der Struktur des Detergenzes

erklären. Der zwitterionische, ambiphile Aufbau ähnelt dem des Phosphatidylcholins

und Lecithins [Gonenne und Ernst, 1978] und imitiert somit die natürlich

vorkommende Membran am ehesten.


221

Im nächsten Schritt wurde eine säulenchromatographische Auftrennung des

Solubilisats an dem Anionenaustauschmaterial DEAE durchgeführt. Wie schon in

Kapitel 2.1.2 beschrieben, gehört die Ionenaustauschchromatographie zu den

wichtigsten Methoden der Proteinreinigung und -gewinnung [Pingoud und Urbanke,

1997].

Bei einem physiologischen pH-Wert konnte die Bindung der für die N-reduktive

Aktivität verantwortlichen Enzyme erreicht werden. Eine Verlaufskontrolle der

eluierten Enzyme wurde bei 280 nm sowie 417 nm durchgeführt (Abb. 5.1). Die

Fraktionen 8-19 stellten dabei eine nichtbindende Fraktion dar. Zur Elution der

bindenden Enzyme wurde ab Fraktion 31 ein linearer Natriumchloridgradient

angeschlossen, der die bindenden Enzyme sukzessive vom Säulenmaterial durch

Verdrängung von den Bindungsstellen eluierte (Abb. 5.1). In den Fraktionen 39-62

konnte bei den gemessenen Wellenlängen Protein unterschiedlicher Menge detektiert

werden. Der Verlauf der Messung bei 280 nm sowie die nachgewiesene

Proteinmenge korrelierten dabei (Daten nicht gezeigt).

Der Elutionsverlauf des Enzyms Cytochrom b5 ist in Abbildung 5.2 gezeigt. Dabei

konnte lediglich in den Fraktionen 53 bis 55 das Enzym detektiert werden. Zur

Bestimmung wurde die unverdünnte Pufferlösung eingesetzt. Der positive Nachweis

korreliert dabei mit der 417 nm Detektion (Abb. 5.2), da Cytochrom b5 ein

hämhaltiges Enzym ist (Kapitel 6.1.1).

Als weiteres an der Reduktion beteiligtes Enzym wurde der Elutionsverlauf der NADH

Cytochrom b5 Reduktase kontrolliert (Abb. 5.3). In den Fraktionen 46-51 konnte das

Enzym nach der Methode von Mihara und Sato [1978] detektiert werden. Damit

trennten sich die beiden beteiligten Elektronentransportproteine Cytochrom b5 und

NADH Cytochrom b5 Reduktase mittels der säulenchromatographischen Auftrennung

voneinander ab.

Zusätzlich wurden die in der bisherigen Reinigung bestimmten Markerenzyme der

äußeren mitochondrialen Membran, Monoaminoxidase und Rotenon-insensitive

Cytochrom c Reduktase, im Elutionsprofil bestimmt (Abb. 5.4 und 5.5). Während die

Monoaminoxidase konzentriert in den Fraktionen 41-47 bestimmbar war, verteilte

sich die Rotenon-insensitive Cytochrom c Reduktase über die Fraktionen 7-14, 38-42

und 45-52. Der positive Nachweis der Proteine bestätigt die bisherigen Ergebnisse

(Kapitel 4.3.1.2.2 und 4.3.1.2.3).


222

Die Verwendung des Detergenzes Zwittergent® 3-14 ermöglichte eine direkte

Testung auf die N-reduktive Aktivität der Fraktionen ohne aufwändige

Detergenzentfernung [Clement et al., 1997]. Die Inkubation der einzelnen Fraktionen

im Standardinkubationsansatz (Kapitel 5.2.3.1.2) ohne Zusatz anderer Enzyme zeigte

in keiner Fraktion eine N-reduktive Aktivität (Kapitel 5.3.1.2.6).

Nach Zusatz der aus Schweinelebermikrosomen gereinigten NADH Cytochrom b5

Reduktase konnten in den Fraktionen 12-13, 39-44 und 47-54 eine

benzamidoximreduzierende Aktivität festgestellt werden (Abb. 5.6). Wurde im

Gegenzug rekombinant gewonnenes humanes Cytochrom b5 eingesetzt, so konnte in

den Fraktionen 14-15 und 42-53 benzamidoximreduzierende Aktivität detektiert

werden (Abb. 5.7). Diese Aktivität lag aber im Vergleich zur zugesetzten NADH

Cytochrom b5 Reduktase bei nur etwa 8 %.

Nach Zugabe beider Elektronentransportproteine zu den Fraktionen der DEAE-Säule

konnte in den Fraktionen 10-15 und 39-48 eine Benzamidoxim-Reduktase-Aktivität

detektiert werden (Abb. 5.8). Hierbei waren vor allem die Fraktionen 40-42 hoch

aktiv. Die Fraktionen 49-54 zeigten zwar auch noch reduktive Eigenschaften, doch

war diese im Vergleich zu den anderen Fraktionen sehr gering. Sie korrelierten mit

den Aktivitäten, die die NADH Cytochrom b5 Reduktase auch allein erzielen konnte

(Abb. 5.6).

Die Fraktionen 40-42 wurden bei etwa 0,2 M Natriumchlorid von der Säule eluiert

und stimmen damit mit den aus der Leber gewonnenen Daten überein [Havemeyer,

2006]. Diese Fraktionen waren frei von Cytochrom b5 (Abb. 5.2) und der NADH

Cytochrom b5 Reduktase (Abb. 5.3).

Eine zweite Benzamidoxim–reduktaseaktive Fraktion wurde in dem nichtgebundenen

Anteil (Fraktion 10-15) gefunden, doch war die Aktivität hier wesentlich geringer als

in den Fraktionen 40-42 (Abb. 5.8). Havemeyer [2006] konnte mit höherem

Salzgradienten eine weitere aktive Fraktion zur Reduktion von Benzamidoxim von der

Säulen eluieren. Eine solche Fraktion war in der Auftrennung der Äußeren Membran

Vesikel aus Schweinenierenmitochondrien nicht zu detektieren und zeigt somit einen

klaren Unterschied zur Enzymgewinnung aus der Leber. Hiermit lässt sich auch

erklären, warum Havemeyer [2006] mit Kaliumcyanid eine Aktivierung der

Benzamidoxim-Reduktase in ihren Äußeren Membran Vesikeln erzielen konnte,

während der Effekt bei den Äußeren Membran Vesikeln aus

Schweinenierenmitochondrien (Abb. 4.7) ausblieb. Havemeyer [2006] vermutete eine

weitere, durch Kaliumcyanid aktivierbare, benzamidoximreduzierende Komponente in

den Äußeren Membran Vesikeln aus Schweinelebermitochondrien, die aber in der

Niere nicht entdeckt werden konnte. Da alle Fraktionen der SDS-

Polyacrylamidgelelektrophorese, dem nit-1 Rekonstitutions-Assay sowie der


223

Immunoblot-Analyse unterzogen werden sollten, wurden keine Fraktionen gepoolt,

sondern getrennt voneinander aliquotiert und bei -80 °C eingefroren.

Die Abbildung 5.10 zeigt die drei aktiven, elektrophoretisch reinen Fraktionen 40-42.

Der Aufreinigungsfaktor, ausgehend von den Mitochondrien bis zum rekonstituierten

System mit diesen hochreinen Fraktionen betrug 242 (Tab. 5.5). Um zu der

hochreinen Fraktion zu gelangen, mussten Nierenmitochondrien gewonnen werden.

Diese stellten einen Pool aus acht Nieren dar. Im nächsten Schritt wurden die

Äußeren Membran Vesikel aus dem Mitochondrienpool gewonnen. Um genügend

Ausgangsmaterial zur Durchführung der Anionenaustauschchromatographie zu

haben, wurden mehrere Äußere Membran Vesikel-Chargen wiederum gepoolt. Somit

ist der Aufreinigungsfaktor auf Mittelwerte der jeweils gewonnenen Chargen bezogen

und nicht individuell auf eine einzelne Niere zurückzuführen.

Die Kontrollinkubationen mit der zugesetzten, aus Schweineleber gewonnenen NADH

Cytochrom b5 Reduktase, zeigten für die Fraktionen 40-42 eine Aktivität von etwa

120 nmol Benzamidin*min-1*mg-1. Bei Zusatz beider Elektronentransportproteine

wurden etwa 4100 nmol Benzamidin*min-1*mg-1 erreicht (Tab. 5.3). Die etwa 3 %ige

Benzamidoxim-Reduktase-Eigenaktivität der gereinigten NADH Cytochrom b5

Reduktase ist vermutlich auf eine Kontamination dieses Enzyms mit Cytochrom b5

zurückzuführen, denn die Umsetzungsraten bei Zusatz beider Enzyme zeigten

deutlich, dass nur im Dreikomponentensystem maximale Umsetzungsraten erzielt

werden konnten. Havemeyer [2006] konnte zudem mit rekombinanter humaner

NADH Cytochrom b5 Reduktase zeigen, dass hiermit allein keine Umsetzung erzielt

werden konnte, sondern der Zusatz von Cytochrom b5 benötigt wurde.

Da die Fraktionen 40-42 nur durch Zusatz von Cytochrom b5 und NADH Cytochrom

b5 Reduktase ihre maximale Reduktionsrate erreichten, bestätigten sich die bisher

beschriebenen Ergebnisse über N-reduktive membrangebundene Enzymsysteme

[Kadlubar und Ziegler, 1974; Clement et al., 1997; Havemeyer, 2006], nach welchen

es sich hierbei um ein Dreikomponentensystem handelt.

Das SDS-Gel der Fraktionen 37-49 (Abb. 5.9) zeigt die Aufreinigung der Proteine. Da

die Fraktionen 40-42 besonders aktiv waren, wurden diese in Abb. 5.10 nochmals

dargestellt. Die Fraktionen wurden jeweils doppelt mit unterschiedlichen

Proteinkonzentrationen aufgetragen. In der zunächst angefertigten Coomassie-Blau-

Färbung konnte keine Bande sichtbar gemacht werden. Erst die sich anschließende

Silberfärbung ergab das abgebildete Foto. In Fraktion 40 war lediglich die 35 kDa

Doppelbande zu erkennen, während in den Fraktionen 41 und 42 noch zusätzliche

Proteine auftraten. Die in Fraktion 41 gefärbten Banden wurden der


224

massenspektrometrischen Analyse unterzogen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5.6

dargestellt.

Die bei etwa 100 kDa auftretende Proteinbande detektierte mit hoher

Wahrscheinlichkeit die Dipeptidylpeptidase IV. In Abbildung 5.9 ist gut sichtbar, dass

die stärkste Detektion in den Fraktionen 42-44 stattfand und stimmt somit nicht mit

den Benzamidoxim-reduzierenden Fraktionen überein (Abb. 5.8).

Die Dipeptidylpeptidase IV ist eine ubiquitäre und multifunktionelle, prolinspezifische

Serinprotease. Im Blut ist sie für die Inaktivierung der gastrointestinalen

Peptidhormone GLP-1 (Glucagon-like peptide-1) und GIP (gastric inhibitory

polypeptide) verantwortlich. Beide Hormone stimulieren in strikter Abhängigkeit von

der Blutglukosekonzentration die Insulinausschüttung aus dem Pankreas. Da der

Proteinverlauf nicht mit der Benzamidoxim-Reduktase übereinstimmte, wurde dieses

Enzym als das verantwortliche ausgeschlossen.

Havemeyer [2006] hatte ebenfalls in ihrer Fraktion Monoaminoxidase detektieren

können. Durch Inkubation mit rekombinanter Monoaminoxidase bzw. zur

Benzamidoximreduktion zugesetzte Monoaminoxidase-Inhibitoren konnte sie die

Beteiligung allerdings ausschließen.

Über das hypothetische Protein in der 16 kDa Bande sind bisher kaum Daten

vorhanden. Es handelt sich dabei um ein in Mitochondrien des Rinderhirns entdecktes

Enzym, welches am Fettsäure-Stoffwechsel beteiligt sein soll [Colca et al., 2004].

Reaktionsmechanismen oder spezielle Funktionen sind von diesem Enzym noch nicht

bekannt.

Wie in Abbildung 5.10 ersichtlich, ist in Fraktion 40 lediglich die 35 kDa Doppelbande

zu sehen. In Fraktion 41 und 42 konnten zusätzlich noch die in Tabelle 5.6

aufgeführten Banden detektiert werden. Da die Fraktionen 40-42 aber etwa

vergleichbare Aktivitäten in ihrer Benzamidoxim-reduzierenden Eigenschaft besaßen

(Abb. 5.8), konnte die Aktivitätssteigerung gegenüber dem Inkubationsansatz ohne

die zugesetzte 3. Komponente nur auf die detektierte 35 kDa Doppelbande

zurückgeführt werden.

Die Aminosäuresequenz des hypothetischen Proteins der 35 kDa Doppelbande ist

theoretisch berechnetet. Im Sequenz-Alignment ergab es eine hohe Homologie zu

MOCO Sulfurase C-terminal domain containing 2, so dass es sich hierbei

wahrscheinlich um das gleiche Protein handelt (Daten nicht gezeigt). Die gefundenen

Teilsequenzen sind identisch mit dem menschlichen und dem homologen

hypothetischen Enzym aus dem Affen. Da das Genom des Schweins noch nicht

vollständig bekannt ist, jedoch in vielen Fällen hohe Homologien zum Menschen


225

vorhanden sind, kann davon ausgegangen werden, dass es sich um ein identisches

Enzym handelt.

Dieses Ergebnis ist identisch mit dem von Havemeyer [2006] detektierten Ergebnis in

der Schweineleber. Sie hatte hierzu Inkubationen mit dem rekombinanten

C-Terminus der humanen und pflanzlichen (A. thaliana) Mocosulfurase zur Reduktion

von Benzamidoxim durchgeführt. Beide rekombinanten Enzyme waren in der Lage,

Benzamidoxim zum korrespondierenden Benzamidin zu reduzieren.

Damit konnte erstmalig die Expression dieses Enzyms in Nierenzellen von

Säugetieren nachgewiesen werden.

Im nit-1 Rekonstitutions-Assay konnte der Molybdäncofaktor nachgewiesen werden

(Abb. 5.11). Dabei wurde in den Fraktionen 8-14 und 40-65 eine nit-1 Aktivität

detektiert. Die hohe Aktivität der Fraktionen 8-14 korrelierte aber nicht mit der

Aktivität der Benzamidoxim-Reduktase. Die Fraktionen 40-44 zeigten wiederum

starke nit-1 Aktivität, welche mit der Benzamidoxim-Reduktase übereinstimmt. In

weiteren Fraktionen korrelierte der Molybdäncofaktornachweis nicht mehr mit der

Reduktaseaktivität.

Die nicht vorhandene Aktivität in den Fraktionen 8-14 bei gleichzeitiger Aktivität der

Fraktionen 40-44 lässt sich mit dem Vorkommen des Molybdäncofaktors in zwei

unterschiedlichen Subtypen erklären (Abb. 6.2). Es ist zum jetzigen Zeitpunkt noch

nicht bekannt, welcher Subtyp für die Benzamidoxim-Reduktase Aktivität

verantwortlich ist. So kann in den Fraktionen 8-14 der eine Molybdäncofaktorsubtyp

eluiert worden sein, der für die N-Reduktivität nicht verantwortlich ist, und in den

Fraktionen 40-44 ein anderer Molybdäncofaktorsubtyp, der Benzamidoxim zu

Benzamidin reduziert. Gegenstand zukünftiger Arbeiten sollte sein, diesen

Mechanismus aufzuklären.

Die nachgewiesene Molybdäncofaktor-Aktivität in den Fraktionen 40-65 konnte

teilweise mit der Benzamidoxim-Reduktase korreliert werden. Ab Fraktion 49 stieg

allerdings die nachgewiesene Menge an Molybdäncofaktor-Aktivität wieder an. Mit

diesem Anstieg ist auch Sulfitoxidase im erhöhten Maße nachweisbar (Abb. 5.12). Die

tierische Sulfitoxidase ist im Intermembranraum der Mitochondrien lokalisiert (Kapitel

6.1.4). Es handelt sich um ein Molybdoenzym, welches in seiner C-terminalen

Domäne den Molybdäncofaktor bindet und in der N-terminalen Domäne Cytochrom

b5 trägt. Somit ist der positive nit-1 Nachweis verständlich. Zudem kann damit die

Sulfitoxidase als verantwortliches Molybdoenzym ausgeschlossen werden, da die

nachgewiesene Sulfitoxidase-Aktivität in den Fraktionen 52-60 nicht mit den

Fraktionen 40-42 übereinstimmt, in denen die Benzamidoxim-Reduktase-Aktivität


226

hauptsächlich nachgewiesen wurde. Außerdem korreliert der positive Nachweis der

Sulfitoxidase mit dem Nachweis des Cytochrom b5 (Abb. 5.2). Da die Sulfitoxidase

Cytochrom b5 am N-terminalen Ende gebunden hat, ergänzen sich diese Ergebnisse.

Die mitochondriale Sulfitoxidase wurde bereits zu Beginn der Siebziger Jahre

nachgewiesen [Ito, 1971]. Zudem wurde ein Molybdäncofaktor in verschiedenen

Organen der Ratte beschrieben [Johnson et al., 1977]. Auffällig ist der starke

Unterschied im Molybdäncofaktornachweis zwischen Niere und Leber in der

genannten Arbeit, wonach die Niere nur eine 10 %ige Menge an Molybdäncofaktor

gegenüber der Leber besitzt. Bezogen auf die Benzamidoxim-Reduktase sind die

Aktivitäten der gewonnenen Mitochondrien aus Leber und Niere etwa gleich. Ob es

sich somit um das gleiche Molybdoenzym handelt, welches zum einen in dieser Arbeit

entdeckt wurde zum anderen von Johnson et al. [1977], ist fraglich.

In den Kapiteln 3.3.1.6.6 und 4.3.1.5.6 wurde schon Natriumvanadat als potenter

Hemmstoff der Benzamidoxim-Reduktase beschrieben. Dabei ist das Salz kein

selektiver Molybdäncofaktorinhibitor, dennoch ist eine Hemmung molybdocofaktor-

abhängiger Reaktionen typisch [Ramadoss, 1980].

Die Anreicherung der nit-1 Aktivität (Tab. 5.1) als Molybdäncofaktornachweis und die

Anreicherung der FormA-Analyse (Tab. 5.2) korrelieren miteinander. Vergleichend

konnte die N-reduktive Aktivität (Tab. 5.5) im Gewinnungsschritt von den

Mitochondrien zur äußeren mitochondrialen Membran mit dem Faktor 2,5 stärker

angereichert werden und im nächsten Schritt nach der Anionenaustausch-

chromatographie noch einmal um den Faktor 2. Dieses Ergebnis deutet stark darauf

hin, dass das gleiche Enzym angereichert wurde.

Der gegen den rekombinanten C-Terminus der Mocosulfurase gerichtete Antikörper

erkannte im Western Blot in den Benzamidoxim-Reduktase aktiven Fraktionen das

35 kDa Protein (Abb. 5.13 und 5.14). Die unterschiedliche Stärke der Anfärbung der

Banden ist mit der unterschiedlich aufgetragenen Proteinmenge zu begründen, da

aus den Fraktionen nach der Anionenaustauschchromatographie jeweils das gleiche

Volumen für den Western Blot verwendet wurde. Auffällig sind die Detektionen von

Banden mit doppeltem und dreifachem Molekulargewicht zur 35 kDa Bande. Dieses

Phänomen wurde für andere Enzyme schon vorher beschrieben [Mziaut et al., 2000;

Zhang et al., 2005]. Da es sich bei dem entdeckten Molybdäncofaktor um ein

membranständiges Enzym handelt, wäre auch eine Zusammenlagerung der Proteine

denkbar und verständlich.

Die Zusammensetzung des Enzymsystems bestehend aus Cytochrom b5, NADH

Cytochrom b5 Reduktase und Molybdäncofaktor zur Reduktion von Benzamidoxim ist


227

bei der Nitratreduktase wiederzufinden [Campbell, 1999], die in autotrophen

Organismen vorkommt (Kapitel 6.1.4). Es ist eine NAD(P)H abhängige Reduktase,

welche Elektronen von NADH Cytochrom b5 Reduktase über Cytochrom b5 auf den

katalytisch aktiven Molybdäncofaktor überträgt [Campbell, 1999]. Damit wurde im

Rahmen dieser Arbeit zum ersten Mal in den Nieren von Säugetieren ein solches

Enzymsystem beschrieben.

Ein genauer Mechanismus der katalysierten Reaktion sollte Gegenstand weiterer

Arbeiten sein.


228

5.5 Zusammenfassung

In dieser Arbeit wurde die Methode zur Gewinnung der dritten Komponente zur

Reduktion N-hydroxylierter Verbindungen auf Schweinenierenmitochondrien

übertragen. Die erhaltenen Daten zeigen eindeutig, dass die Methode übertragbar

ist. Sie stellt damit eine schnelle Methode dar, die es erlaubt, Cytochrom b5 und

NADH Cytochrom b5 Reduktase von der sehr aktiven N-reduktiven Enzymfraktion

abzutrennen. Dabei ist diese Komponente nicht als die allein aktive Fraktion

anzusehen, sondern die Kombination mit Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5

Reduktase machen das stark N-reduktiv wirksame Enzymsystem aus. Im Gegensatz

zur Leber konnte in dieser Arbeit aber nur ein aktives, reduzierendes Enzymsystem

detektiert werden.

Ziel war es, diese dritte Komponente zu identifizieren. Es handelt sich um ein 35 kDa

großes Protein, welches den Molybdäncofaktor enthält. Da mehrere

molybdäncofaktorabhängige Enzyme beschrieben sind, ist die komplette Sequenz

noch nicht bekannt. Aufgrund der durchgeführten Untersuchungen konnte gezeigt

werden, dass die Sulfitoxidase nicht das verantwortliche Enzyme sein kann. Zudem

wurde Molybdäncofaktoraktivität in Fraktionen gefunden, die nicht Benzamidoxim

reduzieren. Möglicherweise sind nicht beide der zwei unterschiedlichen

Molybdäncofaktorsubtypen dazu in der Lage, Benzamidoxim zu reduzieren.

Im Rahmen dieser Arbeit konnte zum ersten Mal das verantwortliche Enzymsystem

zur Reduktion von Benzamidoxim aus porcinen Nieren komplett identifiziert werden.

Zudem wurde damit erstmalig ein molybdäncofaktorabhängiges Enzymsystem in den

Nieren aus einem Säugetier beschrieben. Die Zusammensetzung ist der in

autotrophen Organismen vorkommenden Nitratreduktase ähnlich.

Reduktion von Benzamidin mit dem Zwei- und Dreikomponentensystem

229

6 REDUKTION VON BENZAMIDOXIM MIT DEM ZWEI-

UND DREIKOMPONENTENSYSTEM

6.1 Einleitung

6.1.1 Cytochrom b5

Cytochrom b5 ist ein ambiphiles Protein, welches an vielen Oxidations- und

Reduktionsreaktionen partizipiert [Strittmatter et al., 1972]. In Hepatozyten sind zwei

homologe, membranständige Isoformen des Cytochrom b5 bekannt [Altuve et al., 2001]. Die eine Isoform ist auf dem Endoplasmatischen Retikulum [Strittmatter et al., 1972], die andere Isoform auf der äußeren Membran der Mitochondrien [D’Arrigo

et al., 1993] lokalisiert. Daneben ist unter anderem in der Schweineniere ein lösliches

Cytochrom b5 isoliert worden, welches die gleichen spektralen Eigenschaften besitzt

wie das mikrosomale [Mangum et al., 1970]. Es findet sich vor allem in den

Erythrocyten.

Cytochrom b5 gehört zur Gruppe der Hämproteine. Definitionsgemäß ist das

Hämgerüst, bestehend aus dem Eisen-Zentralatom und Protoporphyrin IX, in

Cytochromen der b-Klasse nicht-kovalent gebunden [Mathews und Czerwinski,

1976]. Es handelt sich um ein Enzym mit einem Molekulargewicht von 16 kDa [Spatz

und Strittmatter, 1971].

Mitochondriale und mikrosomale Isoformen haben in der Röntgenstrukturanalyse

einen nahezu identischen Aufbau [Altuve et al., 2001]. Ambiphiles Cytochrom b5 ist

ein monomeres Polypeptid aus 133 Aminosäuren. Es ist aus drei funktionell

verschiedenen Teilen aufgebaut [Durley und Mathews, 1996; Altuve et al., 2001]. Die

hydrophile, cytosolisch exponierte N-terminale Domäne (≈ 100 Aminosäuren) enthält

das Hämgerüst und nimmt an der Elektronenübertragungsreaktion teil. Die

N-terminale Aminosäure ist bei den meisten Spezies durch Acetylierung blockiert

[Abe et al., 1985]. Die mittlere, hydrophobe Domäne (≈ 20 Aminosäuren) stellt den

Membrananker dar und ist in die Lipiddoppelschicht eingebettet. Die hydrophile,

C-terminale Domäne (≈ 10 Aminosäuren) ist in das Lumen des Endoplasmatischen

Retikulums bzw. zum Intermembranraum der Mitochondrien gerichtet.

Eine Propionylseitenkette des Häms ist aus der Oberfläche von Cytochrom b5

herausgerichtet, während das Häm selbst fast vollständig vom umgebenden Medium

abgeschirmt ist. Diese Seitenkette ist von weiteren Carboxylgruppen umringt und

kann mit der NADH Cytochrom b5 Reduktase interagieren [Strittmatter und Dailey,

1982; Durley und Mathews, 1996]. Diese Abschirmung des Hämgerüstes erklärt auch


230

die geringe Bindungsfähigkeit von Liganden wie Kohlenmonoxid und Cyanid im

Vergleich zu anderen Hämproteinen wie Hämoglobin.

Die membranständigen Cytochrom b5 Proteine haben ein annähernd identisches

Molekulargewicht [Ito, 1980] und zeigen aufgrund der hochkonservierten

hämbindenden Domäne [Lederer et al., 1983] die gleichen spektroskopischen

Eigenschaften [Rivera et al., 1992]. Es wurden beschrieben, dass das Hämgerüst

über einen Histidinrest gebunden wird [Strittmatter, 1960]. Dieses wurde später

durch Röntgenstrukturanalysen bestätigt [Mathews et al., 1971 und 1979].

Die mikrosomale sowie die lösliche Form des Cytochrom b5 werden wahrscheinlich

durch das gleiche Gen kodiert. Die lösliche Form muss demnach noch

posttranslatorisch modifiziert werden [Slaughter et al., 1982; Borgese et al., 1993].

Während mikrosomales und lösliches Cytochrom b5 die gleiche katalytisch aktive

N-terminale Domäne besitzen [Slaughter et al., 1982], unterscheidet sich davon die

N-terminale Domäne des mitochondrialen Cytochrom b5 in seiner Aminosäure-

sequenz. Die katalytisch aktive Domäne des mitochondrialen Enzyms hat eine

60 %ige Übereinstimmung der Aminosäuresequenz im Vergleich zum mikrosomalen

und löslichen Enzym [Lederer et al., 1983].

Weiterhin unterscheidet sich das mitochondriale Cytochrom b5 in seinen

biophysikalischen Eigenschaften von dem mikrosomalen und löslichen Cytochrom b5.

Ersteres zeigt eine höhere Stabilität gegenüber thermischer und chemischer

Denaturierung [Altuve et al., 2004] und weist ein um etwa 100 mV negativeres

Redoxpotential aufgrund einer stärkeren Häm-Polypeptid-Interaktion auf [Cowley et al., 2004].

6.1.2 NADH Cytochrom b5 Reduktase

Elektronen des Cosubstrates NADH können nicht direkt auf Cytochrom b5 übertragen

werden. Als Elektronenüberträger des Zweielektronendonators NADH und des

Einelektronenakzeptors Cytochrom b5 dient die NADH Cytochrom b5 Reduktase, ein

Flavoprotein, welches Elektronen sukzessiv auf einen Elektronenakzeptor übertragen

kann [Mathews und Czerwinski, 1976]. Es enthält pro Molekül ein Molekül nicht-

kovalent gebundenes Flavinadenindinukleotid [Mathews und Czerwinski, 1976].

NADH Cytochrom b5 Reduktase ist in den unterschiedlichen subzellulären Fraktionen

molekular identisch [Borgese und Longhi, 1990] und wird durch ein Gen kodiert

[Pietrini et al., 1992; Borgese et al., 1993]. Die Aminosäuresequenz der löslichen

Reduktase ist fast vollständig identisch mit der C-terminalen Domäne der

membrangebundenen Form [Yubisui et al., 1987].


231

Das ambiphile Molekül wurde durch Behandlung der Mikrosomen mit Detergentien

gewonnen [Mihara und Sato, 1972; Spatz und Strittmatter, 1973]. Durch die

Einführung der Bioaffinitätschromatographie mit 5’-ADP Agarose waren hochreine

Präparationen des Flavoproteins mit guten Ausbeuten erhältlich [Schafer und

Hultquist, 1980], so dass Untersuchungen der Struktur durchgeführt werden

konnten.

NADH Cytochrom b5 Reduktase konnte in enzymatischen Testverfahren sowie in

immunochemischen Nachweisen vor allem in der äußeren mitochondrialen Membran

nachgewiesen werden. In kleinerer Konzentration wurde das Enzym auch im

Endoplasmatischen Retikulum nachgewiesen. Schließlich konnte das Enzym auch in

Lysosomen, Plasmamembranen sowie in der Membran des Golgiappartes

nachgewiesen werden [Borgese und Pietrini, 1986]. Die membrangebundene Form

der NADH Cytochrom b5 Reduktase hat ein Molekulargewicht von etwa 34,5 kDa

[Ozols et al., 1985]. Daneben existiert noch eine lösliche Form der NADH Cytochrom

b5 Reduktase. Diese kommt in den zirkulierenden Erythrocyten vor und katalysiert die

Reduktion von Methämoglobin [Hultquist und Passon, 1971].

Das Enzym ist aus etwa 300 Aminosäuren aufgebaut [Ozols et al., 1985]. Im

Gegensatz zu Cytochrom b5 ist die N-terminale Domäne (≈ 24 Aminosäuren) in die

Membran eingelagert, während die cytosolisch exponierte C-terminale Domäne

(≈ 275 Aminosäuren) katalytisch aktiv ist [Ozols et al., 1984; Borgese et al., 1993].

Das katalytisch aktive Fragment des Enzyms setzt sich aus dem N-terminalen

flavinadenindinukleotidbindenden und dem C-terminalen NADH-bindenden Teil

zusammen [Strittmatter, 1971; Kimura et al., 2003].

Eine Kristallisation der NADH Cytochrom b5 Reduktase gelang aus Schweineleber

[Miki et al., 1987], wobei eine Röntgenstrukturanalyse bis heute noch nicht existiert,

da die erhaltenen Kristalle für die Analyse zu klein sind.

Mittels Antikörperstudien konnte die Ähnlichkeit der mikrosomalen und

mitochondrialen NADH Cytochrom b5 Reduktase gezeigt werden [Takesue und

Omura, 1970]. Außerdem konnten die Autoren nachweisen, dass das mitochondriale

Enzym die Reduktion von mikrosomalem Cytochrom b5 katalysieren kann. Die

molekulare Identität des in der äußeren Mitochondrienmembran und des in

Mikrosomen vorkommenden Flavoproteins wurde durch enzymatische und

immunochemische Studien belegt [Kuwahara et al., 1978; Borgese und Piertrini,

1986].


232

6.1.3 Zusammenspiel zwischen Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5 Reduktase

Untersuchungen zum Verlauf der Elektronenübertragung, sowohl vom

Elektronendonator auf die Reduktase sowie von der Reduktase auf das

entsprechende Hämprotein Cytochrom b5, wurden schon in den Fünfziger Jahren

durchgeführt [Strittmatter, 1958 und 1959]. Auch wenn hierzu kürzlich Mechanismen

postuliert wurden, so unterscheiden sich diese kaum von denen, die sehr viel früher

publiziert wurden [Hara und Minakami, 1971; Kimura et al., 2003].

Im ersten Schritt der Elektronenübertragung von NADH auf Cytochrom b5 bindet das

Cosubstrat an der oxidierten Form der NADH Cytochrom b5 Reduktase. Das

Cosubstrat bindet dabei mit der Phosphatgruppe an einen Lysinrest (Lys110,

Ochsenleber) des Flavoproteins [Strittmatter 1958; Strittmatter et al., 1992a].

Über eine reaktive Zwischenstufe erfolgt die Reduktion des Enzyms bei gleichzeitiger

Oxidation des Nukleotids.

Entgegen älterer Annahmen, dass sich zu diesem Zeitpunkt das Nukleotid NAD+

abspaltet [Hara und Minakami, 1971], geht man heute davon aus, dass das Nukleotid

NAD+ bis zum Schluss der Elektronenübertragungen gebunden bleibt [Kimura et al., 2003]. Es findet somit zunächst die Übertragung eines Elektrons vom zweifach

elektronenreduzierten Enzymkomplex auf das Eisen-Zentralatom des Cytochrom b5

statt. Dieses wird dadurch von der dreiwertigen Form zur zweiwertigen Form

reduziert. Der Enzymkomplex aus NADH Cytochrom b5 Reduktase und NAD+ geht

dabei in eine neutrale Semichinonform über.

Diese neutrale Semichinonform wandelt sich unter Abgabe eines Protons relativ

schnell in das anionische Semichinon um.

Im nächsten Schritt wird das zweite Elektron transferiert und unter Bindung von

NADH entsteht ein oxidierter, ternärer Komplex aus NADH Cytochrom b5 Reduktase,

NAD+ und Cosubstrat.

Im letzten Schritt wird das NAD+ abgespalten und die NADH Cytochrom b5 Reduktase

steht einem neuen katalytischen Zyklus zur Verfügung.

Da Cytochrom b5 nur ein Elektron in einem Schritt empfangen kann, verläuft der

oben beschriebene Zyklus über zwei nacheinander ablaufende Einzelübertragungen

der Elektronen [Iyanagi et al., 1984].

Ein Elektronentransfer findet zwischen den beiden Enzymen über eine

komplementäre Ladungspaarung der Lysinreste (Lys41, Lys125, Lys163, Ochsenleber)

der NADH Cytochrom b5 Reduktase mit der Carboxylgruppe des katalytischen


233

Zentrums des Cytochrom b5 über stereospezifische Interaktion statt [Strittmatter et al., 1990; Strittmatter et al., 1992b]. Dabei sind beide Enzyme zufällig und

unabhängig voneinander in der Membran verteilt. Der schnelle Elektronentransfer auf

das Eisen des Hämproteins ist den hydrophoben Domänen beider Enzyme zu

verdanken. Sie sorgen für eine spezifische Orientierung [Enoch et al., 1977; Ozols et al., 1985]. Dennoch ist die Kollision der katalytisch aktiven Fragmente zufällig

[Rogers und Strittmatter, 1974; Tonegawa et al., 2005].

Die Bedeutung dieses Elektronenübertragungssystems ist in den Zellorganellen bisher

in unterschiedlichem Ausmaß untersucht worden. Die Arbeiten zum mikrosomalen

System sind unüberschaubar aufgrund einer Vielzahl von Publikationen. Lange

beschrieben ist die Übertragung der Elektronen von NADH auf die terminalen Enzyme

Steroloxidase der Cholesterolbiosynthese [Reddy et al., 1977; Fukushima et al., 1981] und der Stearyl-CoA-Desaturase beim Fettsäurestoffwechsel [Strittmatter et al., 1974; Keyes et al., 1979]. Neben physiologischen Funktionen ist die

Elektronenübertragung auf Cytochrom P450 Isoenzyme beschrieben [Hildebrandt

und Estabrook, 1971; Mokashi et al., 2003].

Das mitochondriale Cytochrom b5 ist dagegen bisher sehr wenig charakterisiert

worden. In Kombination mit Cytochrom c sorgen die beiden Enzyme für einen

Elektronentransport zwischen innerer und äußerer Membran [Bernardi und Azzone,

1981]. Zudem wird eine Beteiligung an der Stimulation der Androgensynthese in den

Leydig-Zellen [Ogishima et al., 2003] sowie der Reduktion von Ascorbatradikalen in

Nebennierenmark und Leber [Ito et al., 1981] vermutet.

Die Beteiligung der Elektronentransporter am N-reduktiven Enzymsystem wurde

bereits ausführlich in Kapitel 1.4 beschrieben. Die löslichen Enzyme sind offenbar

auch allein in der Lage, N-reduktive Prozesse im Fremdstoffmetabolismus durch-

zuführen [Kurian et al., 2004; Saulter et al., 2005]. Die membranständigen Enzyme

hingegen wurden bisher im Fremdstoffmetabolismus in Kombination mit einer dritten

Komponente beschrieben [Kadlubar und Ziegler, 1974; Andersson et al., 2005].

Dieses Verhalten entspricht den endogenen Abläufen wie Desaturaseaktivität und

Cholesterolbiosynthese. Im mikrosomalen Metabolismus des Benzamidoxims in der

Leber ist ein Cytochrom P450 Isoenzym postuliert worden [Clement et al., 1997]. Für

Cytochrom b5 sind Interaktionen mit Cytochrom P450 Isoenzymen beschrieben

worden, wobei Cytochrom b5 die Cytochrom P450-abhängigen Oxygenierungs-

reaktionen steigert [Baron et al., 1973; Aoyama et al., 1990]. Daneben kann das

mikrosomale Cytochrom b5 auch als Elektronenakzeptor mit der NADPH Cytochrom


234

P450 Reduktase agieren [Enoch und Strittmatter, 1979; Dailey und Strittmatter,

1980].

Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5 Reduktase sind jeweils als Fusionsproteine

beschrieben. NADH Cytochrom b5 Reduktase liegt als funktionelle Domäne in der

Nitratreduktase autotropher Organismen [Campbell, 1999] vor. In Kombination mit

Cytochrom b5 findet man sie in der humanen cytosolischen NAD(P)H Oxidoreduktase

[Zhu et al., 1999] sowie der in Säugetieren befindlichen mikrosomalen NAD(P)H

Reduktase [Xie et al., 2004]. Cytochrom b5 allein findet sich als Fusionsprotein in

Kombination mit der mitochondrialen Sulfitoxidase in Säugetieren [Rudolph et al., 2003] sowie mit der Nitratreduktase autotropher Organismen [Campbell, 1999]

wieder. Nitratreduktase und Sulfitoxidase enthalten eine weitere Domäne, welche

den Molybdäncofaktor binden kann (Kapitel 6.1.4).

6.1.4 Molybdänhaltige Enzyme

Molybdän ist das einzige Übergangsmetall der zweite Reihe im Periodensystem der

Elemente, welches von fast allen lebenden Organismen benötigt wird. Für wenige

Arten ist Molybdän nicht essentiell. Diese weichen auf Wolfram aus, welches im

Periodensystem direkt unter Molybdän angeordnet ist [Hille, 2002]. Molybdän kommt

mit den Oxidationszahlen +II bis +VI vor, wobei die Molybdän(VI)-Verbindungen am

beständigsten sind.

Molybdän ist nur im Komplex mit Molybdopterin, dem Molybdäncofaktor, biologisch

aktiv. Einzige Ausnahme hiervon bildet die bakterielle Nitrogenase, welche einen

Eisen-Molybdän-Schwefel-Cluster enthält. [Kisker et al., 1997; Hille, 2005].

Molybdopterin ist ein inaktiver Cofaktor (Abb. 6.1). Die typischen Oxidationszahlen

des im Molybdopterin gebundenen Molybdäns sind +IV bis +VI [Mendel und Bittner,

2006].

Molybdoenzyme hingegen sind bisher in allen untersuchten Organismen außer in

Saccharomyces cerevisiae gefunden worden. Sie sind am Stoffwechsel vieler

Kohlenstoff-, Stickstoff- und Schwefelverbindungen beteiligt [Hille, 2005; Kisker et al., 1997]. In Prokaryoten sind bisher mehr als 50 Molybdoenzyme beschrieben, in

Eukaryoten bisher nur sechs [Hille, 1996; Mendel und Bittner, 2006].

Die Bildung des Molybdäncofaktors verläuft in Eukaryoten ähnlich der Bildung in

Prokaryoten, da der Weg hochkonserviert ist [Mendel und Bittner, 2006]. Zunächst

wird aus Guanosintriphosphat das Pterinderivat PrecursorZ gebildet. Durch


235

Sauerstoff-Schwefel-Tausch entsteht dann das Molybdopterin (Abb. 6.1). Bevor

schließlich durch Einfügen des Molybdäns der Molybdäncofaktor entstehen kann,

muss das Molybdopterin zunächst adenyliert werden.

NH

N NH

NH

OO

PO

O

O

SRSR

NH2

O

NH

N NH

NH

OO

PO

O

ONH2

OS

MoSOX

O

N

N

O

NH

N NH

NH

OO

PO

NH2

OSR

SR

OP

O

O

OO

OHOH

N

N

NH2

Molybdopterin

Molybdopterin-AMP

Molybdän-Cofaktor

Abb. 6.1: Bildung des Molybdäncofaktors [nach Mendel und Bittner, 2006]. Für Molybdopterin und Molybdopterin-AMP sind die Liganden der Dithiolat-Schwefel mit „R“ gekennzeichnet, da nicht bekannt ist, wann Kupfer an das Dithiol gebunden vorliegt. Der Molybän-Cofaktor-Ligand „X“ kennzeichnet einen zusätzlichen Liganden, wobei nicht bekannt ist, wie viele Liganden das Molybdän tatsächlich besitzt [Mendel und Bittner, 2006].


236

Nach Einfügen des Molybdäns wird Adenosinmonophosphat wieder abgespalten.

Zwischenzeitlich wird an die Thiolgruppen Kupfer angelagert, wie neueste

Kristallstrukturen zeigen. Funktion und Bedeutung hiervon sind noch nicht bekannt.

Der Molybdäncofaktor wird möglicherweise mittels Molybdäncofaktor-Carrier-Proteine

in die entsprechenden Targetenzyme eingebaut [Mendel und Bittner, 2006].

Neben dem Molybdäncofaktor besitzen eukaryotische Molybdoenzyme mindestens

ein weiteres Redoxzentrum. Einzige Ausnahme hiervon bildet die pflanzliche

Sulfitoxidase [Mendel und Bittner, 2006]. Sulfitoxidase bildet zusammen mit

Xanthindehydrogenase, Aldehydoxidase und Nitratreduktase die wichtigsten

Molybdoenzyme.

Die Nitratreduktase ist nur in autotrophen Organismen zu finden [Campbell, 1999].

Dort verkörpert es das Schlüsselenzym der anorganischen Nitrat-Anpassung. Es sind

mehrere Formen der Nitratreduktase entdeckt worden. So existieren NADH-, NADPH-

und bispezifische Formen [Campbell, 1999].

Die Nitratreduktase ist ein homodimeres Enzym, was bedeutet, dass die beiden

Monomere identisch sind. Ein Monomer besteht dabei aus einer N-terminalen

Molydäncofaktor-, einer Cytochrom b5- und einer C-terminalen NADH Cytochrom b5

Reduktase-Domäne [Campbell, 1999].

Die Aldehydoxidase katalysiert die Bildung von Carbonsäuren aus Aldehyden

[Rajagopalan et al., 1962]. Die hohe Sequenzhomologie zur Xanthindehydrogenase

lässt vermuten, dass sie wahrscheinlich aus dieser entstanden ist [Rodriguez-Trelles

et al., 2003].

Die Xanthindehydrogenase ist ebenfalls ein Homodimer. Ein Monomer besteht dabei

aus zwei [2Fe-2S]-Cluster-Domänen, sowie einer flavinbindenden und einer

molybdäncofaktor-Domäne [Kisker et al., 1997]. In Säugetieren existieren zwei

Formen des Enzyms. Die normalerweise vorkommende Dehydrogenasevariante kann

Elektronen sowohl auf NAD+ als auch auf molekularen Sauerstoff übertragen. Mittels

Oxidation oder proteolytischer Spaltung kann das Enzym auch in der Oxidasevariante

auftreten. In dieser Form ist die Übertragung der Elektronen nur auf molekularen

Sauerstoff möglich [Stirpe und Della Corte, 1969; Hille und Nishino, 1995].

Die Sulfitoxidase katalysiert den Abbau schwefelhaltiger Aminosäuren [Kisker et al., 1997]. Das tierische Enzym ist im Intermembranraum der Mitochondrien lokalisiert

[Cohen et al., 1972] und ist ebenfalls ein Homodimer. Der N-Terminus trägt das

Hämprotein Cytochrom b5 während der C-Terminus den Molybdäncofaktor beinhaltet

[Kisker et al., 1997; Rudolph et al., 2003].


237

Der gebildete Molybdäncofaktor wird in Tieren, den Menschen eingeschlossen, in

zwei Subtypen unterteilt. Diese lassen sich nach den Bindungspartnern am Molybdän

unterscheiden (s. Abb. 6.2).

NH

N NH

NH

OO

PO

O

ONH2

OS

MoSOS

OMo

NH

N NH

NH

OO

PO

O

ONH2

OS

SOS

Cys

O

Sulfitoxidase-Familie Xanthinoxidase-Familie

Abb. 6.2: Eukaryotische Molybdäncofaktor-Familien [nach Mendel und Bittner, 2006]

Wie der Abbildung 6.2 zu entnehmen ist, gibt es zwei eukaryotische

Molybdäncofaktorfamilien. Zur Sulfitoxidasefamilie zählen die Sulfitoxidase und die

Nitratreduktase. Durch Bindung an das Apoenzym werden die beiden Enzyme

aktiviert [Mendel und Bittner, 2006].

Zur Xanthinoxidasefamilie gehören die Xanthindehydrogenase und die

Aldehydoxidase. Schon die hohe Sequenzhomologie lässt auf die

Familienzugehörigkeit schließen. Beide Enzyme benötigen zur katalytischen Aktivität

nach Einbau des Molybdäncofaktors einen terminalen Schwefel. Die Mocosulfurase ist

das für diese Übertragung verantwortliche Enzym [Mendel und Bittner, 2006]. Aus

A. thaliana konnte das hierfür verantwortliche Protein ABA3 identifiziert werden

[Bittner et al., 2001]. Wahrscheinlich verhilft die C-terminale Domäne des

homodimeren Enzyms, welches zwei Domänen pro Untereinheit besitzt, zur

Interaktion mit den Zielproteinen Aldehydoxidase und Xanthindehydrogenase [Bittner

et al., 2001]. Bis heute ist der genaue Aktivierungsmechanismus der Zielproteine

mittels ABA3 noch nicht geklärt [Mendel und Bittner, 2006].

6.1.5 Reduktion N-hydroxylierter Verbindungen mit molybdänhaltigen Enzymen

Die cytosolischen, molybdänhaltigen Enzyme Xanthindehydrogenase und

Aldehydoxidase spielen eine relevante Rolle im oxidativen Fremdstoffmetabolismus

[Beedham, 1997]. Aber auch die Reduktion funktioneller Gruppen am Stickstoff ist


238

oft beschrieben. Im Falle der Oxime und Amidoxime konnte die Beteiligung der

Aldehydoxidase am anaeroben, cytosolischen, reduktiven Prozess von Benzamidoxim,

Salicylaldoxim und Acetophenonoxim gezeigt werden [Tatsumi und Ishigai, 1987].

Das Amidinohydrazonderivat Guanoxabenz wird durch die Xanthinoxidase reduziert

[Dambrova et al., 1998]. Ebenfalls ist die Xanthinoxidase an der Reduktion von

Hydroxylaminen [Stöhrer, 1968; Clement und Kunze, 1992] beteiligt. Zur Reduktion

von Hydroxamsäuren sowie N-hydroxyliertem Urethan hingegen wird die

Aldehydoxidase benötigt [Sugihara et al., 1983a; Sugihara et al., 1983b; Sugihara

und Tatsumi, 1986; Kitamura et al., 1994].

Alle beschriebenen Reduktionen benötigen einen Elektronendonator.

Aldehydoxidasen können dabei auf die Elektronen von Aldehyden sowie

N-Methylnicotinamid und 2-Hydroxypyrimidin zurückgreifen [Sugihara et al., 1983a;

Sugihara und Tatsumi, 1986; Kitamura et al., 1994]. Xanthindehydrogenasen nutzen

in der Regel Xanthin und NADH [Dambrova et al., 1998; Clement und Kunze, 1992].

Eine Sauerstoffabhängigkeit dieser Reaktionen ist nicht klar erkennbar. Manche

Reduktionen finden aerob statt [Dambrova et al., 1998; Clement und Kunze, 1992;

Dick et al., 2005, 2006]. Die meisten Reaktionen hingegen sind als anaerob

beschrieben [Stöhrer 1968; Sugihara et al., 1983a; Sugihara und Tatsumi, 1986;

Kitamura et al., 1994].


Die löslichen Enzyme Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5 Reduktase sind offenbar

auch allein in der Lage N-reduktive Prozesse im Rahmen des Fremdstoff-

metabolismus durchzuführen [Kurian et al., 2004; Saulter et al., 2005]. Die

membranständigen Enzyme hingegen sind bisher im Fremdstoffmetabolismus in

Kombination mit einer dritten Komponente beschrieben [Kadlubar und Ziegler, 1974;

Clement et al. 1997; Andersson et al., 2005]. Die Historie der Untersuchungen

N-hydroxylierter Verbindungen ist in Kapitel 1.4 dargestellt.

Während einzelne Daten zur Untersuchung des Zweikomponentensystems für die

Reduktion von N-Hydroxy-Melagatran vorliegen [bisher nicht veröffentlicht], sind die

Daten für die in dieser Arbeit genutzten Modellsubstanz Benzamidoxim nur in einem

sehr geringen Umfang vorhanden.


239

6.1.7 Zielsetzung

Ausgehend von Schweinenierenmitochondrien wurde in dieser Arbeit eine

Komponente zur Reduktion N-hydroxylierter Verbindungen isoliert. Das isolierte

Protein Moco Sulfurase C-terminal domain containing 2 ist nicht allein dazu in der

Lage, die Reduktion durchzuführen. Vielmehr scheint es als Art enzymatischer

Aktivator auf die an der Reduktion beteiligten Enzyme Cytochrom b5 und NADH

Cytochrom b5 Reduktase zu wirken. Die beiden membranständigen Enzyme sind auch

allein in geringem Maße zur Reduktion befähigt.

Es sollten im Rahmen dieser Arbeit die N-reduktive Aktivität des Zwei- und des

Dreikomponentensystems untersucht und verglichen werden. Im

Zweikomponentensystem war die Abhängigkeit der beiden membranständigen

Enzyme zu untersuchen, um ein optimales Verhältnis der Enzyme für diese Reaktion

zu bestimmen.

Gleiche Untersuchungen sollten im Dreikomponentensystem stattfinden, um

Übereinstimmungen oder Unterschiede in der Reduktion festzustellen. Dazu mussten

Abhängigkeiten der einzelnen Enzyme untereinander erstellt werden.


240

6.2 Methoden

6.2.1 Gewinnung der Enzympräparationen




6.2.1.2 Gewinnung von Schweinelebermikrosomen

Die Schweinelebern zur Gewinnung der Mikrosomen stammten von einem ortsnahen

Schlachter aus Einzelschlachtungen. Die Tiere wurden per Elektroschock getötet,

durch Öffnen der Halsschlagader ausbluten lassen und anschließend einem Brühbad

unterworfen. Danach wurden den Schweinen die Lebern entnommen und in einem

4 °C kaltem Transportpuffer (20 mM Kaliumphosphat, 250 mM Saccharose, 1 mM

EDTA, pH 7,4) zum Labor transportiert. Pro Aufarbeitung wurden 1-2 Lebern sowohl

weiblicher Tiere als auch männlicher Kastrate verwendet.

Die folgenden Reinigungsschritte fanden bei 4 °C oder unter Eiskühlung statt. Eine

ausreichende Perfusion der Lebern wurde mit 50 mM Phosphatpuffer (250 mM

Saccharose, 1 mM EDTA, pH 7,4) durchgeführt. Durch Entfärben der dunkelroten

Lebern war eine gute Perfusion zu erkennen. Die klein geschnittenen Leberstücke

wurden so lange mit 50 mM Phosphatpuffer gespült, bis das Waschwasser nahezu

farblos blieb. Die gut gespülten Leberstücke wurden durch einen handelsüblichen

Fleischwolf gegeben. Die so erhaltene Masse wurde mit gleichem Volumen an 20 mM

Phosphatpuffer (250 mM Saccharose, pH 7,4) gemischt und zweimal durch einen

Durchflusshomogenisator gegeben [Ziegler und Pettit, 1966]. In den folgenden

Schritten wurde nur noch der letztgenannte EDTA-freie Puffer verwendet, da das zu

verarbeitende Material zu diesem Zeitpunkt blutfrei war. Der Verlust an Volumen

durch das Homogenisieren wurde durch Auffüllen mit Puffer wieder hergestellt.

Anschließend wurde das entstandene Leberhomogenat mit Kaliumhydroxid-Lösung

auf pH 7,4 eingestellt.

Das Homogenat wurde 30 Minuten bei 9.000 g (Rotor JA 10) zentrifugiert. Der

erhaltene Überstand wurde zur Abtrennung von Fettsäuren durch Verbandmull

koliert. Die vereinigten Überstände wurden für 60 Minuten bei 100.000 g (Rotor

45 Ti) der Ultrazentrifugation unterzogen. Der cytosolische Überstand konnte

aliquotiert und bei -80°C eingefroren werden. Das erhaltene Pellet wurde mit Puffer


241

in einem Teflon-Glas-Homogenisator resuspendiert und zur weiteren Aufreinigung

erneut 60 Minuten bei 100.000 g ultrazentrifugiert. Das entstandene mikrosomale

Pellet wurde wieder in Puffer resuspendiert , mit Kaliumhydroxid-Lösung auf pH 7,4

eingestellt, aliquotiert und bei -80 °C eingefroren.

6.2.1.3 Isolierung von Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5 Reduktase


Die Solubilisation wurde mit dem nichtionischen Detergenz Thesit® durchgeführt. Es

ergab sich folgende Zusammensetzung des Solubilisationsansatzes: Schweineleber-

mikrosomen wurden mit Solubilisationspuffer (10 mM Kaliumphosphat, 2 mM EDTA,

2 mM Dithiothreitol, 1 M Natriumchlorid, 40 % (w/v) Glycerol, 0,4 % (w/v) Thesit®,

pH 7,4) in gleichen Teilen miteinander verdünnt. Der Ansatz wurde eine Stunde im

Eisbad mit einem Flügelrührer gerührt und anschließend eine Stunde bei 100.000 g

(Rotor 45 Ti) zentrifugiert, um die solubilisierten Proteine abzutrennen. Der erhaltene

Überstand wurde durch Verbandmull koliert und mit 10 %iger Natriumcholatlösung

auf einen Gehalt von 0,5 % (w/v) Natriumcholat eingestellt.

6.2.1.3.2 Hydrophobe Interaktionschromatographie

Die Hydrophobe Interaktionschromatographie erfolgte an Octyl-Sepharose CL-4B®

(Fa. Pharmacia, 3,5 x 29 cm, Gelvolumen 270 ml) in Anlehnung an die Methode von

Kling et al. [1985]. Nach Auftragen des Solubilisats erfolgte die Elution durch einen

positiven Stufengradienten der Detergenzkonzentration sowie einen negativen

Stufengradienten der Ionenstärke. Die Flussrate betrug 0,83 ml*min-1 und das

Volumen der aufgefangenen Fraktionen jeweils 15 ml.


b5 Reduktase) verfolgt. Ein zusätzliches Elutionsprofil wurde durch Vermessen der

einzelnen Fraktionen bei 417 nm (Cytochrom b5) erstellt. Außerdem wurden spezielle

Aktivitätstests auf Cytochrom b5, Cytochrom b5 Reduktase, Cytochrom P450 Enzyme,

NADPH Cytochrom P450 Reduktase durchgeführt (Kapitel 2.2.2.2-5). Alle aktiven

Fraktionen wurden in Pools vereinigt und mittels Amicon-Zellen eingeengt,

umgepuffert und bei -80°C eingefroren.


242

6.2.1.3.3 Gewinnung von Cytochrom b5

Cytochrom b5 wurde nach der Methode von Lomb [1995], der weiterentwickelten

Vorschrift von Taniguchi et al. [1984], isoliert. Das im Rahmen dieser Arbeit

verwendete Cytochrom b5 war im Arbeitskreis vorhanden und wurde mir

freundlicherweise zur Verfügung gestellt.

Humanes rekombinantes Cytochrom b5 [Holmans et al., 1994] wurde von der Firma

MoBiTec (Göttingen) bezogen.

6.2.1.3.4 Gewinnung von NADH Cytochrom b5 Reduktase

6.2.1.3.4.1 Präparative HPLC an Fractogel® EMD TMAE 650 (S)

NADH Cytochrom b5 Reduktase wurde modifiziert nach Clement et al. [1997] aus

Schweinelebermikrosomen gereinigt.

Die aus Kapitel 6.2.1.3.2. erhaltene NADH Cytochrom b5 Reduktase Fraktion, in der

sich auch die dritte Komponente befand, wurde mit Hilfe präparativer HPLC durch

Anionenaustausch an Fractogel® EMD TMAE 650 (S) weiter aufgereinigt. Hieraus

ergaben sich zwei Proteinfraktionen. In einer Fraktion war die dritte Komponente

enthalten, die andere Fraktion enthielt NADH Cytochrom b5 Reduktase. Beide

Fraktionen wurden mittels Amicon-Zellen eingeengt, umgepuffert und bei -80°C

eingefroren.

6.2.1.3.4.2 Bioaffinitätschromatographie an 5’-AMP-Sepharose®

Die unter Kapitel 6.2.1.3.4.1 aufgearbeitete NADH Cytochrom b5 Reduktase Fraktion

wurde auf eine 5’-AMP-Sepharose®-Säule (Fa. Pharmacia, 2,5 x 8 cm, Gelvolumen

40 ml) gegeben. Die Säule wurde zuvor ausreichend mit Äquilibrierpuffer (10 mM

Kaliumphosphat, 0,1 mM EDTA, 0,1 mM DTT, 20 % (w/v) Glycerol, 0,02 % (w/v)

Triton X-100, pH 7,4) konditioniert. Alle Arbeiten fanden mit einem Fluss von

0,167 ml*min-1 statt. Nach Auftrag der Proteinlösung wurde etwa ein Säulenvolumen

mit Äquilibrierpuffer gespült. Alle Verunreinigungen und unspezifisch gebundenen

Proteine wurden damit von der Säule gespült.

Anschließend erfolgte die Elution der NADH Cytochrom b5 Reduktase mit dem

Elutionspuffer (100 mM Kaliumphosphat, 0,1 mM EDTA, 0,1 mM DTT, 20 % (w/v)

Glycerol, 0,02 % (w/v) Triton X-100, 0,5 mM NADH, pH 7,4). Dieser Schritt erfolgte

bei einem Fluss von 0,25 ml*min-1 über 2 Stunden.


243

Das Eluat wurde in Fraktionen von 4 ml Größe aufgefangen und auf seine Reduktase-

Aktivität untersucht. Alle aktiven Fraktionen wurden gepoolt und mittels Amicon-

Zellen eingeengt, umgepuffert und bei -80°C eingefroren.

6.2.1.4 Umpufferung und Detergenzentfernung

Um in den Puffern enthaltene niedermolekulare Bestandteile aus den

Enzympräparationen zu entfernen, wurden diese über eine Sephadex® G-25

(NAPTM25) gegeben und mit einem Neutralpuffer (10 mM Kaliumphosphat, 20 %

Glycerol (w/v), pH 7,4) wieder eluiert.

Das Eluat wurde mit ca. 1,0 ml Calbiosorb®-Adsorber (EMD Biosciences, San Diego,

CA, USA) versetzt und mit Hilfe eines Überkopfschüttlers vorsichtig geschüttelt. Nach

Sedimentation des Adsorptionsmaterials wurde die Enzympräparation wieder

abpipettiert. Zur vollständigen Entfernung der Detergentien musste dieser Vorgang

mehrfach wiederholt werden.

6.2.2 Analytische Methoden zur Charakterisierung der Enzympräparationen



6.2.2.2 NADH Cytochrom b5-Aktivitätsbestimmung

Die Methode der NADH Cytochrom b5 Reduktase-Aktivitätsbestimmung ist in Kapitel



Die Methode zur Herstellung und Durchführung der SDS-Polyacrylamid-

gelelektrophorese ist in Kapitel 2.2.2.7 beschrieben.

Silberfärbung :




244

6.2.3 Analytische Methoden zur Charakterisierung der Benzamidoxim-Reduktion durch Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5 Reduktase








Reinheit geprüft.




mikrosomalen Biotransformationsstudien setzte sich aus unterschiedlichen Mengen

Cytochrom b5 sowie Cytochrom b5 Reduktase, 1000 µM NADH, 500 µM

Benzamidoxim, 40 µM DLPC in 150 µl eines 100 mM Kaliumphosphatpuffers pH 6,3

zusammen.

Zunächst wurden die Enzyme bei 37 °C zwei Minuten vorinkubiert, dann das








Ansätze mit dem gereinigten C-Terminus der Mocosulfurase wurden zur

Vergleichbarkeit unter den gleichen Bedingungen inkubiert. Es wurden im

Dreikomponentensystem unterschiedliche Mengen des C-Terminus der Mocosulfurase

eingesetzt.


245


In Anlehnung an die von Wolf [noch nicht veröffentlicht] entwickelte Methode wurde

gebildetes Benzamidin im Zweikomponentensystem mittels HPLC-Analytik bestimmt.




HPLC-Pumpe und Controller: Waters 600

Detektor: Waters 2487 UV

Autosampler: Waters 717 plus








Laufzeit: 28 min







Benzamidin erfolgte mit vier verschiedenen Konzentrationen im Bereich 0-500 nM in

Fließmittel gelöst und wurde mittels der beschriebenen HPLC-Analytik vermessen. Für

jede Konzentration wurden 2 Ansätze parallel pipettiert, die jeweils doppelt


246





Denaturierung der Proteinpräparation wurden die Zusammensetzung,

Inkubationsbedingung und Aufarbeitung entsprechend der unter 6.2.3.1.2

beschriebenen Methode durchgeführt. Für jede Konzentrationsstufe wurden 2

Ansätze parallel pipettiert, die jeweils doppelt vermessen wurden. Benzamidin konnte

im angegebenen Konzentrationsbereich (bis 500 nM) quantifiziert werden. Die

Wiederfindungsrate betrug 97±9 %.


Benzamidin im Dreikomponentensystem mittels HPLC-Analytik bestimmt.














Laufzeit: 28 min



247







in Fließmittel gelöst und wurde mittels der beschriebenen HPLC-Analytik vermessen.







6.2.3.1.2 vermessen. Für jede Konzentrationsstufe wurden 2 Ansätze parallel

pipettiert, die jeweils doppelt vermessen wurden. Benzamidin konnte im

angegebenen Konzentrationsbereich (bis 250 µM) quantifiziert werden. Die

Wiederfindungsrate betrug 95±5 %.


248

6.3 Ergebnisse

6.3.1 Charakterisierung und Inkubationsoptimierung des Zweikomponentensystems

6.3.1.1 Inkubationszeit

Es wurde eine Abhängigkeit der Inkubationszeit mit zwei unterschiedlichen

Verhältnissen der Enzyme Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5 Reduktase

zueinander durchgeführt. Hiermit konnte festgestellt werden, ob die Inkubationszeit

abhängig von dem Enzymverhältnis war. Gleichzeitig konnte eine optimale,

enzymverhältnisunabhängige Inkubationszeit für die folgenden Studien bestimmt

werden. Die Inkubationszeit für die Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin

verlief über einen Zeitraum bis 30 Minuten linear. Wurde noch länger inkubiert, so

nahm die Reaktionsgeschwindigkeit ab (Abb. 6.1). Gebildetes Benzamidin war mit

der empfindlicheren HPLC-Methode (Kap. 6.2.3.1.3) bei 201 nm quantifizierbar.

020406080

100120

0 20 40 60

Zeit [min]

Benz

amid

in[n

mol

*mg-1

]

Cytochrom b5:NADH Cytochrom b5

Reduktase (10:1)

Cytochrom b5:NADH Cytochrom b5

Reduktase (5:1)

Abb. 6.1: Zeitabhängigkeit der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch das Zweikomponentensystem. Die Inkubationsansätze setzten sich wie folgt zusammen: 85 bzw. 170 pmol Cytochrom b5, 0,05 U NADH Cytochrom b5 Reduktase, 1 mM NADH und 0,5 mM Benzamidoxim, 40 µM DLPC in 150 µl eines 100 mM Kaliumphosphatpuffers pH 6,3. Die Inkubationszeit betrug 0-65 Minuten. Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 6.2.3.1.2 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand mit der in Kapitel 6.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden. Die Daten beziehen sich auf die insgesamt eingesetzte Proteinmenge.


249

6.3.1.2 Verhältnisabhängigkeit der zwei Proteine bei konstantem Proteingehalt

Es wurde eine Abhängigkeit der Proteine zueinander mit unterschiedlichen

Verhältnissen durchgeführt. Hierbei wurde der Gehalt an NADH Cytochrom b5

Reduktase in dem gleichen Maße erniedrigt, in welchem Cytochrom b5 erhöht wurde.

Dieses bedeutete einen konstanten Proteingehalt. Es konnte bis zu einem Verhältnis

der eingesetzten Enzyme von 10:1 zu Gunsten des Cytochrom b5 eine Steigerung der

Umsetzungsrate festgestellt werden, danach fiel sie wieder langsam ab (Abb. 6.2).

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

0:1 1:1 5:1 10:1 25:1 50:1 75:1 100:1 150:1

VerhältnisCytochrom b5/NADH Cytochrom b5 Reduktase

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

Abb. 6.2: Verhältnisabhängigkeit der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch das Zweikomponentensystem. Die Inkubationsansätze setzten sich wie folgt zusammen: 0-200 pmol Cytochrom b5, 0,3-0,004 U NADH Cytochrom b5 Reduktase, 1 mM NADH und 500 µM Benzamidoxim, 40 µM DLPC in 150 µl eines 100 mM Kaliumphosphatpuffers pH 6,3. Die Inkubationszeit betrug 30 Minuten. Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 6.2.3.1.2 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand mit der in Kapitel 6.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden. Die Daten beziehen sich auf die insgesamt eingesetzte Proteinmenge.


250

6.3.1.3 Substratabhängigkeit

Die Substratabhängigkeit des Benzamidoxims war nahezu linear (Abb. 6.3). Die

gebildete Benzamidinmenge konnte bei erhöhter Zugabe von Benzamidoxim immer

weiter gesteigert werden.

0

10

20

30

40

50

60

0 50 100

Benzamidoxim [mM]

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

Abb. 6.3: Substratabhängigkeit der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch das Zweikomponentensystem. Die Inkubationsansätze setzten sich wie folgt zusammen: 170 pmol Cytochrom b5, 0,05 U NADH Cytochrom b5 Reduktase, 1 mM NADH und 0-150 mM Benzamidoxim, 40 µM DLPC in 150 µl eines 100 mM Kaliumphosphatpuffers pH 6,3. Die Inkubationszeit betrug 30 Minuten. Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 6.2.3.1.2 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand mit der in Kapitel 6.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus zwei parallel inkubierten Reaktionsansätzen, welche jeweils doppelt vermessen wurden. Die Daten beziehen sich auf die insgesamt eingesetzte Proteinmenge.


251

6.3.2 Charakterisierung und Inkubationsoptimierung des Dreikomponentensystems

6.3.2.1 Inkubationszeit

Es wurde eine Abhängigkeit der Inkubationszeit mit den zwei

Elektronentransportproteinen Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5 Reduktase

sowie dem gereinigten Moco-bindenden Enzym durchgeführt. Die Inkubationszeit für

die Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin verlief über einen Zeitraum bis

30 Minuten linear. Wurde noch länger inkubiert, so nahm die


wenigen Minuten mit der weniger empfindlicheren HPLC-Methode (Kap. 6.2.3.1.3)

bei 229 nm quantifizierbar.

02000400060008000

10000120001400016000

0 20 40 60 80 100 120

Zeit [min]

Benz

amid

in[n

mol

*mg-1

]

Abb. 6.4: Zeitabhängigkeit der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch das Dreikomponentensystem. Die Inkubationsansätze setzten sich wie folgt zusammen: 34 pmol Cytochrom b5, 0,05 U NADH Cytochrom b5 Reduktase, 10 µl DEAE-Fraktion, 1 mM NADH und 0,5 mM Benzamidoxim, 40 µM DLPC in 150 µl eines 100 mM Kaliumphosphatpuffers pH 6,3. Die Inkubationszeit betrug 0-120 Minuten. Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 6.2.3.1.2 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand mit der in Kapitel 6.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus einem Reaktionsansatz, welcher doppelt vermessen wurde. Die Daten beziehen sich auf die insgesamt eingesetzte Proteinmenge.


252

6.3.2.2 Verhältnisabhängigkeit der zwei Elektronentransportproteine bei konstantem Proteingehalt sowie konstanter Zugabe des gereinigten Moco-bindenden Enzyms

Es wurde eine Abhängigkeit der zwei Elektronentransportproteine zueinander mit

unterschiedlichen Verhältnissen durchgeführt. Hierbei wurde der Gehalt an NADH

Cytochrom b5 Reduktase in dem gleichen Maße erniedrigt, in welchem Cytochrom b5

erhöht wurde, so dass ein konstanten Proteingehalt erhalten wurde. Zusätzlich ist

das gereinigte Moco-bindende Enzym in konstanter Menge zugesetzt worden. Es

konnte ein 1:1 Verhältnis der eingesetzten Elektronentransportproteine als das

optimale Verhältnis festgestellt werden, danach fiel die Umsetzungsrate wieder ab

(Abb. 6.5).

0,00

500,00

1000,00

1500,00

0:1 0,5:1 1:1 2:1 5:1 10:1 20:1 50:1 100:1

VerhältnisCytochrom b5:NADH Cytochrom b5 Reduktase

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

Abb. 6.5: Verhältnisabhängigkeit der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch das Dreikomponentensystem. Die Inkubationsansätze setzten sich wie folgt zusammen: 0-200 pmol Cytochrom b5, 0,3-0,004 U NADH Cytochrom b5 Reduktase, 10 µl DEAE-Fraktion, 1 mM NADH und 0,5 mM Benzamidoxim, 40 µM DLPC in 150 µl eines 100 mM Kaliumphosphatpuffers pH 6,3. Die Inkubationszeit betrug 30 Minuten. Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 6.2.3.1.2 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand mit der in Kapitel 6.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus einem Reaktionsansatz, welcher doppelt vermessen wurde. Die Daten beziehen sich auf die insgesamt eingesetzte Proteinmenge.


253

6.3.2.3 pH-Wert


bei pH 5,7, wobei sich der Bereich zwischen pH 5,5 und pH 6,0 nicht signifikant

unterschied (Abb. 6.6).

0200400600800

10001200140016001800

4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8

pH-Wert

Benz

amid

in[n

mol

*min

-1*m

g-1]

Abb. 6.6: pH-Wertabhängigkeit der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch das Dreikomponentensystem. Die Inkubationsansätze setzten sich wie folgt zusammen: 50 pmol Cytochrom b5, 0,15 U NADH Cytochrom b5 Reduktase, 10 µl DEAE-Fraktion, 1 mM NADH und 0,5 mM Benzamidoxim, 40 µM DLPC in 150 µl eines 100 mM Kaliumphosphatpuffers pH 4,0-8,0. Die Inkubationszeit betrug 15 Minuten. Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 6.2.3.1.2 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand mit der in Kapitel 6.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus einem Reaktionsansatz, welcher doppelt vermessen wurde. Die Daten beziehen sich auf die insgesamt eingesetzte Proteinmenge.


254

6.3.2.4 Substratabhängigkeit



halbmaximaler Sättigung (Km) 0,5 mM und die maximale Reaktionsgeschwindigkeit

(Vmax) 3,1 µmol*min-1*mg-1. Die sich daraus ergebende katalytische Effizienz lag bei

5,9*10-3 min-1*mg-1.

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

0 2 4 6 8 10

Benzamidoxim [mM]

Benz

amid

in[µ

mol

*min

-1*m

g-1]

Abb. 6.7: Substratabhängigkeit der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch das Dreikomponentensystem. Die Inkubationsansätze setzten sich wie folgt zusammen: 50 pmol Cytochrom b5, 0,15 U NADH Cytochrom b5 Reduktase, 10 µl DEAE-Fraktion, 1 mM NADH und 0-10 mM Benzamidoxim, 40 µM DLPC in 150 µl eines 100 mM Kaliumphosphatpuffers pH 5,7. Die Inkubationszeit betrug 15 Minuten. Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 6.2.3.1.2 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand mit der in Kapitel 6.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus einem Reaktionsansatz, welcher doppelt vermessen wurde. Die Daten beziehen sich auf die insgesamt eingesetzte Proteinmenge.


255

6.3.2.5 Cosubstratabhängigkeit


Cosubstrates. NADH wurde hierbei gegenüber NADPH bevorzugt (Abb. 6.8). Ab einer

NADH-Konzentration von 1,5 mM sowie 5,0 mM im Fall des NADPH kam es zu keiner

nennenswerten Steigerung der Umsetzungsrate. Im Lineweaver-Burk-Plot betrug die

Cosubstratkonzentration bei halbmaximaler Sättigung (Km) 1,5 mM und die maximale

Reaktionsgeschwindigkeit (Vmax) 6,3 µmol*min-1*mg-1 für NADH. Die sich daraus

ergebende katalytische Effizienz lag bei 4,4*10-3 min-1*mg-1. Die Cosubstrat-

konzentration betrug für NADPH bei halbmaximaler Sättigung (Km) 1,4 mM und die

maximale Reaktionsgeschwindigkeit (Vmax) 2,0 µmol*min-1*mg-1. Die sich daraus

ergebende katalytische Effizienz lag bei 1,4*10-3 min-1*mg-1.



0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

0 2 4 6 8 10

Cosubstrat [mM]

Benz

amid

in[µ

mol

*min

-1*m

g-1]

NADH

NADPH

Abb. 6.8: Cosubstratabhängigkeit der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch das Dreikomponentensystem. Die Inkubationsansätze setzten sich wie folgt zusammen: 50 pmol Cytochrom b5, 0,15 U NADH Cytochrom b5 Reduktase, 10 µl DEAE-Fraktion, 0-10 mM NADH bzw. 0-10 mM NADPH, 5 mM Benzamidoxim und 40 µM DLPC in 150 µl eines 100 mM Kaliumphosphatpuffers pH 5,7. Die Inkubationszeit betrug 15 Minuten. Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 6.2.3.1.2 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand mit der in Kapitel 6.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus einem Reaktionsansatz, welcher doppelt vermessen wurde. Die Daten beziehen sich auf die insgesamt eingesetzte Proteinmenge.


256

6.3.2.6 Verhältnisabhängigkeit des gereinigten Moco-bindenden Enzyms zum konstanten 1:1 Verhältnis der zwei Elektronentransportproteine

Für die Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin wurde das gereinigte Moco-

bindende Enzym in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt. Die Reaktion ist

steigerbar durch Zugabe des Moco-bindenden Enzyms, jedoch nähert sich die

Aktivität einem Grenzwert an (Abb. 6.9).

01234567

0 5 10 15 20

Moco-Fraktion [µl]

Benz

amid

in[µ

mol

*min

-1*m

g-1]

Abb. 6.9 Verhältnisabhängigkeit der Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin durch das Dreikomponentensystem. Die Inkubationsansätze setzten sich wie folgt zusammen: 50 pmol Cytochrom b5, 0,15 U NADH Cytochrom b5 Reduktase, 0-20 µl DEAE-Fraktion, 2 mM NADH, 5 mM Benzamidoxim und 40 µM DLPC in 150 µl eines 100 mM Kaliumphosphatpuffers pH 5,7. Die Inkubationszeit betrug 15 Minuten. Durchführung und Aufarbeitung der Reaktionsansätze sind in Kapitel 6.2.3.1.2 beschrieben. Die Quantifizierung des gebildeten Benzamidins fand mit der in Kapitel 6.2.3.1.3 beschriebenen HPLC-Analytik statt. Die ermittelten Umsetzungsraten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus einem Reaktionsansatz, welcher doppelt vermessen wurde. Die Daten beziehen sich auf die insgesamt eingesetzte Proteinmenge.


257

6.4 Diskussion

In den Lebermikrosomen diverser Spezies ist die Beteiligung der beiden

Elektronentransportproteine Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5 Reduktase

beschrieben und gilt als gesichert [Kadlubar und Ziegler, 1974; Clement et al., 1997;

Andersson et al., 2005]. Gleiches konnte ebenfalls für die Lebermitochondrien des

Schweins gezeigt werden [Havemeyer et al., 2006]. In dieser Arbeit wurde die

Beteiligung der beiden Enzyme Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5 Reduktase

mittels der Inhibitoren Cytochrom c und p-Hydroxymercuribenzoat für die Nieren-

mikrosomen und -mitochondrien aus dem Schwein bestätigt (Kapitel 2.3.7.4.3-4 und

3.3.1.6.3-4).

Es sollte der Einfluss des Häm/Flavin-Verhältnisses im Zwei- und

Dreikomponentensystem für die Benzamidoxim-Reduktase untersucht werden.

Beschrieben ist ein physiologisches Verhältnis der beiden membranständigen Enzyme

zueinander mit einem etwa zehnfachen Überschuss des Hämproteins im Vergleich

zum Flavoprotein im Endoplasmatischen Retikulum [Rogers und Strittmatter, 1974;

Kadlubar und Ziegler, 1974; Yang und Ceederbaum, 1996]. Für die beiden löslichen

Enzyme wurde ein ähnliches Verhältnis bei der Reduktion von Hydroxylaminen und

Amidoximen gefunden, welches zwischen acht- und zehnfachem Überschuss des

Hämproteins liegt [Kurian et al., 2004]. Yubisui und Takeshita [1980] ermittelten

eine Korrelation zwischen Flavingehalt und der Enzymaktivität der NADH Cytochrom

b5 Reduktase, bei der 1 U lösliche NADH Cytochrom b5 Reduktase etwa 340 pmol

Flavin entspricht.

Die beiden Elektronentransportproteine wurden in verschiedenen stöchiometrischen

Verhältnissen zusammen inkubiert und ihre N-reduktive Aktivität bestimmt (Abb.

6.2). Die Bestimmung des gebildeten Benzamidins wurde mit einer sehr

empfindlichen Methode (Kapitel 6.2.3.1.3) bestimmt. Durch die Messung bei 201 nm

konnte die Bestimmungsgrenze gegenüber der Messung bei 229 nm um den Faktor

100 gesenkt werden. Dabei wurde ab einem Verhältnis von zehn Teilen Häm zu

einem Teil Flavin eine kaum noch nennenswerte Erhöhung der Reduktion erzielt.

Dieses Ergebnis entspricht den beschriebenen Daten für Mikrosomen [Rogers und

Strittmatter, 1974; Kadlubar und Ziegler, 1974; Yang und Ceederbaum, 1996; Kurian

et al., 2004]. Eine darüber hinausgehende deutliche Erhöhung des Hämanteils zeigte

keinen signifikanten Einfluss auf das gebildete Benzamidin. Bei dieser Untersuchung

wurde der Proteingehalt konstant gehalten, was bedeutete, dass die sukzessive

Erhöhung des Häms eine gleichzeitige Erniedrigung des Flavins mit sich brachte.


258

Daten über das Cytochrom b5/NADH Cytochrom b5 Reduktase-Verhältnis in der

äußeren mitochondrialen Membran von Nieren sind bisher nicht beschrieben. In der

äußeren mitochondrialen Membran der Rattenleber konnte im Gegensatz zum

endoplasmatischen Retikulum der Rattenleber etwa fünfmal soviel an NADH

Cytochrom b5 Reduktase detektiert werden [Borgese und Pietrini, 1986]. Im

Gegenzug wurden aber nur 50 % des detektierbaren Cytochrom b5 Gehalts in der

äußeren mitochondrialen Membran gegenüber den Rattenlebermikrosomen bestimmt

[D’Arrigo et al., 1993]. Werden diese Daten miteinander verknüpft, so ergibt sich für

die äußere mitochondriale Membran ein 1:1 Verhältnis. Somit scheinen sich die

tatsächlichen Verhältnisse in der äußeren mitochondrialen Membran von denen im

endoplasmatischen Retikulum zu unterscheiden und eher einem gleichwertigen

Verhältnis näher zu kommen.

Die Substratabhängigkeit verlief im Zweikomponentensystem im Bereich von

0-125 mM Benzamidoxim linear. Hierbei wurde das vorher optimierte 10:1 Verhältnis

zwischen Häm und Flavin eingesetzt (Abb. 6.3). Die Reaktion ist somit nicht

sättigbar. Eine lineare Abhängigkeit spricht normalerweise nicht für eine

enzymkatalysierte Reaktion. Kurian et al. [2004] und Saulter et al. [2005]

prognostizierten die Abhängigkeit der Reduktion von diesem Zweikomponenten-

system mit löslichen Enzymen im 10:1 Verhältnis zugunsten des Cytochrom b5. In

der vorliegenden Arbeit wurde dagegen ausschließlich mit membrangebundenen

Enzymen gearbeitet. Die Daten sind somit nicht in allen Einzelheiten vergleichbar.

Mitochondrien und Mikrosomen, die als Modelle die physiologische Situation besser

simulieren können, zeigten eine Michaelis-Menten Kinetik. Da diese Kinetik im

Zweikomponentensystem nicht erzielt werden konnte, ist die Übertragbarkeit dieses

in vitro Modells auf die in vivo Verhältnisse anzuzweifeln.

Das Dreikomponentensystem bestehend aus Cytochrom b5, seiner Reduktase und

dem gereinigten Moco-bindenden Enzym zeigt in der Abhängigkeit der

Inkubationszeit in den ersten 30 Minuten eine Linearität, danach konnte die pro Zeit

gebildete Benzamidinmenge nicht mehr wesentlich gesteigert werden (Abb. 6.4).

In der Untersuchung des Dreikomponentensystems bezüglich der Verhältnis-

abhängigkeit der Enzyme Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5 Reduktase

zueinander wurden diese in verschiedenen stöchiometrischen Verhältnissen inkubiert

und ihre N-reduktive Aktivität bestimmt (Abb. 6.5). Die Zunahme von Cytochrom b5

wurde durch Abnahme seiner Reduktase ausgeglichen, so dass der Proteingehalt

konstant gehalten werden konnte. Zudem wurde eine konstante Menge des in dieser

Arbeit gereinigten Moco-bindenden Enzyms zugesetzt. Hierbei konnte zwischen

Cytochrom b5 und seiner Reduktase ein 1:1 Verhältnis als optimal ermittelt werden.


259

Die deutliche Steigerung der gebildeten Benzamidinmenge zeigte die Überlegenheit

des Dreikomponentensystems gegenüber dem Zwei-komponentensystem.

Eine mögliche Erklärung für die starke Hemmung des Dreikomponentensystems bei

erhöhter Cytochrom b5 Zugabe ist in der Konkurrenz zwischen dem Drei- und

Zweikomponentensystem zur Reduktion von Benzamidoxim zu finden. Das

Zweikomponentensystem scheint das Dreikomponentensystem zu entkoppeln. Die

sehr hohe Wechselzahl des Cytochrom b5 mit seiner Reduktase (etwa 900 Cytochrom

b5*s-1) [Shirabe et al., 1992] ist bei erhöhter Cytochrom b5 Menge nicht mehr in der

Lage, noch Elektronen auf das in dieser Arbeit gereinigte Moco-bindende Enzym zu

übertragen. Das optimierte 1:1 Verhältnis zwischen dem Cytochrom b5 und seiner

Reduktase scheint dem physiologischen Verhältnis der äußeren mitochondrialen

Membran auch eher zu entsprechen.

Das pH-Optimum wurde für das Dreikomponentensystem bei 5,7 gefunden, wobei

der Bereich zwischen pH 5,5 und pH 6,0 nicht signifikant unterschiedlich war (Abb.

6.6). Oberhalb von pH 6,0 sowie unterhalb von pH 5,5 verringerte sich die

Umsetzungsrate sehr stark. Das Ergebnis entsprach den Daten, die vorher für die

Mitochondrien sowie für die äußere mitochondriale Membran gefunden wurden (Abb.

3.3 sowie 4.3) und deutet daraufhin, dass es sich wahrscheinlich jeweils um das

gleiche Enzymsystem handelt. Lediglich der optimale pH-Wert selbst verschob sich in

den jeweiligen Reinigungsstufen weiter in den sauren Bereich, was für die

mikrosomale Benzamidoxim-Reduktase in der Schweineleber auch schon festgestellt

wurde [Lomb, 1995].

Die Substratabhängigkeit des Dreikomponentensystems folgte im Gegensatz zum

Zweikomponentensystem einer Michaelis-Menten-Kinetik (Abb. 6.7). Der Km-Wert des

in dieser Arbeit optimierten Enzymsystems lag bei 0,5 mM, die maximale

Reaktionsgeschwindigkeit bei Substratsättigung lag bei Vmax = 3,1 µmol*min-1*mg-1.

Die sich daraus ergebende katalytische Effizienz lag bei 5,9*10-3 min-1*mg-1.

Der Cosubstratvergleich zeigte eine deutlich höhere Umsetzungsrate von

Benzamidoxim zu Benzamidin mit NADH im Vergleich zu NADPH (Abb. 6.8). Der

Km-Wert für das Cosubstrat NADH lag bei 1,5 mM, die maximale

Reaktionsgeschwindigkeit bei Substratsättigung Vmax = 6,3 µmol*min-1*mg-1 und die

sich daraus ergebende katalytische Effizienz bei 4,4*10-3 min-1*mg-1. Der Km-Wert für

das Cosubstrat NADPH lag bei 1,4 mM, die maximale Reaktionsgeschwindigkeit bei

Substratsättigung Vmax = 2,0 µmol*min-1*mg-1 und die sich daraus ergebende

katalytische Effizienz bei 1,4*10-3 min-1*mg-1. Wie sich schon für die Mitochondrien

sowie für die äußere mitochondriale Membran zeigte, wurde die Sättigung des

Systems mit NADH sehr viel schneller erhalten, als im Vergleich zu NADPH (Abb. 3.5,

4.5). Auch diese ähnlichen Eigenschaften unterstützen die These, dass in den drei


260

unterschiedlichen Reinigungsstufen jeweils das gleiche Enzymsystem für die

Reduktion von Benzamidoxim verantwortlich war.

Das System aus Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5 Reduktase wurde noch mit

der Zugabe des in dieser Arbeit gereinigten Moco-bindenden Enzyms optimiert (Abb.

6.9). Die Reaktion ist steigerbar durch Zugabe des Moco-bindenden Enzyms, jedoch

nähert sich die Aktivität einem Grenzwert an. Weitere Experimente zur Untersuchung

der sättigbaren Reaktion sollten zur Aufklärung des Mechanismus durchgeführt

werden.


261

6.5 Zusammenfassung

Es wurde das Zweikomponentensystem bestehend aus Cytochrom b5 und NADH

Cytochrom b5 Reduktase mit dem Dreikomponentensystem bestehend aus

Cytochrom b5, NADH Cytochrom b5 Reduktase und dem in dieser Arbeit gereinigten

Moco-bindenden Enzym hinsichtlich ihrer Fähigkeiten zur Reduktion von

Benzamidoxim verglichen.

Das Zweikomponentensystem ist in der Lage, Benzamidoxim zu Benzamidin zu

reduzieren. Ein optimiertes System der zwei Enzyme zueinander bestand aus zehn

Teilen Cytochrom b5 zu einem Teil seiner Reduktase. Dieses Verhältnis wurde in

Mikrosomen sowie für die löslichen Enzyme ebenfalls gefunden. In der äußeren

mitochondrialen Membran scheint aber dieses Verhältnis nicht physiologisch zu sein.

Interessanterweise war für dieses System die Reduktion von Benzamidoxim nicht

sättigbar, sondern verlief linear. Die vorher untersuchten Mitochondrien sowie die

äußere mitochondriale Membran folgten hingegen einer Michaelis-Menten Kinetik, so

dass die in vitro-in vivo Korrelation des Zweikomponentensystems anzuzweifeln ist.

Das Dreikomponentensystem ist ebenfalls in der Lage, Benzamidoxim zu Benzamidin

zu reduzieren. Die erzielte Umsetzungsrate überstieg bei weitem diejenige, die im

Zweikomponentensystem erreicht wurde. Außerdem folgte das Dreikomponenten-

system einer Michaelis-Menten Kinetik, was für eine enzymatische Umsetzung sprach

und damit vergleichbar zu den Daten aus den Mitochondrien sowie der äußeren

mitochondrialen Membran war. Eine Optimierung des Cytochrom b5 und seiner

Reduktase führte zu einem 1:1 Verhältnis dieser zwei Enzyme, während das in dieser

Arbeit gereinigte Moco-bindende Enzym eher einem katalytischen Einfluss gleich

kam, da die Reaktionsgeschwindigkeit zunächst stark gesteigert werden konnte, sich

aber einem Maximalwert annäherte. Das 1:1 Verhältnis des Cytochrom b5 zu seiner

Reduktase scheint dem physiologischen Verhältnis näher zu kommen, da

verschiedene Arbeiten zeigen konnten, dass der Cytochrom b5 Gehalt in der äußeren

mitochondrialen Membran gegenüber Mikrosomen erniedrigt ist, während die NADH

Cytochrom b5 Reduktase-Aktivität deutlich erhöht ist. Auch wenn diese Daten aus

Untersuchungen mit Rattenleber stammen und Erkenntnisse hierzu in der Niere

bisher fehlen, so deuten die Ergebnisse in dieser Arbeit auf ähnliche Verhältnisse hin.

Zusammenfassung und Ausblick

262

7 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit den enzymatischen Grundlagen der Reduktion

N-hydroxylierter Verbindungen in der Schweineniere. Als Zellkompartimente wurden

Mikrosomen und Mitochondrien verwendet, als Modellsubstrat Benzamidoxim (Abb.

7.1). Das Modellsubstrat zeigt ähnliche Charakteristika der Reduktion zum

Benzamidin im Vergleich zu den Arzneistoffen Ximelagatran oder Sibrafiban

[Clement, 2002], so dass die in dieser Arbeit erhaltenen Daten auf zukünftige

Arzneistoffentwicklungen übertragen werden können.

N

NH2

OH NH

NH2

Abb. 7.1: Reduktion von Benzamidoxim zu Benzamidin

Hemmstudien der renalen Zellkompartimente deuteten auf identische N-reduktive

Enzymsysteme der Benzamidoxim-Reduktase mit den literaturbeschriebenen

Hydroxylaminreduktasen [Bernheim, 1969; Kadlubar und Ziegler, 1974] hin. Dabei

wiesen die NADH-abhängigen Benzamidoxim-Reduktasen der Mikrosomen und der

Mitochondrien die typischen Charakteristika der hepatischen sauerstoffinsensitiven

Benzamidoximreduktion auf [Clement et al., 1988b; Clement et al., 2005b]. Die

Beteiligung der Elektronentransportproteine Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5

Reduktase sowie einer dritten Komponente, wie sie für das hepatische System schon

beschrieben ist [Clement et al., 1997; Havemeyer et al., 2006], konnte für das renale

System ebenfalls bestätigt werden.

Trotz dieser Übereinstimmungen gelang eine Übertragung der etablierten Methode

zur Gewinnung des mikrosomalen Enzymsystems von der Leber auf die Niere nicht.

Die in den Lebermikrosomen postulierte dritte Komponente ist ein Cytochrom P450

Isoenzym der Subfamilie 2D. Dies gab Anlass, die Reinigung an Literatur-

beschriebene Methoden zur Isolierung von Cytochrom P450 Isoenzymen anzupassen.

Dabei wurde eine Cytochrom P450 Fraktion aus den Nierenmikrosomen erhalten, die

allerdings nicht in der Lage war, im rekonstituierten System mit Cytochrom b5 und

NADH Cytochrom b5 Reduktase Benzamidoxim zu Benzamidin zu reduzieren.

Mit der O-Demethylierung von Dextromethorphan als Markerreaktion für CYP2D

konnte gezeigt werden, dass es bei den Nierenmikrosomen im Vergleich zu den

ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK

263

Lebermikrosomen zu einer vierfach geringeren O-Demethylierung von

Dextromethorphan kommt. Allerdings reduzieren Nierenmikrosomen deutlich besser

Benzamidoxim zu Benzamidin als Lebermikrosomen. In der Literatur ist eine mRNA

Verteilung des CYP2D6 im Menschen zwischen Niere und Leber von 1:100 aufgeführt

[Nishimura et al., 2003]. Spezifische Immunoblotanalysen zum CYP2D Nachweis als

Vergleich zwischen Maus und Mensch zeigten ähnliche Verhältnisse [Miksys et al., 2005], welches zwar die niedrigere O-Demethylierungsrate der Nierenmikrosomen

erklärt, nicht aber die erhöhte Reduktionsrate von Benzamidoxim.

Daher wurde eine neue Reinigung an einem Anionenaustauscher durchgeführt. Die

Reinigung war nicht mehr speziell auf die Isolierung von CYP450 Enzymen ausgelegt.

In einer Fraktion, welche kein Cytochrom b5 und keine NADH Cytochrom b5

Reduktase enthielt, konnte durch Zusatz dieser beiden Elektronentransportproteine

die Reduktase-Aktivität rekonstituiert werden. Dieses System zeigte eine etwa 20fach

höhere spezifische Aktivität der Benzamidoxim-Reduktase als die ursprünglichen

Mikrosomen. Die gereinigte Fraktion enthielt kein detektierbares Cytochrom P450

und war auch nicht in der Lage, Dextromethorphan zu O-demethylieren.

In den gewonnenen Mikrosomen wurde als eine mitochondriale Verunreinigung

Monoaminoxidase gefunden. Havemeyer et al. [2006] isolierten aus der äußeren

mitochondrialen Membran der Schweineleber ein Molybdoenzym, welches mit

Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5 Reduktase Benzamidoxim reduzierte. Deshalb

wurde die aktive Fraktion der Anionenaustauscherchromatographie auf das von

Havemeyer [2006] entdeckte mitochondriale Molybdoenzym aus der Schweineleber

untersucht. Mit Immunoblot-Analyse und spezifischen Enzymnachweisen konnte das

Molybdoenzym in der aktiven Fraktion nach dem Anionenaustauscher detektiert

werden. Auch wenn noch mehrere Enzyme in dieser aktiven Fraktion nachgewiesen

werden konnten, so sind die Anreicherungsfaktoren der Benzamidoxim-Reduktase

und der Enzymnachweise für das molybdänhaltige Enzym vergleichbar.

Auf Grund der in dieser Arbeit zusammengestellten Daten kann davon ausgegangen

werden, dass das mikrosomale CYP2D Enzym der Schweineleber nicht als die

verantwortliche dritte Komponente der Schweinenierenmikrosomen in Frage kommt.

Zur weiteren Untersuchung wurden Schweinenierenmitochondrien hoch gereinigt.

Aus diesen wurde die äußere mitochondriale Membran gewonnen und die

N-reduktive Aktivität mittels enzymatischer Testverfahren auf dieser Membran

lokalisiert.

Durch eine Anionenaustauschchromatographie konnte eine molybdäncofaktorhaltige

Enzymfraktion gewonnen werden, welche kein Cytochrom b5 und keine NADH

Zusammenfassung und Ausblick

264

Cytochrom b5 Reduktase enthielt und erst nach Zugabe der beiden

Elektronentransportproteine Benzamidoxim zu reduzieren vermochte. Die Isolierung

fand nach der von Havemeyer [2006] entwickelten Methode mit leichten

Modifikationen statt und war somit von Leber auf Niere übertragbar. Es wurde eine

240-fache Anreicherung der N-reduktiven Aktivität erzielt.

Die Auswertung der massenspektrometrischen Analyse des isolierten Enzyms ergab

ein 35 kDa Molybdoprotein, welches zumindest eine verantwortliche dritte

Komponente im Enzymsystem der Nierenmitochondrien darstellt. Zusätzliche

Hemmstudien zeigten ebenfalls die Anreicherung des Molybdäncofaktors im Verlauf

der Reinigung von den Mitochondrien bis hin zur isolierten Fraktion.

Da für die zwei Elektronentransportproteine Cytochrom b5 und NADH Cytochrom b5

Reduktase bekannt ist, dass sie Benzamidoxim auch allein reduzieren können [Kurian

et al., 2004; Saulter et al., 2005], wurde dieses Zweikomponentensystem mit dem

Dreikomponentensystem bestehend aus Cytochrom b5, NADH Cytochrom b5

Reduktase und dem isolierten Molybdoenzym im Hinblick auf die Umsetzungsraten

der Reduktion von Benzamidoxim verglichen. Das Zweikomponentensystem

bevorzugte dabei ein 10:1 Verhältnis zwischen Häm- und Flavinkomponente,

während das Dreikomponentensystem eher einem 1:1 Verhältnis zwischen

Cytochrom b5 und seiner Reduktase gleich kam. Zudem konnte die deutliche

Überlegenheit des Dreikomponentensystems gegenüber dem Zweikomponenten-

system in Form einer wesentlich erhöhten Reduktionsrate gezeigt werden. Des

Weiteren konnte bewiesen werden, dass NADH als Co-Substrat gegenüber NADPH

deutlich bevorzugt war.

Damit konnte erstmals ein molybdäncofaktorabhängiges Enzymsystem aus der Niere

von Säugetieren isoliert werden, dessen Aufbau und Zusammensetzung der

Nitratreduktase autotropher Organismen ähnelt [Campbell, 1999].

Der eindeutige Nachweis des Enzyms in den Schweinenierenmitochondrien bestätigt

das Ergebnis des isolierten Enzyms aus den Schweinelebermitochondrien.

Der gleichzeitige Nachweis in den Schweinenierenmikrosomen gibt einen Hinweis auf

eine mögliche Co-Exprimierung des Enzyms im endoplasmatischen Retikulum. Eine

weitere Charakterisierung der Mikrosomen sollte vor allem im Hinblick auf die

Verunreinigung mit äußerer mitochondrialer Membran fortgeführt werden.

Im Weiteren sollte das hier isolierte Enzymsystem auf die Reduktionsfähigkeit von

aliphatischen und aromatischen Hydroxylaminen, N-Hydroxyguanidinen, N-Hydroxy-

ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK

265

amidinohydrazonen und Oximen getestet werden. Gerade die Reduktion von

Hydroxylaminen ist von großer Bedeutung, da diese häufig ein genotoxisches

Potential besitzen und u. a. durch die Reduktion detoxifiziert werden.

Die Ergebnisse zeigen zudem, dass das in dieser Arbeit isolierte Enzym der Niere

hinsichtlich der Aktivität dem der Leber ähnlich ist.

Da das isolierte Enzym aus dem Mitochondrium stammt, eröffnen sich aus dieser

Tatsache neue Ansätze in der Metabolismusforschung. Bisher sind neben Leber und

Niere auch Darm, Gehirn und Fettzellen auf Benzamidoxim-Reduktase hin untersucht

worden, allerdings bis auf die Fettzellen nur mikrosomal. Andersson et al. [2005]

erkannten, dass Fettzellen besonders hohe Reduktionsraten von Benzamidoxim

aufwiesen. Da gerade Fettzellen zu einem sehr hohen Stoffwechselumsatz in der

Lage sind, ist in ihnen auch eine sehr hohe Zahl von Mitochondrien vorhanden und

die hohe Reduktionsrate erscheint verständlich. Zu den Zellen mit den höchsten

Mitochondrienzahlen gehören die Eizelle und die Herzmuskelzelle. Eine Untersuchung

der Reduktion N-hydroxylierter Verbindungen in diesen Zellen ist sicherlich von

großem Interesse, da die Detoxifizierung von genotoxischen Substanzen durch diese

Zellen noch nicht bekannt ist.

MATERIALIEN UND GERÄTE

266

8 MATERIALIEN UND GERÄTE

8.1 Substanzen und sonstige Materialien

Die verwendeten Chemikalien stammten, soweit nicht anders in der Tabelle

aufgeführt, von der Firma Fluka Chemie GmbH (Buchs, Schweiz).

Alle verwendeten Chemikalien wurden in höchster verfügbarer Reinheit bezogen.

Substanz Firma

Acetonitril J.T. Baker, Deventer, Holland

Acrylamid Serva Electrophoresis GmbH,

Heidelberg

Ammoniak Merck KGaA, Darmstadt

Ammoniumacetat Merck KGaA, Darmstadt

Argon Messer Griesheim GmbH, Krefeld

BCA-Kit zur Proteinbestimmung Pierce, Rockford, USA

Bromphenolblau Merck KGaA, Darmstadt

Cellstar® Flaschen, 15 ml Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen

Coomassie® Brilliant blue R 250 Serva, Feinbiochemica, Heidelberg

Cytochrom c Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen

Dimethylsulfoxid Merck KGaA, Darmstadt

Eisen(III)Chlorid-Tetrahydrat Merck KGaA, Darmstadt

Eisessig J.T. Baker, Deventer, Holland

Emulgen® 911 Kao Chemicals, Tokio, Japan

Ethylendiamintetraessigsäure,

Dinatriumsalz Roth GmbH Co. KG, Karlsruhe

Hydroxylamin-HCl Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen

p-Hydroxymercuribenzoat Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen

Isopropanol Merck KGaA, Darmstadt

Kaliumcyanid Merck KGaA, Darmstadt

Kaliumhydroxid Merck KGaA, Darmstadt

Kaliumhexacyanoferrat(III) Merck KGaA, Darmstadt

Kohlenmonoxid Messer Griesheim GmbH, Krefeld

Methanol J.T. Baker, Deventer, Holland

Natriumcholat Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen

Natriumchlorid Merck KGaA, Darmstadt


267

Natriumdithionit Merck KGaA, Darmstadt

Natriumdodecylsulfat Merck KGaA, Darmstadt

Natriumvanadat Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen

NADPH Roche Diagnostics, Mannheim

1-Ocytlsulfonat Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen

Ortho-Phosphorsäure, 85 % Merck KGaA, Darmstadt

Reaktionsgefäße, 1,5 ml Sarstedt AG & Co., Nümbrecht

Silberfärbe Kit GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala,

Schweden

Triton® X-100 Merck KGaA, Darmstadt

Zwittergent® 3-14 Calbiochem, SanDiego, USA


268

8.2 Geräte

Gerät Firma

Econo-Chromatographiesäule 2,5*10 cm Bio-Rad, München

Einmalküvetten mikro, Zentrumshöhe

15 mm, Volumen 70-550 µl Brandt GmbH & Co. KG, Wertheim

Einmalküvetten, 500-1000 µl Sarstedt, Nürnberg

Fraktionssammler Redi frac Amersham Biosciences Europe GmbH,

Freiburg

Gelelektrophoresekammer Modell 2001 Amersham Biosciences Europe GmbH,

Freiburg

Geltrockner Modell 2003 LKB, Bromma, Schweden

Gradientenformer GM-1 Amersham Biosciences Europe GmbH,

Freiburg

Hochleistungszentrifuge J2-21 M/E,

Rotor JA 10 und JA 14 Beckman, München

IKA-Vibrax-VXP Janke & kunkel GmbH & Co KG, Staufen

ISMATEC Schlauchpumpe für

Niederdruckchromatographiesäulen Typ

MCP ISM 726

ISMATEC Laboratoriumstechnik GmbH,

Wertheim-Mondfeld

Jupiter Fleischwolf Typ 885 Jupiter Kitchen Tools GmbH, Schorndorf

Magnetkernrührer MR mini Heidolph Instruments GmbH & Co. KG,

Schwabach

Messer-Homogenisator Eigenbau der Universität Austin, Texas

Millipore Schlauchpumpe für

Organperfusion Modell XX8200230 Millipore GmbH, Schwalbach

pH-Messgerät inoLab® pH level 1 Wissenschaftlich-Technische Werkstätten

GmbH, Weinheim

Pipetten Reference® Eppendorf Eppendorf AG, Hamburg

Potter-Elvehjem Homogenisator mit

Teflonpistill

B. Braum Biotech International,

Melsungen

Schüttelwasserbad GFL 1087 Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel

Spektralphotometer Varian Cary® 50 Bio

mit Water Peltier System PVB 150 Varian GmbH, Darmstadt

Temperiereinheit für

Gelelektrophoresekammer Julabo C/F20 Julabo, Labortechnik GmbH, Seelbach


269

Tischzentrifuge Hettich Mikro 200 Hettich Zentrifuge, Tuttlingen

Ultraschallbad, Sonorex, Super RK 510H Bandelin, Berlin

Ultrazentrifuge L7-65, Rotor 45Ti Beckman, München

Vortexer VF2 Janke & Kunkel GmbH & Co. KG, Staufen

Waage, MC 1, Laboratory LC 620 P Sartorius, Göttingen

Waage, MC 1, Research CP 225 D Sartorius, Göttingen

Zweistrahlphotometer Uvikon 930 Kontron, Neufahrn

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DANKSAGUNG

Danksagung

Die vorliegende Arbeit entstand am Pharmazeutischen Institut der Christian-Albrechts-

Universität zu Kiel auf Anregung und unter der Leitung von

Herrn Prof. Dr. Bernd Clement.

Für die freundliche Aufnahme in seinen Arbeitskreis, die Überlassung des interessanten

Promotionsthemas sowie die stetige Diskussionsbereitschaft und die mir gewährte

Unterstützung möchte ich mich bei meinem Doktorvater herzlich bedanken.

Ebenso gilt mein Dank Herrn HD Dr. Thomas Kunze für seine immerwährende Bereitschaft

zur Diskussion sowie vielen hilfreichen Tipps. Seine Hinweise und Ratschläge bei analytischen

und biochemischen Fragen waren eine großartige Hilfe.

Ganz besonders möchte ich mich bei Herrn Dr. Florian Bittner (TU Braunschweig) für seine

unermüdliche Zusammenarbeit sowie ständige Bereitschaft zur Unterstützung bei allen

Fragen bezüglich molybdänhaltiger Enzyme bedanken. Für die Durchführung zahlreicher

nit-1 Assays, FormA Analysen und Western Blots bedanke ich mich gleichermaßen bei Tanja

Otte (TU Braunschweig).

Ebenso sei Richard Jones (Division of Systems Toxicology, FDA/NCTR, Jefferson, AR 72079)

für die massenspektrometrischen Analysen gedankt.

Für die Einarbeitung in die HPLC-Analytik und ständige Hilfe bei allen Fragen bzgl. HPLC

möchte ich mich bei Sven Wichmann bedanken. Ebenso möchte ich mich bei Thomas

Behrendt für seine Unterstützung bei vielen Enzymassays sowie der Durchführung von SDS-

Gelelektrophoresen und ihren Anfärbungen bedanken. Petra Köster danke ich für die

Unterstützung bei der Proteinreinigung. Arne und Detlef sei für ihre ständige Unterstützung

und gute Zusammenarbeit im Bereich der EDV gedankt. Moni und Susanne aus dem

Geschäftzimmer danke ich für Bearbeitung aller Formalien und sonstiger übertragener

Arbeiten.

Mein weiterer Dank gilt Britta, Christiane, Dennis, Helen, Jacek, Jan, Martin und Ullvi für die

angenehme und unkomplizierte Zusammenarbeit bei der Betreuung des 2. Semesters.

Für das zügige und sorgfältige Korrekturlesen dieser Arbeit sowie hilfreichen und

konstruktiven Hinweisen bedanke ich mich bei Dennis, Ilka, Sabine, Sanja und Thomas.

Allen meinen Kollegen, insbesondere der „Reinigungsgruppe“, bin ich für ihren

freundschaftlichen Umgang sowie ständiger Hilfs- und Diskussionsbereitschaft sehr dankbar.

DANKSAGUNG

Ein weiterer besonderer Dank gilt meinen Freunden Anja, Ule, Dana, Lutz, Conny, Frank und

Juliane sowie Inga, Lina, Lisa und Jens, mit denen ich Vieles erlebt habe. Sie hatten großen

Anteil an der Gestaltung meines Lebens.

Ebenfalls möchte ich mich bei Stefan, Hendrik, Thorsten, Marc, Heiner und Jana für die

schon lange bestehende Freundschaft bedanken.

Mein letzter und ganz besonderer Dank gilt meinen Eltern und meinem Bruder. Sie haben

immer an mich geglaubt und mich jederzeit unterstützt.

LEBENSLAUF

PERSÖNLICHE DATEN

Vor- und Familienname Dirk Jan Holtkamp

Geburtsdatum 24. September 1976

Geburtsort Gronau/Westfalen

Staatangehörigkeit deutsch

SCHULAUSBILDUNG

1983 – 1987 Grundschule, Bad Bentheim/Gildehaus

1987 – 1996 Missionsgymnasium St. Antonius, Bad Bentheim/Bardel

ZIVILDIENST

Juni 1996 – Juni 1997 Deutsches Rotes Kreuz, Nordhorn

STUDIUM

1997 – 2001 Studium der Pharmazie an der Christian-Albrechts-

Universität zu Kiel

Frühjahr 1999 1. Abschnitt der Pharmazeutischen Prüfung

Januar 2000 – Dezember 2000 Wissenschaftliche Hilfskraft am Pharmazeutischen

Institut der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel

November 2001 2. Abschnitt der Pharmazeutischen Prüfung

Januar 2002 – Juni 2002 Pharmaziepraktikum in der Belvedere-Apotheke, Kiel

Juli 2002 – Dezember 2002 Pharmaziepraktikum im Department of Clinical

Pharmacology, Flinders Medical Centre, Bedford Park,

South Australia 5042, Australien

Januar 2003 3. Abschnitt der Pharmazeutischen Prüfung

BERUFLICHE TÄTIGKEIT UND WEITERBILDUNG

Seit März 2003 Wissenschaftlicher Angestellter am Pharmazeutischen

Institut der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel und

Anfertigung der Dissertation unter Leitung von Prof. Dr.

B. Clement

Seit August 2006 Fachapotheker für Pharmazeutische Analytik

EIGENE VERÖFFENTLICHUNG

Publikation: HOLTKAMP, D.; HAVEMEYER, A.; KUNZE, T.; BITTNER, F.; MENDEL, R. R.; JONES, R. C.; UND CLEMENT, B.

Identification of the third component active in reduction of benzamidoxime in combination with

cytochrome b5 und NADH cytochrome b5 reductase in pig kidney mitochondria (in Vorbereitung).

ERKLÄRUNG ZU §10 ABS. 2 NR. 2 DER PROMOTIONSORDNUNG

Der Inhalt dieser Abhandlung wurde – abgesehen von der Beratung durch meinen

Betreuer – selbstständig von mir erarbeitet und in dieser Form zusammengestellt.

Die Arbeit hat an keiner anderen Stelle im Rahmen eines Prüfungsverfahrens

vorgelegen.

Kiel, im März 2007

Dirk Holtkamp

KURZFASSUNG

Stark basische Verbindungen mit Amidin- und Guanidinstruktur liegen unter

physiologischen Bedingungen überwiegend protoniert vor. Enthalten Arzneistoffe

solche funktionelle Gruppen, werden sie schlecht im Gastrointestinaltrakt resorbiert.

Die Herabsetzung dieser starken Basizität ist durch die N-Hydroxylierung des Amidins

oder Guanidins möglich, wodurch die Verbindung resorbierbar wird. Nach Resorption

findet die N-Reduktion durch Mikrosomen und Mitochondrien hepatisch und

extrahepatisch statt. Die Kenntnis der an der N-Reduktion beteiligten Enzyme ist

hilfreich zur Risikoabschätzung von unerwünschten Wirkungen der resorbierten

Substanzen. Mit spezifischen Inhibitoren wurde die Beteiligung von Cytochrom b5 und

NADH Cytochrom b5 Reduktase am N-reduzierenden Enzymsystem sowohl in den

Mikrosomen als auch in den Mitochondrien der Schweineniere demonstriert. Ferner

konnte mit den Mikrosomen gezeigt werden, dass die Beteiligung eines Cytochrom

P450 Isoenzyms an dieser Reaktion in der Schweineniere auszuschließen ist. Dafür

konnte die Beteiligung eines Molybdäncofaktor-bindenden Enzyms gezeigt werden.

Im Zuge dieser Studien konnte in den Mikrosomen ein hoher Anteil der äußeren

mitochondrialen Membran als Verunreinigung demonstriert werden. Das Vorkommen

des Enzymsystems ist somit vermutlich nicht auf die Mikrosomen zurückzuführen.

Deshalb wurden Mitochondrien der Schweineniere bezüglich dieses Enzymsystems

untersucht. Das Enzymsystem konnte auf der äußeren mitochondrialen Membran

lokalisiert werden. Die Auftrennung der äußeren mitochondrialen Membran mit einem

Anionenaustauscher führte zu einem Enzym, welches zusammen mit Cytochrom b5

und NADH Cytochrom b5 Reduktase die N-hydroxylierte Verbindung Benzamidoxim

reduziert. Das gereinigte Enzym der Schweinenierenmitochondrien konnte als

Molybdäncofaktor-bindendes Enzym identifiziert werden.

ABSTRACT

Strongly basic compounds with amidine and guanidine function are usually

protonated under physiological conditions. Therefore, these drugs will not be

absorbed, if they contain such functional groups. N-hydroxylation of amidines and

guanidines decreases this strong basicity. In this case, the compounds can be readily

absorbed. Following absorption, hepatic and extrahepatic microsomes and

mitochondria are able to reduce these N-hydroxylated compounds. The knowledge of

the enzymes participating in this N-reducing system is extremely helpful for risk

analyses of undesired side effects caused by these absorbed compounds. In pig

kidney microsomes and mitochondria the participation of cytochrome b5 and NADH

cytochrome b5 reductase was demonstrated with specific inhibitors. Furthermore the

participation of a cytochrome P450 isoenzyme could be excluded for the enzyme

system in pig kidney. Instead of this, the participation of a Moco-binding enzyme was

shown. In addition, it was demonstrated, that the microsomes were contaminated

with outer mitochondrial membrane and it seems that this contamination is

responsible for the microsomes N-reducing capability. Therefore the enzyme system

was purified form pig kidney mitochondria and it was located on the outer

mitochondrial membrane. Further purification of the outer mitochondrial membrane

with anion exchange chromatography lead to an enzyme, that was able to reduce

the N-hydroxylated compound benzamidoxime in combination with cytochrome b5

and NADH cytochrome b5 reductase. The purified enzyme of pig kidney mitochondria

was identified as a Moco-binding enzyme.

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