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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FFCLRP - DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENTOMOLOGIA

Dinâmica populacional em populações de abelhas Africanizadas

(Apis mellifera L.) no Nordeste brasileiro.

CAROLINE JULIO MORETTI

Dissertação apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da USP, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Ciências, Área: ENTOMOLOGIA

RIBEIRÃO PRETO-SP

2014

CAROLINE JULIO MORETTI

Dinâmica populacional em populações de abelhas Africanizadas

(Apis mellifera L.) no Nordeste brasileiro.

Versão corrigida da dissertação apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da USP, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Ciências, Área: ENTOMOLOGIA

Orientador: Prof. Dr. Tiago Mauricio Francoy.

RIBEIRÃO PRETO-SP

2014

Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio

convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a

fonte.

Folha de Aprovação

Moretti, Caroline Julio Dinâmica populacional em populações de abelhas

Africanizadas (Apis mellifera L.) no Nordeste brasileiro. Ribeirão Preto, 2014.

131 p.: il. ; 30cm Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de

Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Área de concentração: Entomologia.

1. Apis mellifera. 2. Africanizada. 3. Morfometria. 4. DNA Mitocondrial. 5. Variabilidade.

Nome: Caroline Julio Moretti Título: Dinâmica populacional em populações de abelhas Africanizadas (Apismellifera L.) no Nordeste brasileiro.

Dissertação apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da USP, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Ciências, Área: ENTOMOLOGIA

Aprovado em:

Banca Examinadora

Prof(a). Dr(a).: _______________________________________________________

Instituição: __________________________________________________________

Parecer: ____________________________________________________________

Assinatura: __________________________________________________________

Prof(a). Dr(a).: _______________________________________________________

Instituição: __________________________________________________________

Parecer: ____________________________________________________________

Assinatura: __________________________________________________________

Prof(a). Dr(a).: _______________________________________________________

Instituição: __________________________________________________________

Parecer: ____________________________________________________________

Assinatura: __________________________________________________________

Ribeirão Preto, ____ de ____________________ de 2014.

Dedico,

Aos meus pais, Célia Moretti e Guido César

Moretti por sempre me apoiarem e proporcionarem a

realização dos meus sonhos.

AGRADECIMENTOS

À Deus por todas as portunidades a mim oferecidas e por me conceder Saúde e Força

para torna-las realidade.

Ao Prof. Dr. Tiago Maurício Francoy, meu orientador, pela oportunidade, orientação,

dedicação e confiança depositada na realização desse trabalho;

Ao Prof. Dr.Lionel Segui Gonçalves e à sua esposa Neide pela oportunidade, sem eles

nada disso teria sido possível.

À Profª. Drª. Zilá Luz Paulino Simões e à Profª Drª Márcia Bitondi, meus

agradecimentos por abrirem as portas de seu laboratório e me recepcionarem.

À família Apilab pela amizade e por todos os momentos de descontração, risadas e

guloseimas.

À todos os técnicos e funcionários do Apilab, Bloco A e do Departamento de

Entomologia

As meninas, Vanessa, Juliana, Claudinéia, Daiana, Clycie e Marina pela disposição e

paciência em me ajudar com a parte molecular e morfométrica e por serem minhas

amigas nos momentos felizes e difíceis.

As minhas amigas Ana Laura e Gabriela por estarem presentes em quase todos os

momentos da minha vida;

Aos meus pais, irmãos, tios, primos e avós por todo o apoio.

Aos meus cinco cachorros por fazerem a minha vida mais bonita.

À Grazi pela arte gráfica.

À todos os apicultores e pesquisadores que contribuíram com o envio das amostras;

Ao CNPq pela concessão da bolsa de mestrado

Ao Departamento de Entomologia da FFCLRP/USP

RESUMO

Em sua distribuição autóctone, as abelhas Apis mellifera apresentam diversas diferenciações morfológicas, comportamentais e ecológicas, que as possibilitam habitar os mais variados ambientes, apresentando grande diversidade de subespécies adaptadas a cada região. Com a introdução das abelhas africanas Apis mellifera scutellata no Brasil, em 1956, surgiram populações polí-hibridas denominadas Africanizadas, sendo que essas abelhas se tornaram interessantes para várias atividades econômicas e essenciais para a apicultura no Brasil. Um local que se apresenta como um bom candidato para o entendimento da dinâmica populacional das abelhas Africanizadas é o Nordeste brasileiro, que, recentemente, tem apresentado grandes avanços na área da apicultura. A análise do DNA mitocondrial tem se mostrado muito útil por permitir a obtenção de polimorfismos genéticos diretamente do DNA, resultando em um rápido e preciso estudo da variabilidade existente. Evidências morfométricas também têm sido utilizadas para estimar a composição genética destas abelhas. Neste contexto, este trabalho tem como objetivo avaliar a variabilidade de abelhas Africanizadas em diferentes localidades do Nordeste brasileiro. Foram coletadas 10 operárias por colônia em várias localidades dentro dos Estados do Rio Grande do Norte, Piauí, Alagoas, Paraíba e Sergipe. Foram feitas análises de DNA Mitocondrial do gene COI e análises do padrão de venação da asa através de Morfometria Tradicional e Geométrica utilizando as localidades e os climas das regiões amostradas como marcadores. Para as análises de morfometria foram utilizadas cinco abelhas por colônia epara a análise molecular, foi utilizada uma abelha por colônia. Foram obtidos fragmentos de 624 pb e identificados 11 diferentes haplótipos, correspondentes a 9 sítios variáveis. Os resultados das análises morfométricas e moleculares quando classificados por localidade corroboram entre si, indicando ausência de estruturação populacional na área amostrada. Essa falta de estruturação populacional provavelmente está relacionada ao alto fluxo gênico entre as populações, que tem como principal fator as altas taxas de enxameação durante os períodos de seca no Nordeste. Outros fatores que provavelmente também estão envolvidos são a apicultura migratória existente na região e, em menor escala, o comercio de compra e venda de rainhas e enxames. Os resultados da análise morfométrica usando como classificador o clima da região amostrada, mostra certa estruturação entre os três climas amostrados (Tropical, Litorâneo Úmido e Semiárido), sugerindo grupos relativamente adaptados a estas condições ambientais, apesar de haver fluxo gênico entre eles. Outra explicação para tal fato pode ser a influência do ambiente na formação das características das asas.

ABSTRACT

In its native distribution, Apis mellifera exhibit various morphological, behavioral and ecological differences that allow them to inhabit various environments and show great diversity of subspecies adapted to each region. With the introduction of African bees Apis mellifera scutellata to Brazil in 1956, emerged hybrid populations called Africanized honey bees, and, overtime, these bees have become important for various economic activities and essential for beekeeping in Brazil. A good candidate for the understanding of population dynamics on Africanized bees is the Brazilian Northeast, which recently has made great advances in the field of beekeeping. The analysis of mitochondrial DNA has proved to be very useful for allowing obtaining genetic polymorphisms directly from DNA, resulting in a fast and accurate method to studies of variability. Morphometric evidence has also been used to estimate the genetic profile of these bees. In this context, this work aims to evaluate the variability of Africanized bees in different localities of Brazilian Northeast. Ten workers per colony were collected at various locations in the states of Rio Grande do Norte, Piauí, Alagoas, Sergipe and Paraiba. Mitochondrial DNA analysis of the COI gene and analysis of the venation pattern of the wing were made through Traditional and Geometric Morphometrics using as markers the localities and climates of the sampled regions. For the analyzes of morphometry were used five bees per colony and for molecular analysis one bee colony was used. Fragments of 624 bp were obtained and 11 different haplotypes were identified, corresponding to 9 variable sites. The results of morphometric and molecular analyzes by location corroborate each other, indicating the absence of population structuration in the sampled area. This is probably related to high gene flow among populations, whose main factor is probably the high rate of swarming during periods of drought in the Northeast. Other factors are probably also involved are migratory beekeeping existing in the region and, to a lesser extent, the trade of buying and selling queens and swarms. The results of morphometric analysis using classifier as the climate of the survey area, showing some structure between the three sampled climates (Tropical, Coastal Humid and Semiarid), suggesting relatively groups adapted to these environmental conditions, although there is gene flow between them. The influence of the environment in shaping the characteristics of the wings is also a possible explanation.

Sumário

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 10

2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 26

2.1 Objetivos gerais ................................................................................................... 26

2.2 Objetivos específicos .......................................................................................... 26

3 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 28

3.1 Material biológico ................................................................................................ 28

3.2 Análises Morfométricas ....................................................................................... 29

3.2.1 Morfometria geométrica .................................................................................... 29

3.2.2 Morfometria tradicional ..................................................................................... 30

3.3.3 Análises estatísticas ......................................................................................... 31

3.3 Análises moleculares .......................................................................................... 33

3.3.1 Extração do DNA .............................................................................................. 33

3.3.2 Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) ........................................................ 34

3.3.3 Sequenciamento .............................................................................................. 34

3.3.4 Análise de dados .............................................................................................. 34

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 37

4.1 Análises Morfométricas ....................................................................................... 37

4.1.1 Morfometria Geométrica ................................................................................... 37

4.1.2 Morfometria Tradicional .................................................................................... 70

4.2 Análises de DNA mitocondrial ............................................................................. 96

5 CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................... 117

6 REFERÊNCIAS .................................................................................................... 120

Introdução

Introdução | 10

1 INTRODUÇÃO

Segundo estimativas da Convenção da Diversidade Biológica (CDB), o Brasil

é considerado o país com maior número de espécies endêmicas e abriga cerca de

15 a 20% de toda a biodiversidade mundial (BARREIRO & BOLZANI, 2009), sendo

um dos países com maior índices de diversidades do mundo (FIORAVANTI, 2006).

Estima-se que no mundo existam mais de 20 mil espécies de abelhas e o

Brasil, devido a suas proporções continentais e sua riqueza de ecossistemas, pode

ser considerado privilegiado neste aspecto, uma vez que abriga cerca de ¼ destas

espécies (SANTOS, 2002).

As abelhas são consideradas como os mais importantes e especializados

polinizadores (DANFORTH et al., 2006), realizando indispensável serviço de

polinização nos ecossistemas terrestres (KLEIN et al., 2007). Tal serviço é essencial

na reprodução de diversas angiospermas e normalmente aumenta a produção de

muitas plantações, além de manter a biodiversidade vegetal local (KLEIN et al.,

2007).

A relação entre os seres humanos e as abelhas é milenar, com registros ao

longo de toda a história da humanidade, como pinturas rupestres que datam de

6.000 a. C., que retratam seres humanos coletando mel em colmeias

(BERENBAUM, 1995). Os egípcios no ano de 2.400 a. C. já criavam abelhas em

potes de barro (GUEDES, 2005), enquanto cilindros de argila crus semelhantes a

colmeias tradicionais encontrados recentemente em Israel sugerem que a apicultura

já era uma prática agrícola bastante elaborada há 3.000 anos (BLOCH, 2010).

Desde os primórdios desta relação, as abelhas já assumiam tamanha

importância para o homem, que eram consideradas sagradas para muitas

civilizações. Com o tempo, elas também assumiram grande importância econômica

e foram consideradas como símbolo de poder para reis, rainhas, papas, cardeais,

duques, condes e príncipes, fazendo parte de brasões, cetros, coroas, moedas e

mantos reais (PEREIRA et al., 2002). Na Grécia antiga tão grande era sua

importância que as abelhas eram estampadas nas moedas “Tetradracme”

(GONÇALVES, 1975).

Atualmente sabe-se que as abelhas são responsáveis por 70% da polinização

das culturas agrícolas utilizadas no mundo, com destaque para as plantações de

amêndoas onde são responsáveis por 100% da polinização e as culturas de maçãs,

Introdução | 11

cebolas, cenouras, brócolis e mirtilo em que são responsáveis por 90% da

polinização, além de várias outras, como pêssego (48%), laranja (27%), algodão

(16%), soja (5%) e diversas outras (MORSE & CALDERONE, 2000; JOHNSON,

2011).

No Brasil, culturas dependentes da polinização por abelhas, como melão

(Cucumis melo), café (Coffea arabica), maracujá (Passiflora edulis), laranja (Citrus

spp.), soja (Glycine max), caju (Anacardium occidentale), maçã (Malus domestica) e

algodão (Gossypium spp.) são de extrema importância para a economia nacional,

tanto por seu valor na balança comercial para exportação quanto para atender a

demanda do mercado interno (FREITAS, 2005).

Outros estudos brasileiros mostram que a introdução de abelhas para a

polinização direcionada em cultivos aumenta a colheita em várias outras culturas,

como, por exemplo, em plantações de mamona (Ricinus communis L) em que a

introdução de abelhas Apis mellifera proporcionou um aumento de 17% na produção

de frutos e 30% na produção de sementes (RIZZARDO, 2012). Em pomares de

acerola (Malpighia emarginata) a introdução da abelha Centris analis também

proporcionou ganhos reais em produtividade, houve aumento da produção em 1,798

kg/ha (MAGALHÃES, 2013). Em plantações de laranja (Citrus sinensis) a introdução

de abelhas Africanizadas aumentou a produção em cerca de 30% e resultou em

frutos mais doces (TOLEDO et al., 2013).

Esses dados mostram que é possível aumentar a produtividade e,

consequentemente, a rentabilidade utilizando polinizadores ao invés de expandir a

área plantada, podendo esta ser uma alternativa rentável para o produtor, além de

ser uma opção ecologicamente mais recomendável do que o desmatamento de

novas áreas para o aumento das áreas plantadas.

Justamente por causa da já descrita importância das abelhas para a

manutenção dos ecossistemas e consequentemente para a humanidade, é que o

fenômeno conhecido mundialmente como “distúrbio do colapso das colônias” (em

inglês, Colony Collapse Disorder, CCD) tem causado apreensão nos últimos anos.

Os relatos mais comuns são de apicultores que, ao abrir suas colmeias, encontram-

nas cheias de mel, cera, e até com massiva presença de imaturos e da rainha,

porém desprovidas de abelhas operárias adultas (ORTH & MATOS, 2000;

JOHNSON, 2011).

Introdução | 12

Nos EUA a situação é alarmante, uma vez que foram registradas perdas de

32% das colônias de Apis mellifera no inverno de 2006-7, 36% no inverno de 2007-

8, 29% no inverno de 2008-9, 34% no inverno de 2009-10 e 30% no inverno de

20010-11 (VANENGELSDORP et al., 2007, 2010, 2012). No inverno de 2012, um

terço das colônias de abelhas Apis mellifera morreu ou desapareceu, valor este

acima do registrado no ano anterior e bem maior do que os 10% a 15% de perdas

ou mortes consideradas normais durante os invernos (WALSH, 2013).

Até o momento, acredita-se que a CCD seja causada por uma combinação de

diversos fatores, entre eles as alterações no agroecossistema, as diversas doenças,

tais como as moscas parasitas Apocephalus borealis que causam desorientação e

perda de equilíbrio nas abelhas parasitadas. Também pode ser considerada a

nutrição das abelhas, onde um estresse nutricional devido à utilização da polinização

em monoculturas pode acarretar alterações no sistema imunológico das abelhas. E

principalmente aos pesticidas agrícolas da família dos neonicotinoide (DE JONG &

MESSAGE, 2008; FAROOQUI, 2013).

Costa et al., (2014) avaliaram a toxicidade de inseticidas utilizados na cultura

do melão (Cucumis melo L.) em adultos de A. mellifera. Os resultados indicaram que

todos os inseticidas de alguma forma foram prejudiciais aos adultos desta abelha:

Os inseticidas Tiametoxam (neonicotinoide), Abamectin, Acetamiprida

(neonicotinoide), Deltametrina, Cloridrato de Cartape e Chlorfenapyr quando

aplicados diretamente sobre as abelhas, foram extremamente tóxicos para adultos

de A. mellifera, causando alta mortalidade (80% a 100%); o inseticida Pyriproxyfen

causou mortalidade moderada (30%); os inseticidas Ciromazina e Flufenoxuron

causaram baixa mortalidade aos adultos de A. mellifera (<20%). Estes resultados

indicam que os inseticidas podem estar entre os principais causadores do atual

desaparecimento das abelhas.

Em 1956, a subespécie africana Apis mellifera scutellata foi introduzida no

Brasil pelo Professor Warwick Estevam Kerr. Ele trouxe 133 rainhas africanas para

iniciar um programa de seleção genética em Rio Claro - SP. Apenas 48 rainhas

sobreviveram a viagem para o Brasil, as quais foram introduzidas em ninhos e

colocadas em quarentena no Horto Florestal de Camacuã, para posterior avaliação

comportamental e de produtividade. Entretanto, após algum tempo, 26 enxames,

com suas respectivas rainhas, acidentalmente escaparam e iniciaram uma série de

cruzamentos com as demais subespécies de abelhas melíferas de origem europeia

Introdução | 13

que haviam sido introduzidas nos séculos anteriores, principalmente A. m. ligustica,

A. m. mellifera e A. m. carnica. (KERR, 1967).

Esta série de cruzamentos levou ao surgimento de populações poli-hibridas,

que foram denominadas Africanizadas. Nestas abelhas predominaram as

características das abelhas africanas, tais como a alta capacidade de defesa, de

adaptação a ambientes adversos e a capacidade de reprodução com ciclo de vida

mais curto que as demais subespécies aqui previamente introduzidas

(GONÇALVES, 1994). Neste híbrido predominou também o comportamento

enxameatório, muito comum na subespécie africana. A enxameação reprodutiva é

um processo natural que permite a multiplicação e dispersão dos enxames no

ambiente, esta ocorre em condições ambientais ótimas, onde o desenvolvimento da

população cresce além do espaço físico do ninho. Sendo assim, grande parte das

operárias junto com a rainha velha, ou com uma nova rainha, saem do ninho para

procurar um novo local para a nidificação (FREE, 1980).

Além da enxameação reprodutiva existem outros tipos, como a migratória e

por abandono, em que ocorre a saída em massa dos indivíduos da colônia, em

resposta a algum nível de stress generalizado (HEPBURN et al., 1998). Em abelhas

Africanizadas, este processo acontece em maior escala quando comparado com as

abelhas europeias. No Brasil, em um ano, a enxameação pode ocorrer cerca de 3 a

4 vezes, dependendo da região do ano (CORREIA-OLIVEIRA et al., 2012). Essas

abelhas conseguem migrar a uma velocidade de 400-500 km por ano (SOARES,

2012). O processo de enxameação é intensificado em regiões com clima instável e

com falta de alimento, como por exemplo, no Nordeste brasileiro, onde, durante a

estação seca, ocorre uma escassez de pasto apícola e, consequentemente, de

alimento para as abelhas (FREITAS,1991; LIMA, 1995).

Estas características permitiram uma rápida ampliação da biomassa e

significativo aumento populacional com ocupação de território, sendo que, em

menos de 50 anos, estas abelhas ocuparam quase todos os países do continente

americano, exceção feita ao Chile e o Canadá (GONÇALVES, 1994).

O Brasil, devido às suas proporções continentais apresenta ao longo de seu

território diferentes zonas climáticas. Uma classificação simples e muito utilizada

para os diferentes tipos de clima do Brasil é a criada por Arthur Strahler (1951)

(Figura 1), que se baseia na origem, natureza e movimentação das correntes e

massas de ar (Tabela 1).

Introdução | 14

Figura 1: Mapa da classificação climática de Strahler (1951) para o Brasil

Tabela 1: Climas do Brasil segundo a classificação de Arthur Strahler (1951).

Clima Localidade Características

Clima Litorâneo Úmido Regiões litorâneas do Sudeste e Nordeste

Alta umidade durante todo o ano, temperaturas elevadas no verão e amenas no inverno.

Clima Equatorial Região da Amazônia Temperaturas elevadas durante todo o ano, alta umidade, índice pluviométrico em torno de 2.500 mm anuais.

Clima Tropical Brasil central Estações bem definidas, com invernos secos e verões úmidos, índice pluviométrico anual de 1.500 mm.

Clima Semiárido Sertão Nordestino

Baixa umidade, chuvas irregulares, pluviosidade média inferior a 1.000 mm/ano, temperaturas altas durante todo o ano.

Clima Subtropical Úmido SC, RS e a parte sul de SP e PR.

Verões quentes e úmidos e invernos frios, com Chuvas bem distribuídas durante todo o ano, o índice pluviométrico anual é inferior a 2.000 mm.

Introdução | 15

Essas diferenças no clima acabam por refletir diretamente na estrutura

genética populacional dos organismos que se estabeleceram nestas regiões. Isto já

foi demostrado por alguns autores, como no trabalho de Nunes (2012) onde foi

observada a formação de grupos distintos de Apis mellifera em diferentes regiões do

Brasil. Diniz-Filho & Malaspina (1995) utilizaram morfometria tradicional e verificaram

variações populacionais na distribuição da abelha Africanizada no Brasil. Tan et al.,

(2006) demostraram grande variedade morfológica em abelhas A. cerana

associadas as diversidades ecológicas na China. Diniz-Filho et al., (2000)

observaram variações em subespécies de Apis mellifera entre populações locais na

África referente a sua distribuição em diferentes climas.

Devido às características vantajosas, em clima tropical, da abelha

Africanizada em comparação com as características das abelhas europeias, estas

se tornaram interessantes para várias atividades econômicas e essenciais para a

apicultura no Brasil. A importância da apicultura é conhecida já há muito tempo,

especialmente pelas repercussões positivas que tem sobre a economia agrária em

geral, pois, além de realizar a polinização de muitas plantas cultivadas, geram lucro

com a produção de mel, geleia real, cera, própolis e pólen (TRINDADE et al., 2004).

O Brasil é o 11º maior produtor mundial de mel e o 5º maior exportador. Em

2011, produziu cerca de 41 mil toneladas de mel, sendo que 16,9 mil toneladas

foram produzidas pelo Nordeste que ocupou a posição de maior produtor de mel do

país (Tabela 2) (SEBRAE, 2014).

Na Paraíba, apesar da região ser sacrificada pela instabilidade climática, é

notável o crescimento e o espaço que a Apicultura vem ocupando no sertão deste

Estado (SOUSA et al., 2012). Em 2011 foram produzidas 303 toneladas de mel

(IBGE, 2014). Segundo dados do IBGE 2008, o Sergipe ocupa a 21ª posição no

ranking nacional e 9ª no Nordeste brasileiro. A sua produção no ano de 2011 foi de

114 toneladas de mel. O Estado do Piauí aparece nas estatísticas do IBGE como o

maior produtor de mel de abelha da região do Nordeste, em 2011 produziu mais de

cinco mil toneladas de mel. Em Alagoas o índice também é crescente, o Estado, que

antes não aparecia nas estatísticas do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

(IBGE), em 2011 já se encontrava à frente do Sergipe com 213 toneladas de mel

(SEBRAE, 2014). O Rio Grande do Norte apareceu como o 10º maior produtor de

mel do país em 2008, uma posição acima do ranking de 2007. A região produziu mais

de 900 toneladas em 2011 (SEBRAE, 2014).

Introdução | 16

Tabela 2: Produção de mel no Brasil em 2011 (SEBRAE, 2014).

Grandes Regiões e Unidades da Federação Quantidade de mel produzido em 2011 (toneladas)

Brasil 41 578

Norte 945

Rondônia 185

Amazonas 48

Roraima 132

Pará 414

Amapá 8

Tocantins 153

Nordeste 16 910

Maranhão 1 107

Piauí 5 108

Ceará 4 165

Rio Grande do Norte 904

Paraíba 303

Pernambuco 2 350

Alagoas 213

Sergipe 114

Bahia 2 646

Sudeste 6 151

Minas Gerais 3 076

Espírito Santo 463

Rio de Janeiro 383

São Paulo 2 229

Sul 16 154

Paraná 5 179

Santa Catarina 3 990

Rio Grande do Sul 6 985

Centro-Oeste 1 415

Mato Grosso do Sul 686

Mato Grosso 379

Goiás 334

Introdução | 17

Porém, em 2012, o clima adverso impediu boas floradas e provocou uma

grande perda de enxames por abandono da colmeia, situação verificada desde o

Piauí até a Bahia. As perdas de enxames foram mais acentuadas para o Rio Grande

do Norte (82%), Pernambuco (70%), Paraíba (80%), Ceará (75%), Piauí (70%) e

Bahia (60%). (UNAMEL, 2013)

O período de chuvas no Nordeste brasileiro é normalmente distribuído no

período entre os meses de fevereiro a maio, porém nessa época em 2012 ocorreu o

inverso (Figura 2) A imagem evidencia claramente que neste período o índice de

precipitação em todo o território do Nordeste foi classificado como Seco, Muito Seco

ou Extremamente Seco (SANTOS et al., 2012)

Figura 2: Classificação da precipitação no Brasil através da técnica de Quantis (Fonte: INMET, 2012.).

Introdução | 18

Segundo dados da Secretaria Nacional de Defesa Civil quase todos os

município em todos os estado da região Nordeste foram afetados de alguma forma

pela estiagem. A tabela a seguir (Tabela 3) mostra quantitativamente a situação de

emergência em cada estado segundo dados da Defesa Civil (SANTOS et al., 2012).

Tabela 3: Tabela referente à quantidade de municípios em situação de emergência por conta da estiagem no Nordeste.

Estado (UF) N° de municípios em situação de emergência

Alagoas 36

Paraíba 196

Piauí 178

Rio Grande do Norte 141

Sergipe 20

Entretanto, mesmo com todas as adversidades climáticas encontradas na

região, seu grande potencial para a apicultura, aliado ao alto comportamento

enxameatório, seja de abandono ou reprodutivo, tornam esta região um bom

candidato para o entendimento da dinâmica populacional das abelhas Africanizadas.

Desde o início da expansão das abelhas Africanizadas em 1956, estas

ganharam foco nas pesquisas cientificas com objetivo primordial de entender sua

biologia, inicialmente com o intuito de favorecer os apicultores, e, mais

recentemente, compreender sua dinâmica populacional e a estruturação de sua

variabilidade genética, visando á aplicação destes dados no entendimento do

processo de Africanização destas abelhas no continente Americano e na utilização

destes dados para a seleção de matrizes de abelhas com características desejáveis

para a apicultura (FRANCOY et al., 2008).

Para tal finalidade, evidências morfométricas e mitocondriais têm sido

comumente utilizadas para a realização de estimativas quanto à composição

genética de abelhas Africanizadas em populações da América do Sul (COLLET et

al., 2006).

A morfometria tradicional é caracterizada pelo estudo da variação e

covariação de medidas lineares. Geralmente medidas de comprimento e largura de

estruturas, além de ângulos são utilizadas (ROHLF & MARCUS, 1993). Neste

Introdução | 19

contexto, a morfometria tradicional é o estudo sobre como e quanto estas medidas

variam, e de como e quão relacionadas elas estão entre si. Após a coleta dos dados,

as medidas são analisadas de acordo com técnicas bem estabelecidas, como

Análise de Componentes Principais, Análise de Fatores, Regressões Múltiplas e

Análises Discriminantes, entre outras (MORAES, 2003).

Diversos trabalhos já foram realizados utilizando técnicas de morfometria

tradicional para diferentes finalidades apresentando resultados bastante

satisfatórios.

Em 1978 Ruttner et al., publicou um guia de medidas de morfometria

tradicional, onde descreve 40 caracteres por abelha, as análises estatísticas de seu

trabalho foram realizadas utilizando 33 caracteres de 404 amostras de abelhas, seus

resultados são até hoje utilizados como referencia para trabalhos de morfometria.

Amssalu et al., (2004) utilizaram treze medidas morfométricas em diferentes

subespécies de A. mellifera que revelou a existência de cinco diferentes grupos

presentes em cinco ambientes ecologicamente diferentes na Etiópia (Apis mellifera

jemenitica presente no noroeste e nas planícies áridas e semiáridas do leste; A. m.

scutellata no oeste, sul e região central úmida do sudoeste; Apis mellifera bandasii

nas terras altas centrais úmidas; Apis mellifera monticola nos planaltos montanhosos

do norte e a Apis mellifera woyi-gambell presente no sudoeste do país). Meixner et

al., (2007) utilizaram 38 caracteres morfométricos para mensurar os limites de

distribuição de A. m. mellifera na Europa Oriental. Kamel et al., (2013) utilizaram 23

medidas morfológicas em A. mellifera para verificar alterações em alguns caracteres

morfológicos de rainhas recém-emergidas, a fim de melhorar as suas características

de qualidade. Meixner et al., (2011) caracterizaram uma nova subespécies de A.

mellifera (A. m. simensis n. ssp) ao utilizar 38 caracteres morfológicos em abelhas

da Etiópia.

Apesar da consagração e efetividade da morfometria tradicional, o

desenvolvimento de novas técnicas tende a enriquecer o entendimento dos

organismos. Além disso, um conjunto de distâncias lineares é normalmente

insuficiente para capturar a geometria do objeto original, perdendo assim alguns

aspectos da forma (ADAMS et al., 2004). Portanto para se compreender a

complexidade do organismo estudado é sempre mais eficiente utilizar mais do que

uma técnica de análise.

Introdução | 20

A morfometria geométrica se caracteriza por ser uma técnica rápida e de

baixo custo e seu uso na identificação e avaliação da diversidade em populações de

abelhas tem se mostrado bastante efetivas (FRANCOY & IMPERATRIZ-FONSECA,

2010). Tal metodologia é baseada no uso de marcos anatômicos homólogos nas

asas anteriores, de forma que permitam identificar variações nos padrões de

venação das asas entre espécies (ROHLF & MARCUS, 1993) e identificação de

variações de forma nos diferentes exemplares de uma mesma espécie (ROHLF,

1998).

A vantagem do uso das coordenadas Cartesianas dos marcos anatômicos em

relação a medidas lineares, é que estas incluem informação sobre as posições

relativas, e deste modo permitem a reconstrução da forma estudada (ROHLF &

MARCUS, 1993). Além disso, é possível, através das grades de deformação,

identificar a região da asa que mais contribuiu para a discriminação (TOFILSKY,

2008).

Vários são os trabalhos realizados utilizando a morfometria geométrica como

ferramenta, tanto na identificação de espécies quanto na diferenciação de grupos de

uma mesma espécie, em abelhas com e sem ferrão.

No estudo de Francoy et al., (2009) foram usadas características

morfométricas extraídas das asas de machos e operárias de abelhas sem ferrão que

se mostraram muito informativas para discriminar as cinco espécies examinadas. No

trabalho de Francoy et al., (2008) houve a identificação de abelhas Africanizadas e

suas subespécies ancestrais. Tofilski (2008) utilizou a morfometria geométrica para

discriminar 3 subespécies de A. mellifera. Mendes et al., (2007) utilizaram a

morfometria na identificação de indivíduos de diferentes populações de abelhas sem

ferrão da espécie Nannotrigona testaceicornis.

Bonatti et al., (2014) ao analisar abelhas Melipona subnitida no Nordeste

brasileiro através da morfometria geométrica encontrou diversidade entre as regiões

amostras, diversidade esta que se mostrou relacionada tanto com o ambiente em

que as amostras foram coletadas quanto com a distância geográfica entre os locais

de coleta. Francoy et al., (2012) através de métodos morfométricos baseados em

marcos anatómicos e contorno celular classificou corretamente 91% das amostras

de cinco espécies de Euglossa. No trabalho de Grassi (2009), ao se analisar

discriminação de 26 subespécies de A. mellifera a morfometria geométrica foi capaz

de acertar 99,5% nas análises discriminantes por colônia.

Introdução | 21

Abou-Shaara (2012) conseguiu discriminar abelhas A. m. jementica de

abelhas A. m. carnica na Arábia Saudita através do uso de 18 marcos anatômicos

da asa anterior. Miguel et al., (2010) afirma que o uso da morfometria geométrica se

mostrou mais apropriado do que a análise molecular do DNA mitocondrial na

identificação da presença da linhagem Africana em populações de abelhas ibéricas

(A. m. iberiensis).

A morfometria geométrica também se mostrou muito eficiente no

reconhecimento de espécies crípticas do gênero Eubazus e Bombus (VILLEMANT et

al., 2007; AYTEKIN et al., 2007), indicando que tal técnica apresenta sensibilidade

suficiente para reconhecer espécies morfologicamente similares.

A análise do DNA mitocondrial tem se mostrado muito útil por permitir a

obtenção de polimorfismos genéticos diretamente do DNA, resultando em um rápido

e preciso estudo da variabilidade existente (FALEIRO, 2007). As análises de DNA

mitocondrial provaram ser de fácil amplificação e sequenciamento, e, com isso, vêm

sendo amplamente utilizadas em estudos filogenéticos e sendo muito úteis na

resolução de questões relativas à dinâmica e estrutura de populações, delimitação

de espécies e subespécies (BESANSKY & FAHEY, 1997; GONÇALVES, 2010) e

também na elucidação da história evolutiva dos grupos (BONATTI et al., 2014).

Isso se deve, principalmente, ao fato da molécula de DNA mitocondrial

apresentar algumas características peculiares e únicas como o fato de ser um

genoma pequeno e circular, ser de herança materna e com ausência de

recombinação, possuir poucos genes, ser um genoma compacto, que raramente

possui sequências espaçadoras, sequências repetitivas, pseudogenes e íntrons.

Além disso, apresenta o conteúdo gênico bastante conservado, e a ordem em que

esses genes se encontram organizados no genoma costuma ser também

conservada, além de possuir alta taxa evolutiva quando comparada a do genoma

nuclear (ARIAS et al., 2003).

O DNA mitocondral evolui de forma mais rápida que o DNA nuclear por

diversas razões, tais como, o fato da mitocôndria possuir em seu interior um

ambiente corrosivo rico em compostos de oxigênio, não possuir um mecanismo de

reparo eficiente, possuir sequências que acumulam mais substituições nucleotídicas,

uma vez que não codificam proteínas diretamente envolvidas em sua replicação,

transcrição e tradução e, finalmente, por não possuir histonas para a estocagem de

seu material genético (AVISE, 2009).

Introdução | 22

O genoma mitocondrial possui de 16 a 20 quilobase (Kb) nos animais (AVISE

et al., 1987). Contêm 37 genes, todos envolvidos na produção de energia e no

estoque de ATP na célula, sendo: dois genes para as subunidades ribossômicas

(12S e 16S); três para as subunidades da enzima citocromo oxidase (COI, II e III);

um para o citocromo B; dois para as subunidades da enzima ATPase (subunidades

6 e 8); e sete para as subunidades da enzima NADH desidrogenase, o restante dos

genes codificam RNAs transportadores (22 genes) (Figura 3).

Figura 3: Mapa do genoma mitocondrial de A. mellifera (FRANCISCO, 2012).

Dentre todos os genes mitocondriais os mais eficientes para trabalhos de

filogenia têm sido os genes codificadores de proteína por não possuírem

inserções/deleções (indels) que prejudicam o alinhamento das sequências (HEBERT

et al., 2003a). Padrões na curta região intergênica entre os genes mitocondriais da

Citocromo Oxidase I e II provaram ser uma boa ferramenta para a caracterização de

linhagens evolutivas em A. mellifera (FERREIRA, 2009).

Em A. mellifera Kandemir et al., (2006) ao trabalhar com análise de restrição

da região intergênica COI-COII de 334 colônias de abelhas de sete regiões

geográficas diferentes da Turquia obteve sete haplótipos diferentes dentro das

Introdução | 23

linhagens A, C e O. Magnus et al., (2014) obteve 23 haplótipos (linhagens A, C e O)

das 247 amostras coletadas de 12 Estados nos Estados Unidos a partir da região

do DNA mitocondrial COI-COII (530 a 1.230 pb).

Dentre os genes mitocondriais codificadores de proteínas, o Citocromo

Oxidase I (COI) possui a menor taxa de evolução, sendo muito conservado em

relação à evolução dos aminoácidos (SIMON et al., 1994). No entanto, mostra

variação suficiente para diferenciação entre as espécies a nível nucleotídeo

(WAUGH, 2007).

Em 2003, uma nova abordagem utilizando a região COI para a identificação

de espécies foi proposta por Hebert et al., (2003) e denominada código de barras de

DNA (Barcode). A proposta é baseada na premissa que as diferenças

interespecíficas (maior que 3%) na sequência dos genes são maiores que as

diferenças intraespecíficas (menor que 1% e raramente maior que 2%). A aplicação

do código de barras de DNA tem provado cada vez mais ser uma poderosa

ferramenta para reduzir incertezas taxonômicas (MURRAY et al., 2007). O método

de Barcode possui etapas padronizadas para todos os tipos animais, consiste no

sequenciamento da curta região de aproximadamente 650 pares de bases do início

do gene COI e da comparação destas sequências entre os grupos (HEBERT et al.,

2004; WARD et al., 2005; HEBERT et al., 2005)

Essa padronização traz vantagens para diversas áreas do conhecimento,

como agricultura (identificação de pestes), biomedicina (identificação de patógenos e

vetores de doenças) e ecologia (SAVOLAINEN et al., 2005) Em insetos a vantagem

dessa padronização é a possibilidade de identificação em qualquer estágio de vida,

já que, a discriminação morfológica de espécies em insetos é bastante complexa e

exige várias chaves diferentes para os diversos estágios de vida. Com o Barcode o

processo é o idêntico para todos os estágios

Um Banco de Dados com todas as espécies que já foram sequenciadas está

disponível em http://www.barcodinglife.org/. Existe também uma campanha global

para a utilização do DNA Barcode em abelhas (www.bee-bol.org).

Apesar da maioria dos trabalhos de variabilidade genética com DNA

mitocondrial em A. mellifera utilizar a região interagência COI-COII, o gene COI

também tem apresentados ótimos resultados nos estudos de variabilidade genética

intraespecífica. Ferreira et al., (2013) utilizaram um fragmento de 600-650-bp da

região COI que revelou a presença de oito haplótipos diferentes entre as populações

Introdução | 24

da abelha solitária Centris aenea. No trabalho de Bonatti et al., (2014) utilizando o

gene COI foram encontrados nove haplótipos nas populações de Melipona subnitida

no Nordeste brasileiro. Em A. mellifera, Stevanovic et al., (2010) constatou que as

abelhas da parte norte da Sérvia diferem das abelhas do leste, sul e sudoeste do

país.

Portanto, ao considerar as diferentes realidades fito-fisiográficas presentes no

Nordeste brasileiro e a importância da abelha A. mellifera para este local, podemo

verificar a importância da avaliação da variabilidade genética das abelhas ocorrentes

nesta área, uma vez que diferentes ecótipos, possivelmente importados juntamente

com as abelhas originalmente trazidas para o Brasil, podem estar adaptados a estas

diferentes regiões.

Objetivos

Objetivos | 26

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivos gerais

Este trabalho teve por objetivo caracterizar e mapear a variabilidade genética

das abelhas Africanizadas A. mellifera no Nordeste brasileiro, visando o

entendimento de sua dinâmica populacional e a distribuição geográfica desta

variabilidade com a finalidade de fornecer subsídios para sua conservação, manejo

e uso sustentável.

2.2 Objetivos específicos

Caracterizar e reconhecer a variabilidade populacional das abelhas A.

mellifera no Nordeste brasileiro considerando suas diferentes regiões;

Caracterizar morfometricamente estas populações, para verificação da

existência de possíveis ecótipos localmente adaptados;

Verificar a existência de diferenças entre os haplótipos mitocondriais

encontrados no litoral (região mais úmida) e no interior (semi-árido).

Entender o processo da dinâmica populacional e do fluxo gênico entre as

populações, de modo a fornecer subsídios para a determinação de

estratégias para o desenvolvimento de programas de melhoramento genético

e preservação desta espécie.

Material e Métodos

Material e Métodos | 28

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Material biológico

Foram coletadas amostras em apiários de abelhas Africanizadas de diferentes

localidades no Nordeste brasileiro. No total foram coletadas abelhas de 124 colônias

em 19 localidades, sendo 47 no Piauí, 27 no Rio Grande do Norte, 19 no Alagoas,

20 no Sergipe e 11 na Paraíba (Tabela 5). Todas as amostras foram coletadas no

período de seca no ano de 2012 (entre Outubro e Dezembro), com exceção do

estado da Paraíba que tiveram suas amostras coletadas em Setembro de 2012.

Além destas, foram também coletadas amostras de 37 colônias na cidade de

Mossoró durante a época de chuvas na região (Março de 2013). Todas as amostras

foram identificadas e acondicionadas em frascos contendo álcool absoluto até sua

chegada ao laboratório, onde as amostras foram individualizadas e armazenadas a -

20 oC em freezer.

Tabela 5: Localidades, coordenadas geográficas e quantidades de amostras de Apis mellifera coletadas.

LOCALIDADE COORDENADAS GEOGRÁFICAS

CLIMA PLUVIOSIDADE MÉDIA QUANTIDADE

São Raimundo Nonato (PI) 9° 0' 54'' S 42° 41' 50'' W Semiárido 697 mm 14

Parnaíba (PI) 9° 6' 41'' S 45° 55' 50'' W Tropical 1.064 mm 13

Bela Vista (PI) 7° 58′ 58″ S 41° 52′ 40″ W Semiárido 847 mm 16

Isaias Coelho (PI) 7° 44' 16'' S 41° 40' 45'' W Semiárido 847 mm 4

Mossoró Chuvas (RN) 5° 11' 17'' S 37° 20' 39'' W Semiárido 765 mm 37

Mossoró (RN) 5° 11' 17'' S 37° 20' 39'' W Semiárido 765 mm 20

Macaíba (RN) 5° 51′ 36″ S 35° 20′ 59″ W Litorâneo Úmido 1.442 mm 2

São Paulo do Potengi (RN) 5° 53' 44'' S 35° 45' 29'' W Litorâneo Úmido 1.750 mm 5

Rio Largo (AL) 9° 28' 49'' S 35° 51' 29'' W Litorâneo Úmido 1.634 mm 8

Barra de Sto Antônio (AL) 9° 24′ 58″ S, 35° 30′ 33″ W Litorâneo Úmido 1.634 mm 5

Murici (AL) 9° 18' 18'' S 35° 56' 30'' W Litorâneo Úmido 1.309 mm 2

Maceió (AL) 9° 39′ 59″ S 35° 44′ 6″ W Litorâneo Úmido 1.570 mm 1

Joaquim Gomes (AL) 9° 6' 60'' S 35° 44' 15'' W Litorâneo Úmido 1.634 mm 3

Brejo Grande (SE) 10° 25' 38'' S 36° 28' 12'' W Litorâneo Úmido 1.650 mm 7

São Cristóvão (SE) 11° 0' 49'' S 37° 13' 21'' W Litorâneo Úmido 1.372 mm 13

Baraúna (PB) 5° 4′ 14″ S, 37° 37′ 2″ W Semiárido 750mm 2

Cuité (PB) 6° 28′ 54″ S, 36° 8′ 59″ W Semiárido 735 mm 2

Taperoá (PB) 13° 32′ 18″ S, 39° 6′ 1″ W Semiárido 503 mm 5

Maturéia (PB) 7° 15′ 59″ S, 37° 20′ 57″ W Semiárido 726 mm 1

João Pessoa (PB) 7° 6′ 55″ S, 34° 51′ 40″ W Litorâneo Úmido 1.874 mm 1


3.2 Análises Morfométricas

Tanto para a morfometria geométrica quanto para a morfometria tradicional

foram utilizadas as mesmas amostras e as mesmas quantidades.

Primeiramente foi realizada uma análise na qual as localidades de origem das

amostras foram utilizadas classificador. Somente as amostras coletadas na época

da seca foram analisadas, ou seja, abelhas de 124 colônias das 19 localidades. Uma

análise adicional, na qual utilizamos as colônias como objeto de análise também foi

realizada. Para tanto, as médias de cada medida foram obtidas de todas as abelhas

de uma mesma colônia.

Os diferentes climas presentes na área amostrada também foram utilizados

como classificador nas análises morfométricas. Nesta análise utilizamos exatamente

as mesmas 124 amostras, porém incluímos as 37 amostras de Mossoró coletadas

na época das chuvas em três das quatro análises feitas, tendo sido utilizadas,

portanto, 161 colônias, sendo: 101 ninhos da região do Semiárido, 47 ninhos da

região classificada como Litorâneo Úmido e 13 ninhos provenientes da região

Tropical.

3.2.1 Morfometria geométrica

As amostras, compreendidas por cinco operárias adultas de cada colônia

amostrada, foram analisadas quanto ao padrão de venação das asas anteriores.

Para tal finalidade, a asa anterior direita de cada indivíduo foi retirada com o auxílio

de pinças e montada entre lâmina e lamínula.

Estas asas tiveram sua imagem capturada por uma câmera digital acoplada a

um estereomicroscópio e foram armazenadas como arquivo digital em um

computador.

Posteriormente, com a auxílio do software tpsUtil versão 1.40 (ROHLF,

2008a), foi criado um arquivo .tps a partir das imagens das asas. Este arquivo foi

futuramente utilizado como banco de dados, onde as coordenadas Cartesianas de

cada marco anatômico (landmarks) foram armazenadas. Com o auxílio do software

tpsDig versão 2.12 (ROHLF, 2008b), 19 marcos anatômicos foram manualmente

marcados nas junções de nervuras das células de cada asa (Figura 4).


Figura 4: Asa anterior direita de operária. Os pontos em branco representam o posicionamento dos marcos anatômico nas junções das nervuras (FRANCOY et al., 2008).

3.2.2 Morfometria tradicional

Para os estudos de morfometria tradicional foram tomadas medidas lineares e

angulares da asa anterior direita de cinco abelhas adultas por colônia através de

uma câmera digital acoplada a um estereomicroscópio. As medidas foram realizadas

de forma digital com o auxílio do software TSView. Os caracteres alares mensurados

foram baseados no guia de medidas publicado por Ruttner e colaboradores, em

1978; foram utilizadas medidas do comprimento da asa, largura da asa e 11 ângulos

(Figura 5 e 6).

Figura 5: Medidas lineares (comprimento e largura) de uma asa de Apis mellifera segundo o guia de medidas publicado por Ruttner em 1978.


Figura 6: Medidas dos 11 ângulos de uma asa de Apis mellifera segundo o guia de medidas publicado por Ruttner em 1978.

3.3.3 Análises estatísticas

As análises de morfometria geométrica que utilizaram os indivíduos como

base dos testes foram realizadas pelo programa MorphoJ versão 1.03

(KLINGENBERG, 2011).

A análise no MorphoJ é baseada nas deformações parciais e nos

componentes uniformes X e Y. A partir dos 19 marcos anatômicos marcados nas

nervuras das asas, as imagens das asas são redimensionadas para um tamanho

uniforme, sobrepostas com base em seus centróides e rotacionadas para

produzirem um alinhamento ideal, onde o somatório das distâncias entre os marcos

anatômicos homólogos seja a menor possível, eliminando assim os efeitos de

tamanho das estruturas e fazendo com que as análises fiquem baseadas

exclusivamente na forma das estruturas.

A média de todas estas configurações é calculada, e o processo de rotação,

sobreposição e redimensionamento é repetido, sobrepondo as formas a esta média.

As deformações parciais (partial warps) são vetores relacionados à variação das

coordenadas dos landmarks de cada indivíduo com a média, baseando-se na

energia gasta para que esta deformação ocorra, gerando assim as grades de

deformação.


Desta forma, a partir dos resíduos de Procrustes, que nada mais são do que

os valores das deformações parciais na qual a informação da forma é extraída, foi

gerada uma matriz de covariância e os dados obtidos foram usados como variáveis

para análises multivariadas, tais como a Análise de Componente Principal (PCA),

Análise de Variáveis Canônicas (CVA) e a Análise da Função Discriminante (DFA).

As análises de morfometria geométrica utilizando as médias dos ninhos como

base dos testes e as análises da morfometria tradicional foram realizadas pelo

software STATISTICA 7.0 (STATSOFT, 2001) com base nos valores médios das

deformações parciais e dos componentes uniformes X e Y dos indivíduos

pertencentes à mesma colônia. A partir destes dados também foram realizadas

análises multivariadas, tais como a Análise de Componente Principal (PCA) e a

Análise de Variáveis Canônicas (CVA) e a Análise da Função Discriminante (DFA).

Os testes de validação cruzada para todos os casos foram realizados através do

software SPSS 15.0 (SPSS Inc.)

A Análise de Componente Principal é utilizada para examinar as

características principais de variação na forma de uma amostra, sendo uma análise

de ordenação, cujo objetivo é examinar o arranjo das amostras no morfoespaço sem

considerar sua origem (KLINGENBERG, 2011).

A Análise de Variáveis Canônicas é uma função de análise multivariada com

a finalidade de discriminar grupos em conjunto de dados. Através de combinações

lineares é possível analisar a similaridade ou a dissimilaridade de grupos em

conjunto de dados, sendo então um dos tipos mais comuns de análise em

morfometria (KLINGENBERG, 2011).

A Análise da Função Discriminante é um método para obter regras de decisão

ótimas para grupos distintos, é usada para se obter a probabilidade de classificação

correta e incorreta entre os grupos (KLINGENBERG, 2011).

O teste de Validação Cruzada é uma análise realizada “as cegas” para se

obter a probabilidade de classificação correta entre os grupos. A porcentagem da

validação Cruzada é obtida dividindo-se o número de classificações corretas pelo

total de indivíduos.

As distâncias de Mahalanobis entre os centróides dos grupos também foram

calculadas e a partir delas foram construídos dendogramas de proximidade

morfológica pelo método de Neighbor Joining através do software MEGA versão 5.2

(TAMURA et al., 2011).


Também foi realizado o teste de Mantel, com o auxílio do software TFPGA

(MILLER, 1997), para verificação de correlações significativas entre as distâncias

morfológicas e distâncias geográficas das localidades estudadas. A distância

geográfica entre as populações, em quilômetros e em linha reta, a partir das

coordenadas geográficas das cidades foi calculada utilizando a ferramenta Google

Earth versão 6.1.0.5001 (GOOGLE INC., 2011). Os testes ANOVA foram feitos com

o auxílio do software SigmaStat 3.5(Systat Software Inc., 2006)

3.3 Análises moleculares

Para a análise molecular todas as amostras que mostraram DNA de

qualidade foram incluídas na análise, sendo estas, abelhas de 116 colônias de 19

localidades, sendo, 24 ninhos no Rio Grande do Norte (18 em Mossoró, 1 Macaíba e

3 em São Paulo do Potengi); 18 ninhos no Alagoas (8 em Rio Largo, 5 em Barra de

Santo Antônio, 2 em Murici,1 em Maceió e 2 em Joaquim Gomes); 46 ninhos no

Piauí (13 em São Raimundo Nonato, 13 em Parnaíba, 16 em Bela Vista e 4 em

Isaías Coelho), 11 ninhos na Paraíba (2 em Baraúna, 2 em Cuité, 5 em Taperoá, 1

em Maturéia e 1 em João Pessoa) e 19 ninhos no Sergipe (7 em Brejo Grande e 12

São Cristóvão). Na divisão por climas foram utilizadas 43 amostras do Litorâneo

Úmido, 13 do Tropical e 60 do Semiárido.

3.3.1 Extração do DNA

A extração do DNA total foi realizada utilizando Chelex 100 de acordo com a

metodologia proposta por WALSH et al., (1991), a partir da perna de uma operária

por colônia, preservada em álcool até o momento da extração. A perna de cada

indivíduo foi retirada com auxilio de pinças devidamente flambadas, colocadas em

tubos eppendorf individuais e levemente macerada em 400 μl de Chelex 10% e 5 μl

de proteinase K 20ug/μl. Em seguida, a solução foi incubada por 30 minutos a 56°C,

depois aquecida por 5 min a 99°C e então centrifugada a 14.000 rpm por 3 min.


3.3.2 Reação da Polimerase em Cadeia (PCR)

O DNA extraído foi submetido à PCR para amplificação de um fragmento do

gene mitocondrial Citocromo Oxidase subunidade I (COI), utilizando o primer

BarbeeF (5’ CAA CAA ATC ATA AAA ATA TTG G –3’) (FRANÇOSO & ARIAS, 2013)

e o primer mtD9 (5´ CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC 3´) (SIMON et al., 1994).

A reação de PCR foi realizada com 2 μl de DNA, 1 μl de primer FWD (10

pmol), 1 μl de primer REV(10 pmol), 10 μl de solução Promega PCR Master Mix 2x

[Taq –DNA –Polymerase (0,05 unidade/μl); 2x reaction buffer, 400 μM de cada dNTP

e 3mM MgCl²] e 6 μl de água bidestilada e autoclavada, totalizando um volume de

20 μl.

A amplificação do locus foi feita em um termociclador Applied Biosystems

geneAmp PCR System 9700 com as seguintes condições: 1 ciclo inicial de 5

minutos a 94°C, seguidos de 35 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1 minuto e 20 segundos

a 40°C, 2 minutos a 64°C, seguidos de 10 minutos de extensão a 64°C. Para

confirmação do sucesso de amplificação, os fragmentos foram visualizados em gel

de agarose 1% corado com brometo de etídio e observados em luz UV.

3.3.3 Sequenciamento

Após a confirmação da existência do fragmento do tamanho esperado por

eletrofose em gel de agarose 1%, as reações de PCR foram purificadas utilizando

Wizard® SV Gel and PCR Clean-up System (PROMEGA) conforme protocolo

recomendado pelo fabricante. Após purificação, o conteúdo de DNA das amostras

foi quantificado em Nanodrop (ND 1000). Foram enviadas pra sequenciamento

(CREBIO) 20 microlitros de cada amostra com uma concentração mínima de

10ng/uL, conforme especificações da empresa.

3.3.4 Análise de dados

As sequências forward e reverse, geradas automaticamente, foram

inspecionadas visualmente, alinhadas e, quando necessário, corrigidas

manualmenteno software ChromasPro version 1.6 (2012). O software DnaSP v.5.10

(LIBRADO & ROZAS, 2009) foi utilizado para separar os haplótipos e determinar o


número de sítios polimórficos, número de haplótipos e a diversidade haplotípica. A

rede de haplótipos foi construída através do programa NETWORK v. 4.6 (POLZIN,

2003), utilizando-se o algoritmo Median Joining que identifica os haplótipos mais

proximamente relacionados. Também foi construído um dendograma baseado nas

distâncias genéticas pelo método de Neighbor Joining com auxílio do programa

MEGA versão 5.2 (TAMURA et al., 2011). O teste de Fst foi executado através do

software Arlequin versão 3.5 (EXCOFFIER & LISCHER, 2010).

Resultados e

Discussão

Resultados e Discussão | 37

4 RESULTADOS

4.1 Análises Morfométricas

4.1.1 Morfometria Geométrica

A partir da anotação dos 19 marcos anatômicos nas nervuras das asas foram

obtidos os valores de Procrustes, onde foi observado que os marcos anatômicos 1,

2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 12, 16, 17, 18 e 19 variaram de forma isotrópica, sendo

distribuídos circularmente em torno da média, não mostrando assim, nenhuma

tendência de variação, podendo estar relacionada tanto a variação casual dos

marcos anatômicos quanto a pequenas variações durante a marcação dos pontos.

Os marcos anatômicos 9, 10, 13, 14 e 15 variaram de forma alotrópica,

mostrando uma tendência na variação que pode indicar a seleção de uma característica

ou a associação de uma característica com outra já selecionada (Figura 7).

Figura 7: Resultados do alinhamento de Procrustes dos 19 marcos anatômicos marcados nas junções das nervuras das asas de operárias. Pontos pretos representam os resíduos de Procrustes e pontos azuis representam à média. A identificação de cada marco anatômico se dá pela numeração em vermelho.

Na Análise de Componente Principal, a partir dos resíduos de Procrustes das

coordenadas Cartesianas alinhadas dos 19 marcos anatômicos, foram geradas 34


medidas de deformações relativas. As 20 primeiras medidas foram superiores a um,

explicando 92% da variabilidade de todo o conjunto de dados. A análise mostra o primeiro

componente principal (13,45%) e o segundo componente principal (12,21%) como os

principais eixos de variação na análise, seguidos dos PC3 (9,06%) e PC4 (8,14%).

Através das grades de deformação podemos observar os principais marcos

anatômicos responsáveis pela mudança da forma. Dentre todas as variáveis

analisadas, as coordenadas Cartesianas X15, X13 e X16 foram as que mais

contribuíram para explicar a variabilidade em CV1 (Figura 8), enquanto que as

coordenadas X15, X5, Y19, X11, e X12 foram as que mais contribuíram para

explicar a variabilidade encontrada no segundo eixo (Figura 9).

Figura 8: Mudanças de forma observadas através da grade de deformação (Thin-plate spline). Cada linha começa na forma consenso, representado pelo ponto, o comprimento e a direção da reta indicam o movimento da forma inicial para a correspondente modificação.



No gráfico de dispersão, com os respectivos eixos que mais contribuíram para

variação dos grupos na PCA (Figuras 10 e 11), foi observado que nenhum dos

grupos analisados apresentou grandes diferenças quando analisamos os dois

primeiros componentes principais (PC1 e PC2), independentemente do classificador

de marcação das elipses, seja Localidades ou Climas. O teste de Componente

Principal indica a distribuição dos dados no morfoespaço, sem se importar com sua

origem, diferentemente da análise de variáveis canônicas que tende a agrupar

indivíduos de um mesmo conjunto, dando ênfase nas diferenças e similaridades

entre as amostras dependendo o marcador morfométrico utilizado.

Figura 10: Representação gráfica da Análise de Componente Principal das populações de Apis mellifera, obtidas a partir das análises dos 19 pontos anatômicos marcados nas junções de nervuras das asas, elipses marcadas por localidades.


Figura 11: Representação gráfica da Análise de Componente Principal das populações de Apis mellifera, obtidas a partir das análises dos 19 pontos anatômicos marcados nas junções de nervuras das asas, elipses marcadas por Climas.

A partir destes resultados foram feitas Análises de Variáveis Canônicas

utilizando como marcador morfométrico as Localidades e os Climas das regiões

amostradas.

Na Análise das Variáveis Canônicas usando como classificador morfométrico

as localidades amostradas, foram encontrados 11 eixos com autovalores maiores do

que 0,1 e que maximizam a separação significativa dessas populações. Os quatro

primeiros eixos foram responsáveis por mais da metade de toda a variabilidade de

todo o conjunto de dados, contribuindo com 54,60%. O primeiro eixo foi responsável

pela explicação de 24,83% de toda a variação, enquanto o segundo eixo explicou

10,94% da variabilidade dos dados, em um total de 35,78%.

A distribuição dos pontos no gráfico de dispersão gerado a partir da análise

das variáveis canônicas não nos permite observar diferenças entre os grupos

analisados, tanto no eixo correspondente à CV1 como à CV2 (Figura 12).


Figura 12: Representação gráfica da disposição relativa das populações de Apis mellifera obtidas a partir das análises de variáveis canônicas dos 19 pontos anatômicos marcados nas junções de nervuras das asas

Segundo os valores das distâncias quadradas de Mahalanobis entre os

centroides das distribuições dos grupos (Tabela 6), As populações de Mossoró (RN),

Rio Largo (AL) e São Raimundo Nonato (PI) apresentaram as maiores proximidades

morfológicas perante o restante das populações, enquanto que as localidades com

apenas um ninho se mostram populações com maior distanciamento entre si.


Tabela 6: Distâncias quadradas de Mahalanobis entre as populações de A. mellifera obtidas através das Análises de Variáveis Canônicas.


A partir destas distâncias (Tabela 6) foi construído um dendograma de

proximidade morfológica entre os grupos estudados (Figura 13), no qual foi possível

perceber a inexistência de um agrupamento específico baseado em distâncias

geográficas entre as localidades, corroborando com o gráfico de dispersão da

Análise Canônica.

Figura 13: Dendrograma de proximidade morfológica entre as populações de A. mellifera construído pelo método de Neighbor Joining.

A Análise de Funções Discriminantes indicou que a maioria das distâncias

quadradas de Mahalanobis entre os centroides de distribuição dos grupos não se

apresentaram estatisticamente significantes (P < 0,05) (Tabela 7). Esta ausência de

significância estatística indica que as populações são extremamente parecidas, sugerindo

uma ausência de estruturação populacional entre as populações amostradas.


Tabela 7: Distâncias quadradas de Mahalanobis (metade inferior da tabela) e significâncias estatísticas (metade superior da tabela) entre as populações estudadas obtidas através das Análises de Função Discriminante.

*Em negrito os pares de populações nas quais a distância entre os centróides foi estatisticamente significante (α = <0,05).


O teste de validação cruzada apresentou uma taxa de acerto de 11%,

indicando nenhuma ou pouca estruturação populacional, corroborando a ausência

de diferenças estatisticamente significantes entre as populações analisadas nas

análises discriminantes e também os resultados encontrados no gráfico de

dispersão.

O teste de Mantel indicou ausência de correlação entre as distâncias

geográficas e as distâncias morfológicas (r = 0,10) e estatisticamente não

significante (P = 0,236).

Dentro de uma colônia podemos ter diferenças entre os indivíduos, tais como,

diferenças de desenvolvimento ou até mesmo mutações. A fim de amenizar estas

variações entre as amostras foi feita uma análise apenas com as médias das

colônias.

Para este tipo de análise é permitido utilizar apenas localidades onde foram

amostrados mais de um ninho, de modo que as amostras que consistiam de abelhas

com apenas um ninho foram retiradas da análise.

Na Análise de Componente Principal foram encontrados 35 eixos que

maximizam a separação significativa dessas populações, sendo que os 11 primeiros

apresentaram autovalores maiores que um, representando 76,4% de toda a

variação. A análise mostra o primeiro componente principal (16,23%) e o

componente principal (11,90%) como os principais eixos de variação na análise,

seguidos dos PC3 (9,47%) e PC4 (8,56%).

No gráfico de dispersão, com os dois primeiros eixos dos componentes

principais (Figura 14), foi observado que nenhum dos grupos analisados apresentou

grandes diferenças visuais entre si.


Figura 14: Representação gráfica da Análise de Componente Principal das populações de Apis mellifera, obtidas a partir das análises dos 19 pontos anatômicos marcados nas junções de nervuras das asas.


das variáveis canônicas nos permite observar uma leve diferenciação entre os

grupos analisados, bem como o agrupamento dos ninhos provenientes de uma

mesma localidade, tanto no eixo correspondente à CV1 como à CV2 (Figura 15).




centroides das distribuições dos grupos (Tabela 8), as maiores proximidades

morfológicas são observadas nas populações de Mossoró (RN), São Cristóvão (AL)

e São Raimundo Nonato (PI) perante o restante, assim como na análise geral, as

maiores distâncias são encontradas entre localidades com poucos ninhos. Apesar

de haver uma diferença entre a grandeza das distâncias de Mahalanobis fornecidas

pelo MorphoJ e as fornecidas pelo Statistica a proporção é similar e são condizentes

entre si.


Tabela 8: Distâncias quadradas de Mahalanobis entre os centroides de distribuição das populações analisadas de acordo com Análise de Variáveis Canônicas utilizando as médias dos indivíduos de mesma colônia como dados de entrada.


Um dendograma de proximidade morfológica entre os grupos estudados

(figura 16) foi construído a partir das distâncias quadradas de Mahalanobis entre os

centroides das nuvens de distribuição dos grupos.


O teste de validação cruzada teve uma taxa de acerto de 16%, indicando

nenhuma ou pouca estruturação populacional e o teste de Mantel também indicou


baixa correlação entre as distâncias geográficas e as distâncias morfológicas (r =

0,10) e estatisticamente não significante (P = 0,201).

A Análise de Funções Discriminantes indicou que a maioria das distâncias

quadradas de Mahalanobis entre os centroides de distribuição dos grupos se

apresentaram estatisticamente significantes (P < 0,05) (Tabela 9), Esta diferença

para a análise anterior pode ser explicada pelo fato de localidades com amostragem

de apenas um ninho terem sido excluídas desta análise, além do fato de que a

análise com as médias das medidas dos indivíduos de cada ninho apresentarem

maior ordem de grandeza. Entretanto, a ausência de estruturação populacional e a

baixa taxa de acerto encontradas nos testes de validação cruzada demonstram a

grande similaridade entre os indivíduos das diferentes populações.



*Em negrito os pares de populações nas quais a distância entre os centróides foi estatisticamente significante (α = <0,05).


Quando comparadas as análises em nível de indivíduos e em nível de

colônia, os resultados são mais satisfatórios e com maior taxa de acerto na

validação cruzada para as análises feitas com as médias (FRANCOY 2007;

OLESKA & TOFILSKI, 2014). Porém os resultados aqui obtidos mostram que não

houve grandes diferenças entre as análises utilizando os indivíduos como base dos

testes em relação à análise utilizando a média das colônias. Em ambos os casos as

populações se mostraram similares e com baixa estruturação populacional. Além

disso, o teste de validação cruzada mostrou apenas leve melhora quando

consideramos as médias da colônia.

No trabalho de Francoy (2007) também foi observado uma falta de

estruturação nas amostras quando separadas por localidades, onde localidades do

Nordeste, Sudeste e Sul do Brasil se mostram misturadas no dendograma de

proximidade morfológica.

Esta ausência de estruturação populacional das populações do Nordeste

brasileiro pode ser explicada principalmente pela influência ambiental e antrópica no

comportamento e na dinâmica populacional destas populações, resultando em altos

níveis de fluxo gênico e miscigenação.

Essa similaridade existente pode ser explicada por diversos fatores. Devido

as grandes secas no Nordeste brasileiro, todos os anos os apicultores perdem

grande parte das suas colônias, que abandonam os apiários em busca de novos

pastos no período de escassez de alimento (FREITAS, 2007). De acordo com Sofia

e Bego (1996) as colônias de abelhas eusociais tropicais, normalmente com elevado

número de indivíduos, exigem uma alta demanda de alimento ao longo do ano. Em

áreas sujeitas à constantes perturbações, as abelhas devem se adequar

continuamente a estas mudanças, caso contrário, ocorrerá a enxameação para

áreas mais favoráveis, fato esse que é ainda mais exacerbado em abelhas

Africanizadas, que tem como uma de suas características principais a enxameação

reprodutiva e de abandono (ALMEIDA, 2008).

Essas altas taxas de enxameação possibilitam que essas abelhas migrem

rapidamente para outras regiões, contribuindo assim para um alto fluxo gênico entre

as populações, podendo este ser o principal motivo da falta de estruturação

populacional encontrada em nossos resultados, uma vez que estas abelhas podem

migrar a uma velocidade de 400-500 km por ano (SOARES, 2012).


Além disso, zangões de abelhas Africanizadas podem cobrir uma área de até

157 km², isto é, um raio 7 km em torno da colônia (CRISTINO, 2003). Rainhas

virgens podem se dirigir para áreas de congregações de 2 km a 5 km de distância da

colônia e acasalar com até 18 machos, provendo assim uma variabilidade genética

considerável além da possibilidade de mistura de genes provenientes de diferentes

lugares (FREE, 1980).

Outro fator que provavelmente também está envolvido é a apicultura

migratória existente na região, onde os apicultores fazem a mudança de conjuntos

de colmeias (apiários) de uma região para outra, acompanhando as floradas e

visando à produção de mel e a prestação de serviços para a polinização, de modo a

contribuir para o fluxo gênico da espécie e consequentemente a falta de

estruturação da população (TRINDADE et al., 2004). O comercio de compra e venda

de rainhas e enxames no Nordeste brasileiro, embora em menor escala também

pode estar contribuindo para a variabilidade local, já que o comportamento humano,

na exploração apícola, tem grande influência sobre a distribuição populacional das

abelhas (FRANCOY, 2007).

Os resultados das análises baseadas em clima são descritos a seguir.

Na Análise das Variáveis Canônicas usando como classificador morfométrico

os climas, foram encontrados dois eixos que maximizam a separação significativa

dessas populações. O primeiro eixo foi responsável pela explicação de 60,23% de

toda a variação, enquanto o segundo eixo explicou 39,76% da variabilidade dos

dados, em um total de 100%.


das variáveis canônicas nos permite observar a existência de três grupos, com clara

sobreposição de parte das nuvens, tanto no eixo correspondente à CV1 como à CV2

(Figura 17).



A partir das distâncias quadradas de Mahalanobis entre os centroides das

distribuições dos grupos foi construído um dendograma de proximidade morfológica

entre os indivíduos pertencentes às diferentes zonas climáticas (Tabela 10) (Figura

18).

Tabela 10: Distâncias quadradas de Mahalanobis entre as populações de A. mellifera obtidas através das Análises de Variáveis Canônicas

Litorâneo Úmido Tropical

Tropical 1,55

Semiárido 1,06 1,33


Figura 18: Dendrograma de proximidade morfológica entre as populações de A. mellifera, construído com base no algoritmo Neighbor Joining.

Através do dendograma de proximidade morfológica podemos perceber uma

maior proximidade entre o Litorâneo Úmido e o Semiárido. Proximidade essa que

corrobora com a divisão geográfica encontrada no Nordeste brasileiro (Figura 1).

A Análise de Funções Discriminantes indicou que todas as distâncias


apresentaram estatisticamente significantes (P < 0,05). Também foi possível

observar que as distâncias de Mahalanobis (Tabela 11) diferem sutilmente da

encontrada pela Análise de Variáreis Canônica (Tabela 10).



Litorâneo Úmido Tropical Semiárido

Litorâneo Úmido <.0001 <.0001

Tropical 1,50 <.0001

Semiárido 1,03 1,39

O teste de validação cruzada identificou corretamente 60,10% dos indivíduos

dentro de suas respectivas áreas, indicando a presença de estruturação

populacional, diferente do observado nas análises anteriores, que utilizaram as

localidades de origem como marcador (11% de identificação correta).

A região Tropical foi a com a menor porcentagem de acerto dentro de sua

respectiva área, a maioria das amostras dessa região foram classificadas dentro da

região mais próxima geograficamente, o Semiárido (Tabela 12).

Tabela 12: Teste de validação cruzada entre os indivíduos das diferentes zonas climáticas amostradas (Em negrito a taxa de acerto dentro de cada grupo).

Zona Climática Associação ao grupo prevista Total

% Litorâneo Úmido Tropical Semiárido

Litorâneo Úmido 55,4 4 40,6 100

Tropical 29,7 15,6 54,7 100

Semiárido 22,7 4,5 72,8 100

Ao serem adicionadas, na análise, as amostras de Mossoró coletadas na

época das chuvas, juntamente com o restante das amostras coletadas durante a

seca, foi necessário o realinhamento das amostras e uma nova Análise de

Componente Principal, já que novas amostras foram adicionadas.

A partir da anotação dos 19 marcos anatômicos nas nervuras das asas foram

obtidos os valores de Procrustes, onde foi observado que os marcos anatômicos 1,

2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 12, 16, 17, 18 e 19 variaram de forma isotrópica, sendo

distribuídos circularmente em torno da média enquanto que os marcos anatômicos

9, 10, 13, 14 e 15 variaram de forma mais alotrópica (Figura 19), não mostrando

grandes diferenças da a análise de componente principal realizada anteriormente,

na qual não haviam sido incluídas as amostras de Mossoró coletadas na época das

chuvas.


Figura 19: Resultados do alinhamento de Procrustes dos 19 marcos anatômicos marcados nas junções das nervuras das asas de operárias. Pontos pretos representam os resíduos de Procrustes e pontos azuis representam à média.

Na Análise de Componente Principal, a partir dos resíduos de Procrustes das

coordenadas Cartesianas alinhadas dos 19 marcos anatômicos, foram gerados 34

medidas de deformações relativas. As 20 primeiras medidas apresentaram valores

superiores a 1, explicando 92% da variabilidade de todo o conjunto de dados. A

representação gráfica mostra o primeiro componente principal (13,36%) e o segundo

componente principal (12,53%) como os principais eixos de variação na análise,

seguidos dos PC3 (11,06%) e PC4 (8,83%).

Através das grades de deformação, foi possível observar os marcos

anatômicos que mais contribuíram pela deformação da forma. Dentre todas as

variáveis analisadas, as coordenadas Cartesianas X15, X13 e X17 foram as que

mais contribuíram para explicar a variabilidade em CV1 (Figura 20), enquanto que as

coordenadas X15, X5, e X11foram as que mais contribuíram para explicar a

variabilidade encontrada no segundo eixo (figura 21).




No gráfico de dispersão, com os respectivos eixos que mais contribuíram para

variação dos grupos na PCA (Figura 22), foi observado que nenhum dos grupos

analisados apresentou grandes diferenças quando analisamos os dois primeiros

componentes principais (PC1 e PC2).



Na análise das Variáveis Canônicas foram encontrados dois eixos que

maximizaram a separação dessas populações. O primeiro eixo foi responsável pela

explicação de 53,8% de toda a variação, enquanto o segundo eixo explicou 46,13%

da variabilidade dos dados, em um total de 100%.


das variáveis canônicas indicou que a adição das amostras de Mossoró coletadas

na época das chuvas muda o padrão, mostrando uma maior homogeneização

principalmente entre o Litorâneo Úmido e o Semiárido (Figura 23).


Figura 23: Representação gráfica obtida a partir das análises de variáveis canônicas dos 19 pontos anatômicos marcados nas junções de nervuras das asas de populações de Apis mellifera classificadas em relação ao clima, coletadas na época da seca mais as amostras de Mossoró coletadas na época de chuvas.

Essa maior homogeneização também pode ser observada analisando as

distâncias de Mahalanobis entre os centroides das distribuições dos grupos (Tabela

13). A distância entre o Litorâneo Úmido e o Semiárido diminui de 1,068 para 0,857

quando as amostras de Mossoró coletadas na época da chuva foram adicionadas,

enquanto o dendograma de proximidade morfológica entre os grupos estudados

(Figura 24) continuou a indicar uma maior proximidade entre as populações da

região do Litorâneo Úmido e o Semiárido.



Tropical 1,5091

Semiárido 0,8572 1,4385



Na Análise de Funções Discriminantes também foi observado que todas as

distâncias quadradas de Mahalanobis entre os centroides de distribuição dos grupos

apresentaram diferenças estatisticamente significantes (P < 0,05) (Tabela 14).

Tabela 14: Distâncias quadradas de Mahalanobis (metade inferior da tabela) e significâncias estatísticas (metade superior da tabela) entre as populações estudadas obtidas através das Análises de Função Discriminante


Litorâneo Úmido <.0001 <.0001

Tropical 1,5074 <.0001

Semiárido 0,8925 1,4809



dentro de suas respectivas zonas climáticas. Um fato que chama a atenção foi que a

adição das amostras de Mossoró coletadas na época das chuvas levou à diminuição

da taxa de acerto do que quando comparado com as análises sem estas amostras

(Tabela 15)


Localidade Associação ao grupo prevista Total


Litorâneo Úmido 50 21 29 100

Tropical 25 50 25 100

Semiárido 27 20,1 52,9 100

Uma análise adicional foi realizada, utilizando as amostras de Mossoró

coletadas na época de chuvas como sendo um marcador diferente, assim como o

Tropical, o Semiárido e o Litorâneo Úmido.

Foram encontrados três eixos que maximizam a separação significativa



dados, em um total de 86,55%.


das variáveis canônicas permitiu a observação de que as amostras coletadas em

Mossoró na época das chuvas, é a responsável por esta homogeneização

encontrada na análise anterior, uma vez que estas amostras foram posicionadas

entre os pontos da região do Litorâneo Úmido e do Semiárido (Figura 25).


Figura 25: Representação gráfica obtida a partir das análises de variáveis canônicas dos 19 pontos anatômicos marcados nas junções de nervuras das asas de populações de Apis mellifera classificadas em relação ao clima, coletadas na época da seca com acréscimo das amostras de Mossoró coletadas na época de chuvas como sendo também um marcador.

Através das distâncias quadradas de Mahalanobis (Tabela 16) e da análise do

dendograma de proximidade morfológica (Figura 26) foi possível observar que

apesar da cidade de Mossoró se localizar no Semiárido a distância entre as

amostras de Mossoró chuvas e o Litorâneo Úmido (2,0017) é menor do que a

distância entre Mossoró chuvas e o Semiárido (2,4529).

Isso explica o fato da distância entre o Litorâneo Úmido e o Semiárido

diminuir de 1,068 para 0,857 quando as amostras de Mossoró coletadas na época

da chuva são adicionadas à análise, pois como observado no gráfico de dispersão

são essas amostras as responsáveis pela maior homogeneização encontrada entre

o Litorâneo Úmido e o Semiárido na análise mostrada anteriormente.



Litorâneo Úmido Mossoró Chuvas Tropical

Mossoró Chuvas 2,0017 Tropical 1,543 2,6578

Tropical Semiárido 1,0539 2,4529 1,3515




quadradas de Mahalanobis entre os centroides de distribuição dos grupos



Litorâneo úmido Mossoró chuvas Tropical Semiárido

Litorâneo úmido <.0001 <.0001 <.0001

Mossoró chuvas 2,3535 <.0001 <.0001

Tropical 1,5074 2,9128 <.0001

Semiárido 1,0373 2,2155 1,3919

O teste de validação cruzada identificou corretamente 59,7,% dos indivíduos

dentro de suas respectivas áreas, sendo que a maior taxa de acerto encontrada foi

para a população de Mossoró coletada na época das chuvas, onde houve 75,4% de

acerto dentro do seu grupo. Essas taxas sugerem assim como o gráfico de

dispersão que essas amostras são bem diferentes do restante (Tabela 18).



% Litorâneo Úmido Tropical Semiárido Mossoró Chuvas

Litorâneo Úmido 47,8 3,1 38,8 10,3 100

Tropical 23,4 12,5 56,3 7,8 100

Semiárido 14,2 4,2 68,9 12,6 100

Mossoró Chuvas 14 0,6 10,1 75,4 100

Ao observar que a distância entre as amostras de Mossoró chuvas e o

Litorâneo Úmido é menor do que a distância entre Mossoró chuvas e o Semiárido,

foi feita uma segunda análise adicional, marcando as amostras coletadas em

Mossoró na época da seca também como um marcador, a fim de entender a relação

entre essas duas amostragens.

Foram encontrados quatro eixos que maximizam a separação significativa



dados, em um total de 84,73%.


Os dados obtidos com esta análise adicional fornecera uma série de

evidências sobre as diferentes amostragens em períodos de seca e chuva, como o

fato de que as amostras de Mossoró coletadas no período da seca e na época das

chuvas se localizam opostamente no gráfico de dispersão (Figura 27) e possuem a

maior distância entre populações (Tabela 19).

Figura 27: Representação gráfica obtida a partir das análises de variáveis canônicas dos 19 pontos anatômicos marcados nas junções de nervuras das asas de populações de Apis mellifera classificadas em relação ao clima, coletadas na época da seca com acréscimo das amostras de Mossoró coletadas na época de chuvas como sendo também um marcador.

Tabela 19: Distâncias quadradas de Mahalanobis entre as populações de A. mellifera obtidas através das Análises de Variáveis Canônicas

Litorâneo Úmido Mossoró Chuvas Mossoró Tropical

Mossoró Chuvas 2,0471

Mossoró 1,3316 2,9944

Tropical 1,5415 2,6782 1,6824

Tropical Semiárido 1,1509 2,3395 1,2993 1,3783

Apesar de Mossoró chuvas ser mais próxima das populações do Litorâneo

Úmido (2,0471), esta população é a mais diferenciada de todas. A população de


Mossoró coletada durante a seca se localiza mais próxima das populações do

Semiárido do que do restante ao contrário da população coletada durante a chuva

que se localiza mais próximas do Litorâneo Úmido (Figura 28).







Litorâneo úmido

Mossoró chuvas

Mossoró seca

Tropical Semiárido

Litorâneo úmido

<.0001 <.0001 <.0001 <.0001

Mossoró chuvas 2,3535 <.0001 <.0001 <.0001

Mossoró seca 1,5432 3,6632 <.0001 <.0001

Tropical 1,5074 2,9128 1,9457 <.0001

Semiárido 1,1687 2,0903 1,4874 1,4851


dentro de suas respectivas áreas, onde, mais uma vez, foi possível observar

Mossoró chuvas com uma alta taxa de acerto dentro de seu grupo. Por outro lado,

as amostras de Mossoró coletadas na época da seca apresentam 27,1% de acerto e

com grande taxa de erro (34,4%) dentro do grupo Semiárido, região esta a de

origem das amostras de Mossoró (Tabela 21).



% Litorâneo Úmido Tropical Semiárido Mossoró Seca Mossoró Chuvas

Litorâneo Úmido

54 4,9 24,6 6,3 10,3 100

Tropical 28,1 17,2 35,9 10,9 7,8 100

Semiárido 16 3,8 52,1 11,3 16,9 100

Mossoró Seca 28,1 8,3 34,4 27,1 2,1 100

Mossoró Chuvas

14 0,6 9,5 0 76 100

Os resultados das análises de morfometria geométrica usando as zonas

climáticas como classificador indicaram certa estruturação entre os três climas

amostrados, sugerindo grupos relativamente adaptados a estas condições

ambientais, apesar de haver fluxo gênico entre eles.


Souza et al., (2009) verificaram, em diferentes regiões geomorfológicas da

Paraíba, a existência de dois grupos distintos de Apis mellifera. Guler et al., (2010),

também utilizando amostras provenientes de diferentes regiões ecológicas,

observaram alta variabilidade entre as subespécies A. m. carnica e A. m. caucasica

através da morfometria geométrica da asa anterior destas abelhas.

Nunes (2012) avaliou a variabilidade de Apis mellifera em cinco regiões do

Brasil (Norte, Nordeste, Sul, Sudeste e Centro-Oeste), onde foi observada a

formação de grupos distintos por região, conforme a distribuição geográfica das

colônias amostradas.

Nossos resultados mostram também que as amostras coletadas em Mossoró

durante a época de chuvas se mostram relativamente mais próximas das amostras

do Litorâneo Úmido do que com as amostras coletadas em Mossoró durante a seca.

Freitas (2007) realizou o monitoramento da chegada e saída de enxames de

duas cidades do Nordeste brasileiro, uma no interior e outra no litoral do Ceará.

Neste trabalho os registros de chuvas mostraram claramente que a migração das

colônias de abelhas Africanizadas no Nordeste estão intimamente relacionadas com

a estação do ano. Os dados do trabalho mostram que no litoral os enxames

chegaram durante todo o ano, mas seu número aumentou consideravelmente

durante a estação seca, mesma época em que a maioria dos enxames deixaram o

interior (julho a outubro). Além disso, os dados mostram grande quantidade de

muitos enxames do litoral que migraram durante a estação chuvosa, devido

principalmente às grandes quantidades de chuvas no litoral entre os meses de

Janeiro a Maio, mesma época em que os enxames começaram a chegar ao Interior.

Em nosso caso, as amostras coletadas durante a época de seca (Novembro)

em Mossoró foram as que permaneceram em suas colônias, mesmo em condições

adversas e não enxamearam como a maioria dos outros ninhos. As amostras

coletadas durante a época das chuvas (Março) em Mossoró são ninhos que se

estabeleceram em caixas-isca, depois que as condições voltaram a ser novamente

favoráveis às abelhas, devido às chuvas. Devido ao fato das abelhas coletadas

durante a época das chuvas em Mossoró serem mais próximas das abelhas do

Litorâneo Úmido do que das abelhas do Semiárido aonde foram coletadas, nos leva

a inferir que nossos resultados estejam refletindo o padrão de dispersão destas

abelhas coletadas em Mossoró entre o Litorâneo Úmido e o Semiárido.


Esta diferença entre os perfis morfométricos entre as abelhas das regiões

úmidas e secas pode ser devido a existência de plasticidade fenotípica como

resultado das diferenças ambientais encontradas nos diferentes climas amostrados.

No trabalho de Jorge et al., (2011) foram analisadas asas de borboletas Heliconius

erato utilizando morfometria geométrica, os resultados mostram variação de

tamanho e forma das asas entre os indivíduos alimentados com plantas diferentes.

Estas diferenças na forma foram interpretadas como efeitos ambientais sobre o

desenvolvimento dos indivíduos. Alguns fatores ambientais, tais como temperatura,

umidade relativa do ar, fornecimento de alimentos e densidade podem favorecer a

existência de plasticidade fenotípica (BATISTA et al., 2013). Os resultados de

Batista et al., (2013) indicam que as diferenças entre as asas de Triatoma

brasiliensis podem estar relacionadas com a existência de plasticidade fenotípica, e

as variações no tamanho e forma das asas podem ser associadas a diferentes

ecótipos, possivelmente como resultado das condições em cada micro-habitat.

Estas diferenças encontradas entre as abelhas que resistiram a seca e não

enxamearam e as abelhas que migraram com maior facilidade pode refletir também

diferenças comportamentais e talvez possam ser utilizadas como fatores de seleção

artificial para linhagens com baixa tendência a enxameação. Certamente que mais

estudos são necessários antes deste passo da seleção, mas estes dados trazem

uma interessante possibilidade de trabalhos futuros.

4.1.2 Morfometria Tradicional

Na Análise de Componentes Principais os seis primeiros eixos apresentaram

autovalores maiores que um e explicaram, em conjunto, 68,23% da variabilidade dos

dados, sendo 15,85% no primeiro eixo e 12,98% no segundo eixo.

A representação gráfica dos dois primeiros eixos da Análise de Componentes

Principais (Figura 29) dos dados de morfometria tradicional indicou uma grande

similaridade entre as populações. Foi possível observar algumas amostras coletadas

nas localidades do estado da Paraíba se diferem das demais quando analisadas no

primeiro eixo (PC1).



A medida que mais contribuiu para distribuição das amostras no primeiro eixo

foi o comprimento da asa anterior, enquanto que no segundo eixo (PC2) a medida

que mais contribuiu foi o ângulo 10. A partir destes resultados foram feitos testes

utilizando como marcador morfométrico as Localidades e os Climas das regiões

amostradas.

As análises utilizando localidades de coleta como classificador morfométrico

apresentaram 12 eixos que maximizam a separação significativa dessas

populações, dentre as medidas utilizadas apenas a largura da asa anterior e o

Ângulo 9 não contribuíram de maneira significativa para a separação das amostras

(Tabela 22).


Tabela 22: Significâncias estatística das medidas de morfometria tradicional na separação dos grupos de acordo com a zona climática onde foram coletadas as amostras de abelhas Africanizadas (Em negrito medidas que não foram significantes na separação das amostras).

Medida P <0,05

Comp. Asa 0,000001

Larg. Asa 0,091324

Ang. 1 0,001922

Ang. 2 0,000199

Ang. 3 0,00329

Ang. 4 0,000076

Ang. 5 0,000001

Ang. 6 0,000224

Ang. 7 0,000001

Ang. 8 0,000001

Ang. 9 0,205521

Ang. 10 0,005287

Ang. 11 0,000001

O gráfico de dispersão da Análise de Variáveis Canônicas indicou um maior

distanciamento de algumas das amostras coletadas nas localidades pertencentes ao

estado da Paraíba no eixo correspondente a CV1 (Figura 30).



Dentre as medidas que mais influenciaram na separação dos eixos, temos

que o comprimento da asa foi à medida que mais influenciou o primeiro eixo (CV1),

enquanto que a medida do Ângulo 5 foi a medida que mais influenciou o segundo

eixo do gráfico (CV2).

Portanto à medida que mais influenciou no distanciamento das amostras

coletadas no estado da Paraíba foi o comprimento da asa. Medidas lineares como

comprimento e largura são diretamente proporcionais ao tamanho do organismo

(RUTTNER, 1988). Com base nas médias, no desvio e no teste ANOVA, foi possível

a visualização de que as abelhas coletadas no estado da Paraíba são maiores do

que o restante (Tabela 23).

Tabela 23: Média e desvio padrão das medidas de morfometria tradicional tomadas junto aos indivíduos de abelhas Africanizadas coletados em diferentes zonas climáticas do Nordeste brasileiro. Letras iguais na mesma linha indicam diferenças estatisticamente não significantes. Letras diferentes na mesma linha indicam diferenças estatisticamente significantes (P < 0,05).

PI RN AL SE PB

Comp.Asa 5,46 ± 0,18 a 5,29 ± 0,12 b 5,39 ± 0,11 b 5,47 ± 0,11 d 5,58 ± 0,12 e

Larg.Asa 2,78 ± 0,17 a 2,72 ± 0,08 b 2,77 ± 0,08 b 2,84 ± 0,08 d 2,86 ± 0,06 e

Ang.1 39,98 ± 4,08 a 39,92 ± 3,76 a 39,43 ± 4,71 a 39,15 ± 4,00 a 41,13 ± 4,17 a

Ang.2 92,37 ± 3,36 a 92,63 ± 3,19 b 92,13 ± 3,90 b 90,31 ± 3,31 d 86,70 ± 3,61 e

Ang.3 79,05 ± 2,79 a 79,51 ± 2,93 a 78,56 ± 3,11 a 79,47 ± 3,17 a 78,23 ± 3,71 a

Ang.4 87,90 ± 3,49 a 87,98 ± 3,07 a 88,31 ± 2,77 b 88,64 ± 3,33 c 86,61 ± 2,42 d

Ang.5 89,77 ± 4,87 a 89,78 ± 4,37 a 92,89 ± 4,42 c 92,58 ± 4,28 c 93,80 ± 4,39 c

Ang.6 89,97 ± 4,86 a 90,50 ± 4,81 a 91,10 ± 4,20 a 90,19 ± 4,19 a 89,57 ± 3,73 a

Ang.7 48,26 ± 4,62 a 48,18 ± 3,37 a 46,94 ± 3,74 c 47,52 ± 3,48 c 47,10 ± 5,63 c

Ang.8 16,2 ± 2,92 a 16,70 ± 1,90 a 17,07 ± 1,55 b 17,09 ± 1,58 b 17,32 ± 1,91 b

Ang.9 19,43 ± 7,33 a 19,00 ± 6,34 a 18,37 ± 1,48 a 17,95 ± 1,46 a 20,39 ± 13,24 a

Ang.10 101,0 ± 9,15 a 101,00 ± 7,26 a 103,45 ± 6,28 a 103,11 ± 5,22 a 99,75 ± 11,30 a

Ang.11 33,40 ± 2,63 a 34,02 ± 2,96 a 32,25 ± 2,57 c 33,31 ± 2,12 a 31,87 ± 2,39 a

Porém segundo o teste ANOVA, dentro da Paraíba, apenas as localidades de

João Pessoa, Baraúna e Cuité apresentaram médias superiores com significância

estatística (Tabela 24).


Tabela 24: Média e desvio padrão das medidas de morfometria tradicional tomadas junto aos indivíduos de abelhas Africanizadas coletados em diferentes zonas climáticas do Nordeste brasileiro. Letras iguais na mesma linha indicam diferenças estatisticamente não significantes. Letras diferentes na mesma linha indicam diferenças estatisticamente significantes (P < 0,05)

Baraúna (PB) Cuité (PB) Taperoá (PB) Maturéia (PB) João Pessoa (PB)

Comp.Asa 5,66±0,08 a 5,63±0,09 b 5,53±0,13 a,b,c 5,56±0,10 a,b,c 5,67±0,08 c

Larg.Asa 2,86±0,04 a 2,89±0,05 b 2,84±0,06 a,b,c 2,88±0,07 a,b,c 2,93±0,04 c

Ang.1 42,20±5,11 a 40,28±3,98 a 40,72±4,02 a 41,13±5,25 a 42,54±3,27 a

Ang.2 89,08±2,83 a 84,47±4,20 a 86,82±3,58 a 87,39±3,30 a 84,80±1,47 a

Ang.3 76,33±4,20 a 78,91±3,72 a 79,24±3,76 a 75,80±2,82 a 78,44±1,80 a

Ang.4 84,17±1,87 a 88,22±2,14 a 87,19±1,72 a 85,84±3,96 a 86,29±1,81 a

Ang.5 93,41±5,56 a 93,96±4,16 a 93,38±4,56 a 93,74±2,74 a 96,10±5,19 a

Ang.6 88,89±3,77 a 89,70±3,60 a 90,56±3,76 a 88,25±3,61 a 87,64±4,03 a

Ang.7 48,44±0,70 a 47,52±2,53 a 45,78±7,39 a 49,32±3,80 a 47,62±6,74 a

Ang.8 16,78±1,41 a 18,10±2,37 a 17,41±2,12 a 17,64±1,44 a 16,32±0,89 a

Ang.9 20,23±2,06 a 17,51±1,90 a 22,94±19,63 a 17,14±1,54 a 17,84±1,71 a

Ang.10 103,9±4,62 a 100,6±4,65 a 97,71±15,97 a 98,91±5,13 a 101,02±5,46 a

Ang.11 31,33±1,05 a 32,47±2,37 a 31,55±2,59 a 33,01±3,60 a 31,99±2,01 a

Estes resultados podem ser explicados pelo fato de exclusivamente as

amostras da Paraíba terem sido coletadas em Setembro, época esta de

enxameação no Nordeste brasileiro (BRANDEBURGO et al., 1989; FREITAS, 2007),

portanto, pode ter ocorrido uma amostragem de enxames de outros lugares, que

devido a época de enxameação estavam nas localidades da Paraíba no momento

da coleta. Além disso, as localidades que apresentaram médias superiores ao

restante com significância estatística são provenientes de localidades relativamente

próximas do litoral, onde João Pessoa se localiza no próprio litoral, Cuité se localiza

a 110Km do litoral e Baraúna a 140Km. Estes fatos permitem a inferência de que os

enxames coletados podem ser enxames pertencentes ao litoral de alguma região

que não foi amostrada.


centroides das distribuições dos grupos (Tabela 25), a maior proximidade

morfológica é observada na população de São Cristóvão (SE), Joaquim Gomes (AL)

e Bela Vista (PI), enquanto que as localidades com apenas um ninho se mostram

populações com maior distanciamento entre si.


Tabela 25: Distâncias quadradas de Mahalanobis, entre os pares de populações estudadas, obtidas de acordo com Análises de Variáveis Canônicas a partir dos dados de morfometria tradicional.


A partir das distâncias quadradas de Mahalanobis foi construído um

dendograma de proximidade morfológica entre os grupos estudados (Figura 31), no

qual fica bem claro o isolamento das localidades pertencentes ao estado da Paraíba.

Figura 31: Dendrograma de proximidade morfológica pelo método de Neighbor Joining entre as populações de A. mellifera.

Quando estas populações foram comparadas duas a duas, na Análise de

Funções Discriminantes, observamos que a maioria das distâncias quadradas de

Mahalanobis entre os centroides de distribuição dos grupos se apresentaram

estatisticamente significantes (P < 0,05) (Tabela 26).


Tabela 26. Significâncias estatísticas entre as populações estudadas obtidas através das Análises de Função Discriminante.

*Em negrito os pares de populações nas quais a distância entre os centróides não foi estatisticamente significante (α = <0,05).


Apesar das localidades do estado da Paraíba possuírem abelhas maiores e

serem classificadas mais distante do restante no dendograma de proximidade, o

teste de Mantel mostrou uma baixa correlação entre distâncias geográficas e

distâncias morfológicas (r = 0.20) e estatisticamente não significante (P = 0.108).

O teste de validação cruzada identificou corretamente 16,2% dos indivíduos dentro

de suas respectivas áreas, indicando também pouca estruturação populacional.

De modo geral os resultados da Morfometria tradicional corroboram com os

resultados da morfometria geométrica, mostrando pouca ou nenhuma estruturação

populacional devido aos vários fatores já abordados que levam estas abelhas a

possuírem um elevado fluxo génico.

Contudo a morfometria tradicional permitiu a observação da diferenciação de

tamanho em localidades pertencentes ao estado da Paraíba, informação esta que

não foi observada nas análises de morfometria geométrica, uma vez que, sem o uso

do tamanho do centroide, o tamanho dos indivíduos não é considerado na análise.

Assim como na morfometria geométrica, também foram realizadas análises

utilizando os climas das localidades amostradas como marcador morfométrico.

Estas análises indicaram dois eixos de separação que maximizam a separação

significativa dessas populações. Dentre as medidas utilizadas, os Ângulos 1, 2, 4 e 9 não

foram estatisticamente significantes para a separação das amostras (Tabela 27).

Tabela 27: Significâncias estatística das medidas de morfometria tradicional na separação dos grupos de acordo com a zona climática onde foram coletadas as amostras de abelhas Africanizadas (Em negrito medidas que não foram significantes na separação das amostras).

Medida P <0,005

Comp. Asa 0,0280342

Larg. Asa 0,040533

Ang. 1 0,292064

Ang. 2 0,064710

Ang. 3 0,030693

Ang. 4 0,059302

Ang. 5 0,003355

Ang. 6 0,006111

Ang. 7 0,000799

Ang. 8 0,001026

Ang. 9 0,201049

Ang. 10 0,002538

Ang. 11 0,030011


Com base nas médias e no desvio padrão das amostras separadas por clima,

foi possível observar diferenças estatisticamente significantes nas medidas relativas

ao tamanho dos indivíduos, indicando que aqueles pertencentes ao Litorâneo Úmido

são maiores do que o restante e que os provenientes do Semiárido são os menores.

Observamos a ausência de diferenças estatisticamente significantes apenas

em algumas amostras do tropical, região esta que já se mostrou entre o Semiárido e

o Litorâneo nas análises anteriores (Tabela 28).

Tabela 28: Média e desvio padrão das medidas de morfometria tradicional tomadas junto aos indivíduos de abelhas Africanizadas coletados em diferentes zonas climáticas do Nordeste brasileiro. Letras iguais na mesma linha indicam diferenças estatisticamente não significantes. Letras diferentes na mesma linha indicam diferenças estatisticamente significantes (P < 0,05)

Litorâneo Úmido Semiárido Tropical

Comp.Asa 5,48 ± 0,13 a 5,41 ± 0,19 b 5,43 ± 0,12 c

Larg.Asa 2,80 ± 0,09 a 2,77 ± 0,16 b 2,75 ± 0,10 a,b

Ang.1 39,39 ± 4,28 a 40,39 ± 4,31 b 39,99 ± 4,81 c

Ang.2 91,25 ± 3,76 a 91,65 ± 3,85 a 92,48 ± 3,43 a

Ang.3 79,00 ± 3,05 a 79,15 ± 3,14 a 78,86 ± 2,35 a

Ang.4 88,52 ± 3,02 a 87,49 ± 3,30 b 88,66 ± 3,11 a

Ang.5 92,72 ± 4,43 a 89,61 ± 4,84 b 92,17 ± 3,87 a

Ang.6 90,78 ± 4,19 a 89,83 ± 4,66 a 90,65 ± 5,27 a

Ang.7 47,41 ± 3,74 a 48,33 ± 4,48 b 46,82 ± 3,86 c

Ang.8 17,16 ± 1,59 a 16,45 ± 2,74 b 16,46 ± 1,68 a

Ang.9 18,22 ± 1,48 a 19,47 ± 7,84 a 19,55 ± 10,33 c

Ang.10 103,03 ± 6,01 a 100,91 ± 8,70 a 100,40 ± 10,56 a

Ang.11 33,09 ± 2,64 a 33,15 ± 2,79 a 33,88 ± 2,24 c

Ao observar a distribuição dos pontos no gráfico de dispersão gerado a partir

da análise das Variáveis Canônicas, foi possível observar a diferenciação entre os

três climas no eixo correspondente à CV1 (Figura 32).

Dentre as medidas que mais influenciaram na separação dos eixos, temos

que o Comprimento da asa foi à medida que mais influenciou o primeiro eixo (CV1),

enquanto que a medida do Ângulo 8 foi a medida que mais influenciou o segundo

eixo do gráfico (CV2).



Interessante notar que, ao observamos apenas o segundo eixo (CV2), é possível

distinguir uma oscilação da magnitude de variação de forma entre os três climas, onde o

clima Semiárido apresenta uma maior variação de forma entre os indivíduos, enquanto

que o clima Litorâneo Úmido apresenta uma menor variação entre os indivíduos.

O semiárido possui condições ambientais mais adversas do que o litorâneo

Úmido (FREITAS, 2007), portanto as abelhas provenientes do Semiárido estão sob

maiores estresses ambientais do que as abelhas provenientes do Litorâneo Úmido.

DEBAT et al., (2003) mostra que estresses ambientais no desenvolvimento dos

indivíduos é o fator chave na forma da asa.

Como já abordado anteriormente, abelhas do semiárido são menores do que

as abelhas do Litorâneo Úmido, essa diferença de tamanho pode influenciar na

eficiência da manutenção da homeostase da colônia, acarretando em maiores

períodos de instabilidade dentro da colônia e por fim ocasionar variações na forma

das populações. Jones et al., (2004) sugere que o desenvolvimento ideal para as

crias de abelhas exige uma temperatura do ninho extremamente estável. Flutuações

assimétricas são mais prováveis de ocorrer em organismos que se desenvolvem sob


condições de estresse, pois apresentam, de modo geral, maior dificuldade em

regular seu desenvolvimento (NUNES, 2012).

A partir das distâncias quadradas de Mahalanobis (Tabela 29) foi construído

um dendograma de proximidade morfológica entre os grupos estudados (Figura 33),

no qual foi possível observar um maior distanciamento entre o Litorâneo Úmido e o

Semiárido, diferente do encontrado na morfometria geométrica.



Tropical 4.19225

Semiárido 16.78640 4.486611





apresentaram estatisticamente significantes (P < 0,00001).


dentro de suas respectivas áreas, indicando uma estruturação bem maior do que

quando separados por localidades. A maior confusão ocorreu na classificação das

amostras coletadas na região Tropical, onde metade foi classificada como Semiárido

e a outra metade como Litorâneo Úmido. Este fato corrobora as informações

encontradas no gráfico de dispersão e no dendograma de proximidade morfológica,

onde as amostras presentes no tropical estão na faixa de transição entre o

Semiárido e o Litorâneo Úmido (Tabela 30).




Litorâneo Úmido 59,6 0 40,4 100

Tropical 50 0 50 100

Semiárido 20,6 1,6 77,8 100

Assim como realizado para as análises de morfometria geométrica, as

amostras de Mossoró coletadas na época das chuvas foram novamente adicionadas

aqui, sendo portanto necessário outra Análise de Componente Principal, já que

novas amostras foram adicionadas. Os seis primeiros eixos apresentaram

autovalores maiores que um, explicando 68,23% da variabilidade dos dados, sendo

17,56% no primeiro eixo e 11,85% no segundo eixo.

A representação gráfica dos dois primeiros eixos da Análise de Componentes

Principais (Figura 34) dos dados de morfometria tradicional indicou uma divisão em

dois grupos, o que antes não era observado.

No primeiro eixo (PC1) à medida que mais contribuiu para o distanciamento

das amostras foi o comprimento da asa anterior, enquanto que no segundo eixo

(PC2) à medida que mais contribuiu foi o ângulo 5.



A Análise de Variáveis Canônicas onde estas amostras foram incluídas

indicou uma mudança no padrão de distribuição dos pontos e, assim como na

análise de morfometria geométrica, foi possível observar a homogeneização das

amostras do Semiárido com as restantes (Figura 35).

Foram encontrados dois eixos que maximizam a separação significativa

dessas populações. Entre as medidas utilizadas, os Ângulos 1, 2, 3, 9 e 11 não

contribuíram significativamente para a separação dos grupos (Tabela 31).



Tabela 31: Significâncias estatística das medidas de morfometria tradicional na separação dos grupos de acordo com a zona climática onde foram coletadas as amostras de abelhas Africanizadas (em negrito medidas que não foram significantes na separação das amostras)

Medidas P<0,05

Comp. Asa 0,000000

Larg. Asa 0,008615

Ang. 1 0,099851

Ang. 2 0,870183

Ang. 3 0,590827

Ang. 4 0,000367

Ang. 5 0,000000

Ang. 6 0,035940

Ang. 7 0,019021

Ang. 8 0,005920

Ang. 9 0,260849

Ang. 10 0,011125

Ang. 11 0,640207


Dentre as medidas que mais influenciaram na separação dos eixos, temos o

comprimento da asa como a medida que mais influenciou o primeiro eixo (CV1),

enquanto a medida do Ângulo 10 foi a que mais influenciou o segundo eixo do

gráfico (CV2).

A partir das distâncias quadradas de Mahalanobis (Tabela 32) foi construído

um dendograma de proximidade morfológica entre os grupos estudados (Figura 36),

no qual essa maior homogeneização também pode ser observada. A distância entre

o Litorâneo Úmido e o Semiárido diminui de 16,78 para 1,33 quando as amostras de

Mossoró coletadas na época da chuva são adicionadas.



Tropical 0.518858

Semiárido 1.339449 2.164804



Na análise de Funções Discriminantes, também observamos que todas as

distâncias quadradas de Mahalanobis entre os centroides de distribuição dos grupos

apresentaram diferenças estatisticamente significantes entre si (P < 0,000001).

O teste de validação cruzada identificou corretamente 60% dos indivíduos dentro

de suas respectivas áreas, assim como na morfometria geométrica aqui também

podemos observar uma maior homogeneização nas classificações (Tabela 33).




Litorâneo Úmido 53,2 27,1 19,7 100

Tropical 32,3 43,5 24,2 100

Semiárido 17,3 17,5 65,2 100

Em um passo adicional, as amostras coletadas em Mossoró na época de

chuvas foram tratadas como sendo um marcador, assim como o Tropical, o

Semiárido e o Litorâneo Úmido. Foram encontrados três eixos que maximizaram a

separação das amostras, dentre as medidas utilizadas os Ângulos 1, 2, 3 e 11 não

contribuíram significantemente (P<0,05) para a separação das amostras (Tabela 34).


Medidas P<0,05

Comp. Asa 0,000000

Larg. Asa 0,000000

Ang. 1 0,126052

Ang. 2 0,177513

Ang. 3 0,381058

Ang. 4 0,000320

Ang. 5 0,000000

Ang. 6 0,070121

Ang. 7 0,000001

Ang. 8 0,000000

Ang. 9 0,002953

Ang. 10 0,217785

Ang. 11 0,506954


Assim como na morfometria geométrica, foi possível observar que as amostras

coletadas em Mossoró na época das chuvas, são as responsáveis por esta

homogeneização encontrada na análise anterior. Além disso, uma parte desta população

se mostra diferente dos três climas amostrados no Nordeste brasileiro (Figura 37).


Dentre as medidas que mais influenciaram na separação dos eixos, temos que o

comprimento da asa foi à medida que mais influenciou o primeiro eixo (CV1), enquanto

que a medida do Ângulo 5 foi a que mais influenciou o segundo eixo do gráfico (CV2).

Devido ao mecanismo de análise das variáveis canônicas que maximizam a

separação de informação grupos, podemos observar que na análise onde somente

os três tipos de climas foram incluídos ocorreu claramente a separação entre eles,

porém, quando uma população diferente, como Mossoró chuvas, foi adicionada a

distância entre os climas antes observadas claramente perto da distância deste novo

grupo inserido se torna pequena a ponto de agrupa-los em praticamente um único

grupo e deixar parte de Mossoró chuvas em outro grupo afastado.


Através das distâncias de Mahalanobis (Tabela 35) e ao observar o

dendograma de proximidade morfológica (Figura 38) foi possível constatar que

apesar de Mossoró se localizar no Semiárido a distância entre as amostras de

Mossoró chuvas e o Litorâneo Úmido (8.2267) é menor do que a distância entre

Mossoró chuvas e o Semiárido (8.5850)



Tropical 0.740017

Semiarido 1.156860 1.45138

Mossoró chuvas 8.226714 12.24034 8.585080





apresentaram diferenças estatisticamente significantes (P < 0,000001).


dentro de suas respectivas áreas. Nesta análise o destaque se dá para as amostras

de Mossoró coletadas na época das chuvas, onde houve 97,6% de acerto dentro do

seu grupo (Tabela 36).


Associação ao grupo prevista Total

% Litorâneo Úmido Tropical Semiárido Mossoró Chuvas

Litorâneo Úmido 48,2 26,1 22 3,7 100

Tropical 22,6 48,4 29 0 100

Semiárido 10,4 25,6 50,3 13,6 100

Mossoró Chuvas 1,2 0 1,2 97,6 100

Assim como na morfometria geométrica, uma segunda análise adicional

foi realizadas, utilizando as amostras coletadas em Mossoró na época da seca

também como um marcador, a fim de entender a relação entre essas duas

amostragens.

Foram encontrados quatro eixos que maximizaram a separação das

amostras, dentre as medidas utilizadas os Ângulos 1, 2, 3, 6, 10 e 11 não

contribuíram significativamente para a separação das amostras (Tabela 37).



Medidas P

Comp. Asa 0,000000

Larg. Asa 0,000000

Ang. 1 0,219174

Ang. 2 0,247709

Ang. 3 0,537152

Ang. 4 0,000909

Ang. 5 0,000000

Ang. 6 0,081848

Ang. 7 0,000002

Ang. 8 0,000000

Ang. 9 0,007131

Ang. 10 0,342886

Ang. 11 0,592207

Dentre as medidas que mais influenciaram a separação das amostras nos

eixos, temos que o comprimento da asa foi à medida que mais influenciou o primeiro

eixo (CV1), enquanto que a medida do Ângulo 5 foi a medida que mais influenciou o

segundo eixo do gráfico (CV2).

Com base nas médias e no desvio padrão das amostras separadas por clima

podemos observar uma diferença significativa no tamanho dos indivíduos, com

exceção das amostras coletadas em Mossoró na época da seca que não

apresentaram diferenças estatisticamente significantes das amostras do Tropical

(Tabela 38).

É possível identificar as amostras coletadas em Mossoró na época das

chuvas como ssendo maiores do que o restante tanto em comprimento quanto em

largura, talvez por terem sido coletadas na época de abundancia de alimento, ao

contrário do restante, que foi coletado na época da seca.

Porém esse não é o único fator que distancia essas amostras do restante,

pois na morfometria geométrica, análise em que não consideramos o tamanho dos

indivíduos, também foi possível observar o distanciamento das amostras de Mossoró

coletadas na época das chuvas do restante dos indivíduos.


Tabela 38: Média e desvio padrão das medidas de morfometria tradicional. Letras diferentes na mesma linha indicam diferenças estatisticamente não significantes (P < 0,05) entre os grupos.

Litorâneo Úmido

Semiárido Tropical Mossoró Seca Mossoró Chuvas

Comp.Asa 5,48±0,19 a 5,43±0,13 b 5,45±0,12 c,d 5,28±0,11 d 5,62±0,26 e

Larg.Asa 2,81±0,089 a 2,81±0,18 b 2,75±0,10 c,d 2,71±0,079 d 2,96±0,21 e

Ang.1 39,40±4,28 a,c,d 40,65±4,54 b,c,d,e 40,00±4,81 c,d,e 39,87±3,77 d 41,46±5,00 e

Ang.2 91,25±3,76 a,b,c,d 91,25±4,049 b,c 92,49±3,43 c 92,49±3,27 d 87,02±7,74 e

Ang.3 79,01±3,05 a,b,c,d 78,94±3,17 b,c,d 78,86±2,35 c,d 79,60±3,04 d 77,62±3,23 e

Ang.4 88,52±3,02 a,c,d,e 87,42±3,41 b,c,d,e 88,67±3,77 c,d,e 87,64±3,07 d,e 87,78±3,18 e

Ang.5 92,72±4,43 a,c,e 89,86±5,18 b,d 92,17±3,87 c,e 89,12±4,04 d 92,92±3,84 e

Ang.6 90,78±4,19 * 89,74±4,50 * 90,65±5,27 * 90,03±4,99 * 89,11±6,89 *

Ang.7 47,41±3,74 a,c,d,e 48,45±4,98 b,d,e 46,83±3,86 c,d,e 48,11±3,22 d,e 47,57±4,86 e

Ang.8 17,17±1,59 a,c 16,48±3,08 b,c,d 16,46±1,68 c,d 16,39±1,84 d 18,07±1,95 e

Ang.9 18,22±1,48 a,c,d,e 19,65±8,15 b,c,d 19,56±10,33 c,d,e 19,11±7,19 d,e 18,23±1,37 e

Ang.10 103,04±6,01 * 101,00±9,35 * 100,41±10,56 * 100,73±7,23 * 100,96±9,15 *

Ang.11 33,10±2,64 a,b,c,e 32,96±2,77 b,e 33,88±2,24 c,e 33,58±2,62 d 33,57±2,62 e


Através do gráfico de dispersão, foi possível observar que apesar das

amostras de Mossoró chuvas e Mossoró seca terem sido coletadas na mesma

localidade, elas se localizam em extremos opostos no gráfico. Porém, a amostra de

Mossoró coletada na época da seca se localiza dentro do grupo Semiárido,

enquanto que a amostra de Mossoró coletada na época das chuvas se localiza

distante do grupo, ficando claro que essa população é diferenciada das demais

(Figura 39).


Através das distâncias quadradas de Mahalanobis e ao observar o

Dendograma de proximidade morfológica também podemos observar que Mossoró

Seca se posiciona ao oposto de Mossoró Chuvas, além disso, Mossoró chuvas se

mostra a população mais afastada (Tabela 39) (Figura 40).



Litorâneo Úmido Tropical Semiárido Mossoró Seca

Tropical 0.83

Semiárido 1.58 2.77

Mossoró Seca 2.21 1.04 2.90

Mossoró Chuvas 10.17 15.17 7.47 18.54




apresentaram estatisticamente significantes (P < 0,000001).


O teste de Validação Cruzada identificou corretamente 53,2% dos indivíduos

dentro de suas respectivas áreas, onde mais uma vez podemos observar Mossoró

chuvas com 96,3% de acerto dentro de seu grupo se mostrando uma população bem

diferente do restante. Por outro as amostras de Mossoró coletadas na época da seca

apresentam apenas 11,5% de acerto e com grande taxa de erro (35,7%) dentro do

grupo Semiárido, localidade essa a de origem das amostras de Mossoró (Tabela 40)


Associação ao grupo prevista Total

% Litorâneo Úmido Tropical Semiárido Mossoró Seca

Mossoró Chuva

Litorâneo Úmido 45,4 24,8 10,6 15,6 3,7 100

Tropical 21 48,4 17,7 12,9 0 100

Semiárido 11,9 16,7 59,5 11,3 0,6 100

Mossoró Seca 11,1 35,4 35,7 11,5 6,4 100

Mossoró Chuva 1,2 0 1,2 1,2 96,3 100

Nestas análises também os resultados da morfometria tradicional corroboram

com os resultados encontrados na morfometria geométrica, onde a divisão por

climas se mostra a mais informativa perante a realidade do Nordeste brasileiro.

Assim como na morfometria geométrica podemos observar certa estruturação

entre os três climas amostrados, sugerindo grupos relativamente adaptados a estas

condições ambientais, apesar de haver fluxo gênico entre eles.

Vários outros trabalhos chegaram a resultados similares utilizando a

morfometria tradicional como ferramenta para avaliar diferenças populacionais em

Apis mellifera expostas a diferentes condições ambientais.

Gruber et al., (2013) analisaram a divergência morfológica e genética de

populações de abelhas A. m. monticola em uma região topograficamente

heterogênea do Leste Africano. Os resultados mostram divergência fenotípica entre

as colônias de áreas de floresta e as colônias de área de savana. Diniz-Filho et al.,

(1995) demonstraram que as abelhas Africanizadas das regiões Sul e Sudeste do

Brasil são mais parecidas com as abelhas europeias do que aquelas encontradas

nas regiões Norte e Nordeste, indicando uma maior influência das abelhas africanas

nas abelhas Africanizadas do Nordeste brasileiro.


COROIAN et al., (2014) encontraram que a diferenciação entre duas

subespécies é fortemente influenciada pelas várias zonas de temperatura na

Romênia, onde a A. m. carnica é mais abundante nas regiões com temperatura

média inferior a 9 ° C, enquanto que A. m. macedonica são abelhas mais frequentes

em regiões com temperaturas médias acima de 9 ° C, embora ambas as

subespécies existam em todas as faixas de temperaturas da Romênia.

Em nosso estudo, através da morfometria tradicional conseguimos

informações extras relacionadas com o tamanho dos indivíduos, onde foi possível

observar através das médias e do desvio padrão que as amostras do Litorâneo

Úmido são significativamente maiores do que as amostras do Semiárido.

Isto porque diferentemente da morfometria geométrica, na tradicional são

utilizadas medidas lineares e angulares, na qual medidas lineares estão mais ligadas

a variações geográficas (ambientais), enquanto que as medidas angulares são

neutras e mais relacionadas com informações filogenéticas e processos associados

à deriva genética e migração de curta distância (DINIZ-FILHO, 1999; 2000).

Segundo Freitas (2007) durante a seca muitas colônias do Semiárido migram para

áreas litorâneas onde o clima é mais ameno e muitas espécies vegetais florescem nesta

época do ano. Estas floradas podem ser o fator determinante para explicar o fato das

abelhas do Litorâneo Úmido serem maiores do que as do Semiárido.

No trabalho de Francoy (2007) foi mostrado através da morfometria tradicional

a existência de um gradiente de tamanho entre as abelhas Norte-Sul do Brasil, onde

as abelhas do Nordeste eram menores em relação as abelhas do Sul e Sudeste.

Nossos dados também indicam que este gradiente de tamanho existe em micro

escala dentro do Nordeste brasileiro, onde abelhas do Semiárido são menores do

que as abelhas do Litorâneo Úmido.

Até o presente momento, nossos dados mostram que de forma geral ambas as

técnicas de morfometria apresentaram resultados satisfatórios e congruentes entre si.

Alguns estudos enfatizam que a morfometria geométrica é mais confiável na

discriminação de subespécies de abelhas do que a morfometria tradicional

(FRANCOY et al., 2008;. TOFILSKI, 2008;. KANDEMIR et al., 2011). Porém na

morfometria tradicional as medições de caracteres de tamanho são altamente inter-

relacionadas com os parâmetros geográficos enquanto que os ângulos são inter-

relacionados com a filogenia (DINIZ-FILHO et al., 1999.; RUTTNER et al., 2000).

Estas medidas podem ser utilizadas de forma bastante efetiva em estudos


populacionais, onde informações ecológicas são de grande valia na interpretação

dos dados, justificando ainda sua utilização para o enriquecimento das análises. Os

resultados deste estudo mostram claramente que ambas as técnicas apresentaram

bons resultados na avaliação da variabilidade de populações de abelhas

Africanizadas. Contudo devido as diferenças ambientais encontradas na região

amostrada, a morfometria tradicional contribuiu com informações adicionais sobre o

tamanho dos indivíduos, o que nos permitiu um melhor entendimento dos dados.

Por outro lado através da morfometria geométrica foi possível observar uma

diferença na forma das asas entre as abelhas coletadas em Mossoró na época das

chuvas e também das abelhas do estado da Paraíba perante as demais populações,

diferença esta que vai além do tamanho dos indivíduos, sugerindo assim uma

plasticidade fenotípica destas abelhas em resposta a diferentes climas. Estas

informações deverão ser objeto de estudos mais aprofundados no futuro, para sua

utilização em trabalhos de seleção e melhoramento genético, bem como para o melhor

entendimento da biologia básica de abelhas Africanizadas e sua dinâmica populacional.

4.2 Análises de DNA mitocondrial

Depois de alinhadas e editadas as sequências, obtivemos fragmentos de 624

pb. Dentre as 116 sequências analisadas, foram identificados, ao todo, onze

diferentes haplótipos, correspondentes a nove sítios variáveis (Tabela 41).

Tabela 41: Haplótipos com seus respectivos sítios variáveis e sua posição em pb dentro do fragmento do gene COI.

Haplótipos 34 130 177 202 245 280 334 382 523 N

H1 T C T C G G C C G 28

H2 . T C . . A T . A 33

H3 C . C . . . . . A 40

H4 . T . T . . T A 3

H5 . . . . A . T A 4

H6 C . C . . . . T A 1

H7 . T C . . A T . . 1

H8 . . . . . . . . A 2

H9 . T . . . . . . A 2

H10 C . C . . . . . . 1

H11 . . C . . . . . A 1


A composição nucleotídica foi de A = 33,03%, C = 15,34%, G = 10,29%, T =

41,70%, onde podemos observar uma maior porcentagem de bases A e T (74,73%),

o que já é o esperado para o genoma mitocondrial de insetos (CROZIER &

CROZIER, 1993; SIMON, et al., 1994)

Foi encontrada uma diversidade haplotípica média de 0,743 e uma

diversidade nucleotídica média de 0,00504. Os valores referentes à quantidade de

amostras, de sítios polimórficos, de haplótipos, de diversidade haplotípica (HD) e

nucleotídica (π) por localidade estão resumidos na tabela 42.

Tabela 42: Diversidade genética das populações de Apis mellifera para os haplótipos do gene mitocondrial COI.

Localidades Número de Sequências

Sítios Polimórficos

Haplótipos HD π

Bela Vista 16 9 7 0,775 0,00417

Brejo Grande 7 5 3 0,667 0,0043

Joaquim Gomes 2 4 2 0,667 0,00481

Mossoró 18 7 4 0,708 0,00492

Murici 2 5 2 1 0,00903

Parnaíba 13 8 4 0,769 0,00528

Rio Largo 8 6 3 0,464 0,00367

São Cristóvão 12 6 6 0,848 0,00539

São Paulo do Potengi 3 4 2 0,667 0,00481

São Raimundo Nonato

13 5 3 0,564 0,00315

Taperoá 5 3 2 0,4 0,00217

Isaias Coelho 4 4 1 0 0

Braúna 2 0 1 0 0

Cuité 2 5 1 0 0

Macaíba 1 3 1 0 0

Maturéia 1 5 1 0 0

João pessoa 1 5 1 0 0

Maceió 1 3 1 0 0

Barra de Sto. Antônio 5 5 1 0 0

Total 112 9 11 0,743 0,00504

Murici (AL) foi a região com maior diversidade haplotípica e nucleotídica e

com haplótipos que mais divergiram entre si, enquanto os haplótipos de Taperoá

(PB) foram os mais semelhantes entre si.


Em populações de Apis cerana da China, a diversidade haplotípica

encontrada foi de 0,752 enquanto a nucleotídica foi de 0.010 (YIN & JI, 2012). Em

populações nativas do Noroeste da Europa (A. m. mellifera) a diversidade

haplotipica variou de 0,220 a 0,640 e a diversidade nucleotídica de 0,037 a 0,080

(JENSEN et al., 2005). Interessante notar que ambos os casos descritos acima

apresentam diversidade haplotípicas semelhante à encontrada em nossos estudos,

mesmo se tratando de populações nativas, diferente do nosso caso. Já no tocante à

diversidade nucleotídica as populações nativas apresentaram valores superiores aos

nossos.

Segundo Nei (1978), a diversidade haplotípica considera o número e a

frequência de haplótipos observados, já o índice de diversidade nucleotídica é

menos influenciável pelo tamanho amostral, tornando-o neste caso mais adequado

para a comparação da variabilidade genética entre populações, já que temos

localidades com baixa amostragem. Os altos valores de diversidade haplotípica e

baixos valores de diversidade nucleotídica encontrados para a maioria das

populações mostram indícios de que a população passou por um período de baixo

tamanho efetivo seguido de um rápido crescimento, acumulando mutações.

(GRAND & BOWEN, 1998), fatos estes perfeitamente condizentes com a história de

introdução das abelhas Africanas no Brasil. O único fato que nos parece pouco

provável aqui é o acúmulo de mutações, dada a curta história de menos de 60 anos

de introdução destas abelhas aqui em território brasileiro.

Os haplótipos H1, H2 e H3 foram os mais frequentes entre as populações,

sendo, pelo menos um dos três, encontrados em todas as localidades. As

populações de Bela Vista (PI) e São Cristóvão (SE) foram as mais diversas com sete

haplótipos cada (Tabela 43).


Tabela 43: Frequência de distribuição (%) dos haplótipos nas populações de A. mellifera amostradas.


Foram encontrados quatro haplótipos exclusivos, sendo estes: H6 encontrado

na população de Isaias Coelho (PI), H7 e H10 encontrados na população de São

Cristóvão (SE) e H11 encontrado na população de Bela Vista (PI).

De acordo com a rede de haplótipos (Figura 41) e o dendograma de

proximidade genética (Figuras 42 e 43), foi possível observar ausências de

estruturação populacional. O teste de Mantel apresentou resultados significantes ao

comparar as distâncias moleculares com as distâncias geográficas (P= 0.0010),

porém indicou total ausência de correlação entre elas (r = 0.0055). Através de outro

teste de Mantel foi observado uma baixa correlação entre as distâncias moleculares

e as distâncias morfológicas tanto para a morfometria tradicional quanto para a

morfometria geométrica (r = 0.0044 e r = 0.0024) e estatisticamente não significante

(P = 0.478 e 0.580) respectivamente. Estes resultados indicam que os haplótipos

mitocondriais encontrados neste trabalho estão distribuídos de maneira aleatória

entre as populações.

Segundo Crandall et al., (1992) os haplótipos ancestrais devem ser

encontrados no centro da rede, enquanto que os haplótipos mais recentes devem

ser encontrados rodeando seus ancestrais através de ramificações que representam

as mutações que originaram estes novos haplótipos. Porém ao observar a rede de

haplótipos (Figura 41) não podemos afirmar quais haplótipos são ancestrais e quais

são recentes. A frequência de cada haplótipos obtido neste trabalho pode estar

sendo influenciada tanto pela amostragem aqui obtida quanto pela amostragem feita

pelo Professor Warwick Estevam Kerr, quando da introdução das abelhas africanas

no Brasil. O ponto vermelho denominado MV1 no centro do losango representa a

posição de um possível ancestral que não foi amostrado.


Figura 41: Rede de haplótipos para o gene COI da espécie Apis mellifera. O tamanho das esferas representa o número de indivíduos e os pontos entre as esferas representam os sítios polimórficos. As diferentes cores indicam a porcentagem de cada haplótipos provenientes das diferentes localidades amostradas.


Figura 42. Dendograma de proximidade genética entre as populações de A. mellifera, calculado a partir das sequencias obtidas para o gene COI. As análises foram realizadas segundo a metodologia de Neighbor Joining. Entre parênteses a quantidade de cada localidade dentro do respectivo haplótipo.


Figura 43. Dendograma de proximidade genética entre os haplótipos encontrados nas populações de abelhas Africanizadas no Nordeste brasileiro. As análises foram realizadas segundo a metodologia de Neighbor Joining.


O Percentual de divergência nucleotídica, baseada no modelo Kimura-dois-

parâmetros (K2P) foi calculado entre os pares dos 11 haplótipos (Tabela 44). A

divergência intraespecífica variou de 0,2% a 1,3%, a maior diferença foi a

encontrada entre os haplótipos 5 e 7, separados por sete passos mutacionais. Estes

dados corroboram com os resultados de Arias & Sheppard (1996) que ao analisarem

várias subespécies de A. mellifera, encontraram uma diversidade intraespecífica que

variou de 0,3% a 0,61%.

Segundo Hebert et al., (2003b) o limiar para o diagnóstico de espécie é 3%,

com exceção de espécies proximamente relacionadas. Os resultados aqui

apresentados mostram que apesar de observamos até sete passos mutacionais

entre os diferentes haplótipos, a maioria dos percentuais de divergência nucleotídica

são inferiores a 1%, mostrando populações bem similares.

Tabela 44: Percentual de divergência nucleotídica, baseada no modelo K2P (metade inferior da tabela) e número de passos mutacionais (metade superior da tabela), calculada entre os pares de haplótipos

H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11

H1 5 3 3 3 4 6 1 2 4 2

H2 0.9% 4 4 6 5 1 4 3 5 3

H3 0.5% 0.7% 4 4 1 5 2 3 1 2

H4 0.5% 0.7% 0.7% 4 5 5 2 1 5 3

H5 0.5% 1.1% 0.7% 0.7% 5 7 2 3 5 3

H6 0.7% 0.9% 0.2% 0.9% 0.5% 6 3 4 2 2

H7 0.7% 0.2% 0.9% 0.9% 1.3% 1.1% 5 4 6 4

H8 0.2% 0.7% 0.4% 0.4% 0.4% 0.5% 0.9% 1 3 1

H9 0.4% 0.5% 0.5% 0.2% 0.5% 0.7% 0.7% 0.2% 4 2

H10 0.4% 0.9% 0.2% 0.9% 0.9% 0.4% 0.7% 0.5% 0.7% 2

H11 0.4% 0.5% 0.2% 0.5% 0.5% 0.4% 0.7% 0.2% 0.4% 0.4%

Adicionamos nesta análise uma sequência de Apis mellifera scutellata

(número de acesso NCBI GeneBank: KJ60174.1) e uma sequência de Apis mellifera

ligustica (número de acesso NCBI GeneBank: L06178.1).

Ao adicionarmos estes dois novos grupos, obtivemos 12 haplótipos,

correspondentes a 14 sítios variáveis. A sequência de A. m. scutellata se agrupou no

haplótipo H1, já a sequência de A. m. ligustica formou um novo haplótipo com 5

sítios variáveis a mais do que o restante, estando estes presentes nas posições,

25pb, 127pb, 440pb, 533pb e 535pb (Tabela 45). Ao comparar os grupos externos


com nossas amostras observamos que todas as mutações que incluem a

subespécie A. m. scutellata foram sinônimas, ou seja, não houve modificação na

sequência proteica gerada. A proximidade das sequências de nossas populações

com a sequência de A. m. scutellata confirma a origem africana do material genético

mitocondrial de nossas abelhas. Já a sequência da subespécie A. m. ligustica

apresentou nove mutações não sinônimas onde houve modificação na sequencia

proteica, estando estas presentes nos sítios, 25pb, 127pb, 177pb, 245pb, 280pb,

440pb, 533pb e 535pb. Segundo Hebert et al., (2003b) as modificações na

sequência proteica podem indicar indivíduos pertencentes a uma categoria

taxonômica mais elevada.

Porém ao observar somente nossas sequências, constatamos que dentre os

nove sítios polimórficos houve modificação na sequência proteica gerada em três

deles, correspondentes aos sítios 177pb, 245pb e 280pb, onde os haplótipos H1,

H4, H8 e H9 apresentaram apenas mutações sinônimas, os haplótipos H3, H6, H10

e H11 apresentaram uma mutação não sinônima (Mutação 3), onde houve a troca

de uma metionina por uma treonina, os haplótipos H2 e H7 apresentaram duas

mutação não sinônimas (Mutação 3 e Mutação 6), na mutação 5 houve a troca de

uma treonina por uma alanina, o haplótipo H5 também apresentou uma mutação não

sinônima (Mutação 5), onde houve a troca de uma alanina por uma treonina.


Tabela 45: Haplótipos com seus respectivos sítios variáveis e sua posição em pb dentro do fragmento do gene COI. Em negrito as mutações não sinônimas. Em vermelho a denominação numérica para cada mutação não sinônima.


A troca entre as bases Timina e Citosina representam 71,5% das mutações

encontradas, a troca entre as bases Alanina e Guanina representam 21,5%, em

ambos os casos se tratam de transições (troca de uma purina por outra ou de uma

pirimidina por outra). Resultados estes que corroboram com os dados encontrados

por Arias & Sheppard, (1996) onde a troca entre Timina e Citosina foi de 85,2% e a

troca entre Alanina e Guanina foi de 14,8%.

Segundo Hartl & Clark, (1997) um pequeno tamanho efetivo da população

pode muitas vezes explicar o acúmulo mais rápida de mutações no genoma

mitocondrial em relação ao nuclear. Jermiin & Crozier, (1994) indicaram altas taxas

de substituição mitocondriais e mais frequentes rearranjos gênicos em

Hymenoptera, quando comparados. Pelo fato destas abelhas terem sido

introduzidas no Brasil recentemente, acreditamos que estas mutações tenham

ocorrido há muito mais tempo, de forma que os indivíduos portadores de tais

mutações foram aleatoriamente introduzidos quando da importação das abelhas

para o Brasil. Porém para a comprovação desta hipótese seria interessante uma

maior amostragem do lugar de origem das abelhas A. m. scutellata para

compararmos com os resultados aqui obtidos. Desta forma poderemos confirmar tal

hipótese.

Através do dendograma de proximidade morfológica (Figura 44) também

podemos observar que a sequência de A. m. scutellata se agrupa no Haplótipo 1

enquanto que a sequência de A. m ligustica se isola em outro ramo. Alguns

trabalhos já comprovaram a predominância da origem africana nas populações

brasileiras de abelhas Africanizadas, principalmente no Nordeste brasileiro

(FRANCOY, 2007; DINIZ-FILHO, 1995; FERREIRA, 2009).


Figura 44. Dendograma de proximidade genética entre as populações de A. mellifera, calculado a partir das sequencias obtidas para o gene COI. As análises foram realizadas segundo a metodologia de Neighbor Joining. Entre parênteses a quantidade de cada localidade dentro do respectivo haplótipo.


O Percentual de divergência nucleotídica, baseada no modelo Kimura-dois-

parâmetros (K2P) também foi calculado (Tabela 45). A divergência encontrada

variou de 1,3% a 2,2%. Como já discutido anteriormente segundo Hebert et al.,

(2003b) o limiar para o diagnóstico de espécie é 3%, porém valores maiores do que

2% já podem sugerir isolamento reprodutivo. O que também corrobora com o

trabalho de Arias & Sheppard, (1996), onde encontraram uma diversidade

interespecífica que variou de 1,22% a 2,13%. O isolamento reprodutivo neste caso

se deu por razões geográficas, uma vez que A. m. scutellata é uma subespécie sub-

Sahariana e A. m. ligustica uma subespécie restrita à região Mediterrânea da

Europa, principalmente na Itália (RUTTNER, 1988). Quando colocadas em uma

mesma região geográfica, como aconteceu no Brasil, o isolamento reprodutivo

desaparece (CRISTINO, 2003; TEXEIRA, 1993).

Tabela 45: Percentual de divergência nucleotídica, baseada no modelo K2P), calculada entre os pares de haplótipos

A.m. scutellata

A.m. ligustica

H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10

A.m. ligustica

1.5%

H1 0% 1.5%

H2 0.9% 2.0% 0.9%

H3 0.5% 1.3% 0.5% 0.7%

H4 0.5% 1.3% 0.5% 0.7% 0.7%

H5 0.5% 1.6% 0.5% 1.1% 0.7% 0.7%

H6 0.7% 1.5% 0.7% 0.9% 0.2% 0.9% 0.5%

H7 0.7% 2.2% 0.7% 0.2% 0.9% 0.9% 1.3% 1.1%

H8 0.2% 1.3% 0.2% 0.7% 0.4% 0.4% 0.4% 0.5% 0.9%

H9 0.4% 1.5% 0.4% 0.5% 0.5% 0.2% 0.5% 0.7% 0.7% 0.2%

H10 0.4% 1.5% 0.4% 0.9% 0.2% 0.9% 0.9% 0.4% 0.7% 0.5% 0.7%

H11 0.4% 1.5% 0.4% 0.5% 0.2% 0.5% 0.5% 0.4% 0.7% 0.2% 0.4% 0.4%

A partir dos resultados obtidos (Tabela 46), podemos perceber um Fst com

valores elevados, porém ao contrario disso as análises anteriores mostram uma falta

de estruturação populacional. Todas as localidades com amostragem de um ou dois

ninhos apresentaram Fst 1, podemos sugerir aqui, que além da forma como estas

abelhas foram introduzidas o que também pode estar influenciando nos valores de

Fst é a grande quantidade de haplótipos únicos ou com poucos indivíduos,


provavelmente resultado de uma amostragem deficiente em algumas localidades. A

colonização de um local por uma determinada população afeta a estrutura genética,

onde efeitos de fundação durante a colonização podem aumentar os valores Fst

(WRIGHT, 1949). Porém estes valores dependem do modo de colonização, isto é da

fonte que se originam os imigrantes (SLATKIN, 1977).

Darger (2013), ao comparar abelhas Africanizadas do Brasil com abelhas

Africanizadas dos Estados Unidos obteve valores de Fst que variaram de 0.0000 a

0.1546, sendo estes, valores muito inferiores aos aqui encontrados para populações

muito mais próximas. Em espécies de abelhas nativas do continente, como, por

exemplo, a espécie de abelha nativa Melipona subnitida podemos encontrar valores

de Fst altos, Bonatti et al., (2014) mostra valores que variam de 0,14325 a 0,78692,

sugerindo que essas abelhas já podem estar em processo de diferenciação.

Francisco & Arias (2009) também encontraram valores de Fst parecidos (de 0,1659

a 0,7266) ao analisarem abelhas nativas do Brasil (Plebeia remota) da região sul e

sudeste.


Tabela 46: Valores de Fst calculados (metade inferior da tabela) e significâncias estatísticas (metade superior da tabela) entre os pares das populações de A. mellifera estudadas (+ estatisticamente significante; - estatisticamente não significante).


Assim como para as análises de morfometria, os climas das regiões

amostradas foram utilizados como fatores de divisão, porém, as amostras de

Mossoró coletadas na época das chuvas não chegaram a ser sequenciadas, por

isso não foram incluídas na análise. O número de indivíduos, de sítios polimórficos,

de haplótipos e de diversidade haplotípica e nucleotídica para cada região estão

resumidos na tabela 47.

Tabela 47: Diversidade genética das populações de Apis mellifera para os haplótipos do gene mitocondrial COI.

Clima Número de Sequências Sítios Polimórficos Haplótipos HD π

Semiárido 61 9 8 0,743 0,00462

Litorâneo Úmido 42 6 6 0,639 0,00437

Tropical 13 8 4 0,764 0,00525

Total 116 9 11 0,743 0,00504

A região Tropical foi a que apresentou com maior diversidade haplotípica e

nucleotídica, com haplótipos que mais divergiram entre si, enquanto os haplótipos do

Litorâneo Úmido foram os mais semelhantes entre si. O Semiárido foi a região com

maior quantidade de haplótipos, o que pode ser explicado devido sua maior

amostragem.

Os haplótipos H1, H2 e H3 foram os mais frequentes, presentes nas três

populações, os haplótipos H4, H5, H8 e H11 são haplótipos únicos do Semiárido,

enquanto que os haplótipos H7, H9 e H10 foram únicos no litorâneo úmido (Tabela 48).

Tabela 48: Frequência de distribuição (%) dos haplótipos nas populações de A. mellifera amostradas.

Semiárido Litorâneo Úmido Tropical

H1 32,30% 9,30% 36,40%

H2 14,00% 53,50% 18,20%

H3 37,10% 27,90% 36,40%

H4 4,80% 0,00% 0,00%

H5 4,80% 0,00% 0,00%

H6 1,60% 0,00% 9,00%

H7 0,00% 2,30% 0,00%

H8 3,20% 0,00% 0,00%

H9 0,00% 4,60% 0,00%

H10 0,00% 2,30% 0,00%

H11 1,60% 0,00% 0,00%


De acordo com a rede de haplótipos (Figura 45) e o dendograma de

proximidade genética (Figura 46) não foi possível observar uma agrupação lógica.

Figura 45: Rede de haplótipos para o gene COI da espécie Apis mellifera. O tamanho das esferas representa o número de indivíduos e os pontos entre as esferas representam os sítios polimórficos.


Figura 46. Dendograma de proximidade genética entre as populações de A. mellifera. As análises foram realizadas segundo a metodologia de Neighbor Joining.


A fim de se conhecer a estruturação genética, foram calculados os valores de

Fst entre os pares dos climas das regiões amostradas (Tabela 49). Os resultados

aqui apresentados são mais condizentes com o observado em outros marcadores,

mostrando baixa estruturação populacional. Estes resultados corroboram com a

discussão anterior relacionada com à baixa amostragem de algumas localidades

para explicar a alta estruturação encontrada no teste Fst anterior onde utilizamos as

localidades como divisor.

Tabela 49. Valores de Fst calculados (metade inferior da tabela) e significâncias estatísticas (metade superior da tabela) entre os pares das populações de A. mellifera estudadas (+ estatisticamente significante; - estatisticamente não significante).

Semiárido Litorâneo Úmido Tropical

Semiárido 0.00000 + +

Litorâneo Úmido 0.19523 0.00000 +

Tropical 0.05232 0.16245 0.00000

Porém, mesmo assim ainda existe uma grande diferença amostral quando

consideramos os climas das regiões amostradas, portanto nossos resultados são

apenas inferências que ainda precisam ser confirmadas com a análise de um maior

número de colônias. Além disso, como já discutido pelo fato destas abelhas terem

sido introduzidas no Brasil, seria interessante uma maior amostragem do lugar de

origem das abelhas A. m. scutellata para compararmos com os resultados aqui

obtidos.

Conclusões e

Considerações Finais

Conclusões e Considerações Finais | 117

5 CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES FINAIS

O trabalho aqui apresentado avaliou a variabilidade genética e morfológica

das abelhas Africanizadas no Nordeste brasileiro, o que permitiu a realização de um

diagnóstico mais completo do atual status da variabilidade das abelhas Apis

mellifera no Nordeste brasileiro. Com base em nossos resultados podemos concluir

que:

O resultado das análises Morfométricas utilizando Localidades como

classificador mostram populações morfometricamente muito similares,

sugerindo alto fluxo gênico e ausência de estruturação entre as populações

amostradas;

Os Climas das localidades amostradas se mostraram classificadores

morfométricos mais eficientes para o entendimento da estruturação

populacional das abelhas Africanizadas no Nordeste brasileiro do que

classificadores políticos como as localidades;

O resultado das análises morfométricas, utilizando climas como

classificador morfométrico, indicou certa estruturação entre os três climas

amostrados, sugerindo grupos relativamente adaptados a estas condições

ambientais, apesar de haver fluxo gênico entre eles;

Os resultados mostram também que as amostras coletadas em

Mossoró durante a época de chuvas se mostram relativamente mais próximas

das amostras do litorâneo úmido do que com as amostras coletadas em

Mossoró durante a seca, enquanto que estas se mostram mais próximas do

Semiárido;

Abelhas do Semiárido são menores e possuem maior variação na

forma do que as abelhas do Litorâneo Úmido;

De forma geral, ambas as técnicas de morfometria apresentaram

resultados satisfatórios e congruentes entre si;

Através da morfometria geométrica foi possível sugerir a existência de

plasticidade fenotípica destas abelhas em resposta a diferentes climas;

Nossa amostragem revelou, através da análise molecular, uma alta

variabilidade genética (11 haplótipos);

Conclusões e Considerações Finais | 118

Através da análise do DNA mitocondrial não foi possível agrupar os

indivíduos por localidades ou climas, indicando que a estrutura populacional

construída a partir deste gene não é influenciada por este marcador;

Através do uso de grupos externos, ocorreu o agrupamento de nossas

amostras junto a abelha africana Apis mellifera scutellata, confirmando as

origem materna dos enxames de abelhas Africanizadas;

Nossos dados mostraram que as abelhas Apis mellifera da região do

Nordeste brasileiro estão sob influencia ambiental e antrópica, o que vem

resultando em altos níveis de fluxo gênico e miscigenação de haplótipos.

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