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Différenciation endothéliale et processus angiogéniques
Pr Philippe NGUYENEA3801 et Laboratoire d’Hématologie
Université de Reims
Champagne Ardenne CHU de ReimsEA3801
Cellule endothéliale
Cellules aplaties (L:100 µm-l:10 µmÉpaisseur :0,3 µm)disposées en mosaïque
- Corps de Weibel Palade (ME)- Facteur Willebrand- PECAM1 (CD31) / VE-Cadhérine (CD144)- Synthèse de NO (eNOS)- JAMS/Esélectine/VEGFR2
1 à 6 10 13 cellulesPoids total : 1 kgSurface : 1 à 7 m2
AngiogénèseANGIOGENESE POST-EMBRYONNAIRE, NON TUMORALE :• angiogénèse : prolifération capillaire, favorisant le flux sanguin • vasculogénèse : à partir de progéniteurs endothéliaux• artériogénèse : développement des réseaux collatéraux (résistance)
HypoxieMigration / Prolifération
Différenciation
HIF-1Facteurs de croissance/Cytokines
VEGF, FGF, IGF…
• Cellule progénitrice endothélial : – endothelial progenitor cell (PEC)
– Différenciation et acquisition d’un phénotype endothélial à partir d’une cellule souche hématopoïétique CD34+ [Asahara, 1997]
– Circulating bone marrow-derived endothelium progenitor cells (CEPCs) [Rafii, 1998] :• CD34+• Marqueurs phénotypiques : facteur von
Willebrand, Dil-Ac-LDL.
Sang de cordon
1. Isolement des PBMC
3.Tri immuno-magnétique des cellules CD34 positives
2. Élimination des cellules adhérentes
4.Mise en culture dans des « conditions endothéliales » (VEGF …)
Isolement des cellules CD34+
Analyse de l’expression membranaire et moléculaire à différent temps de la différenciation:
VEGF, VEGFR1,VEGFR2,CD144(VE-cadhérine), et FT
Modèle de différentiation des cellules CD34+ en progéniteurs endothéliaux (PEC)
Cellule souche CD34+
Progéniteurs endothéliaux
J0 J25-30Facteurs de
croissance
(VEGF…)
Caractérisation des PEC
• Culture cellulaire– À partir de sang de cordon, de sang périphérique
– Support :
• gélatine, fibronectine, collagène de type I
– Facteurs de croissance :
• VEGF, IGF-1, EGF, FGF-B
– Temps d’obtention – Aspect des colonies :
• Cellules adhérentes « spindle shaped »
• Tapis de cellules fusiformes
précoces
tardives
Phénotype des PEC
• CD133 (AC133) :– Exprimé par la CSH– Absent de la cellule endothéliale mature et
du monocyte– Différenciation endothéliale in vitro
• CD34 : – marqueur de cellule souche hématopoïétique– Présent (faible expression) sur la cellule
endothéliale mature• VEGF-R2 (KDR) :
– Marqueur endothélial
VEGFR2
EPC
HUVEC
CD34
Co
un
tCD34
CD34
EPC
HUVEC
Co
un
t
Phénotypage des PEC par cytométrie en flux
CD34 : PBMC de sang de cordonPEC : en milieu de culture adaptéHUVEC : Cellules endothéliales matures
EA3801
Origine (multiple) des précurseurs endothéliaux
HSC
Progéniteurs Myéloïdes
Progéniteurs Endothéliaux
Hémangioblaste
Monocyte
Progéniteurs endothéliaux circulants
Monocyte
PEC
CD14+
CD14+,CD34low, KDR+
Sous-type myéloïde
CD34+, CD133+, KDR+
« True angioblast »
PEC
CD34+
Leri, Circ Res 2005
Origine et différenciation des progéniteurs endothéliaux, d’après Dimmeler, 2004.
• Mesure de la prolifération• Expansion• Migration cellulaire• Formation de tubes : (Matrigel)Formation de tubes : (Matrigel)• Activité paracrine :
– synthèse de facteurs de croissance : VEGF, HGF, G-CSF, GM-CSF
• Modèles animaux :– Implant de Matrigel– Modèle d’ischémie de la patte (ligature de l’artère
fémorale)
Caractérisation des PEC
Rehman, 2003 ; Hur, 2004
X 40
Sources possibles de cellules endothéliales
– Cellules souches : CSH, cellules souches « cardiaques », cellules souches mésenchymateuses,
– Cellules myéloïdes : • CD14+/VEGF-R2+ CD34-/CD133- :• Acquisition de marqueurs endothéliaux
phénotypiques• Formation de tubes in vitro
– Cellules endothéliales matures :• shedding vasculaire
Mobilisation des « PEC »
Cellules stromales médullaires
Hémangioblaste
cKit+
PEC circulantsPrécurseur hématopoïétiquecirculants
mKitL MMP-9
sKitL
Moelle osseuse
Sang
Barrière endothéliale
D’après Hristov, 2003
Mobilisation des PEC
• Micro-environnement, « niches » :– Fibroblastes, ostéoblastes, cellules endothéliales
• Protéinases :– Élastase, cathepsine G, métalloprotéinases
matricielles (MMP)– Clivage de mkitL (kit ligand membranaire) par
MMP-9
• Facteurs de croissance– G-CSF, GM-CSF, EPO– SDF-1, VEGF, angiopoïétine
Processus de réparation endothéliale par les PEC
intégration
PEC
CE
CML
TransdifférenciationD’après Hristov, 2003
Matrice extracellulaire
Cellule endothélialeCirculante (CEC)
CD146 +
CD31 +
vWF+
Comparaison CEC versus PEC
• Cellule mature, provenant de la paroi vasculaire
• Témoin d’une lésion vasculaire
• Expression de marqueurs endothéliaux : CD146, vWF, CD31…
• Pas d’expression des marqueurs CD45/CD133
• Pas de potentiel clonogénique
• Progéniteur• Témoin d’une lésion
vasculaire ? D’une régénération ?
• Faible expression de CD146, CD31
• Faible expression de CD45, expression de CD133
• Potentiel clonogénique
CEC PEC
20 cellules/mL
Dimmeler, 2004
Différents phénotypes endothéliaux
• Cellule « tip »– Leader– Filopodes étendus– Signaux de direction– Migration à travers la matrice
extracellulaire• Cellule « stalk »
– Prolifération– Vacuoles créant la lumière
vasculaire– Produit la matrice
• Cellule « phalanx »– Devient quiescent– Monocouche– Jonctions serrées– Contact avec le péricyte
Induction et déstabilisation de la paroi capillaire
• Induction par hypoxie– HIF : complexe hétérodimérique sensible à
l’hypoxie– En hypoxie : dimérisation et activation des
gènes cibles (HRE : promoteurs)
• Déstabilisation de la paroi capillaire : sortie de la quiescence endothéliale– NO libéré lors de l’hypoxie : favorise la
perméabilité induite par le VEGF– VEGF : VEGF-R2 : activité tyrosine kinase
(MAPK/PI3K)– Angiopoiétines
Facteurs de croissance angiogéniques
• VEGF– Effet via les récepteurs VEGF-R1 (flt-1) et VEGF-R2
(flk/KDR) : activité tyrosine kinase– Favorise la migration et la prolifération endothéliale– Augmente la perméabilité vasculaire
• Angiopoïétine-1– Effet via le récepteur Tie2 (tyrosine kinase)– Effet sur l’engagement des précurseurs
endothéliaux– Effet sur la migration endothéliale– Pas d’effet sur la prolifération endothéliale– Recrutement des péricytes
• Angiopoïétine-2– Expansion cellulaire
• b-FGF– Anti-apoptotique, activation d’Akt
Inhibiteurs de l’angiogénèse
• Angiostatine– 38 kDa, 3 kringles– Générée par protéolyse du plasminogène par métallo-
élastases et MMP– Induit l’apoptose des cellules endothéliales– Inhibe la prolifération endothéliale
• Endostatine– 20kDa, fragment du collagène XVIII (cathépsine L,
élastase)– Inhibition de la migration endothéliale (dépendant de
eNOS)– Pro-apoptotique (réduction de Bcl-2, Bcl-XL)
• Thrombospondine-1– Glycoprotéine haut poids moléculaire– Ligand de CD36– Pro-apoptotique (p38-MAPK : activation des caspases)
Progéniteurs de la cellule endothéliale
Source Procédé d’isolement
Marqueurs cellulaires
Moelle osseuse Microbilles CD133+ CD146-, CD133+, CD31-, vWF-,VE-cadhérine -
Sang de cordon Microbilles CD34+ CD133+
Sang périphérique
Microbilles CD34+ Adhésion PBMC
CD133+ ou CD133-
CD146 : marqueur de la cellule endothéliale circulante
Identification des PEC dans un produit de thérapie cellulaire
EA 3801
Identification des PEC dans un produit de thérapie cellulaire
EA 3801