difenilamina pag19

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PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA GENERAL

2º CURSO

LICENCIATURA DE FARMACIA

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

UNIVERSIDAD DE SEVILLA

CURSO 2005/2006

NOMBRE:_________________________________________________________

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PRACTICA 1 PURIFICACION DE UNA ENZIMA: LA LISOZIMA DE HUEVO

OBJETIVO : Purificar la enzima lisozima a partir de la clara del huevo mediante cromatografía de intercambio catiónico utilizando carboximetilcelulosa. Determinar la actividad de la lizosima en las diferentes fracciones de purificación.

INTRODUCCIÓN

El nombre de lisozima o muramidasa (EC 3.2.1.17) incluye a un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces glicosídicos β(1→ 4) de los polisacáridos de la pared celular bacteriana. Son proteínas globulares constituidas por una sola cadena polipeptídica (129 aminoácidos para la lisozima de Gallus gallus) y de peso molecular comprendido en el rango de 14 a 30 KDa. Estas proteínas contienen cuatro puentes cruzados disulfuro que contribuyen a su elevada estabilidad. La lisozima fue la primera proteína secuenciada, la primera enzima de la que se dispuso de un modelo tridimensional (usando cristalografía de rayos x) y la primera para la que se propuso un mecanismo de acción detallado. CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO

La cromatografía de intercambio iónico se fundamenta en las propiedades ácido-base de las proteínas. Una proteína, a pH menor de su pI (punto isoeléctrico), tendrá carga positiva y a pH mayor de su pI presentará carga negativa. Por lo que, en el primer caso, se unirá a una resina con carga negativa (Carboximetil-celulosa, CM-celulosa) y en el segundo a una resina con carga positiva (Dietilaminoetil-celulosa, DEAE-celulosa).

Una vez unida la proteína a las resinas, estas se pueden eluir de dos formas distintas: 1) variando el pH del medio hasta alcanzar el pI 2) mediante un gradiente iónico añadiendo el contraión correspondiente (Na+ en el caso

de intercambio catiónico o Cl- para el intercambio aniónico)

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Dado que el pI de la lisozima es de 11, dos unidades de pH superior al del resto de las proteínas de la clara del huevo, a un pH de 9,5 - 10 la lisozima es prácticamente la única proteína con carga positiva neta. Ello permite separar esta enzima del resto de proteínas mediante la utilización de resinas intercambiadoras de cationes. La CM-celulosa es, debido a la presencia de restos carboxilo ionizados a pH neutro y básico, una resina intercambiadora de cationes. A pH 10, la lisozima es prácticamente la única proteína que puede unirse a la CM-celulosa. Posteriormente, puede disociarse de la resina mediante lavados con un tampón de alta fuerza iónica. MATERIALES Y METODOS

• Huevos de gallina para la obtención de la enzima. • Tampón A: glicina/NaOH 100 mM, pH 10 • Tampón B: glicina/NaOH 100 mM, pH 10, conteniendo 0.6 M NaCl • Carboximetil-Celulosa

Activación de la CM: previamente a su utilización, la resina se lava con HCl 0.5 M (5 minutos), 2 veces con H2O (hasta pH neutro), NaOH 0.5 M (5 minutos) y finalmente dos veces con H2O (hasta pH neutro). Por último se hace una suspension 1/1 (vol/vol) en tampón glicina/NaOH 100 mM pH 10

• Tampón fosfato sódico 100 mM, pH 6,2 • Suspensión de la bacteria Micrococcus Lvsodeikticus 20 mg en 100 ml del

tampón fosfato anterior

A. PURIFICACION DE LA LISOZIMA 1. Recoger la clara procedente de un huevo. Diluirla 1/5 (vol/vol) con tampón A. Tomar 10

ml de la muestra anterior en un tubo cónico con tapón de 15 ml. 2. Antes de comenzar la purificación de la lisozima separar una alícuota de 1 ml para medir

la actividad de la enzima en la fracción de partida. 3. A los 9 ml restantes (Fracción O, Fo), añadir 4 ml de CM-celulosa previamente

activada y agitar suavemente durante 15 min, para que la lisozima se adsorba a la resina.

4. Al finalizar la incubación, centrifugar la muestra a 600 rpm durante 3 min. Guardar el sobrenadante (Fracción 1, F1).

5. Añadir a la resina (precipitado) 10 ml de tampón A. Agitar suavemente y centrifugar de nuevo. Recoger el sobrenadante (Fracción 2, F2).

6. Repetir el lavado anterior y desechar el sobrenadante. 7. Elución. Resuspender la CM-celulosa con 3 ml de tampón B e incubar, agitando

suavemente, durante 10 minutos. Centrifugar y recoger el eluido (Fracción 3, F3, lisozima purificada).

Medir, exactamente, en tubo cónico graduado el volumen total de cada fracción

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B. MEDIDA DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA La medida de la actividad lisozima se realiza utilizando una suspensión de agregados de

pared celular del microorganismo Micrococcus Lysodeikticus en concentración suficientemente elevada para atenuar, por dispersión, la transmisión de luz monocromática a través de la cubeta de un espectrofotómetro. Al incubar esta suspensión con lisozima, los fragmentos de pared celular se hidrolizan, originando otros más pequeños, lo que reduce la dispersión de la luz, que se manifiesta en una reducción en la absorbancia a una longitud de onda fija de 450 nm. La actividad enzimática es proporcional a la disminución de la absorbancia a 450 nm. Por definición, en condiciones estándar (25ºC, pH 6,2 y 0,1 M fosfato), se considera que 1 unidad de actividad enzimática de lisozima (U) produce una disminución en la absorbancia de 0,001 en 1 minuto. METODO DE MEDIDA:

1. En una cubeta de espectrofotómetro, añadir 3 ml de suspensión de pared bacteriana. Meterla en el espectrofotómetro y anotar la densidad óptica (D.O.). Esta medida constituye el tiempo cero y hay que hacerlo para cada medida.

2. Añadir 25 µl de la fracción correspondiente a ensayar, tomar el tiempo por el reloj, agitar e introducir la cubeta en el espectrofotómetro y anotar la absorbancia observada al primer minuto y al segundo minuto. Calcular la variación de absorbancia al primer minuto (∆A1/min) y al segundo (∆A2/min). Hacer la media de las dos medidas.

Anotar los resultados en la tabla siguiente:

Volúmenes (ml)

Absorbancia a tº 0´



∆A1/min

∆A2/min

_ ∆A/min

Actividad(U)

F0 F1 F2 F3

CALCULOS: 1. Actividad de cada fracción 2. % Retención de la resina: Actividad F0 – Actividad F1 x 100

Actividad F0 3. % de Recuperación: Actividad F3 x 100

Actividad Fo GUARDAR TODAS LAS FRACCIONES PARA USARLAS EN LAS PRÓXIMAS PRACTICAS

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PRACTICA 2 A.- ELECTROFORESIS: Separación de proteínas en geles de poliacrilamida OBJETIVO: utilizar la técnica de la electroforesis en gel para analizar la purificación de la enzima lisozima. Se analizará la composición proteica de las distintas fracciones y se constatará el grado de pureza de la lisozima.

FUNDAMENTO

La electroforesis es la migración de iones en un campo eléctrico. Es una de las técnicas analíticas más importantes dentro de la Bioquímica. Las moléculas biológicas (ADN, proteínas, vitaminas, etc.) poseen cargas eléctricas, y por tanto poseen esta propiedad de movilidad en un campo eléctrico. La movilidad dependerá de la carga que presentan al pH que trabajemos. La electroforesis en gel es el método más conveniente para realizar separaciones de macromoléculas (ADN y Proteínas). El soporte de la electroforesis (el gel) es un entramado tridimensional que impide o reduce la difusión. Este gel ha de ser compatible con los tampones usados y debe permitir la entrada del líquido en los poros (reticulados hidratables).

Los soportes pueden ser más o menos restrictivos según que el tamaño de poros limite o impida el paso de las moléculas. Los más restrictivos, como los geles de acrilamida-bisacrilamida, oponen impedimento al paso de las moléculas, participando así en el proceso de separación. Entre los menos restrictivos está la agarosa. El tamaño de poro que da unas dimensiones moleculares de criba de los geles puede ser establecido previamente. El gel en la electroforesis retarda, en mayor o menor medida, a las moléculas mayores respecto a las de menor tamaño. Las separaciones moleculares están pues basadas en el tamizado molecular junto a la movilidad electroforética de las moléculas que van a ser separadas.

Para llevar a cabo la electroforesis se necesita: A) una fuente de Tensión que proporciona

el campo eléctrico, mediante dos electrodos, positivo (ánodo) y negativo (cátodo), entre los que se establece la diferencia de potencial. B) una cubeta o recipiente, en cuyos extremos se sitúan los electrodos. C) un soporte electroforético. D) el tampón de electroforesis: durante la electroforesis se produce electrolisis del agua, generándose protones en la proximidad del ánodo e iones hidroxilos en la proximidad del cátodo; el tampón evitará que el entorno anódico se acidifique y el catódico se haga más básico a lo largo de la electroforesis.

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El polímero utilizado para la formación del gel es la acrilamida y la bis-acrilamida, los cuales se polimerizan mediante la adición de catalizadores (persulfato amónico, TEMED). En nuestro caso, la separación de las proteínas se verá condicionada sólo por su tamaño y no por su carga ya que previamente las proteínas serán desnaturalizadas utilizando un detergente (SDS), el cual despliega a las proteínas y se queda pegado a su superficie confiriéndole una gran carga negativa. Esa gran carga negativa enmascara la carga intrínseca de la proteína, y las proteínas una vez tratadas con SDS presentan todas la misma carga, y la separación será debida solamente a la masa molecular de la proteína. PROTOCOLO

La separación electroforética se lleva a cabo según el método descrito por Laemmli en geles de poliacrilamida Gel de separación: poliacrilamida 16%

- Acrilamida (30%) 5.33 ml - Bis-acrilamida (1%) 1.32 ml - Tampón de separación 4X 2.54 ml - H20 0.81 ml - TEMED 20 µl - Persulfato amónico 50% 20 µl

Verter, cuidadosamente, la acrilamida entre los cristales. Cubrir, cuidadosamente con agua (utilizar una pipeta Pasteur) para delimitar el frente. Esperar a que el gel polimerice.

7 Gel concentrador: poliacrilamida 3%

- Acrilamida (30%) 1 ml - Bis-acrilamida (1%) 1 ml - Tampón de empaque 2X 5 ml - H20 3 ml - TEMED 10 µl - Persulfato amónico 50% 20 µl Retirar el agua. Verter, cuidadosamente, la acrilamida entre los cristales. Colocar los peines y esperar a que polimerice. Retirar los peines.

El volumen final de los geles es aproximadamente 10 ml, para la preparación de 2

cristales. El tampón de separación se prepara 4X porque se diluye 4 veces en el volumen final de 10 ml. El tampón de empaque está preparado 2X, se diluye dos veces en el volumen final

PROTOCOLO

A 20 µl de la Fracción 3 se le añaden, en un eppendorf, 20 µl de tampón de carga (MIXER): (Tris-HCI 0,125 M, pH 6,8; SDS 4%; glicerol 20%; 2-mercaptoetanol 10%; Azul de bromofenol 0,008%). Calentar las muestras a 95°C durante 3 min. Calentar también el estándar de proteínas

que incluye las siguientes proteínas: Albúmina sérica bovina (66kd), Ovoalbúmina (40kD) y Lisozima (16 kD). Cargar en pocillos 20 µl de F3 y 10 µl del estándar de proteínas Correr la electroforesis en tampón Tris-HCl 0,025 M, pH 8,8, glicina 0,192 M y SDS

0,1%, a una intensidad de corriente constante de 30 mA hasta que el azul de bromofenol esté aproximadamente, a 1 mm del extremo inferior del gel. Desmontar el gel y teñirlo con metanol/acético/H20 (5/1/5) con azul de Coomassie (1 g/l). Desteñir el gel en metanol/acético/H20 (10/10/80).

Standard Fo F1 F2 F3

B

O4

L1

SA 66

VOALBUMINA 0 KDa

ISOZIMA 4-17 KDa

BSA 66 KDa

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B.- EFECTO DE LA TEMPERATURA Y DE LA REDUCCIÓN DE LOS PUENTES DISULFURO SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA LISOZIMA

OBJETIVO: estudiar la contribución de los enlaces disulfuro y puentes de hidrógeno a la conformación del centro activo de la lisozima y su efecto sobre la actividad de la enzima. La lisozima es una proteína globular constituida por una sola cadena polipeptídica, su estructura presenta 4 hélices α y 1 hoja extendida β. Esta proteína presenta cuatro puentes disulfuro cruzados que contribuyen a su elevada estabilidad.

El DTT (ditiotreitrol) es un reductor de puente disulfuro. Por tanto, su adición en concentración suficiente, reducirá los -S-S- de la lisozima y producirá cambios en la estructura terciaria de la proteína. Estos cambios pueden afectar a la actividad enzimática de la lisozima.

Por otra parte, los puentes de hidrógeno también están implicados en el mantenimiento de la estructura de las proteínas. Estos puentes de hidrógenos se pueden romper fácilmente por tratamiento con calor. Del mismo modo al caso anterior, la modificación de la estructura de la proteína por rotura de los puentes de hidrógeno puede modificar la actividad del enzima.

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PROTOCOLO El estudio se lleva a cabo en la fracción F3 purificada en la práctica anterior 1. Preparar 4 tubos eppendorf numerados del 1 al 4 y pipetear las cantidades adecuadas según se indica en la tabla siguiente:

Tubo Fracción F3 DTT (0.5 M)* 50°C/30min

1

200µl -

-

2

200µl

20µl

-

3

200µl

-

+

4

200µl

20µl

+

* La concentración de DTT de 0.5M es concentración inicial (75 mg/1000 ml) Los tubos 1 y 2 se mantienen a temperatura ambiente Los tubos 3 y 4 se calientan a 50ºC durante 30 min.

2. Medir la actividad como se indicó en la práctica anterior. Anotar los resultados en la tabla siguiente:

Tubo




∆A1/min

∆A2/min

_ ∆A/min

Actividad (U)/200 ml

1

2

3

4

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PRÁCTICA 3

DETERMINACIÓN DE PROTEINAS OBJETIVO: Calcular la concentración total de proteínas contenida en una disolución. Con este fin, utilizaremos las muestras obtenidas en la práctica de Purificación de la Lisozima y seguiremos el método de Lowry. FUNDAMENTO

El método de Lowry se basa en la reacción de las proteínas con el reactivo de Folin dando un complejo coloreado. Este reactivo es una disolución de tungstato sódico y molibdato sódico en ácido fosfórico y ácido clorhídrico. El mecanismo del proceso es el siguiente: el Cu2+, en medio alcalino, forma un complejo con los enlaces peptídicos de las proteínas reduciéndose a Cu+. Este ion, así como los grupos R de los residuos de tirosina y triptófano de las proteínas, reaccionan con el reactivo de Folin, produciendo inicialmente un producto inestable, que se reduce para formar un compuesto coloreado.

La intensidad del color depende de la cantidad presente en las proteínas de estos aminoácidos aromáticos y será proporcional a la concentración de proteínas en la disolución.

La concentración de una disolución problema puede calcularse interpolando el valor obtenido de absorbancia en una recta de calibrado trazada con valores conocidos de concentración de una proteína y sus respectivas absorbancias. MATERIAL Y REACTIVOS

• Lowry A: Na2CO3 al 2,0% en NaOH 0,1N • Lowry B: CuSO4 al 1% • Lowry C: Tartrato sódico al 2% • Reactivo de Folin-Ciocalteus: tungstato Na y molibdato sódico en PO4H3 y ClH • Albumina: 500 µg/ml

PROTOCOLO 1.- Diluir las muestras a las cuales vamos a determinarles la concentración de proteínas: • F0 y F1, como tendrán una mayor concentración de proteínas se diluyen 100 veces (dilución

1/100) (0.1 ml fracción + 9.9 ml H2O) • F2, fracción que procede de lavar la columna de CM y que tendrá una menor cantidad de

proteínas se diluye 10 veces (dilución 1/10) (0.1 ml fracción + 0.9 ml H2O) • F3, fracción de lisozima pura se diluye 50 veces (dilución 1/50) (0.1 ml fracción + 4.9 ml H2O)

112.- Rotular tubos de plástico transparente del 1 al 10.

En los tubos del 1 al 6 se prepara la curva patrón de albúmina. Se parte de una solución concentrada de albúmina de 500 µg/ml y se diluye con agua (tabla adjunta), para obtener concentraciones crecientes de albúmina desde 0 a 500 µg/ml. El volumen final en los tubos es de 400 µl En los tubos del 7 al 10 se ponen 400 µl de las soluciones problemas debidamente diluidas

COMPROBAR QUE LOS 10 TUBOS TIENEN UN VOLUMEN FINAL DE 400 µl

3.- Preparar la solución D: Solución D: 30 ml Lowry A

0.3 ml Lowry B 0.3 ml Lowry C

4.- Añadir a todos los tubos 2 ml de la solución D. Mezclar y esperar 15 min a temperatura ambiente 5.- Añadir a todos los tubos 200 µl de reactivo de Folin diluido en agua destilada 1/1 (vol/vol). Mezclar y esperar 30 min a temperatura ambiente 6.- Medir la densidad óptica a 750 nm ajustando el aparato a cero con el blanco

TUBOS H2O Albumina

500 µg/ml Muestras diluidas

Solución D Folin 1:1

1 Blanco Alb 0 µg/ml

400 µl - - 2 ml 200 µl

2 Albúmina 25 µg/ml

380 µl 20 µl - 2 ml 200 µl


340 µl 60 µl - 2 ml 200 µl


300 µl 100 µl - 2 ml 200 µl


200 µl 200 µl - 2 ml 200 µl


- 400 µl - 2 ml 200 µl

7 F0 (1/100) - - 400 µl 2 ml 200 µl 8 F1 (1/100) - - 400 µl 2 ml 200 µl 9 F2 (1/10) - - 400 µl 2 ml 200 µl

Curva patrón
Muestras Problemas
10 F3 (1/50) - - 400 µl 2 ml 200 µl CALCULOS:

Representar los valores de absorbancia a 750 nm frente a los µg/ml de albúmina. Extrapolar los valores correspondientes a las distintas fracciones de la purificación para el cálculo de la concentración de proteínas en mg/ml. Tener en cuenta el factor de dilución empleado.

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Nº TUBO [Proteínas] Absorbancia a 750 2 25 µg/ml 3 75 µg/ml 4 125 µg/ml 5 250 µg/ml 6 500 µg/ml 7 F0 (1/100) 8 F1 (1/100) 9 F2 (1/10) 10 F3 (1/50)

Fracciones

Volúmenes de las

fracciones de la práctica 1 (ml)

Proteínas (mg/ml)

Proteínas

totales (mg)

F0

F1

F2

F3

13PRACTICA 4 ESTUDIO CINETICO DE UNA ENZIMA: ACTIVIDAD SUCCINATO DESHIDROGENASA OBJETIVO: Determinar la actividad de la succinato deshidrogenasa en la fracción mitocondrial

de hígado de rata en presencia y en ausencia de un inhibidor competitivo de la enzima.

Determinar los parámetros cinéticos de la enzima: Km y Vmax y Ki

INTRODUCCION

La enzima succinato deshidrogenasa (SDH, E.C. 1.3.99.1) es una flavoproteína que participa en el ciclo de Krebs y al estar asociada a la membrana interna mitocondrial, también forma parte la cadena de transporte electrónico mitocondrial. La SDH cataliza estereoespecíficamente la deshidrogenación en trans del ácido succínico hasta ácido fumárico. Esta enzima se inhibe por malonato y maleato, que son análogos estructurales del succinato.

MATERIALES Y METODOS Material Hígado de rata. Succinato sódico 20 mM, pH 7.4; malonato sódico 0.5 mM, pH 7.4; acetato de etilo; ácido tricloroacético al 10% (p/v). El medio de aislamiento está compuesto por: Tris-HCl 15 mM, pH 7.4; sacarosa 0.25 M, EDTA 1 mM y DTT 1 mM. La mezcla de reacción enzimática está compuesta por: Tampón fosfato sódico 0.1 M, pH 7.4, sacarosa 50 mM, INT al 0.2% (p/v) en etanol y EDTA 4 mM. Obtención de la fracción mitocondrial Se sacrifica al animal, se extrae el hígado y se introduce inmediatamente en un vaso de precipitado con medio de aislamiento frío. Se seca el órgano sobre papel de filtro, se pesa y se trocea con tijeras. Se homogeniza en frío con un homogenizador mecánico de teflón en medio de aislamiento (1g de tejido por cada 10 ml de medio).

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Las fracciones citosólicas y mitocondrial se obtienen mediante centrifugación diferencial según el esquema siguiente:

H O M O G E N A D O8 0 0 X G 1 0 m i n ( S o r v a l l R C 5 , r o t o r S S - 3 4 , 3 0 0 0 r p m )

P R E C I P I T A D O( n ú c l e o s ,

c e lu l a s e n t e r a s ,

g l ó b u l o s r o j o s )

S O B R E N A D A N T E( F . c i t o s ó l i c a )

P R E C I P I T A D O( F . m i t o c o n d r i a l )

S O B R E N A D A N T E8 2 0 0 x g , 1 0 m i n S S - 3 4 , 9 0 0 0 r p m

El precipitado final, que corresponde a la fracción de mitocondrias, se resuspende en medio de aislamiento (1g/7ml) y se vuelve a centrifugar a 8200xg, 10 min. El último precipitado resuspendido finalmente en Tris-ClH 50 mM, pH 7.4, (1g/7ml), constituye la fracción mitocondrial final. Se somete a dos pulsos de sonicación de 30 segundos. La concentración de proteínas se determina por el método de Lowry y deberá ajustarse, por dilución, a 1 mg de proteínas/ml. Medida de la actividad enzimática El método de ensayo de la actividad SDH se basa en la utilización de un aceptor artificial de electrones, el cloruro de 2-[4-iodofenil]-3-[4-nitrofenil]-5-feniltetrazolio (INT) que al aceptar los H+ y e- de la enzima se reduce a formazano, tomando una coloración violeta, que es soluble en acetato de etilo y absorbe a 490 nm. Cálculo de la actividad enzimática

Aplicamos la ley de Lambert y Beer que relaciona la absorbancia con la concentración a través de una constante de proporcionalidad (A = εbc). A es la absorbancia de la muestra, ε es el coeficiente de extinción molar ε490 = 21.3 x mM-1cm-1, b el paso de luz a través de la cubeta en cm y c la concentración. La intensidad del color observado será reflejo de los µmoles/ml del sustrato reducido. Teniendo en cuenta que el volumen de acetato de etilo empleado es de 5 ml, que el tiempo de reacción es de 20 minutos, aplicamos la siguiente fórmula para calcular la actividad de la enzima en Unidades Internacionales (µmoles/min) Absorbancia x 5ml Actividad SDH (U) = ε (mM-1/cm) x 1cm x tiempo (min)

Para pasar las unidades de actividad (U = µmol/min) a miliunidades (mU), el valor obtenido al

aplicar la fórmula anterior lo multiplicamos por 1000.

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PROTOCOLO Para determinar la Km, Vmáx y Ki (malonato), vamos a medir la actividad enzimática a distintas

concentraciones de sustrato en presencia y ausencia del inhibidor malonato. 1. Rotular 11 tubos de plástico blanco y añadir a cada uno de ellos los reactivos que se

indican en la tabla excepto la fracción mitocondrial

2. Iniciar la reacción añadiendo 150 µl de fracción mitocondrial a cada tubo. Incubarlos a 37ºC durante 20 minutos

3. A los 20 minutos, parar la reacción agitando bien con 1 ml de ácido tricloroacético al

10% (p/v). El tubo 1 se utiliza como blanco

4. Se añaden después a todos los tubos 5 ml de acetato de etilo para extraer el formazano. Tapar los tubos y agitar vigorosamente en un Vortex. Se recoge la fase orgánica (coloreada) con pipeta Pasteur, midiéndose su absorción a 490 nm frente al blanco, en un tubo de vidrio para espectrofotómetro

Succinato Malonato

0,5 mM Mezcla reacción

Fracción mitocondrial

Tubo H2O

1 mM 10 mM 20 mM

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

350µl 250µl 150µl 300µl 250µl 100µl 200µl 100µl 250µl 200µl 50µl

- 100µl 200µl - - - 100µl 200µl - - -

- - - 50µl 100µl - - - 50µl 100µl -

- - - - - 250µl - - - - 250µl

- - - - - - 50µl 50µl 50µl 50µl 50µl



¿Cómo se calcula la concentración de sustrato o de inhibidor de cada tubo?

Conociendo la concentración de partida y la alícuota que ponemos, calculamos primero el factor de dilución según la fórmula: Volumen final del tubo

Factor de dilución = Alícuota

Una vez calculado el factor de dilución de cada caso, dividimos la concentración inicial por dicho factor.

Por ejemplo, la concentración de malonato en los tubos del 7 al 11 será de 25 µM, ya que como el volumen final del tubo es de 1 ml, la alícuota que hemos puesto es de 50 µl, el factor de dilución es 20. Dividiendo la concentración inicial de malonato 0.5 mM por 20, da 25 µM.

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Tubos

Abs 490 nm

[v] Actividad mU

[S] Succinato mM

[I] malonato µM

1/[v] (mU/min)-1

1/[S] Succinato mM-1

2 XXXXXXX

3 XXXXXXX 4 XXXXXXX

5 XXXXXXX 6 XXXXXXX

7 25 8 25

9 25 10 25 11 25

El cálculo de los parámetros cinéticos Km, Vmax y Ki pueden realizarse por el metodo de

Lineweaver-Burk :

[ ] )máx1()1()

máx(1:

VSVmK

vBurKLineweaver +=−

Km´ = Km ( 1+ [I]/Ki) A partir de esta fórmula calculamos la Ki del malonato

17 PRACTICA 5

PURIFICACIÓN Y DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE ÁCIDOS NUCLEICOS OBJETIVO: Extraer ADN a partir de hígado de rata y cuantificarlo por el método de la

difenilamina. Realizar una electroforesis en gel de azarosa para visualizar las bandas de ADN.

A. AISLAMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS

INTRODUCCION Los ácidos nucleicos son macromoléculas que se encuentran tanto en el núcleo como en el

citoplasma celular. Por ello para su aislamiento es necesario digerir previamente las membranas

citoplasmáticas y nuclear con un detergente adecuado. Este detergente a su vez desnaturaliza las

proteínas asociadas a los ácidos nucleicos. Una vez que ha actuado el detergente, se trata la solución

con disolventes orgánicos (fenol, cloroformo, alcohol isoamílico, etc). Tras una centrifugación, en el

precipitado (fase orgánica más densa) quedan los lípidos de membrana, en la interfase quedan las

proteínas desnaturalizadas y en el sobrenadante (fase acuosa menos densa) quedan disueltos los

ácidos nucleicos. Se separa el sobrenadante y se añade alcohol absoluto, el cual insolubiliza el

ADN, que va quedando en forma de fibras.

MATERIALES Y REACTIVOS

• Higado de rata

• DNAzol® Reagent (Reactivo preparado para aislar el ADN en un solo paso. Contiene

un detergente, derivado de la guanidina, que hidroliza al ARN y es selectivo para la

obtrención de ADN a partir de lisados celulares. Los disolventes orgánicos de este

reactivo son no fenólicos, obviando la toxicidad del mismo)

• Etanol 100%

• Etanol 95%

• NaOH 8 mM

• HEPES 1 M

PROTOCOLO 1. Se toman unos 800 mg de hígado de rata en un vaso de precipitado pequeño. Se añaden

16 ml de DNAzol® Reagent. 2. Se trocea muy bien con unas tijeras y se homogeniza el tejido con un homogenizador.

3. Poner 1 ml del homogenizado en un tubo de 10 ml. Centrifugar 10 minutos a 5000 rpm.

184. Se quita todo el sobrenadante con cuidado de no llevarnos el precipitado y se pasa a un

eppendorf limpio.

5. Se precipita el ADN con 500 µl de etanol al 100 % (se mezcla por inversión).

6. Dejamos a temperatura ambiente 1-3 minutos.

7. Se coge la madeja de ADN que se forma, con la punta de una pipeta y se pasa a un nuevo

eppendorf dejándolo en la pared del tubo para que escurra bien.

8. Se deja 1 minuto escurriendo y a continuación se recoge el líquido que haya soltado con

una pipeta y se desecha.

9. Lavar la madeja de ADN 2 veces con 800 µl de etanol al 95 % invirtiendo los tubos 3-6

veces. Dejarlos 1 minuto y quitar el etanol con la pipeta y desechar.

10. Dejar los tubos abiertos 10 minutos para que se evapore el resto del etanol.

11. Disolver el ADN con 500 µl de NaOH 8 mM (con la pipeta muy despacito, subiendo y

bajando).

12. Finalmente se le ajusta el pH con 15 µl de HEPES 1 M.

13. Separar 15 µl para el apartado C de la práctica y con los 500 µl restantes se continúa

con el apartado B.

B. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE DNA POR EL MÉTODO DE LA DIFENILAMINA INTRODUCCION La concentración de ADN en la muestra se puede estimar con la reacción de la

difenilamina. Este colorante reacciona selectivamente con 2-deoxipentosas. En disolución

ácida la deoxipentosa se convierte en el altamente reactivo β-hidroxilevulín aldehido que

reacciona con la difenilamina para dar un compuesto azul. Una curva patrón de concentraciones

conocidas de DNA nos permitirá determinar el contenido en DNA del problema por interpolación

sobre la recta patrón de las densidades ópticas de la disolución problema.

MATERIALES • Ácido perclórico (PCA) al 10% y 20%. • Difenilamina (DFA) al 4% en ácido acético glacial. • Acetaldehido 0.8% V/V en agua (mantener en frío). • ADN patrón (esperma de salmón) 1mg/ml.

PROTOCOLO 1.- Preparación de la curva patrón: Dilución ½ del ADN patrón: en un eppendorf de 2

ml poner 1 ml de ADN patrón y 1 ml de PCA al 20% . Concentración de ADN patrón 500

µg/ml. 2.- Rotular 7 tubos de 10 ml y añadir según la tabla adjunta:

19

1 BLANCO

2 [ADN]

25 µg/ml

3 [ADN]

37.5 µg/ml

4 [ADN]

50 µg/ml

5 [ADN]

62.5 µg/ml

6 [ADN]

75 µg/ml

7 [ADN] muestra

Dil 1/4

¿? µg/ml

[ADN]

500 µg/ml

_

100 µl

150 µl

200 µl

250 µl

300 µl

_

[ADN]

muestra

_

_

_

_

_

_

500µl

PCA

10%

2000 µl

1900 µl

1850 µl

1800 µl

1750 µl

1700 µl

1500 µl

3. Poner todos los tubos tapados con tapón de plástico a hidrolizar en baño a 90ºC durante

30 min.

4. Poner los tubos en hielo. Cuando estén fríos añadir a todos los tubos 4 ml de disolución

de difenilamina y agitar.

5. Añadir 50 µl de disolución de acetaldehido y agitar. Mantener en frío porque el

acetaldehído es muy volátil. Mantener siempre tos tubos cerrados

6. Dejar los tubos cerrados a 30ºC toda la noche.

7.Medir la absorbancia a 595 nm. Realizar las medidas en espectrofotómetros colocados

en el interior de campanas extractoras. Echar las muestras en las cubetas de plástico

con pipetas Pasteur de plástico. Limpiar bien las cubetas por fuera para no manchar el

aparato.

CALCULOS

Representar los valores de absorbancia a 595 nm frente a los µg/ml de ADN patrón. Extrapolar los valores correspondientes a las distintas diluciones de la muestra para el cálculo de la concentración de ADN. Tener en cuenta el factor de dilución empleado.

Nº TUBO [ADN] Absorbancia a 595 2 25 µg/ml 3 37.5 µg/ml 4 50 µg/ml 5 62.5 µg/ml 6 75 µg/ml 7 Muestra diluida 1/4

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C. SEPARACIÓN Y VISUALIZACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS POR ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA- BROMURO DE ETIDIO. INTRODUCCION Se pueden detectar fácilmente pequeñas diferencias entre moléculas similares de ADN y ARN

separándolas mediante electroforesis en gel. En muchos tipos de geles, la movilidad

electroforética de un fragmento de ADN es inversamente proporcional al logaritmo del número de

pares de bases, dentro de un cierto límite. Se utilizan geles de poliacrilamida para separar

fragmentos de hasta unos mil pares de bases, y geles más porosos, de agarosa, para resolver

mezclas de fragmentos mayores. La agarosa es un polímero lineal, procedente de las algas rojas,

en el que se alternan D-galactosa y 3,6-anhidro-L-galactosa. Una característica importante de

estos geles es su alto poder de resolución. Además es posible visualizar los ácidos nucleicos

separados en el gel si a éste se le añade bromuro de etidio durante su preparación. El bromuro de

etidio es un compuesto fluorescente con capacidad de intercalarse entre los pares de bases de los

ácidos nucleicos, haciendo posible su visualización cuando el gel es iluminado con luz ultravioleta.

Como se trata de un compuesto altamente cancerígeno en esta práctica utilizaremos un reactivo

alternativo denominado SYBR Safe TM con el que visualizaremos las bandas de ADN.

MATERIALES Y REACTIVOS

• Agarosa

• SYBR Safe TM

• Tampón de electroforesis 10XTAE:

- 0.4 M Tris-Acetato

- 0.02 M EDTA

• Tampón de carga:

- 25% Ficoll

- 25 mM EDTA

- 0.25% Verde de cianol

- 0.25% Azul de bromofenol

PROTOCOLO Preparación del gel. Se utilizará un gel de agarosa al 1.5 %. Para prepararlo se añaden 2.25 g de agarosa a 150 ml de tampón de electroforesis TAE, se mezcla bien y se calienta la mechero hasta que la

agarosa se disuelva sin que llegue a hervir. Cuando no esté tan caliente se añaden 7.5 µl de

21SYBR Safe y se remueve para que se mezcle. Mientras tanto se prepara la placa donde va a

polimerizar el gel cerrando sus extremos con celo e introduciendo el peine para formar los pocillos.

Una vez que la agarosa no esté tan caliente se vierte sobre la placa y se deja polimerizar. Cuando

esto ocurra se saca el peine con cuidado y se retira el celo.

Electroforesis.

1. Añadir 5 µl de tampón de carga a 5 µl de ADN aislado previamente.

2. Introducir la muestra en el pocillo con ayuda de una punta y micropipeta.

3. Separar las muestras en tampón 1X TAE a 90 voltios durante 15-20 min.

4. Una vez terminada la electroforesis el gel se visualizan en un transiluminador con luz ultravioleta. Las bandas de ADN se verán de color verde.

difenilamina pag19

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