Aus dem Institut fur Pflanzenpathologie und Pflanzenschutzder Universitat GottingenDirektor: Prof. Dr. W. H. Fuchs

Die Veranderungen des Nukleinsauregehaltes im Blatt vonPhaseolus vuigaris nach Infektion mit Uromyces phaseoli var. typica

Von

MARIA BAUER, geb. DE LA ISLA')

Mit einer Abbildung

Am Wirt-Parasit-Komplex Puccinia graminis—Triticum aestivum wurde inden letzten Jahren gezeigt, dafi die Infektion die Verteilung dcr organischenPhosphatverbindungen nachdriicklich bceinfluEt (vgl. z .B. Ht:iTEiuss 1965,1966 a) und insbesondere zu wesentlichen Veranderungen des Nukleinsiiurespie-gels fuhrt (HEITEFUSS 1966 b, dort weitere Literatur). Wir priiften die Frage, obbei analoger Versuchsanstellung ahnlidie Veranderungen im Phosphathaushaltdurch die Infektion von Uromyces phaseoli auf Phaseolus vuigaris hervorgerufenwerden.

Material und Methode

Samen von Phaseolus vuigaris, Sorte 'Favorit' (van Wavcren) wurden in Topfen aufgedampftcr Erde ausgesat. Nadidcm die ersten Versudie gezeigt hactcn, dali der trotz allcrBemiihungen unvcrmeidlidie Wechsel dcr AufSenbedingungcn in Gcwachshausern crhcblieh'-Unsidierheit in den Ergebnisscn mit sidi bringt, wurde die Anzucht standardisiert. Sie er-folgte im Thermostaten bei 21 ± 2°C und 15stundiger Beliditung mit Qucdtsilberdampf-hodidrucklampen (HQL 400 mit Radaircflektoren, ccwa 6500 Lux in Pflanzcnhohe). Unterdiesen Bedingungen fielen die fur die Versudie ausersohcnen Primarblatter vorzeitig ab. Ahn-lidi wie STAPLES und STAHMANN (1964) verhinderten wir dies dadurdi, dafi dcr Austrieb regel-maliig alle adit Tage zuriidigesdinittcn wurde (vgl. audi TSCHIN 1966).

Als Infcktionsmatcrial diente ein Klon von Uromyces phaseoli (Pers.) Wint. var. typicaArth., den das Instituut voor Plantcnziektenkundigc Onderzoek in Wageningen freundlidicr-weise zur Verfugung gestellt hatte. Auf Grund des Befalls auf sedis von aeht Tcstsorten nadiDAVISON und VAUGHAN (1963) handelt es sidi nach freundlidier briefUdier Mitteilung vonDr. VAUCHAN an Professor FUCHS (vom 24.Oktober 1966) uni einc von den genannten Auto-ren nitht besdiriebene Rassc. Inokuliert wurden 14 Tage alte Pflanzen durdi Verspruhen einerSuspension von 1 mg frisdier Urcdosporcn und 2 mg Talkum in 20 ml destilHertem Wasserauf beide Seiten von 40 Primarblattern der Bohnenpflanzen. Danadi wurden die Pflanzen

1) Ansdirift: MARIA DE LOURDF.S DE BAUER, Artcaga 45, Q u e r e t a r o , Qro . Mexico.

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24 Stundcn in Feiiditkamniern gehalten und dann in die Standardbedingungcn zurudtvcrsetzt.Es konnte ziemlidi glcidimafiig einc Pustcldiditc von zwolf Pustcln jc Quadratzcntiinetererreidit werden.

Rcprasencitivc Muster von Primarblattern wurden nach dem von HEITKPUSS (1965)bcsdiricbencn Extraktionsgang aufgcarbcitct; dio Cblorophyllc lassen sidi au.s Bohnen sdiwe-rer als aus Weizen extrahieren; daher wurde dcr Aufarbeitungsgang variicrt insofern, als zurEntfemung dieser Stoffe /usaczlidi zwoimal mit 25 ml bzw. 10 ml Athcr-Alkohol vor derExtraktion mit HCIO, gewa.schen wurde.

Der Pbosphatgchalt wurde in aiiquotcn Tcilcn der cin/elnen Frakiion nadi AlLEN(1940) bcstimmr. Die direkte Bestimmung des RNS-Gchaltes erfolgte spektronietrisdi (7.cUlPMQ II, 1-cm-Kuvctten) aus dcr Differenz der Absorptionswerte bei 260 und 280 m/n (vgl.HEBER 1963). Das Absorptionsspektrum dcr RNS-Fraktion gHdi dem bei Weizen bestimmten(HErTEFuss 1966a).

Der DNS-Gchalt wurde in aliquoten Mengen dcr RNS und die DNS-Fraktion alsDesoxyribose nadi BURTON (1956) bestimmt.

Ergebnisse und Diskussion

In drei, unter Gcwadishausbcdlngungen durchgefiihrten Versiichsreihenwurde festgestellt, dafi der Gesamtphosphatspiegcl, der RNS-Spicgel und derRNS-Anteil am Phosphat bereits vom dritten Tage nach der Infektion an ininfizierten Blattern hoher lag als in nichtinfizierten. Der DNS-Spiegel zeigt erstvom siebcnten Tage an eine deutliche infcktogene Erhohung. Da die drei Ver-suchsreihen auf Grund der unterschiedlichen AulSenbedingungen, die sidi audi inder Infektionsdichte auswirkten, in der Tcndenz (naheres siehe DK LA TSLA 1967)niit emer unter standardisierten Bedingungen durchgefiihrten Versuchsreihc iiber-einstimmten, wird nur diese naher erortert (Tab.); sie unterschi-idet sich aller-dings durch die Dekapitierung von den im Gewachshaus durchgefiihrten Unter-sudiungen.

Die Untersuchungen erfolgten in zweitiigigen Abstanden vom dritten bisciften Tage nach der Infektion. Wahrend dieser Zeit veranderte sieh dcrTrocken-

TahelleVeranderungen des Gesamtphosphatgehaltes, RNS-P und DNS-P nadi der Infektion,

Wcrtc in mg/g Frisdigewidit

Tage p.i.

3. niditinfizicrtinfiziert

5. niditinfizicrtinfiziert

7. niditinfizicrtinfiziert

9. niditinfizicrtinfiziert

11. niditinfiziertinfiziert

Gcsamtphosphat-gehalt

0,6720,7660,6950,7760,5960,7350,5180,5490,4360,481

RNS-P

0,1070,1330,1060,1320,0910.1070,0790,0980,0850,100

DNS-P

0,0360,0370,0330,0410,0390,0360,0190,0330,0280,033

Veranderungen des Nukleinsauregehaltes im Blatt von Phaseolus vuigaris 193

substanzgehalt der Primarblatter unter unseren Bedingungen kaum; es bestandenauch keine gesicherten Differenzen zwischen nichtinfizierten und infizierten Blat-tern. Die obigen Ergebnisse werden daher auf Frischsiibstanz bezogen, um dieVergleichbarkeit mit anderen Vcrsudisreihen zu gewahrleisten, in welchen austedinisdien Grunden der Trockensubstanzgehalt der einzelnen Versuchsgliedernidit laufend untersudit werden konnte.

Bereits am dritten Tage p. i. war der Gesamtphosphatgehalt infizierter Blat-ter hoher als der niditinfizierter. Vom funften Tage p. i. ab verminderte er sidiin den niditinfizierten Pflanzen stetig, wahrend in den infizierten Ptlanzen einsolcher Abfall erst nach dem fiinften Tage p. i. auftrat; am siebenten Tage p. i.ist die Differenz der beiden Versuchsmuster am grdfiten.

Der hohere Phosphorgehalt der infizierten, verglichen mit den niditinfizier-ten Blattern entspricht Ergebnissen an versehiedenen anderen Wirt-Parasit-Kom-binationen (vgl. HEiTcruss 1966b), da das infizierte Blatt sich als Attraktions-zentrum erweist. Rostbefallene Busdibohnenblatter nehmen bereits vor demSiditbarwerden der Pusteln mehr P"'- auf als nichtinfizierte (BALDACCI et al.1958, BETTO et al. 1958, GERWITZ 1962, GERWITZ und DURBIN 1963); die nor-male Verteilung innerhalb der Pflanze (BIDDULPH et al. 1958) ist zugunsten derinfizierten Blatter gestort {GF.RTITZ und DURIUN 1965). Dem entsprechen unsereErgebnisse. Quantitative Vergleiche mit den genannten Arbeiten sind allerdingskaum moglidi, da wir mit regelmafiig dekapitierten Pflanzen unter Standard-bedingungen arbeiteten. Die Einschrankung der Apikaldominanz in unseren Ver-suchen kommt der Stoffanreicherung im infizierten Gewebe entgegen (vgl. jungstPozsAR und KIRALY 1966) und verzogert den Ablauf von Alterungsersdieinun-gen im Primarblatt (hierzu vgl. MENCEI. 1961, STAPLES 1964, STAPLES und STAH-

MANN 1964); dieses ist iiberdies durch die von uns angewandte geringe Pustelzahlweniger belastet als bei hoheren Infektionsdiditen. Die qualitative Oberein-stimmung der Versudie im Gewadishaus niit den unter Standardbedingungendurchgefuhrten erweist, da(5 letztere den Nukleinsaurestoffwechsel nicht grund-satzlich beeinflussen.

Von den Fraktionen, in die das Phosphat aufgeteilt wurde (vgl. DE LA ISLA1967), interessieren hier nur die beiden Nukleinsaure enthaltenden. Im groiSenGanzen liegt der RNS-Anteil am Gesamtphosphat im infizierten Blatt hoher undder DNS-Anteil an den ersten Untersuchungstagen niedriger, am neunten undelften Tag p. i. jedodi hoher als beim nichtinfizierten Blatt.

Die Nukleinsaure wurde zusatzlich aus der UV-Absorption, bzw. als Des-oxyribose bestimmt. Die gefundenen Unterschiede zwischen gesunden und infi-/ierten Pflanzen stimmen mit Ausnahme der DNS am siebenten Tag p. i. gut mitden aus den Phosphoranalysen errechneten Werten uberein. Es ergab sidi, dafidie ,,RNS-Fraktion" wahrend der ganzen Versudiszeit eine gewisse, allmahlichvon etwa 3 % auf etwa 9 % ansteigende DNS-Menge enthalt, deren Abtrennungnicht gelang. Es bedarf noch naherer Untersudiungen, ob dies durdi die ange-wandte Methode bedingt ist oder auf das Vorhandensein von RNS-DNS-Hy-briden deutet, welche von verschiedenen Autoren (vgl. CARPENTER und GHERRY

1966) angenommen werden. Ein Einflufi der Infektion auf diesen Anteil lafitsich nicht erkennen.

194 BAUEK

li-

12V1.0

0.7-

0,5-

0.3-

0,2 DNS nadi

3 5

gesund

Abb. Veranderungen desund DNS-Gehaltes

Infektion, ermitteltaus UV-Absorption bei260/280 ni.u und aus Des-

oxyribosebestimmungnach Infektion

mfiziert

Der RNS-Spiegel der infizierten Pflanzen liegt bereits am dritten Tag p. i.(und vermutlich sdion vor diesem Zeitpunkt) eindeutig hoher gegenuber dem dernichtinfizierten Blatter (Abb.). Der altersbedingte Abfall des RNS-Spiegels (vgl.QtjiCK und SHAW 1964) verlauft in den beiden Mustern nicht parallel, sondernsetzt im infizierten Blatt spater ein, so daft die Differenz ein Maximum amsiebenten Tage p. i., also bei Beginn der Sporulation des Pilzes erreicht (eineahnlidie Beziehung fanden u. a. MALCA et al. 1964 fiir Gerstenmehltau).

Die vorliegenden Ergebnisse fugen den Bohnenrost in die Reihe der Wirt-Parasit-Beziehungen em, in welchen analytisch oder zytospektrometrisch infekto-gene RNS-Vermehrung nachgewiesen wurde (Literatur vgl. HEITEFUSS 1966b).

Wahrend der DNS-Gehalt im nichtinfizierten Blatt im Laufe des Unter-suchungszeitraumes etwas abnimmt (Abb), steigt er im infizierten Blatt vomdritten bis zum siebenten Tag bei etwas vermindertem Anteil am Gesamt-phosphat nur allmahlidi an. Zwischen dem siebenten und neunten Tage p.i.steigt dann der DNS-Spiegel sprunghaft auf etwa das Doppelte der Ausgangs-menge an und bleibt bis zum elften Tag p.i. auf dieser Hohe. Wahrend dielangsame Vermehrung der DNS vielleicht dem Pilzwadistum zugeordnet werdenkonnte, ware doch ein Zusammenhang des sprunghaften Anstiegs mit dem Er-reichen der vollen Sporulation kaum zu deuten, da eine Vermehrung der Kern-substanz hoher Hegen miifite. Dazu kommt, dafi HEITEFUSS (1966 a) in gleich-artigen Untersuchungen an sdiwarzrostinfizierten Weizen in Obereinstimmungmit cytophotometrisdien Untersuchungen am gleichen Objekt (WHITHNEY et al.1962, BHATTACHARYA et al. 1966) keine solche DNS-Vermehrung feststellenkonnte. WILLIAMS (1966) fand dagegen an P/tismotiio/'^ora-befallenem Kohl aus-gepragte infektogene DNS-Zunahme und deutet diesen Unterschied gegenuberden eben erwahnten Untersuchungen dahin, dal^ es in seinem Fall sidi um eineinfektogene Hyperplasie handele. Ahnlidies konnte fur rostbefallene Busdiboh-nen zutreffen. YARWOOD und COHEN (1957) beriditen, da(l mittelstarker Rost-

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befall (1 bis 200 Pusteln/qcm) eine ,,Hypertrophie" der Primarblatter von Boh-nen zumindest auf bestimmten Sorten und unter bestimmten Umstanden hervor-riefen. Sie beschreiben Untersdiiede der Zellgrofie, betonen aber, dafi sie keineKernteilung gefunden hatten. Die auffallend starke Markierung der Zellkerneder Wirtszellen bei Futterung mit Thymidin ^H in der unmittelbaren Nachbar-schaft der Rostpusteln (STAPLES und LEDBETTER 1960) weist ebenfalls auf einebesondere Aktivitat und auf bevorzugte DNS-Synthese (oder Umsatz) hin.Nachdem nun TSCHEN (1967) in diesen Geweben audi zahlreiche Kernteilungs-stadien am aditen Tag p.i. an einem dem unseren vergleichbaren Material fest-stellte, kann die sprunghafte Zunahme des DNS-Spiegels zu einem ahnlidienZeitpunkt als Hinweis auf erhohte Teilungsaktivitat im Sinne einer hyper-plastisdien Reaktion der Bohne auf den Rostbefall gedeutet werden. Eine solcheReaktion der Primarblatter wird durch unsere Anzuchtbedingungen gefordert.

Zusammenfassung

1. Der Einflud der Infektion von Uromyces phaseoli auf den Phosphat- undNukleinsauregehalt der Primarblatter von Phaseolus vuigaris, Sorte Favorit,wurde unter verschiedenen Bedingungen untersucht.

2. Auch an rostbefallenen Buschbohnen ist der Gehalt an Gesamtphosphatund an Ribonukleinsaure hbher als an vergleidibaren nichtinfizierten Blattern.

3. Der DNS-Gehait der Blatter steigt unter dem Einfluii der Rostinfektionbis zum siebenten Tage p. i. nur allmahlidi an, zwisdien dem siebenten und neun-ten Tage p.i. dagegen sprunghaft. Dieser Befund wird im Zusammenhang mitder Moglichkeit postinfektioneller Hyperplasien bei der Bohne erortert.

Summary

Changes in nucleic-acid content in the leafof Phaseolus vuigaris after infection with Uromyces phaseoli var. typica

1. The influence of infection of Uromyces phaseoli on the content of phos-phates and nucleic acid in the primary leaves of Phaseolus vuigaris cv. 'Favorit'was studied under various conditions.

2. The total phosphate content and the nucleic-acid content are higher indwarf beans infected by rust than in comparable healthy leaves.

3. The DNA content of the leaves increases under the influence of rustonly gradually up to the 7th day after infection but rises suddenly between the7th and 9th day. This result is discussed in connection with the possibility ofpostinfective hyperplasia in the bean.

Der Alexander-von-Humboldt-Stiftung danke idi herzlich fur ein Stipendium.

Literaturverzeichnis

ALLEN, R. J. L., 1940; The estimation of phosphorus. Biochem. J. 34. 858—865.BALDACCI, E., E. BETTO, R. FOA e A. VOLPI, 1958: La richiesta di fosforo nei tessuti di pianti

invasi da funghi o da virus, esaminata con l'impiego del P^ .̂ Ric. Sci. 27, 2674—2676.

196 BAUER

BETTO, E., R. FOA C A. VoLPi, 1958: La compctizinoni pirr il fosforo fra Uromyccs appendi-culatus (PLTS.) Link c Phaseolus vulgaris L. studiata con P'^^. Phytopath. Z. 32, 283—292.

BHATTACHARYA, P. K., J. M. NAYLOR, and M. SHAW, 1966: Nucleic acid and protein diangcsin wheat leaf nuclei during rust infections. Science 150, 1605—1607.

BiDDULPH, O., S. BiDDULPH, R. GoKv, and H. KOONTZ, 1958: Cirtulation patterns for phos-phorus, sulfur and calcium in the bean plant. Plant Physiol. 33, 293—300.

BURTON, K., 1956: A study of the conditions and mcdianism of the diphenylainine reactionfor the colorimetric fstimaiion of DNA. Biodiem. J. 62, 315^323.

CARPENTER, W. J. G., and J. H. CHERRY, 1966: Effects of protein inhibitors and auxin onnucleic acid metabolism in peanut cotyledons. Plant Physiol. 41, 919—922.

DAVISON, A. D., and E. K. VAUGHAN, 1963: A simplified method for identification of U. pha-seoli var. phaseoli. Phytopathology 53, 456—459.

DE LA ISLA, M, L., 1967; Beitrag zum Ribonucleinsiiurestoffwechsel von Phaseolus vulgarisnadi Infektion mit Uromyces phaseoli var. typica. Diss, Gottingen.

GERVITZ, D . L., 1962; The effect of rust on the weight growth rate and P^- content of bean.Phytopathology 52, 733.

, and R. D. DUKUIN, 1963: The effect of bean rust on the foliar uptake of P-'-, Phyto-pathology 53, 876.

, and , 1965: The influence of rust on the distribution of P̂ a Jn l}^^. bean plant.Phytopathology 55, 57—61.

HEBER, U., 1963: Ribonucleinsaurcn in den Chloroplasten der Blatt/elle. Planta 59, 858 — 865.HEITEFUSS, R., 1965: Untcrsuthungen zur Physiologie des temperaturgcsteucrten Vertraghdi-

keitsgradcs von Weizen und Puccinia graminis tritici. I. Veranderungen von Sauerstoff-aufnahme und Phosphatstoffwedisel. Phytopath. Z. 54, 379—400.

, 1966a: Untersuchungen zur Physiologie des temperaturgestcuerten Vertraglidikeits-grades von Weizen und Puccmia graminis tritici. II. Veranderungen des Nukleinsaure-stoffwedisvls. Phytopath. Z. 55, 67—85,

— -—, 1966b: Nucleic acid metabolism in obligate parasitism. Ann. Rev. Phytopath. 4,221—244.

MALCA, I,, F, P. ZscHEiLE, and R. Guixi, 1964: Nucleotide composition of RNA in healthyand mildew infected leaves of barley. Phytopathology 54, 1112—1116.

MENGEL, K., 1961: Ernahrung und Stoffwechsel der Pflanze. VEB Gustav I-'isdier Verlag, Jena.I'OZSAR, B. I., and Z. KIR.\I.Y, 1966: Phloem-transport in rust-infected plants and the cyto-

kinin-directed long-distance movement of nutrients. Phytopath. Z. 56, 297—309.QUICK, W. A,, and M. SHAW, 1964: The physiology of host-parasite relations. XIV. The effect

of rust infection on the nucleic acid content of wheat leaves, Ganad, J. Bot. 42,1531 — 1540.

STAPLES, R. G., 1964: Effect of removing the terminal bud of bean plants upon proteindianges after infection by the bean rust fungus. Phytopathology 54,909.

•, and M. C. LEDHETTER, 1960: Incorporation of tritium labeled thymidine into nuclei ofrusted bean leaves. Gontr. Boyce Thompson Inst. 20, 349—351.

, and M, A, STAHMANN, 1964: Ghanges in protein and several enzymes in susceptiblebean leaves after infection by the bean rust fungus. Phytopathology 54, 760—764.

TscHEN, J., 1966: Die Verteilung einiger durdi Uromyccs phaseoli (Pers.) Wint. induzierterVeranderungen des Stoffwedisels im Primarblart von Phaseotus vulgaris L. Diss. Got-tingen.

, 1968: ObtT den Einbau von Orotsaure G " in Geweben von Phaseolus vulgaris nadiInfektion niic Uromyces phaseoli (in Vorberoitung).

WHITNEY, H , S., M. SHAW, and J. M. NAYLOR, 1962: The physiology of host-parasite relations.XII. A eytophotometric study of the distribution of DNA and RNA in rust infectedleaves. Ganad. J. Bot. 40, 1533 — 1544.

WILLIAMS, P. H., 1966: A cytodiemical study of hypertrophy in clubroot of cabbage. Phyto-pathology 56, 521—524.

YARWOOD, G. E,, and M. GOHEN, 1951: Hypertrophy from the uredial stage of bean rust. Bot.Ga-/. 112,294—300.