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Aus dem Institut für experimentelle und klinische
Pharmakologie und Toxikologie der Universität zu Lübeck
Direktor: Prof. Dr. P. Dominiak
Die Reduktion des Körpergewichts nach chronischer
AT 1-Blockade ist assoziiert mit Hypophagie und einer
„Downregulation“ orexigener Peptide im Hypothalamus
Inauguraldissertation
zur
Erlangung der Doktorwürde
der Universität zu Lübeck
- Aus der medizinischen Fakultät -
vorgelegt von
Antonie Markert
aus Hildesheim
Lübeck 2007
1. Berichterstatter: Prof. Dr. rer. nat. Walter Raasch
2. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Achim Peters
Tag der mündlichen Prüfung: 08.12.2008
zum Druck genehmigt. Lübeck, den 08.12.2008
gez. Prof. Dr. med. Werner Solbach
- Dekan der Medizinischen Fakultät -
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
1.1 Adipositas und das Metabolische Syndrom 1
1.2 Gewichtsregulation allgemein 2
1.3 Gewichtsregulation im Hypothalamus 3
1.4 Zirkulierende Parameter 7
1.5 Renin-Angiotensin-System 10
1.6 AT1-Rezeptor-Antagonisten 13
1.7 Fragestellung 13
2. Methoden 15
2.1 Behandlung der Tiere 15
2.2 Analytische Methoden 17
2.2.1 Radio-Immuno-Assays 17
2.2.2 Elisa 20
2.2.3 Real-Time-Polymerase-Ketten-Reaktion 20
2.3 Statistische Methoden 25
3. Ergebnisse 26
3.1 Körpergewicht 26
3.2 Hämodynamik und Parameter des Renin-Angiotensin-Systems 30
3.3 Zirkulierende metabolische und endokrinologische Parameter 34
3.4 Neuropeptide im Hypothalamus 39
4. Diskussion 44
5. Zusammenfassung 55
6. Literaturverzeichnis 56
7. Anhang 74
7.1 Abkürzungsverzeichnis 74
7.2 Material 75
7.3 Erklärung über die Genehmigung der Tierversuche 81
8. Danksagungen 82
9. Lebenslauf 83
10. Publikationen 84
Einleitung
1
1. Einleitung
1.1 Adipositas und das Metabolische Syndrom
Die Prävalenz der Adipositas bei Erwachsenen und auch bei Kindern erhöht sich in den
Industrieländern seit den letzten drei Dekaden dramatisch. In Deutschland ist besonders die
Zahl adipöser Patienten mit einem Body-Mass-Index (BMI) ≥ 30 in den letzten zwanzig
Jahren stark angestiegen. 2003 waren 70 % der Männer und 50 % der Frauen
übergewichtig (BMI ≥ 25) oder adipös (BMI ≥ 30) [Mensink et al., 2005].
Fettleibige Patienten haben ein deutlich erhöhtes Mortalitätsrisiko [Bray und Gray, 1988],
in den Vereinigten Staaten beispielsweise versterben 300 000 Menschen pro Jahr aufgrund
einer Adipositas [Sharma und Chetty, 2005]. Übergewicht beschleunigt den
Alterungsprozess. Kardiovaskuläre Erkrankungen wie Bluthochdruck, Herz- und
Gehirninfarkte treten bei Adipositas vermehrt auf. Hiermit vergrößert sich das Risiko an
einer Demenz zu erkranken. Fast 60 % der adipösen Patienten entwickeln einen
Hypertonus [Sharma et al., 2001]. Bei ihnen ist die Blutdruckeinstellung deutlich
schwieriger als bei Normalgewichtigen. Fettleibige Menschen haben einen erhöhten
Sympathotonus und ein stimuliertes Renin-Angiotensin-System (RAS) [Engeli und Sharma,
2000]. Außerdem ist Adipositas der größte Risikofaktor für die Entwicklung eines
Diabetes mellitus Typ 2 [Bray, 2003], der BMI korreliert positiv mit dem relativen Risiko
von Diabetes mellitus bei Männern [Chan et al., 1994] und Frauen [Colditz et al., 1995].
Zusätzlich treten Krebserkrankungen vermehrt auf. Eine Fettleber kann zu hepatischer
Dysfunktion und Fibrose führen, Lungenerkrankungen sind häufiger und schwerer,
Osteoarthritis, Komplikationen während und nach Operationen, Fertilitäts-,
Schwangerschafts- und Geburtsprobleme sind neben Depressionen und Suiziden häufig
mit Adipositas assoziiert. Die soziale Akzeptanz und die Lebensqualität sind bei diesen
Patienten stark eingeschränkt. [Roth et al., 2004].
Die Therapie der Adipositas ist sehr schwierig. Diät und Bewegung haben kurzzeitig gute
Effekte, auf lange Sicht sind jedoch nur wenige Betroffene mit dieser Therapie erfolgreich.
Medikamente zur Gewichtsreduktion sind umstritten [Padwal et al., 2004]. Als Alternative
bleibt ein operativer Eingriff, der die Magenverkleinerung oder Malabsorption zum Ziel
hat [Steinbrook, 2004]. Ein wichtiger Baustein der Therapie ist die medikamentöse
Behandlung der Begleit- und Folgeerkrankungen wie Hypertonie, Hyperlipidämie,
Diabetes mellitus und Depression [Roth et al., 2004].
Einleitung
2
Eng mit der Adipositas verknüpft ist das Metabolische Syndrom, das durch Insulinresistenz
charakterisiert ist [NCEP, 2001; Grundy et al., 2004]. Hier besteht eine Konstellation von
atherogenen Risikofaktoren wie Dyslipidämie, Hypertonie, Hyperglykämie und erhöhten
proinflammatorischen und prothrombotischen Faktoren [Prasad und Quyyumi, 2004].
Dadurch kann das Auftreten einer linksventrikulären Hypertrophie, Herzinsuffizienz und
eines Diabetes mellitus Typ 2 induziert werden [Sharma und Chetty, 2005]. Die
Wahrscheinlichkeit, ein Metabolisches Syndrom zu entwickeln, steigt mit höherem Alter,
höherem Body-Mass-Index, in der Postmenopause, durch Rauchen sowie durch
Bewegungsmangel. Viszerale Adipositas ist der Hauptrisikofaktor zur Entwicklung eines
Metabolischen Syndroms [Bosello und Zamboni, 2000]. In den USA liegt die Prävalenz
bei 20 % der erwachsenen Bevölkerung [Park et al., 2003]. In einer neueren Untersuchung
in Deutschland wurde bei 40 % der erwachsenen Bevölkerung eine gestörte
Glukosetoleranz oder Diabetes mellitus Typ 2 festgestellt [Regitz-Zagrosek et al., 2006].
Die Behandlung der beiden Krankheitsbilder und ihrer Komplikationen wird durch die
hohe und noch steigende Prävalenz und Komplexität eine große medizinische
Herausforderung in den nächsten Jahrzehnten sein und belastet das Gesundheitssystem
schon heute erheblich. Die zugrunde liegenden Störungen können bisher nicht befriedigend
therapiert werden. Die Gewichtsregulation und der Stoffwechsel stellen daher ein
wichtiges Forschungsgebiet dar. Da die Behandlung eines Hypertonus mit RAS-Hemmern
bei Adipositas und dem Metabolischen Syndrom heute zum Standard gehört, ist der
Einfluss dieser Medikamente auf den Metabolismus von besonderem Interesse und soll in
dieser Arbeit näher untersucht werden.
1.2 Gewichtsregulation allgemein
Die Aufrechterhaltung des Körpergewichts setzt eine Balance zwischen Energieaufnahme
und Energieverbrauch voraus. Wird dieses Gleichgewicht gestört, setzen zahlreiche
hormonelle Kompensationsmechanismen ein. Wenn die Kalorienaufnahme den
Energieverbrauch dauerhaft übersteigt, entsteht Adipositas. Auch bei normalgewichtigen
Menschen wird der Alterungsprozess häufig von einer deutlichen Erhöhung der
Körpermasse begleitet [Rossner, 2001]. Wenn die Fettreserven des Körpers bedroht sind,
z.B. während Fastenzeiten, werden Regulationsmechanismen in Gang gesetzt, die die
Wiederauffüllung der Fettspeicher fördern. Diese setzen auch bei der Behandlung von
Adipositas ein und erschweren die Therapie [Pasman et al., 1999]. Wie an der hohen und
wachsenden Prävalenz der Adipositas weltweit zu sehen ist [Kopelman, 2000], sind die
Einleitung
3
Mechanismen, die bei Gewichtsverlust gegensteuern, effektiver als jene, die die
Gewichtszunahme inhibieren. Der anabole Stoffwechsel stimuliert die Nahrungsaufnahme
und Gewichtszunahme und senkt den Energieverbrauch. Im Gegensatz dazu vermindert
eine katabole Stoffwechsellage das Körpergewicht, hier ist der Energieverbrauch erhöht
[Schwartz et al., 2000].
1.3 Gewichtsregulation im Hypothalamus
Das Körpergewicht wird entscheidend von Neuropeptiden des Hypothalamus bestimmt,
die im Nucleus arcuatus (ARC), im lateralen Hypothalamus (LHA) und im Nucleus
paraventricularis (PVN) exprimiert werden (Abb.1). Sie fördern entweder die
Gewichtszunahme (Orexigene) oder wirken der Gewichtszunahme entgegen (Anorexigene)
(Tabelle 1).
Gehirn
ARC
NPY POMCAgRP CART
PVN
CRH
LHA
MCHOREX
Nahrungsaufnahme
Sympathisches Nervensystem
Zirkulierende Parameter z.B. Leptin, Insulin, Corticosteron
Abb. 1: Anatomische Verteilung der Neuropeptide im Gehirn und deren periphere
Wirkungen
PVN: Nucleus paraventricularis CRH: Corticotropin-Releasing-Hormon
ARC: Nucleus arcuatus NPY: Neuropeptid Y
AgRP: Agouti-Related-Protein
POMC: Prepro-Opiomelanocortin
CART: Cocain-Amphetamin-Reguliertes-Transkript
LHA: Lateraler Hypothalamus MCH: Melanin-Concentrating-Hormon
OREX: Orexin-A
Einleitung
4
Tabelle 1: Wirkung der Neuropeptide
Orexigen wirkende Peptide Anorexigen wirkende Peptide
Neuropeptid Y (NPY)
Agouti-Related-Protein (AgRP)
Melanin-Concentrating-Hormon (MCH)
Orexin-A (OREX)
Prepro-Opiomelanocortin (POMC)
Cocain-Amphetamin-Reguliertes-
Transkript (CART)
Corticotropin-Releasing-Hormon (CRH)
Die orexigenen Peptide Neuropeptid Y (NPY) und Agouti-Related-Protein (AgRP) aus
dem Nucleus arcuatus im Hypothalamus fördern den anabolen Weg [Broberger et al., 1998;
Hahn et al., 1998]. NPY vermindert den Energieverbrauch [Korner und Aronne, 2003],
beide Peptide stimulieren die Nahrungsaufnahme. NPY bindet an den NPY-Rezeptor,
AgRP wirkt als inverser Agonist der neuronalen Melanocortin-Rezeptoren (MC3- und
MC4-Rezeptor) [Schwartz et al., 2003].
Den katabolen Stoffwechsel vermitteln die anorexigenen Neuropeptide des Nucleus
arcuatus. Hierzu gehört das α-Melanozyten-Stimulations-Hormon (α-MSH), das aus dem
Peptid Prepro-Opiomelanocortin (POMC) abgespalten wird. Viele POMC-exprimierende
Neurone sezernieren ebenfalls das Cocain-Amphetamin-Regulierte-Transkript (CART)
[Elmquist et al., 1999], ein Peptid, das ebenso wie α-MSH die Nahrungsaufnahme inhibiert.
α-MSH bindet agonistisch an die MC3- und MC4-Rezeptoren.
Die NPY/AgRP- und POMC/CART-exprimierenden Neurone projizieren in benachbarte
Areale des Hypothalamus, die die Nahrungsaufnahme und autonome Funktionen
kontrollieren, wie den Nucleus paraventricularis und den lateralen Hypothalamus
[Schwartz et al., 2003]. Da chemische oder elektrische Zerstörung des Nucleus arcuatus zu
Adipositas führt [Bergen et al., 1998], scheint der katabole Output des Nucleus arcuatus
über den anabolen Output zu dominieren. Läsionen des Nucleus arcuatus vermindern
außerdem die Fähigkeit von Leptin die Nahrungsaufnahme zu inhibieren [Tang-
Christensen et al., 1999]. Ein intakter Nucleus arcuatus scheint für die Nahrungsregulation
durch Leptin nötig zu sein.
Als regulatorische Antwort auf Gewichtsverlust wird der anabole Weg aktiviert, während
der katabole gehemmt wird. Zum Beispiel erhöht sich beim Fasten oder Diabetes mellitus
mit Insulinmangel die Expression von NPY- und AgRP-mRNA im Nucleus arcuatus,
während die POMC- und CART-Expression vermindert ist. NPY- und AgRP-Neurone
Einleitung
5
haben eine tonische inhibitorische Kontrolle über POMC- und CART-Neurone. AgRP
antagonisiert die Interaktion von α-MSH am MC4-Rezeptor und stimuliert dadurch das
Essverhalten (Korner und Aronne, 2003). Vorübergehende Aktivierung von NPY- und
AgRP-Neuronen führt also nicht nur zu einer Verstärkung der anabolen Signale, sondern
inhibiert auch die katabolen Signale durch Antagonisierung der Melanocortin-Rezeptoren
und Hemmung des neuronalen Outputs der katabolen Neurone. Im Gegensatz dazu ist die
Reaktion auf Überfütterung nur einfach. Der katabole Weg wird aktiviert, während der
anabole nicht beeinträchtigt wird. Werden Ratten über Magensonden überfüttert, so wird
POMC erhöht exprimiert, während sich NPY und AgRP nur wenig ändern [Schwartz et al.,
2003].
Signale des katabolen Weges, nicht des anabolen Weges sind nötig, um ein normales
Körpergewicht aufrecht zu erhalten. Genetische Mutationen des POMC- oder
Melanocortin-4-Rezeptors (MC4R) führen zu Hyperphagie und Adipositas [Huszar et al.,
1997; Yaswen et al., 1999]. Ebenfalls führt eine Mutation im CART-Gen zu erhöhtem
Körpergewicht [del Giudice et al., 2001; Yamada et al., 2002]. Andererseits haben Mäuse,
die NPY-defizient sind, einen normalen Phänotyp und leiden nicht an Anorexie oder
Gewichtsverlust [Erickson et al., 1996]. Übereinstimmend mit diesen Ergebnissen erhöhen
zentral verabreichte MC4R-Antagonisten die Nahrungsaufnahme und das Körpergewicht
[Fan et al., 1997; Hagan et al., 2000; Kim et al., 2000], während ein NPY-Rezeptor-
Antagonist keinen gewichtsabnehmenden Effekt hat [Zimanyi et al., 1998]. Sowohl
NPY-defiziente [Erickson et al., 1996] als auch AgRP-defiziente [Qian et al., 2002] Mäuse
zeigen eine Hyperphagie als Antwort auf einen Fastenzustand [Zimanyi et al., 1998].
Insgesamt ist der intakte katabole Weg für die Aufrechterhaltung des Körpergewichts
wichtig. Die Läsion eines orexigenen Faktors hat keine offensichtlichen Auswirkungen auf
das Gewicht, während schon die Störung eines Anorexigens meist zu Adipositas führt. Die
beschriebenen Interaktionen bieten eine Erklärung, warum die Therapie zur
Gewichtsreduktion so schwierig ist. Um effektiv zu sein, sollte die Behandlung bei
mehreren orexigenen Faktoren gleichzeitig angreifen.
Ein weiteres Neuropeptid in der Stoffwechselregulation ist das Melanin-Concentrating-
Hormone (MCH). Das zyklische 19-Aminosäuren-Polypeptid wird hauptsächlich von
Neuronen des lateralen Hypothalamus und der Zona Incerta produziert, die in viele
Regionen des Gehirns projizieren [Bittencourt et al., 1992]. MCH ist ebenfalls ein
wichtiger Mediator in der Regulation der Energiebilanz und des Körpergewichts.
Einleitung
6
Tonischer Input von MCH-Neuronen scheint für die normale Kontrolle der
Nahrungsaufnahme nötig zu sein, da die Gendeletion von MCH zu einem dünnen
Phänotyp führt [Shimada et al., 1998]. MCH könnte eine entscheidende Rolle in der
Weitergabe und Verarbeitung der Signale spielen, die ursprünglich von den
hypothalamischen Neuronen der Gewichtsregulation im Nucleus arcuatus kommen
[Kokkotou et al., 2001; Schwartz et al., 2003]. Diese Hypothese wird durch die
reichhaltigen Verbindungen der NPY-, AgRP-, POMC-, CART-Neurone des Nucleus
arcuatus zu den MCH-Neuronen im lateralen Hypothalamus unterstützt [Elias et al., 1998;
Kokkotou et al., 2001].
MCH-Gen-defiziente Mäuse sind dünn, hypophag und haben eine erhöhte metabolische
Rate [Shimada et al., 1998]. Im Gegensatz dazu sind Mäuse, die das MCH-Gen
überexprimieren, empfänglich für Adipositas, haben eine erhöhte Leptinkonzentration,
eingeschränkte Glukosetoleranz sowie eine Insulinresistenz [Ludwig et al., 2001].
Intrazerebroventrikuläre Applikation von MCH stimuliert die Nahrungsaufnahme [Qu et
al., 1996; Sahu, 1998b; Rossi et al., 1999]. Die einmalige Gabe von MCH1-Rezeptor-
Antagonisten schwächt bei Ratten die Stimulation der Nahrungsaufnahme durch MCH ab
und vermindert den Konsum von schmackhaftem Futter. Chronische Gabe dieser
Antagonisten führt zu einer deutlichen Reduktion des Körpergewichts bei Ratten mit
nahrungsbedingter Adipositas. Die Expression der MCH-Neurone verändert sich sowohl
bei Gewichtsverlust als auch bei Gewichtszunahme [Tritos und Maratos-Flier, 1999].
Während des Fastens ist die MCH-Expression erhöht und ebenfalls bei ob/ob-Mäusen, die
einen Leptin-Synthese-Defekt aufweisen [Qu et al., 1996]. MCH interagiert mit peripheren
Hormonen der Gewichtsregulation. Es erhöht die Synthese und Sekretion von Leptin in
Adipozyten [Bradley et al., 2000].
Zusätzlich zu diesem Effekt auf den Stoffwechsel könnte MCH eine Rolle in der
Stimmungsregulation spielen, da MCH-Rezeptor-Antagonisten einen antidepressiven und
anxiolytischen Effekt haben [Borowsky et al., 2002].
Im lateralen Hypothalamus ebenfalls exprimiert wird das Neuropeptid Orexin-A bzw.
Hypocretin-1 [Sakurai et al., 1998; de Lecea et al., 1998]. Die Orexin-exprimierenden
Neurone haben wie die MCH-sezernierenden Zellen Projektionen in alle wesentlichen
Gehirnareale mit Ausnahme des Cerebellums [Peyron et al., 1998; Nambu et al., 1999].
Orexin-A ist ebenfalls in die Nahrungsregulation involviert, zentral verabreicht stimuliert
es die Kalorienaufnahme [Sakurai et al., 1998]. Orexin-Knockout-Mäuse zeigen dennoch
Einleitung
7
keine Gewichtsabnahme, stattdessen haben sie eine Störung des Schlaf-Wach-Rhythmus,
die der Narkolepsie ähnelt [Chemelli et al., 1999]. In einer anderen Studie führte die
genetische Ablation der Orexinneurone zu erniedrigter physischer Aktivität und induzierte
trotz Hypophagie eine late-onset Adipositas [Hara et al., 2001]. Axone der Orexin-Neurone
stehen bei Ratten in Kontakt mit NPY- und POMC-Neuronen im Nucleus arcuatus und
Mikroinjektionen von Orexin in den Nucleus arcuatus stimuliert ebenfalls die
Nahrungsaufnahme [Muroya et al., 2004]. Auch AgRP-Neurone werden durch Orexin
stimuliert [van den Top et al., 2004].
Vorwiegend in Neuronen des Nucleus paraventricularis wird das anorexigene Peptid CRH
exprimiert. Die Zellen projizieren diffus von diesem Kern in andere Bereiche des
Hypothalamus und beeinflussen das neuroendokrine System und die Energiehomöostase
[Mezey et al., 1984; Liposits et al., 1985; Sakanaka et al., 1986; Arase et al., 1989].
Zentrale Gabe von CRH inhibiert die Nahrungsaufnahme, Injektion von CRH in den
Nucleus paraventricularis oder eine Läsion dieses Kerns ruft Hypophagie bzw.
Hyperphagie hervor [Arase et al., 1988; Krahn et al., 1988]. CRH-Signale sind zusätzlich
wichtig für eine adäquate Reaktion des Körpers auf Stress [Bale et al., 2000; Coste et al.,
2000].
1.4 Zirkulierende Parameter
Peripher nimmt Leptin in der Koordination zwischen dem anabolen und dem katabolen
Stoffwechsel eine Schlüsselrolle ein. Das Hormon wird von Fettzellen freigesetzt und
zirkuliert proportional zur Fettmasse des Körpers. Es unterdrückt Appetit und stimuliert
das sympathische Nervensystem [Mark et al., 2002]. Das Hormon überwindet die Blut-
Hirn-Schranke und bindet an Leptin-Rezeptoren im Hypothalamus. Es aktiviert Signale zur
Verminderung der Nahrungsaufnahme und Erhöhung des Energieverbrauchs [Korner und
Aronne, 2003]. Leptin-Rezeptor-defiziente Ratten (adipöse Zucker-Ratten) und Leptin-
defiziente Mäuse (ob/ob-Mäuse) entwickeln eine Hyperphagie, Adipositas, periphere
Insulinresistenz, Hyperinsulinämie und Hyperlipidämie [Zucker, 1965; Ionescu et al., 1985;
Kasiske et al., 1992; Gades et al., 1999]. Diese Tiere haben wie die meisten adipösen
Patienten einen erhöhten Leptinspiegel und entwickeln eine primäre oder sekundäre
Leptinresistenz. Leptin hat Effekte auf die Genexpression und Synthese von sowohl
orexigenen als auch anorexigenen Peptiden im Hypothalamus. Im Nucleus arcuatus
werden NPY und AgRP negativ, POMC und CART positiv reguliert [Mizuno et al., 1998;
Einleitung
8
Flier und Maratos-Flier, 1998; Elmquist et al., 1999; Korner und Aronne, 2003]. Leptin
erhöht die Sekretion, Konzentration und mRNA-Expression von CRH im Nucleus
paraventricularis [Huang et al., 1998], bei den Leptin-Rezeptor-defizienten Zucker-Ratten
ist die Konzentration von CRH im Hypothalamus geringer [Plotsky et al., 1992; Richard et
al., 1996]. Außerdem inhibiert Leptin wie auch Glukose die elektrische Aktivität von
Orexin-Neuronen [Yamanaka et al., 2003]. Gibt man fastenden Mäusen Leptin, so
erniedrigt sich die durch Fasten induzierte Erhöhung von hypothalamischen MCH und
NPY wieder [Ahima et al., 1996]. Leptinverabreichung bei Leptin-Gen-defizienten
ob/ob-Mäusen führt zu Erniedrigung der NPY-Expression im Hypothalamus [Stephens et
al., 1995], ähnliche Effekte traten mit MCH auf [Kokkotou et al., 2001]. In anderen
Studien dagegen erhöhte Leptin die Expression von MCH mRNA im Hypothalamus bei
ob/ob-Mäusen [Huang et al., 1999].
Insulin ist ebenfalls in wichtige Stoffwechselvorgänge involviert und wirkt zentral ähnlich
wie Leptin. Intrazerebroventrikuläre Gabe von Insulin reduziert die Nahrungsaufnahme
und das Körpergewicht [Air et al., 2002], intranasal über einen längeren Zeitraum
appliziert verringert es das Körpergewicht von Männern, nicht aber von Frauen
[Hallschmid et al., 2004]. Dagegen ruft Deletion des neuronalen Insulin-Rezeptors
Hyperphagie, Adipositas und Insulinresistenz hervor [Obici et al., 2002]. Dennoch ist
Insulin peripher ein anaboler Faktor, pharmakologische Level von Insulin sind mit
Gewichtszunahme assoziiert [Air et al., 2002]. Plasma-Insulinkonzentrationen korrelieren
mit Plasma-Leptinkonzentrationen bei Tieren und Menschen [Ahren et al., 1997; Havel,
1998]. Persistierende erhöhte Level von Insulin desensibilisieren die Zielzellen und führen
zu generalisierter Insulinresistenz [Roth et al., 2004]. Leptin-Gen-defiziente ob/ob-Mäuse
sind hyperinsulinäm und können einen Diabetes mellitus entwickeln [Joosten und van der
Kroon, 1974; Muzzin et al., 1996]. Die Resistenz besteht auch bei Hyperleptinämie, wie
der Agouti-Maus [Boston et al., 1997], bei Leptin-Rezeptor-defizienten Zuckerratten
[Kemmer et al., 1979] und bei Diät-bedingter Adipositas [Frederich et al., 1995]. Tiere, die
mit NPY behandelt wurden, entwickelten ebenfalls eine Insulinresistenz, sogar, wenn sie
keine Adipositas bekamen [Sainsbury et al., 1997]. Hyperinsulinämie und Insulinresistenz
sind beide in die Pathogenese von Hypertonie, Adipositas, Diabetes mellitus Typ 2 und
Atheriosklerose involviert [Prasad und Quyyumi, 2004].
Einleitung
9
Adiponectin ist wie Leptin ein vom Fettgewebe produziertes Protein mit einem erheblichen
Einfluss auf die Insulinsensitivität. Adiponectin-mRNA wird in Adipozyten exprimiert und
Adiponectin zirkuliert in hohen Konzentrationen in Nagern und Primaten. Im Gegensatz zu
vielen anderen Adipokinen korreliert das Adiponectin invers zur Fettmasse im Körper
[Gorzelniak et al., 2002] und ist damit bei Übergewicht und Insulinresistenz erniedrigt
[Guerre-Millo, 2004]. Bei Rhesus-Affen sinkt die Plasma-Adiponectinkonzentration mit
der Entwicklung von Insulinresistenz bei Übergewicht und im Alterungsprozess [Hotta et
al., 2001]. Das Risiko, an Diabetes mellitus Typ 2 zu erkranken, ist bei Personen mit hohen
Adiponectinspiegeln deutlich niedriger als bei Menschen mit geringen
Adiponectinkonzentrationen im Plasma [Lindsay et al., 2002; Spranger et al., 2003].
Therapeutische Maßnahmen, die die Insulinsensitivität verbessern, wie Gewichtsverlust,
Kalorienrestriktion usw. erhöhen die Adiponectin-Expression im Fettgewebe bzw. die im
Plasma zirkulierenden Adiponectin-Level [Guerre-Millo, 2004]. Die Behandlung mit
rekombinantem Adiponectin senkt den Blutzucker und verbessert die Insulinresistenz bei
übergewichtigen und diabetischen Mäusen [Tsao et al., 2002; Berg et al., 2002].
Interessanterweise kann die Insulinresistenz bei lipoatrophen Mäusen mit physiologischen
Dosen von Adiponectin und Leptin vollständig aufgehoben werden, bei alleiniger Gabe
von Adiponectin oder Leptin dagegen nur teilweise [Yamauchi et al., 2001]. Bei den
Leptin-Gen-defizienten ob/ob-Mäusen verbessert Adiponectin wiederum die
Insulinresistenz, jedoch nicht das Übergewicht [Yamauchi et al., 2003].
Corticosteron wird bei Stresszuständen von der Nebennierenrinde sezerniert. Dieser
Prozess ist durch die Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse (HPA-Achse)
reguliert. Die Verabreichung von CRH erhöht die Konzentration von zirkulierendem
Adrenocorticotropen Hormon (ACTH) und dieses wiederum die Menge des Corticosteron
im Plasma innerhalb von 10 min [Stanley et al., 2004]. Ist zu wenig Corticosteron
vorhanden, erhöht sich durch negatives „Feedback“ die hypothalamische
CRH-Immunoreaktion und der ACTH-Gehalt der Hypophyse, wie z.B. nach
Adrenalektomie [Moldow und Fischman, 1982; Gertz et al., 1987]. Gibt man Corticosteron
dagegen in höheren Dosen, so wird das hypothalamische CRH inhibiert und es erniedrigt
sich der ACTH-Gehalt des Hypophyse [Bagdy et al., 1990; Akana et al., 1992].
Hypertensive Patienten haben einen erhöhten Cortisol-Spiegel im Plasma [Filipovsky et al.,
1996]. Corticosteron beeinflusst den Metabolismus und das Körpergewicht. Beim
Cushing-Syndrom, das durch primären Hypercortisolismus entsteht, sind Adipositas und
Einleitung
10
das Metabolische Syndrom zu beobachten [Peeke und Chrousos, 1995] und sowohl bei
Tieren als auch bei Menschen wird die Leptin-Produktion von Glucocorticoiden stimuliert
[Dagogo-Jack et al., 1997].
Neben Leptin und Adiponectin sezernieren Adipozyten eine große Vielzahl weiterer
Hormone, Zytokine, Wachstumsfaktoren und anderer bioaktiver Mediatoren. Diese
Adipokine haben zahlreiche Effekte auf die Vaskularisation und den Metabolismus
[Guerre-Millo, 2002]. Erhöhte Level von Zytokinen, darunter auch Interleukin-6 (IL-6),
zeigen die Entwicklung eines Diabetes mellitus Typ 2 an [Pradhan et al., 2001].
Proinflammatorische Parameter, wie IL-6, TNFα und das C-reaktive Protein, sind bei
übergewichtigen Probanden erhöht und korrelieren mit verschiedenen Markern der
Adipozytenmenge [Kaiser und Schunkert, 2001; Cottam et al., 2004]. IL-6 ist neben dem
Körpergewicht auch mit Insulinsensitivität verbunden, hier aber invers [Bastard et al., 2000;
Bastard et al., 2002]. Bei gesunden Menschen stammt ungefähr 30% des zirkulierenden
Interleukin-6 aus dem Fettgewebe [Mohamed-Ali et al., 1997]. IL-6-defiziente Mäuse
entwickeln eine Adipositas mit Glukoseintoleranz, die durch IL-6-Administration teilweise
rückgängig gemacht werden kann. Außerdem wird IL-6 in zentralen Kernen des
Hypothalamus exprimiert, die das Körpergewicht regulieren. Intrazerebroventrikulär
verabreichtes IL-6 erhöht im Gegensatz zu intraperitoneal gegebenem IL-6 den
Energieverbrauch. Demnach hat IL-6 zentral deutliche gewichtsreduzierende Effekte bei
Nagern [Wallenius et al., 2002]. In Versuchen mit Biopsien von humanem weißen
Fettgewebe und in Adipozytenkulturen sind IL-6 und TNFα potente Inhibitoren der
Adiponectin-Expression und -Sekretion [Bruun et al., 2003; Fasshauer et al., 2003]. Die
von diesen Zytokinen induzierte Insulinresistenz könnte also teilweise auf Inhibition der
Adiponectin-Sekretion zurückzuführen sein.
1.5 Renin- Angiotensin- System
Das in dieser Studie verwendete Medikament Candesartan, dessen Einfluss auf das
Körpergewicht hier untersucht werden soll, greift in das Renin-Angiotensin-System (RAS)
ein. Das RAS ist eine enzymatische Kaskade. Angiotensinogen wird in Angiotensin I
(ANG I) umgewandelt, dieses zu Angiotensin II (ANG II). Renin und das
Angiotensinogen-Conversions-Enzym (ACE) sind die Enzyme, die diesen Prozess primär
katalysieren. Außerdem gibt es weitere alternative Wege. ANG II stimuliert die
Freisetzung von Aldosteron. Zusätzlich zum endokrinen System kann parakrine
Einleitung
11
RAS-Aktivität in Fettgewebe, Gehirn, Niere, Herz und Blutgefäßen nachgewiesen werden.
Die Effekte des ANG II werden hauptsächlich über den Angiotensin II-Rezeptor-Typ-1
(AT1-Rezeptor) ausgeübt [Prasad und Quyyumi, 2004]. Neben dem AT1-Rezeptor gibt es
den Angiotensin II-Rezeptor-Typ-2 (AT2-Rezeptor). Beide Rezeptoren gehören zu den G-
Protein-Rezeptoren mit sieben Transmembranregionen, sie haben unterschiedliche
Transduktionswege [Timmermans et al., 1993]. Der AT1-Rezeptor ist in vielen Geweben
und Organen vorhanden, wie in Herz, Blutgefäßen, Nieren, Gehirn und Fettgewebe,
während der AT2-Rezeptor hauptsächlich beim Fetus exprimiert wird und nach der Geburt
nur noch eine niedrige Expression aufweist. Die meisten physiologischen und
pathophysiologischen Effekte von ANG II scheinen über den AT1-Rezeptor übertragen zu
werden, der AT2-Rezeptor spielt eine untergeordnete Rolle [Prasad und Quyyumi, 2004].
Bei Nagetieren gibt es zwei AT1-Rezeptor-Subtypen, den AT1A- und AT1B-Rezeptor. Diese
Rezeptoren werden von unterschiedlichen Genen kodiert, unterschiedlich exprimiert und
reguliert, pharmakologisch können sie nicht unterschieden werden [Inagami et al., 1994].
Das RAS übt vielfältige Funktionen im Organismus aus. ANG II reguliert den
Flüssigkeitshaushalt, den Tonus der Gefäßmuskulatur, den Blutdruck sowie
kardiovaskuläre Strukturen [Timmermans et al., 1993; Fitzsimons, 1998]. Zentral
appliziertes ANG II erhöht in Ratten den Blutdruck, die Trinkmenge und stimuliert die
sympathoadrenerge Katecholaminsynthese [Seltzer et al., 2004]. AT1A-Rezeptoren sind der
dominante Subtyp im Gehirn von Nagetieren [Leong et al., 2002]. Die zentralen Effekte
von Angiotensin II auf Blutdruck und Dehydratation werden vermutlich durch den
AT1A-Rezeptor weitergeleitet [Sanvitto et al., 1997; Davisson et al., 2000; Morris et al.,
2001], die der Flüssigkeitsaufnahme durch den AT1B-Rezeptor [Davisson et al., 2000].
Das RAS beeinflusst ebenfalls den Stoffwechsel. Sowohl ACE-Hemmer [ALLHAT, 2002]
als auch AT1-Rezeptor-Antagonisten [Dahlof et al., 2002; Julius et al., 2004] verbessern
die Insulinsensitivität und damit das Risiko, an Diabetes mellitus Typ 2 zu erkranken.
Ratten mit einer Überexpression des RAS im Gehirn und weiteren Geweben entwickeln
schon im Alter von sechs Wochen eine Insulinresistenz [Henriksen und Jacob, 2003]. Auch
bei Patienten mit dem Metabolischen Syndrom scheint das RAS aktiviert zu sein [Prasad
und Quyyumi, 2004]. Gehirnareale mit RAS-Aktivität und AT1-Rezeptor-Expression sind
an der Insulin- und Leptinregulation, der Steuerung der Nahrungsaufnahme und des
Metabolismus beteiligt [Ellacott und Cone, 2004; Niswender et al., 2004; Morton et al.,
2005].
Einleitung
12
Auch auf das Körpergewicht hat das RAS Einfluss. Die Ergebnisse verschiedener Studien
sind diesbezüglich allerdings widersprüchlich. In adipösen Patienten bzw. Ratten sind
Parameter des RAS wie Angiotensinogen, Renin, Aldosteron und ACE im Fettgewebe
erhöht [Hainault et al., 2002; Giacchetti et al., 2002; Boustany et al., 2004; Engeli et al.,
2005]. Mit Gewichtsreduktion von adipösen Patientinnen kehren die Angiotensinogen-,
Renin-, Aldosteron- und ACE-Level auf Normalwerte zurück und der Blutdruck verringert
sich [Engeli et al., 2005]. Mäuse mit systemischen Angiotensinogenmangel haben ein
erniedrigtes Körpergewicht [Massiera et al., 2001]. ASrAogen-Ratten mit geringem
Angiotensinogenlevel im Gehirn wiegen deutlich weniger als Kontrollratten und haben
eine geringere Masse viszerales Fett [Kasper et al., 2005]. Patienten mit Polymorphismen
im Angiotensinogen-Gen zeigen Unterschiede im Gewicht [Chaves et al., 2002; Strazzullo
et al., 2003]. Nach der Behandlung mit ACE-Hemmern und AT1-Rezeptor-Antagonisten
wird eine Gewichtsreduktion in Ratten und Patienten beobachtet [Enalapril in
Hypertension Study Group (UK), 1984; McGrath et al., 1990; Campbell et al., 1995;
Benson et al., 2004], die mit einer geringeren Fettmasse einhergeht [Carter et al., 2004]. Im
Gegensatz zu diesen Studien wurden bereits 1979 in einer Arbeit erniedrigte ANG II-
Plasmakonzentrationen bei Patienten mit erhöhtem Körpergewicht beobachtet [Walker et
al., 1979]. Im Anschluss zeigten weitere Studien eine Induktion von Gewichtsverlust und
Reduzierung der weißen Fettmasse durch ANG II. Diese Effekte sind unabhängig vom
Blutdruck und dem Applikationsort, peripher oder intrazerebroventrikulär, und werden
durch AT1-Rezeptoren vermittelt [Brink et al., 1996; Cassis et al., 1998; Harrison-Bernard
et al., 1999; Porter und Potratz, 2004].
AT1-Rezeptoren sind in hypothalamischen Arealen vorhanden, die auch in die
Nahrungsaufnahme, das Sättigungsempfinden und die Regulation des
Energiemetabolismus involviert sind [Ellacott und Cone, 2004; Niswender et al., 2004;
Morton et al., 2005]. Mehrere Komponenten des RAS wie Angiotensinogen, ACE und
AT1-Rezeptoren sind im menschlichen Fettgewebe vorhanden. Das fettgewebsständige
RAS wird von Hormonen und Ernährungsfaktoren reguliert und korreliert mit dem
Ausmaß des Übergewichts [Massiera et al., 2001]. ANG II könnte im Fettgewebe die
Durchblutung, das Wachstum und den Metabolismus modulieren [Goossens et al., 2003].
Ein hochreguliertes RAS im Fettgewebe könnte also zu lokalen und systemischen Effekten
von adipösen Patienten führen und so zu Insulinresistenz und Hypertonus beitragen
[Prasad und Quyyumi, 2004].
Einleitung
13
1.6 AT1-Rezeptor-Antagonisten
Das Medikament Candesartan, das hier verwendet wurde, gehört zu den AT1-Rezeptor-
Antagonisten. Diese binden kompetitiv und selektiv an den AT1-Rezeptor [Burnier, 2001],
ihre Sicherheit und Effektivität wurde in zahlreichen Studien belegt [Cohn und Tognoni,
2001; Brenner et al., 2001; Parving et al., 2001; Lewis et al., 2001; Dahlof et al., 2002;
Lindholm et al., 2002; Pfeffer et al., 2003]. Sie werden in der medizinischen Praxis heute
routinemäßig als Antihypertensiva sowie zur Therapie der Herzinsuffizienz angewendet.
Im Gegensatz zu einer Medikation mit ACE-Hemmern ist durch die AT1-Rezeptor-
Blockade auch die Wirkung von durch alternative ACE-unabhängige Wege produziertes
ANG II gehemmt. Somit wird auch der „ACE-Escape-Effekt“, die langsame Anpassung
des ANG II-Levels an Konzentrationen vor der Behandlung, umgangen. Ein weiterer
Vorteil ist das Ausbleiben des von ACE-Hemmern oft hervorgerufenen Reizhustens
[Sharma, 2004].
Das verwendete Medikament Candesartan senkt den Blutdruck bei Säugetieren und
Menschen wirkungsvoll [McKelvie et al., 1999; Naruse et al., 2002; Seltzer et al., 2004;
Raasch et al., 2004; Raasch et al., 2006]. Orale Vorbehandlung mit Candesartan inhibiert
die Effekte von interventrikulär applizierten ANG II in Ratten [Seltzer et al., 2004]. Auch
zur Behandlung des Metabolischen Syndroms scheinen AT1-Rezeptor-Antagonisten
geeignet zu sein. Kurz- und langfristige AT1-Rezeptor-Blockade verhindert die
Entwicklung von Hypertonie und Hyperinsulinämie, die mit erhöhter ANG II-
Konzentration und AT1-Rezeptordichte auftritt [Iyer et al., 1996; Iyer und Katovich, 1996].
In einem Mausmodell mit genetisch hervorgerufenem Metabolischen Syndrom verhindern
AT1-Rezeptor-Antagonisten die Entwicklung von Hyperinsulinämie, Hypertonie,
Adipositas, kardialer Hypertrophie und Atheriosklerose [Ortlepp et al., 2002]. Behandlung
mit Valsartan, Losartan oder Candesartan reduziert die Inzidenz von Diabetes mellitus
Typ 2 [Dahlof et al., 2002; Lindholm et al., 2002; Julius et al., 2004; Yusuf et al., 2005].
1.7 Fragestellung
In der vorliegenden Arbeit sollen die Mechanismen der Gewichtsregulation in
Zusammenhang mit dem Renin-Angiotensin-System näher untersucht werden. Der
Schwerpunkt liegt auf der Frage, ob sich das Körpergewicht parallel zur Absenkung des
Blutdrucks durch AT1-Antagonisten vermindert, ab welcher Dosierung dies geschieht, wie
sich die Nahrungsaufnahme in diesem Zusammenhang ändert und welche hormonellen und
neuroendokrinen Veränderungen beobachtet werden können. Die meisten Studien, welche
Einleitung
14
die Zunahme bzw. die Abnahme des Körpergewichts in Abhängigkeit des RAS
untersuchen, konzentrieren sich auf periphere Effekte, wie zum Beispiel Lipolyse,
Reduktion der Fettmasse, Thermogenese oder die periphere sympathische Aktivität. Es
gibt Studien zur zentralen Wirkung des RAS, in denen beispielsweise ANG chronisch
intrazerebroventrikulär verabreicht wurde [Porter und Potratz, 2004] oder
Angiotensinogen-defiziente Ratten verwendet wurden [Kasper et al., 2005]. Dennoch ist
bisher wenig bekannt, wie sich eine Blockade des RAS auf orexigene und anorexigene
hypothalamische Neuropeptide auswirkt.
Bereits in früheren Versuchen der Arbeitsgruppe fiel auf, dass Candesartan in höheren
Dosen über längere Zeiträume bei Ratten die Gewichtszunahme deutlich senkt. Dies gab
den Anstoß zu dieser Arbeit, in der spontan hypertensive Ratten über vier Wochen mit dem
AT1-Rezeptorantagonisten Candesartan behandelt und Parameter wie Nahrungs- und
Wasseraufnahme, Herzfrequenz, Blutdruck, Gewicht sowie Glukose bestimmt wurden.
Anschließend wurden die „mRNA-steady-state“-Konzentrationen von AT1A-, AT1B-
Rezeptoren sowie MCH, Orexin, CART, NPY, POMC, AgRP und CRH mittels
Real-Time-Polymerase-Ketten-Reaktion (RT-PCR) im Hypothalamus gemessen.
Außerdem wurden die peripheren gewichtsregulierenden Hormone Insulin, Leptin,
Adiponectin und IL-6 ermittelt.
Methoden
15
2. Methoden
2.1 Behandlung der Tiere
Als Versuchstiere wurden männliche spontan hypertensive Ratten (SHR) der Firma
Charles River, Sulzfeld verwendet. Die Tiere lebten in einem Tag-Nacht-Rhythmus von je
12 Stunden, die Lichtanschaltung erfolgte um 14 Uhr. Die SHR waren zu dritt oder zu viert
in Käfigen mit freiem Zugang zu Leitungswasser und Standardnahrung bei einer
konstanten Temperatur von 24 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 50 % untergebracht. Die
Tierversuche wurden entsprechend der Deklaration von Helsinki und den entsprechenden
Richtlinien für den Umgang und die Verwendung von Labortieren nach Genehmigung
durch das Ministerium für Landwirtschaft, Umwelt und ländliche Räume des Landes
Schleswig-Holstein bewilligt (siehe Anhang).
60 dieser SHR wurden im Alter von 8-9 Wochen in vier Gruppen nach Körpergewicht
randomisiert. Die Tiere bekamen über vier Wochen täglich zum gleichen Zeitpunkt
morgens über eine Schlundsonde Candesartan-Cilexetil in Suspension mit destilliertem
Wasser und Gummi-Arabicum (1µl/1g Körpergewicht) je nach Gruppe in den
Konzentrationen von 2; 6; 16 mg/kg Körpergewicht. Der Kontrollgruppe wurde das
gleiche Volumen einer Gummi-Arabicum-Suspension (1µl/1g Körpergewicht) gegeben.
Zur Berechnung der zu gebenden Candesartandosis wurden die Tiere täglich gewogen. Am
19. Tag der Medikamentengabe wurden die Tiere isoliert, damit vom 20.- 21. Tag die
Futteraufnahme in 24 Stunden über das Gewicht der Nahrung gemessen werden konnte.
Am 21. Tag wurde den Ratten in Pentobarbital-Narkose (75 mg/kg Körpergewicht) ein
Polyethylen-Katheter in die rechte Arteria femoralis eingesetzt und gleichzeitig 1 ml Blut
abgenommen. Das Vollblut wurde mit 50 µl EDTA-Lösung (900 mg EDTA auf 10 ml
destilliertem Wasser) versetzt, 5 min bei 3500 xg zentrifugiert und das Plasma
abgenommen. In der Narkose wurde die Körperlänge gemessen (Nasenspitze zu
Schwanzwurzel). Über den Katheter und NaCl-gefüllten Schlauch erfolgte dann am
22. Tag zwischen 9 und 11 Uhr randomisiert am wachen Tier in blutiger Messmethode
eine Blutdruck- und Herzfrequenzbestimmung. Die Werte wurden für 5 min aufgenommen
und ein Mittelwert in einem Zeitfenster von 20 s als repräsentativer Wert ermittelt [Raasch
et al., 2006]. Anschließend wurden die Tiere wieder in die alten Käfige gesetzt. Am
30. Tag wurden die Ratten ohne Narkose mit einer Guillotine getötet. Der Blutzucker
wurde mit Hilfe eines Glukose-Sensors bestimmt, der nach enzymatischer
Glukoseoxidation amperemetisch die Konzentration misst (Ascensia ELITE XL, Bayer).
Methoden
16
Weiteres Blut wurde abgenommen, von dem ein Teil mit EDTA (s.o.), ein anderer Teil zur
Angiotensin-Bestimmung mit 12,1 mM EDTA und 20 µM Bestatin versetzt und
zentrifugiert wurde (s.o.). Das Gewicht des linken Ventrikels wurde gemessen.
Nachdem das Gehirn frei präpariert war, wurde es in 2-Methylbutan gefroren. Omentales
Fettgewebe wurde in flüssigem Stickstoff gefroren und alle Organe zunächst bei -20 °C
und anschließend bei -80 °C tiefgefroren.
Isolierung des Hypothalamus
Der Hypothalamus wurde nach der Methode von Palkovitz und Brownstein entnommen.
Die bei -80 °C gelagerten Gehirne wurden für 30 min bei -12 °C erwärmt. Mit
anatomischer Pinzette und Skalpell wurde ein Koronarschnitt ca. 1 mm rostral des
Chiasma opticums und ein weiterer Schnitt zur Abtrennung der Corpora mamillaria gesetzt.
Von dem Stück mit Hypothalamus wurden die Amygdala lateral abgetrennt und das
Gewebe ventral des Hypothalamus einschließlich der Comissura anterior entfernt. Bis zur
weiteren Verarbeitung wurde der Hypothalamus erneut bei -80 °C gelagert.
Methoden
17
2.2 Analytische Methoden
2.2.1 Radio-Immuno-Assays
Die Bestimmung von Angiotensin, Aldosteron, Leptin, Insulin, Adiponectin und
Corticosteron erfolgte mittels kommerziell erhältlicher Kits analog den Vorschriften. Das
genaue Vorgehen sei deshalb hier nur in Kürze geschildert.
Angiotensin
Der Angiotensingehalt im Plasma (12,1 mM EDTA und 20 µM Bestatin) vom Schlachttag
wurde mit dem Euria-Angiotensin II Kit (Kat.Nr. RB 320) bestimmt.
250 µl Plasmaprobe wurden mit 1 ml kaltem Ethanol geschüttelt, 15 min bei 4 °C und
2000 xg zentrifugiert und der Überstand abpipettiert. Für die Wiederfindungsrate wurde
eine beliebige Plasmaprobe mit 50 µl J-125-Angiotensin II gemischt und dann wie
beschrieben behandelt. Die Flüssigkeit verdampfte über Nacht in einem Vakuum-
Verdampfer. Anschließend wurden die Proben mit 250 µl Assaypuffer rekonstituiert. Zur
Bestimmung der Wiederfindungsrate wurden 200 µl der Wiederfindungsprobe
abgenommen. Diese und 100 µl J-125-Angiotensin II für die Gesamtaktivität wurden im
γ-Counter 5 min gezählt. Die Wiederfindung (%) ist die Aktivität der
Wiederfindungsprobe dividiert durch die Gesamtaktivität multipliziert mit Faktor 250, sie
betrug 71,88 %.
Eine Verdünnungsreihe 1:2 des Standards wurde mit Assaypuffer hergestellt. 200 µl
Standard, Aliquot oder Kontrolle wurden mit 100 µl Anti-Angiotensin II bei 4 °C 6 h
inkubiert. 100 µl des J-125-Angiotensin II wurden hinzugegeben, anschließend 20 h bei
4°C inkubiert. Dann wurden 50 µl Trennreagenz dazu pipettiert, bei 4 °C 45 min inkubiert,
geschüttelt, 15 min bei 1700 xg bei 4 °C zentrifugiert, der Überstand abgesaugt und die
Proben im Gamma-Counter 5 min gezählt.
Aldosteron
Die Plasma-Aldosteronkonzentration des 21. Tages wurde mit Hilfe des Aldosterone DA
Kit von MP Biomedicals (Kat.Nr. 07-108202) bestimmt.
100 µl Plasma wurden mit 2 ml Ethylacetat:Hexan in dem Verhältnis 3:2 für 45 s in
verschließbaren Glasröhrchen geschüttelt und dann für 20 min zur Phasentrennung bei
Methoden
18
Raumtemperatur inkubiert. Die Röhrchen wurden für 15 s in einer Mischung aus Methanol
und Trockeneis gefroren, anschließend die flüssige organische Phase dekantiert und auf
einem Wärmetisch bei 40 °C im Stickstoffstrom getrocknet. Die Rekonstituierung erfolgte
mit 1 ml Steroid-Diluent, die Probeninkubation dauerte 30 min und wurde dreimal von
einer Minute Schütteln unterbrochen. Die Proben lagerten für 20 h bei -20 °C.
250 µl Aliquot bzw. Standard wurden mit 50 µl Anti-Aldosteron und 50 µl J-125-
Aldosteron gemischt, 60 min bei Raumtemperatur und anschließend 60 min im Wasserbad
bei 4 °C inkubiert. 250 µl Präzipitationslösung der Temperatur von 37 °C erwirkten die
Ausfällung. Die Proben wurden bei 1000 xg 20 min zentrifugiert, anschließend der
Überstand abgesaugt und die Proben im Gamma-Counter 5 min ausgezählt. Zum Erhalt der
Einheit pg/ml wurden die Werte mit 40 multipliziert.
Leptin
Die Leptin-Konzentrationen wurden mittels Radioimmunoassay unter Verwendung des Rat
Leptin Ria Kit von Linco Research (Cat.#RL-83K) bestimmt.
Leptinbestimmung im Plasma:
Zu je 50 µl Pufferlösung wurde 50 µl EDTA-Plasma der Probe, Kontrolle oder Standard
gegeben und 50 µl Ratten-Leptin-Antikörper hinzugegeben, anschließend geschüttelt und
24 h bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden 50 µl J-125-Ratten-Leptin-
LabelHydratingPufferlösung dazu pipettiert und nochmals für 24 h bei Raumtemperatur
inkubiert. Am dritten Tag wurden die Proben mit 500 µl auf 4 °C gekühlter
Präzipitationslösung versetzt, 20 min bei 4 °C inkubiert, 20 min bei 4 °C mit 2000-3000 xg
zentrifugiert, abgesaugt und im Gamma-Counter jede Probe 5 min gezählt.
Leptinbestimmung im Fettgewebe:
Die tiefgefrorenen Proben wurden auf Eis aufgetaut und mit einem Skalpell grob
zerkleinert. Maximal 300 mg je Probe wurden auf der Feinwaage abgewogen und mit der
vierfachen Menge eines Homogenisat-Puffers (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 250 mM
Saccharose, 2,5 µl/ml Leupeptin, 3,5 µl/ml Aprotinin, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid,
1% Triton, pH-Einstellung auf 7,4 mit HCl und NaOH) auf Eis aufgefüllt [Russell et al.,
2001]. Die Proben wurden mit dem Tourax (Stufe 4) 30 s auf Eis homogenisiert und dann
60 min bei 4 °C bei 5000 xg zentrifugiert. Das Homogenisat wurde abgenommen und bei
-20 °C eingefroren. Der RIA zur Bestimmung der Leptin-Konzentration wurde wie oben
Methoden
19
beschrieben durchgeführt. Anstatt EDTA-Plasma wurde ein Aliquot von 50 µl des
Homogenisats verwendet.
Insulin
Die Bestimmung der Insulinkonzentration am 21. Tag im Plasma erfolgte mittels
Radioimmunoassay, es wurde der Rat Insulin Ria Kit von Linco Research (Cat.#RI-13K)
verwendet.
50 µl EDTA-Plasma der Probe bzw. 50 µl Kontrolle oder Standard wurde mit 50 µl J-125-
Insulin-LabelHydratingPufferlösung versetzt. 50 µl Ratten-Insulin-Antikörper wurden zu
der Probe hinzugegeben, geschüttelt und bei 4 °C für 24 h inkubiert. Dann wurden 500 µl
der 4 °C kalten Präzipitationslösung hinzu pipettiert, erneut geschüttelt und bei 4 °C für
20 min inkubiert. Bei 2000-3000 xg wurde 20 min bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand
abgesaugt. Die Proben wurden anschließend im Gamma-Counter je 5 min gezählt.
Adiponectin
Der Adiponectin-Gehalt des EDTA-Plasmas vom Schlachttag wurde mit dem Mouse
Adiponectin Ria Kit (Cat.#MADP-60HK) bestimmt.
Zunächst wurde das Plasma mit Assaypuffer 1:500 in zwei Schritten verdünnt. Zu 50 µl
Assaypuffer wurden 50 µl Standard, Kontrolle oder verdünnte Probe gegeben, 50 µl J-125-
Adiponectin und danach 50 µl Adiponectin-Antikörper hinzugefügt und anschließend für
24 h bei Raumtemperatur inkubiert. 5 µl des Kaninchen-Trägers und 500 µl auf 4 °C
gekühlte Präzipitationslösung wurden dazugegeben, geschüttelt und 20 min bei 4 °C
inkubiert. Die Proben wurden bei 4 °C 20 min bei 2000-3000 xg zentrifugiert und der
Überstand abgesaugt. Der Gamma-Counter maß die Aktivität der Proben für je 5 min.
Corticosteron
Das Corticosteron im Plasma wurde mittels Corticosteron 125-J-Ria Kit für Ratten und
Mäuse (Kat.Nr. 07-120102) aus dem Blut vom Schlachttag bestimmt.
Die Plasmaproben wurden 1:200 mit Steroid-Diluent in zwei Schritten verdünnt. Zu 50 µl
Standard bzw. verdünnte Probe wurde 100 µl J-125-Corticosteron gegeben und dann
100 µl Anti-Corticosteron hinzugefügt, geschüttelt und bei Raumtemperatur 2 h inkubiert.
Methoden
20
Die Fällung wurde mit 250 µl Präzipitationslösung ausgelöst, anschließend die Proben
geschüttelt und 15 min bei 1000 xg zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und die
Proben im Gamma-Counter je 5 min gezählt.
2.2.2 Elisa
Der IL-6-Gehalt der ANG II-Plasma Proben wurde mit dem kommerziell erhältlichen Kit
Rat IL-6 ELISA von Bender MedSystems GmbH, Wien (Kat.Nr. BMS625) analog den
Vorschriften ermittelt.
Auf der Microwell-Platte wurde eine Verdünnungsreihe des Standards 1:2 mit
Pufferlösung hergestellt, 100 µl je Standard, 100 µl der Proben und 100 µl Puffer als
Blankoprobe wurden in der Platte mit 50 µl Biotin-Konjugat gemischt und die abgedeckte
Platte 2 h auf einem Schwenker (200 rpm) bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde
mit Waschpuffer dreimal gewaschen und dann 100 µl Streptavidin-HRP hinzugefügt. Nach
Abdecken inkubierte die Platte erneut für 1 Stunde auf dem Schwenker (200 rpm) bei
Raumtemperatur. Nach dreimaligen Waschen mit dem Waschpuffer wurde 100 µl TMB
Substratlösung (SubstrateSolution1:SubstrateSolution2; 1:1) hinzugefügt und die Platte
10 min im Dunkeln inkubiert. Die Reaktion endete mit 100 µl Stop-Lösung und die
Absorption wurde bei 450 nm im FLUOstar OPTIMA gemessen.
2.2.3 Real-Time-Polymerase-Ketten-Reaktion
Die Neuropeptide des Hypothalamus wurden mittels Real-Time-Polymerase-Ketten-
Reaktion (RT-PCR) bestimmt. Aus dem homogenisierten Hypothalamus-Gewebe wurde
die RNA extrahiert und cDNA hergestellt, damit anschließend die RT-PCR durchgeführt
werden konnte. Es wurden kommerzielle Kits benutzt und nach Vorschrift vorgegangen
(Isolation of Total RNA from Plant, Applied Biosystems; Cloned AMV First-Strand cDNA
Synthesis Kit, Invitrogen, Cat.No.: 12328-040; Scybr Green I Reaction System,
Eurogentec SA, Cat.No.: ME-SN73-05).
Homogenisierung des Hypothalamus und RNA-Isolierung
PBS-Puffer und Lysis Solution wurden im Verhältnis 1:1 unter sterilen Bedingungen
gemischt und der Hypothalamus in 1000 µl dieser Lösung mit dem Tourax homogenisiert.
Methoden
21
Das homogenisierte Gewebe wurde mit 40 µl Proteinase K versetzt und 1 h bei
Raumtemperatur inkubiert. Das Vakuumgerät zur RNA-Isolierung (6100 Nucleic Acid
Prep Station) wurde mit 50 µl Waschpuffer 1 in allen Probenöffnungen vorbereitet. 250 µl
des homogenisierten Hypothalamus wurden dazugegeben und dann die Lösung mit
Vakuum abgesaugt. Anschließend wurden erneut 500 µl Waschpuffer 1 hinzugefügt und
abgesaugt. Dieser Waschvorgang wiederholte sich mit 400 µl Waschpuffer 1 und zweimal
mit 300 µl Waschpuffer 2. Nachdem sämtlicher Waschpuffer entfernt war, wurden 150 µl
Elution Solution hinzugeführt und darin die RNA gelöst. Nach Überführung in eine neue
Platte wurde die Flüssigkeit abgenommen und bei -80°C gelagert. Die Reinheit der RNA
wurde durch Messung des Absorptionskoeffizienten bei den Wellenlängen 260 nm und
280 nm im Photometer und Berechnung des Quotienten belegt.
cDNA-Herstellung
RT-Pool:
5x RT Puffer 4 µl je Probe
DEPC Wasser 1 µl je Probe
DTT (0,1 M) 1 µl je Probe
RNaseOUT (40 units/ µl) 1 µl je Probe
Cloned AMV RT (15 units/ µl) 1 µl je Probe
Die cDNA-Herstellung erfolgte mit dem Cloned AMV First-Strand Synthesis Kit von
Invitrogen. Die Primer (Tabelle 2) wurden im Labor designed und validiert. Pro Probe
wurden 1 µl Oligo (dT) Primer mit 2 µl cNTP Mix gemischt und 3 µl dieser Lösung zu 9 µl
RNA pipettiert. Die RNA und Primer inkubierten 5 min bei 65 °C im Cycler. 8 µl des RT-
Pools wurden zu jeder Probe gegeben und im Cycler für 60 min auf 50 °C und
anschließend für 5 min auf 85 °C erhitzt. Die synthetisierte cDNA wurde 1:2 mit Nuclease-
freiem Wasser verdünnt und bei -20 °C eingefroren.
Methoden
22
Tabelle 2: Nukleotid-Sequenzen der für die RT-PCR verwendeten Primer
Name Orientation Sequence
AT1A Sense 5´- TCA AAC TCC CAG TGG ACC TC -3´
Antisense 5´- CTC ACC GAA GCC TCT CTC AC -3´
AT1B Sense 5´- TTC AAC CTC CAG CAA TCC TT -3´
Antisense 5´- CCC AAA TCC ATA CAG CCA CT -3´
MCH Sense 5´- CAT TTT ACT TTC GGC CTC CA -3´
Antisense 5´- TGG AGC CTG TGT TCT TTG TG -3´
Prepro-Orexin Sense 5´- GCC GTC TCT ACG AAC TGT TG -3´
Antisense 5´- CGA GGA GAG GGG AAA GTT AG -3´
CART Sense 5´- ACT GTC CCC GAG GAA CTT CT -3´
Antisense 5´- ATT TTG AAG CAG CAG GGA AA -3´
NPY Sense 5´-TAA CAA ACG AAT GGG GCT GT -3´
Antisense 5´-TGT CTC AGG GCT GGA TCT CT -3
POMC Sense 5´- GAA GGT GTA CCC CAA TGT CG -3´
Antisense 5´- CTT CTC GGA GGT CAT GAA GC -3´
AgRP Sense 5´- GCA GAC CGA GCA GAA GAT GT -3´
Antisense 5´- CTT GAA GAA GCG GCA GTA GC -3´
CRH Sense 5´- AAA GGG GAA AGG CAA AGA AA -3´
Antisense 5´- GTT TAG GGG CGC TCT CTT CT -3´
RT-PCR:
Mit RT-PCR wurde der Gehalt von mRNA im Hypothalamus von AT1A-Rezeptoren,
AT1B-Rezeptoren, MCH, Orexin, AgRP, CART, NPY, POMC, CRH gemessen. Um eine
quantitative Aussage und Bewertung der PCR-Ergebnisse machen zu können, wurde
Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) als interner Standard verwendet.
Alle RT-PCR-Werte wurden durch die in der cDNA gemessenen RT-PCR-Werte der
GAPDH Menge der jeweiligen Proben dividiert.
Methoden
23
TE-Puffer:
1 M Tris pH 7,4 100 µl
0,5 M EDTA pH 8,0 20 µl
DEPC-Wasser 9880 µl
PCR-Master Mix:
Puffer 10X 250 µl
dNTP-Mix, 5mM 100 µl
MgCl2, 50mM 162,5 µl
HotGoldStar Enzyme 12,5 µl
SybrGreen 75 µl
DEPC-Wasser 1550 µl
Sense Primer (10 pmol/µl) 75 µl bzw. 225 µl bei NPY, MCH, POMC
Antisense Primer (10 pmol/µl) 75 µl
Die Standardverdünnung erfolgte jeweils 1:10 mit TE-Puffer. 2 µl cDNA der Proben bzw.
2 µl cDNA der jeweiligen Standards wurden mit 22 µl PCR-Master Mix in der PCR Platte
gemischt und kurz abzentrifugiert. Die Reaktion lief im ABI PRISM 7000 Sequence
Detection System, Applied Biosystems ab, die Messung fand bei 520 nm statt. An den
Schmelzkurven lässt sich die Reinheit der Proben überprüfen. In Abb. 2 sind sie für zwei
Werte exemplarisch abgebildet.
70 80 90-0.1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
A: MCH
Temperatur (°C)
Abs
orpt
ion
70 80 90-0.1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
B: CART
Temperatur (°C)
Abs
orpt
ion
Abb. 2:
A: Schmelzkurve eines Wertes von MCH, 16 mg/kg/d Candesartan
B: Schmelzkurve eines Wertes von CART, 16 mg/kg/d Candesartan
Methoden
24
Gel
Ladepuffer:
Glycerol 600 µl
DEPC-Wasser 1200 µl
2,5% Xylen-Cyanol in DEPC 200 µl
Um mit einer weiteren Methode die Reinheit der Proben zu belegen, wurden exemplarisch
Gele angefertigt, in denen sich die DNA elektrophoretisch auftrennt (Abb. 3; Abb. 4). Ein
2 % Agarosegel (6 g Agarose auf 300 ml TAE-Puffer, nach Erhitzen Zugabe von 6 µl
Ethidiumbromid) bestückte man mit 2,5 µl Marker und 12,5 µl RT-PCR-Proben, die
jeweils mit 2,5 µl Ladepuffer gemischt worden waren, und legte eine Spannung von 220 V
mit 400 mA für 30 min an. Die Bilder wurden unter UV-Licht aufgenommen.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Abb. 3: Gel-Elektrophorese MCH; Proben 1-4: Behandlung mit 0 mg/kg/d Candesartan;
Proben 5-8: Behandlung mit 2 mg/kg/d Candesartan; Probe 9: Marker
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Abb. 4: Gel-Elektrophorese Orexin; Proben 1-4: Behandlung mit 0 mg/kg/d Candesartan;
Proben 5-8: Behandlung mit 2 mg/kg/d Candesartan; Probe 9: Marker
Methoden
25
2.3 Statistische Methoden
Aus den Einzelmesswerten wurden die arithmetischen Mittelwerte gebildet. Diese werden
mit dem Standardfehler abgebildet.
Mit folgenden Tests wurde auf Signifikanz geprüft:
Bei Normalverteilung und homogenen Varianzen konnte der One-Way ANOVA
angewendet werden. Als Posttest wurde der Dunnettest zum Vergleich der Gruppen gegen
die Kontrollgruppe bzw. der Bonferronis Multiple Comparison Test zum Vergleich aller
Gruppen benutzt. Lag keine Normalverteilung vor oder waren die Varianzen inhomogen,
so wurde der Wilcoxon-Test angewendet. Zum Vergleich der mRNA-Werte wurde der
Bootstrap-Test mit 1 000 000 Replikationen und einem Konfidenzintervall von 95 %
verwendet.
Für die Korrelationsanalysen wurde der Pearson-Test einseitig mit einem
Konfidenzintervall von 95 % im GraphPad Prism-Programm angewendet.
Der Unterschied wird als statistisch signifikant angegeben, wenn die Nullhypothese mit
einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 5 % verworfen werden kann. Das Signifikanzniveau
ist p < 0,05.
Ergebnisse
26
3. Ergebnisse
3.1 Körpergewicht
Das Körpergewicht der SH-Ratten der verschiedenen Gruppen unterschied sich zu Beginn
der Versuche nicht (Abb. 5). Es betrug 261,1 ± 17,6 g.
0 2 6 16200
225
250
275
300
325
Candesartandosis (mg/kg/d)
Kör
perg
ewic
ht (
g)
Abb. 5: Körpergewicht am 1. Tag; MW ± SEM, n = 15, es bestehen keine signifikanten
Unterschiede zwischen den Gruppen, die mit 0; 2; 6; 16 mg Candesartan/
kg Körpergewicht/ Tag behandelt wurden.
Im Verlauf des Versuches nahmen die Ratten, die mit 16 mg Candesartan pro
kg Körpergewicht täglich behandelt wurden, deutlich weniger zu als die Ratten mit den
Dosierungen von 0; 2; 6 mg/kg/d (Abb. 6). Die Gewichtszunahme der Tiere mit der
Medikation von 2 und 6 mg/kg/d Candesartan lag tendenziell, aber nicht signifikant, über
dem der Ratten der Kontrollgruppe. Am 21. Tag wurde den Nagern unter Narkose ein
Katheter in die Femoralarterie eingesetzt. Nach diesem Ereignis verloren alle Ratten an
Gewicht, die Unterschiede zwischen den Gruppen blieben erhalten. Die Tiere mit der
Medikation von 16 mg/kg/d verloren nach dem Eingriff am stärksten an Körpergewicht
und wogen, anders als die Ratten der anderen Gruppen, sogar deutlich weniger als zu
Beginn der Studie.
Ergebnisse
27
0 10 20 30
-20
-10
0
10
20
30
0 2 6 16Candesartan (mg/kg/d):
Zeit (Tage)
Gew
icht
(∆ g
)
Abb. 6: Entwicklung des Körpergewichts von SH-Ratten unter der Gabe von 0; 2; 6;
16 mg Candesartan/ kg Körpergewicht/ Tag, am 21. Tag wurden die Tiere operiert und ein
Katheter in die Femoralarterie eingesetzt; MW ± SEM, n = 15.
Am Tag 21 war das Körpergewicht der Ratten mit 16 mg/kg/d Candesartan-Behandlung
signifikant niedriger (268,5 ± 16,5 g) gegenüber der Kontrollgruppe mit der Behandlung
0 mg/kg/d Candesartan (284,9 ± 15,3 g) (Abb. 7). In der am 21. Tag gemessenen
Körperlänge zeigten sich keine Unterschiede zwischen den Gruppen (0,211 ± 0,006 m)
(Abb. 8), so dass der Body-Mass-Index (Körpergewicht/ Körperlänge2) bei den Tieren mit
16 mg/kg/d Candesartan im Vergleich zur Gruppe mit 0 mg/kg/d Candesartan ebenfalls
signifikant verringert war (Abb. 9).
Ergebnisse
28
0 2 6 16200
225
250
275
300
325
*
Candesartandosis (mg/kg/d)
Kör
perg
ewic
ht (
g)
Abb. 7: Körpergewicht am 21. Behandlungstag mit Candesartan (0; 2; 6; 16 mg/kg/d),
MW ± SEM, n = 15, *: p < 0,05 vs. 0 mg/kg/d Candesartan.
0 2 6 160.10
0.15
0.20
Candesartandosis (mg/kg/d)
Kör
perl
änge
(m
)
Abb. 8: Körperlänge am 21. Behandlungstag mit Candesartan (0; 2; 6; 16 mg/kg/d),
MW ± SEM, n = 15, keine signifikanten Unterschiede.
0 2 6 164
5
6
7
*
Candesartandosis (mg/kg/d)
BM
I (k
g/m
2 )
Abb. 9: Body-Mass-Index (BMI) am 21. Behandlungstag mit Candesartan (0; 2; 6;
16 mg/kg/d), MW ± SEM, n = 15, *: p < 0,05 vs. 0 mg/kg/d Candesartan.
Ergebnisse
29
Am 20. Tag wurde die Futteraufnahme über 24 h gemessen. In Übereinstimmung mit der
eingeschränkten Gewichtszunahme nahm die 16 mg/kg/d Candesartan-Gruppe signifikant
weniger Futter zu sich (16,0 ± 2,8 g) als die Kontrollgruppe (19,6 ± 2,0 g) (Abb. 10). Bei
den Ratten mit 6 mg/kg/d Candesartan war die Futteraufnahme dagegen deutlich auf
21,3 ± 1,4 g erhöht, diese Tiere hatten ein tendenziell aber nicht signifikant höheres
Körpergewicht als die Ratten mit 0 mg/kg/d Candesartan.
0 2 6 16
12
15
18
21
*
*
Candesartandosis (mg/kg/d)
Fut
tera
ufna
hme
(g/2
4 h)
Abb. 10: Futteraufnahme über 24 h am 20. Behandlungstag mit Candesartan (0; 2; 6;
16 mg/kg/d), MW ± SEM, n = 15, *: p < 0,05 vs. 0 mg/kg/d Candesartan.
Ergebnisse
30
3.2 Hämodynamik und Parameter des Renin-Angiotensin-Systems
Um die Effektivität der Candesartanbehandlung zu prüfen, wurden am 22. Tag bei allen
Tieren mittels Femoralarterienkatheter der mittlere arterielle Blutdruck (MAP) und die
Herzfrequenz (HF) gemessen. Der MAP ist bei spontan hypertensiven Ratten erhöht, wie
bei der Kontrollgruppe zu beobachten war (164,7 ± 7,04 mmHg). Durch die Behandlung
mit Candesartan sank der Blutdruck stark ab, wobei die Unterschiede zwischen allen
Gruppen jeweils signifikant waren (Abb. 11). Bei den Tieren, die Candesartan in der
Konzentration von 16 mg/kg/d bekamen, lag der MAP schließlich im Normbereich bei
81,1 ± 13,3 mmHg und war damit im Vergleich zur Kontrollgruppe auf die Hälfte
verringert. Die Herzfrequenz zeigte in den Gruppen mit 0; 2 und 6 mg/kg/d Candesartan
keine Unterschiede, bei den Ratten mit 16 mg/kg/d Candesartan dagegen war sie
signifikant niedriger (Abb. 12). Sie war von 382,1 ± 27,1 /min (0 mg/kg/d Candesartan)
auf 349,3 ± 21,7 /min (16 mg/kg/d Candesartan) abgesunken.
Abb. 11: Mittlerer Arterieller Blutdruck (MAP) am 22. Behandlungstag mit Candesartan
(0; 2; 6; 16 mg/kg/d), MW ± SEM, n = 15, *: p < 0,05 vs. 0 mg/kg/d Candesartan,
†: p < 0,05 vs. 2 mg/kg/d Candesartan, ‡: p < 0,05 vs. 6 mg/kg/d Candesartan.
0 2 6 160
100
200
** †
* † ‡
Candesartandosis (mg/kg/d)
MA
P (
mm
Hg)
Ergebnisse
31
0 2 6 16300
350
400
*
Candesartandosis (mg/kg/d)
HF
(n/
min
)
Abb. 12: Herzfrequenz (HF) am 22. Behandlungstag mit Candesartan (0; 2; 6;
16 mg/kg/d), MW ± SEM, n = 15, *: p < 0,05 vs. 0 mg/kg/d Candesartan.
Mit dem Blutdruck und in Abhängigkeit zur Candesartandosis war auch das Gewicht des
linken Ventrikels verringert, das am Schlachttag bestimmt wurde. Die Unterschiede im
linksventrikulären Gewicht zwischen allen Gruppen und die Korrelation zwischen MAP
und linksventrikulären Gewicht waren signifikant (Abb. 13).
0 2 6 16
400
600
800
1000
**
* † ‡
†
A
Candesartandosis (mg/kg/d)
Link
sven
trik
ulär
es G
ewic
ht (
mg)
60 80 100 120 140 160 180
400
500
600
700
800
900
0616
Candesartandosis (mg/kg/d)
r=0.99, p<0.05
2
B
MAP (mmHg)
Link
sven
trik
ulär
es G
ewic
ht (
mg)
Abb. 13:
A: Linksventrikuläres Gewicht am 30. Behandlungstag mit Candesartan (0; 2; 6;
16 mg/kg/d), MW ± SEM, n = 15, *: p < 0,05 vs. 0 mg/kg/d Candesartan, †: p < 0,05 vs.
2 mg/kg/d Candesartan, ‡: p < 0,05 vs. 6 mg/kg/d Candesartan.
B: Korrelation zwischen Mittlerem Arteriellen Blutdruck (MAP) und Linksventrikulärem
Gewicht, MW ± SEM, n = 15.
Ergebnisse
32
Auf endokriner Ebene war die effektive AT1-Blockade erkennbar an einer starken
Erhöhung der Plasmakonzentrationen von Angiotensin II (ANG II) und Aldosteron. Das
zirkulierende ANG II war unter der Behandlung mit Candesartan von dem Ausgangswert
41,3 ± 30,5 pmol/l um mehr als das Fünffache angestiegen (225,2 ± 49,7 pmol/l bei
16 mg/kg/d Candesartan) (Abb. 14). Die Unterschiede aller Gruppen im Vergleich zur
Kontrolle waren hier signifikant. Die Aldosteronkonzentration war erst bei den größeren
Candesartangaben von 6 und 16 mg/kg/d (Abb. 15) erhöht und der Anstieg hier ebenfalls
signifikant.
0 2 6 160
50
100
150
200
250
*
*
*
Candesartandosis (mg/kg/d)
Ang
iote
nsin
II
(pm
ol/l)
Abb. 14: Plasma-Angiotensin II Konzentration nach Candesartanbehandlung (0; 2; 6;
16 mg/kg/d), MW ± SEM, n = 15, *: p < 0,05 vs. 0 mg/kg/d Candesartan.
0 2 6 160
50
100
150
200
250 * *
Candesartandosis (mg/kg/d)
Ald
oste
ron
(pg/
ml)
Abb. 15: Plasma-Aldosteron-Konzentration nach Candesartanbehandlung (0; 2; 6;
16 mg/kg/d), MW ± SEM, n = 15, *: p < 0,05 vs. 0 mg/kg/d Candesartan.
Ergebnisse
33
Die AT1A- und AT1B-Rezeptor-„mRNA-steady-state“-Konzentrationen im Hypothalamus
veränderten sich unter der Candesartan-Behandlung nicht. Auffällig war, dass im
Hypothalamus die AT1A-Rezeptor-Level deutlich höher als die AT1B-Rezeptor-Level
waren (Tabelle 3).
Tabelle 3: „mRNA-steady-state“-Konzentrationen der AT1A - und AT1B -Rezeptoren im
Hypothalamus in Relation zu GAPDH bei Candesartan-behandelten Ratten (0; 2; 6;
16 mg/kg/d).
Candesartan 0 mg/kg/d 2 mg/kg/d 6 mg/kg/d 16 mg/kg/d
AT1A 1,79 * 106
± 2,7 * 105
1,89 * 106
± 3,2 * 105
1,63 * 106
± 3,4 * 105
1,94 * 106
± 3,0 * 105
AT1B 3,88 * 104
± 2,6 * 103
3,40 * 104
± 4,4 * 103
3,37 * 104
± 5,4 * 103
3,52 * 104
± 4,6 * 103
Ergebnisse
34
3.3 Zirkulierende metabolische und endokrinologische Parameter
Die Behandlung mit Candesartan in unterschiedlichen Dosen führte bei den Ratten nicht zu
einer signifikanten Änderung des Leptins im Vergleich zur Kontrolle (2,08 ± 0,7 ng/ml).
Tendenziell war die Plasmakonzentration mit steigender Candesartanbehandlung bis zu
einer Dosis von 6 mg/kg/d erhöht. Bei den Tieren, die 16 mg/kg/d Candesartan bekamen,
war die Leptinmenge im Plasma dann auf einen Wert unterhalb der Kontrollgruppe
abgefallen (Abb. 16). Der Unterschied zwischen den Gruppen mit den Behandlungen 6 und
16 mg/kg/d Candesartan war signifikant. Im Fettgewebe war dieser Trend nicht so deutlich.
Der Leptingehalt lag dort bei (5,52 ± 1,8 ng/ml) und änderte sich bei den verschiedenen
Gruppen nicht (Abb. 17).
0 2 6 160
1
2
3
‡
Candesartandosis (mg/kg/d)
Lept
in P
lasm
a (n
g/m
l)
Abb. 16: Leptin im Plasma nach Candesartanbehandlung (0; 2; 6; 16 mg/kg/d),
MW ± SEM, n = 15, ‡: p < 0,05 vs. 6 mg/kg/d Candesartan.
0 2 6 160
1
2
3
4
5
6
7
Candesartandosis (mg/kg/d)
Lept
in F
ettg
eweb
e (n
g/m
l)
Abb. 17: Leptin im Fettgewebe nach Candesartanbehandlung (0; 2; 6; 16 mg/kg/d),
MW ± SEM, n = 15.
Ergebnisse
35
Die Korrelation von Leptin im Plasma zum Körpergewicht war in allen Gruppen
signifikant. Interessanterweise war sie bei den Tieren bis zu einer Candesartandosis von
6 mg/kg/d positiv, während bei den Ratten mit der höheren Dosierung eine inverse
Korrelation beobachtet werden konnte (Abb.18; Tabelle 4). Die Tiere mit dem niedrigsten
Körpergewicht hatten also eine im Vergleich hohe Leptinkonzentration im Plasma.
200 225 250 275 300 325 3500
1
2
3
4 0
2
6
16
0
2
6
16
Candesartan(mg/kg/d)
Körpergewicht (g)
Lept
in P
lasm
a (n
g/m
l)
Abb. 18: Korrelation zwischen Plasma-Leptin und Körpergewicht in Abhängigkeit der
Candesartandosis, statistische Auswertung siehe Tabelle 4.
Tabelle 4: Statistische Parameter zur Korrelation zwischen Plasma-Leptin und
Körpergewicht.
Candesartan Pearson r P-Wert Korrelation
0 mg/kg/d 0,5450 0,0178 *
2 mg/kg/d 0,5704 0,0132 *
6 mg/kg/d 0,5925 0,0100 *
16 mg/kg/d -0,6224 0,0087 *
Ergebnisse
36
Außerdem korrelierten nach Behandlung mit 16 mg/kg/d Candesartan die Plasma-
Leptinkonzentrationen invers zur Herzfrequenz (Abb. 19).
300 325 350 375 4000
1
2
3
Herzfrequenz (n/min)
Lept
in (
ng/m
l)
Abb. 19: Korrelation zwischen Plasma-Leptinkonzentration und Herzfrequenz nach
Behandlung mit 16 mg/kg/d Candesartan, Pearson r = -0,7309, p-Wert der
Korrelation = 0,0015.
Die Konzentration von Adiponectin im Plasma änderte sich durch die Gabe von
Candesartan nicht, die Menge des zirkulierenden Hormons betrug 2,787 ± 0,651 ng/ml
(Abb. 20). Die Korrelationsanalyse zwischen Adiponectin und dem Körpergewicht
erbrachte dagegen in allen Gruppen einen signifikanten inversen Zusammenhang zwischen
beiden Parametern (Abb. 21, Tabelle 5). Die Plasma-Adiponectin-Konzentration war mit
Zunahme des Körpergewichts verringert.
0 2 6 160
1
2
3
4
Candesartandosis (mg/kg/d)
Adi
pone
ctin
(ng
/ml)
Abb. 20: Adiponectin im Plasma nach Candesartanbehandlung (0; 2; 6; 16 mg/kg/d),
MW ± SEM, n = 15, keine signifikanten Unterschiede.
Ergebnisse
37
250 275 300 325
1
2
3
4
5 0
2
6
16
0
2
6
16
Candesartan(mg/kg/d)
Körpergewicht (g)
Adi
pone
ctin
(ng
/ml)
Abb. 21: Korrelation zwischen Plasma-Adiponectin und Körpergewicht nach
Candesartanbehandlung (0; 2; 6; 16 mg/kg/d), statistische Auswertung siehe Tabelle 5.
Tabelle 5: Statistische Parameter zur Korrelation zwischen Adiponectin und
Körpergewicht.
Candesartan Pearson r p-Wert Korrelation
0 mg/kg/d -0,4902 0,0315 *
2 mg/kg/d -0,6806 0,0026 *
6 mg/kg/d -0,7111 0,0021 *
16 mg/kg/d -0,8110 0,0004 *
Ergebnisse
38
Die weiterhin bestimmten zirkulierenden Parameter Insulin, Glukose, Corticosteron und
Interleukin 6 zeigten bei den SH-Ratten keine Veränderungen durch die
Candesartanbehandlung in verschiedenen Dosen. Die genauen Werte sind der Tabelle 6 zu
entnehmen.
Tabelle 6: Konzentration von Insulin, Glukose, Corticosteron und Interleukin 6 im Plasma
nach Candesartanbehandlung (0; 2; 6; 16 mg/kg/d), MW ± SEM, n = 15.
Candesartan 0 mg/kg/d 2 mg/kg/d 6 mg/kg/d 16 mg/kg/d
Insulin
(ng/ml)
2,88 ± 0,90 3,62 ± 1,99 2,73 ± 1,05 2,59 ± 2,00
Glukose
(mg/dl)
86,53 ± 12,09 87,80 ± 7,53 84,43 ± 6,70 89,53 ± 11,39
Corticosteron
(ng/ml)
137,9 ± 87,7 164,6 ± 101,8 162,4 ± 100,2 178,7 ± 124,9
Interleukin 6
(pg/ml)
416,8 ± 193,9 430,3 ± 186,2 333,7 ± 220,8 351,7 ± 172,4
Ergebnisse
39
3.4 Neuropeptide im Hypothalamus
Bei den Ratten, die mit Candesartan der Konzentration 16 mg/kg/d behandelt wurden,
halbierten sich die „mRNA-steady-state“-Konzentrationen des orexigenen Peptids MCH
im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant um mehr als die Hälfte (2,33 * 108 ±
7,91 * 107 bei 0 mg/kg/d Candesartan; 1,13 * 108 ± 7,89 * 107 bei 16 mg/kg/d
Candesartan). Bei geringeren Candesartandosen war eine leichte aber nicht signifikante
Verringerung der Expression zu beobachten (Abb. 22). Die Korrelationsanalyse der Werte
zum Körpergewicht der Ratten ergab bei den Tieren mit der Behandlung von 16 mg/kg/d
Candesartan eine positive Korrelation (Tabelle 7).
0 2 6 160
1.0×108
2.0×108
3.0×108
*
Candesartandosis (mg/kg/d)
MC
H/G
AP
DH
Abb. 22: „mRNA-steady-state“-Konzentration von MCH im Hypothalamus nach
Candesartanbehandlung (0; 2; 6; 16 mg/kg/d), MW ± SEM, n = 10, *: p < 0,05 vs.
0 mg/kg/d Candesartan.
Tabelle 7: Statistische Parameter zur Korrelation zwischen hypothalamischen
mRNA-Level von MCH und Körpergewicht.
Candesartan Pearson r p-Wert Korrelation
0 mg/kg/d -0,2906 0,2076
2 mg/kg/d -0,3535 0,1582
6 mg/kg/d 0,04615 0,4496
16 mg/kg/d 0,5596 0,0463 *
Ergebnisse
40
Bei der Bestimmung von Orexin-mRNA ergab sich ein ähnliches Bild. Auch hier waren
die „mRNA-steady-state“-Konzentrationen bei einer Behandlung mit Candesartan von
16 mg/kg/d signifikant um mehr als 50% reduziert (418072 ± 237573 bei 0 mg/kg/d
Candesartan; 159607 ± 108168 bei 16 mg/kg/d Candesartan) (Abb. 23). Im Gegensatz zu
MCH korrelierten die Werte hier nicht mit dem Körpergewicht der Ratten (Tabelle 8).
0 2 6 160
2.0×105
4.0×105
6.0×105
*
Candesartandosis
Ore
xin/
GA
PD
H
Abb. 23: „mRNA-steady-state“-Konzentration von Orexin im Hypothalamus nach
Candesartanbehandlung (0; 2; 6; 16 mg/kg/d), MW ± SEM, n = 10, *: p < 0,05 vs.
0 mg/kg/d Candesartan.
Tabelle 8: Statistische Parameter zur Korrelation zwischen hypothalamischem mRNA-
Level von Orexin und Körpergewicht.
Candesartan Pearson r p-Wert Korrelation
0 mg/kg/d -0,5292 0,0579
2 mg/kg/d -0,1892 0,3003
6 mg/kg/d 0,1185 0,3722
16 mg/kg/d 0,2463 0,2464
Ergebnisse
41
Das dritte Neuropeptid, das bei der Behandlung mit 16 mg/kg/d Candesartan wie die
orexigenen Parameter MCH und Orexin signifikant verändert war, ist das anorexigen
wirkende Peptid CART. Der relative CART-Wert von 1667300 ± 454986 (0 mg/kg/d
Candesartan) war auf 1239800 ± 315889 (16 mg/kg/d) abgesunken (Abb. 24). In den
anderen Gruppen war kein Unterschied zu beobachten. In der Korrelation zum
Körpergewicht waren die Gruppen von 6 und 16 mg/kg/d Candesartan signifikant. Bei der
Medikamentendosis von 6 mg/kg/d Candesartan korrelierten die Werte positiv, bei der
Dosis von 16 mg/kg/d Candesartan dagegen negativ (Tabelle 9).
0 2 6 160
1.0×106
2.0×106
*
Candesartandosis (mg/kg/d)
CA
RT
/GA
PD
H
Abb. 24: „mRNA-steady-state“-Konzentration von CART im Hypothalamus nach
Candesartanbehandlung (0; 2; 6; 16 mg/kg/d), MW ± SEM, n = 10, *: p < 0,05 vs.
0 mg/kg/d Candesartan.
Tabelle 9: Statistische Parameter zur Korrelation zwischen hypothalamischem mRNA-
Level von CART und Körpergewicht.
Candesartan Pearson r p-Wert Korrelation
0 mg/kg/d 0,2802 0,2165
2 mg/kg/d -0,1230 0,3675
6 mg/kg/d 0,7539 0,0059 *
16 mg/kg/d -0,7260 0,0087 *
Ergebnisse
42
Nicht in der Gruppe von 16 mg/kg/d Candesartan, sondern bei der geringeren Dosis von
6 mg/kg/d, waren sowohl das orexigene NPY (Abb. 25) als auch das anorexigene Peptid
POMC (Abb. 26) signifikant verändert. Bei beiden Parametern war der bestimmte Wert im
Gegensatz zur Kontrollgruppe zunächst bis zu einer Konzentration von 6 mg/kg/d
abgesunken und bei der höchsten Dosierung wieder angestiegen.
0 2 6 160
2.0×107
4.0×107
6.0×107
*
Candesartandosis (mg/kg/d)
NP
Y/G
AP
DH
Abb. 25: „mRNA-steady-state“-Konzentration von NPY im Hypothalamus nach
Candesartanbehandlung (0; 2; 6; 16 mg/kg/d), MW ± SEM, n = 10, *: p < 0,05 vs.
0 mg/kg/d Candesartan.
0 2 6 160
2.0×107
4.0×107
6.0×107
8.0×107
*
Candesartandosis (mg/kg/d)
PO
MC
/GA
PD
H
Abb. 26: „mRNA-steady-state“-Konzentration von POMC im Hypothalamus nach
Candesartanbehandlung (0; 2; 6; 16 mg/kg/d), MW ± SEM, n = 10, *: p < 0,05 vs.
0 mg/kg/d Candesartan.
Ergebnisse
43
Die „mRNA-steady-state“-Konzentrationen der weiterhin bestimmten Peptide AgRP und
CRH blieben trotz Behandlung mit Candesartan unverändert (Abb. 27).
0 2 6 160
1.0×107
2.0×107
A
Candesartandosis (mg/kg/d)
AgR
P/G
AP
DH
0 2 6 160
1.0×106
2.0×106
B
Candesartandosis (mg/kg/d)
CR
H/G
AP
DH
Abb. 27:
A: „mRNA-steady-state“-Konzentration von AgRP im Hypothalamus nach
Candesartanbehandlung (0; 2; 6; 16 mg/kg/d), MW ± SEM, n = 10.
B: „mRNA-steady-state“-Konzentration von CRH im Hypothalamus nach
Candesartanbehandlung (0; 2; 6; 16 mg/kg/d), MW ± SEM, n = 10.
Diskussion
44
4. Diskussion
Die durchgeführten Versuche hatten zum Ziel, den Zusammenhang zwischen
AT1-Rezeptor-Blockade und Gewichtsverlust zu untersuchen und unter
Candesartanbehandlung auftretende Änderungen von peripheren Hormonen und
hypothalamischen Peptiden mit Einfluss auf die Regulation des Körpergewichts zu
bestimmen.
Das wichtigste Ergebnis dieser Arbeit sind die verringerten „mRNA-steady-state“-
Konzentrationen der orexigenen Neuropeptide MCH und Orexin im Hypothalamus unter
hohen Candesartandosen (16 mg/kg/d). Die Ratten mit dieser Behandlung wiesen ebenfalls
ein niedrigeres Körpergewicht und eine geringere Futteraufnahme als die Kontrollgruppe
auf. Parallel dazu waren auch die Werte des anorexigenen Peptids CART vermindert. Bei
peripheren Hormonen (Leptin, Adiponectin, Insulin, Glukose, Corticosteron, Il 6) konnten
keine Veränderungen festgestellt werden.
In Übereinstimmung mit früheren Studien [Raasch et al., 2004] zeigte sich die Effektivität
der AT1-Rezeptor-Blockade durch Candesartan in einer deutlichen Senkung des mittleren
arteriellen Blutdrucks (MAP) und des linksventrikulären Gewichts in Abhängigkeit von
der verabreichten Dosis. Die Herzfrequenz dagegen blieb bei mittleren Dosen Candesartan
unverändert, war aber bei 16 mg/kg/d des Medikaments ebenfalls signifikant abgesunken.
Wie schon früher beobachtet [Hubner et al., 1997] waren die Plasma-Angiotensin-II-
Konzentrationen bei selektivem Antagonismus des AT1-Rezeptors angestiegen. Durch
einen negativen „Feedback“ der AT1-Rezeptoren [Kurtz und Wagner, 1999] erhöht sich die
Renin-Sekretion bei andauernder AT1-Blockade und führt zu einer Steigerung der
ANG II-Konzentration. Aldosteron wird normalerweise durch die Stimulation von
AT1-Rezeptoren freigesetzt [Lumbers, 1999]. Die Erhöhung des Aldosteron im Plasma
trotz Behandlung mit 6 und 16 mg/kg/d Candesartan ging vermutlich auf den
„Aldo-Escape“ zurück. Bei längerer Blockierung der AT1-Rezeptoren werden die
AT2-Rezeptoren durch das gestiegene ANG II aktiviert und führen zu der Steigung der
Aldosteronkonzentrationen [Hubner et al., 1997; Naruse et al., 2002].
Die Behandlung mit Candesartan führte, wie auch in anderen Arbeiten [Nishimura et al.,
2000], nicht zu einer Änderung der zentralen AT1A- und AT1B-Rezeptor-mRNA-Menge.
Diskussion
45
Die Gewichtszunahme der spontan hypertensiven Ratten war unter der hohen Dosis
Candesartan von 16 mg/kg/d deutlich vermindert. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit
früheren Arbeiten, die Gewichtsverlust unter der Therapie von ACE-Hemmern bzw. AT1-
Rezeptor-Antagonisten zeigen [Enalapril in Hypertension Study Group (UK), 1984;
McGrath et al., 1990; Campbell et al., 1995; Benson et al., 2004; Fogari et al., 2005; Zorad
et al., 2006]. Auch Tiermodelle mit entsprechenden genetischen Veränderungen
entwickeln ein niedrigeres Körpergewicht als Kontrollgruppen. Hier sind die ASrAogen-
Ratten zu nennen, die eine geringere gliale Expression von Angiotensinogen aufweisen
[Schinke et al., 1999; Kasper et al., 2005] bzw. Mäuse mit systemischen
Angiotensinogenmangel [Massiera et al., 2001]. Ebenso haben Mäuse, denen durch
genetische Manipulation die AT1A- und AT1B-Rezeptoren fehlen, ein erniedrigtes Gewicht
[Tsuchida et al., 1998].
Interessanterweise war das Gewicht der Ratten in dieser Studie bis zu einer
Candesartandosis von 6 mg/kg/d tendenziell erhöht, wenn auch nicht signifikant, und dann
bei der höchsten Medikamentendosierung abgefallen. Da die Körperlänge vergleichbar
blieb, änderte sich der BMI parallel zum Körpergewicht. Die Futteraufnahme war bei den
Ratten mit einer Candesartanbehandlung von 6 mg/kg/d im Gegensatz zur Kontrollgruppe
deutlich gesteigert, die Tiere mit 16 mg/kg/d Candesartan nahmen dagegen signifikant
weniger Nahrung als die Kontrolltiere zu sich.
Die Ratten, die unter der Behandlung von 16 mg/kg/d Candesartan weniger an Gewicht
zunahmen als die Tiere mit einer geringeren Medikamentendosis, zeigten im Vergleich zur
Kontrollgruppe keine signifikanten Unterschiede bei den peripheren Hormonen und
Adipozytokinen Leptin, Insulin, Adiponectin, Corticosteron und Interleukin-6. Dies ist
überraschend, da diese Hormone bekanntermaßen in der Regulation des Körpergewichts
eine wichtige Rolle spielen [Richard und Baraboi, 2004; Guerre-Millo, 2004; Tomas et al.,
2004].
Lediglich die Leptinkonzentrationen wiesen leichte Veränderungen auf, sie waren wie das
Körpergewicht bis zu einer Gabe von 6 mg/kg/d Candesartan angestiegen und dann bei der
höchsten Candesartandosierung im Vergleich zur Kontrollgruppe erniedrigt. Signifikant
war jedoch nur der Unterschied zwischen 6 mg/kg/d und 16 mg/kg/d Candesartan. Auch in
der Literatur finden sich Versuche, in denen Interventionen in das RAS mit
Gewichtsverlust bei unveränderten zirkulierenden Leptinkonzentrationen einhergehen. So
zeigen beispielsweise zentral Angiotensinogen-defiziente Mäuse, die wie SHR unter
Diskussion
46
AT1-Blockade eine leichte Hypotension und vermindertes linksventrikuläres Gewicht
entwickeln [Tamura et al., 1998; Umemura et al., 1998], ein erniedrigtes Körpergewicht
und unverändertes zirkulierendes Leptin [Massiera et al., 2001; Kim et al., 2002a]. In einer
neuen Studie dagegen zeigen sich erniedrigte Leptin- und erhöhte
Adiponectinkonzentrationen durch die Behandlung von 10 mg/kg/d Candesartan-Cilexetil
[Zorad et al., 2006]. Der wesentliche Unterschied zu unserem Versuchsaufbau ist die lange
Behandlungsdauer von 18 Wochen. Dadurch ist die Vergleichbarkeit zu unseren nach vier
Wochen gemessenen Werten eingeschränkt. Ebenso ist das Plasmaleptin bei hypertensiven,
adipösen Patienten unter der Einnahme des AT1-Rezeptor-Antagonisten Valsartan
erniedrigt [Fogari et al., 2005]. Bei diesen Patienten vermindert sich gleichzeitig das
Körpergewicht, auch wenn sie keinerlei diätetischen Maßnahmen unterliegen. Dieses
Ergebnis ist allerdings nicht direkt mit unserer Studie bzw. den transgenen Tieren zu
vergleichen, da die übergewichtigen Patienten vermutlich von vornherein eine Leptin-
Resistenz aufwiesen.
Auch wenn der Unterschied nicht signifikant war, konnte in dieser Arbeit doch
insgesamt eine leichte Verminderung des Plasma-Leptins bei der höchsten
Candesartankonzentration beobachtet werden. Dies steht wiederum im Einklang mit den
eben zitierten Studien. Dieser Effekt ist vermutlich auf eine Reduzierung des Fettgewebes
zurückzuführen, da das Serum-Leptin proportional zu der Körperfettmasse zirkuliert [Fried
et al., 2000]. Der erniedrigte BMI in der Gruppe mit 16 mg/kg/d Candesartan lässt auf
verringerte Fettreserven schließen, die zu den geringeren Leptin-Werten geführt haben
könnten. Das Auftreten von hypotrophen Fettzellen und erniedrigten zirkulierenden
Leptinkonzentrationen bei AT1-Inhibition wurde kürzlich in der Langzeitstudie von Zorad
et al. nachgewiesen [Zorad et al., 2006]. Eine andere Möglichkeit wäre eine Änderung der
Leptin-Sekretion der Fettzellen, die in diesem Versuchsaufbau allerdings nicht gemessen
wurde. Die Leptinkonzentrationen im Fettgewebe waren jedoch gleichbleibend, was nicht
auf eine veränderte Sekretionsleistung hinweist.
Da die Tiere freien Zugang zum Futter hatten, müsste die niedrige Leptinkonzentration im
Plasma zu einer kompensatorisch gesteigerten Nahrungsaufnahme geführt haben, um den
Gewichtsverlust auszugleichen (Abb. 28). Tatsächlich war das anorexigene Peptid CART
im Hypothalamus unter der Medikamentengabe von 16 mg/kg/d ebenfalls erniedrigt.
CART verringert die Nahrungsaufnahme und führt damit zu einer Reduzierung des
Körpergewichts [Kristensen et al., 1998; Vrang et al., 1999; Larsen et al., 2000].
Diskussion
47
CART-defiziente Mäuse entwickeln dagegen bei hochkalorischer Diät Übergewicht
[Asnicar et al., 2001]. Allerdings korrelierten die mRNA-Konzentrationen von CART mit
dem Körpergewicht invers.
Fettgewebe
Leptin im Plasma
Nahrungs-aufnahme
Körpergewicht
AT1-Blockade
�
�
CART�
�
HA
Abb. 28: Schematische Darstellung des peripheren/ hypothalamischen Regelkreises zur
Körpergewichtsregulation
HA: Hypothalamus, CART: Cocain-Amphetamin-Reguliertes-Transkript,
�: Erniedrigung, � : Erhöhung
Der deutliche Gewichtsunterschied der Ratten unter der Behandlung mit Candesartan in
hohen Dosierungen weist auf eine komplexe Regulierung der Nahrungsaufnahme und des
Körpergewichts in Abhängigkeit der AT1-Blockade hin. Die Bedeutung von Leptin und
Adiponectin für die Gewichtsregulation lässt sich an der signifikanten Korrelation mit dem
Körpergewicht ermessen. Adiponectin korreliert in allen Gruppen invers zum Gewicht. Die
Leptin-Werte der Tiere mit 0, 2, 6 mg/kg/d Candesartan korrelieren positiv mit dem
Körpergewicht, in der Gruppe mit 16 mg/kg/d Candesartan kehrt sich die Korrelation ins
Negative. Betrachtet man die Abb. 18 (Seite 35), so fällt auf, dass aus der Gruppe
16 mg/kg/d Candesartan gerade die Tiere mit niedrigem Körpergewicht hohe Leptinwerte
aufweisen und damit zu der negativen Korrelation führen. Würde man diese aus der
Korrelationsanalyse nehmen, so wäre die Korrelation in dieser Gruppe wie bei den anderen
Ratten positiv. Wegen der kleinen Fallzahl käme hier dann jedoch kein statistisch
signifikantes Ergebnis zustande. Obwohl zwischen den einzelnen Tiergruppen keine
Diskussion
48
signifikanten Änderungen der Leptinkonzentrationen zu beobachten waren, stellt sich die
Frage, ob sich bei den SH-Ratten unter der hohen Candesartan-Dosierung eventuell
vorhandene gegensätzliche Effekte aufgehoben haben. Bei den besonders schlanken Tieren
war das Leptin eher hoch, während die Ratten aus der gleichen Gruppe, die etwas mehr
Gewicht zugenommen hatten, die niedrigsten Leptinkonzentrationen aufwiesen.
Die hohen Leptinkonzentrationen bei den dünnen Tieren mit der höchsten
Medikamentendosierung lassen auf eine weitere andere Beteiligung von
gewichtsregulierenden Peptiden im Hypothalamus schließen. Tatsächlich zeigten sich im
Gegensatz zu den unveränderten peripher bestimmten Hormonen bei den untersuchten
Neuropeptiden deutliche Effekte. Die mRNA-Werte von MCH im Hypothalamus waren
mit zunehmender Medikamentendosis verringert und bei den Ratten mit 16 mg/kg/d
Candesartan gegenüber der Kontrollgruppe deutlich reduziert.
MCH ist ein wichtiger Regulator des Körpergewichts, insbesondere der
Nahrungsaufnahme. MCH-defiziente bzw. MCH-Rezeptor-defiziente Mäuse nehmen
weniger Futter auf, haben damit ein verringertes Körpergewicht und erniedrigte Leptin-
Werte [Shimada et al., 1998; Chen et al., 2002; Segal-Lieberman et al., 2003; Kokkotou et
al., 2005]. Auch bei Verabreichung von MCH-Rezeptor-Antagonisten beobachtet man eine
Verminderung von Futteraufnahme, Körpergewicht und Leptinkonzentrationen [Takekawa
et al., 2002; Shearman et al., 2003; Morens et al., 2005; Kowalski et al., 2006]. Dagegen
führt die Gabe von MCH zu einer Erhöhung von Futteraufnahme, Körpergewicht und
Leptin-Spiegeln [Qu et al., 1996; Ito et al., 2003; Gomori et al., 2003]. Ein ähnliches Bild
zeigt die MCH-Überexpression [Ludwig et al., 2001]. Auch umgekehrt beeinflussen sich
Leptin und MCH. Gibt man Leptin intrazerebroventrikulär, so erniedrigen sich das MCH,
die Futteraufnahme sowie das Körpergewicht [Sahu, 1998a]. Bei erniedrigtem Leptin bzw.
Leptinresistenz erhöhen sich in mehreren Studien die MCH-Werte, die Futteraufnahme
und das Körpergewicht [Tritos et al., 2001; Stricker-Krongrad et al., 2001; Gavrila et al.,
2005].
Neben ihrer Änderung in den verschiedenen Tiergruppen korrelieren die MCH-Werte bei
diesem Versuchsaufbau mit dem Körpergewicht in der Tiergruppe von 16 mg/kg/d
Candesartan positiv. Damit ist ein Einfluss des AT1-Antagonismus auf die
Nahrungsaufnahme durch Modulation des MCH wahrscheinlich. Außerdem könnte die
Senkung der MCH-Konzentrationen im Hypothalamus auf die erhöhten Leptin-Werte der
besonders leichten Ratten zurückzuführen sein (Abb. 29).
Diskussion
49
Fettgewebe
Leptin im Plasma
Nahrungs-aufnahme
Körpergewicht
AT1-Blockade
�
��
MCH�
�
�
HA
�
�CART �
�
Abb. 29: Schematische Darstellung des peripheren/ hypothalamischen Regelkreises zur
Körpergewichtsregulation
HA: Hypothalamus, CART: Cocain-Amphetamin-Reguliertes-Transkript,
MCH: Melanin-Concentrating-Hormon, �: Erniedrigung, � : Erhöhung
Andererseits ist es auch möglich, dass der Effekt der Gewichtsabnahme durch
AT1-Blockade primär zentral vermittelt wird. Die periphere Gabe eines
AT1-Rezeptorblockers inhibiert nicht nur peripher sondern auch zentral AT1-Rezeptoren
[Nishimura et al., 2000; Seltzer et al., 2004]. Die Fähigkeit, die Blut-Hirn-Schranke zu
überwinden, hängt von der verabreichten Dosis, dem Zeitpunkt der Gabe und der
Lipidlöslichkeit der Komponenten ab [Bui et al., 1992; Polidori et al., 1998; Gohlke et al.,
2001; Wang et al., 2003; Seltzer et al., 2004]. Seltzer et al., 2004, zeigten, dass 10 mg/kg/d
Candesartan-Cilexetil die Blut-Hirn-Schranke überwinden und an zentrale Rezeptoren
binden. Somit kann davon ausgegangen werden, dass bei den Ratten mit 16 mg/kg/d
Candesartan ebenfalls die zentralen AT1-Rezeptoren blockiert wurden. In unserem Versuch
gingen die erniedrigten MCH-mRNA-Werte mit verminderter Futteraufnahme,
vermindertem Körpergewicht und gleich bleibenden bzw. leicht reduzierten Leptin-
Plasmakonzentrationen einher. Das leicht verminderte Leptin könnte als Reaktion im Sinne
der Fettreduktion oder als Gegenregulation zur Steigerung des Appetits zu erklären sein.
Die Neuropeptide NPY, AgRP und POMC im Nucleus arcuatus und das CRH im Nucleus
paraventricularis waren bei den Tieren mit Candesartanbehandlung von 16 mg/kg/d nicht
Diskussion
50
verändert, obwohl Leptin Einfluss auf ihre Genexpression und Synthese hat. Auch dies
könnte die Vermutung unterstützen, dass das Leptin nicht die primäre Ursache für den
Gewichtsverlust bei den Tieren ist.
Doch warum sind die Leptinkonzentrationen bei den besonders dünnen Tieren hoch? Der
Einfluss von weiteren Regulationsmechanismen liegt nah. ANG II erhöht die Leptin-
Sekretion von Adipozyten [Kim et al., 2002b; Skurk et al., 2005]. Damit übereinstimmend
waren die Plasma-Konzentrationen von ANG II in unserer Studie insbesondere unter der
Candesartanbehandlung mit 16 mg/kg/d erhöht. Allerdings wird dieser Effekt über die
AT1-Rezeptoren vermittelt [Skurk et al., 2005], die in diesem Versuch effektiv blockiert
waren. Weiterhin könnte die Leptin-Sekretion durch ANG II-Spaltprodukte wie
Angiotensin III und Angiotensin IV stimuliert werden. Diese Metabolite sind nach
Langzeittherapie mit AT1-Antagonisten ebenfalls erhöht [Shibasaki et al., 1999]. Ob die
Freisetzung von Leptin in Adipozyten durch Angiotensin III und IV durch den
AT1-Rezeptor vermittelt ist, wie es für die Sekretion des Plasminogen-Aktivator-Inhibitor
(PAI-1) gezeigt wurde [Skurk et al., 2001], ist bisher nicht geklärt.
Außerdem könnte das sympathische Nervensystem (SNS) in diesem Zusammenhang eine
Rolle spielen, da Leptin vom SNS beeinflusst wird. Die Aktivierung des SNS, die
Stimulation von adrenergen Rezeptoren oder Kälteexposition vermindern Leptin in vitro
und in vivo [Hardie et al., 1996; Donahoo et al., 1997; Pinkney et al., 1998; Ricci und
Fried, 1999; Ricci et al., 2000; Couillard et al., 2002; Ricci et al., 2005]. Ebenso führt
Fasten zu einer Erniedrigung des Leptins, was durch die Aktivierung des SNS erklärt
werden kann [Fried et al., 2000]. Eine Blockade der adrenergen Rezeptoren dagegen führt
zu Erhöhung der Leptin-mRNA im braunen Fettgewebe, der Sekretion von Leptin im
weißen Fettgewebe und der Plasma-Leptinkonzentration bei Ratten und bei kachektischen
Patienten [Evans et al., 1999; Mastronardi et al., 2001; Cammisotto und Bukowiecki, 2002;
Hryniewicz et al., 2003]. Die in dieser Arbeit gemessenen höheren Leptin-Werte bei den
besonders dünnen Tieren mit der Candesartandosierung von 16 mg/kg/d könnten auf eine
Verminderung der sympathischen Aktivität zurückgehen. Als Surrogat-Parameter für
diesen Zusammenhang könnte die Herzfrequenz dienen, die in dieser Rattengruppe invers
zur Leptinkonzentration korreliert (Abb. 13, Seite 31). Eine verminderte Herzfrequenz
unter hohen Candesartandosen wurde ebenfalls bei hypertensiven Patienten beobachtet
[Ghiadoni et al., 2000]. Dieser Effekt könnte zumindest teilweise durch die Hemmung der
sonst durch ANG II induzierten Katecholamin-Freisetzung an präsynaptischen Rezeptoren
Diskussion
51
durch Candesartan entstehen [Dendorfer et al., 2002]. Die Fähigkeit von Candesartan, die
sympathische Aktivität der Muskeln und der Nieren zu vermindern, wurde bereits bei
Ratten und Patienten nachgewiesen [Sakata et al., 2002; Grassi et al., 2003].
Außerdem wäre ein modulierender Einfluss des hypothalamischen Peptids Orexin auf die
Interaktion zwischen dem RAS und dem SNS hinsichtlich des Körpergewichts möglich.
Orexin erhöht intrazerebroventrikulär appliziert die Nahrungsaufnahme, Orexin-
Antikörper und Rezeptor-Antagonisten führen dagegen zu Hypophagie und
Gewichtsverlust [Sakurai et al., 1998; Yamada et al., 2000; Szekely et al., 2002; Haynes et
al., 2002]. Der in unserem Versuch beobachtete Abfall der Orexin-mRNA-Expression im
Hypothalamus bei Tieren, die mit 16 mg/kg/d Candesartan behandelt wurden, stimmt mit
diesen Ergebnissen überein und könnte zu dem Gewichtsverlust dieser Ratten beigetragen
haben. Allerdings korrelierten die Werte des Orexins im Gegensatz zu den bei MCH
gemessenen Werten nicht mit dem Körpergewicht. In der Literatur gibt es in Bezug auf die
Nahrungsregulation von Orexin widersprüchliche Ergebnisse. So ändert sich die Prepro-
Orexin-Expression im Gegensatz zur MCH-Expression als Reaktion auf Fasten nicht
[Tritos et al., 2001]. Orexin-defiziente Mäuse zeigen keine Gewichtsabnahme, sie haben
stattdessen eine Störung des Schlaf-Wach-Rhythmus, die der Narkolepsie ähnelt [Chemelli
et al., 1999]. In einer anderen Studie entwickeln diese Tiere sogar ein erhöhtes
Körpergewicht [Fujiki et al., 2006]. Genetische Ablation von Orexin-Neuronen führt zu
Hypophagie und Übergewicht [Hara et al., 2001] und Patienten mit Narkolepsie und
Orexin-Mangel entwickeln abdominelle Adipositas [Kok et al., 2003]. Zusätzlich zur
Regulation der Nahrungsaufnahme stimuliert Orexin zentral oder spinal verabreicht die
sympathische Aktivität, erhöht die Herzfrequenz sowie den arteriellen Blutdruck [Samson
et al., 1999; Shirasaka et al., 1999; Chen et al., 2000; Antunes et al., 2001; Matsumura et
al., 2001]. Da in diesem Versuch die Expression von Orexin im Hypothalamus vermindert
war, ist es denkbar, dass ein solcher Orexin-abhängiger Mechanismus zur verminderten
Aktivität des SNS und somit zu den gesteigerten zirkulierenden Leptinkonzentrationen
trotz ausgeprägter Gewichtsreduktion beigetragen hat (Abb. 30).
Diskussion
52
Fettgewebe
Leptin im Plasma
Nahrungs-aufnahme
Körpergewicht
AT1-Blockade
�
��
MCH�
�
�
Orexin�
�
HA
SNS
�
AT1
AT1-Blockade�
�
�CART �
Abb. 30: Schematische Darstellung des peripheren/ hypothalamischen Regelkreises zur
Körpergewichtsregulation
HA: Hypothalamus, CART: Cocain-Amphetamin-Reguliertes-Transkript,
MCH: Melanin-Concentrating-Hormon, SNS: Sympathisches Nervensystem,
�: Erniedrigung, � : Erhöhung
Insgesamt erscheint eine Unterteilung der Tiere mit 16 mg/kg/d Candesartan in zwei
Untergruppen nach den unterschiedlichen Leptinkonzentrationen sinnvoll zu sein, da sich
aus den gemessenen Werten in dieser Tierauswahl deutliche Unterschiede ergeben und für
eine Sonderrolle der Ratten mit extrem niedrigem Körpergewicht und höherem Leptin
sprechen. Der Mechanismus der Gegenregulation mit Verringerung des Leptins zur
Stimulation der Nahrungsaufnahme funktioniert vermutlich bei dem Teil der Tiere, bei
denen der Gewichtsunterschied nicht so groß ist. Im Gegensatz dazu scheint er gerade bei
den Ratten, deren Gewichtszunahme in dem Behandlungszeitraum gering war,
unterbrochen zu sein.
Bei den Tieren, die eine Behandlung von 6 mg/kg/d Candesartan bekamen, sieht das Bild
der Neurotransmitter deutlich anders aus als bei den bereits diskutierten Ratten mit
16 mg/kg/d Candesartan. Hier war ein Abfall des anorexigenen Peptides POMC wie auch
des orexigenen Peptids NPY zu beobachten. Die Werte von MCH und Orexin lagen bereits
unter der Kontrollgruppe, waren aber zu dieser nicht signifikant verändert. Die bei der
Diskussion
53
höheren Candesartandosierung aufgetretene Reduzierung von CART war nicht zu messen,
ebenso unverändert stellten sich die AgRP- und die CRH-Expression dar. Auch bei
AT1-Rezeptor-Blockade geringerer Konzentration kam es demnach zu Veränderungen der
Neuropeptide, die mit einer signifikant erhöhten Futteraufnahme aber nur tendenziell
höherem Körpergewicht einhergingen. Die Absenkung der NPY- und POMC-Werte war
bei der höheren Candesartankonzentration nicht mehr zu beobachten. Diese Ergebnisse
könnten mit der dosisabhängigen Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke für die
AT1-Antagonisten zusammenhängen. Wenn die Konzentration von 6 mg/kg/d Candesartan
nicht ausreicht, um das Medikament in ausreichender Konzentration in den Hypothalamus
gelangen zu lassen, müssen die Veränderungen der zentralen Neuropeptid-Expression
sekundär über primäre periphere Effekte ausgelöst sein. Allerdings konnten wir bei den
peripheren Parametern keine Veränderungen messen, lediglich das Leptin war tendenziell
erhöht. Die Neuropeptide des Nucleus arcuatus werden direkt von Leptin reguliert,
während im lateralen Hypothalamus zumindest Orexin vermutlich nur indirekt von Leptin
beeinflusst wird [Tritos et al., 2001]. Jedenfalls führten die hormonellen Veränderungen
trotz erhöhter Futteraufnahme nicht zu einem signifikant erhöhten Körpergewicht.
Aus vorangegangenen Studien war bereits bekannt, dass das Renin-Angiotensin-System
einen Einfluss auf den Metabolismus hat und eine Hemmung dieses Systems zur
Reduzierung des Körpergewichts führt [Enalapril in Hypertension Study Group (UK),
1984; McGrath et al., 1990; Campbell et al., 1995; Massiera et al., 2001; Benson et al.,
2004; Kasper et al., 2005; Fogari et al., 2005; Zorad et al., 2006]. Eine Vielzahl dieser
Arbeiten hat die peripheren Parameter untersucht, die in diesem Zusammenhang verändert
sind. Wenig ist bisher jedoch über zentrale Veränderungen bekannt, insbesondere in den
Zentren des Hypothalamus, die das Körpergewicht regulieren. In dieser Arbeit führte die
effektive AT1-Rezeptor-Blockade mit Candesartan in hoher Dosierung (16 mg/kg/d) bei
SH-Ratten zu einer Verminderung des Körpergewichts bei gleichzeitig erhöhter
Futteraufnahme. Dies ging mit einer deutlichen Reduzierung der MCH-, Orexin- und
CART-„steady-state“-Konzentrationen einher, während NPY, POMC, AgRP und CRH
unverändert blieben. Auch bei den peripheren Hormonen wie Leptin, Insulin, Adiponectin,
Interleukin-6, Corticosteron wurden keine Änderungen gegenüber der Kontrollgruppe
nachgewiesen.
Diskussion
54
In jedem Fall konnte ein Zusammenhang zwischen dem RAS und den Neuropeptiden im
Hypothalamus beobachtet werden. Parallel zur Gabe von AT1-Rezeptor-Antagonisten
änderte sich die Expression der mRNA von einigen dieser metabolischen Faktoren des
Gehirns. Ob dieser Effekt primär peripher oder primär zentral hervorgerufen wird, lässt
sich durch die im Studiendesign vorgesehene Fallzahl und die untersuchten Parameter
nicht klären. Ein primär peripherer Effekt durch das Leptin ist denkbar, weil eine
Untergruppe der Tiere mit 16 mg/kg/d Candesartan, die ein besonders geringes
Körpergewicht aufwiesen, tendenziell höhere Leptinkonzentrationen im Plasma hatten.
Dies könnte zu einem Absinken der MCH-Expression mit parallelem Appetit- und
Gewichtsverlust geführt haben. Auf der anderen Seite spricht für eine primär zentrale
Regulation, dass Candesartan in der Konzentration von 16 mg/kg/d ZNS-gängig ist und die
peripheren Parameter außer einer tendenziellen Erniedrigung von Leptin gleich bleibend
sind. Bei einem primären Effekt von Leptin müssten auch die Neuropeptide des Nucleus
arcuatus verändert und MCH statt erniedrigt wie in anderen Studien hochreguliert sein. Die
mangelnde Gewichtszunahme könnte also auf eine Modulation der MCH-Expression durch
Candesartan zurückgehen. Alternativ bleibt eine Erklärung der Gewichtsreduktion über
einen Effekt des erhöhten ANG II, der nicht AT1-Rezeptor vermittelt ist, oder eine
Wirkung von ANG II-Spaltprodukten. Hier bedarf es weiterer Studien, die die Erforschung
des genauen Zusammenhangs vom RAS und der MCH-Expression im Hypothalamus bzw.
weitere periphere Effekte des RAS zum Ziel haben.
Weiterhin konnte beobachtet werden, dass schon die Dosis von 6 mg/kg/d Candesartan zu
veränderten Neuropeptidkonzentrationen führt. Hier sind NPY und POMC erniedrigt, ein
Effekt, der allerdings keinen messbaren Einfluss auf das Körpergewicht hat. Dieser
Unterschied zu der höheren Candesartankonzentration könnte durch die dosisabhängige
Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke zustande kommen.
Diese Arbeit bestätigt, dass der AT1-Rezeptor-Antagonist Candesartan in den
Metabolismus des Körpers eingreift und neben einer Senkung des Blutdrucks zu einer
verminderten Gewichtszunahme führt. Die Kombination dieser Wirkungen ist bei der
Behandlung des Metabolischen Syndroms, das durch Hypertonie, Insulinresistenz und
Adipositas gekennzeichnet ist, wünschenswert. Um einen Effekt der Gewichtsregulation
hervorzurufen sind allerdings höhere Dosen des Medikaments notwendig.
Zusammenfassung
55
5. Zusammenfassung
Das Metabolische Syndrom ist eine weit verbreitete Krankheit mit steigender Prävalenz,
erhöhtem Mortalitätsrisiko und eingeschränkter Lebensqualität der Patienten. Zahlreiche
Co-Morbiditäten wie zum Beispiel Übergewicht und Hypertonie erschweren die Therapie.
In letzter Zeit mehren sich Hinweise auf eine gewichtsregulierende Wirkung der zur
Blutdruckreduktion eingesetzten AT1-Antagonisten. Der zugrunde liegende Mechanismus
ist unklar. Ziel dieser Arbeit war zu untersuchen, ob eine chronische blutdruckeffektive
AT1-Blockade Hormon- bzw. Neuropeptidveränderungen induziert, die mit Hypophagie
und Gewichtsverlust assoziiert sind.
60 spontan hypertensive Ratten wurden für vier Wochen mit Candesartan-Cilexetil
(0; 2; 6 und 16 mg/kg/d) behandelt und Futteraufnahme, Blutdruck und Herzfrequenz
gemessen. Periphere Hormone (u.a. Leptin) sowie Neuropeptide des Hypothalamus
(u.a. MCH, Orexin, CART) wurden mittels RIA- bzw. RT-PCR-Analytik ermittelt.
Die Effektivität der Candesartanbehandlung zeigte sich in der Reduktion des Blutdrucks,
der Herzfrequenz bzw. dem Anstieg von Angiotensin II und Aldosteron. Die mit
16 mg/kg/d Candesartan behandelten Tiere hatten ein signifikant geringeres Körpergewicht
und parallel hierzu deutlich verringerte „mRNA-steady-state“-Konzentrationen von MCH,
Orexin und CART, während weitere bestimmte Neuropeptide (NPY, POMC, AgRP, CRH)
und periphere Hormone (u.a. Corticosteron, Insulin, IL-6) unverändert blieben. Lediglich
Leptin zeigte einen tendenziellen Abfall und korrelierte negativ zum Körpergewicht.
Aus den Ergebnissen dieser Arbeit ist zu schließen, dass eine chronische AT1-Rezeptor-
Blockade eine Hypophagie und konsekutiv eine geringere Zunahme des Körpergewichts
herbeiführt. Allerdings trat dieser Effekt nur unter der Hochdosis von Candesartan
(16 mg/kg/d) auf. Vermutlich als Folge der Minderung von Gewicht und Fettmasse war
das Plasma-Leptin leicht erniedrigt. Somit könnte die „Downregulation“ des anorexigenen
CART im erniedrigten Leptin begründet sein. Allerdings war auffällig, dass gerade in den
Tieren mit niedrigstem Körpergewicht erhöhtes Leptin zu beobachten war, was im
Gegensatz zu den anderen Behandlungsgruppen bei der Candesartan-Hochdosis zu einer
inversen Korrelation zwischen Körpergewicht und Plasma-Leptin führte. Diese höheren
Leptin-Werte könnten die „Downregulation“ der orexigenen Peptide MCH und Orexin bei
diesen Ratten erklären. Da eine Sympathikus-Stimulation mit einer Leptinreduktion
einhergeht, könnte das erhöhte Leptin Folge der Sympathikus-hemmenden Wirkung von
Candesartan sein. Für diese Hypothese spricht der zum Körpergewicht proportionale
Abfall der Herzfrequenz.
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Anhang
74
7. Anhang
7.1 Abkürzungsverzeichnis
α-MSH α-Melanozyten-Stimulations-Hormon
ACE Angiotensin-Converting-Enzym
ACTH Adrenocorticotropes Hormon
AgRP Agouti-Related-Protein
ANG I bzw. ANG II Angiotensin I bzw. II
ARC Nucleus arcuatus
AT1- bzw. AT2-Rezeptor Angiotensin-Rezeptor-Typ-1 bzw. Typ-2
BMI Body-Mass-Index
CART Cocain-Amphetamin-Reguliertes-Transkript
cDNA Complementäre Desoxyribonucleinsäure
CRH Corticotropin-Releasing-Hormon
EDTA Ethylendiamin-Tetracetat
ELISA Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay
GAPDH Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase
HA Hypothalamus
HF Herzfrequenz
HPA-Achse Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-
Achse
IL-6 Interleukin 6
LHA Lateraler Hypothalamus
MAP Mittlerer Arterielle Blutdruck
MC3- bzw. MC4R Melanocortin-3- bzw. Melanocortin-4-Rezeptor
MCH Melanin-Concentrating-Hormon
mRNA Messenger Ribonucleinsäure
MW Mittelwert
NPY Neuropeptid Y
OREX Orexin-A
POMC Prepro-Opiomelanocortin
PVN Nucleus paraventricularis
RAS Renin-Angiotensin-System
RIA Radio-Immuno-Assay
Anhang
75
RNA Ribonucleinsäure
RT-PCR Real-Time-Polymerase-Chain-Reaction
SEM Standardfehler
SHR Spontan Hypertensive Ratte
TNFα Tumor-Nekrose-Faktor-α
7.2 Material Laborausrüstung:
Geräte:
Absauggerät Eppendorf 4151 Eppendorf
Blutzuckermessgerät Ascensia ELITE XL Bayer
Cycler für cDNA-Herstellung Biometra
Druckmessgeräte:
Pressure Processor Gould
DC Amplifier Gould
Druckaufnehmern Stratham P23Db Hellige
Eismaschine Scotsman AF 10
Elektrophoresegerät Sub-Cell GT BioRad
FLUOstar OPTIMA Basisgerät 2003-8143 BMG LABTECH
Gamma-Counter Wallac
Gefriertruhen Bosch
Kamera CellCam b/w digital control PHASE
Kameragerät Power Pac 300 BioRad
Kühlschränke Bosch
Magnetrührer IKA-Combimag RCT Janke & Kunkel Gmbh &
Co.KG
Mikrowelle Cortina
PCR-Gerät:ABI PRISM 7000 Sequence Detection System Applied Biosystems
pH-Meter WTW ph 531 WTW Weilheim
RNA-Isolierung: 6100 Nucleic Acid Prep Station Applied Biosystems
Rüttler Janke & Kunkel Gmbh &
Co.KG
Schüttel/Schwenkgerät REAX 2 Heidolph
Ultra-Tourax 78 IKA-Werke
Anhang
76
Vakuum-Verdampfer Savant
Vortex REAX 2000 Heidolph
Waagen
Feinwaage Sartorius
Waage MC1 Laboratory LC220S Sartorius
Wärmebad Köttermann
Zentrifugen
Tischzentrifuge MIKRO 200R Hettich Zentrifugen
Tischzentrifuge PCR-Labor Eppendorf
Zentrifuge PCR-Labor Jouan
Minifuge RF Heraeus sepatech
Gebrauchsmaterial:
Futter: Haltungsdiät Altromin
Gelkammer und Kämme BioRad
Glasgefäße Schott Duran
Guillotine Harvard Apparatus CO. INC.
MILLIS. MASS. USA
Käfige Makrolon Typ III und IV E. Becker & Co.
Kanülen Braun
Katheter SIMS trademarks
Messzylinder Duran
Assistent
IDL Germany
Nahtmaterial Mopylen monofil 5-0 USP Resorba
Operationsinstrumente FST Heidelberg
Pipetten:
Pipette 0,5-10µl Eppendorf
Finnpipette 5-40µl, 40-200µl, 200-1000µl Labsystems
Anthos 50-200 µl, 200-1000 µl Anthos new line
Multipipetten 50-300 µl, 1ml Eppendorf
Glaspipetten 5ml, 10ml,??? Hirschmann EM Technology
Brand
Omnilab
Anhang
77
Pipettenaufzieher Hirschmann Laborgeräte
Probenplatten:
PCR-Platte Sarstedt Aktiengesellschaft &
Co
Splash Guard Plate Applied Biosystems
RNA-Purification Tray Applied Biosystems
96-Well optical reaction plate Applied Biosystems
Rasierer Aeskulap
Riaröhrchen Greiner bio-one
Rührfische Bohlender
Schlundsonden Fine Science Tools INC
Skalpell Microtome blade Feather Safety Razor CO., LTD
Medical Devision
Spritzen: 2ml, 5ml, 10ml BD Discardit
Stoppuhr Junghans
Substanzen
Medikamente:
Bestatin Sigma
Betaisodona Mundipharma
Candesartan-Cilexetil Astra-Zeneca
Gummi-Arabicum Caesar & Loretz GmbH
Pentobarbital-Na Pharmazeutische
Handelsgesellschaft mbH
Chemikalien:
Agarose NEEO Carl Roth
Aprotinin (Trasylol 0,5) Bayer
Diethylpyrocarbinat (DEPC) Sigma
DNA Molecular Weight Marker XIV Roche Diagnostics Gmbh
EDTA Merck
Ethanol p.A. 98% Merck
Ethidiumbromid BioRad Laboratories
Ethylacetat Merck
Anhang
78
Glycerol Gibco BRL
HCl Merck
Hexan Sigma
Leupeptin Sigma
Methanol J.T.Baker
2-Methylbutan Sigma
Natriumhydroxid Fluka
Natriumchlorid Merck
PBS Puffer Hausapotheke
Phenylmethylsulfonylfluorid Sigma
Saccharose Merck
Stickstoffstrom Hausleitung
TAE-Puffer Invitrogen
Tris 1M Sigma
Triton X-100 Serva
Trockeneis Hausapotheke
Xylen-Cyanol BioRad Laboratories
Fertige Kits:
Euria-Angiotensin II Kit Euria
Inhalt: Anti-Angiotensin II
J-125-Angiotensin II
Doppel-Antikörper-Festphase/ Trennreagenz
Assaypuffer
Angiotensin II Standard 300 pmol/l
Angiotensin II Kontrolle, hoch und niedrig
Aldosterone DA Kit MP Biomedicals
Inhalt: Anti-Aldosteron
Aldosteron-Standards (1,0; 2,5; 5,0; 10; 25; 50; 100 pg/0,5ml)
J-125-Aldosteron
Steroid-Diluent
Präzipitationslösung
Anhang
79
Rat Leptin Ria Kit Linco Research
Inhalt: Pufferlösung
Ratten-Leptin-Antikörper
J-125-Leptin-Tracer
LabelHydratingPuffer
Standards (0,5; 1; 2; 5; 10; 20; 50 ng/ml)
Kontrolle 1 und 2
Präzipitationslösung
Rat Insulin Ria Kit Linco Research
Inhalt: Pufferlösung
Ratten-Insulin-Antikörper
J-125-Insulin-Tracer
LabelHydratingPuffer
Standards (0,1; 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0 ng/ml)
Kontrolle 1 und 2
Präzipitationslösung
Mouse Adiponectin RIA Kit Linco Research
Inhalt: Assaypuffer
Adiponectin-Antikörper
J-125-Adiponectin
Adiponectin Standard 100 ng/ml
Kontrolle 1 und 2
Rabbit Carrier
Präzipitationslösung
Corticosteron RIA Kit MP Biomedicals
Inhalt: Steroid-Diluent
Anti-Corticosteron
Corticosteron Standards (25; 50; 100; 250; 500; 1000 ng/ml)
Präzipitationslösung
J-125-Corticosteron
Kontrolle 1 und 2
Anhang
80
Rat IL-6 ELISA Bender MedSystems GmbH
Inhalt: Microwell-Platte, besetzt mit monoklonalen Il-6-Antikörper
Biotin-Conjugate
Streptavidin-HRP
Il-6-Standard
Pufferlösungskonzentrat
Waschpufferkonzentrat
Substrate Solution 1
Substrate Solution 2
Stop Solution
Plate Covers
Kit zur RNA-Isolierung Applied Biosystems
Inhalt: Proteinase K
Waschpuffer 1
Waschpuffer 2
Elution Solution
Lysis Solution
Cloned AMV First-Strand cDNA Synthesis Kit Invitrogen
Inhalt: cNTP Mix, 10mM
Oligo(dT), 0,5 µg/µl
5x RT-Puffer
DTT, 0,1M
RNaseOUT, 40 units/µl
Cloned AMV RT, 15 units/µl
Scybr Green I Reaction System Eurogentec SA
Inhalt: PCR-Master Mix:
Puffer 10X
dNTP-Mix, 5mM
MgCl2, 50mM
HotGoldStar Enzyme
SybrGreen
Anhang
81
7.3 Erklärung über die Genehmigung der Tierversuche
Die Tierversuche wurden entsprechend der Deklaration von Helsinki und den
entsprechenden Richtlinien für den Umgang und die Verwendung von Labortieren nach
Genehmigung durch das Ministerium für Landwirtschaft, Umwelt und ländliche Räume
des Landes Schleswig-Holstein bewilligt.
Antrag vom 11.11.03:
„Desensitivierung der HPA-Achse durch Blockade des Renin Angiotensin Systems“
Zeichen V742-72241.122-22
genehmigt am 06.05.04
Antrag vom 13.02.06:
„Die Bedeutung des zentralen RAAS für die Regulation von Futteraufnahme und Gewicht“
Zeichen V362-72241.122-22
genehmigt am 10.03.06
Danksagungen
82
8. Danksagungen
Herrn Prof. Dr. P. Dominiak danke ich für die Bereitstellung eines Arbeitsplatzes am
Institut für experimentelle und klinische Pharmakologie der Universität zu Lübeck.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. W. Raasch, der mich zur Erarbeitung des
Themas motivierte, mich hervorragend betreute und unterstützte und mir stets mit
wertvollen Ratschlägen und konstruktiver Kritik zur Seite stand.
Weiterhin danke ich Herrn C. Wittmershaus für die großzügige Überlassung der Proben
und Herrn F. Pahlke vom Institut für Medizinische Biometrie und Statistik für die Beratung
bei der statistischen Auswertung.
Herrn PH Dr. O. Jöhren möchte ich für die Beratung bei der Durchführung der RT-PCR
danken.
Allen Mitarbeitern des Instituts danke ich für die kollegiale Zusammenarbeit, insbesondere
Frau A. Kaiser, Frau G. Vierke, Frau B. Lembrich und Herrn H. Müller für die exzellente
Einarbeitung in die Laborarbeit und die Unterstützung während des experimentellen Teils
der Arbeit.
Lebenslauf
83
9. Lebenslauf
Name: Antonie Markert
Geburtsdatum: 02.03.1980
Geburtsort: Hildesheim
Ausbildung
1986- 1990 Grundschule Moritzberg, Hildesheim
1990- 1999 Gymnasium Andreanum, Hildesheim, Allgemeine Hochschulreife
07.99- 02.00 Community Service Program in Panama- City, Panama
04.00- 07.01 Physikstudium, Technische Universität Berlin
10.01- 09.04 Medizinstudium, Freie Universität Berlin, Universitätsmedizin
Charité Berlin
10.04- 10.08 Medizinstudium, Universität Lübeck
Dissertation
02.05- 02.06 Durchführung des Praktischen Teils, Institut für experimentelle und
klinische Pharmakologie und Toxikologie, Universitätsklinikum
Schleswig-Holstein, Campus Lübeck
Publikationen
84
10. Publikationen
Weight loss after AT1-blockade is correlated to a downregulation.
Raasch W, Markert A, Wittmershaus C, Dominiak P, Jöhren O
Exp Clin Endocrinol Diabetes, OR6-31, S10 (2006)
Weight loss after AT1-blockade is correlated to a downregulation of orexigenic peptides in
the hypothalamus.
Raasch W, Markert A, Wittmershaus C, Jöhren O., Dominiak P
Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol 372 (Suppl): 68/239 (2006)
Reduction of bodyweight and food intake after AT1-blockade is associated with a
downregulation of orexigenic peptides in the hypothalamus 30.
Raasch W, Markert A, Jöhren O, Wittmershaus C, Dominiak P
Wissenschaftlicher Kongress Hypertonie 2006, Deutsche Hochdruckliga DHL – Deutsche
Hypertonie Gesellschaft, München 22.-24. 11. 2006 (2006)