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F1-Praktikum "Molekulare Tierphysiologie"

Die Keratine der Zellkulturlinie RTG2

(Rainbow Trout Gonade)

Station 3:

Molekularbiologie

F1 Praktikum (Molekularbiologie) 2

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1. EINLEITUNG 1.1 Die Keratine Keratine gehören zu der großen Multigenfamilie der Intermediärfilament-Proteine. Innerhalb der Zellen lagern sie sich zu den 10 nm dicken Intermediärfilamenten zusammen und bilden neben den Aktinfilamenten und den Mikrotubuli das Cytoskelett der meisten Wirbeltierzellen. Derzeit werden die IF-Proteine aufgrund ihrer Primärstrukturen und auch der Organisation ihrer Gene in fünf verschiedene Typen untergliedert. Den Typ I und II bilden die Keratine, die gleichzeitig auch die größte und komplexeste IF-Protein-Gruppe repräsentieren. Zum Aufbau der Keratinfilamente müssen sich immer Typ I und Typ II-Keratine zu gleichen Anteilen zusammenlagern. Die menschlichen Keratine wurden bis heute am besten untersucht. Hier existieren mindestens 21 verschiedene Keratin-Gene, die in unterschiedlichen Epithelien exprimiert werden. Dazu kommen noch mindestens 10 verschiedene Gene, die typischerweise in Haar- und Nagelbildungszellen erscheinen. Diese außerordentliche Diversität und ihre zell- und gewebetypische Expression macht die Keratine zu geeigneten Differenzierungsmarkern in der Entwicklungsbiologie und Pathologie des Menschen. Neben einigen Säugern ist vor allem der Krallenfrosch Xenopus laevis bezüglich seiner –ebenfalls zahlreichen-Keratine gut charakterisiert. Wie die Identifikation von Mutationen in Keratingenen als Ursache für einige läsive Hauterkrankungen unterstreicht, sind die IF-Proteine sicher für die mechanische Stabilität der verschiedenen Zellen und Gewebe wichtig. Die Ursache für ihre überraschende molekulare Diversität liegt allerdings weitgehend im Dunkeln. Der Urprung dieser großen IF-Protein-Vielfalt deutet sich schon bei den Cephalochordaten und Urochordaten an, allerdings scheint die enorme Diversifizierung der IF-Proteine erst innerhalb der Fische stattgefunden zu haben. Unsere vergleichenden Untersuchungen der Keratin-Systeme von Knorpelfischen, Knochenfischen und Neunaugen enthüllten bereits einige wichtige und fundamentale Unterschiede zwischen den Keratinsystemen der veschiedenen Wirbeltierklassen. Dennoch lassen sich sowohl in Landwirbeltieren als auch in Knochen-, Knorpelfischen und Agnathen vor allem zwei Expressionstypen von Keratinen unterscheiden: Einerseits die Keratine der mehrschichtigen Epidermis, die E-Keratine und andererseits die Keratine der einschichtigen, simplen Epithelien, die S-Keratine. Damit ergeben sich innerhalb der Wirbeltiere insgesamt vier verschiedene Keratin-Kategorien: IE, IIE, IS, IIS. Tabelle 1: Die Multigenfamilie der Intermediärfilament-Proteine

Typ Name typisches Vorkommen in Säugern

I Keratine alle Epithelien II Keratine alle Epithelien III Vimentin mesenchymale Zellen Desmin Muskelzellen Gliafilament-Protein Gliazellen; Astrozyten Peripherin diverse neuronale Zellen IV α-Internexin Nervenzellen Neurofilament-Proteine Nervenzellen V Lamine Lamina des Zellkerns


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1.2 Die Keratine der Kulturzelllinie RTG2

Die RTG2 Zellen leiten sich von Fibroblasten aus Gonadengewebe der Regenbogenforelle ab. Sie lassen sich in Kultur halten und exprimieren den kompletten Satz an S-Keratinen (S3 allerdings nur in geringen Mengen):

2. ZIEL DES KURSES: Sie sollen die klonierte cDNA für das Keratin S1 in einem Plasmidvektor mittels "Southern Blot" nachweisen, die cDNA-Sequenz des Keratins S1 bestimmen und mit den Methoden der Bioinformatik untersuchen. Dafür werden zunächst Plasmide aus E.coli Zellen gewonnen. Diese werden einem Restriktionsverdau unterzogen, im Agarose-Gel nach Länge aufgetrennt und auf eine Nylon-Membran transferiert. Die spezifische S1-cDNA wird durch Hybridisierung mit einer nicht-radioaktiv markierten DNA-Sonde nachgewiesen. Die Sequenz des S1-Keratins wird durch Sequenzierung eines die entsprechende cDNA enthaltenden, gereinigten Plasmids ermittelt. Sie werten diese anhand Computer-gestützten Datenanalyse aus. Verwendete Techniken: • Plasmid-DNA-Präparation

• Southern Blotting

• Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

• Computer-gestützte Sequenzdatenanalyse

B

A

S1 S2 Sx S3

S4 S5

S6 S7

S8

IEF

SDS

Abb1.: Die Keratine der Zelllinie RTG2. Zweidimensionale Gelelektrophorese einer Cytoskelettpräparation aus RTG2-Zellen, wobei eine isoelektrische Fokussierung in der ersten Dimension und eine denaturierende SDS-PAGE in der zweiten Dimension durchgeführt wurde. Die Proteine wurden anschließend mit Coomassie Blue gefärbt. B, Rinderserumalbumin; A, Aktin; S1 bis S3, Typ II-Keratine; S4 bis S8, Typ I-Keratine


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2. ABLAUF DES KURSES:

Kursteil Molekularbiologie: 9.08. - 13.08.2004

Montag:

• Ansetzen einer Übernachkultur von E. coli XL1-Blue mit einem Keratin-S1-Plasmid

• Ansetzen von Lösungen

Dienstag:

• Präparation der Plasmid-DNA ("Minipräp")

• Restriktionsverdau der Plasmid-DNA

• Vorbereitung eines Agarose-Gel

Mittagspause

• Auftrennung des geschnittenen Plasmides im Agarosegel

• Southern Blot: Transfer der DNA auf Nylonmembran

• Markierung der cDNA mit Digoxygenin-dUTP mittels PCR

Mittwoch:

• Qualitätstest der markierten Sonde durch Dottest und Agarosegel

Mittagspause

• Fortsetzung des Southern Blot: Hybridisierung der Nylonmembran mit der markierten

Sonde (über Nacht)

Donnerstag:

• Fortsetzung des Southern Blot: Detektion der hybridisierten DNA

Mittagspause

• Auswertung der Ergebnisse

• Beginn der Sequenzdatenanalyse

Freitag:

• Fortsetzung der Sequenzdatenanalyse

Abschlussbesprechung und Protokolle


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3. KURSANLEITUNG:

MONTAG (09.08.2002) Ansetzen von Lösungen:

5 M NaCl (200 ml) 20 % SDS (wird gestellt) 1 M Tris-HCl pH 7,5 (500 ml) 1 M Tris-HCl pH 9,5 (500 ml) 10x TBE (1l): 890 mM Tris/Cl 890 mM Borsäure

20 mM Na2EDTA pH 7,5

20 x SSC (1l): 3 M NaCl (Transferpuffer) 0,3 M Na-Citrat, pH 7,0 Denaturierungslösung (1l): 0,5 N NaOH 1,5 M NaCl

Neutralisationslösung (1l): 0,5 M Tris (HCl) 1,5 M NaCl (pH 7,5) Hybridisierungslösung(1l): 5 x SSC 0,1 % Laurylsacrcosinat 0,02 % SDS (20 %ige Stammlösung verwenden, wird gestellt!) 2 % Blocking Reagent (Roche Life Chemicals) Detektionspuffer 1 (1l): aus Stammlösungen (siehe oben) verdünnen: 10 mM Tris-HCl 150 mM NaCl pH 7,5 Detektionspuffer 2 (1l): frisch herstellen! (25.09.2002) 5 % Magermilchpulver in Detektionspuffer 1 Detektionspuffer 3 (1l): aus Stammlösungen (siehe oben) verdünnen: 10 mM Tris-HCl 100 mM NaCl pH 9,5 Waschpuffer 1 (1l): 2 x SSC (aus Stammlösung verdünnen) 0,1 % SDS (20 %ige Stammlösung verwenden, wird gestellt!) Waschpuffer 2 (1l): 0,1 x SSC (aus Stammlösung verdünnen) 0,1 % SDS (20 %ige Stammlösung verwenden, wird gestellt!)

Stamm-/Gebrauchslösung

Verdünnung

Frisch ansetzen

wird gestellt


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Färbelösung (500ml): frisch herstellen! (25.09.2002)

auf 10 ml Detektionspuffer 3

wird gestellt: 66 µl NBT (Vorsicht „cancerogen!)

33 µl BCIP NBT [(Nitroblau-Tetrazolium) 50mg/ml in 70%

Dimethylformamid] BCIP [(5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-Phosphat) 50mg/ml in 100%

Dimethylformamid]

6x Loading Dye (gestellt): 30 % Glycerin 0,24 % Bromphenolblau 0,24 % Xylencyanol 6 x TBE


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MONTAG (9.08.2004) 1. Ansetzen der Bakterien-Übernachtkultur zur Plasmidpräparation.

Sie erhalten einen E. coli-Stamm, der ein extrachromosomales Plasmid (eine kleine, sich autonom replizierende zirkuläre DNA) enthält, in dem sich die cDNA des Keratins S1 (Klon 8-1) befindet. Das Plasmid (pBluescript SK-) trägt außerdem das Gen für eine Antibiotikumresistenz (Ampicillin), was die Selektion auf die mit dem Plasmid ausgestatteten Bakterien ermöglicht. Die Bakterien werden über Nacht vermehrt. Das Plasmid wird am nächsten Tag gereinigt. • Eine LB-Agar-Platte [LB ist ein Standard-Nährmedium für Bakterien] mit den Bakterien

wird bereitgestellt. • Füllen sie ein bereitgestelltes Röhrchen mit etwa 5 ml LB (50 µg/ml Ampicillin)

(dekantieren, nicht pipettieren!). Arbeiten Sie steril über der Flamme. • Stechen Sie mit einem sterilen Zahnstocher eine einzelne Kolonie aus der bereitgestellten

LB-Agar-Platte aus und überführen Sie dieses in das Röhrchen. • Die Bakterien werden nun über Nacht bei 37°C geschüttelt (200 rpm). Dienstag (10.08.2004) 1. Plasmid-Präparation (Miniprep)

Die Aufreinigung von Plasmid-DNA aus E. coli Zellen beruht auf dem Prinzip der Bindung von Nukleinsäuren an eine Glasmatrix. Dieser Versuch wird mit einem Kit der Firma PEQLAB durchgeführt ("E.Z.N.A. Plasmid Miniprep Kit"). Die Bakterienzellen werden dabei zunächst lysiert, die genomische DNA und andere große Zellbestandteile werden druch Zentifugation entfernt, und die Plasmid-DNA anschließend auf eine Säule aufgetragen. Nach mehrmalgen Waschen wird die Plasmid-DNA mittels Wasser von der Säule eluiert. Lösungen:

Alle Lösungen werden dem "E.Z.N.A. Plasmid Miniprep Kit" der Firma PEQLAB entnommen. Steriles Wasser wird gestellt. Durchführung:

• Überführen Sie etwa 1,5 ml der Bakterienkultur in ein 1,5 ml Eppendorf Reaktionsgefäß. Zentrifugieren Sie dieses 10 min bei 2000 x g in der Tischzentrifuge.

• Verwerfen Sie den Überstand (Achtung: Bakterienabfall!) • Resuspendieren Sie das Bakterienpellet in 250 µl Lösung I. Überführen Sie die Lösung in

ein steriles 1,5 ml Eppendorfröhrchen. • Geben Sie 250 µl Lösung II hinzu, und invertieren Sie die Lösung mehrmals (4 bis 6 mal).

Lösung II enthält NaOH und SDS, welches die Zellen aufbricht. • Geben Sie ohne weitere Verzögerung (maximal 2 min) 350 µl Lösung III hinzu. Mischen

Sie wie oben. Lösung III enthält K-Acetat zur Neutralisation des Gemischs. • Zentrifugieren Sie das Gemisch 10 min bei Maximalgeschwindigkeit in der Tischzentrifuge. • Überführen Sie den Überstand in das Säulchen, welches auf einem 2 ml Sammelröhrchen

steckt und zentrifugieren dieses 1 min bei Maximalgeschwindigkeit. • Verwerfen Sie den Durchfluß, geben Sie 750 µl DNA-Waschpuffer hinzu und zentrifugieren

Sie wie oben.


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• Verwerfen Sie erneut den Durchfluß, stellen Sie das Röhrchen zurück, und zentrifugieren Sie das Röhrchen wiederum bei Maximalgeschwindigkeit.

• Stellen Sie die Säule in ein frisches 1,5 ml Eppendorfröhrchen und pipettieren Sie 50 µl steriles H2O auf die Membran. Lassen sie das Ganze etwa 1 min stehen. Eluieren Sie die DNA durch einminütige Zentrifugation bei Maximalgeschwindigkeit. Beschriften Sie das Röhrchen und stellen Sie es auf Eis.

2. Restriktionsverdau des gereinigten rekombinanten Plasmides Für einen Restriktionsverdau wird folgender Ansatz zusammengemischt:.

Volumen 10 µl x µl Plasmid-DNA (ca. 300 ng, photometrische Bestimmung) x µl 10x Puffer x µl Restriktionsenzym x µl H2O

Es werden folgende Restriktionsansätze zusammengestellt: • Eco R I/Xho I • Sma I/ Kpn I • Apa I • Pst I

Als Negativkontrolle wird ein rekombinantes Plasmid (pCR4, 3.5kb; “nicht-Keratin Insert“ 1.5kb) mit Eco RI verdaut. Inkubation 2 h, 37°C Zusätzlich werden sechs Verdünnungen des isolierten rekombinanten Plasmides hergestellt (300ng – 3 pg).

3. Elektrophoretische Auftrennung von DNA im Agarosegel

Die Auftrennung von DNA-Fragmenten erfolgt aufgrund ihrer Größe. In einem elektrischen Spannungsfeld wandert die negativ geladene DNA in Richtung der Anode. Die Agarose fungiert hierbei als “Molekularsieb”, indem sie je nach Konzentration in einem Gel eine gewisse Porengröße erzeugt. Große Fragmente werden stärker zurückgehalten als kleinere. In einem Bereich zwischen 0,1-60kb kann so eine sehr effiziente Auftrennung erreicht werden. Die aufgetrennte DNA wird durch Ethidiumbromid (EtBr) sichtbar gemacht. Dies interkaliert in die DNA und erzeugt bei UV-Beleuchtung eine intensiv orange-gelbe Fluoreszenz. Die aufgetrennten Fragmente können dadurch als Banden erkannt werden, die nur 20-50ng DNA enthalten.

Ethidiumbromid-Stammlösung 10 mg/ml (Vorsicht mutagen!)

Vorbereitung eines Agarosegels:

% Agarose effiziente Auftrennung % Agarose effiziente Auftrennung 0,3% 5-60 kb 0,9% 0,5-7 kb 0,6% 1-20 kb 1,5% 0,2-3 kb 0,7% 0,8-10 kb 2,0% 0,1-2 kb


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Die Agarose wird in 1x TBE durch Aufkochen gelöst, mit EtBr (Endkonz.: 0,5µg/ml) versetzt und in einen abgedichteten Gelschlitten gegossen. Nach Verfestigung der Agarose wird der Kamm entfernt, das Gel in eine Elektrophoresekammer gegeben und mit 1x TBE bedeckt. 4. Markierung der Keratin S1-Sonde mittels PCR

Mit Hilfe der „polymerase chain reaction“ (PCR) ist es möglich, DNA-Abschnitte zu vervielfältigen. Hierzu benötigt man als "Starthilfe" sogenannte Oligonukleotid-primer. Dabei handelt es sich um kurze einzel-strängige DNA-Moleküle, die komplementär zu den Enden einer definierten Sequenz sind. Die Taq- Polymerase, eine thermo-stabile DNA-Polymerase, verlängert ausgehend von diesen Pimern in Anwesen-

heit von Nukleotiden und unter geeigneten Reaktionsbedingungen die einzelstängige DNA-Matrize. Wiederholt man diese Reaktion mehrfach so erhält man theoretisch nach z.B. nach 35-facher Wiederholung ca. 235 Kopien eines spezifischen DNA-Abschnittes. Für die Herstellung einer Sonde kann man (neben vielen anderen Möglichkeiten) dieses PCR-Vervielfältigungsprinzip eines DNA-Abschnittes heranziehen. Allerdings werden bei dieser Art der PCR nicht nur „normale“ dNTPs zur Strangverlängerung eingesetzt, sondern ein Gemisch von dNTPs und Digoxigenin-markierten dUTP. Hierdurch erfolgt neben dem Einbau von dTTP auch der Einbau von Dig-dUTP. Es wird demzufolge ein gewünschter spezifischer DNA-Abschnitt vervielfältigt und gleichzeitig markiert. Die Markierung ist durch spezifische Antikörper und hierdurch vermittelte Färbemethoden zu detektieren.


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94° C 94°C 72°C 72°C 3’ 20’’ 55°C 1’30’’ 7’ 30’’ 4°C 1× 30× 1× 8

PCR Dig 1 PCR Dig 2 H2O [µl] 18,5 Ann.-Temp H2O [µl] 17,0 Ann.-Temp

10x PCR Puffer [µl] 2,5 53°C 10x PCR Puffer [µl] 2,5 53°C 50mM MgCl2 [µl] 0,5 Programm 50mM MgCl2 [µl] 2 Programm

10mM Dig-dNTP [µl] 1 10mM Dig-dNTP [µl] 1 Primer #1 [µl] 0,5 RA1b1_Up Primer #1 [µl] 0,5 RA1b1_Up Primer #2 [µl] 0,5 RA1b1_Do1 Primer #2 [µl] 0,5 RA1b1_Do1

DNA [10ng/µl] [µl] 1 DNA aus Miniprep DNA [10ng/µl] [µl] 1 DNA aus Miniprep

5U/µl Taq [µl] 0,5 5U/µl Taq [µl] 0,5

Vol. 25 µl Vol. 25 µl

PCR control 3 PCR control 4

H2O [µl] 18,5 Ann.-Temp H2O [µl] 17,0 Ann.-Temp 10x PCR Puffer [µl] 2,5 53°C 10x PCR Puffer [µl] 2,5 53°C

50mM MgCl2 [µl] 0,5 Programm 50mM MgCl2 [µl] 2 Programm 10mM dNTP [µl] 1 10mM dNTP [µl] 1 Primer #1 [µl] 0,5 RA1b1_Up Primer #1 [µl] 0,5 RA1b1_Up Primer #2 [µl] 0,5 RA1b1_Do1 Primer #2 [µl] 0,5 RA1b1_Do1

DNA [10ng/µl] [µl] 1 DNA aus Miniprep DNA [10ng/µl] [µl] 1 DNA aus Miniprep

5U/µl Taq [µl] 0,5 5U/µl Taq [µl] 0,5

Vol. 25 µl Vol. 25 µl

Pipettierschemata für die PCR: Jeder Teilnehmer pipettiert 2 Ansätze in 200 µl-Caps auf Eis in der angegebenen Reihenfolge:

A Temperaturverlauf und Laufzeiten des PCR-Programms im

d-UTP- Digoxigenin

1

2 3

4

5


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5. Elektrophoretische Auftrennung von DNA Fragmenten im Agarosegel

Die aufzutrennenden Proben, versetzt mit 10x Probenpuffer (Endkonz. 1x), werden in die Taschen gefüllt und mit 8 V/cm Elektrodenabstand aufgetrennt.

Mit Hilfe eines UV-Transilluminators werden die aufgetrennten Fragmente sichtbar gemacht und zur Dokumentation fotografiert.

Als Größenmarker dienen:

6. Southern Blot

Ein spezifisches Restriktionsfragment kann durch Hybridisierung mit einer markierten Sonde sichtbar gemacht werden. Zunächst wurde die zu analysierende DNA restringiert und gelelektrophoretisch aufgetrennt. Die Doppelstränge müssen anschließend denaturiert und auf eine Membran transferiert werden. Dieser Transfer erfolgt durch Kapillarkräfte. Die ssDNA, auf der Membran fixiert, wird mit einer markierten (siehe unten) Sonde hybridisiert und eine entsprechende Detektionsmethode (siehe unten) angeschlossen. Nur dort, wo sich eine zur Sonde komplementäre Sequenz unter den Restriktionsfragmenten befindet, kann ein Signal detektiert werden und so eine ganz bestimmte Sequenz aufgespürt werden.

Glasplatte

Papiertücher

FilterpapierMembranGel

Filterpapier

Transferpuffer

Gewicht

Abb.II.5: Aufbau eines Southern-Blot Lösungen: 20 x SSC (Transferpuffer) 3 M NaCl 0,3 M Na-Citrat, pH 7,0 Denaturierungslösung 0,5 N NaOH 1,5 M NaCl

Neutralisationslösung 0,5 M Tris (HCl) 1,5 M NaCl (pH 7,5)

λ-DNA verdaut mit : Eco RI und HindIII

“100 bp Leiter”


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Durchführung: • Messen Sie das Gel aus. • Schwenken Sie das Gel 15 min in Denaturierungslösung und anschließend 15 min in

Neutralisationslösung • Schneiden Sie eine Nylonmembran genau auf Gelgröße. • Schneiden Sie drei Lagen Whatman-Papier und mehrere Lagen (etwa 3 cm hoch)

Filterpapier auf Gelgröße. Schneiden Sie ein Whatman-Papier etwa 15 cm länger als die übrigen.

• Füllen Sie die bereitgestellte Elektrophoresekammer auf beiden Seiten etwa 2 cm hoch mit 20 x SSC. Benetzen Sie das langen Whatman-Papier mit 20 x SSC und legen Sie diesen so in den Gelkammer, daß beide Enden jeweils in das SSC hineinreichen.

• Legen Sie das Gel auf das Whatman-Papier in der Kammer. Auf dieses wiederum legen Sie vorsichtig die Nylonmembran. Man sollte eine Korrektur der Lage der Membran möglichst vermeiden. Auf diese Membran kommt wiederum 3 Lagen Whatman-Papier, schließlich die Filterpapiere, und schließlich eine Glasplatte. Decken Sie den Aufbau mit einer Frischhalte-folie ab und beschweren Sie die Glasplatte mit einem Gewicht (etwa 500 g).

• Lassen Sie den Aufbau über Nacht bei Raumtemperatur stehen. MITTWOCH (11.08.2004) 1. Qualitätstest der markierten Sonde:

a) Agarosegel:

Die Agarose wird in 1x TBE durch Aufkochen gelöst, mit EtBr (Endkonz.: 0,5µg/ml) versetzt und in einen abgedichteten Gelschlitten gegossen. Nach Verfestigung der Agarose wird der Kamm entfernt, das Gel in eine Elektrophoresekammer gegeben und mit 1x TBE bedeckt.

Je 10µl der PCR-Ansätze werden mit 10x Probenpuffer (Endkonz. 1x) versetzt, in die Taschen gefüllt und mit 8 V/cm Elektrodenabstand aufgetrennt.

Mit Hilfe eines UV-Transilluminators werden die aufgetrennten Fragmente sichtbar gemacht und zur Dokumentation fotografiert.

Als Größenmarker dienen:

λ-DNA verdaut mit : Eco RI und HindIII

“100 bp Leiter”


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b) Dottest

Die Effizienz des Einbaus des DIG-dUTPs in die DNA-Sonde soll überprüft werden. Hierzu wird eine geringe Menge (0,5µl und 2 µl) der PCR-Lösung auf ein Stück Nylonmembran aufgebracht, und das DIG-UTP mittels eines Antikörpers und eines anschließenden Farbtests nachgewiesen (siehe oben). Vorbereitete Lösungen :

Färbelösung: auf 10 ml Detektionspuffer 3 66 µl NBT (Vorsicht „cancerogen!)

33 µl BCIP NBT [(Nitroblau-Tetrazolium) 50mg/ml in 70%

Dimethylformamid] BCIP [(5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-Phosphat) 50mg/ml in 100 % Dimethylformamid] Durchführung:

• Schneiden Sie ein kleines Stück Nylonmembran zurecht (etwa 4 x 4 cm). • Tragen Sie auf dieses 0,5 und 2 µl der markierten Sonde (PCR-Produkt) auf. • Fixieren Sie die Sonde durch 30 min backen bei 80°C. • Blocken Sie die unspezifischen Bindungsstellen durch 15 min Schütteln bei

Raumtemperatur in 10 ml Detektionspuffer 2. • Inkubieren Sie die Nylonmembran 30 min in 5 ml Detektionspuffer 2 mit 1 µl anti-DIG-

Antikörper, gekoppelt an alkalische Phosphatase. • Gießen Sie die Lösung ab und schwenken die Membran kurz in Detektionspuffer 1.

Waschen Sie die Membran anschließend 3 x 5 min mit viel Detektionspuffer 1. • Detektion: Überführen Sie die Membran in 10 ml Detektionspuffer 3. Geben Sie 33 µl

BCIP und 66 µl NBT hinzu. Die markierte Sonde sollte nach kurzer Zeit dunkelviolett erscheinen.

2. Fortsetzung des Southern-Blots (Hybridisierung mit markierter DNA-Sonde): Die DNA wurde durch den Southern -Transfer über Nacht auf die Nylon-Membran überführt. Sie wird anschließend durch Hitze an diese fixiert. Um eine spezifische DNA in dem Gemisch der verschiedenen DNA-Moleküle nachweisen zu können, wird eine der gesuchten DNA entsprechende Sonde verwendet. Diese Sonde (Keratin S1) wurde mit Digoxigenin (DIG) mittels PCR markiert. Die Sonde wird mit der auf der Membran befindlichen DNA inkubiert, wobei sich die Sonde an die gesuchte DNA anlagert ("hybridisiert"). Anschließend kann die Sonde (und somit auch die gesuchte DNA) mittels eines Antikörpers gegen DIG nachgewiesen werden. An den Antikörper ist gleichzeitig ein Enzym (Alkalische Phosphatase) gekoppelt, welches eine Farbreaktion katalysiert. Lösung: Hybridisierungslösung: 5 x SSC 0,1 % Laurylsacrcosinat 0,02 % SDS (20 %ige Stammlösung verwenden!) 2 % Blocking Reagent (Roche Life Chemicals)


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Durchführung: • Bauen Sie die Transferapparatur ab und schwenken Sie die Nylonmembran kurz in 6 x SSC.

Die Nylonmembran wird im Ofen 1 Stunde bei 80°C gebacken. Dies dient zur Fixierung der transferierten DNA.

• Prähybridisierung der Membran: Schwenken Sie die Membran bei 68°C im Wasserbad in einem geschlossenen Behälter für 1 h in etwa 20 ml Hybridisierungslösung.

• Denaturieren Sie die Digoxygen-markierten Keratin-DNA-Sonde für 5 min bei 95°C und kühlen Sie diese anschließend sofort auf Eis. Dieser Schritt dient zur Auftrennung der beiden DNA-Stränge.

• Schütten Sie die Hybridisierungslösung vorsichtig ab. Geben Sie 10 ml frische, auf 68°C vorgewärmte, Hybridisierungslösung hinzu. Anschließend pipettieren Sie 20 µl (oder nach Anweisung) der denaturierten Sonde hinzu und schwenken die Membran mit der Lösung über Nacht bei 68°C.

DONNERSTAG (12.08.2004) 1. Fortsetzung des Southern-Blots (Detektion): Über Nacht hat die DNA-Sonde an das gesuchte Keratin-Fragment gebunden. Die unspezifisch an die Membran gebundene Sonde muß nun durch mehrere Waschschritte entfernt werden. Anschließend wird die spezifisch gebundene Sonde anhand der bereits beschriebenen Farbreaktion nachgewiesen. Lösungen:

Waschpuffer 1: 2 x SSC, 0,1 % SDS Waschpuffer 2: 0,1 x SSC, 0,1 % SDS Detektionspuffer 1: 10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl pH 7,5

Detektionspuffer 2: 5 % Magermilchpulver in Detektionspuffer 1

Detektionspuffer 3: 10 mM Tris-HCl, pH 9,5 100mM NaCl

Durchführung: • Waschen der Membran: Die Membran wird aus der Hybridisierungslösung entnommen und

2 x 5 min bei Raumtemperatur in Waschpuffer 1 geschwenkt. • Anschließend wird die Membran 2 x 15 min bei 68°C in Waschpuffer 2 geschwenkt. • Antikörperbindung: Blocken Sie die unspezifischen Bindungsstellen durch 30 min Schütteln

bei Raumtemperatur in 20 ml Detektionspuffer 2. • Inkubieren Sie die Nylonmembran 1 h in 10 ml Detektionspuffer 2 mit 2 µl anti-DIG-

Antikörper, gekoppelt an alkalische Phosphatase. • Gießen Sie die Lösung ab und schwenken die Membran kurz in Detektionspuffer 1.

Waschen Sie die Membran anschließend 3 x 10 min mit viel Detektionspuffer 1. • Detektion: Überführen Sie die Membran in 10 ml Detektionspuffer 3. Geben Sie 33 µl

BCIP und 66 µl NBT hinzu. Die gesuchte Keratin-DNA sollte nach einiger Zeit dunkelviolett erscheinen. Eventuell über Nacht inkubieren.

• Fotografieren oder kopieren Sie die Membran für Ihre Unterlagen.


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INSTITUT FÜR ZOOLOGIE, MÜLLERWEG 6, 1. STOCK RAUM 01223, COMPUTER POOL 2. Sequenzdatenanalyse: Um wesentliche Aussagen zur Struktur und Evolution der Keratine zu erhalten, müssen die Proteinssequenzen ermittelt werden. Diese werden heutzutage meist über die cDNA-Sequenz abgeleitet, die in Protein übersetzt werden können. Die cDNA kann über verschiedenene Methoden gewonnen werden (Antikörper-Screening, DNA-Sonden-Screening, PCR). Die cDNA wird in einen geeigneten Vektor (Plasmid; hier pBluescript SK-) kloniert und kann mittels spezifischer Primer (17 – 25 bp lange Oligonukleotide), die an die Sequenz des Vektors binden, sequenziert werden. Üblicherweise sequenziert man heute nicht mehr selbst, sondern überlässt dies einem kommerziellen Unternehmen. Das Plasmid, welches die cDNA des Keratins S1 enthält, wurde bereits in der Arbeitsgruppe von beiden Enden mit den beiden Standardprimern für den Vektor (T3 und T7) sequenziert. Sie erhalten zwei Sequenzdatenfiles, wie sie von der Firma per email zugeschickt wurden. Durchführung: § Legen Sie sich im Verzeichnis "O:\F1-Praktikum\" ein eigenes Verzeichnis an. Kopieren

Sie die Sequenzdatenfiles in dieses Verzeichnis. Bitte verwenden Sie dieses Verzeichnis, und nur diese Verzeichnis, als Speicherort für Ihre Dateien.

§ Öffnen Sie das Sequenzdatenfile mit dem Programm "Chromas". Schauen Sie sich diese Datei an und suchen Sie nach "N"s. Was ist dort passiert?

§ Welche der beiden Sequenzen entspricht dem 5' bzw. 3'-Ende? Wo endet der Vektor, wo beginnt die cDNA? Vergleichen Sie dafür die Sequenzen mit der Vektorsequenz (pBlueskript SK-).

Sie erhalten dann die vollständige Sequenz der Keratin S1-cDNA. Ihre Aufgabe ist es nun, diese Sequenz in Protein zu übersetzen, das Molekulargewicht dieses Proteins zu bestimmen und den Isoelektrischen Punkt zu errechnen. Anschließend soll untersucht werden, welche Sequenzen in den öffentlich zugänglichen Datenbanken mit der Forellen-Keratinsequenz Ähnlichkeiten zeigen, und diese mit der Forellensequenz zu vergleichen. Durchführung: § Öffnen Sie die bereitgestellte Textdatei mit der Keratin S1-Sequenz mit einem Editor (z.B.

Word). Alle weiteren Analysen werden mit der aus der cDNA abgeleiteten Amino-säuresequenz durchgeführt. Dazu müssen Sie die vorgegebene DNA-Sequenz in Protein übersetzen. Dazu stehen verschiedene Programme zur Verfügung. Wir verwenden eine netz-basierte Applikation.

Starten Sie den Web-Browser (Netscape oder Explorer) und öffenen Sie die Seite:

http://www.expasy.ch/tools/dna.html

§ Kopieren Sie die DNA-Sequenz wiederum in die dafür vorgesehene Dialogbox und starten Sie das Programm ("Translate Sequence"). Die Optionen müssen nicht verändert werden.


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§ Nun erhalten Sie die in allen sechs möglichen Leserastern translatierte DNA-Sequenz. Woran erkennen Sie das richtige Leseraster?

§ Wählen Sie das geeignete Leseraster und klicken Sie dieses an. Sie erhalten nun die translatierte Sequenz. Wählen Sie den Translationsstart (woran zu erkennen?) und klicken Sie die entsprechende Aminosäure an.

§ Das so erhaltene "virtuelle" Protein kopieren Sie und speichern Sie dieses in Ihrem Verzeichnis ab.

§ Weiterhin erhalten Sie Angaben zum Molekulargewicht und dem theoretischen isoelektrischen Punkt. Stimmen das theoretische Molekulargewicht und der pI mit den biochemisch bestimmten Werten (siehe Seite 2) überein?

FREITAG [(13.08.2004) INSTITUT FÜR ZOOLOGIE, MÜLLERWEG 6, 1. STOCK RAUM 01223, COMPUTER POOL] Sequenzvergleiche und molekulare Phylogenie Wenn man eine neue Sequenz hat, interessiert man sich natürlich dafür, welche anderen Sequenzen es gibt, die Ähnlichkeiten mit der eigenen Sequenz zeigen. Dafür vergleicht man die eigene Sequenz mit denen in den öffentlichen Datenbanken, die unter den folgenden Adressen zugänglich sind:

NCBI-BLAST: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ BLAST-Japan: http://www.blast.genome.ad.jp/

§ Öffnen Sie mit dem Web-Browser eine der genannten Adressen. Kopieren Sie Ihre Proteinsequenz in die dafür vorgesehene Dialogbox. Wählen Sie die Option "blastp" (Vergleich einer Proteinsequenz mit den Proteindatenbanken) und unter databases "nr" bzw. "nr-aa". Starten Sie das Programm durch drücken des "search" bzw. "exec" Knopfs. Dieser Vorgang kann einige Minuten in Anspruch nehmen.

Mit welchen anderen Proteinen weist diese Sequenz Ähnlichkeiten auf? § Als nächstes sollen einige ausgewählte Proteine mit dem Keratin S1 verglichen werden. § Öffnen Sie zunächst das Programm "GENEDOC". Wählen Sie aus den Datenbanken

(NCBI etc; siehe oben) ca. 10 verschiedene Keratine aus. Die nähere Auswahl bleibt Ihnen überlassen.

§ Kopieren Sie die Aminosäuresequenzen mit Hilfe der vorgesehenen Dialogbox (Knopf "S" -> "import" -> "input") in GENEDOC. Verwenden Sie die in den Datenbanken vorgege-benen Namen bzw. geeignete Abkürzungen. Kopieren Sie ihre eigene Sequenz in GENEDOC.

§ Wenn Sie fertig sind, speichern Sie die Datei in Ihrem Verzeichnis unter "Keratine.msf". § Exportieren Sie die Datei im CLUSTAL-Format. (Knopf "file" -> "export" -> "Clustal

(aln)". Benennen Sie Ihre Datei "Keratine.aln". § Nach dem Abspeichern öffnen Sie das Programm "CLUSTALX" und laden die Datei

"Keratine.aln" (Menü "File" -> "Load Sequences"). Nun "alignen" Sie die Sequenzen. D.h., das Programm versucht die Sequenzen so aneinanderzulegen, daß sie optimal übereinstimmen. Dafür müssen in einige Sequenzen Lücken bzw. Insertionen eingefügt werden. Sie können hierfür die Standardeinstellungen von CLUSTAL verwenden: Menü: "Alignment" -> "Do Complete Alignment". Nach Bestätigung der Dialogbox ("OK") nimmt der Sequenzvergleich einige Sekunden in Anspruch.

§ Was erkennen Sie an diesem Alignment? Was hat das Programm mit den Sequenzen, im Vergleich zu den Ausgangsdaten, gemacht?


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