This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

Die Immunologie der Lebermikrosomen II. Immunologische Beziehungen der Mikrosomen zu anderen Zellfraktionen

V o n P E T E R K . V O G T *

Aus dem Max-Planck-Institut für Virusforscliung, Tübingen ( Z . Natur forschg . 15 b, 2 1 8 — 2 2 1 [ 1 9 6 0 ] ; e i n g e g a n g e n am 9 . Januar 1960)

The general immunological relationships between microsomes and nuclei, mitochondria, and soluble cytoplasmic extract were studied by antibody binding capacity experiments. The microsomes crossreacted with the nuclei, mitochondria and soluble cytoplasmic extract. The largest degree of crossreaction occurred with the mitochondria, the smallest with the soluble cytoplasmic extract. Frac-tion spezific antigens can be demonstrated in mitochondria as well as in microsomes. The tissue spe-cific antigens of the microsomes were not found present in measurable amounts in the nuclear, mito-chondrial and soluble cytoplasmic fractions. They are therefore considered fraction specific with respect to the microsomes. In the liver microsomes tissue specificity and fraction specificity are due to the same group of antigens.

Elektronenmikroskopische Untersuchungen haben gezeigt, daß die Membransysteme des endoplasmati-schen Reticulums mit der Zellmembran einerseits und der Kernmembran andererseits verbunden sind1. In der regenerierenden Rattenleber und bei Fütte-rung nach längerem Fasten wird das endoplasmati-sche Reticulum von bestimmten Regionen des Cyto-plasmas her bevorzugt in der Nähe der Zellmem-bran und der Kernmembran neu aufgebaut. In die-sen Teilen der Zelle finden sich dann auch stets Ansammlungen von Mitochondrien 2. Die biochemi-sche Basis für diese morphologischen Beobachtun-gen ist nicht bekannt. Die Mikrosomenfraktion hat einige Enzymaktivitäten mit anderen Zellfraktionen gemeinsam, wie TPNH-Cytochrom-c-Reduktase oder Cholinesterase. Glucose-6-Phosphatase, Cytochrom-m und DPNH-Cytochrom-m-Reduktase scheinen nur in den Mikrosomen vorzukommen 3 '6. Immunologische Methoden erlauben es, in den Vergleich zwischen Zellorganellen außer Enzymen auch Struktursubstan-zen einzubeziehen, für die keine spezifischen bio-chemischen Teste zur Verfügung stehen. In dieser Mitteilung werden Experimente beschrieben, mit denen sich zwei Gruppen von Mikrosomen-Antigenen unterscheiden lassen: Antigene, die für die Mikro-somenfraktion spezifisch und solche, die in mehre-ren Zellfraktionen gleich oder ähnlich sind. Weitere Experimente beschäftigen sich mit dem Vorkommen der gewebespezifischen Mikrosomen-Antigene in an-

* Mit Unterstützung der S t u d i e n s t i f t u n g d e s d e u t s c h e n V o l k e s .

1 G . E . PALADE, J . Biophys. Biochem. Cytol. 1 , 5 6 7 [ 1 9 5 5 ] ;

M. L. W A T S O N , J. Biophys. Biochem. Cytol. 1, 257 [1955]; M . A . E P S T E I N , J . Biophys. Biochem. Cytol. 3 , 8 5 1 [ 1 9 5 7 ] .

deren Zellfraktionen und entscheiden damit über die Zugehörigkeit dieser Antigene zu einer der beiden eben erwähnten Gruppen.

Material und Methoden

1. Immunologische Methoden. Die Gewinnung von Antiseren und die Durchführung des Präzipitintests wurden in der vorhergehenden Mitteilung beschrieben 4.

2. Gewebefraktionierung durch Zentrifugation. Abge-sehen von dem unterschiedlichen Homogenisations-Medium bei der Präparation der Zellkerne wurden die Ratten-Leberhomogenate nach der in 1. c. 4 angegebenen Weise hergestellt. Die Präparation der Leber-Zellkerne geschah nach der Methode von H O G E B O O M und Mitarbei-tern 5. In dem nach dreimaligem Sedimentieren und Resuspendieren erhaltenen Präparat waren mit dem Phasenkontrastmikroskop nur noch vereinzelt Mitochon-drien festzustellen. Bedingt durch die Kontinuität von Kernmembran und endoplasmatischem Reticulum sind Mikrosomen als Verunreinigung in der Kernfraktion zu erwarten. Um größere Beimengungen dieser Art zu ver-meiden, wurden Ausstriche im Elektronenmikroskop überprüft. Die Kerne besaßen eine glatte Oberfläche und waren frei von anhaftenden Mikrosomen-Membranen. In zwei Präparaten wurde die Glucose-6-Phosphatase, ein Enzym, das nur in den Mikrosomen vorkommt, be-stimmt. Die spezifische Aktivität betrug beide Male 4% derjenigen der Mikrosomenfraktion. Die Zellkern-Prä-parationen enthalten jedoch Fragmente der Zellmem-bran 5, die zum größten Teil aus dem Gerüst der Gallen-kapillaren bestehen. Nach dem Ausschleudern der Kerne folgen bei höheren Zentrifugalkräften die Mitochon-drien und schließlich die Mikrosomen. Zwischen diesen

2 W . BERNHARD U. C. ROUILLER, J . Biophys. Biochem. Cytol. 2 ,

Suppl. 7 3 [ 1 9 5 6 ] . 3 G . H . HOGEBOOM, E . L . K U F F U . W . SCHNEIDER, I n t . R e v .

Cytol. V I , 4 2 5 [ 1 9 5 7 ] ; P . STRITTMATTER U. S . F. VELICK, J .

biol. Chemistry 2 2 1 , 2 5 3 [ 1 9 5 6 ] ; 2 2 1 , 2 7 7 [ 1 9 5 6 ] ; 2 2 8 ,

7 8 5 [ 1 9 5 7 ] .

beiden Fraktionen wandern die Lysosomen 6. Ihr Sedi-mentations-Verhalten deckt sich mit dem der kleinen Mitochondrien einerseits und dem der größeren Mikro-somen andererseits. Es erschien jedoch wünschenswert, nur mit Fraktionen zu arbeiten, die sich von einer Art Zellorganell herleiten. Deshalb wurde von dem Größen-spektrum der Cytoplasmapartikel an beiden Enden eine Fraktion abgetrennt, die „schwere" Mitochondrien-Frak-tion und die Mikrosomen-Fraktion. Die Partikel der dazwischen liegenden Größenklassen, ein Gemisch von Mitochondrien, Mikrosomen (größeren Fragmenten des endoplasmatischen Reticulums) und den mengenmäßig sehr stark zurücktretenden Lysosomen, wurden nicht zu den immunologischen Experimenten herangezogen. Die Mitochondrien-Fraktion entsprach der „mitochondrial head fraction" von A P P E L M A N S und Mitarbeitern7. Die Partikel wurden aus dem Cytoplasmaextrakt mit einer Phywe „Eispirouette" bei einem pi-Wert von 0,32-IO8

12 Min. lang zentrifugiert. Die kleinsten unter diesen Bedingungen sedimentierten Partikel hatten eine Sedi-mentationskonstante von 35 000 S. Die Präparate wur-den zweimal durch Resuspendieren und Sedimentieren gewaschen. Als Indikator auf Beimengungen von Mikro-somen wurde die Aktivität von Glucose-6-Phosphatase bestimmt. Sie überstieg nicht 1% der spezifischen Aktivi-tät der Mikrosomen-Fraktion. Die Darstellung der Mikrosomen erfolgte in der bereits angegebenen Weise; das Präparat leitete sich vom endoplasmatischen Reticu-lum her4. Der bei der Mikrosomen-Sedimentation ent-stehende Überstand bildete den löslichen Cytoplasma-extrakt.

Ergebnisse

1. K r e u z r e a k t i o n e n z w i s c h e n M i k r o -s o m e n und a n d e r e n Ze 11 f r a k t i o n e n ; f r a k t i o n s s p e z i f i s c h e A n t i g e n e . 400 ju g Protein-N Zellkerne, Mitochondrien, Mikrosomen und löslicher Cytoplasmaextrakt wurden in je einem Ansatz zu 4 ml Mikrosomen-Antiserum pipettiert. Ein 5. Ansatz erhielt 0,9% NaCl an Stelle des Antigens. Nach 6-stdg. Verweilen bei Raumtemperatur wurden die Präzipitate zentrifu-giert und bestimmt. Die Menge des nicht gebunde-nen Antiserums wurde in Präzipitinkurven der Über-stände mit Mikrosomen als Antigen ermittelt. Diese Titrationen sind in Abb. 1 wiedergegeben. In dem mit Mikrosomen absorbierten Antiserum ist kein Antikörper gegen Mikrosomen mehr vorhanden. Gleiche Mengen der anderen Zellfraktionen binden weniger Mikrosomen-Antikörper. Die Bindungskapa-zität wird in der Reihenfolge Mitochondrien > Zell-kerne > löslicher Cytoplasmaextrakt geringer. Diese Reihenfolge bezeichnet das Ausmaß der Kreuzreak-tion der Mikrosomen mit den anderen Zellfraktio-nen.

Zu dem gleichen Ergebnis gelangt man bei der partiellen Absorption eines Mitochondrien-Anti-serums mit den verschiedenen Zellfraktionen. Die Titration ergibt ähnliche relative Antikörperbin-dungs-Kapazitäten.

t 200 . 5

•SJ cg J>70O

u £

0 100 200 300 Antigen ([ig Protein N)

Abb. 1. Partielle Absorption eines Lebermikrosomen-Anti-serums mit 100 fxg Protein-N der einzelnen Zellfraktionen/ml Serum, absorb, mit Lebermikrosomen • O , absorb, mit Lebermitochondrien A A» absorb, mit Leberzellkernen

A A , absorb, mit lösl. Zellfraktion O — — O » 9 • = Präzipitinkurve der nicht absorbierten Kontrolle.

Mit der beschriebenen Bestimmung des Restanti-körpers nach partieller Absorption wird nur die Bin-dungsfähigkeit der Antigene für Mikrosomen-Anti-körper erfaßt. Hierin verhalten sich die Fraktionen gegenüber Mikrosomen-Antiserum und gegenüber Mitochondrien-Antiserum ähnlich. Dagegen ist die Gesamtmenge an gebundenem Antikörper nur direkt aus den Präzipitaten zu ermitteln, die bei der par-tiellen Absorption zuerst ausgeschleudert werden. Hier tritt ein deutlicher Unterschied zwischen Mikro-somen- und Mitochondrien-Antiserum auf (Tab. I).

Zu 1 ml Antiserum wurden 100 p.g

Protein-N folgender Antigene pipettiert

ncr Quotient l o

[J-g

Mikrosomen-antiserum

S Präzipitat X Antigen

Mitochon-drien-

antiserum

Zellkerne Mitochondrien Mikrosomen löslicher Cytoplasma-extrakt

1,50 1,10 1,69 0,38

1,60 1,87 1,26 0,39

Tab. 1. Antikörperbindung aus Mikrosomen-Antiserum und Mitochondrien-Antiserum durch verschiedene Zellfraktionen.

Die absolut größten Mengen Antikörper vermögen aus dem Mitochondrien- und dem Mikrosomen-Anti-serum jeweils die homologen Antigene zu binden. Diese Daten weisen darauf hin, daß die einzelnen Zellfraktionen charakteristische und spezifische Anti-gene besitzen.

2. L o k a l i s a t i o n der g e w e b e s p e z i f i -s c h e n M i k r o s o m e n - A n t i g e n e in der Z e l l e . Mit der Unterscheidung zwischen fraktions-spezifischen und kreuzreagierenden Antigenen in den einzelnen Zellfraktionen entsteht die Frage, ob die gewebespezifischen Mikrosomen-Antigene auf die Mikrosomen-Fraktion beschränkt sind, oder ob sie sich auch in anderen Zellfraktionen finden.

a) Versuche mit partieller Absorption von gewebe-spezifischem Mikrosomen-Antiserum. Zu gewebe-spezifischem Antiserum wurde in verschiedenen An-sätzen 120 jug Protein-N der zu untersuchenden Zell-fraktion pipettiert. Nach 6-stdg. Verweilen bei Raum-

. 300

I

t 1 .§100

0 100 200 300 WO Antigen (fig Protein N) —

Abb. 2. Antiserum 33 A, partiell absorbiert mit 120 /tg Protein-N-Leberzellkernen/ml Serum.

extrakt wurde mit der direkten Präzipitinmethode geprüft. Vier hochtitrige, gewebespezifische Anti-seren ergaben mit dem löslichen Cytoplasmaextrakt im Bereich von 50 bis 300 jug Protein-N-Antigen keine Präzipitate, während in Kontrollen mit Mikro-somen alles Antigen gefällt wurde. Der lösliche Cytoplasmaextrakt hat daher keine gewebespezifi-schen Antigene mit den Mikrosomen gemeinsam.

c) Die Antigene der Mikrosomen wurden in einem weiteren Experiment mit denen der Mitochon-drien verglichen. Zwei Kaninchen wurden mit Mito-chondrien immunisiert. Die Antiseren ergaben Präzi-pitate mit allen Zellfraktionen der Leber sowie mit

Antigen (pg Protein N) —

Abb. 3. Antiserum 38 A, partiell absorbiert mit 120 /tg Protein-N-Lebermitochondrien/ml Serum.

temperatur wurden die Antigene aus den Ansätzen durch Zentrifugation entfernt und der Überstand im Präzipitintest titriert. In den Abb. 2 und 3 sind die Ergebnisse notiert (eingezeichnete Meßpunkte). Die oberen, ausgezogenen Kurven zeigen die Präzipitin-Titrationen des nicht absorbierten Antiserums. Die unteren Kurven stammen von den Kontrollansätzen, bei denen Lebermikrosomen in der gleichen Konzen-tration wie die zu vergleichende Zellfraktion für die Absorption verwendet wurden.

Aus diesen Versuchen geht hervor, daß von Zell-kernen und Mitochondrien kein leberspezifischer Mikrosomen-Antikörper fixiert wird. Der Anti-körpergehalt des partiell absorbierten Serums deckt sich mit dem des nicht absorbierten. Zellkern- und Mitochondrien-Fraktion enthalten demnach keine gewebespezifischen Mikrosomen-Antigene. Wie zu erwarten war, fixieren in derselben Versuchsanord-nung auch Nierenmikrosomen und Nierenmitochon-drien keinen Antikörper.

b) Auf das Vorkommen der gewebespezifischen Mikrosomen-Antigene in dem löslichen Cytoplasma-

Nierenmitochondrien und -mikrosomen. Bei Absorp-tion mit Nierenpartikeln verschwanden auch die Antikörper gegen Lebermikrosomen. Es blieb kein gewebespezifischer Mikrosomen-Antikörper zurück. Die entsprechenden Antigene waren deshalb nicht in der zum Immunisieren verwendeten Partikelfrak-tion, den Mitochondrien, vorhanden. Zusammenfas-send kann gesagt werden, daß die in der Mikro-somenfraktion nachweisbaren, gewebespezifischen Antigene in Kernen, Mitochondrien und löslichem Cytoplasmaextrakt nicht in meßbaren Mengen vor-kommen. Sie sind spezifisch für die Mikrosomen und damit für das endoplasmatische Reticulum.

Diskussion

Die in der vorliegenden Arbeit angewandten Me-thoden für die Zellfraktionierung erlauben eine sau-bere Trennung von Kernen, Mitochondrien, Mikro-somen und löslichem Cytoplasmaextrakt. Es kann daher angenommen werden, daß die beobachteten Kreuzreaktionen zwischen den Fraktionen nicht auf

Verunreinigungen zurückzuführen sind, sondern den Besitz von gleichen oder ähnlichen Antigenen an-zeigen. Keine Aussage ist möglich über die Antigene der Lysosomen, da diese Partikel, wegen der Schwie-rigkeit, sie frei von Mikrosomen-Material zu erhal-ten, nicht in den Antigenvergleich einbezogen wur-den.

Der Nachweis von fraktionsspezifischen, nur in bestimmten Zellorganellen auftretenden Antigenen steht in Übereinstimmung mit den Ergebnissen von P E R L M A N N und D ' A M E L I O an Desoxycholat- und Athylendiaminotetraessigsäure-Extrakten aus Cyto-plasmapartikeln 8.

Gewebespezifische Mikrosomen-Antigene fehlten

4 P. K. VOGT, Z . Naturforschg., im Drude. 5 G. H . HOGEBOOM, W. SCHNEIDER U. M. J . STRIEBICH, J . biol.

Chemistry 196, 111 [1952]. 6 C . DE D U V E , C . PRESSMAN , R . GIANETTO , R . WATTIAUX U . F .

APPELMANS , Biochem. J . 6 0 , 604 [1955]; E. L. KUFF, G . H .

HOGEBOOM U. A . J . DALTON, J . Biophys. Biochem. Cytol. 2 ,

33 [1956],

in Kernen, Mitochondrien und löslichem Cytoplasma-extrakt. Sie gehören zu den fraktionsspezifischen Antigenen. Gewebespezifität und Fraktionsspezifität gehen bei den Lebermikrosomen auf die gleichen Antigene zurück. Es bleibt jedoch die Möglichkeit offen, daß andere Zellfraktionen eigene gewebe-spezifische Antigene besitzen. Die Existenz von be-sonderen Mitochondrien-Antigenen geht aus Tab. 1 hervor. In diesem Zusammenhang ist die Entdek-kung eines Phosphatids von Interesse, das nur in den Mitochondrien gefunden wird9. Eigene, noch unvollständige Versuche zeigen, daß sich die Mito-chondrien der Leber von denen der Niere immuno-logisch unterscheiden lassen.

7 F. APPELMANS , R. W A T T I A U X U. C. DE D U V E , Biochem. J . 5 9 ,

438 [1955]. 8 P . PERLMANN U. V. D 'AMELIO , Nature [London] 1 8 1 , 491

[1958]. 9 G. V. MARINETTI, J . ERBLAND U. E . STOTZ, J . biol. Chemistry

233, 562 [1958],

Die Immunologie der Lebermikrosomen III. Die Lokalisation gewebespezifischer Antigene innerhalb der Strukturkomponenten

des endoplasmatischen Reticulums

V o n P E T E R K . V O G T *

Aus dem Max-Planck-Institut für Virusforschung, Tübingen ( Z . Natur forschg . 15 b, 2 2 1 — 2 2 5 [1960] ; e i n g e g a n g e n am 9. Januar 1960)

Microsomes were fractionated by suspending them in a medium composed of 0.25 M sucrose, 0.08 M sodium citrate, and 0.01 M phosphate buffer pH 7.2, followed by a differential centrifugation. Three fractions were obtained. The first, sedimenting at an Smin of 200 consisted predominantly of the membranous component of the endoplasmic reticulum. Lipoprotein was enriched in this fraction. A second fraction ranging between 20 and 200 Svedberg units contained 70 per cent of the microsomal RNA and included mainly the ribosomes. However, membranous material was found still to be present. The remaining supernatant formed the soluble microsomal extract. Extraction of the microsomes with a fluorocarbon yielded pure ribosome preparations consisting of 60 per cent RNA and 40 per cent pro-tein. These ribosomes existed in two sizes, sedimenting at 70 and 100 Svedberg units. Among the microsomal subtractions prepared by the use of citrate the membranous material showed the highest concentration of tissue specific antigens, followed by the unfractionated microsomes and the ribo-nucleoprotein fraction. No tissue specific antigens were found in the soluble microsomal extract. The residual activity of the ribonucleoprotein fraction was due to contaminating microsomal membranes; pure ribosomes prepared by the fluorocarbon method failed to give precipitates with tissue specific antibody. It is concluded that the tissue specific antigens of the microsome fraction are occuring exclusively in the membranes of the endoplasmic reticulum.

P O R T E R und P A L A D E haben mit elektronenmikro-skopischen Aufnahmen von ganzen, äußerst flach ausgebreitet wachsenden Gewebekulturzellen und von Dünnschnitten die weite Verbreitung eines netz-

* Mit Unterstützung der S t u d i e n s t i f t u n g d e s d e u t s c h e n V o l k e s .

1 K . R. PORTER, J . exp. Medicine 97, 727 [1953] ; Harvey Lect. 5 1 , 175 [1957]; G. E. PALADE U. K . R . P O R T E R , J .

artigen Systems zusammenhängender Gefäße im Cytoplasma verschiedener Zelltypen gezeigt und da-für die Bezeichnung „endoplasmatisches Reticulum" vorgeschlagen 1. In diesem Begriff sind verschiedene

exp. Medicine 1 0 0 , 641 [1954]; G. E. PALADE, J . Biophys. Biochem. Cytol. 2, Suppl. 85 [1956]; 1, 567 [1955],