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DIAGNÓSTICO GENÉTICOPREIMPLANTACIONAL

MÓDULO 3: DIAGNÓSTICO PRENATAL

TÍTULO DE EXPERTO UNIVERSITARIO EN MEDICINA GENÉTICA Y GENÓMICA 2019

Material didáctico: Módulo 3 – Clase 3

Material didáctico creado por Mar Benito, MSc https://www.linkedin.com/in/marbeni to/

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DIAGNÓSTICO GENÉTICO PREIMPLANTACIONAL


MÓDULO 3: DIAGNÓSTICO PRENATAL

3.3.- DIAGNÓSTICO GENETICO PREIMPLANTACIONAL

Dr. Julio Martín Rodríguez.

1. CLASIFICACIÓN ENFERMEDADES GENÉTICAS........................................................................... 1

2. PGT- A DIAGNÓSTICO GENÉTICO PREIMPLANTACIONAL DE ANEUPLOIDÍAS............................1

3. PGT-M DIAGNÓSTICO GENÉTICO PREIMPLANTACIONAL ENFERMEDADES MONOGÉNICAS.....6

ANEXO I. PREGUNTAS................................................................................................................... 9

Título de Experto Universitario en Medicina Genética y Genómica 2019 Página 0



Hoy en día las siglas para el diagnóstico preimplantacional son PGT (Preimplantational Genetic Test), antiguamente también se conocía como PGS (screening) o PGD (diagnosis). Ahora tenemos el PGT-A para aneuploidías, PGT-SR para reorganizaciones estructurales y PGT-M para enfermedades monogénicas.

1. CLASIFICACIÓN DE ENFERMEDADES GENÉTICAS

A continuación se muestra de manera resumida la clasificación de las enfermedadesgenéticas atendiendo al tipo de alteración:

Cromosómicas: alteración numérica o estructural en cuanto a la dotacióncromosómica. Tienen una incidencia del 3,8 por 1000.

Monogénicas: causadas por un único gen. Tienen una incidencia del 20 por 1000. Multifactoriales: además de componentes genéticos influyen también otros

factores ambientales. Tienen una incidencia del 646.4 por 1000. Mitocondriales: alteración en el ADN mitocondrial. Transmisión vía materna. Mutaciones somáticas (cáncer): entre 5-10% de los cánceres son hereditarios, y

son debidos a genes mendelianos.

Las enfermedades monogénicas y las cromosómicas son las que realmente podemosabordar, ya que desde el punto de vista del diagnóstico nos tenemos que centrar enaquellas donde el componente genético es principal, de cara a la manifestación de lossíntomas. También se está iniciando la detección y/o el diagnóstico en embriones del ADNmitocondrial (de herencia materna), a pesar de la heteroplasmia que implica que no entodas las mitocondrias se presenta la mutación y por tanto el % es variable. Esto hacecomplicado el diagnóstico. En cuanto a las enfermedades somáticas, no es aplicable eldiagnóstico embrionario, excepto a aquellos tipos de cánceres de susceptibilidadhereditaria y que están englobados en el grupo de patologías monogénicas.

El diagnóstico genético preimplantacional es un diagnóstico muy temprano que se da invitro. Lo que se quiere conseguir es tener un embrión mediante reproducción asistida parapoder analizar el material genético.

2. PGT-A DIAGNÓSTICO GENÉTICO PREIMPLANTACIONAL DE ANEUPOLIDÍAS

Las muestras que se pueden analizar son:

- corpúsculo polar en ovocitos, análisis solo del material materno.

- embrión, análisis de la información paterna y materna:

1) día 3, aquí el embrión tiene entre 6 y 8 células sin uniones intercelulares. Se utiliza unláser para perforar la zona pelúcida y mediante aspiración suave se obtienen una o doscélulas. Si hay mosaicismo y las células son diferentes se puede obtener un resultadoerróneo.

2) día 5, ya se ha dado la primera diferenciación celular. La técnica estándar hoy en día escoger muestras en este momento. Se toma una biopsia del trofoectodermo, que es la capaque dará lugar a las vellosidades coriales, aquí ya hay uniones intercelulares. Las células




que se extraen se lisan y se hace una amplificación de su material genético de formaaleatoria.

Si se transfiere a la mujer en el mismo ciclo que se ha estimulado, se conoce comotransferencia en fresco. También se puede hacer la transferencia de un embrión vitrificado(congelado) en otro ciclo menstrual, esto presenta ventajas a la hora de conseguir lagestación. El objetivo de todo esto es transferir embriones sanos para que las parejas,sobre todo con alto riesgo, no tengan que tomar decisiones de interrupción voluntaria delembarazo (TOP decisions). Para las parejas de bajo riesgo también se quiere evitar abortosrepetidos o gestaciones infructuosas.

3) blastocentesis, consiste en tomar líquido del bastocele. En este líquido se encuentra elADN de las células embrionarias que se han destruido. Lo están haciendo pocos grupos.

Las técnicas que se han utilizado para el análisis de los embriones han ido evolucionando(diapositivas 5 y 6).

- FISH (1990-2010). Se extraía el núcleo de la célula a analizar, se ponía en un porta y sehacía la hibridación con sondas fluorescentes específicas. Mediante microscopía defluorescencia se hacía el contaje de las sondas que habían hibridado. Los cromosomas quese podían analizar eran 15, 16, 17, 18, 21, 22, X e Y. Se piensa que con esta técnica seobtienen muchos falsos positivos. Se puede aplicar sobre corpúsculo polar o sobre célulaúnica en día 3.

- Arrays de SNPs, no se ha utilizado de forma generalizada. Illumina comercializa elKaryomapping con el que se pueden analizar todos los cromosomas mediante SNPs.

- PCR cuantitativa, no se ha utilizado de forma generalizada para la detección deaneuploidías

- Array-CGH. Se han utilizado arrays con sondas de BACs.

- NGS es la técnica más utilizada actualmente. Hay dos plataformas principales, la deIllumina y la de Thermo (IonTorrent). Con esta técnica se puede analizar el ADNmitocondrial además de poder detectar el mosaicismo.Es una secuenciación masiva en paralelo con un alto rendimiento, da una gran cantidad deinformación que tenemos que saber relacionar con el fenotipo. Se tiene que tener unabuena estructura para almacenar toda la información, y buenas herramientas debioinformática. Hay que ser capaces de trasladar los hallazgos a la práctica clínica.En investigación se está trabajando con niPGT-A que consiste en analizar el ADN que hanliberado los embriones al medio en el que han sido cultivados, así no hace falta biopsiarlos.Se están obteniendo buenos resultados.

Con el diagnóstico prenatal no invasivo cambia el tipo de muestreo (sangre materna) perola tecnología será la misma.

Ha habido controversia sobre la utilidad del PGT en los embriones. En la diapositiva 9 semuestran datos que nos dicen que sí que hay una ventaja si se analizan los embriones. Laprevalencia de aneuploidías aumenta con la edad materna. Estas aneuploidías estánrelacionadas con el número de abortos espontáneos. A mayor edad más abortos. Si se




analizan los embriones a nivel prenatal antes de implantarlos baja mucho la tasa deaneuploidías. Esto puede tener un gran beneficio para las parejas que se sometan a untratamiento de fecundación in vitro.

DIAPOSITIVAS 3-10

Indicaciones del PGT-A

1) Edad materna avanzada

El objetivo del PGT-A es mejorar las tasas de gestación de las parejas con baja fertilidad. Con más de 12.000 ciclos y más de 60.000 embriones analizados se ha visto que se puede conseguir. A medida que avanza la edad materna la incidencia de aneuploidías aumenta y la posibilidad de encontrar embriones aptos para transferir disminuye. En nuestra sociedad se está retrasando la maternidad, y muchas parejas después de un tiempo sin conseguir un embarazo deciden acudir a las clínicas de fertilidad. En la diapositiva 11 se muestra que a cierta edad materna con el PGT-A (anteriormente PGS) aumentan las posibilidades de gestación por cada embrión transferido. Una de las indicaciones principales del PGT-A es la edad materna avanzada (38-41 años). En este escenario se dan unas tasas de nacimiento mayor con PGT-A que solo haciendo el análisis morfológico de los embriones.El PGT-A también hace que disminuya de manera drástica la tasa de abortos espontáneos en mujeres de edad avanzada.En Estados Unidos se considera edad materna avanzada a partir de 35 años, en Europa a partir de 38 años.

2) Anomalías cromosómicas estructurales en la pareja

Si uno de los miembros de la pareja tiene una anomalía cromosómica estructural equilibrada, no presenta síntomas. Esto es muy frecuente, 1/250 de las muestras prenatales y un 0.2% de los recién nacidos presentan este tipo de anomalías. Suelen ser translocaciones o inversiones. - Las translocaciones pueden ser recíprocas o robertsonianas (diapositiva 12).- Las inversiones son fragmentos que se cortan, se dan la vuelta y se vuelven a insertar. Esto provoca desapareamientos entre los cromosomas durante la meiosis y la mitosis, que dan lugar a errores en las divisiones celulares.

3) Aborto espontáneo recurrente

Ocurre cuando en una pareja se dan dos o tres abortos consecutivos. Puede ser que haya implantación pero no evolución. Aquí el PGT-A mejora las tasas de gestación e implantación.

4) Fallo repetido de implantación




Ocurre cuando se dan tres fallos de implantación en tratamientos de IVF. Puede que los embriones sean de calidad pero no se consigue la implantación. Con el PGT-A se mejoran las tasas de implantación.

5) Factor severo de infertilidad masculina. Pocos espermatozoides o de poca calidad.

6) Embarazo trisómico previo

Hay estudios que muestran que la transferencia de un solo embrión en pacientes de buenpronóstico es más eficaz si se hace PGT-A y examen morfológico, que si solo se examina lamorfología (diapositiva 14). Esto nos indica que el análisis cromosómico tiene ventajas.

DIAPOSITIVAS 11-14

Tecnologías aplicadas y evolución

La técnología más utilizada para la determinación de aneuploidías es la secuenciaciónmasiva. En la diapositiva 15 se muestran los pasos del procedimiento de NGS:

- se extrae el ADN de la muestra- se hace una amplificación de todo el genoma para tener más ADN- se etiquetan las células añadiendo una secuencia específica al ADN de esa célula, asípodremos reconocer los diferentes embriones- se crea la librería, enriqueciendo la región de interés o capturándola con sondas- secuenciación- se alinea y ensambla mediante herramientas de bioinformática.

Podemos hacer dos tipos de análisis:

1) Targeted genome sequencing (secuenciación dirigida)2) Whole genome sequencing (secuenciación de todo el genoma)

En el targeted genome sequencing se puede incrementar la cobertura de las regiones deinterés. Se pueden diseñar estrategias con sondas o con amplicones para capturar lasregiones de interés, que son las que se van a secuenciar. Hasta hace poco esto era másbarato que secuenciar todo el genoma, pero está cambiando y se están equiparando losprecios. Si leemos menos regiones podemos poner más muestras cada vez (higherthroughput).

En el targeted genome sequencing se puede analizar todo el genoma (22.000 genes), elexoma clínico (4800 genes) o paneles de genes (500-100 genes).

El análisis de aneuploidías se basa en whole genome sequencing de muy baja cobertura. Elnúmero de muestras va a depender de la plataforma. Cuando se buscan enfermedadesmonogénicas se hace un análisis más concreto de determinados genes.




En las diapositivas 16 y 17 se puede ver un resultado normal de NGS y un resultado conalteraciones. Se hace la secuenciación de 3-4 células de cada embrión a la vez. En el primergráfico de la diapositiva 17 se ve una monosomía del cromosoma 18, en el segundo se venganancias o pérdidas en diferentes cromosomas, y el tercero corresponde a un embrióncaótico o con células caóticamente diferentes entre ellas. Si este último fuera un fallo deamplificación se vería un perfil muy aserrado en todos los cromosomas.

Las ventaja de trabajar con NGS es que se pueden buscar aneuploidías y enfermedades monogénicas a la vez. Hoy en día, para una pareja que tenga riesgo de una enfermedad monogénica se hace también el análisis de aneuploidías en el embrión, porque se ha visto que esto mejora el éxito de implantación del embrión. Antes se cogían dos biopsias, con una se hacía el array para buscar aneuploidías y con la otra se hacían técnicas de Sanger o PCR para buscar enfermedades monogénicas. Ahora se coge una sola biopsia de trofoblasto, se hace el whole genome amplification, se etiqueta el material amplificado, se enriquece la región de interés y se secuencia. Se utiliza el genoma humano de referencia para determinar las CNVs.

Se ha visto que determinar la cantidad de ADN mitocondrial que tiene un embrión, ayuda en el éxito de la implantación. Mediante NGS también se puede determinar si existe mosaicismo.

Las diferentes plataformas de NGS dan diferentes rendimientos. La plataforma de Thermo que usan en Igenomix permite analizar 96 embriones simultáneamente. El coste por muestra es mayor cuantas menos células se carguen.

Mosaicismo

Ya se intentó ver el mosaicismo en los embriones con el array-CGH, pero no ha sido hasta la utilización de las técnicas de NGS que se han podido transferir embriones después de determinar su mosaicismo. En el primer artículo de Greco et al. (2015), se determinó el mosaicismo de varios embriones, se transfirieron en diferentes escenarios y se obtuvieron niños sanos. Parecía que el mosaicismo influía menos de lo que se esperaba en el éxito reproductivo. En trabajos posteriores se vio que hay un rendimiento clínico menor cuando se transfieren embriones con mosaicismo. Los posibles estados de mosaicismo son: que la masa interna sea diferente al trofoblasto (el trofoblasto es lo que dará lugar a la placenta), mosaico dentro de la capa interna, mosaico en el trofoblasto o mosaico en las dos capas (diapositiva 18). En estos embriones dependiendo de la biopsia que se coja se obtendrá un resultado u otro.

La NGS nos permite conocer estos diferentes grados de mosaicismo. Se necesita más investigación para saber las ventajas que aporta conocer el grado de mosaicismo de un embrión y en qué momento se puede aplicar para tener un mayor éxito.

DIAPOSITIVAS 15-19




Como ya se ha dicho, está claro que la incidencia de aneuploidías aumenta con la edad materna, pero también está presente en donantes de ovocitos, que son población joven. Al aumentar la edad materna desciende el número de embriones que se pueden transferir, porque las mujeres con edad avanzada tienen menos embriones y además muchos de ellospueden presentar anomalías. En la diapositiva 21 se muestra una gráfica en la que se ven las tasas de gestación sin selección por PGT-A y con selección por PGT-A en diferentes edades maternas. La tasa de transferencia es menor en el grupo con edad materna avanzada, pero si hay transfer la tasa de gestación evolutiva es mucho mayor en este grupo.

En conclusión, para el análisis de aneuploidías:

- actualmente se pueden analizar los 24 cromosomas mediante NGS.- la biopsia se hace en día 5-6 y la transferencia se puede hacer en el mismo ciclo o en otro posterior.- el PGT-A mejora la tasa de nacidos vivos, disminuye la tasa de abortos y las gestaciones múltiples, ya que se suele transferir un solo embrión.- el PGT-A disminuye el tiempo que una pareja tiene que esperar para conseguir una gestación, y con ello precio del tratamiento.- el futuro está en el análisis no invasivo, sin necesidad de biopsia

DIAPOSITIVAS 20-22

3. PGT-M DIAGNÓSTICO GENÉTICO PREIMPLANTACIONAL EN ENFERMEDADES MONOGÉNICAS

Las enfermedades monogénicas no son significativas de manera individual, pero sí en su conjunto. Hay 1-3% de incidencia de estas enfermedades en la población. En la web de OMIM vemos que cada mes hay nuevos genes que se asocian a fenotipos patológicos. En total hay unos 5000 genes relacionados con enfermedades en las que se conoce bien la base molecular.

Se hace un estudio de portadores para determinar las parejas en riesgo, y ofrecerles diagnóstico preimplantacional, prenatal o tratamiento postnatal.

En este caso no son parejas que entran en reproducción asistida porque no consiguen un embarazo, sino que ya saben que tiene el riesgo de tener un hijo con una enfermedad monogénica. Aquí la biopsia también se hace en día 5-6.

En la diapositiva 26 se muestra un diagrama de flujo de lo que ocurre. Una familia tieneantecedentes familiares de una enfermedad monogénica y pregunta si se puede hacer PGD.Lo primero es ver si la mutación está identificada o no. Si no está identificada tenemos queacceder a ADN de algún afectado (puede ser un hijo que haya fallecido), para poder




identificar la mutación y el haplotipo ligado. Una vez la mutación está identificada tenemosque ver si ya existe un protocolo diseñado. Si ya está diseñado se hace un test deinformatividad, prueba preliminar para poder empezar con la reproducción asistida. Si nohay protocolo disponible lo tendremos que desarrollar. Si no se llega a desarrollar se puedeofrecer el cambio de gameto o el diagnóstico prenatal.

Fases

1. Pre PGT-A: En esta primera etapa hay que establecer si realmente la indicaciónpermite seguir adelante. Se hace un diseño previo con la estrategia molecular a seguir. Sesolicitan las muestras necesarias a la pareja (sangre, células bucales, linfocitos individualesy otros). Normalmente se hace el análisis en linfocitos. También se pueden requerirmuestras de otros familiares. Se desarrolla un test genético que confiere valor para poderabordar posteriormente el análisis de los embriones.

Para el diseño existen multitud de herramientas online de bases de datos deenfermedades: una vez se tiene la mutación o gen/haplotipo, se trata de buscar lalocalización, identificar los marcadores, diseñar primers, etc. El diagnóstico puede serdirecto, sobre la mutación, o indirecto, mediante la identificación de marcadores (STRs oSNPs). Normalmente hoy en día se hace un diagnóstico combinado de la mutación másmarcadores indirectos. Como estamos trabajando con tan poco material, por el fenómenode allele drop out, puede ser que perdamos parte de la información de los alelos que nosinteresan, por esto es conveniente también utilizar marcadores. No se suele hacer solo eldiagnóstico directo.Si no se tiene identificada la mutación pero el diagnostico clínico es claro se pueden usarsolo marcadores. Esto se hace para genes como el PKD1 de la poliquistosis renal, ya que esmuy complejo y caro de analizar. Se intenta utilizar marcadores intragénicos oextragénicos pero muy próximos al gen.

DIAPOSITIVAS 25-31

Los métodos que se usan para detectar estos marcadores y mutaciones suelen estarbasados en PCR, arrays (plataforma comercial Karyomapping de Illumina) o NGS.Otro método imprescindible a día de hoy es el WGA (whole genome amplification): se lisa lacélula y se hace una amplificación random de todo el genoma. A partir de aquí se puedenhacer análisis simples de las regiones de interés (PCRs individuales y Sanger) oamplificaciones múltiples más NGS de las regiones de interés.Para el análisis de fragmentos por plataformas Sanger (Thermo), mediante fluorescenciapodemos ver el tamaño de los fragmentos. También se podría utilizar el RFLP (RestictionFragment Lenght Polymorphism), pero ya está anticuado y no se usa. Se ha substituido entodos los laboratorios por la minisecuenciación. En la minisecuenciación o Snapshot, solose interroga el nucleótido de interés. Se para la amplificación con ddnucleótidos y se mirael último nucleótido incorporado, que estará marcado. También se pueden utilizar SNParrays o secuenciación masiva.




En la diapositiva 34 se ven los resultados de ensayos de enfermedades monogénicasmediante NGS con la tecnología de Illumina. Si se hace un diseño de amplicones dirigidosespecíficamente a mutaciones (parte derecha del gráfico), se tiene que hacer un análisisbioinformático de esos amplicones que nos permita ver si se ha hecho una buena capturade la región de interés. Puede ser que se de una eficiencia de amplificación diferente. Aveces si hay dos mutaciones próximas en una región se tendrán que diseñar ampliconessolapados y hacer un proceso bioinformático de Soft-clipped para que una mutación noquede enmascarada por los primers de la otra. Todas estas complicaciones se tienen quedeterminar antes de lanzar un test clínico.Si se hace el análisis por sondas tenemos un patrón como de montaña (parte izquierda delgráfico). La parte de arriba representa la cobertura, vemos que la zonas flanqueantestambién tienen buena cobertura, y esto puede ser bueno para ciertas variantes de splicingo intrónicas que no estén muy alejadas.

DIAPOSITIVAS 32-39

En la diapositiva 40 se muestran los datos históricos desde que se empezó con el PGT-M enel 2001. Ha aumentado el número de casos y el número de enfermedades analizadas. En la diapositiva 41 se ve un análisis para Huntington, con amplificación por PCR y análisisde fragmento. Para evitar la contaminación materna también se miran marcadores (picosen verde). Las dos primeras líneas corresponden a la madre y al padre, y las dos siguientesa dos embriones. La línea punteada es el límite entre expansiones normales y patogénicas.Vemos que el segundo embrión tiene los mismos marcadores que la madre, que tambiéntiene la expansión. En este embrión se ha dado una contracción de la expansión, aunquesigue siendo patogénica.

Se podría decir que el 80% de las peticiones de análisis embrionario por enfermedadesmonogénicas son de enfermedades frecuentes (Huntington, fibrosis quística, distrofiamiotónica, beta-talassemia, distrofia muscular espinal, Duchenne), el otro 20% sonenfermedades específicas (síndrome de Lynch, Von Hippel-Lindau, etc.) en el que se tendráque desarrollar un protocolo específico para esa pareja

En la diapositiva 42 se muestra para cada enfermedad común (atrofia muscular espinal,fibrosis quística, X frágil, poliquistosis renal dominante, beta talassemia o anemiafalciforme, síndrome de Steiner, Huntington, hemofilia, neurofibromatosis, Charcot- Marie-Tooth tipo 1A, y Duchenne) el porcentaje de transferencias, de gestación y de aborto.A día de hoy se han analizado más de 400 enfermedades monogénicas y la tasa degestación está en 40-45%. Lo que se quiere es analizar a la vez aneuploidías yenfermedades monogénicas.Se puede hacer el diagnóstico de mutaciones asociadas a cáncer hereditario de mama yovario (BRCA1 y BRCA2) (diapositiva 46). Los portadores pueden ser tanto la madre comoel padre.DIAPOSITIVAS 40-46




En la diapositiva 47 se ve el diagrama de flujo del PGT-M:- se hace un análisis de sangre de los dos miembros de la pareja y de otro familiar afecto- la clínica inicia la estimulación y acumula ovocitos vitrificados- se hace el ICSI para crear los embriones- se hace la biopsia en día 5-6- se hace una amplificación genómica- se leen los resultados- decisión del diagnóstico- transferencia de uno o dos embriones sanos. Si hay más embriones sanos se vitrifican porsi se necesitan más adelanteEn el registro histórico aumenta el número de ciclos de diagnóstico de PGT-M debido alincremento de peticiones para nuevas patologías. En Igenomix tienen una lista abiertapara enfermedades monogénicas con el gen asociado. Hay casos especiales que no estánpermitidos por la ley. Por ejemplo, en España si se quiere analizar un gen asociado acáncer, la petición tiene que ser evaluada y autorizada por una comisión nacional.A veces puede ser que un embrión normal para la enfermedad monogénica estudiadatenga alguna aneuploidía.

DIAPOSITIVAS 47-49

ANEXO I. PREGUNTAS

1. Si el padre es el que tiene la mutación ¿Se tiene que hacer todo el ciclo dereproducción asistida?

Sí, se tiene que hacer todo exactamente igual. Si la mutación es masculina lo ideal seríapoder analizar los gametos y elegir uno correcto, pero hoy en día el analizar los gametosmasculinos significa destruirlos, después no se pueden utilizar para el tratamiento.

2. ¿Sería recomendable hacer PGS a todas las parejas que quieren hacerreproducción asistida?

Hay datos que dicen que sí. No se les puede obligar pero se les recomienda. Si la parejatiene riesgo de enfermedad monogénica y necesita reproducción asistida, la ley obliga ahacer PGD. Para las parejas en general que entran a reproducción asistida, la ley no diceque se tengan que analizar genéticamente sus embriones, pero los datos con NGS, indicanque se puede llegar a mejorar un 20% haciendo PGS.

3. ¿Cómo se hace cuando hay un fallo de implantación?




Hay un test que se llama ERA (endometrial receptivity array), basado en ARN, que analizaperfiles de expresión génica para determinar si la mujer está en fase receptiva (ventana deimplantación).


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