diagnóstico del complejo respiratorio porcino paso a paso · diagnóstico del complejo ....

14 n SUIS Nº 94 Enero/Febrero 2013

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Diagnóstico del complejo respiratorio porcino paso a paso

Resumen

El diagnóstico del complejo respiratorio porcino (CRP) suele ser com-plicado, ya que están implicados diversos patógenos de distintas natura-leza, por lo que es necesario seguir una sistemática lógica que combine distintos elementos de juicio. El cuadro clínico suele ser inespecífico y requiere de un diagnóstico anatomopatológico macroscópico y el uso de distintas técnicas complementarias que faciliten la identificación de los agentes involucrados. Dichas técnicas incluyen la histopatología, las téc-nicas de tinción específicas, las determinaciones serológicas y el uso de biología molecular (PCR, PCR en tiempo real o hibridación in situ). Uno de los puntos clave es la toma correcta de muestras que evitará errores de diagnóstico. También es de gran ayuda conocer las distintas pruebas complementarias disponibles para cada agente y la muestra adecuada para su realización.

Palabras clave: Complejo respiratorio porcino, toma de muestras, técnicas diagnósticas

Summary

The diagnostic procedure of Porcine Respiratory Disease Complex step by step

The diagnosis of Porcine Respiratory Disease Complex (PRDC) is difficult because there are different pathogens involved, so it is necessary to follow a logical and systematic procedure combining different diagnostic tools. Clinical picture is quite non-specific and needs for a macroscopic pathological diag-nosis and the use of a wide range of complementary diagnostic techniques. Such techniques include histopathology, specific staining techniques, serolo-gy and molecular biology (PCR, q-PCR and in situ hybridization). One key po-int is the correct sampling that will avoid diagnostic errors. It is also necessary to know the different complementary techniques available for each pathogen that can be involved in the process and which is the best sample to run them.

Keywords: Porcine Respiratory Disease Complex, sampling, diagnostic techniques

Guillermo Ramis1 y Francisco José Pallarés2

Imágenes cedidas por los autores

Contacto con los autores: 1 Departamento de Producción Animal. Facultad de Veterinaria - Universidad de Murcia. 2 Departamento de Anatomía y Anatomía Patológica Comparadas. Facultad de Veterinaria - Universidad de Murcia

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SUIS Nº 94 Enero/Febrero 2013 n 15

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Figura 1. Esquema de diagnóstico en cualquier proceso que afecte a un colectivo.

El complejo respiratorio porcino (CRP) se caracteriza precisa-mente por su complejidad, ya que puede implicar la acción si-

nérgica de diversos patógenos de tipo víri-co y bacteriano (primarios u oportunistas), junto con estrategias de manejo inadecua-das y condiciones ambientales deficientes. Los patógenos primarios son aquellos capaces de inducir enfermedad clínica y lesiones por sí mismos, y dentro de este grupo se incluyen virus como el del sín-drome respiratorio y reproductivo por-cino (PRRS), circovirus porcino tipo 2 (PCV2), virus influenza porcino y el virus de la enfermedad de Aujeszky; y bacte-rias como Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bor-detella bronchiseptica y algunas cepas de Pasteurella multocida. Los patógenos oportunistas son aquellos que generalmente inducen una enferme-dad subclínica, a menos que el cerdo se encuentre inmunodeprimido o la infección esté complicada por otros virus o bacte-rias, y dentro de este grupo se incluyen el

coronavirus respiratorio y el citomegalo-virus porcinos, la mayoría de cepas de P. multocida, Streptococcus suis, Haemo-philus parasuis y Mycoplasma hyorhinis.A la hora de determinar si en una ex-plotación existe un proceso de este tipo, como en todo diagnóstico, hay que em-plear una sistemática aplicada que siga una secuencia lógica (figura 1). En los úl-timos años hemos visto cómo a menudo se intenta hacer un diagnóstico saltando directamente del diagnóstico clínico a las determinaciones laboratoriales, y esto sólo puede conllevar errores. La lógica dice que a partir de un diagnóstico clínico presuntivo basado en la inspección de los animales y las instalaciones, y mediante el uso de la anamnesis y los datos históricos debemos pasar al diagnóstico anatomo-patológico macroscópico (figura 2). Esta es la única forma de entender qué está pa-sando y darle valor a los animales muer-tos, que de otro modo sólo son pérdidas. A partir de ahí nos plantearemos qué tipo de muestras tomar para las distintas prue-bas laboratoriales complementarias.

DIAGNÓSTICO CLÍNICOComo ya hemos indicado, el diagnóstico clínico debe ser el primer paso. La clínica del complejo respiratorio puede ser muy inespecífica, puesto que los principales signos de la mayor parte de los patógenos implicados son puramente respiratorios: estornudos (sobre todo en los pródromos de la enfermedad), secreción nasal y ocular y toses que pueden ser de distinta natura-leza (seca, productiva, paroxística, etc). Y además, hay que tener siempre en cuenta la perspectiva del diagnóstico colectivo, ya que excepto en el caso de las cerdas, donde se hace un diagnóstico más individualiza-do, en todas las demás fases productivas tendremos que diagnosticar y tomar accio-nes terapéuticas para todo el colectivo. La expresión clínica tiene una clara relación con la patogenia de los distintos agentes y con el tipo de lesión que producen.Obviamente lo primero a observar será la actitud de los animales (estado de alerta, letargia, disposición a moverse), aspecto externo (estado de la piel, calidad y canti-dad de pelo, color de las mucosas, estado de carnes, etc.), consumo de agua y pien-so (aspecto del abdomen de los animales, llenado de las tolvas, falta de orina y he-ces en el suelo de las cuadras). A partir de esas observaciones nos fijaremos en los síntomas específicos antes citados: ruidos respiratorios (tos y estornudos), frecuen-cia respiratoria, dificultad en la respiración (respiración brusca y/o abdominal), fiebre y presencia de exudados y secreciones en ollares y ojos. Además, en ocasiones, pode-mos encontrar síntomas no respiratorios: síntomas nerviosos, síntomas digestivos (como el vómito), alteraciones anatómicas como la desviación nasal y alteraciones re-productivas como abortos (bien por la pro-

Figura 2. Necropsia de campo de un cerdo con complejo

respiratorio porcino.

Diagnóstico clínico Anamnesis

Datos históricos

Inspección de animales

Necropsia de campo

Necropsia reglada

Histopatología

Microbiología

Serología

Toma de muestras

PCR

Aguas

Pienso

Diagnóstico anatomopatológico

macroscópico

Determinaciones laboratoriales



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pia acción del patógeno, como en el caso de PRRS, o indirectamente por la hipertermia como la que produce el virus influenza).

DIAGNÓSTICO ANATOMOPATOLÓGICOTal y como hemos comentado anterior-mente, a la hora de dirigir el diagnóstico es muy importante realizar una detallada ins-pección macróscopica de las lesiones. En el caso del pulmón, las características mor-fológicas del proceso inflamatorio nos van a dar información de gran importancia, como la vía de llegada del agente al pul-món (aerógena o hematógena), el lugar de asiento de la reacción inflamatoria (alvéo-lo o septo) y el mecanismo patogénico del agente involucrado. Los diferentes tipos de neumonías que nos podemos encontrar es-tán recogidos en la figura 3.

BronconeumoníasLas bronconeumonías están causadas por bacterias que penetran en el pulmón por vía aerógena y afectan a los lóbulos apicales y medios, que presentan una intensa colo-ración rojiza y un acentuado aumento de consistencia y de tamaño, puesto que la re-

acción inflamatoria se localiza en el alveolo. Dentro de este modelo neumónico se in-cluyen dos subtipos, la bronconeumonía fibrinosa y la catarro-purulenta.

n La bronconeumonía fibrinosa está pro-ducida por bacterias de alta virulencia y se caracteriza por el depósito de fibrina en la pleura. Las zonas afectadas suelen sufrir ne-crosis o ser asiento de intensas hemorragias. Si el proceso se croni-fica aparecerán focos de necrosis demarca-dos por una cápsula de teji-do conectivo. Producen este tipo de neumonía bacterias como A. pleuropneumoniae o algunas cepas de P. multocida.

n La bronconeumonía catarro-purulenta se caracteriza por la presencia de un exudado mucoso y/o purulento en vías aéreas. En las formas crónicas se pueden obstruir los bronquios, formándose abscesos en los ló-bulos apicales y/o medios. Pueden causarla bacterias como B. bronchiseptica, S. suis o algunas cepas de P. multocida.

Neumonías broncointersticialesEn las neumonías broncointersticiales el agente etiológico puede ser un virus o un micoplasma que llega al pulmón por vía aerógena y provoca una reacción infla-matoria en los septos, que afecta a los lóbulos apicales y medios. Estos presen-tan una coloración rojiza, un aumento de consistencia y, en menor medida, un aumento de tamaño (figura 4). Entre los agentes causantes de este tipo de neu-monía se encuentran el virus influenza y M. hyopneumoniae.

Neumonías embólicasLas neumonías embólicas se presentan en procesos septicémicos, por lo que las bacterias llegan al pulmón por vía san-guínea y se distribuyen por todo el órga-no. Así, se desarrollan lesiones focales, de entre 1 mm a 2 cm de diámetro, que en las formas agudas suelen estar rodea-das por un halo rojizo, mientras que en las formas crónicas habitualmente apa-recen delimitadas por una banda de teji-do conectivo (figura 5). Causan este tipo de neumonías bacterias como S. suis o Arcanobacterium pyogenes.

Figura 4. Neumonía broncointersticial.

Figura 3: Esquema con los diferentes tipos de neumonías (Fuente: Carrasco et al. Diagnóstico diferencial de las enfermedades del cerdo.

Enfermedades respiratorias. Suis 2009).

Bronconeumonías

Embólica

Fibrinosa Catarro-purulenta

Sin aumento de tamañoAusencia de pleuritis

Aeró

gena

Hem

atóg

ena

Aumento de tamaño, pleuritis

Broncointersticiales

Intersticiales

Difusa Multifocal



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Neumonías intersticialesLas neumonías intersticiales están causa-das por virus que llegan al pulmón por vía hematógena, de manera que la reac-ción inflamatoria se localiza en los septos alveolares. Aunque resulta afectado todo el pulmón, que presenta una consistencia firme o gomosa, la lesión puede ser difu-sa, de forma que el órgano mostrará una coloración normal o multifocal, donde solo algunos lobulillos muestran un color rojizo. Entre los virus que pueden causar-la destacamos el virus del PRRS, PCV2 y coronavirus respiratorio.

Importancia de la histopatologíaLa histopatología es una técnica muy sensible pero muy poco específica. En los pulmones, como hemos visto ante-riormente, hay lesiones que pueden estar causadas por más de un agente patógeno, por lo que son necesarias otras pruebas complementarias para poder alcanzar un diagnóstico definitivo. No obstante, co-nocer el tipo de lesión puede aportar una valiosa información sobre el o los posi-bles agentes causales. En la práctica, los veterinarios de campo muchas veces solicitan directamente prue-bas complementarias y no piden estudios histopatológicos, y a veces, cuando los resultados de los estudios complementa-

rios no están claros, saber la lesión que aparece en los órganos dañados puede darnos la pista definitiva para completar el diagnóstico y saber qué agente es el que nos está causando la enfermedad.

TOMA DE MUESTRASLa recogida de muestras en campo, así como su envío al laboratorio, pueden con-dicionar la realización y los resultados de las pruebas diagnósticas laboratoriales.

Toma de muestras de sangrePara la extracción de muestras de sangre se usan tubos de vacío tipo Vacutainer (tapón rojo —sin aditivos— para suero y tapón verde —heparina— o morado —EDTA— para sangre entera), y se emplean distintos tamaños de aguja (siempre estériles) de-pendiendo del tipo de animal a muestrear. La extracción de sangre en los cerdos se ve dificultada por la propia conformación corporal del animal, ya que la cobertura grasa hace que el acceso a los vasos sea complicado, agravado en algunos casos por la capa oscura del animal. Los puntos de extracción más accesibles son la vena lateral de la oreja, grandes vasos del cue-llo y porción craneal del tórax, vena cau-dal de la cola y seno retroftálmico. El envío se debe hacer lo más rápido posi-ble, por lo que se suelen emplear servicios

de mensajería que en cuestión de horas transportan la muestra a cualquier punto del país. Sin embargo, se debe hacer con unas condiciones mínimas:

n Para evitar que los tubos se vuelquen podemos usar las mismas gradillas de po-liestireno expandido en las que normal-mente vienen los tubos de toma de mues-tras, usando cinta adhesiva para fijarlos a la misma. Si enviamos sueros podemos introducirlos en tubos tipo Eppendorf que también se pueden introducir en una gradilla del mismo tipo y fijarlos también con cinta adhesiva.

n Identificación: las muestras deben ir identificadas individualmente mediante las etiquetas que van adheridas a los tu-bos. Además, debemos acompañar las muestras de una pequeña anamnesis y un cuadro de identificación escrito en papel con objeto de facilitar la tarea del labora-torio. Muchos laboratorios disponen de sus propios formularios de identificación y anamnesis.

n Conservación: la sangre no se puede congelar, ya que se produce hemólisis y el suero posteriormente es muy sucio y a veces no apto para el análisis. Los sueros en cambio sí se pueden congelar, aunque debemos saber que si lo que queremos es identificar la presencia de antígeno o ge-noma de virus, los virus ARN son más lábiles y por tanto, una parte se perderá a lo largo del tiempo. Si el análisis a realizar es serológico o el virus es ADN, la con-servación en congelación será adecuada. Para el transporte podemos usar neve-ras isotermas de poliestireno expandido (incluso las mismas que usan los labo-ratorios para enviarnos las vacunas) que ayudarán a conservar la temperatura de la muestra, y no debemos olvidar incluir algunos bloques refrigerantes que asegu-ren el mantenimiento de dicha temperatu-ra. Finalmente sellaremos las neveras con cinta adhesiva o precinto para evitar que se abran durante el transporte.

n Sistema de envío: como dijimos ante-riormente los más adecuados son los ser-vicios de mensajería urgente, que en cues-tión de pocas horas trasladan nuestras muestras a cualquier punto de España. Incluso algunos de estos servicios hacen transporte refrigerado. Debemos enviar las muestras, si es posible, a principios de semana, puesto que si las muestras llegan, por ejemplo, un viernes por la tarde al la-boratorio, es posible que no se conserven bien hasta el lunes.

Figura 5. Neumonía embólica.



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n Bioseguridad: como estamos trabajan-do con material potencialmente infec-cioso debemos imponernos un mínimo de bioseguridad en nuestros envíos. Una idea es colocar los tubos que contengan la muestra en contenedores intermedios, por ejemplo frascos para toma de muestras de orina, de modo que vayan más protegidos frente a golpes durante el transporte. Los contenedores intermedios se pueden relle-nar de papel, de modo que si escapara el contenido de alguno de los tubos, el papel lo empaparía y se reduciría la posibilidad de pérdidas. En cualquier caso, el uso de las neveras de poliestireno expandido, que son bastante gruesas, ayuda a que las muestras no se dañen durante el transpor-te y reducen la posibilidad de escapes de material biológico.

Toma de muestras de tejidos para histopatologíaLas muestras deben ser extraídas lo antes posible, han de incluir un fragmento de

la lesión y las zonas adyacentes de apa-riencia macroscópica normal. Si existen dudas acerca de los cambios observados, es aconsejable el envío de muestras de los órganos principales, aunque presen-ten apariencia normal, ya que podrían aportar información complementaria. Se adjuntará un historial clínico con los da-tos relevantes, referidos tanto al animal como al colectivo de procedencia, así como una descripción detallada y objeti-va de las lesiones macroscópicas.El fijador habitual utilizado para histopa-tología es el formol al 10%, que consiste en una solución formada por una parte de formol comercial o formalina (formal-dehído al 40%) y nueve partes de agua corriente (del grifo); también se puede utilizar para la dilución solución salina o tampón. El volumen del fijador será, como mínimo, diez veces superior al de la pieza (figura 6). El grosor de la muestra no deberá exceder de un centímetro, ya que debido a la velocidad de penetración

del formol en los tejidos, si la muestra es más gruesa puede quedar sin fijar en la porción central, por lo que entrará en un proceso de autolisis y no servirá para el estudio histopatológico. Es de gran importancia incidir en que el material congelado no es apto para el es-tudio histopatológico, ya que los crista-les que se forman durante la congelación suelen desgarrar el tejido y a veces esto impide llegar a un diagnóstico definitivo.

Toma de muestras de tejidos para microbiologíaPara el estudio microbiológico se deben tomar las muestras con las mayores con-diciones higiénicas posibles, evitando que haya contacto entre unas muestras y otras para impedir contaminaciones cruzadas. Por ello, se deben tomar las piezas con unos guantes limpios y depositarlas den-tro de contenedores aislados (pueden uti-lizarse bolsas de plástico con autocierre o botes estériles de muestras) e identificarse correctamente. Las muestras deben mantenerse en refri-geración hasta el momento del envío, que ha de realizarse en unas condiciones simi-lares a las expuestas anteriormente para las muestras de sangre.

Toma de muestras de tejidos para PCRPara los estudios de PCR pueden enviar-se muestras de tejido refrigeradas, por lo que la toma de muestras puede realizar-se en las mismas condiciones de higiene

Figura 6. Toma de muestras para histopatología: relación

correcta entre volumen de fijador y volumen de muestra.

Tarjetas FTA

El problema de las muestras potencialmente infecciosas que impedía, por ejemplo, enviarlas a laboratorios fuera de España (o incluso el riesgo que comportaba el envío dentro del país) se ha solventado gracias a las denominadas tarjetas FTA. Éstas son tarjetas de papel que contienen elementos químicos gracias a los cuales se lisan todas las células contenidas en una muestra y solo se preservan los ácidos nucleicos. De esta forma, el ADN o el ARN se pueden conservar a temperatura ambiente y se pueden enviar por correo en un sobre. La capacidad infectiva de las muestras desaparece completamente. Se puede tomar muestras tanto de sangre, leche y exudados como de tejidos. Como inconveniente, hay que decir que el rendimiento en cantidad de ADN o ARN aislado normalmente es inferior al que se puede obtener de una muestra fresca.



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que las muestras para bacteriología. Una vez tomadas e identificadas también pue-den mantenerse en congelación hasta el momento de ser enviadas al laboratorio. Para mantener el estado de congelación durante el envío es recomendable utilizar nieve carbónica y contenedores de polies-tireno expandido.También se pueden obtener muestras de fluidos traqueobronquiales (FTB) o lí-quidos broncoalveolares (LBA). Estos dos tipos de toma de muestras están en boga últimamente. El primero consiste en introducir una sonda a través de las vías respiratorias e introducir 15-20 ml de un medio como PBS para, a continuación, aspirar dicho líquido arrastrando los pa-tógenos que se encuentren en la luz de las vías respiratorias. La toma de LBA consis-te en la introducción de una sonda en las vías respiratorias de forma más profunda y la obtención del fluido que se encuen-tra en el límite de bronquiolos y alveolos respiratorios sin introducir ningún medio de lavado. La ventaja del LBA es que no se diluye, lo que mejora la sensibilidad de algunas técnicas moleculares.

Toma de muestras de fluido oralEl fluido oral se ha convertido en los últi-mos años en uno de los materiales biológi-cos sobre los que más se está investigando. Actualmente se están desarrollando diver-sas técnicas para la detección de patógenos involucrados en el CRP, tanto de los anti-cuerpos producidos frente a ellos como de los propios agentes mediante PCR. Tiene la ventaja de que la toma de mues-tras es relativamente sencilla, puesto que se basa en dejar a disposición de los animales cordones de algodón que éstos muerden e impregnan de fluido oral. Pos-teriormente, el prensado de dichos cordo-nes permite recoger la muestra que poste-riormente se analizará. Como desventaja, cuando se utiliza en cuadras colectivas se puede diluir la cantidad de anticuerpos o de patógeno presente y caer por debajo del umbral de detección de las técnicas moleculares o serológicas.

PRUEBAS COMPLEMENTARIAS LABORATORIALESUna vez que hemos realizado un buen diagnóstico presuntivo a partir de la ob-servación clínica y la anatomía patoló-gica, normalmente acudimos a técnicas laboratoriales complementarias para di-

SerologíaLas técnicas serológicas son las que más habitualmente se aplican al diagnóstico del CRP. El elemento de determinación será el suero o el plasma. El principal inconvenien-te de estas técnicas es que sólo nos indican, de forma indirecta, el contacto del animal con un patógeno en concreto, pero esto no implica que dicho patógeno esté ejerciendo su efecto sobre el animal en el momento del análisis. Las estrategias para determinar si efectivamente el patógeno está involucrado serán la dinámica serológica y el seroperfil. Dinámica serológica y seroperfilesLa dinámica serológica consiste en repetir el análisis con un periodo de dos o tres

Figura 7. Técnica de inmunofluorescencia: antígeno de

M. hyopneumoniae sobre las células del epitelio de un

bronquiolo.

Figura 8. Técnica de inmunoperoxidasa: antígeno de virus influenza en las células del epitelio de un bronquiolo.

lucidar qué agentes están implicados en el CRP que afecta a los animales. Se han desarrollado numerosas técnicas para cada agente (ver tabla en la página siguiente) que van desde el aislamiento (tratamos de encontrar al propio agente), la detección directa (con las que tratare-mos de determinar la presencia de ácidos nucleicos o proteínas del agente) o la de-tección indirecta (tratamos de encontrar anticuerpos formados contra el agente).

InmunocitoquímicaSon técnicas que permiten, sobre seccio-nes de tejido, identificar agentes patóge-nos. Para ello, se emplean anticuerpos específicos frente a los antígenos a visua-lizar. Para localizar el lugar donde se está produciendo la reacción antígeno-anti-cuerpo es necesario utilizar un marcador. Entre estos marcadores, se utilizan para microscopía óptica fluorocromos como el isotiocianato de fluoresceina (técnicas de inmunofluorescencia) y enzimas como la peroxidasa o la fosfatasa alcalina (téc-nicas inmunoenzimáticas) (figuras 7 y 8). Estas técnicas se utilizan en el diagnósti-co de diversos patógenos implicados en el CRP como virus PRRS, PCV2, virus influenza, virus de la enfermedad de Au-jeszky, coronavirus respiratorio porcino y M. hyopneumoniae.



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semanas de diferencia y ver si el número de seropositivos y la titulación aumentan. El seroperfil trata de determinar cuál es la dinámica de un patógeno en una pobla-ción, y podemos hacerlo de dos modos: de forma longitudinal (tomando mues-tras de los mismos animales a lo largo del tiempo) o transversal (tomando muestras de animales en distintas edades de forma

simultánea). Aunque el más próximo a la realidad sea el longitudinal, usamos con mucha más frecuencia el transversal en el diagnóstico del CRP. Tomaremos muestras con varias semanas de cadencia (normalmente tres semanas) y estudiaremos cómo varía el número de seropositivos o el título frente a los pa-tógenos que queramos determinar. Para

interpretar una serología hay dos ele-mentos a tener en cuenta: la presencia de anticuerpos derivados de la vacunación y los anticuerpos calostrales. La duración de la inmunidad calostral es variable de-pendiendo del patógeno: desde las cuatro semanas del virus PRRS hasta las 12 se-manas que puede durar la inmunidad ma-terna frente al virus influenza.

Resumen de las pruebas complementarias disponibles para los distintos patógenos implicados en el CRP.

Patógeno Histopatología Tinciones específicas* Microbiología Serología** Técnicas moleculares Muestra

Virus del síndrome reproductivo y

respiratorio porcino (PRRS)

Sí InmunocitoquímicaAislamiento

víricoSí

PCR, q-PCR, secuen-ciación

Placentas, fetos abortados, pulmón, linfonodos, tonsila, suero, fluido oral

Circovirus porcino tipo 2


víricoSí

PCR y q-PCRHibridación in situ,

secuenciación

Pulmón, linfonodos, suero, fluido oral

Enfermedad de Aujeszky

-Inmunocitoquímica

InmunofluorescenciaAislamiento

vírico

Sí. Diferencial con anticuerpos

vacunalesPCR y q-PCR

Pulmón, nervio trigémino, SNC, fetos, pulmón, tonsila, bazo

Coronavirus respiratorio porcino

- InmunocitoquímicaAislamiento

víricoNo PCR y q-PCR Pulmón

Virus de la influenza porcina


víricoSí

PCR y q-PCR, se-cuenciación

Pulmón, lavado traqueobronquial, exudado broncoal-veolar, escobillones

nasales, tonsila

Citomegalovirus porcino

Sí - Aislamiento vírico No PCREscobillones nasales,

exudado nasal

Mycoplasma hyopneumoniae

SíInmunocitoquímica

InmunofluorescenciaAislamiento† Sí PCR y q-PCR

Pulmón, lavado traqueobronquial, exudado broncoal-

veolar, tonsila

Mycoplasma hyorhinis

Sí - Aislamiento† - PCRPulmón, exudados

respiratorios

Actinobacillus plueropneumoniae

Sí -Aislamiento y tipificación

SíPCR, Q-PCR, PCR-

RFLPPulmón

Pasteurella multocida


No PCR, q-PCRPulmón, secreción

nasal, tonsila

Bordetella bronchiseptica


SíPulmón, cornete

nasal

Actinobacillus suis Sí -Aislamiento y tipificación

No PCR Pulmón, tonsila

Haemophilus parasuis


No PCRPulmón, SNC, líquido

cefalorraquideo

Streptococcus suis Si -Aislamiento y tipificación

Sí PCRPulmón, secreción

nasal, SNC

† Muy largo y laborioso. No se utiliza de forma habitual. * Se citan las tinciones específicas en los casos en los que se use como técnica de rutina. En todos los patógenos listados existen estas técnicas para experimentación. **Se han señalado como “Sí” aquellos patógenos de los que se dispone de un kit comercial para serología. De todos ellos existen tests serológicos “caseros” en distintos laboratorios del mundo.



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Estos dos elementos debemos conocerlos antes de interpretar un seroperfil, espe-cialmente si vamos a empezar desde una edad muy precoz, donde aún persistan los anticuerpos maternales. Una vez que de-terminamos dónde empiezan a serocon-vertir la mayoría de los animales, podre-mos construir una tabla de coinfección. Lo que hacemos es marcar el momento en que los animales empiezan a tener pro-blemas. A continuación tomamos la edad a la que seroconvierten los animales para cada patógeno y le restamos 2-4 semanas (dependiendo del patógeno), que es el tiempo que tardan los animales en sero-convertir desde la infección. Esto nos da una imagen de los patógenos que pueden estar implicados en dicho proceso. Esta técnica nos permite plasmar en conjunto toda la información que se puede obtener de las serologías. La figura 9 recoge un ejemplo. En este caso, tendríamos un caso en el que los síntomas comenzarían en la semana 12-13 de vida. Al ver cuándo empiezan a seroconvertir los animales y restarle las dos semanas que suponemos tardarán en seroconvertir, tendríamos virus PRRS, PCV2 y virus influenza por delante de la línea que marca la aparición de los pro-blemas (posiblemente la diseminación de PCV2 y virus influenza se ha visto favo-

recida por la acción del virus PRRS). El agravamiento de la sintomatología se de-bería a la diseminación de M. hyopneu-moniae y A. pleuropneumoniae. Obvia-mente, en este ejemplo los animales no se habían vacunado frente a ninguno de los patógenos testados. Una de las pocas serologías que diferencia animales infectados de animales vacuna-dos es la determinación de gE de la en-fermedad de Aujeszky. En prácticamente todos los demás patógenos es indiferen-ciable la respuesta inmunológica vacunal de la derivada de una infección natural.

Técnicas molecularesLas técnicas moleculares se han desarro-llado en los últimos 30 años, pero sobre todo en la última década han progresado y se han popularizado para el diagnóstico del CRP. En este caso detectamos la pre-sencia de los ácidos nucleicos del agente que estemos buscando, por lo que consti-tuye una determinación directa, a diferen-cia de la serología.

PCRLa más utilizada es la PCR (siglas en in-gles de reacción en cadena de la polimera-sa), tanto en la forma clásica como en la forma en tiempo real. Esta técnica copia numerosas veces un fragmento contenido

de forma específica en el ácido nucleico del patógeno a detectar y después se vi-sualiza mediante fluorescencia. La prin-cipal diferencia es que la clásica es una prueba a punto final cualitativa (positivo/negativo) mientras que la PCR en tiempo real es cuantitativa y nos puede indicar el número de copias de ácido nucleico pre-sentes en la muestra (equivalente al núme-ro de patógenos presentes en la muestra). El problema de la PCR es que indica que el patógeno está presente pero no que esté ejerciendo su acción patogénica. Cuando utilizamos la técnica de PCR debemos tener en cuenta diversos aspectos especí-ficos relacionados con algunos de los pa-tógenos del CRP. Por ejemplo, en el caso de PCV2, un resultado positivo no indica que el problema esté causado por este vi-rus, ya que casi todas las granjas son po-sitivas a este agente y su presencia, si no está relacionada con las lesiones micros-cópicas características, no indicaría que es el causante del problema. Recientemente, con el uso de la PCR en tiempo real se considera que cuando la carga vírica pasa de un determinado umbral, el virus está implicado en el proceso patológico. Otro de los agentes con los que debemos tener cuidado a la hora de interpretar los resul-tados de la PCR es M. hyopneumoniae, ya que las PCR frente a este agente son

Figura 9. Ejemplo de tabla de coinfecciones en las que se puede ordenar la seroconversión frente a los distintos patógenos y determinar cuáles de ellos presumiblemente infectaron a los animales antes de que apareciera la expresión clínica.

Inicio de los problemas Agravamiento de la enfermedad

PRRSv

PCV2 IgG

PCV2 IgM

Virus influenza

M. hyopneumoniae

A. pleuropneumoniae

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20



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muy sensibles y detectan su presencia aunque no esté implicado en el problema.

PCR-RFLPCon esta técnica lo que hacemos es una PCR y posteriormente una digestión con enzimas de restricción que reconocen una secuencia concreta en el ADN. Su nombre RFLP deriva de las siglas en inglés de po-limorfismo de los fragmentos de restric-ción. Esta técnica se utiliza, por ejemplo, para diferenciar las distintas variedades de A. pleuropneumoniae.

Hibridación in situOtra técnica que se ha popularizado para el diagnóstico del CRP es la hibridación in situ. Este método detecta la presencia del ácido nucleico del patógeno presen-te en un corte de tejido preparado para histopatología. Se hace mediante sondas que, en caso de encontrar la secuencia

objetivo, producen una reacción de color fácilmente detectable. Se ha utilizado am-pliamente en la determinación de presen-cia de PCV2.

SecuenciaciónLa secuenciación consiste en determinar la secuencia genética del ácido nucleico de alguno de los patógenos implicados en el CRP. Se ha utilizado sobre todo con el virus PRRS y se ha secuenciando normal-mente el fragmento ORF5 de su cadena de ARN. Esta técnica sirve para compa-rar cepas y para determinar la similitud entre ellas, e incluso para determinar la lejanía filogenética de las distintas cepas. De hecho, cada vez estamos más familia-rizados con los dendogramas en los que se encuadran las cepas por su homología genética. Hay que hacer hincapié en que esta técnica de ningún modo sirve para determinar cuál de las vacunas será más

eficaz en la prevención de la enfermedad (aunque esté filogenéticamente muy cer-cana a nuestra cepa) ni qué cepa es más o menos virulenta.

CONCLUSIONESComo en cualquier proceso, debemos ser rigurosos a la hora de hacer el diag-nóstico del CRP. No es muy lógico que pasemos directamente a las técnicas complementarias como las serologías o la PCR si no hemos hecho previamente una labor de diagnóstico clínico o anato-mopatológico adecuada. Está claro que hacer sólo esto nos conducirá siempre a un diagnóstico presuntivo, pero también es evidente que el uso exclusivo de téc-nicas laboratoriales nos llevará a graves errores de diagnóstico. Por tanto, debemos seguir el método de diagnóstico paso a paso y no saltar etapas si queremos evitar estos riesgos.

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