diagnosi di laboratorio delle anemie emolitiche autoimmuni
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Anemie emolitiche autoimmuni:diagnostica di laboratorio e terapia trasfusionale
Diagnosi di laboratorio delle anemie
emolitiche autoimmuni
Maria Antonietta Villa
Laboratorio di Immunoematologia di Riferimento
U.O.C. Centro Trasfusionale
Fondazione IRCCS Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico
Diagnosi delle Anemie Emolitiche
1-2 Marzo 2018
� Le Anemie Emolitiche Autoimmuni (AEA)
comprendono un gruppo eterogeneo di
disordini del sistema immunitario
caratterizzate dalla presenza di
autoanticorpi diretti contro antigeni
eritrocitari e da un quadro clinico di emolisi
variabile nella sua gravità
AEA: definizione
Diagnosi delle Anemie Emolitiche
1-2 Marzo 2018
� Hanno un incidenza di 1-3 casi/100.000/anno,
una prevalenza di 17/100.000 nella popolazione
generale e una mortalità compresa tra il 4-11%
� Possono insorgere dalla prima infanzia ma più
frequentemente dopo la III-IV decade di vita con
un picco compreso tra 40 e 70 anni
AEA: incidenza
Diagnosi delle Anemie Emolitiche
1-2 Marzo 2018
Petz LD, Garratty G. Immune Hemolytic Anemias. 2004
AEA: epidemiologia
� Sulla base della presentazione sono classificate in:
• Primitive
• Secondarie
� Nel 50% dei casi sono associate ad altre patologie
50% idiopatica
20% secondarie a malattie linfoproliferative
20% secondarie a malattie autoimmuni
10% secondarie a neoplasie maligne o infezioni
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� AEA da autoanticorpi caldi: (60-70% dei casi)
� AEA da autoanticorpi freddi :
• Malattie da agglutine fredde (CHD) (20-25% dei casi)
• Emoglobinuria parossistica a frigore (1-5% dei casi)
� AEA miste da autoanticorpi caldi e freddi: (3-10%)
� AEA da farmaci
� AEA con Test dell’Antiglobulina Diretto (TAD) negativo
AEA: classificazione
Diagnosi delle Anemie Emolitiche
1-2 Marzo 2018
� Emoglobina
� Reticolocitosi
� Bilirubina totale e indiretta
� LDH
� Emoglobinemia, emoglobinuria
Diagnosi di laboratorio
STUDIO
IMMUNOEMATOLOGICO
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1-2 Marzo 2018
Nel laboratorio di immunoematologia
pervengono campioni di pazienti:
� con anemia di sospetta natura
immuno-mediata
� segnalati dal reparto per mancato
incremento trasfusionale
� con patologie associate ad AEA
AEA: studio immunoematologico
Diagnosi delle Anemie Emolitiche
1-2 Marzo 2018
Nei pazienti con sospetta AEA è
importante conoscere:
� Sintesi anamnestica con la
diagnosi del paziente
� Pregresse gravidanze/aborti
� Pregresse trasfusioni
� Principali dati di laboratorio
� Terapie in corso
Storia clinica
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Nei pazienti con sospetta AEA vengono eseguite:
Indagini immunoematologiche
Indagini sugli eritrociti
Indagini sul siero
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1-2 Marzo 2018
Etichettatura: secondo la norma
vigente come per i test trasfusionali,
pertanto i campioni devono essere
sempre firmati
Particolari precauzioni: nel caso si
sospetti la presenza di anticorpi di tipo
freddo il prelievo e il trasporto in
laboratorio devono avvenire sempre a
37oC
2 provette in EDTA
1 provetta di sangue in toto (siero)
� Autocontrollo a 20oC (autoagglutinazione)
� Test dell’antiglobulina diretto (TAD) o test di Coombs
diretto
� Test dell’antiglobulina indiretto (TAI) o ricerca di
anticorpi eritrocitari nel siero/plasma a 4oC, 20oC,37oC
e in AHGT
� Ricerca emolisine mono e bifasiche
� Identificazione di eventuali alloanticorpi eritrocitari
� Determinazione fenotipo eritrocitario
� Test sierologici addizionali (es. auto/alloassorbimento)
Test di laboratorio
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� In genere è positivo nelle AEA da
autoanticorpi freddi ma non nelle
forme da autoanticorpi caldi
� Se l’autoagglutinazione è positiva
bisogna lavare le emazie con
fisiologica a 37oC prima di
eseguire il TAD
Autocontrollo a 20 °°°°C
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1-2 Marzo 2018
� Il TAD può essere eseguito in
prima istanza con un antisiero
antiglobulina umano polispecifico
in provetta, microcolonna e fase
solida
� In caso di positività si esegue il
TAD con antisieri antiglobuline
umane monospecifici anti-IgG,
anti-C3 e/o C3c/C3d, anti-IgM ed
anti-IgA
Test dell’antiglobulina diretto (TAD)
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Cause TAD positivo
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� L’eluato può essere eseguito con
diverse procedure tecniche:• Glicina acida
• Congelamento-scongelamento rapido
• Calore
� L’eluato è utile per:• confermare l’autoanticorpo caldo
• escludere che il TAD non si dovuto alla
AEA ma da un alloanticorpo adeso
• verificare che non si tratti di un anemia
emolitica da farmaco
Test di eluizione
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� In microcolonna
� In fase solida
� In provetta con additivo PEG/LISS
� In provetta a 4oC, 20oC, 37oC
� In provetta con preincubazione
Ricerca/Identificazione di anticorpi
AEA da autoanticorpi caldi
AEA da autoanticorpi freddi
Si possono utilizzare emazie autologhe ed
omologhe non trattate e pre-trattate con
enzimi proteolitici (papaina, ficina) ed
cellule cordonali
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� TAD: positivo da IgG (IgG1-IgG3) e/o Complemento , raramente IgM e IgA
Autoanticorpi:
• di tipo caldo con una temperatura ottimale di legame a 37oC , in genere dimostrabili nel siero e nell’eluato
• reagiscono contro gli eritrociti normali, possono mostrare specificità rivolta contro determinanti antigenici degli eritrociti del paziente (di solito del sistema Rh)
• causano emolisi extra-vascolare
AEA da autoanticorpi caldi
Panreattività nei test sierologici
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� TAD: positivo o negativo da Complemento
� Autoanticorpi:
• di tipo IgM con una temperatura ottimale di legame < a 30oC , in grado di attivare il complemento
• reagiscono meglio a 0o- 4oC ma a differenze delle crioagglutinine fisiologiche presentano un alto titolo a 4oC e un ampio range termico anche sino a 37oC
• presentano specificità frequentemente anti-I, talora anti-i (mononucleosi ), anti-H e anti-Pr
• causano emolisi intra-vascolare
AEA da autoanticorpi freddi
Significato clinico se optimum termico a 37oCDiagnosi delle Anemie Emolitiche
1-2 Marzo 2018
� TAD: positivo da IgG e Complemento (C3d)
� Autoanticorpi:
• di tipo caldo (IgG)
• di tipo freddo IgM: in genere a basso titolo a 4oC(<64) ma con range termico ampio
• presentano delle specificità indipendenti
• causano emolisi intra e/o extravascolare
AEA di tipo misto
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1-2 Marzo 2018
� Dimostrazione della presenza nel siero della emolisina bifasica di Donath-Landsteiner
� TAD: positivo da Complemento
� Autoanticorpo:
• di tipo IgG (emolisina bifasica) in genere a specificitàanti-P
• in grado di sensibilizzare gli eritrociti a temperatura <30oC e causarne l’emolisi a 37oC
• causano emolisi intra-vascolare
AEA da Emoglobinuria Parossistica a Frigore
Diagnosi delle Anemie Emolitiche
1-2 Marzo 2018
� Dimostrazione della presenza nel siero della emolisina bifasica di Donath-Landsteiner
� TAD: positivo da Complemento
� Autoanticorpo:
• di tipo IgG in genere a specificità anti-P,
• in grado di sensibilizzare gli eritrociti a temperatura <30oC e causarne l’emolisi a 37oC
• causano emolisi extravascolare
AEA da emolisina bifasica
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1-2 Marzo 2018
� Storicamente l’α-metildopa e la penicillina sono state responsabili della maggior parte dei casi di AEA da farmaco
� Dopo gli anni 80, con la diminuzionedel loro uso, l’incidenza di questotipo di AEA da farmaco si è molto ridotta (12-18%) mentre èaumentata quella delle cefalosporinedi seconda e terza generazione(70%)
AEA da farmaco
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1-2 Marzo 2018
� Assorbimento e legame del farmaco allamembrana con produzione di IgG che silegano al complesso farmaco-membrana; emolisi extravascolare; TAD positivo daIgG
� Formazione dell’immunocomplessofarmaco e anticorpo anti-farmaco(soprattutto IgM) che si attacca allamembrana eritrocitari; emolisiintravascolare; TAD positivo daComplemento
� Modifica da parte del farmaco dellamembrana del globulo rosso rendendolaantigenica; induce la produzione diautoanticorpi IgG; emolisi extravascolare; TAD positivo da IgG
Meccanismi AEA da farmaco
Arnat Immunohematology 2014;30(2):44-54
Diagnosi delle Anemie Emolitiche
1-2 Marzo 2018
Rappresentano un problema diagnostico critico e
sono state segnalate con crescente frequenza sia
negli adulti che nei bambini (dal 10 al 20%)
� Ridotto numero di immunoglobuline adese agli
RBCs in relazione alla tecnologia utilizzata
� Bassa affinità degli autoanticorpi IgG sensibilizzanti
o dissociazione durante i lavaggi
� Autoanticorpi IgA o IgM (non rilevati se utilizzato
un reagente polispecifico)
AEA con TAD negativo
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• Provetta: almeno 500 molecole
• Microcolonna: 200-300 molecole
• Fase solida: <100 molecole
• Citofluorimetria: <50 molecole
Intensità di reazione IgG/cellula
0 < 25-120
debole 120
1 + 200
2 + 200-500
3 + / 4 + > 500
Garratty 2005
Segel 2013
Quantità IgG e score reazione
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� Lavaggio emazie con fisiologica fredda o con LISS al 65%
� Microcolonna (con antisieri monospecifici)
� Fase solida
� DUAL-DAT
� Citometria
� Mitogen Stimulation (MS-DAT)
AEA con TAD negativo
I metodi più frequentamente utilizzati sono:
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1-2 Marzo 2018
Mitogen Stimulated Direct Antiglobulin Test
(MS-DAT)
� Il test viene eseguito su sangue intero (eparina) dopo stimolazione per 48 h con dei mitogeni (es.fitoemagglutinina)
� La stimolazione mitogenica determina la produzione in vitro di autoanticorpi da parte dei linfociti B e il loro successivo legame alle emazie autologhe
� La quantità di autoanticorpi adesi viene valutata mediante un test ELISA competitivo in fase solida
MS-DAT
Barcellini Br J Haematol, 2000
Barcellini Blood 2009Diagnosi delle Anemie Emolitiche
1-2 Marzo 2018
AEA e alloimmunizzazione
� Il 15-53% delle AEA presenta alloanticorpi eritrocitari in associazioneagli autoanticorpi
� Per questo motivo devono essere utilizzate delle procedure speciali: diluizione del siero, tecniche di preincubazione, assorbimento del siero, uso di reagenti tiolici (mercaptoetanolo, DDT) per escludereeventuali alloanticorpi
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1-2 Marzo 2018
• descritto nel 1987 (Nance e Garratty)
• utilizzato nel 1995 (Liew e Duncan) per
autoassorbimenti e alloassorbimenti
Assorbimento autologo è la procedura ideale per rimuovere l’autoanticorpo:
� Comporta lunghi tempi di esecuzione
� Dilazione delle trasfusioni urgenti
� Non eseguibile in tutti i pazienti (es. con anemia severa o recentemente trasfusi)
PEG
Assorbimento
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1-2 Marzo 2018
Barron & Brown, Immunohematology 1997;13:119-122
Cheng et al, Transfusion 2001;41:13-17
Judd & Dake, Immunohematology 2001;17:82-85
PEGTradizionale
PEG
RBC non trattati e
trattati con enzimi
Siero/plasma
Siero/plasma
RBC non trattati
Assorbimento: confronto
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1-2 Marzo 2018
Vantaggi del PeG
� Facilita l’assorbimento di anticorpi
� Non richiede emazie pretrattate
� Riduce il tempo tecnico
� Precipitazione di proteine
� Perdita di alloanticorpi debolmentereattivi
Svantaggi del PeG
Vantaggi e svantaggi
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1-2 Marzo 2018
Assorbimento con Peg/LISS
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1-2 Marzo 2018
L’alloassorbimento è un’alternativaall’autoassorbimento nei soggetti con
AEA recentemente trasfusi (nei 3 mesiprecedenti)
• Se la tipizzazione non è nota usare
emazie selezionate
• Se la tipizzazione è nota usare emazie
identiche alla tipizzazione del paziente
Allossorbimento
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1-2 Marzo 2018
� Richiede lunghi tempi
� Disponibilità di campioni idonei
� Può comportare la rimozione di anticorpi verso
antigeni ad alta incidenza
� Richiede esperienza nell’esecuzione ed
interpretazione dei test
� Deve essere ripetuto ad ogni evento
trasfusionale
Assorbimento: limiti
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1-2 Marzo 2018
Nei pazienti non recentemente trasfusi i
globuli rossi possono essere tipizzati in
provetta con reagenti monoclonali o
reagenti policlonali dopo aver staccato gli
autoanticorpi dai globuli rossi con:
� Clorochina
� ZZAP (ditiotreitolo e papaina)
� Sistemi a pH variabile/gradiente di densità
� Metodi acidi a freddo
� Soluzioni di glicina-HCL-EDTA
� Acido citrico
si possono denaturare
alcuni sistemi antigenici
Determinazione fenotipo eritrocitario
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1-2 Marzo 2018
� L’impiego delle tecniche di genotipizzazione ha
permesso di determinare il fenotipo eritrocitario
esteso e facilitare gli studi di assorbimento,
l’identificazione di eventuali alloanticorpi associati e
le strategie trasfusionali
� Per evitare di eseguire ad ogni evento trasfusionale
studi di assorbimento i pazienti con AEA
Si possono tipizzare all’esordio in biologia molecolare, e
per la trasfusione si possono assegnare unità
estensivamente tipizzate per gli antigeni clinicamente
significativi
AEA e biologia molecolare
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1-2 Marzo 2018
Sapatnekar S Transfusion 2014
Kappler E, Transfusion 2010
� La decisione di trasfondere o meno i pazienti con AEA non dipende dai risultati delle prove di compatibilità ma essenzialmente dalle necessità cliniche del paziente
� Nella maggior parte dei casi i test pre-trasfusionali e le prove di compatibilitàhanno spesso un risultato positivo ed èdifficile escludere la presenza di eventuali alloanticorpi
� Per la trasfusione è meglio trasfondere emazie con la specificità antigenica dell’autoanticorpo piuttosto che rischiare una alloimmunizzazione eritrocitaria
AEA trasfusione si o no?
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1-2 Marzo 2018
� Frequentemente utilizzato
� Identifica le unità di globuli rossi con risultati
meno positivo nella prova di compatibilità
� Può essere interpretato in modo diverso da diversi
operatori sanitari
� Non è informativo nella discussione con i clinici
Petz LD. “Least incompatible” units for transfusion in
autoimmune hemolytic anemia: should we eliminate this
meaningless term? A commentary for clinicians and transfusion
medicine professionals. Transfusion 2003
Il termine “meno incompatibile”
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1-2 Marzo 2018
Shirey et al. Transfusion 2002
� Prima della trasfusione tipizzare il paziente per antigeni RH, KEL, JK, FY, MNS
• selezionare unità di emazie identiche per la trasfusione
� Per pazienti non tipizzati
• selezionare unità fenotipo compatibile, K- negative per antigeni verso i quali sono rivolti eventuali alloanticorpi
• ripetere studi con alloassorbimenti prima di ogni trasfusione
� Pazienti con tipizzazione parzialmente determinata (antigeni RH, KEL, JK) con antisieri monoclonali
• selezionare unità identiche al paziente per gli antigeni determinati e unità negative per antigeni verso i quali sono rivolti eventuali alloanticorpi
• ripetere studi con alloassorbimenti prima di ogni trasfusione
AEA: come trasfondere
Diagnosi delle Anemie Emolitiche
1-2 Marzo 2018
Procedura AEA
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1-2 Marzo 2018
• Se la ricerca di anticorpi è negativa vengono selezionate unità a fenotipo compatibile, Kell negative
• Se la ricerca di anticorpi è positiva e la trasfusione è urgente vengono selezionate unità a fenotipo compatibile, Kell negative
• Se la trasfusione si può rimandare di qualche ora eseguire l’autoassorbitoe la tipizzazione del paziente con antisieri monoclonali e selezionare unitàidentiche per gli antigeni clinicamente significativi
In soggetti non recentemente trasfusi:
In soggetti recentemente trasfusi:
• Se la ricerca di anticorpi è negativa vengono selezionate unità a fenotipo
compatibile, Kell negative con assegnazione filtro
• Se la ricerca di anticorpi è positiva e non è disponibile una tipizzazione del
paziente, nei turni notturni e festivi devono essere selezionate unità a
fenotipo compatibile, Kell negative.
• La tipizzazione genomica o eventuali alloassorbimenti mirati verranno
eseguiti durante il turno lavorativo diurno
AEA e trasfusione
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1-2 Marzo 2018
� La conoscenza dell’anamnesi del
paziente, dei segni clinici e dei dati di
laboratorio può aiutare a formulare una
corretta diagnosi di AEA
� Il laboratorio di immunoematologia: deve
caratterizzare l’autoanticorpo implicato ed
escludere la presenza di eventuali
alloanticorpi eritrocitari
� Il clinico deve dire se la trasfusione è
proprio necessaria perchè una terapia
trasfusionale aggressiva potrebbe essere
gravata da complicanze
� L’immunoematologo e il clinico devono
lavorare insieme
Conclusioni
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1-2 Marzo 2018