determining the sequence of dna
DESCRIPTION
Determining the Sequence of DNA. Methods: Chain termination or dideoxy method F. Sanger Shotgun sequence method 2 nd generation sequence methods Pyrosequencing. Sequentiation of NA. Frederick Sanger. The Nobel Prize in Chemistry 1958. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
![Page 1: Determining the Sequence of DNA](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081722/568164d5550346895dd7103c/html5/thumbnails/1.jpg)
Determining the Sequence of DNAMethods:
1. Chain termination or dideoxy method F. Sanger
2. Shotgun sequence method3. 2nd generation sequence methods
Pyrosequencing
![Page 2: Determining the Sequence of DNA](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081722/568164d5550346895dd7103c/html5/thumbnails/2.jpg)
Sequentiation of NA
Frederick Sanger
"for his work on the structure of proteins, especially that of insulin”
The Nobel Prize in Chemistry 1958
![Page 3: Determining the Sequence of DNA](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081722/568164d5550346895dd7103c/html5/thumbnails/3.jpg)
Chain Termination with ddNTP
![Page 4: Determining the Sequence of DNA](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081722/568164d5550346895dd7103c/html5/thumbnails/4.jpg)
Sekvenování nukleových kyselinUrčení sekvence (pořadí) nukleotidů úseků DNA a RNAo několika stech bazí se provádí nejčastěji na principu konvenční Sangerovy metody (dideo-xynukleotidová, ddNTP reakce) nebo nověji pomocí cyklického sekvenování na termocykleru bez nutnosti alkalické denaturace. Označené produkty sekvenační reakce se rozdělí a detekují na sekvenačním gelu pomocí elektroforézy. Původní metoda vyžadovala 4 samostatné sekvenační reakce a také samostatné dělení při elektroforéze pro každý jednotlivý nukleotid. Metoda má čtyři fáze: přiložení primeru k analyzovanému fragmentu DNA, označení primeru, prodlužování primeru o další komplementární baze syntézou pomocí T7 DNA polymerasy, ukončení reakce inkorporací dideoxynukleotidu. Značení primerů se provádělo pomocí radioizotopů. Sekvenační 5% polyakrylamidový gel je denaturační (např. 7 mol/l urea), obvykle 0.3 mm silný, separační vzdálenost 50 cm, TBE pufr. Parametry zdroje pro separační rychlost asi 100 bazí za hodinu jsou 60 W (1900 V, 45 mA). Moderní sekvenování je plně automatizováno. Místo radioaktivního značení se používá značení fluoresceinem, místo značení primerů se používá značení terminátorů reakce (ddNTP), reakce se provádí na termocykleru pomocí Taq DNA polymerasy, všechny čtyři reakce je možno provést v jedné zkumavce a elektroforetické dělení je také z jednoho vzorku. Laserová detekce emise čtyř různých fluorescenčních barev se provádí pomocí fotonásobiče a velmi citlivého detektoru přímo z gelu. Počítačem je řízený posuv, fokusace, optimální laserový paprsek a vyhodnocení získaných dat. K dispozici je specializovaný software.
![Page 5: Determining the Sequence of DNA](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081722/568164d5550346895dd7103c/html5/thumbnails/5.jpg)
Automated DNA Sequencing
Smith et al. 1986 DNA molecules labeled with fluorescent
dyes Products of dideoxy-sequencing reactions
separated by gel electrophoresis Dye molecules are excited by laser beam Fluorescent signals are amplified and
detected by Photomultiplier tubes (CCD Camera)
Computer software identifies each nucleotide based on the distinctive color of each dye
![Page 6: Determining the Sequence of DNA](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081722/568164d5550346895dd7103c/html5/thumbnails/6.jpg)
![Page 7: Determining the Sequence of DNA](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081722/568164d5550346895dd7103c/html5/thumbnails/7.jpg)
![Page 8: Determining the Sequence of DNA](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081722/568164d5550346895dd7103c/html5/thumbnails/8.jpg)
PyrosequencingNote: No actual housesare burned down in pyrosequencing
![Page 9: Determining the Sequence of DNA](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081722/568164d5550346895dd7103c/html5/thumbnails/9.jpg)
Pyrosequencing(Life Sciences / Roche 454)A luciferase is an enzyme which emits light
in the presence of ATP.
Several organisms, such as the American firefly and the poisonous Jack-o-lantern mushroom, produce luciferases.
![Page 10: Determining the Sequence of DNA](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081722/568164d5550346895dd7103c/html5/thumbnails/10.jpg)
Emulzní PCR jako první krok k přípravě knihovny k pyrosekvenaci
![Page 11: Determining the Sequence of DNA](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081722/568164d5550346895dd7103c/html5/thumbnails/11.jpg)
Sequencing by synthesis Advantages:
AccurateParallel processingEasily automatedEliminates the need for labeled primers
and nucleotidesNo need for gel electrophoresis
![Page 12: Determining the Sequence of DNA](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081722/568164d5550346895dd7103c/html5/thumbnails/12.jpg)
Detecting polymerase activityRecall: Pyrophosphate is also known as PPi,
also known as “two phosphate groups stuck together”. During replication, each addition of a dNTP releases pyrophosphate
In the reaction mixture, PPi allows adenosine phosphosulfate (APS) to be converted to ATP; this ATP allows luciferase to luciferate (emit light).
Measures strand extension as it happens
![Page 13: Determining the Sequence of DNA](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081722/568164d5550346895dd7103c/html5/thumbnails/13.jpg)
Pyrosequencing cycle Add dATP. If light is emitted, your sequence starts with A.
If not, the dATP is degraded (or elutes past immobilized primer).
Add dGTP. If light is emitted, the next base must be a G. Then add T, then C. You now know at least one (maybe
more) base of the sequence. Repeat!
![Page 14: Determining the Sequence of DNA](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081722/568164d5550346895dd7103c/html5/thumbnails/14.jpg)
Pyrosequencing output
Runs of bases produce higher peaks – for instance, the sequence for (a)is GGCCCTTG. Sample (c) comes from a heterozygous individual (hencethe heights in multiples of ½)