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Revista Real Academia Galega de Ciencias. Vol. XXVII. Págs. 5-40 (2008)

DETERMINACIÓN DE METALES EN ALGAS MARINAS DESTINADAS A LA ALIMENTACIÓN HUMANA

PRODUCIDAS Y PROCESADAS EN GALICIA: DESARROLLO DE METODOLOGÍA ANALÍTICA AUTOMÁTICA

M. CARMEN YEBRA BIURRUN1

Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología.Facultad de Química. Universidad de Santiago de Compostela.

15782-Santiago de [email protected]

RESUMEN

Se ha propuesto un método nuevo, simple, rápido y automático basado en la extracción ácida asistida con energía de ultrasonidos para la determinación de metales en algas. Los metales se determinaron en línea por espectrometría de absorción atómica con llama utilizando un sistema de análisis por inyección en flujo. Se estudió la influencia de varias variables en la eficacia del proceso de extracción utilizando diseños experimentales. Además, las metodologías propuestas fueron evaluadas calculando el límite de detección, límite de cuantificación y precisión. La validación se efectuó analizando un material de referencia certificado (NIES-9, ”Sargasso”, National Institute for Environmental Studies, Japan) y mediante estudios de recuperación. Finalmente, la metodología propuesta se ha utilizado para la determinación de Zn, Cu, Fe, Mn, Ca y Mg en algas marinas destinadas a la alimentación humana producidas y procesadas en Galicia.

Palabras clave: metales, extracción ácida continua, ultrasonidos, análisis por inyección en flujo, algas.

1 Premio de Investigación Real Academia Galega de Ciencias-Fundación Caixa Galicia, convocatoria 2007.

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ABSTRACT

A new, simple, fast and automated method based on continuous ultrasound-assisted acid extraction has been developed for the determination of metals (Zn, Cu, Fe, Mn, Ca and Mg). The target metals have been on-line monitoring by flame atomic absorption spectrometry by using a flow injection analysis manifold. The influence of several extraction parameters on the efficiency of metal leaching has been evaluated by using experimental designs. Limits of detection and quantification and precision of the over all procedure have been assessed. Method validation was performed analysing a seaweed reference material (NIES-9, “Sargasso”, National Institute for Environmental Studies, Japan) and by recovery studies. Finally, the developed continuous extraction methodology has been applied to the determination of Zn, Cu, Fe, Mn, Ca and Mg in edible seaweeds produced and processed in Galicia.

Key words: metals, continuous acid extraction, ultrasounds, flow injection analysis, edible seaweeds.

INTRODUCCIÓN

Las algas se definen como plantas talofitas, unicelulares o pluricelulares que viven de preferencia en el agua, tanto dulce como marina, y que, en general, están provistas de clorofila acompañada a veces de otros pigmentos de colores variados que la enmascaran. El talo de las pluricelulares tiene forma de filamento, de cinta o de lámina y puede ser ramificado. Aunque hay muchas algas de agua dulce, la mayoría vive en el mar. Dentro de éstas, se encuentran las algas unicelulares, microalgas o fitoplancton, las cuales son microscópicas y representan el primer eslabón de la cadena alimenticia de los animales acuáticos. Además, existen algas pluricelulares o macroalgas, visibles al ojo humano y que normalmente se conocen como algas marinas (Pérez-Cirera López-Niño, 2005). Entre las algas marinas macroscópicas se pueden diferenciar cuatro grupos principales: Cyanophyta o algas azules, Chlorophyta o algas verdes, Rhodophyta o algas rojas y Phaeophyceae o algas pardas. Estos grupos se caracterizan no sólo por los pigmentos que poseen, sino también por la complejidad de su talo y sus mecanismos reproductivos (Otero Schmitt et al., 2002). Sin embargo, tienen la característica común de vivir sin raiz, y extraen su alimento y los nutrientes esenciales para su crecimiento del agua del mar que les rodea. Desde hace mucho tiempo, el

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hombre ha usado las algas con distintos fines para el medio ambiente y el ser humano. Estas aplicaciones son:

- agropecuarias. Mejoran la producción vegetal utilizadas como abono y fertilizante, como corrector del pH de la tierra, e incluso como alimento para el ganado.

- alimenticias. Las algas se han incorporado desde hace muchos siglos en la dieta alimenticia, sobre todo en las culturas orientales y especialmente en Japón, Corea y China, y en la “poliacuicultura ecológica”, las algas sirven de complemento dietético para peces o moluscos de granjas de cultivo.

- cosméticas. Los extractos de algas se emplean en productos para el tratamiento de uñas rotas, acné, arrugas, seborrea, e incluso para la caída del cabello, el rejuvenecimiento de la piel, la obesidad o la celulitis. Asimismo, su capacidad fotoprotectora se está utilizando para el desarrollo de cremas solares.

- farmacológicas. Las algas son muy utilizadas en la medicina tradicional oriental.

- industriales. Para la optención de ficocoloides: agarófitos (E-406), alginatos (E-401 al E-405), y fundamentalmente carrageninas (E-407). El agar se emplea en la elaboración de medio de cultivo en laboratorio por tener un gran poder gelificante. El agar también se añade como aditivo gelificante y espesante (E-406) en gran cantidad de alimentos. Asimismo se emplea en la industria fotográfica y en la industria biotecnológica (agarosa para separaciones cromatográficas y electroforéticas). Las carrageninas son polisacáridos sulfatados muy apreciados por diversos tipos de industrias por sus numerosas aplicaciones, normalmente alimentarias.

- medioambientales y energéticas. Como restauradoras de zonas contaminadas, depuradoras de efluentes o como bioindicadores para conocer el estado de un determinado medio (Chaudhuri et al., 2007; Morrison et al., 2007; Kamala-Kannan et al., 2008). Asimismo, su uso como combustible, para generar biogás (metano), hidrógeno o biodiesel es otra línea fructífera de investigación (Castelló Orvay, 1993).

El consumo directo de algas en la alimentación humana está muy extendido en los países orientales (China, Corea, Japón). Sin embargo, en las


últimas décadas, la demanda de algas para la alimentación humana esta en alza en países occidentales (González et al., 1998; Fernández Saa, 2002). Las algas más apreciadas para la cocina son:

- wakame (Undaria pinnatifida): pertenece a las algas pardas y es apreciada en la cultura oriental y muy abundante en las costas de Galicia. Rica en calcio, yodo, proteínas y fibra.

- Espagueti de Mar (Himanthalia elongata): es una alga parda, muy sabrosa y frecuente en litorales profundos y aguas agitadas. Rica en fibra y en hierro.

- Kombu (Laminaria ochroleuca, Laminaria hyperborea, Laminaria saccharina): alga de gran tamaño, color pardo y consistencia carnosa. Su principal característica es que es rica en ácido glutámico que potencia el sabor de los demás alimentos y es rica en minerales, especialmente calcio y magnesio. La Laminaria saccharina tiene un sabor ligeramente dulce y es llamada por ello Kombu de azúcar.

- Dulse (Palmaria palmata): es un alga de color rojo rica en vitamina C, proteínas y potasio.

- Nori (Porphyra umbilicalis): es un alga de pequeño tamaño y muchos pliegues. En Galicia se encuentra silvestre en la bajamar. Tiene un sabor intenso y destaca en proteínas, vitamina A y vitamina B12.

- Osmundea (Osmundea pinnatifida): es un alga muy pequeña, pero con un intenso olor a mar. Muy difícil de coger ya que se encuentra bajo las rocas en las que se crían los percebes.

- Codium (Codium tomentosum).

- Lechuga de mar (Ulva rigida): es un alga verde que recuerda mucho en su apariencia a la lechuga.

- Agar-agar Atlántica, Gelatina de algas (Gelidium sesquipedale). Es la fibra soluble extraída del alga Gelidium sesquipedale. Se suele emplear como espesante y gelificante (E-406) y también muy usada en investigación (microbiología).

- Musgo de Irlanda (Chondrus crispus): Se utiliza en su gran mayoría para la producción industrial de carrageninas, pero también puede utilizarse en cocina como espesante (E-407).


- Verdello (Enteromorpha Intestinalis): Es una alga verde del orden de las Ulvales.

El análisis composicional de las algas desvela que concentran del agua del mar una amplia variedad de nutrientes esenciales: contenido elevado en minerales esenciales (Ca, Na, K, Mg, Mn, P, Cl, Fe, Cu, Zn, I, etc.) (Robledo y Freile Pelegrin, 1997; Rao et al., 2007). Algunas especies son ricas en proteínas. Presentan mayor cantidad en aminoácidos esenciales que las verduras. Contienen antioxidantes y son extremadamente ricas en polifenoles, carotenoides, vitaminas E y C, clorofila, ácidos grasos esenciales, enzimas y fosfolípidos, que neutralizan los radicales libres y ayudan a retrasar el envejecimiento. Además, contienen vitamina A, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B9, vitamina B12 y vitamina K. Presentan un bajo contenido calórico en relación con otros alimentos, y como poseen ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (Omega-3 y Omega-6) ayudan a disminuir y a regular el exceso de colesterol. Los glúcidos que contienen se encuentran casi exclusivamente en forma no asimilable (fibra). Por tanto, aportan poco valor energético. Contienen ácido algínico que es un desintoxicante abundante en las algas pardas laminarias (kombu) que ayuda a prevenir la contaminación de elementos radiactivos en el cuerpo.

El agua de mar contiene, de forma natural, pequeñas concentraciones de metales que no sólo no resultan perjudiciales para el ecosistema sino que son necesarios para el desarrollo de los organismos vivos. El problema surge cuando se produce un aumento de concentración y se convierten en sustancias tóxicas para los organismos marinos o se acumulan en la cadena trófica de forma que pueden convertirse en tóxicos para el hombre. Las macroalgas bioconcentran los iones metálicos libres mediante dos procesos físico-químicos. El primer proceso es rápido y reversible e involucra la adsorción del ión metálico sobre la superficie externa de la pared celular. Este proceso puede ser iónico o por formación de complejos con los ligandos de la pared celular. Los polímeros que componen la pared celular son ricos en grupos carboxílicos, fosforílicos, hidroxilos y aromáticos que pueden ligar cationes o producir complejos orgánicos que pueden influir la absorción de metales. El segundo mecanismo de incorporación de metales es más lento, esta regulado por el metabolismo celular y los metales se almacenan en el citoplasma en vacuolas ricas en polifenoles (Granan et al., 1992). Como producto de esta acumulación las algas pueden alcanzar contenidos de elementos traza varios


ordenes de magnitud más elevados respecto a las aguas. Además, hay que tener en cuenta que las distintas especies de algas tienen diferentes afinidades por los metales, por lo que su contenido metálico depende de la clase de alga. La concentración de metales puede variar en las diferentes partes del alga, siendo normalmente mayor en las partes más viejas, ya que han estado más tiempo expuestas al medio. Muchas especies muestran variaciones en la concentración de metales dependiendo de sus periodos de inmersión. Para especies que vivan en el mismo hábitat, el contenido metálico depende de la edad del alga. Otros factores que influyen en la concentración metálica de las algas son el área geográfica, temperatura del agua, pH, etc. (Villares et al., 2002; Yamada et al., 2007).

En los procedimientos analíticos en los que se tiene que eliminar la materia orgánica y/o disolver la muestra, la etapa de pretratamiento de la muestra constituye normalmente el talón de Aquiles del proceso analítico debido, sobre todo, al tiempo que consume su realización. Por eso, la automatización de las operaciones previas del proceso analítico es en la actualidad uno de los objetivos principales de la Química Analítica. De esta manera, la preparación de la muestra es una etapa muy importante en la estrategia del análisis. Por lo que en todo procedimiento analítico es deseable que tenga lugar una mínima manipulación de la muestra, utilizando un pretratamiento lo más sencillo posible, lo cual además, evita problemas de pérdida y contaminación de analito(s). La selección del tipo de pretratamiento de la muestra depende de la técnica analitica que se va a utilizar para la determinación de los metales. Como la espectroscopía de absorción atómica con llama es usualmente la técnica de determinación elegida, ésta requiere normalmente que las muestras sólidas estén disueltas para que la muestra pueda ser introducida en la fuente de atomización. Los métodos clásicos utilizados para la preparación de muestras vegetales implican la digestión por vía seca (calcinación) o la digestión por vía húmeda de las muestras (Knapp et al., 1975; Somenath, 2003; Munilla et al., 1995). Los métodos clásicos haciendo uso de una digestión por vía húmeda en recipientes abiertos son procedimientos laboriosos y tediosos, y además, están sujetos a posibles errores por pérdida de analito(s) y/o contaminación de la muestra. Otro inconveniente de este procedimiento es el manejo de ácidos concentrados y la generación en el proceso de gases tóxicos (óxidos de nitrógeno). De la misma manera, los procesos que implican una calcinación de la muestra también presentan inconvenientes, ya que además de la pérdida de analitos volátiles y la posibilidad de contaminación de la


muestra, se pueden producir reacciones en las paredes del crisol. Tampoco se deben olvidar las dificultades que se pueden producir al disolver el residuo obtenido en la combustión (Meeravali y Sunil, 2000). Debido a estos problemas, se han propuesto otros procedimientos para la preparación de muestras vegetales (Curdova et al., 1998; Zezzi Arruda, 2006). Así, se han utilizado procedimientos de digestión en vía húmeda realizados en recipientes cerrados y bajo la acción de la energía de microondas. Sin embargo, aunque estos procesos son una buena alternativa para llevar a cabo la preparación de la muestra, ya que reducen el tiempo de pretratamiento en comparación con las metodologías clásicas, siguen presentando el inconveniente del uso de ácidos concentrados. Además, como la muestra se disuelve completamente, aumenta la probabilidad de que existan interferencias de matriz. Debido a estos inconvenientes se han propuesto otras estrategias para realizar la preparación de muestras de origen vegetal. Éstas se basan en la calcinación mediante láser, en extracción con líquidos a presión y en procesos de extracción ácida bajo la acción de la energía de ultrasonidos. Sin embargo, las dos primeras propuestas presentan los siguientes inconvenientes: elevado costo del equipo y dificultad para realizar los procesos de manera automática y miniaturizada (Ahlgren et al., 1988; Saeed et al., 1999; Morales-Muñoz, et al, 2007; Moreda-Piñeiro et al., 2007). Como la extracción ácida de metales asistida por la energía de ultrasonidos no presenta estos inconvenientes, es hoy día una de las alternativas más válidas para realizar el pretratamiento de las muestras sólidas, incluídas las de origen vegetal como las algas marinas (Luque Garcia y Luque de Castro, 2002; Luque de Castro y Priego Capote, 2007).

La energía de ultrasonidos facilita y acelera procesos como la disolución y la extracción. Las muestras sometidas a energía de ultrasonidos se dispersan de tal forma que originan una fina suspensión que se ataca fácilmente por los reactivos (ácidos o bases diluídos). Los procesos de extracción en un baño de ultrasonidos proporcionan una mayor eficacia en la disolución de numerosos analitos de muestras complejas y reducen la duración del proceso en comparación con los métodos clásicos de extracción. Esta metodología proporciona recuperaciones entre el 94-100%, con una buena reproducibilidad para la mayoría de los metales. Los metales son extraídos generalmente con ácidos diluidos, lo que hace que no se disuelva la matriz de la muestra, evitándose de esta forma las interferencias que puede producir en la determinación de el (los) analito(s) (Priego Capote y Luque de Castro, 2004; Luque de Castro y Priego Capote, 2007).


En lo que se refiere a la determinación de metales en muestras de vegetales y plantas, se han propuesto varias metodologías basadas en la extracción ácida asistida por energía de ultrasonidos. Así, se han determinado Ba, Ca, Cd, Cu, Mg, Ni, Pb, Sr y Zn en diversos tejidos vegetales y plantas (Lavilla et al., 1998; Filgueiras et al., 2002; Nascentes et al., 2001; Borkowska-Burnecka et al., 2003) y As, Ba, Ca, Na, Mg, Cd, Cr, Cu, Fe, K, Mg, Mn, Ni, Pb, V y Zn en algas (Dominguez-Gonzalez et al., 2005; Ladra-Ramos et al., 2005).

La extracción continua de metales en muestras sólidas usando energía de ultrasonidos llevada a cabo en un dispositivo automático basado en el análisis por inyección en flujo (FIA) ha resultado ser una metodología rápida, sencilla y cuantitativa para el pre-tratamiento de muestras sólidas (Ruiz-Jiménez et al., 2003; Moreno-Cid et al., 2004; Yebra et al., 2005). Otras ventajas que presenta esta metodología en comparación con la alternativa no automática comentada en el apartado anterior son las siguientes: reducción de la contaminación de la muestra y de las pérdidas de analito debido a una mínima manipulación de la muestra, bajo consumo de reactivos y de muestra (el sistema es miniaturizado), disminución considerable del tiempo de tratamiento de la muestra, se evitan las etapas de centrifugación y filtración para la separación de la fase líquida del residuo sólido (matriz de la muestra) e incremento de la calidad de la metodolgía analítica.

Este procedimiento combina los beneficios de la extracción asistida con energía de ultrasonidos con los obtenidos por los sistemas FIA (Valcárcel y Luque de Castro, 1987). Estos métodos automáticos todavía no se han propuesto para la extracción ácida asistida por energía de ultrasonidos de metales y su posterior determinación en muestras de algas, siendo por primera vez objeto de estudio y aplicación en este trabajo de investigación.

JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO

El mar es muchas veces el destino final de los contaminantes generados por los seres humanos. Los metales pesados son uno de estos contaminantes. El problema surge cuando se produce un aumento de concentración y se convierten en sustancias tóxicas para los organismos marinos o acumularse en la cadena trófica de forma que pueden convertirse en tóxicos para el hombre. Los productos marinos, entre los que se encuentran las algas, forman parte hoy día de la dieta humana. Por lo que sería interesante conocer su composición en


lo que se refiere a metales para establecer su valor nutricional y para determinar su seguridad alimentaria. Las algas se utilizan como bioindicadores de la contaminación ambiental, con lo cual también es importante conocer su contenido metálico para establecer el grado de contaminación por metales del medio ambiente marino de donde proceden. Hasta la fecha no se han propuesto métodos analíticos automáticos para la determinación de metales en muestras de algas.

Todo ello justifica la necesidad de proponer metodologías analíticas automáticas para utilizar de manera rutinaria en laboratorios de control de calidad de alimentos y en laboratorios de control de calidad del medio marino. Estos métodos permitirán realizar de manera rápida y fiable un control riguroso del contenido metálico en organismos marinos como son las algas.

PARTE EXPERIMENTAL

En este trabajo de investigación se ha realizado la determinación de metales en algas marinas destinadas a la alimentación humana producidas y procesadas en Galicia. Para llevar a cabo este estudio se han optimizado dispositivos basados en el análisis por inyección en flujo (FIA) que permiten realizar en línea la extracción ácida asistida por energía de ultrasonidos de los metales de las muestras de algas y la determinación continua de los mismos por FAAS.

Reactivos, aparatos e instrumentación analítica

Ácido nítrico (Merck): 65%, d=1,39 g/mL, Pm= 63,01 g/mol, ácido clorhídrico (Merck): 30%, d=1,15 g/mL, Pm=36,46 g/mol, agua ultrapura de 18,2 MΩ cm de resistividad específica, obtenida por el sistema Milli-Q (Millipore Corp.), disolución patrón de cinc (Merck): 1000 mg/L (Zn (NO3)2 en HNO3 0,5 mol/L), disolución patrón de cobre (Merck): 1000 mg/L (Cu(NO3)2 en HNO3 0,5 mol/L), disolución patrón de hierro (Merck): 1000 mg/L (Fe(NO3)3 en HNO3 0,5 mol/L), disolución patrón de manganeso (Merck): 1000 mg/L (Mn(NO3)2 en HNO3 0,5 mol/L), disolución patrón de calcio (Merck): 1000 mg/L (Ca (NO3)2 en HNO3 0,5 mol/L), disolución patrón de magnesio (Merck): 1000 mg/L (Mg (NO3)2 en HNO3 0,5 mol/L). Cloruro de lantano (III) heptahidratado (LaCl3·7 H2O) (Merck). Agua ultrapura de 18,2 MΩ cm de resistividad específica, obtenida por el sistema Milli-Q (Millipore Corp.).


Bombas peristálticas GILSON MINIPULS 3, con ocho canales y selector de velocidad. Minicolumna de vidrio borosilicatado químicamente inerte (Omnifit) de 3 mm de diámetro interno y 100 mm de longitud con dos terminales fijos y 0,70 mL de volumen de lecho. En esta minicolumna se introduce la muestra, colocando, en cada uno de sus extremos, un papel de filtro (Whatman 541) para evitar cualquier obturación de sistema por pérdida de muestra durante el proceso (Figura 1).

Figura 1. Minicolumna conteniendo la muestra.

Ultrasonidos Selecta de 550 watios de potencia con selector de temperatura y tiempo programable. Frecuencia de ultrasonidos 40 kHz. Válvulas de selección y de inyección de tipo hexagonal (Rheodyne). Espectrofotómetro de Absorción Atómica Perkin Elmer, modelo 5000, con llama aire-acetileno y sistema nebulizador de bola de impacto y mechero de 10 cm.

Todo el material de vidrio y plástico fue lavado y almacenado en ácido nítrico al 10% (V/V) al menos durante 48 h. Antes de ser utilizado se enjuagó tres veces con agua ultrapura (Milli-Q).

Preparación de las muestras de algas

Para poder llevar a cabo los análisis de las muestras, éstas han sido trituradas y homogeneizadas. Una vez homogeneizadas, se secaron en una estufa a 80 ± 5 ºC hasta tener las muestras a peso constante. Después se tamizaron para conseguir fracciones de partículas menores de 30 µm y partículas entre 30-200 µm.

Procedimiento para la determinación de cinc, cobre, hierro y manganeso

El esquema de trabajo del método optimizado para la determinación de Zn, Cu, Fe y Mn en algas marinas utilizando el dispositivo FIA


propuesto (Figura 2) es el siguiente: En una primera etapa se realiza la extracción de Zn, Cu, Fe y Mn. Para ello se inserta con cuidado y se pesa

Figura 2. Dispositivo FIA usado para la determinación de Zn, Cu, Fe y Mn en muestras de algas mostrando los valores óptimos. AU, agua ultrapura (portador); B, blanco; BU, baño de ultrasonidos; B1 y B2, bombas peristálticas; D, desecho; DE, disolución extractante; DP, disolución patrón; FAAS, espectrofotómetro de absorción atómica con llama; M, columna conteniendo la muestra; RM, reactor de mezcla; VI, válvula de inyección; VS1, VS2 y VS3, válvulas de selección.

directamente en la minicolumna la muestra de alga marina seca, triturada y homogeneizada (10, 80, 10 y 25 mg, para Zn, Cu, Fe y Mn, respectivamente). Posteriormente, se colocan dos papeles de filtro en los extremos de la columna para evitar pérdidas de muestra a través del sistema. Una vez preparada la minicolumna, se conecta en el sistema de flujo continuo, se llena el sistema de disolución extractante por medio de la VS1 (1 mL de ácido nítrico 0,1M; 3 M; 3M y 0,5 M para Zn, Cu, Fe y Mn, respectivamente), manteniendo la temperatura del baño a 20 ºC (temperatura ambiente). Después, se somete a la minicolumna a la acción de la energía de ultrasonidos durante 0,5 min para el Zn y el Mn, y 1 min para el Cu y el Fe, a la vez que circula a su través la disolución extractante. El sentido del movimiento de la disolución extractante que circula a través de la columna a 6 mL/min se cambia cada 10-15 s para que no se produzcan compactaciones de la muestra en el interior de la columna. Una vez realizada la extracción de los metales de la muestra, se gira la válvula de selección (VS2) pasando el extracto ácido a la segunda parte del sistema, mientras que la disolución blanco va al desecho. En esta parte, el extracto ácido se homogeneiza en un reactor de mezcla (RM). Tras ser homogeneizado, se inyectan 250 µL de extracto ácido en una corriente portadora (agua ultrapura) a través de una válvula de inyección (VI). Esta


disolución portadora que circula a un caudal de 3,5 mL/min, transporta el bolo de muestra hasta el nebulizador de un espectrofotómetro de absorción atómica con llama (FAAS), donde se detectan los metales de forma continua. Para realizar las rectas de calibrado se introducen secuencialmente en el sistema FIA disoluciones patrón de distintas concentraciones de cada metal (preparadas en ácido nítrico 0,1 M para el Zn, 3 M para el Cu y el Fe, y 0,5 M para el Mn). El volumen inyectado de cada disolución patrón a través de la válvula de inyección (VI) en la disolución portadora es de 250 mL (igual que el de la muestra). La disolución blanco es ácido nítrico 0,1 M para el Zn, 3 M para el Cu y el Fe, y 0,5 M para el Mn.

Procedimiento para la determinación de calcio y magnesio

El esquema de trabajo del método optimizado para la determinación de Ca y Mg en algas marinas utilizando un dispositivo FIA (Figura 3) es el siguiente: Primero se

Figura 3. Dispositivo FIA usado para la determinación de Ca y Mg en muestras de algas mostrando los valores óptimos. AU, agua ultrapura (portador); B, blanco; BU, baño de ultrasonidos; B1 y B2, bombas peristálticas; D,desecho; DE, disolución extractante; DIL, canal de dilución (disolución de lantano); DP, disolución patrón; FAAS, espectrofotómetro de absorción atómica con llama; M, columna conteniendo la muestra; RM, reactor de mezcla; VI, válvula de inyección; VS1, VS2 y VS3, válvulas de selección.

realiza la extracción de Ca y Mg. Para ello se inserta con cuidado y se pesa directamente en la minicolumna la muestra de alga marina seca, triturada y homogeneizada (30 mg para la determinación de Ca y 5 mg para la determinación de Mg). Después, se colocan dos papeles de filtro en los extremos de la columna para evitar pérdidas de muestra a través del sistema.


Una vez preparada la minicolumna, se conecta en el sistema de flujo continuo, se llena el sistema de disolución extractante por medio de la VS1 (5 mL de ácido nítrico 3 M para Ca y 0,5 M para Mg), manteniendo la temperatura del baño a 20 ºC (temperatura ambiente). Después, se somete a la minicolumna a la acción de la energía de ultrasonidos durante 0,5 min, a la vez que circula a su través la disolución extractante. El sentido del movimiento de la disolución extractante que circula a través de la columna a 6 mL/min se cambia cada 10-15 s para que no se produzcan compactaciones de la muestra en el interior de la columna. Una vez realizada la extracción de los metales de la muestra, se gira la válvula de selección (VS2) pasando el extracto ácido a la segunda parte del sistema, mientras que la disolución blanco va al desecho. En esta parte, el extracto ácido se homogeneiza en un reactor de mezcla (RM). Tras ser homogeneizado, se inyectan 250 µL de extracto ácido en una corriente portadora (agua ultrapura) a través de una válvula de inyección (VI). Esta disolución portadora que circula a un caudal de 0,2 mL/min converge con un canal de dilución (lantano 2%) que circula a 5,8 mL/min. El canal resultante que contiene el extracto ácido diluido llega directamente hasta el nebulizador de un espectrofotómetro de absorción atómica con llama (FAAS), donde se detectan los metales de forma continua. Para realizar las rectas de calibrado se introducen secuencialmente en el sistema FIA 2 disoluciones patrón de distintas concentraciones de cada metal (preparadas en ácido nítrico 3 M para Ca y 0,5 M para Mg) a través de la válvula de inyección (VI). El volumen inyectado de cada disolución patrón en la disolución portadora es de 250 mL (igual que el de la muestra). Las distintas disoluciones patrón sufren la misma dilución en

Tabla 1. Determinación de Zn, Cu, Fe y Mn. Variables y nivelesconsiderados para el diseño factorial de screening.

línea que las muestras. La disolución blanco es ácido nítrico 3 M para el Ca, y 0,5 M para el Mg.


RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Determinación de cinc, cobre, hierro y manganeso

Para realizar la optimización de los parámetros que afectan a la extracción de Zn, Cu, Fe y Mn de las muestras de algas, se ha utilizado un diseño factorial debido a que el número de variables implicadas es elevado (6 variables). Así, es necesario aplicar un diseño factorial de screening, para reducir de modo significativo el número de experimentos a realizar en la optimización. Uno de los diseños de screening más utilizados es el diseño de Plackett-Burman. Éste permite fraccionar un diseño factorial completo proporcionando números de combinaciones de factores que son un múltiplo de cuatro. Por ejemplo, si se aplicara un diseño factorial completo a 2 niveles para 6 variables implicaría la realización de 64 experimentos. Sin embargo, aplicando el diseño de Plackett-Burman con un punto central, el número de experimentos a realizar es de trece. Así, las variables a optimizar para el dispositivo FIA 1 son las siguientes: concentración de HNO3 (disolución extractante), concentración de HCl (disolución extractante), tiempo de extracción,

Tabla 2. Determinación de Zn, Cu, Fe y Mn. Concentración certificada y cantidad de muestra analizada del material de referencia “Sargasso”, NIES-9, National Institute for Environmental Studies, Japan.

temperatura de extracción, caudal de extracción y volumen de disolución extractante. Para poder realizar este diseño factorial es necesario considerar para cada variable dos niveles (valor máximo y mínimo). Estos valores fueron seleccionados en función de experimentos realizados en estudios previos (Tabla 1).

El diseño factorial aplicado es el de Plackett-Burman 2^6*3/16 que implica realizar 13 experimentos (Statgraphics Plus v.5.1). En este diseño se ha


considerado un punto central en el que las variables toman un valor medio entre el límite superior e inferior. Una vez obtenida la matriz del diseño, se realizaron los experimentos fijados por la misma. Para realizar estos experimentos se utilizó un material de referencia certificado (NIES-9,”Sargasso”, National Institute for Environmental Studies, Japan). La concentración certificada para Zn, Cu, Fe y Mn, y la cantidad de material de referencia utilizada (fijada en función de la concentración) para optimizar el proceso se muestran en la Tabla 2.

La variable respuesta considerada ha sido el % eficacia en la extracción (% EF), calculado según la siguiente ecuación:

La matriz del diseño de Plackett-Burman con los valores que toma cada variable en cada experimento y el % eficacia en la extracción

Tabla 3. Matriz del diseño de Plackett-Burman con los valores de % EF para cada variable en cada experimento para la determinación de Zn, Cu, Fe y Mn. A, [HNO3]; B, [HCl]; C, Tiempo de extracción; D, Temperatura de extracción; E, Caudal de extracción; F, Volumen de disolución extractante.


obtenido para el Zn, Cu, Fe y Mn, se recogen en la Tabla 3. Los experimentos se han realizado por duplicado, por lo que el % eficacia en la extracción indicada es la media de estos dos experimentos.

Una vez realizados los experimentos, se procede al análisis de los datos. Para conocer que variables son significativas se recurre a las Cartas Pareto estandarizadas (Figura 4).

Figura 4. Cartas Pareto estandarizadas para la determinación de Zn, Cu, Fe y Mn. A, [HNO3]; B, [HCl]; C, Tiempo de extracción; D, Temperatura de extracción; E, Caudal de extracción; F, Volumen de disolución extractante.

A partir de la observación de las cartas Pareto (Figura 4) se pueden establecer las siguientes conclusiones en función de cada variable:

Concentración de ácido nítrico (A): En todos los casos la concentración de HNO3 es una variable estadísticamente significativa con efecto estimado positivo. Esto se debe a su efecto oxidante, el cual facilita el proceso de extracción.


Concentración de ácido clorhídrico (B): No es una variable estadísticamente significativa. Aunque presenta un efecto estimado positivo para la extracción de Zn, Cu, Fe y Mn.

Tiempo de extracción (C): No es una variable estadísticamente significativa. Aunque presenta un efecto estimado positivo para la extracción de Zn, Cu, Fe y Mn, ya que cuanto más tiempo permanezca la muestra bajo la acción de la energía de ultrasonidos mayor contacto se produce entre la muestra y la disolución extractante, y por tanto se logra una mayor eficacia en la extracción. Sin embargo, tiempos de sonicación elevados suponen elevados tiempos de análisis y por lo tanto una reducción de la frecuencia de muestreo.

Temperatura de extracción (D): No es una variable estadísticamente significativa, y presenta efectos estimados muy pequeños en todos los casos. Esto indica que esta variable prácticamente no influye en el proceso de extracción.

Caudal de extracción (E): Para ninguno de los cuatro metales es una variable estadísticamente significativa. Aunque presenta un efecto estimado positivo.

Volumen de disolución extractante (F): En ninguno de los casos es una variable estadísticamente significativa y siempre presenta un efecto estimado positivo, aunque éste no es muy elevado.

Como el diseño de Plackett-Burman proporciona las tendencias de cada una de las variables hacia el óptimo, y no el valor optimo en sí mismo, se realizaron una serie de experimentos fuera del marco del diseño, de acuerdo con los resultados obtenidos por el mismo, para determinar los valores óptimos de cada una de las variables que afectan a la extracción de Zn, Cu, Fe y Mn. Comenzando por aquellas variables no significativas se comprueba que un volumen de disolución extractante de 1 mL y una temperatura de extracción de 20ºC pueden ser los valores óptimos para estas variables, ya que con ellos se obtienen eficacias en la extracción cuantitativas (experimentos 1 y 3 de la matriz de Plackett-Burman, Tabla 3).

En el estudio de las variables tiempo de extracción y caudal de extracción (Figura 5) se observa que, a pesar de que el tiempo de extracción tiene un efecto estimado bastante positivo, son suficientes 0,5, 1, 1 y 0,5 min a un


caudal de 6 mL/min para extraer cuantitativamente el Zn, Cu, Fe y Mn en este tipo de muestras. Así, éstos valores serán elegidos como óptimos para estas variables, ya que con ellos se alcanza la frecuencia de muestreo más elevada

Figura 5. Optimización del tiempo de extracción para Zn, Cu, Fe y Mn para caudales de extracción de 3,5 y 6 mL/min. [HNO3]=3 M; [HCl]=3 M; Temperatura de extracción= 20 ºC; Volumen de disolución extractante= 1 mL.

Con respecto a las concentraciones de los ácidos, se estudió la posibilidad de eliminar el ácido clorhídrico, ya que su concentración resultó ser una variable no estadísticamente significativa en el diseño de screening. Así, los estudios realizados deteminaron que si se elimina de la disolución extractante este ácido (utilizando únicamente HNO3 3M como disolución extractante) se obtienen eficacias en la extracción cuantitativas (95,3-100,5%), lo cual también se puede corroborar con los experimentos 1 y 4 de la matriz de Plackett-Burman, Tabla 3). Una vez comprobado que se podía eliminar el ácido clorhídrico de la disolución extractante, se estudió la posibilidad de disminuir la concentración de HNO3 al máximo. Como se observa en la Figura 6, fue posible disminuir la concentración de este ácido hasta un valor de 0,1 M para la extracción del Zn y 0,5 M para la extracción del Mn, mientras que para la extracción de Cu y Fe la mínima concentración de ácido nítrico necesaria para extraer cuantitativamente estos metales debía ser de 3M.


Figura 6. Optimización de la concentración de ácido nítrico utilizado como disolución extractante para Zn, Cu, Fe y Mn. [HCl]=0 M; Tiempo de extracción= 0,5 min para Zn, y Mn y 1 min para Cu y Fe; Temperatura de extracción= 20 ºC; Caudal de extracción= 6 mL/min; Volumen de disolución extractante= 1 mL.

Al realizar la optimización de las distintas variables que afectan al proceso de extracción ácida se han utilizado las cantidades de muestra indicadas en la Tabla 2. No obstante, también se ha investigado la posibilidad de analizar cantidades de muestra mayores con el objetivo de incrementar la sensibilidad de la metodología analítica desarrollada. Para realizar este estudio se ha tenido en cuenta la sensibilidad de cada uno de los metales en el espectrofotómetro de absorción atómica con llama y la concentración normalmente existente en las muestras de algas. Así, los resultados obtenidos en este estudio para Zn, Cu, Fe y Mn demostraron que con las condiciones óptimas es posible utilizar cantidades de muestra hasta 60, 100, 25 y 90 mg, para Zn, Cu, Fe y Mn, respectivamente. Cantidades mayores no se probaron porque esto requeriría incorporar un canal de dilución en el dispositivo para no sobrepasar el límite de linealidad del detector.

Los estudios anteriores se realizaron con el material de referencia certificado NIES-9, el cual presenta un diámetro de partícula de 80 mesh (177 µm). Por tanto, con el objetivo de estudiar si esta variable influye en el proceso de extracción de Zn, Cu, Fe y Mn de las muestras de algas se analizaron diferentes porciones de la misma muestra con diferentes tamaños de partícula. Los diámetros de partícula estudiados fueron dos: 1) partículas de muestra con diámetros menores de 30 µm y 2) partículas de muestra con diámetros entre 30-200 µm. Para realizar el estudio de la influencia del tamaño de partícula, se tomó una muestra real de alga, de la que se seleccionaron


los dos tamaños de partícula anteriormente citados. En consecuencia, para poder comparar los resultados obtenidos por el método propuesto para cada tamaño de partícula fue necesario establecer la concentración de los metales en cada fracción de muestra. Para ello, se realizó la determinación de los metales utilizando como pretratamiento de la muestra una digestión ácida, ya que ésta es una metodología contrastada y convencional para este tipo de muestras (Chan et al., 2006). De este modo, fue posible correlacionar los valores obtenidos con cada metodología (la propuesta y la convencional) para cada tamaño de partícula estudiado. En la Tabla 4 se muestran los resultados obtenidos, demostrándose que en el intervalo estudiado el tamaño de partícula no influye en la determinación de estos metales con la metodología propuesta, ya que en todos los casos se obtienen %EF cuantitativos (mayores de 95%). Esto simplifica el análisis, ya que no hay que realizar un tamizado exhaustivo para seleccionar un tamaño de partícula concreto y muy pequeño de la muestra antes de insertarla en el dispositivo automático de determinación de los metales.

Determinación de calcio y magnesioPara realizar la optimización de los parámetros que afectan a la

extracción de Ca y Mg de las muestras de algas, también se ha utilizado un diseño factorial. Al igual que en el estudio de la optimización de las

Tabla 4. Determinación de Zn, Cu, Fe y Mn. Experimentos realizados en porciones de muestra con diferente tamaño de partícula.

*DA: Digestión ácida de la muestra**MP: Método propuesto


variables implicadas en la extracción de Zn, Cu, Fe y Mn, se ha elegido como diseño de screening el diseño de Plackett-Burman. En este caso, las variables a optimizar para el dispositivo FIA (Figura 3) son las siguientes: concentración de HNO3 (disolución extractante), concentración de HCl (disolución extractante), tiempo de extracción, temperatura de extracción, caudal de extracción, volumen de disolución extractante y concentración de la disolución de lantano. Como se puede observar, se ha incluido como variable la concentración de lantano, a pesar de no ser una variable implicada directamente en el proceso de extracción. Esto se explica porque para poder realizar la determinación tanto del calcio como del magnesio, es necesario eliminar las posibles interferencias químicas que sufren estos dos metales en la celda de atomización. Además, el extracto ácido debe diluirse, ya que las concentraciones de estos dos metales presentes en las muestras objeto de estudio son muy elevadas. De hecho, según el límite de linealidad de estos metales, 5 y 0,5 µg/mL, para Ca y Mg, respectivamente, y teniendo en cuenta las concentraciones a las que se pueden encontrar estos metales en las algas marinas, se escogieron respectivamente, como caudal de portador y caudal de dilución 0,2 y 5,8 mL/min, lo que supone realizar en línea una dilución 1:30. Para realizar el diseño de screening es necesario considerar para cada variable un valor máximo y uno mínimo. Estos valores fueron seleccionados en función de experimentos realizados en estudios previos (Tabla 5).

Tabla 5. Determinación de Ca y Mg. Variables y niveles considerados para el diseño factorial de screening.


El diseño factorial aplicado es el de Plackett-Burman 2^7*3/32 que implica realizar 13 experimentos (considerando un punto central) (Statgraphics Plus v.5.1). Para realizar los experimentos establecidos por la matriz del diseño se utilizó el material de referencia certificado (NIES-9,”Sargasso”, National Institute for Environmental Studies, Japan). La concentración certificada es de 1,34 ± 0,05 y 0,65 ± 0,03 %, para Ca y Mg, respectivamente. La cantidad de material de referencia utilizada para optimizar el proceso (fijada en función de la concentración) fue de 30 y 5 mg, para Ca y Mg, respectivamente. La variable respuesta considerada ha sido el % EF. La matriz del diseño de Plackett-Burman con los valores que toma cada variable en cada experimento y el % EF obtenido para el Ca y el Mg, se muestran en la Tabla 6. Los experimentos se han realizado

Tabla 6. Matriz del diseño de Plackett-Burman con los valores de % EF para cada variable en cada experimento para la determinación de Ca y Mg. A, [HNO3]; B, [HCl]; C, Tiempo de extracción; D, Temperatura de extracción; E, Caudal de extracción; F, Volumen de disolución extractante; G, concentración de la disolución de lantano.

por duplicado, por lo que el % EF indicada es la media de estos dos experimentos.

Una vez realizados los experimentos, se analizaron los datos mediante las Cartas Pareto estandarizadas (Figura 7).


Figura 7. Cartas Pareto estandarizadas para la determinación de Ca y Mg. A, [HNO3]; B, [HCl]; C, Tiempo de extracción; D, Temperatura de extracción; E, Caudal de extracción; F, Volumen de disolución extractante; G, Concentración de la disolución de lantano.

A partir del estudio de las cartas Pareto (Figura 7) se pueden establecer las siguientes conclusiones en función de cada variable:

Concentración de ácido nítrico (A): Para Ca y Mg la concentración de HNO3 es una variable estadísticamente significativa con efecto estimado positivo.

Concentración de ácido clorhídrico (B): No es una variable estadísticamente significativa, aunque presenta un efecto estimado positivo para la extracción de Ca y Mg.

Tiempo de extracción (C): No es una variable estadísticamente significativa. Aunque presenta un efecto estimado positivo para la extracción de Ca y Mg.

Temperatura de extracción (D): No es una variable estadísticamente significativa, y presenta efectos estimados muy pequeños para la extracción de Ca y Mg. Esto indica que esta variable prácticamente no influye en el proceso de extracción.

Caudal de extracción (E): No es una variable estadísticamente significativa para la extracción de estos dos metales. Aunque presenta un efecto estimado positivo.

Volumen de disolución extractante (F): En ninguno de los casos es una variable estadísticamente significativa y siempre presenta un efecto estimado positivo, aunque éste no es muy elevado.


Concentración de la disolución de lantano (G): Para Ca y Mg la concentración de la disolución de lantano es una variable estadísticamente significativa con efecto estimado positivo. Esto demuestra que es necesaria esta disolución para eliminar las interferencias producidas por la formación de compuestos estables a la temperatura de llama.

Se realizaron una serie de experimentos fuera del marco del diseño, de acuerdo con los resultados obtenidos por el mismo, para determinar los valores óptimos de cada una de las variables que afectan a la extracción de Ca y Mg. Se comenzó por aquellas variables no significativas y se comprobó que un volumen de disolución extractante de 5 mL y una temperatura de extracción de 20ºC pueden ser los valores óptimos para estas variables, ya que con ellos se obtienen eficacias en la extracción cuantitativas (experimento 1 de la matriz de Plackett-Burman, Tabla 6). Si se tiene en cuenta que el caudal de extracción presenta un efecto estimado positivo y que en los experimentos 5 y 11 de la matriz de Plackett-Burman (Tabla 6) se consiguen eficacias en la extracción cuantitativas, un caudal de extracción de 6 mL/min podía ser considerado como óptimo para la extracción de Ca y Mg.

Al estudiar el tiempo de extracción (Figura 8) se puede ver que aunque esta variable presenta un efecto estimado bastante importante y positivo, son suficientes 0,5 min para extraer cuantitativamente el Ca y el Mg en este tipo de muestras.

Figura 8. Optimización del tiempo de extracción para Ca y Mg. [HNO3]=3 M; [HCl]=3 M; Temperatura de extracción= 20 ºC; Caudal de extracción= 6 mL/min; Volumen de disolución extractante= 1 mL; Concentración de la disolución de lantano= 2%.


Además, se estudió la posibilidad de eliminar el ácido clorhídrico de la disolución extractante, ya que su concentración resultó ser una variable no estadísticamente significativa en el diseño de screening. Así, los estudios realizados deteminaron que si se elimina se obtienen eficacias en la extracción cuantitativas (98,7-101,7%), lo cual también se puede corroborar con los experimentos 1 y 11 de la matriz de Plackett-Burman, Tabla 6). Una vez comprobado que se podía eliminar el ácido clorhídrico de la disolución extractante, se estudió la posibilidad de disminuir la concentración de ácido nítrico al máximo. Como se observa en la Figura 9, fue posible disminuir la concentración de este ácido hasta un valor de 0,5 M para la extracción del Mg, mientras que para la extracción de Ca la mínima concentración de ácido nítrico necesaria para extraer cuantitativamente este metal debía ser de 3M.

Figura 9. Optimización de la concentración de ácido nítrico utilizado como disolución extractante para Ca y Mg. [HCl]=0 M; Tiempo de extracción= 0,5 min; Temperatura de extracción= 20 ºC; Caudal de extracción= 6 mL/min; Volumen de disolución extractante= 5 mL; Concentración de la disolución de lantano= 2%.

Por último, se estudió la variable concentración de la disolución de lantano. Así, se comprobó que para ambos metales, la concentración de la disolución de lantano, necesaria para eliminar las interferencias, no podía ser menor del 2%.

Al realizar la optimización de las distintas variables que afectan al proceso de extracción ácida se han utilizado las cantidades de muestra antes indicadas.


En este caso, también se ha investigado la posibilidad de analizar cantidades de muestra mayores con el objetivo de incrementar la sensibilidad de la metodología analítica desarrollada. Para realizar este estudio se ha tenido en cuenta la sensibilidad de ambos metales en el espectrofotómetro de absorción atómica con llama y la concentración normalmente existente en las muestras de algas. Los resultados obtenidos en este estudio demostraron que con las condiciones óptimas establecidas es posible utilizar cantidades de muestra hasta 50 y 10 mg, para Ca y Mg, respectivamente. Cantidades mayores no se probaron porque esto requeriría aumentar el caudal del canal de dilución del dispositivo FIA para no sobrepasar el límite de linealidad del detector.

Se analizaron diferentes porciones de la misma muestra de alga con diferentes tamaños de partícula (menor de 30 y entre 30 - 200 µm) con el objetivo de estudiar si la variable tamaño de partícula influía en el proceso de extracción de Ca y Mg de las muestras de algas. En la Tabla 7 se muestran los resultados obtenidos, demostrándose que en el intervalo estudiado el tamaño de partícula no influye en la determinación de estos metales con la metodología propuesta, ya que en todos los casos se obtienen %EF cuantitativos.

Tabla 7. Determinación de Ca y Mg. Experimentos realizados en porciones de muestra con diferente tamaño de partícula.

*DA: Digestión ácida de la muestra**MP: Método propuesto

Características analíticas de los métodos propuestos para la determinación de Zn, Cu, Fe y Mn en muestras de algas

Con el objetivo de estudiar las posibles interferencias que puede provocar la matriz de la muestra, es decir la influencia de los demás componentes de


las algas, se comparó para cada uno de los casos la pendiente de la recta de calibrado con la obtenida para la recta de adición. Los resultados obtenidos aparecen en la Figura 10. Como se puede observar en esta Figura, en todos los casos la recta de calibrado y la recta de adición son paralelas. Dicho paralelismo se corroboró mediante la aplicación de un test estadístico t para un nivel de significación del 95%. Por todo ello, se puede decir que no existe efecto matriz para la determinación de Zn, Cu, Fe y Mn en las muestras de algas por el método propuesto. Lo que se traduce en que se puede utilizar únicamente la recta de calibrado correspondiente para relacionar la señal de la muestra con la concentración existente de cada metal.

Figura 10. Rectas de calibrado y adición para Zn, Cu, Fe y Mn.

Se calculó el límite de detección (LOD), el límite de cuantificación (LOQ) y el intervalo lineal teniendo en cuenta distintas cantidades de muestra para la determinación de Zn, Cu, Fe y Mn en muestras de algas por el método propuesto. Los resultados obtenidos para cada uno de estos parámetros se muestran en la Tabla 8.

La comprobación de la exactitud de la metodología analítica propuesta se realizó de tres maneras: realizando el test de pares de valores (comparación con


un método convencional de pretratamiento de la muestra realizando la digestión de la misma con ácidos concentrados), estudio de la recuperación analítica y mediante la utilización de un material de referencia. Los valores obtenidos en el test de pares de valores sobre diferentes muestras resultaron comparables estadísticamente al 95% de probabilidad, es decir, no hay diferencias entre los resultados obtenidos por los dos métodos. El estudio de la recuperación del método se realizó analizando una muestra real de alga. En el análisis de esta muestra se utilizaron disoluciones extractantes (HNO3 0,1M para Zn, HNO3 3 M para Cu y Fe, y HNO3 0,5 M para Mn) a las que se le habían adicionado distintas concentraciones de cada metal (0,1; 1,0; 1,0 y 0,5, µg/mL, para Zn, Cu, Fe y Mn, respectivamente). Los resultados obtenidos fueron 98,7, 96,8, 101,3 y 99,3%, para Zn, Cu, Fe y Mn, respectivamente. Se analizó un material de referencia (NIES-9,”Sargasso”, National Institute for Environmental Studies, Japan), de

Tabla 8. LOD, LOQ e intervalo lineal para la determinación de Zn, Cu, Fe y Zn en algas para distintas cantidades de muestra.

composición elemental típica de un alga marina parda. El contenido certificado, para los metales en este material de referencia es: 15,6 ± 1,2; 4,9 ± 0,2; 187


± 6 y 21,2 ± 1,0 µg/g, para Zn, Cu, Fe y Mn, respectivamente. Los resultados obtenidos para el análisis de estos metales por el método propuesto fueron los siguientes (media ± desviación estándar, n=3): 15,0 ± 0,2; 5,1 ± 0,1; 183,7 ± 1,1 y 20,9 ± 0,2 µg/g, para Zn, Cu, Fe y Mn, respectivamente. Con todos estos datos se puede decir que el procedimiento utilizado para realizar la determinación de Zn, Cu, Fe y Mn en algas marinas mediante la metodología automática propuesta es exacto.

La precisión se estudió en base al cálculo de la repetibilidad de la metodología propuesta. Para ello, se aplicó el método propuesto a once muestras de una misma alga. Los resultados obtenidos expresados como coeficiente de variación fueron los siguientes: 1,3; 2,0; 0,6 y 1,0%, para Zn, Cu, Fe y Mn, respectivamente.

Se calculó la frecuencia de muestreo del método propuesto considerando la duración de la etapa de extracción y la duración de la etapa de medida (20 s). De esta manera, las frecuencias de muestreo para los distintos metales fueron las siguientes: 60, 36, 36 y 60 muestras/h, para Zn, Cu, Fe y Mn, respectivamente.

Características analíticas de los métodos propuestos para la determinación de Ca y Mg en muestras de algas

Como se puede observar en la Figura 11, la recta de calibrado y la recta de adición son paralelas. Este paralelismo se comprobó mediante la aplicación de un test estadístico t para un nivel de significación del 95%. Por todo ello, es posible concluir que no existe efecto matriz para la determinación de Ca y Mg en las muestras de algas por el método propuesto.

Figura 11. Rectas de calibrado y adición para Ca y Mg.


Se calculó el límite de detección (LOD), el límite de cuantificación (LOQ) y el intervalo lineal teniendo en cuenta distintas cantidades de muestra para la determinación de Ca y Mg en muestras de algas por el método propuesto. Los resultados obtenidos para cada uno de estos parámetros se muestran en la Tabla 9.

La comprobación de la exactitud de la metodología analítica propuesta se realizó mediante el estudio de la recuperación analítica y analizando un material de referencia certificado. El estudio de la recuperación del método se realizó analizando una muestra real de alga. En el análisis de esta muestra se utilizaron disoluciones extractantes (HNO3 3 M para Ca y HNO3 0,5 M para Mg) a las que se le habían adicionado distintas concentraciones de cada metal (20 y 1 µg/mL, para Ca y Mg, respectivamente). Los resultados obtenidos para la recuperación analítica fueron 98,7 y 101,0%, para Ca y Mg, respectivamente). Lo que significa

Tabla 9. LOD, LOQ e intervalo lineal para la determinación de Ca y Mg en algas para distintas cantidades de muestra.

que se obtiene una recuperación cuantitativa en ambos casos. Además, se analizó un material de referencia (NIES-9,”Sargasso”, National Institute for Environmental Studies, Japan). El contenido certificado, para Ca y Mg en este material de referencia es 1,34 ± 0,05 y 0,65 ± 0,03%, para Ca y Mg, respectivamente. Los resultados obtenidos para la determinación de estos metales en el material de referencia por la metodología propuesta


(media ± desviación estándar, n=3) fueron 1,33 ± 0,02 y 0,66 ± 0,01%, para Ca y Mg, respectivamente.

La precisión se estudió en base al cálculo de la repetibilidad de la metodología propuesta. Para ello, se aplicó el método propuesto a once muestras de una misma alga. Los resultados obtenidos para el estudio de la precisión expresados como coeficiente de variación estaban en el intervalo 0,9-1,4%, demostrándose la precisión de la metodología analítica propuesta.

Se calculó la frecuencia de muestreo del método propuesto considerando la duración de la etapa de extracción (0,5 min) y la duración de la etapa de medida (25 s). Así, la frecuencia de muestreo para Ca y Mg resultó ser de 55 muestras/h.

APLICACIÓN DE LAS METODOLOGÍAS ANALÍTICAS DESARROLLADAS. DETERMINACIÓN DE ZN, CU, FE, MN, CA Y MG EN ALGAS MARINAS DESTINADAS A LA ALIMENTACIÓN HUMANA PRODUCIDAS Y PROCESADAS EN GALICIA

Los métodos propuestos fueron aplicados para la determinación de de Zn, Cu, Fe, Mn, Ca y Mg en algas marinas destinadas a la alimentación humana producidas y procesadas en Galicia. Las muestras analizadas se adquirieron en supermercados y tiendas de alimentación. Estas algas son las siguientes:

Algas rojas: Agar-agar Atlántica (Gelidium sesquipedale), Dulse (Palmaria palmata), Musgo de Irlanda (Chondrus crispus) y Nori (Porphyra umbilicalis).

Algas pardas: Wakame (Undaria pinnatifida), Espagueti de Mar (Himanthalia elongata), Kombu (Laminaria ochroleuca) y Kombu de azúcar (Laminaria saccharina).

Algas verdes: Lechuga de mar (Ulva rigida).Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 10.

CONCLUSIONES

Las ventajas que presenta la metodología automática propuesta frente a los métodos analíticos utilizados hasta el momento para realizar la determinación de metales en muestras de algas son las siguientes:


Tabla 10. Resultados obtenidos para las muestras de algas analizadas: concentraciones de Zn, Cu, Fe, Mn, Ca y Mg. Media ± desviación estándar (n= 3 determinaciones).

* Concentraciones expresadas en % (g metal /g muestra) x 100

- Se utiliza una cantidad de muestra menor: 5-160 mg frente a 0,2-0,5 g.

- El modo dinámico del los sistemas y la reducción del tamaño de muestra hacen que se pueda reducir el tiempo necesario para realizar cuantitativamente la extracción de los metales: 0,5-2 min frente a 30-35 min.

- La extracción tiene lugar con ácidos diluidos (0,1-3 M HNO3) y a temperatura ambiente.

- Debido a la miniaturización, se reduce el volumen de reactivos, lo cual además, en el caso del volumen de la disolución extractante, incrementa la sensibilidad del sistema.

- Se evita la contaminación de la muestra y las pérdidas de analito debido a una mínima manipulación de la muestra.

- Se evitan las etapas de centrifugación y filtración para la separación de la fase líquida del residuo sólido (matriz de la muestra). Este punto con el punto nº 2 hacen que se produzca una disminución considerable del tiempo de tratamiento de la muestra.

- Se produce un incremento en la calidad de la metodolgía analítica inherente a la metodología FIA utilizada.


Los metales esenciales, también denominados biometales, son los que están presentes en los organismos vivientes y ejercen una función biológica insustituible. Un déficit en el organismo de un metal esencial conduce a serias alteraciones biológicas. Actualmente la Organización Mundial de la Salud considera entre otros metales esenciales para la salud humana a Zn, Cu, Fe, Mn, Ca y Mg. En las algas estudiadas se encuentra un contenido importante de metales, lo que representa un alto valor nutritivo para este alimento. Según los datos obtenidos, las algas más ricas en Zn son Nori y Espagueti de mar, el alga más rica en cobre es la Dulse, las algas más ricas en hierro son Dulse y Lechuga de mar, las algas más ricas en manganeso son Dulse y Lechuga de mar, las algas más ricas en calcio son Espagueti de Mar y Wakame, y el alga más rica en magnesio es la Lechuga de mar. Estas concentraciones suponen una concentración de metales esenciales mayor que la que presentan los vegetales “terrestres” (Mataix Verdú, 1998).


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determinaciÓn de metales en algas … · las algas se definen como plantas talofitas, unicelulares...

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