determinacion de estroncio en muestras biologicas …

DETERMINACION DE ESTRONCIO EN MUESTRAS BIOLOGICAS POR

ESPECTROSCOPIA DE ABSORCION ATOMICA

TESIS DE MAESTRIA

Tutor: Dra. Marcela Burguera Co-tutor: Dr. Edgar Nieto

María Luisa Di Bernardo Navas

Mérida, 1999.

DIGITAliZADA http:l/tesis. ula.ve

SEHBIUJL. l: Tullo Febres Cordon)

CONTENIDO

Resumen

CAPITULO l. ESTRONCIO

1.1. Historia y estado natural

1.2. Propiedades químicas del estroncio

1.3. Uso del estroncio y sus compuestos

1.3 .1 Aplicaciones Industriales

1.3 .2 Aplicaciones clínicas

1.4 Distribución del estroncio en la biosfera

1.5 Toxicidad y bioquímica del estroncio y sus compuestos

1.6 Estroncio y las enfermedades óseas

Referencias bibliográficas

Pg.

1

1

2

2

3

4

5

7

10

CAPITULO 11. METO DOS PARA LA DETERMINACION DE ESTRONCIO EN MUESTRAS BIOLOGICAS

2.1 Análisis por activación neutrónica y microanálisis por Rayos-X

2.2 Emisión en plasma inductivamente acoplado

2.3 Espectroscopia de absorción atómica


12

13

13

16

CAPITULO 111. DETERMINACION DE ESTRONCIO EN HUESOS POR ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN ATOMICA EN LLAMAS

3.1 Aparatos 18

3.2 Reactivos 20

3.3 Muestras y procesamiento de muestras 22

3.4 Procedimiento general 22

3.5 Resultados y discusión 23

3.5.1 Optimización de los parámetros instrumentales 23

3.5.2 Proceso de digestión de la muestra 27

3.5.3 Estudio de interferencias 29

3.5.4 Evaluación del método 34

3.6 Aplicación a muestras reales 36

3.7 Conclusiones 40

Referencias bibliográficas 41

CAPITULO IV. DETERMINACION DE ESTRONCIO EN SANGRE Y ORINA POR ESPECTROSCOPIA DE ABSORCION ATOMICA CON ATOMIZACION ELECTROTERMICA

4.1 Aparatos 42

4.2 Reactivos 43

4.3 Muestreo y preparación de las muestras 44

4.4 Procedimiento general 45

4.5 Resultados y discusión 46

4.5.1 Elección del modificador 48

4.5.2 Programa de temperatura 52

4.5.3 Evaluación de interferencias 54

4.5.4 Características analíticas 55

4.6 Aplicación a muestras reales 57

4.7 Conclusiones 58

Referencias bibliográficas 59

María Di Bernardo ESTRONCIO Tesis de Maestria

RESUMEN

En el presente trabajo se desarrollaron métodos rápidos y directos para la determinación

de estroncio en distintas matrices biológicas (huesos, sangre y orina), basados en la

atomización del analito en llamas de acetileno (aire/acetileno y óxido nitroso/acetileno) y

en horno de grafito (con y sin plataforma y con y sin adición de modificadores de matriz).

En todos los casos se han optimizado los parámetros experimentales y se han

caracterizado los sistemas en términos de rango de trabajo, detección limite, precisión y

exactitud.

Las interferencias químicas y los efectos de ionización producidas por los componentes

de la matriz ósea en las llamas estudiadas se minimizaron por la adición simultánea de

lantano al 5% a las soluciones patrón y a las muestras. Una comparación de distintos

procedimientos de digestión mostró que el ácido nítrico concentrado añadido a la muestra

pulverizada y en presencia de radiación microondas destruye completamente la matriz ósea.

La llama de óxido nitroso/acetileno presenta características analíticas superiores, por lo

que se recomienda para el análisis de numerosas muestras con un contenido variable de

estroncio.

Este método se aplico para la determinación de estroncio en huesos (cabeza de fémur,

fémur y otros) de individuos aparentemente sanos y de pacientes que sufren osteoporosis.

En los digeridos se determinó el contenido de estroncio (33.86±15.81 ¡.tgg-1). Observándose

una relación estrecha con el contenido de calcio, el sexo, la edad la patología (osteoporosis)

y el tipo de hueso. Estos resultados muestran que el estroncio ayuda a la reabsorción del

calcio y a la remineralización ósea. Una discusión más detallada de estos parámetros será

objeto de trabajo posterior a esta tesis.

Para la determinación de estroncio en sangre y orina, se utilizo la técnica de absorción

atómica con atomización electrotérmica. Con el objeto de encontrar las mejores y más

cómodas condiciones de trabajo, se realizo un estudio comparativo de varios modificadores

de matriz (La, Mg, Pd, Ni, Ta, Lu, S m, E u, Tm y Tb) así como diferentes procedimientos

para corregir la radiación de fondo (lámpara de deuterio y efecto Zeeman) y diferentes

técnicas de atomización (pared y plataforma). Este objetivo se logro utilizando dos

María Di Bernardo ESTRONCIO Tesis de Maestría

instrumentos con distintos correctores de fondo: uno con lámpara de deuterio y el otro con

efecto Zeeman. Este estudio demostró que el lantano como modificador y atomización

sobre pared sin corregir el fondo con deuterio permite la obtención de los mejores

resultados. Sin embargo, utilizando el efecto Zeeman como corrector de la señal de fondo y

atomización sobre la plataforma integrada sin modificación de matriz también se obtienen

excelentes resultados. Ambos procedimientos proveen herramientas analíticas válidas para

la determinación de estroncio a los bajos niveles encontrados en fluidos biológicos,

permitiendo la realización de análisis rutinarios. Esta información es útil para entender las

interacciones del estroncio con otros elementos, su distribución en los diferentes

compartimentos del organismo y su papel en el desarrollo o prevención de algunas

enfermedades óseas. Elegir uno u otro de los procedimientos desarrollados solo está

limitado por la disponibilidad de equipos en los laboratorios analíticos.

El contenido de estroncio en muestras de sangre y orina fue de 30.12 ± 11.72 J.tgL"1 y

89.90 ± 34.75 J.tgL-1, respectivamente, con un coeficiente de correlación de 0.6235 que es

altamente significativo (p<0.001) para un intervalo de confianza del99%.

Los resultados obtenidos tanto para las muestras óseas como para los fluidos biológicos,

demuestran que existe una estrecha relación entre el contenido de estroncio, el sexo y la

edad, observándose en el sexo femenino una marcada baja de los niveles, comparado con

los hombres, que coincide con el descenso hormonal y el inicio de la etapa pre

menospausica.


CAPITULO 1

ESTRONCIO

l.l.Historiay estado natural

Durante mucho tiempo, los compuestos de estroncio fueron confundidos con los de

bario. Sin embargo, a finales del siglo XVIII (1790), el médico Escocés Crawford obtuvo a

partir de un mineral encontrado en una mina de plomo cerca de la localidad de Strontian,

condado de Argyle, Escocia "una nueva especie de tierra" a la que llamó estroncianita. Cl-3)

En 1792, Hope afumó que en realidad esto era un nuevo oxido (tierra) diferente al oxido de

bario, pero apenas en 1808, Davy preparó por electrólisis de este oxido un nuevo metal que

lo llamó estroncio. El estroncio fue preparado en un estado más puro por Bunsen y

Matthiessen en el proceso de electrólisis del cloruro de estroncio fundido en presencia de

pequeñas cantidades de cloruro de amonio, usado para bajar el punto de fusión. (3)

Los yacimientos más importantes de este metal se encuentran en algunas regiones de

Rusia, Inglaterra, Francia, Alemania, Estados Unidos, India, etc. Las fuentes principales de

compuestos de estroncio son la celestita (SrS04) y la estroncianita (SrC03). En distintas

proporciones también forma parte de otros minerales como estroncianoapatita (Ca,

Sr)s[(P04)3(F, OH)], stroncianocalcita (SrCa(C03)2) o baritocelestita (SrBa(S04)2).

Igualmente se ha señalado su presencia en yacimientos de aragonita, yeso, dolomita, ciertos

silicatos y en formaciones hidrotermales (J).

1.2 Propiedades químicas del estroncio

El estroncio es un metal amarillo, cuyo símbolo químico es Sr, el número atómico 38, y

con una masa atómica de 87,62 g mot1• Se encuentra ubicado en la Tabla Periódica en el

grupo lla de los elementos alcalinotérreos; en todas sus combinaciones tiene valencia +2,

forma compuestos predominantemente iónicos solubles en agua, del tipo SrX2 donde X =

cr, Br-, r, N02-, N03 -, Cl03-, Cl04-, Br03-, CN-, etc. y sales insolubles tales como:

carbonato, sulfato, cromato, oxalato, fluoruro, etc (l,2). El ion Sr +2 forma complejos 1:1 con


complexonas del tipo EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) o CDTA (ácido

ciclohexandiaminotetraacético) y con éteres policíclicos del tipo diciclohexil-18-corona-6.

Se conocen quince isótopos de estroncio, con números de masa entre 81 y 94 y otro con

número de masa 97. Los más abundantes son: Sr84 (0,56%), Sr86 (9,86%), Sr87 (7,02%), y

Sr88 (82,6%) conocidos como isótopos naturales y el Sr90 que es radioactivo. Este último es

un emisor ~ que resulta de la desintegración de las explosiones radiactivas y tiene una

semi-desintegración de 29 años. Este estroncio tiene actividad oncogénica, es captado por

el hueso y puede causar tumores óseos y transformación leucémica en la medula ósea;

ejemplo de ello fue la frecuencia de muertes por enfermedades neoplásicas en

sobrevivientes de las bombas atómicas de Hiroshima y Nagasaky (Z). Las descargas que

contienen Sr90 se quedan en la capa superficial del suelo y no penetra mas de 5 cm de

profundidad, siendo fácilmente acumulado en frutas y vegetales. El Sr90 proveniente de las

descargas nucleares hechas mar adentro (muchas veces clandestinamente), se acumulan en

organismos marinos que son ingeridos por el hombre a través de la cadena alimenticia. Este

tipo de estroncio no debe confundirse con el Sr88, el cual es estable, no acumulativo en el

organismo y objeto de este estudio.

1.3. Uso del estroncio y sus compuestos

l. 3.1. Aplicaciones industriales

Aunque se conocen muchos compuestos de estroncio, sólo unos pocos tienen cierta

importancia industrial: las sales de estroncio (principalmente el nitrato) se utilizan en

pirotecnia porque tienen la propiedad de producir una llama brillante de color carmesí.

También se utilizan como aditivos en los lubricantes y secantes por su estabilidad y

resistencia a altos cambios de temperatura. El carbonato de estroncio es uno de los

compuestos mas importantes; se usa para obtener otras sales, en la refinación de cinc (para

remover plomo y cadmio), en la preparación de magnetos cerámicos permanentes y en la

fabricación de pantallas de TV a color. El óxido de estroncio se emplea en la refinación del

azúcar de remolacha porque tiene la propiedad de formar un bisacarato insoluble

2


(C12H220 11 • 2Sr0), que puede ser separado de la melaza y refinado. La adición de

anhídrido carbónico regenera la sacarosa juntamente con el carbonato de estroncio

insoluble (1). Otra aplicación industrial importante es el uso del cloruro de estroncio como

aditivo en algunas marcas de pastas dentales. Esto se debe a estudios epidemiológicos que

indican baja incidencia de caries dentales en zonas con alto contenido de estroncio ( 5 - 1 O

mg L"1) y flúor (1 mg L"1

) en las aguas de consumo humano <4>. Los efectos beneficiosos de

la adición de compuestos de flúor a las pastas dentales podrían multiplicarse con la adición

de sales de estroncio.

1.3.2. Aplicaciones clínicas

El carbonato de estroncio es la adquisición más reciente en el campo de la terapia

antidepresiva desplazando las sales de litio como el carbonato y el acetato usadas

comúnmente para tal fin. Fundamentalmente es más eficaz para controlar el ánimo en

pacientes con psicosis maníaco-depresivas (5).

Los iones de estroncio en las terminaciones nerviosas pueden sustituir a los iones de

calcio asegurando la liberación de la acetilcolina, la cual es un derivado acetilado de la

colina, liberada en la terminación nerviosa mioneural y causante de la actividad muscular

que sigue a la estimulación nerviosa parasimpática <5>.

En el organismo, Sr88 se intercambia con el calcio y es incorporado al hueso y a los

dientes en crecimiento. Este intercambio es más rápido cuando el ritmo de incorporación

del calcio a la hidroxiapatita (3Ca3(P04)2.Ca(OH)2), responsable de la mineralización de la

matriz ósea es elevado. Los conocimientos sobre este proceso se han aprovechado para

estudiar el mecanismo de adsorción de calcio en el organismo y para descubrir neoplasias y

metástasis malignas en hueso usando Sr85 como marcador <5>.

El cloruro de estroncio se emplea actualmente en la terapia de cáncer óseo como

analgésico, con excelentes resultados, siendo incluso más eficaz y económico que cualquier

otro agente terapéutico de su competencia <6>. Igualmente, el estroncio tiene efectos

terapéuticos beneficiosos en la osteoporosis (?,s)_

3


1.4. Distribución del estroncio en la biosfera

La distribución de estroncio por toda la tierra es amplia; muestreos de suelo revelan

contenido de estroncio alrededor de 300 mg Kg-1, mientras que su presencia en los océanos

resulta (en un 80 %) como producto de sedimentación de carbonatos y sulfatos (9). Las

aguas marinas contienen cerca de 8 mg Sr L"1 y la cantidad de estroncio varía en un amplio

rango: desde 20 hasta 500 mg Kg"1 y desde 260 hasta 1400 mg Kg -1 en animales y plantas

marinas, respectivamente (10). Los niveles de este elemento en aguas dulces (0.08 mg L"\

animales (14 mg L"1) y plantas (26 mg L"1

) terrestres son significativamente mas bajos. La

proporción Sr/Ca en los ríos del mundo es de 0.005 y sin embargo, se estima que ellos le

confieren a los océanos 2.2 mio toneladas de estroncio por año, calculo basado en el

contenido promedio de los ríos.

Hay algunas evidencias de la presencia de un alto contenido de estroncio en el

organismo animal y humano, reportándose que una persona con un peso promedio de 70

Kg posee alrededor de 140 mg de estroncio, distribuido en distintos compartimentos del

cuerpo. El 99 % de este estroncio se encuentra depositado en los huesos, variando su

contenido en un mismo hueso y en diferentes partes del mismo (ll). Igualmente, los niveles

de estroncio en huesos varían con la región geográfica, hecho atribuible a diferencias en el

contenido de estroncio en las aguas de consumo y en los alimentos. Hay una aparente

relación proporcional entre los niveles de estroncio en huesos y en dientes, conociéndose

además que estos niveles aumentan con la edad (12). En la Tabla 1 se muestran valores

significativos de estroncio en diferentes matrices biológicas, observándose que los niveles

en fluidos biológicos (sangre y orina) son bastante bajos, por lo cual su determinación

necesariamente debe hacerse por métodos sensibles tales como espectroscopia de absorción

atómica con atomización electrotérmica (ETAAS) (13).

4


Tabla l. Niveles de estroncio en diferentes matrices biológicas3

Sangre Plasma Suero Orina Huesos Tejidos

completa blandos

26.8±0.8 16±8 22.2±4.8 81.0±2.5 30.0±2.5 0.14 7±0.005

17.0-42.5 10-28 14.4-30.7 30.5-150.0 18.3-48.9

(n=20) [13] (n=6) [14] (n=15)[15] (n=20) [13] (n=lO) [13] (n=10) [4]

11.4±3.88 25.5±6.0 30.9± 11.7 158±26 0.11 0±0.006

5.7-15.6 18.5-34.3 10-55 113-200 4.7-43.3

(n=22)[16] (n=18) [17] (n=25) [18] (n=6) [14] [18] (n=10) [18]

a ¡.tg L"1 y ¡.tg g·1 en fluidos y en tejidos (blandos y duros), respectivamente. (en cada columna se indica: promedio± desviación estándar; rangos, cuando los autores suministran la información; número de muestras analizadas en paréntesis; y número de la referencia citada al final del capitulo).

1.5 Toxicidad y bioquímica del estroncio y sus compuestos

El estroncio es considerado como un elemento de baja toxicidad; su toxicidad depende

del anión con que forme sales, siendo el salicilato y el cromato los más tóxicos, mientras

que en concentraciones elevadas, las demás sales resultan irritantes. Los síntomas de

intoxicación aguda son entre otros: excesiva salivación, cólicos, diarreas, vómitos y

eventualmente paro respiratorio <6>. El cromato de estroncio (SrCr04) es conocido como un

potente cancerígeno, propiedad atribuida mas bien al cromo y no al estroncio. Existe un

amplio margen de seguridad entre los niveles dietéticos de estroncio estable ingerido a

partir de los alimentos o de agua de consumo y aquellos que inducen efectos tóxicos. Por

ejemplo, niveles de estroncio tan altos como 3000, 6000 ó 12000 mg g·1 añadidos como

carbonato al alimento para gallinas ponedoras fueron suministrados por cuatro semanas en

una dieta con 3.6% de calcio. En ningún momento se produjo síntomas de intoxicación,

más sí se observó mayor producción de huevos, aumentó el peso del huevo y las cascaras

ofrecían resistencia a roturas o resquebrajaduras <19). Sin embargo, en dietas deficientes en

calcio, dosis altas de estroncio inducen mineralización ósea deficiente<2o) alteraciones en el

perfil mineral <21,2

2) o raquitismo<22

•23>.

5


Las propiedades toxicológicas y bioquímicas del Sr88 o el estroncio estable no han sido

estudiadas a fondo por lo que no está del todo elucidado que el estroncio sea un elemento

esencial para humanos. Hace casi 50 años se ha reportado que la omisión de este elemento

del suplemento mineral en el alimento para ratas produce retardo en el crecimiento,

problemas en la calcificación de los huesos y los dientes y alta incidencia de caries <12

).

Hasta la fecha, estos estudios no han sido confrrmados pero tampoco invalidados. La

ausencia de investigaciones similares llevados a cabo después de la segunda guerra mundial

se debe posiblemente a la confusión que hubo entre las propiedades del estroncio

radioactivo y el estable. Recientemente el estroncio esta siendo estudiado y relacionado con

el Ca+2 como importante osteoformador evitando la debilidad ósea y consecuentes

enfermedades derivadas de la misma. Se cree que el estroncio retarda la conversión de las

células óseas a osteoclastos <7,9

,24

).

La ingesta de estroncio en la dieta diaria es relativamente baja y se estima que varía de

1.5 a 2.5 mg por día (8,25

). En general, los alimentos de origen vegetal son fuentes de

estroncio apreciablemente más ricas que los productos animales, excepto donde los últimos

incluyen hueso <7'9). El estroncio absorbido es transportado de la sangre a los tejidos, donde

es preferencialmente depositado en los huesos y dientes por dos procesos distintos: <12)

a) una fase de rápida incorporación atribuida al estroncio sanguíneo depositado

por intercambio iónico, absorción superficial y/o ligamento de proteína preósea.

b) una lenta incorporación de estroncio dentro de la estructura enrejada de los

cristales de los huesos durante su formación. Se cree que ambos procesos

dependen principalmente de la concentración de estroncio en la sangre,

incluyendo el cordón umbilical en vista de la temprana aparición del estroncio

en los huesos y dientes de fetos humanos. La absorción gastrointestinal de

estroncio soluble varía entre 5 y 25%, mientras que las sales insolubles se

absorben en menos del 5%. El metabolismo del estroncio y el calcio están

interconectados, siendo la vitamina D el factor preponderante para la absorción

de ambos (7)_ La excreción del estroncio en mamíferos depende de la especie.

En el hombre, el 90% es eliminado por orina y heces. Esta establecido que un

adulto al ingerir 1.99 mg de Sr/día sobre un periodo de ocho días eliminó 1.58

mg por heces y 0.39 mg en la orina (I2).

6


1.6. Estroncio y las enfermedades óseas

El estroncio como ion divalente se intercambia con el calcio de manera equimolar y se

incorpora a los cristales del hueso, el cual es un tejido conectivo denso, intensamente

mineralizado. Aunque el mecanismo es desconocido, se sabe que la incorporación del

estroncio al hueso es un proceso dosis-dependiente y que el contenido de estroncio en

hueso es directamente proporcional a sus niveles en plasma. A nivel mineral, el estroncio

sustituye el calcio al azar en los cristales de hidroxiapatita. El tamaño de los cristales que

contienen estroncio es mas grande que los de calcio solo (el radio iónico del estroncio es

1.12 A y el del calcio iónico es de solo 0.99 A) que conduce a una forma cristalina más

regular y más estable. Esto le confiere al material (hueso o dientes) más resistencia.

La matriz ósea consiste principalmente en colágeno de tipo I al cual le corresponde 90%

o más del material orgánico del hueso. La parte orgánica restante está compuesta por

proteínas de naturaleza no-colágena. Las células del hueso provienen de fibroblastos. Al

desarrollarse el hueso se depositan preosteoblastos en la matriz orgánica que se diferencian

en osteoblastos, después de lo cual la matriz ósea se mineraliza por depósitos de

hidroxiapatita microcristalina. Durante la mineralización, los osteoblastos quedan

aprisionados en la matriz ósea y se transforman en osteocitos; relativamente inactivos. Los

osteoblastos persisten en la superficie externa del hueso, debajo de una capa de tejido

conectivo denso (periosteo ). En la Figura 1 se observa la constitución de la matriz ósea,

detallando cada una de sus partes. El contenido mineral de la matriz ósea sirve no solo para

brindar resistencia a la estructura sino también como reserva de calcio y fosfato (estos

elementos aportan el 98.5 % a la fase inorgánica del hueso), que están en equilibrio

dinámico entre hueso y sangre. Otros iones que se incorporan normalmente a los cristales

de hidroxiapatita en mínimas cantidades incluyen carbonato, citrato, sodio, magnesio y

fluoruro. Además puede haber intercambio de calcio con elementos como estroncio, bario,

radio, torio, plomo y plutonio, conocidos como buscahuesos (s). Durante el crecimiento,

varios iones metálicos pueden incorporarse al hueso; algunos forman parte de la fase

orgánica (Cu, Mn, Fe, Zn) y otros a la fase inorgánica Al, Pb, Sr, Zn). Algunos de ellos

pueden ser beneficiosos (Fe, Sr, Zn, Cu) por jugar un papel importante en el metabolismo

óseo, mientras que la presencia de otros (Pb) refleja exposición en el ambiente de trabajo o

7


cotidiano. La deposición de estos últimos puede debilitar la estructura ósea y conducir a

distintas dolencias.

Algunas alteraciones óseas se originan por deficiencia de minerales o vitaminas o por

que hay demasiada o muy poca cantidad de hormonas que se encargan de regular la

homeostasis. Las infecciones y tumores también son responsables de ciertas alteraciones

óseas. Después de procesos de desintegración ósea, osteoblastos y fibroblastos se

transforman en osteoclastos. Estos atacan a la matriz orgánica del hueso provocando una

desmineralización secundaria, causa de un estado patológico denominado osteoporosis. La

osteoporosis, se caracteriza por la disminución de la masa ósea (los osteoblastos se hacen

menos activos) y un aumento de la susceptibilidad a las fracturas como resultado de la

disminución de los niveles de estrógeno originando la perdida de calcio.

Enfermedades sistémicas y esqueléticas reflejan profundas alteraciones en las sales del

hueso, la mayoría de estas enfermedades han sido enfocadas cm su mayor parte por

alteraciones del metabolismo del calcio. Sin embargo, es bien conocido que niveles

satisfactorios de estroncio ayudan a la reabsorción del calcio y aumentan la formación

ósea, mientras que niveles alto inducen a un deterioro óseo <26"28

).

Investigaciones sobre varios desordenes relacionados con la absorción del calcio,

particularmente la osteoporosis, permiten la utilización de estroncio estable para la prueba

de absorción, el cual reemplaza el costo y riesgo del uso de calcio radioactiva (Ca45 y Ca47)

y los métodos nucleares aplicados para su detección <26'29

).

Existen varios trabajos y estudios clínicos relacionados con la incorporación de estroncio

en los huesos y dientes y su efecto terapéutico. Marie y colaboradores <25

'27

) refieren que

igual como pasa con el calcio la deposición de estroncio en el hueso no es uniforme, varía

en huesos diferentes y en partes diferentes del mismo hueso, asegurando que la mayor

concentración de estroncio invariablemente se encontrará en huesos y dientes en

crecimiento activo o mineralización reciente y que el mismo es un importante

osteoformador evitando la débilid~d ósea y consecuentes enfermedades deriva~as de 1a

misma, actuando como mediador o barrera en el paso de los osteoblastos a osteoclastos,

retardando o inhibiendo la aparict~n de estos últimos. Aunque el esqueleto humano solo

contiene rastros de estroncio, bajo circunstancias favorables puede guardar cantidades

apreciables de este elemento. Lo seguro, es que por un mecanismo no elucidado el

8


estroncio posee efectos beneficiosos sobre la osteoporosis. Sin embargo, Mac Donald y

colaboradores aunque sustentan los estudios de Marie, dicen que a pesar de todas las

similitudes del estroncio con el calcio, este no puede servir con el propósito de ser el

componente principal del hueso, solo debe mantenerse en cantidades satisfactorias para

asegurar la reabsorción del calcio <30).

Aunque el esqueleto por si mismo es incapaz de diferenciar entre cantidades de estroncio

y calcio, más estudios contundentes harían falta para asegurar que el estroncio es

indispensable en el organismo donde el calcio juega un papel estelar.

E~nn:r rxox L

Diáfisis

Epifbis[ dlscal

Figura l. Esquema de la estructura ósea

9

\ 1

' J /~


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11


CAPITULO 11

ME TODOS PARA LA DETERMINACION DE ESTRONCIO EN

MUESTRAS BIOLOGICAS

De los comentarios hechos en el capitulo anterior~ se desprende que en los últimos años

ha crecido el interés científico por la determinación del estroncio en distintas matrices

biológicas. Sin embargo, los datos analíticos encontrados en la bibliografia consultada son

muy escasos. Los métodos más sensibles, utilizados para la determinación de estroncio en

material biológico son: análisis por activación neutrónica CAANP·3)~ fluorescencia de

rayos-x<4'5

\ espectroscopia de emisión en plasma inductivamente acoplado (ICPi6•7>~ ICP

espectrometria de masas (ICP-MS)(l,7) y espectroscopia de absorción atómica (AAS) con

atomización en llamas (FAASi8-12

) o electrotérmica (ETAASi13-17>.

2.1. AAN y microanálisis por rayos-X

Son métodos no-destructivos que dan información sobre la incorporación del estroncio a

la red de la apatita; permiten estudios in-vitro<IS) u in-vivo<19) para detectar la deposición del

estroncio durante el crecimiento óseo. Recientemente, Versieck y colaboradores<2>

analizaron estroncio en suero humano y glóbulos rojos por AAN, con la finalidad de

evidenciar que realmente el estroncio~ siendo un elemento análogo al calcio, tiene efectos

beneficiosos sobre la osteoporosis y algunas enfermedades osteolíticas (metástasis óseas)

así que su distribución y metabolismo deben ser similares. El procedimiento consiste en

irradiar la muestra liofilizada con rayos y de 388.4 KeV a un flujo de 1.48 * 1012 neutrones

cm·2 s·1• A la muestra irradiada se le adiciona 1 ml de nitrato de estroncio (de una solución

de 10 ¡..tg ml"1), manganeso, cobre y zinc radioactivos y luego se mineraliza~ calentándola

bajo agitación con ácido perclórico y ácido nítrico. La solución se enfría, y se le adiciona

ácido perclórico y solución saturada de sulfato de hidrazina para reducir el manganeso.

Luego de una larga serie de pasos (ajustes repetidos de pH y extracciones sucesivas) se

colecta la fase orgánica previamente lavada con hidróxido de sodio 0.3 M en un

Erlenmeyer de 150 ml, para después proceder a la determinación propiamente dicha. A

12

Maria Di Bernardo ESTRONCIO Tesis de Maestria

pesar de ser métodos precisos, no son disponibles para el análisis rutinario, son tediosos,

involucran demasiados pasos conllevando a perdida de tiempo y posiblemente de analito,

requieren de instrumentación muy costosa y de personal entrenado.

2.2. Emisión en plasma inductivamente acoplada (ICP-AES e ICP-MS)

Estos métodos permiten análisis multielemental y simultaneo, pero presentan severas

interferencias de los concomitantes, requiriendo la aplicación de procedimientos de adición

de patrón y simulación de matriz. Adicionalmente, para evitar que el tubo central de cuarzo

del plasma y el nebulizador se tapen, es necesario digerir las muestras. Sin embargo,

Mauras y colaboradores(6) solo diluyen el plasma sanguineo antes de nebulizarla en el

plasma, mientras que otros investigadores(1,7

) recomiendan digestión de las muestras para

destruir la materia orgánica. V andecasteele y colaboradores(!) por ejemplo, determinaron

estroncio en suero sanguíneo humano, preparando los estándares y las muestras en ácido

nítrico 0.14 M purificado. Para evitar la supresión de la señal analítica por elementos

concomitantes fácilmente ionizables en el plasma, los autores recomiendan la utilización de

indio como estándar interno, ya que la masa atómica de este elemento es similar a la del

isótopo de estroncio usado en ICP-MS.

2.3. Espectroscopia de Absorción Atómica (F AAS y ETAAS).

Es la técnica más adecuada y más usada para la determinación de estroncio en cualquier

tipo de muestra. La sensibilidad de los métodos de absorción atómica está dentro de las

partes por millón (mg L"1 o mg Kg-1) (FAAS) y partes por billón (~-tg L"1 o 1-1-g Kg-1

)

(ET AAS). Adicionalmente, estos métodos son rápidos, selectivos y poseen instrumentación

de costo moderado. El escoger un método u otro estará condicionado a la cantidad de

muestra disponible y fundamentalmente a la concentración del analito en la misma. Una

revisión de la bibliografía reciente, evidencia que los pocos estudios publicados en los

últimos años con relación a la concentración de estroncio en tejidos y fluidos biológicos

muestran preferencia por F AAS o ET AAS.

13


Recientemente en nuestro laboratorio se realizó un desarrollo metodológico para

determinar estroncio en huesos, sangre y orina por ET AAS utilizando lantano como

modificador de matriz y atomización sobre la pared de los tubos de grafito sin corrección

de fondo(lO). Los resultados se encuentran en concordancia con los valores reportados por

otros autores. Las diferencias observadas pueden atribuirse a la distribución geográfica, la

alimentación, la edad, sexo y/o ciertas enfermedades que afectan a los individuos bajo

estudio. Ninguno de los trabajos publicados reportan el uso de modificadores químicos,

todos se limitan al uso de correctores de fondo Zeeman; con el uso de modificadores

químicos se logran aún más bajos limites de detección, mejorando indudablemente la

reproducibilidad y sensibilidad. ET AAS resulta entonces un método adecuado para

determinar niveles de estroncio por el orden de Jlg L-1, rango en el cual se encuentran los

valores normales de estroncio en fluidos biológicos humanos tales como sangre y orina.

Además, tiene la ventaja de permitir el uso de diferentes programas de temperatura y

correctores de fondo para minimizar el efecto de interferentes.

Para la determinación de niveles de estroncio en huesos, matriz en la cual el elemento se

encuentra en el orden de los Jlg g-1 (en los digeridos esto se traduce en concentraciones en

el orden de mg L-1), es aconsejable utilizar FAAS, ya que es un método más económico y

sencillo en comparación con ETAAS. Determinar estroncio en una matriz como el hueso,

rica en calcio y fosfato no es del todo fácil. Aparte de las posibles interferencias químicas

que pueden producir estos y otros elementos, el estroncio forma un óxido refractario (SrO),

dificil de romper para liberar el estroncio atómico, al no ser que se apliquen condiciones

experimentales apropiadamente optimizadas. Por esta razón, en F AAS es importante tomar

en cuenta la composición y temperatura de la llama, así como el uso de reactivos adecuados

para eliminar, o al menos minimizar las interferencias químicas y de ionización. Las

elevadas temperaturas de las llamas de acetileno aumentan la población total de átomos en

la llama, mejorando la sensibilidad aunque para ciertos elementos, ocurre una disminución

en sensibilidad debido a la perdida de átomos por los procesos de ionización. Este efecto se

compensa con el uso de agentes supresores de ionización tales como potasio o lantano.

La realización de este trabajo se encuentra justificado, por significar el mismo un aporte

a los pocos existentes en la literatura y contribuir a la elucidación del papel de

osteoformador que juega realmente el estroncio en el organismo. Las determinaciones del

14


elemento se realizan en muestras óseas, por ser este tejido donde preferencialmente se

deposita. Las mismas se realizan por F AAS por encontrarse el estroncio en cantidades

detectables con este método. Adicionalmente por ser un método rápido, más económico,

preciso, de fácil manejo y disponible generalmente para rutina en cualquier laboratorio.

Al iniciar este trabajo se plantearon las siguientes hipótesis:

• a.- Si los parámetros experimentales se optimizan apropiadamente es posible

determinar estroncio en huesos por F AAS, utilizando llamas de acetileno

(aire/acetileno y óxido nitroso/acetileno) y en fluidos biológicos por ETAAS.

• b.- El estroncio al igual que el calcio es un osteoformador. Si determinamos los

niveles del mismo, en diferentes matrices biológicas y lo relacionamos con el

sexo, la edad y las diferentes patologías. Seria posible deducir que en cierta etapa

de la vida el estroncio es también responsable del deterioro óseo, conllevando a

una enfermedad denominada osteoporosis. Siendo el sexo femenino el más

predispuesto a la misma.

Para cumplir con las hipótesis propuestas, se fijaron los siguientes objetivos:

• Desarrollar un método analítico rápido, confiable, selectivo y de bajo costo para

la determinación de estroncio en muestras óseas.

• Desarrollar un método analítico rápido, confiable, selectivo y de bajo costo para

la determinación de estroncio en fluidos biológicos.

• Conociendo previamente, la constitución de la matriz en estudio, minimizar los

efectos depresivos de los interferentes, sobre la señal analítica.

• Determinar estroncio en muestras biológicas, estableciendo una correlación entre

ambos y con ciertas enfermedades óseas particularmente la osteoporosis.

15


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18. E. Canalis, M. Hott, P. Deloffre, Y. Tsouderos yP.J. Marie. Bone. 18:517-523, 1996.

19. E. Rokita, T. Sawicki, A. Wrobel, P.H.A. Mutsaers y M.J.A. de Voigt. Trace Elements

and Electrolytes. 13: 155-161, 1996.

16


20. M. Burguer~ J.L Burguer~ C. Rondón, M.L. Di Bernardo, E. Nieto y R. Salinas.

Spectrochim. Acta. En prensa. 1998.

17


CAPITULO 111

DETERMINACION DE ESTRONCIO EN HUESOS POR

ESPECTROSCOPIA DE ABSORCION ATOMICA EN LLAMAS.

Desarrollo metodológico

3.1. Aparatos

Para la determinación de estroncio en huesos se desarrolló un método analítico que hace

uso de un espectrofotómetro de absorción atómica, marca Perkin-Elmer, modelo 3100

equipado con un nebulizador neumático con sistema de aspas, una lámpara de cátodo hueco

de estroncio marca Perkin-Elmer y mecheros con ranuras de 10 y 5 cm para las llamas de

aire/acetileno y óxido nitroso/acetileno, respectivamente.

Para efectos de comparación de resultados se empleó un espectrofotómetro de absorción

atómica, marca Perkin-Elmer (PE 4100 ZL AAS) modelo 4100ZL, equipado con corrector

de fondo Zeeman, atomizador de grafito con calentamiento transversal (THGA),

automuestreador Perkin-Elmer modelo AS-71 y lampara de cátodo hueco de estroncio

marca Perkin-Elmer. Los tubos fueron con cubierta de grafito pirolítico marca Perkin

Elmer (PN-B0504033) y plataformas de L 'vov incorporadas. El instrumento es controlado

por una computadora personal marca EPSON modelo EL 486UC a través de un software

Perkin-Elmer 4100PC (versión 7.3). Una impresora marca EPSON, modelo LX-810 se usó

para el procesamiento de datos.

Una bomba peristáltica Gilson Miniplus-2 equipada con tubos de polivinilo se usó como

instrumento de propulsión de soluciones. En la Figura 1 se observa esquemáticamente un

espectrofotometro de absorción atómica, con el sistema de propulsión incluido. El mismo

tuvo como función el mezclar las soluciones de patrón o de muestra con el agente liberador

o el supresor de ionización seleccionados para minimizar las interferencias químicas o de

ionización, respectivamente. Para tal efecto se hace confluir el reactivo con el patrón o con

la muestra en un dispositivo en forma de Y, diseñado y construido en el laboratorio con

18


material de polivinilo y conectado directamente al nebulizador lográndose así una mezcla

en una proporción 1:1 (v/v)

Lámpara Llama Monocromador Detector

Nebulizador 1 mL/min

Figura l. Esquema de un espectrofotómetro de absorción atómica (R Reactivos; M = patrón o muestra).

Otros equipos empleados fueron: un liofilizador marca Leybold- modelo Lyovac GT -2

Heraeus para secar las muestras óseas, un molino analítico marca Tekmar, modelo A-10

para homogeneizarlas, un agitador ultrasónico marca Branson, modelo 221 O y un agitador

Heidolph, modelo Reax 1 tipo vortex para acelerar los procesos de disolución durante la

etapa de preparación de reactivos, un horno de microondas de uso domestico marca

Panasonic, modelo EN7669/6660 y plancha de calentamiento para digerir las muestras y

micropipetas marca Wheaton para la dilución y adición de muestras y reactivos.

19


3.2. Reactivos

Los reactivos empleados fueron de la mas alta pureza disponible y de grado analítico,

excepto el ácido nítrico que fue Suprapur® 65 %, marca Merck. Agua doblemente

desionizada con resistividad especifica de 18 MQ cm-1 obtenida en un sistema Millipore

Milli-Q plus, se utilizó para la preparación de soluciones y lavado de material de

laboratorio.

Una solución patrón de estroncio (1 g e 1) se preparó a partir de nitrato de estroncio

anhidro (Sr(N03)2), 99 % de pureza, disolviendo 1.2200 g de la sal en 500 mi de agua

Milli-Q y ácido nítrico 0.2 % (v/v). Los patrones de trabajo se prepararon por dilución

sucesiva del patrón concentrado en los rangos de 0-25 Jlg L-1 y de 0-12 mg L-1 para la

determinación de estroncio por ET AAS y por llamas, respectivamente.

Los elementos estudiados como potenciales interferentes en la llama aire/acetileno:

sodio, aluminio, calcio magnesio y potasio añadidos como nitratos y carbonato, cloruro,

fluoruro y fosfato añadidos como las correspondientes sales de amónio, fueron preparados

en las concentraciones que se muestran en la Tabla l. Las concentraciones indicadas con

negritas concuerdan con los niveles en que los interferentes se encuentran en la matriz

ósea(I)

Como posibles liberadores químicos de las interferencias producidas por la compleja

composición de la matriz ósea en la llama de aire/acetileno se utilizaron: nitrato de lantano

al 10 % (p/v), EDTA de amonio 1.6 M y mezcla 1:1 de EDTA/lantano. El EDTA de

amonio, fue preparado a partir de EDTA comercial e hidróxido de amonio en cantidad

suficiente hasta obtener una concentración fmal de 1.6 M según la siguiente reacción(2):

[CH2N(CH2COOH)2h + 4NlLJOH ~ [CH2N(CH2COONiLJ)2h + 4H20.

Como agentes supresores de ionización en la llama óxido nitroso/acetileno se utilizaron

potasio a concentraciones de 1000 - 4000 mg L -I preparado a partir de cloruro de potasio y

nitrato de lantano a concentraciones de 0,5 - 5,0 % (p/v)

Otros reactivos utilizados~ éter dietílico 99,5% de pureza y peróxido de hidrogeno 30%

(v/v) marca Riedel-de Haen para remover posibles restos de lípidos y de tejido conectivo

sobre la superficie de las muestras óseas, respectivamente.

Para evaluar la exactitud se aplicó el método desarrollado a la determinación de

20


estroncio en dos muestras de hueso (SRM 1400 bone ash y SRM 1486 bone meal)

certificadas por National Institute ofStandards and Technology, (NIST) de Estados Unidos.

Los gases que se utilizaron fueron: argón, como gas de purga en ET AAS, aire y óxido

nitroso como oxidantes y acetileno como combustible, todos de alta pureza, marca AGA.

Tabla l. Componentes inorgánicos de la matriz ósea estudiados como interferentes en la

llama aire/acetileno

Interferente Contenido en el Concentraciones estudiadasa (mg L"') hueso(!) (J.lg g"1)

(valores promedio de absorbancia)

Ninguno - 5 mg SrL-1

(0.245)

Sodio 4400 50 100 220 300 400

(0.250) (0.255) (0.261) (0.275) (0.286)

Potasio0 550-3000 20 30 50 100 150

(0.260 (0.278) (0.290) (0.300) (0.315)

Calcio 250.000 4000 8000 12800 16000 20000

(0.278) (0.320) (0.375) (0.403) (0.405)

Magnesio0 200-4000 20 40 50 100 200 300

(0.220) (0.215) (0.215) (0.210) (0.210) (0.210)

Aluminio 200-600 2 4 6 8 10 12

(0.098) (0.051) (0.030) (0.010) (0.008) (0.003)

Fósforo 120.000 3000 4000 6000 7000 8000

(0.097) (0.083) (0.072) (0.070) (0.065)

Carbonato 40.000 500 1000 2000 4000 5000

(0.250) (0.250) (0.250) (0.250) (0.250)

Cloruro 1700 20 40 85 100 150

(0.240) (0.235) (0.235) (0.235) (0.235)

Flúor0 600-3000 20 30 50 100 150 200

(0.233) (0.230) (0.220) (0.210) (0.210) (0.210)

~asado en 500 mg de masa seca diluida en un volumen final de 10 mL

bconcentración dependiente del tipo de hueso

Todo el material utilizado en este trabajo fue sumergido por 24 horas en ácido nítrico

21


(10 %), luego enjuagado con abundante agua de tubo y fmalmente con agua Milli-Q. Para

evitar contaminación, el único material de vidrio fueron algunos frascos volumétricos para

la preparación de los patrones y para diluir los digeridos. Inmediatamente después de

preparadas, las muestras y los patrones se guardaron en envases de polietileno tapados y

adecuadamente etiquetados. Para la manipulación y preparación de muestras se usaron

guantes estériles.

3.3. Muestras y procesamiento de las muestras

Todas las muestras óseas fueron suministradas por el Departamento de Traumatología de

la Facultad de Medicina de la Universidad de Los Andes. Las mismas fueron obtenidas

durante intervenciones quirúrgicas realizadas a pacientes aparentemente sanos que por

algún motivo (generalmente accidentes automovilísticos) habían sufrido fracturas

reparables, o a pacientes con problemas patológicos (pseudoartrósis, artrósis, fracturas de

cabeza de fémur o de caderas que presumiblemente padecen osteoporosis, etc.) que

ameritaban operaciones.

Las muestras se prepararon de la siguiente manera:

El tejido adherido a los huesos fue removido por los médicos cirujanos con bisturí de

tantalio y los restos de sangre lavados con agua. Las muestras colocadas en bolsas plásticas

de polietileno debidamente identificadas, fueron transportadas al laboratorio en cavas

refrigeradas. En el laboratorio, los huesos se sumergieron en peróxido de hidrogeno al 30%

(v/v) para remover trazas de sangre o de tejido y enjuagadas repetidas veces con agua milli

Q. Luego de lavarse con agua, las muestras son embebidas en dietiéter en un baño

ultrasónico para remover la grasa residual (estos residuos etéreos fueron analizados

comprobando la ausencia de Sr en los mismos). Una vez cumplido el procedimiento de

limpieza, las muestras se colocaron en bolsas de polietileno previamente codificadas y se

congelaron a 1 05°C por 1 hora. El material así congelado es sumergido en nitrógeno

líquido, para facilitar su fracturación a piezas más pequeñas utilizando un martillo de acero

recubierto de plástico inerte. El material se pesa antes y después de liofilizarse para

determinar el contenido de agua en el mismo. Se encontró que el contenido de agua en los

huesos es alrededor de 24 ± 5%. Los resultados de Sr en hueso por muestra seca son

expresados en J.lg de Sr g-1

22


Para mayor homogeneidad, las muestras secas se muelen en un molino analítico, y se

guardan a temperatura de congelación en bolsas de polietileno, herméticamente selladas,

previamente rotuladas hasta su posterior análisis.

3.4. Procedimiento general

Para cada experimento se pesan alrededor de 500 mg de muestra seca, se coloca en un

vial de polietileno de 2.5 mL, se humedece con 1mL de HN03 concentrado y se lleva a un

horno de microondas operado a una potencia de 140 W por 7 minutos. El digerido

transparente se transfiere cuantitativamente a un matraz aforado de 1 O mL que se aforra

hasta la marca con agua Milli-Q.

Las muestras digeridas o los patrones se mezclan en línea en una proporción 1:1 (v/v)

con el agente liberador o supresor de ionización a través del dispositivo ilustrado en la

Figura l. La mezcla es aspirada directamente en la llama cuya composición ha sido

previamente optimizada, para obtener la señal analítica. Este procedimiento se esquematiza

en la Figura 2.

Horno microondas (140 W x 7 min.) 500 mg. M:x seca. + 1 mL HN03

La5%

Mx (10 mL)

Figura 2. Procedimiento general esquematizado. (Mx =Muestra)

3.5. Resultados y discusión

3.5.1. Optimización de los parámetros experimentales

23


Los parámetros experimentales que podrían afectar la seiial de absorbancia del estroncio

obtenida a su línea resonante ( 460.7 nm), son: tiempo de integración, ancho de rendija,

corriente de la lámpara de cátodo hueco, posición del mechero y la composición de la

llama. Algunos de estos parámetros, tales como el tiempo de integración y el ancho de

rendija son inherentes del instrumento y de la longitud de onda de trabajo, por lo que se

usan tal y como lo recomienda el manual de operaciones del equipo (Tabla 2). Los demás

son fácilmente variados para obtener una señal analítica optima. En todos los experimentos

descritos en esta sección, se ha utilizado una solución patrón de 5 mg Sr mL-1 y un pool de

muestras óseas digerido según el procedimiento descrito anteriormente

La corriente de la lámpara se varió entre 10 y 18 mA. En la Figura 3 se observa un leve

incremento de la absorbancia con el aumento de la intensidad de la fuente, llegándose a un

plateau para corrientes mayores a 16 mA. Para asegurar mayor estabilidad en la seiial,

podría usarse una corriente de 18 mA; sin embargo, para salvaguardar la vida útil de la

misma, es recomendable usar 16 mA, que coincidencialmente corresponde a la corriente

recomendada por el fabricante.

C'O ·o

0.5

0.4

5i 0.3 € ~ 0.2 ~

0.1

o 10

B

12 14 16 18 20 Corriente (mA)

Figura 3. Optimización de la corriente de la lámpara de cátodo hueco en las llamas de

aire/acetileno (A) y óxido nitroso/acetileno (B), respectivamente.

24


Tabla 2. Parámetros instrumentales optimizados

Tipo de llama

Parámetro Aire/ Acetileno Oxido nitroso/acetileno

Longitud de onda (nm) 460.7 460.7

Ancho de rendija (nm) 0.2 0.7

Tiempo de integración (s) 1 1

Corriente de lámpara (mA) 16 16

Flujo de oxidante (L min"1) 4.0 6.0

Flujo de Acetileno (L min"1) 2.0 3.0

Altma de observación (mm) 5 10

Otro parámetro que afecta considerablemente la señal instrumental es la altma de

observación, definida como la distancia entre la cabeza del mechero y el paso óptico del

instrumento. Es bien sabido que la población atómica, dependiendo del analito y de la

natmaleza de la muestra, se obtiene en distintas zonas de las llamas, siendo en algunas más

abundantes que en otras; la absorbancia varía por ende con la altma de observación en la

llama. La posición más baja fue limitada por la intersección de la cabeza del mechero con

el camino del haz de la fuente, mientras que en la posición más alta se pierde sensibilidad y

la precisión empeora debido a la inestabilidad fisica de la llama en su zona superior. Por

esta razón, este parámetro solo se pudo variar sistemáticamente entre 1.5 y 15 mm sobre la

cabeza del mechero, buscando así la posición que provee la mejor relación señaVruido. Se

ha observado un incremento en los valores de absorbancia a medida que se llegaba al valor

óptimo (5 y 10mm en las llamas aire/acetileno y óxido nitroso/acetileno, respectivamente),

seguido de un descenso lento de la señal en la llama aire/acetileno y uno muy rápido en la

de óxido nitroso/acetileno (Figura 4). Casi siempre, en las llamas laminares, como las

usadas en este estudio, la mejor sensibilidad se obtiene justo encima del cono interno,

donde ambas llamas alcanzan el equilibrio térmico, en concordancia con lo encontrado

experimentalmente.

25


0.4 B

o 5 10 15 20 Altura (mm)

Figura 4. Efecto de la altura de observación sobre la señal de estroncio contenido en

patrones (A, B) y muestras (a, b) en la llama de aire/acetileno (A, a) y óxido

nitroso/acetileno (B, b) respectivamente.

Las llamas son procesos dinámicos cuya temperatura, forma y tamaño dependen de su

composición (tipo de oxidante y combustible usados) y del flujo de los gases mezclados.

Indudablemente, las mezclas más usadas en estudios analíticos son: aire u óxido nitroso

(N20) como oxidantes y acetileno (C2H2) como combustible. La Tabla 3 contiene algunas

características de estos importantes atomizadores analíticos, necesarias para entender los

procesos fisico-químicos que ocurren cuando una muestra, de composición relativamente

compleja es atomizada.

Las reacciones de combustión que experimenta el acetileno en presencia de cada uno de

los oxidantes son:

C2H2 + 5/202 + 1 ON2 = ZC02 + H20 + 1 ON2 (Ecuación I)

(llama aire/C2H2)

C2H2 + SN20 = ZC02 + H20 + SN2

(llama N20/C2H2)

26

(Ecuación II)


Tabla 3. Características fisico-químicas de las llamas

Llama Ranura del T Log de-llama Log de-Sr n¡/11r Flujos óptimos

mechero (cm) COK) Oxidante C2H2

Aire/ C2H2 10 2500 10.60 10.58 0.963 4.0 2.0

N20/C2H2 5 3000 10.78 10.87 1.333 6.0 3.0

Donde: T = temperatura de la llama; de - llama y de- Sr = densidad de electrones libres en la llama y la contribución de electrones debidos a la ionización del Sr, respectivamente; n¡/tlr razón de número de moles de productos (a la T de la llama) y número de moles de reactantes (a T ambiente).

Debido a combinaciones radicalicas que ocurren en llamas de esta naturaleza, la

concentración de electrones en ambas llamas es pequeña y es de esperar que sea excedida

por la contribución del analito. En ambos casos la densidad electrónica es similar.

La determinación del estroncio en llamas requiere la optimización de la relación

oxidante/combustible para obtener máxima sensibilidad y reproducibilidad. El estroncio al

igual que algunos otros elementos forma fácilmente su correspondiente óxido refractario

SrO cuya energía de disociación es de 4.2 e V. Es de esperar, que para romper este tipo de

compuesto y liberar los átomos de estroncio, se necesitan altas temperaturas. La

temperatura máxima de las llamas bajo estudio se obtiene bajo relación estequiométrica de

los gases que según las Ecuaciones I y II corresponden a 1:2.5 y 1:5.0 para aire/acetileno y

óxido nitroso/acetileno, respectivamente. Sin embargo, para elementos como el estroncio

que forman óxidos refractarios, además de llamas calientes, es aconsejable usar llamas ricas

en combustible si se quiere obtener la máxima sensibilidad. En tales llamas, la cantidad de

oxígeno es menor que la necesaria para la completa combustión del acetileno,

favoreciéndose así la completa disociación del óxido.

Con el objeto de mantener una aspiración y por lo tanto una nebulización constante, el

flujo de los oxidantes se ha mantenido en 4.0 y 6.0 L min"1 para aire y óxido nitroso

respectivamente. También experimentalmente, estos flujos se comprobaron como óptimos.

Manteniendo estos flujos de los oxidantes constantes, se varió el flujo de acetileno entre 1.0

y 5.0 L min"1 encontrándose el óptimo en 2.0 y 3.0 L min"1 para las llamas de aire/acetileno

27


y óxido nitroso/acetileno, respectivamente (Figura 5). Estos resultados se traducen en una

relación oxidante: combustible de 2 para ambas llamas, hecho que sustenta la teoría

expresada anteriormente.

Un listado de los parámetros óptimos obtenidos para la determinación de estroncio en

digeridos de huesos se muestra en la Tabla 2.

0.4 ~~~ A b 0.3

S A • o

./·~ r b 0.2

a / . n e • b

i 0.1

/~~ a a •

0.0 ·-· ""' o 2 3 4 Razón Oxidante:Com bustibtible

Figura 5. Efecto de la relación oxidante:combustible sobre la absorbancia de un patrón (A,B) y de una muestra (a, b) en la llama de aire/acetileno y óxido nitroso/acetileno, respectivamente.

3.5.2. Proceso de digestión de las muestras

Para la digestión de los materiales de referencia y de las muestras reales de hueso se han

empleado diferentes procedimientos de preparación de muestras, tales como calcinación (3,4

)

y varias modalidades de digestión húmeda(5,6

-8>. Cualquiera que fuese el proceso de

digestión, el material seco (500 mg) se procesó según el procedimiento general descrito en

la sección 3.3. Cuando fue necesario, por ejemplo para las muestras certificadas que tienen

un alto contenido de estroncio, se hicieron diluciones de los digeridos.

Para el procedimiento de calcinación, las muestras pulverizadas se pesaron directamente

en cubetas de platino que se calientan luego en un Mufla a 550 oc durante 3 h. El residuo

inorgánico se disolvió en 1 mi de ácido nítrico concentrado, cuantitativamente transferido a

un frasco volumétrico de 1 O mi y aforrado con agua de alta pureza. Debido a la alta

28


estabilidad térmica del estroncio (800 °C y 1366 oc de puntos de fusión y ebullición,

respectivamente), durante este proceso no hay pérdidas potenciales debido a la

volatilización Sin embargo, el procedimiento es inadecuado para análisis rutinarios debido

al tiempo necesario para procesar la totalidad de las muestras.

En consecuencia, la destrucción de la materia orgánica podría realizarse en presencia de

ácidos inorgánicos. Las pruebas preliminares muestran que el ácido clorhídrico no digiere

completamente el material, probablemente debido a su baja capacidad de oxidación,

mientras que en presencia de ácido sulfúrico se forma un precipitado blanco abundante,

presumiblemente de sulfatos de calcio y estroncio. En todos los procedimientos sucesivos

de digestión húmeda, las muestras pulverizadas y secas se pesaron en viales de

polipropileno con capacidad de 2.5 mi a las que se les adicionó 1 mi de ácido nítrico

concentrado. Mientras que 5 de estos envases se dejaron durante la noche a temperatura

ambiente; otros 5 fueron colocados sobre una plancha de calentamiento cuidadosamente

calentada para evitar pérdida de material por salpicaduras; los siguientes 5 viales se

ubicaron en un horno de microondas a 140 W por 7 min tomando ciertas precauciones de

seguridad (9) y los viales del último conjunto se colocaron durante 20 min en un baño

ultrasónico. El residuo obtenido al final de cada proceso se disolvió en agua y se aforró a un

volumen final de 10 mi. El contenido de estroncio en cada solución se medió siguiendo el

procedimiento antes descrito. Los resultados mostrados en la Tabla 4 indican que se puede

utilizar cualquiera de los procedimientos de digestión por vía húmeda pro hados para las

muestras de huesos. Sin embargo, se recomienda la radiación de microondas por realizarse

la digestión en menor tiempo y presentar menos probabilidad de contaminación o pérdidas

de material durante el calentamiento.

29


Tabla 4. Comparación de los procedimientos de digestión

Concentración de estroncio a ( ~g g"') Procedimiento Tiempo0 (min) 1400 bone ashc 1486 bone mealc Cabeza de fémur

Calcinación a 650 oc 270 226.0±5.9 240.9±6.2 22.82±0.22

Temperatura ambiente Toda la noche 247.9±6.5 262.6±5.8 24.48±0.50

Plancha de calentamiento 45 227.8±6.4 241.6±6.5 22.50±0.28

Ultrasonido 20 248.0±6.9 263.0±7.0 25.02±0.38

Radiación microondas 7 248.2±6.8 263.5±7.2 24.90±0.20

a . ' ' o_ expresada como promedio ± desvtacwn estandar, basada en 500 mg de masa osea seca, refendo como el tiempo necesario para el proceso de digestión, e valores certificados de 249± 7 y 264± 7 Jlg de Sr g·1 para "bone ash" y "bone meal", respectivamente.

3.5.3. Estudio de interferencias

Es bien sabido que, dependiendo del tipo de llama y la composición de la matriz, la

formación e ionización de compuestos estables o refractarios son los principales

responsables de interferencias en la determinación de estroncio por llama AAS (IO,ll).

Muchas de las interferencias se pueden remover por medios químicos, aunque el tiempo

que toma el análisis se incrementa enormemente <12

•13>. Los efectos de varios cationes

(sodio, potasio, magnesio y aluminio) y aniones (fosfato, fluoruro y cloruro) que son los

mayores componentes de la matriz ósea, se investigaron a diferentes concentraciones

alrededor de sus niveles fisiológicos, para simular la matriz ósea (Tabla 1). En cada caso, se

preparó un blanco conteniendo solamente el interferente añadido para chequear la línea

base o posible contaminación con trazas de estroncio durante la preparación de las

muestras. Se consideró que una especie interfiere significativamente cuando la señal de una

solución que contenía solamente estroncio (5 mg 1"1) fue diferente en un 5 % cuando se

comparó con la solución que contenía además del analito, un interferente o una mezcla de

ellos. Este estudio comprensivo permitió observar el efecto individual de los constituyentes

inorgánicos: los elementos alcalinos y alcalino-terreos tienen un ligero efecto positivo sobre

la señal del analito (Figura 6, a-d), mientras que el carbonato, el fluoruro y el cloruro

30


exhiben un efecto despreciable (Figura 6 e-g).

0.25

0.2

"' -~ 0.15 € ~ 0.1 <

0.05

o 100 200 300 400

[Na]ug/ml

Figura éa Efecto dei Na en un estándar de Sr

0.3!

03

10.25

o~

0.15

0.1

01l5

O SO 100 1SO 200 250 300 350

[OI)ug.ld Figura Se Efecto del Ca en llR estándar

de Sr

0.2

.!!! 0.15 g -ll 0.1

~ < 0.05

o 20 40 60 80 100 [F]ug/ml

Figura 6e Efecto del F en un estándar de Sr

31

Q25

0.2 .. ·¡; :¡¡ 0.15 -e o ~ 0.1

0.05

o 20 40 60 80 100

[k]I.Q'n1

Figura 6b Efedo del K en un estándar de Sr

o 50 100 150 200 250 300 (Mg] ug/ml

Figura 6d Efecto del Mg en un estándar de

0.2

f 0.15

t 0.1

~o.os

Sr

o~~~~~~~~~~

o 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Figura 6f. Efecto del CÜJ- en un estándar de Sr


1 0.1

0.05

o 50 100 150

[CU ugJlTII

Figura 6g Efecto del cr en un estándar de Sr

El incremento de la señal de estroncio causado por ciertos elementos, en vez de

considerarse una interferencia positiva, podría explicarse como una disminución en el grado

de ionización del estroncio en la presencia de metales mas fácilmente ionizables (I4

). Otras

especies probadas, como fosfato y aluminio (Figura 7 a y b), inhiben fuertemente la

respuesta del estroncio.

0.14 0.12

·~ 0.1 ffi 0.08 .e ~ 0.06 ~ 0.04

0.02

2 4 6 8 10 12

{Al] ug/ml

Figura ?a Efecto del Al en un estándar de Sr

0.14

ca 0.12 ·o 0.1 e: e O.CB oO.OO ~ 0.04 <( 0.02

0+---~--~--~--~~

R~ 7b B'Edo<EI Pa1 un eSá'd!r' eleS'

El grado de depresión de la señal de estroncio se incrementa gradualmente con el

aumento en la concentración del interferente, acercándose a valores nulos de absorbancia

cuando se añaden en un gran exceso (Tabla 2). El efecto depresivo acentuado que producen

estas especies puede deberse a la formación de compuestos refractarios, como aluminatos y

fosfatos de estroncio, dificil de romper en la llama aire/acetileno. Los datos disponibles en

32


la literatura acerca del mecanismo de tales efectos son escasos. Sin embargo, se demostró

que el efecto negativo del fosfato y el aluminio sobre la absorbancia de Sr depende de la

concentración, tal como fue reportado anteriormente por Luecke <15

). En consecuencia, es

oportuno establecer si las interferencias de ionización o químicas (o ambas) son

responsables de los efectos positivos y negativos que afectan la determinación exacta de

estroncio en esta llama. Para corregir estos efectos se añadieron a las soluciones de

estroncio con interferentes y a las muestras, agentes liberadores (La), compuestos quelantes

(EDTA) y buffers de ionización (K) tal como se señaló en el procedimiento. Aunque

pueden ocurrir algunos efectos compensatorios entre las interferencias positivas y

negativas, ninguno de los aditivos mencionados corrige del todo el fuerte efecto depresivo

causado por el aluminio y el fosfato (Tabla 5). Se observa que 5% de lantano y 4000 mg L" 1 de potasio tienen un efecto similar tanto sobre las respuestas individuales de los

interferentes como sobre mezclas de ellos o sobre la muestra real de hueso.

Tabla 5. Efecto de algunos agentes químicos sobre un patrón de estroncio (5 mg L"1)con

todos los interferentes estudiados añadidos.

Interferente Referencia Lantano Potasio Potasio EDTAde mgL-1 5% (v/v) 2000mgL"1 4000m2L-1 amonio0.8 M Ninguno 0,120 0,148 0,146 0,149 0,135 Na (220) 0,123 0,145 0,143 0,145 0,135 K(30) 0,130 0,155 0,156 0,156 0,145 Ca (12800) 0,125 0,160 0,157 0,160 0,150 Mg (40 y200) 0,105 y 0,110 0,135 y 0,150 0,134 y 0,150 0,134 y 0,150 0,120 y 0,135 Al (6 y 8) 0,030 y 0,01 o 0,082 y 0,060 0,080 y 0,057 0,081 y 0,060 0,035 y 0,020 p (6000) 0,072 0,095 0,093 0,093 0,080 co3 (2000) 0,120 0,147 0,147 0,148 0,140 Cl"(85) 0,115 0,145 0,144 0,145 0,145 F (30 y 150) 0,120 0,147 0,146 0,147 0,140 Mezcla I * 0,130 0,165 0,163 0,165 0,140 Mezcla II ** 0,050 0,080 0,077 0,081 0,065 Mezcla III *** 0,075 0,105 0,102 0,104 0,090 Muestra (Pool) 0,012 0,068 0,069 0,066 0,030

* cationes, ** aniones y *** aniones y cationes

Como los interferentes estudiados son componentes intrínsecos de la matriz ósea, quizás

su contenido puede variar en los diferentes tipos de hueso, por lo que también puede variar

33


el grado de interferencia y de compensación. Además, los resultados gra:ficados en la Figura

8 a, b y e muestran claramente que el efecto depresivo persiste, por lo que pareciera que los

resultados obtenidos en la llama de aire/acetileno podrían no ser correctos pese al uso de

liberadores químicos.

Por esta razón, se preparó una muestra sintética simulando en lo posible la matriz real

(mezcla 111 indicada en Tabla 5) que fue analizada, junto con algunas muestras reales, por

ETAAS, siguiendo el procedimiento establecido previamente (I6

) y en las llamas de

aire/acetileno usando simulación de la matriz para la calibración y 5 % de lantano como

liberador, y óxido nitroso/acetileno usando calibración acuosa y 4000 mg L"1 de potasio

como buffer de ionización. Los resultados que se muestran en la Tabla 6 indican un error

que varía desde 26.4 hasta 37.0 % en la llama aire/acetileno en comparación con lo

obtenido por ETAAS y en la llama de óxido nitroso/acetileno. Estos resultados indican

claramente que el uso de la llama aire/acetileno produce resultados inexactos en la

determinación de estroncio en huesos.

Tabla 6. Respuesta de la supresión en la llama de aire/acetileno comparada con los

resultados obtenidos por ETAAS y óxido nitroso/acetileno.

Contenido de Sr (~g g·) Muestra ósea ETAAS N20/C2H2 Aire/C2H2 % de supresión

M-1 23.80±0.23 22.80±0.21 6.30±0.02 26.4

M-2 26.90±0.21 25.70±0.23 8.50±0.04 31.6

M-3 22.40±0.20 21.40±0.25 7.30±0.02 32.6

M-4 29.30±0.25 28.60±0.22 10.80±0.10 37.0

M-5 18.90±0.51 17.60±0.20 5.40±0.03 28.5

M-6 22.80±0.24 21.60±0.21 6.80±0.12 29.8

Sintética 4.80±0.22 4.60±0.20 2.50±0.05 52.0

Como era de esperarse, el efecto interferente de las especies estudiadas no se

experimentó en la llama de óxido nitroso/acetileno. Las soluciones de estroncio acuoso que

contenían incluso el doble de interfereJl~e que su nivel normal en huesos, dió la misma señal

que las soluciones similares sin interferepte añadido<17). La temperatura de esta llama es

34


suficientemente alta (sobre 3000 °C) y por lo tanto es capaz de disociar compuestos estables

del tipo SrO, Sr-aluminatos y Sr-fosfatos sin la ayuda de agentes liberadores. Sin embargo,

se debe añadir un buffer de ionización para minimizar los efectos de ionización que para el

estroncio son del 84% a la temperatura de esta llama 08>. El potasio es recomendado para

solventar este problema (19) y fue también efectivo en este trabajo (ver resultados en Tablas

5 y 6.). Debido a que el potencial de ionización del lantano (5.61 e V) es comparable con el

del estroncio (5.70 eV) sus sales actúan también como buffer de ionización en llamas

calientes. Una curva de la absorbancia del estroncio en función de la concentración del

buffer de ionización añadida alcanza un plateau en aprox. 5.5 %La (Figura. 8 a), y sobre

2000 mg L-1 de potasio, indicando que el efecto de la ionización se reduce a cero en

presencia de cualquiera de estos reactivos. La calibración acuosa es adecuada y exacta para

la determinación de estroncio en esta llama.

0.5

0.4

.!!! o 0.3 e (U .o ... 5! 0.2 ~

0.1

o o 2 4 6 8

acuosa

sintetice

muestra

[%La]

Figura 8 a E fe oto de la concentración de Lantano en un estándar acuoso, sintético y muestra en llama óxido

nitroso/acetileno

3.5.4. Evaluación del método

Bajo las condiciones antes optimizadas, las mejores figuras analíticas de mérito

obtenidas en ambas llamas se especifican en la Tabla 7. Estos resultados muestran que el

rango de calibración acuoso lineal en la llama óxido nitroso/acetileno es ligeramente más

amplio que el obtenido con llama aire/acetileno. También, el límite de detección y la

precisión son mejores en esta llama. El límite de cuantificación (L.Q.), definido como diez

35


veces el límite de detección, es el límite inferior de las curvas de calibración e indica la

cantidad mínima de estroncio que se puede medir con exactitud.

Tabla 7. Figuras de mérito analítico

LLama Ecuación de regresióna Rango lineal r D.L.o R.S.D.c

Aire/acetileno A= 0.0519 [Sr]+ 0.0050 0.30-20 0.9960 0.030 1.50

N20/acetileno A= 0.1031 [Sr] + 0.0043 0.15-25 0.9997 0.015 0.50

a A = m [Sr] + b, (.ionde A = absorbancta, m = pendiente del gráfico de cahbractón, [Sr] = concentración de Sr mg t 1 y b = intercepto con el eje X. b limite de detección (D.L.) definido como señal/blanco = 3/1, expresada en mg 1"1• e Desviación estándar relativa para diez lecturas consecutivas de la misma solución en %.

La precisión total, determinada por el análisis de cinco réplicas de 500 mg de hueso

seco, fue también mejor en la llama óxido nitroso/acetileno (0.5 %) comparado con la

obtenida en la llama de aire/acetileno (1.5 %). La precisión evaluada diariamente y también

día a día se calculó para seis muestras reales en la llama óxido nitroso/acetileno. Los

resultados in la Tabla 8 dejan poca duda acerca de la conveniencia de la aplicación de este

método para mediciones rutinarias de estroncio en grandes lotes de muestras de hueso.

Tabla 8. Determinación de la precisión analítica en la determinación de Sr en muestras de

cabeza de fémur por EAA en llamas.

Precisión (RSD %)

Muestra No. Contenido de Sra(J.tg g-1) Diaria~> Día por díac

1 23.78 4.32 4.28 2 27.03 1.60 1.62 3 22.30 3.67 3.61 4 29.54 5.13 5.10 5 19.24 1.95 1.90 6 22.85 3.54 3.57

a basados en 500 mg de masa ósea seca; b seis medidas repetitivas durante el día; e medidas por S días consecutivos.

La exactitud del método se garantizó mediante el análisis de dos materiales certificados:

36


cenizas de huesos (bone ash) SRM 1400 y harina de huesos (bone meal) SRM 1486 de la

NIST. Las cantidades obtenidas de 247 ± 8 y 260 ± 8 ¡.tg Sr g"1 están en concordancia con

los valores certificados de 249 ± 7 y 264 ± 7 ¡.tg Sr g"1 para cenizas de huesos y harina de

huesos, respectivamente. Sin embargo, es útil disponer de materiales de referencia con bajo

contenido de estroncio semejante a las concentraciones de estroncio en las muestras reales.

Adicionalmente, se intentaron estudios de recuperación mediante el salpicado del pool de

muestras óseas con diferentes cantidades de estroncio antes y después de realizar los

procesos de digestión. Como se esperaba, los resultados obtenidos para las muestras

salpicadas antes de la digestión son ligera pero no significativamente inferiores, aunque

cercanos al lOO% en todos los casos (Tabla 9).

Tabla 9. Recuperación de estroncio adicionado a pool de muestras óseas*.

Cantidad de estroncio (mg L"1) Recuperado ( % )

Adicionado Encontrado Antes de la digestión Después de la digestión

2 1.93 ± 0.02 96.5 ± 0.3 97.0 ± 0.4 4 3.92 ± 0.04 98.0 ± 0.5 99.1 ± 0.3 6 6.06 ± 0.03 101.0 ± 0.4 103.0 ± 0.2 8 8.23 ± 0.06 102.9 ± 0.4 101.0 ± 0.3

*Cantidad de endogeno 24.90 J..lg g·1

3.6. ANALISIS DE RESULTADOS Y DISCUSION

Las muestras óseas analizadas en esta sección fueron cabezas de fémur, fémur, tibia y otros

(vértebras L3 y L4, 4to metacarpianos, rodillas y juanetes. Los resultados analíticos obtenidos

se muestran en el Anexo l.

El estudio involucró 120 pacientes, 76 de sexo femenino y 44 de sexo masculino con

media de edades y contenido de estroncio que se muestran en la. Tabla 1 O. Es importante

hacer notar que los promedios de estroncio para mujeres son menores que para los hombres

o que los promedios globales. Otros autores también han encontrado que el contenido de

estroncio en cabeza de fémur varía entre 30 y 60 ¡.tg g"1 (s), pero no hacen un análisis

37


estadístico profundo. Los altos coeficientes de variación indican una gran variabilidad en

los datos obtenidos para ambos sexos. Los valores del coeficiente de asimetría evidencian

que la distribución global del estroncio es asimétrica positiva (el 75 % de los valores de

estroncio son menores o iguales a 38 ¡..tg g-1) mientras que el coeficiente de kurtosis revela

una distribución platicurtica (es < que 3) para el estroncio global y en hombres y una

distribución leptocurtica (es> que 3) para el estroncio en mujeres. Este tipo de distribución

permite predecir que la concentración de estroncio en huesos depende del sexo, siendo mas

baja en mujeres que en hombres. Estadísticamente, se ha encontrado una relación

inversamente proporcional entre el sexo, la edad y el contenido de estroncio, gráficamente

demostrado en la Figura 9.

Tabla 1 O. Análisis estadístico descriptivo global por edad y sexo de los sujetos estudiados

Global

n* 120 Media 63.06 SD 15.42 CV(%) 24.45 Skewness 0.27 Kurtosis -0.81 W:Normal 0.9458

76

EDAD F

67.20 15.40 22.91 -0.05 -1.01 0.9475

M

44 56.00 12.72 22.75 0.81 1.18 0.9376

ESTRONCIO (J.tg g-1)

Global F M

120 76 44 33.86 30.45 39.75 15.81 13.15 18.26 45.77 43.20 45.95 1.69 2.51 0.94 2.25 7.37 0.31 0.7331 0.7331 0.8558

• n =número de sujetos estudiados; SD = desviación estándar; CV = coeficiente de variación. • Skewnwss = coeficiente de asimetría; Kurtosis = tipo de distribución

De la Figura 9 se desprende que el contenido de estroncio empieza a disminuir a edades

diferentes en ambos sexos, observándose en las mujeres una marcada disminución entre 45

y 55 años, mientras que para los hombres la disminución empieza entre 55 y 65 años. Si la

misma disminución de los niveles de estroncio en mujeres está ligada a bajos niveles

hormonales, esto repercute también en un descenso de los niveles de calcio. La relación

entre estos dos elementos así como la variación de ellos con el tipo de hueso y la patología

son objeto de posteriores estudios.

38


SEX

F M

EDAD

Ji3 a 45

0.07

0.05

0.05 0 ::J

~ 0.04

' ,-0.03

0.02

0.01

Figura 9. Relación del contenido de estroncio con el sexo y la edad.

3 7. CONCLUSION

l.-Los resultados obtenidos en este trabajo favorecen la selección de la llama óxido

nitroso/acetileno para la determinación de estroncio en digeridos de huesos, puesto que

mejoran significativamente la sensibilidad y reducen el límite de detección con respecto a

la llama aire/acetileno. Además, la temperatura de esta llama es suficientemente alta para

disociar los componentes refractarios, eliminando así la necesidad de la adición de

cualquier agente liberador. Sin embargo, el efecto de la ionización en cada una de las

llamas es significante de manera que se requiere la adición de un buffer de ionización (K o

La).

2.-El uso del dispositivo en forma de "Y" conectado al nebulizador hace al método

versátil y útil en el trabajo rutinario del laboratorio.

3.- Por los analisis estadísticos realizados a los datos analiticos obtenidos, puede

asumirse que los niveles de estroncio descienden a una edad más temprana en el sexo

femenino.

39



l. W.S. Spector. (Ed.). Handbook ofBiological Data. W.B. Sounders Co., London, 1965.

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40


CAPITULO IV

DETERMINACION DE ESTRONCIO EN SANGRE Y ORINA POR

ESPECTROSCOPIA DE ABSORCION ATOMICA CON

ATOMIZACION ELECTROTERMICA

Desarrollo metodológico

4.1. Aparatos

Para la determinación de estroncio en sangre y orina se utilizó un espectrofotometro de

absorción atómica marca Perkin-Elmer, modelo 2100 (PE-2100) equipado con un corrector

de fondo de deuterio, un horno de grafito marca Perkin-Elmer modelo HGA-700 y un

automuestreador marca Perkin-Elmer, modelo AS-90. Con el objeto de seleccionar las

condiciones experimentales óptimas, se probaron tubos de grafito pirolítico con (lote PN

B012-1091) y sin (lote PN-B013-5653) plataformas deL 'vov. El control del instrumento y

el procesamiento de los datos analíticos se llevó a cabo con una computadora IBM, modelo

50Z dotado de un software (versión 9.1), propiedad de Perkin-Elmer.

Para comparación de los resultados, también se ha empleado un espectrofotometro de

absorción atómica marca Perkin-Elmer, modelo 4100 (PE-4100ZL) dotado de un corrector

de fondo basado en el efecto Zeeman longitudinal, un atomizador de grafito calentado

transversalmente (THGA) y un automuestreador marca Perkin-Elmer, modelo AS71. Con

este instrumento se usaron tubos de grafito pirolítico (lote PN-BOS0-4033) con plataformas

de L 'vov integradas. Una computadora personal marca Epson, modelo EL-486UC, dotada

de un software Perkin-Elmer 4100PC (versión 7.3) se usó para controlar el equipo y para

procesar los datos.

Con ambos equipos se utilizó una lámpara de cátodo hueco de estroncio, marca Perkin

Elmer y una impresora Epson modelo LX-810 para imprimir los perfiles de absorbancia,

los valores de área de picos y los datos estadísticos.

Otros equipos utilizados en este trabajo fueron: un bafio ultrasónico marca Branson,

modelo 221 O y un agitador tipo vortex marca Heidolph, modelo Reax 1 para facilitar la

41


disolución de los reactivos y homogeneizar los fluidos biológicos. La dilución de patrones y

adición de reactivos o muestras se realizó con pipetas marca Wheaton. En todo momento se

utilizaron guantes quirúrgicos para manipular las muestras biológicas.

4. 2 Reactivos

Todos los reactivos utilizados en este trabajo fueron del mas alto grado analítico,

excepto el ácido nítrico que fue Suprapur® (65 %) de la Merck. Agua doblemente de

ionizada con resistividad especifica de 18 Mn cm-1, obtenida en un sistema Millipore Milli

Q Plus se usó para la preparación de todas las soluciones y para enjuagar el material de

laboratorio.

Se preparó un patrón de estroncio (1 g L-1) disolviendo la cantidad apropiada de nitrato

de estroncio anhidro (99 % de la Merck) en 500 ml de ácido nítrico 0.2 % (v/v).

Diariamente se prepararon las soluciones de trabajo en el rango 0.0 a 20.0 ¡..tg L-1 por

diluciones sucesivas del patrón.

Algunos compuestos químicos se probaron como posibles modificadores de matriz:

nitratos de magnesio<1'2>, lantano, nickel, talio y paladio y óxidos de samario, europio,

terbio, holmio, erbio, tulio y lutecio<3-5>. El nitrato de lantano al 0.4 % (p/v) se preparó al

disolver la cantidad apropiada de la sal hexahidratada (La(N03)2. 6H20, 99% de la Sigma)

en agua, mientras que los demás nitratos solo se disuelven en ácido nítrico 0.2 % (v/v).

Soluciones transparentes de los óxidos se han obtenido en ácido nítrico 1:1 bajo agitación

ultrasónica por 20 min.

Triton X-100, 0.1 % (v/v) preparado por dilución con agua del reactivo concentrado de

la BDH se utilizó para diluir las muestras de sangre y orina para evitar problemas

experimentales asociados con la viscosidad de las muestras reales.

Argón de alta pureza (99.99% de AGA) se utilizó como gas de purga de los tubos de

grafito.

Para evitar contaminación exógena, los utensilios de laboratorio utilizados en la

preparación de reactivos y muestras fueron rigurosamente lavados con ácido nítrico (10 %)

y enjuagados copiosamente con agua antes de ser usados. En lo posible, se debe evitar el

42


uso de material de vidrio, por lo que las muestras y las soluciones de trabajos se deben

almacenar en envases de polietileno.

4.3 Muestreo y preparación de las muestras

Las muestras de sangre y orina analizadas en este trabajo fueron suministradas por el

Departamento de Traumatología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Los

Andes. Provienen de pacientes enfermos que por algún motivo consultaron o fueron

intervenidos quirúrgicamente por presentar molestias o enfermedades óseas

La sangre es un fluido biológico espeso de color rojo, que circula por el sistema

cardiovascular; esta formado de un plasma incoloro compuesto de suero y fibrinógeno y de

elementos en suspensión: glóbulos rojos, eritrocitos o hematíes y glóbulos blancos o

leucocitos y plaquetas o trombocitos. El peso total de la sangre equivale aproximadamente

a 1113 del peso corporal. Contiene 78% de agua y 22% de elementos sólidos. Los niveles de

cualquier elemento circulante en sangre son proporcionales a los encontrados en el

organismo <6).

El muestreo (5 ml de sangre completa) se realizó por punción venosa del antebrazo en

tubos "vacutainer" heparinizados con tapas de polietileno. Después de mezclarlas

suavemente por inversión, las muestras se guardaron bajo refrigeración ( 4 °C) hasta el

momento del análisis.

La orina, es otro fluido biológico importante formado por los desechos metabólicos y

sustancias tóxicas que algunos órganos excretores filtran de los fluidos circulatorios y los

elimina del organismo. Es un liquido secretado fundamentalmente por los rifi.ones durante

un proceso de filtración del plasma sanguíneo que pasa a través de los tubos nefrones.

Durante este proceso, agua y algunas sustancias útiles al organismo tales como

aminoácidos, glucosa y algunos nutrientes inorgánicos, son reabsorbidas en la corriente

sanguínea, dejando pasar una solución concentrada en desechos. La orina tiene color ámbar

con reacción ligeramente ácida, olor peculiar, sabor salino amargo y peso específico

variable entre 1.005 -1.030 g ml-1• La cantidad diaria secretada por un adulto es de 1.3 a 1.6

L y contiene normalmente 96 % de agua y 4 % de principios sólidos: urea como resultado

del metabolismo de los aminoácidos, sales inorgánicas, ácidos fosfórico, sulfúrico, úrico y

43


hipúrico entre otros, varias sales orgánicas, creatinina, amoníaco, etc. <6). En general la

composición de la orina es el espejo del agua que necesita el organismo: los animales de

agua dulce excretan orina diluida, los marinos tienden a combatir pérdida de agua en su

ambiente salado excretando orina concentrada y los animales terrestres, incluyendo al

hombre, tienen tendencia de retener agua en el organismo y eliminar orina concentrada en

sales.

La colección de las muestras de orina se llevó a cabo durante la primera micción en

envases estériles, desechables de polietileno. Las muestras fueron estabilizadas con ácido

nítrico (0.1 ml de ácido por cada 100 ml de orina) para evitar la descomposición y

subsecuente precipitación de fosfato de calcio, con la posibilidad de co-precipitación del

estroncio presente. Las muestras se guardaron luego bajo refrigeración ( 4 °C) hasta el

momento del análisis.

Antes del análisis, las muestras fueron sacadas del refrigerador y dejadas para adquirir

temperatura ambiente. Luego de homogeneizarlas en un vortex, las muestras de sangre y

orina se diluyen 1:10 y 1:20, respectivamente con Triton X-100 0.1% (v/v)

Para efecto de optimización de parámetros instrumentales se preparó un pool de sangre y

uno de orina combinando pequeños volúmenes de cada muestra independiente en un mismo

envase.

4.4. Procedimiento general

El procedimiento está basado en atomizar electrotérmicamente el analíto contenido en

muestras depositadas sobre la pared del tubo pirilítico o sobre la plataforma integrada de los

equipos PE-2100 y PE-4100ZL, respectivamente. La atomización sobre la pared se realiza

inyectando 1 O J.Ll de la solución del modificador que contiene 12.8 J.Lg de lantano, seguido

de 10 f.ll de muestra diluida con Triton X-100 o de patrón que contiene 5 f..Lg L"1 de

estroncio directamente en el tubo bajo las condiciones óptimas indicadas en la Tabla l. No

fue necesario usar modificador con la plataforma integrada. En cada caso las medidas se

hicieron por triplicado; paralelamente se midieron blancos preparados igual que las

muestras. Para evitar cambios en la sensibilidad debido al envejecimiento de los tubos, se

compararon las pendientes de dos gráficos de calibración preparados uno al comienzo de

44


cada experimento y otro al final. El tubo se reemplazó con uno nuevo cuando se encontró

una diferencia significativa (p < 0.05) entre las dos pendientes.

4.5. Resultados y discusión

Los parámetros experimentales considerados como óptimos para la determinación de

estroncio en sangre y orina (Tabla 1) fueron escogidos en base al criterio de máxima

sensibilidad y alta precisión. Para obtenerlos, se variaron las temperaturas y los tiempos de

secado, pirólisis y atomización predeterminados por el fabricante y recomendados en el

manual de operación de cada equipo.

Es importante mencionar que a la longitud de onda de absorción del estroncio ( 460.7

nm), la intensidad de emisión de la lámpara de deuterio utilizada como corrector de fondo

con el equipo PE-2100 es baja, mientras que la emisión de la matiz (sangre y orina) es

alta(2). La diferencia entre la absorbancia integrada obtenida para 5 ¡..tg Sr L"1 y para las

muestras estudiadas sin y con corrección de fondo resultó ser menor a 0.005 unidades de

absorbancia, indicando que la lampara de deuterio del PE-2100 realmente no hace falta

(Fig. 1). Igualmente, el intento de usar plataformas deL 'vov con este instrumento resultó

infructuoso; la adición de modificador o aumento en la temperatura de atomización no han

mostrado mejoras en sensibilidad ni siquiera para patrón solo. Posiblemente no se alcanza

la temperatura de atomización del estroncio sobre la plataformac2,7).

45

María Di Bernardo

0,7

0,6

'(ij' 0,5 e( -cu o 0,4 r::: i! o 1/) 0,3 ~

0,2

0,1

0,0

ESTRONCIO

AA AA-BG Técnica de medida

Tesis de Maestría

BG

Fig. l. Señales de absorbancia obtenidas con atomización sobre la pared con el PE-21 00 usando distintos modos de medida en presencia de lantano como modificador: AA =

sin corrección de fondo; AA-BG = con corrección de fondo; BG= solo señal de fondo; para: a) 5 J.lg Sr L -I; (b,c,d) sangre completa y ( e,f,g) orina, diluidas (1 :5, 1:1 O y 1 :20), respectivamente. Las condiciones se indican en la Tabla l .

. En cambio, la atomización sobre la pared piro lítica mejoró la sensibilidad en un 40 % en

presencia de lantano como modificador (Fig. 2a). Por esta razón, para estudios posteriores

se optó por utilizar el modo de atomización desde la pared, en presencia de modificador y

sin corrección de fondo con el instrumento PE-2100. Dadas las características de

fabricación del PE-4100ZL, no se ha podido variar el modo de medida- la plataforma es

integrada al tubo de grafito y el corrector tiene que estar encendido para que el equipo

funcione. Sin embargo, con este equipo se obtuvo la misma absorbancia integrada con y sin

modificador (Fig. 2b ), por lo que se optó no usar modificador en aras de conservar la vida

útil del tubo de grafito.

46

Maria Di Bernardo ESTRONCIO Tesis de Maestría

a

0,4 0,4 0,4 11 iii

0,3 0,3

0,2 0,2 -<( - 0,1 0,1 m ·o e

0,0 o 0,0 o m .o .... o (1) .o b <(

0,10

0,08

0,06

0,04

0,02

0,000

Tiempo (s)

Fig. 2. Respuesta analítica para 5 f..lg Sr L"1 obtenida con a) PE-2100: i) plataforma L'vov; ii) atomización sobre la pared sin modificador; iii) atomización sobre la pared con modificador. b) PE-4100: l. atomización sobre plataforma integrada sin modificador; y 2. Atomización sobre plataforma integrada con modificador. Las condiciones se especifican en la Tabla l.

4. 5.1. Elección del modificador

En ausencia de modificador, se ha obtenido una reproducibilidad pobre para las muestras

de sangre y orina, posiblemente debido a la formación de compuestos carbonatados sobre la

superficie del grafito, que puede producir seftales de absorbancia no-específica en ciclos

subsiguientes de temperatura.

47


Tabla l. Programas de temperatura para los tubos de grafito

Paso Temperatura 1 °C Rampa/ s Hold 1 s Flujo de argón/ mlmin-1

Instrumento 2100 4100 2100 4100 2100 4100 2100 4100 Secado 90 110 5 1 10 20 300 250 Secado 120 130 4 5 10 30 300 250 Secado 250 - 3 - 5 - 300 -Piro lisis 1500 1300 20 10 5 20 300 250 Atomización 2700 2400 o o 5 5 o o Limpieza 2800 2600 1 1 3 2 300 250 Enfriamiento 20 20 3 3 5 5 300 250

Variables comunes para ambos instrumentos: A. = 460.7 nm; Corriente de lámpara = 15 mA; Tiempo de integración= Ss; Modo de medida= Area de pico. Ancho de rendija= 0.2 and O. 7 nm para PE 2100 y PE 41 OOZL, respectivamente.

A una dilución de 1 : 1 O y 1 :20 para sangre y orina, respectivamente, las respuestas

mejoraron aunque la reproducibilidad se deteriora después de procesar algunas muestras.

La temperatura de atomización utilizada (Tabla 1 ), aunque alta, posiblemente no elimina

eficientemente todos los componentes de la matriz en la etapa de atomización. El uso de

modificadores de matriz podrían facilitar la atomización del analito. En este sentido, se han

probado varios elementos como posibles modificadores para determinar 50 pg de estroncio

por ETAAS, que incluyen: La, Ta, Mg, Lu, Pd, Ni, Sm, Eu, Ho, Er, Tm y Tb. En presencia

de Eu, Er, Tm y Tb se han obtenido picos chatos con colas, mientras que Ni, Sm y Ho no

han mostrado ningún efecto. Entre todos los demás (Fig. 3), pareciera que La y Ta mejoran

la señal del Sr con respecto a la obtenida sin modificador, aunque Mg, Lu y Pd también

tienen un leve efecto positivo. Estos elementos se estudiaron en mas detalles para las

matrices bajo estudio (sangre y orina).

48

María Di Bernardo

? ('I'J ·o e: ('I'J .e ... o (/) .e <(

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0,00

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0,00

0,4

0,3

0,2

Lu

0,51

0.1 sm~~rn 0•0o±-' --,1!--~~2~-~3 ~~· W&J,_5

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1 Er wm 0,00 5

ESTRONCIO Tesis de Maestría

0,5

0,4

0,3

0,2 Mg-wm 0,1

5 0,00

0,5 0,5

0,4 0,4

0,3 0,3

0,2 0,2

0,1 Pd wm 0,1 Ni 0,00 0,00

0,5. 0,51 0,4 0,4

0,3 0,3

0,2 0,2

o,1 E~"''"'' o.1 0'00 1 2 3 4 5 °'00

H~,_.,,., 1 2 3 4 S

0,5 0,5

0,4 0,4

0,3 0,3

0,2 0,2

0,1 0,1 Tb wm 0,00 5 0,00

Tiempo (s)

Fig. 3. Efecto de varios modificadores de matriz sobre el perfil de absorbancia de 50 pg de

Sr. wm =sin modificador. Las condiciones se indican en la Tabla l.

Sin embargo, el lantano es el modificador que permite obtener los mejores resultados en

términos de alta reproducibilidad y sensibilidad para los fluidos biológicos estudiados. La

Figura 4 muestra que cantidades crecientes de nitrato de lantano producen un incremento de

la señal analítica hasta obtenerse una meseta; es obvio que la cantidad optima sería entre 5

y 15 f.!g de La, siendo 12.8 f.!g (10 f.!l de nitrato de lantano 0.4 %(p/v)) la cantidad utilizada

en experimentos subsiguientes.

49


0,24

• • 1 . ---------------

·~ 0,22 1 ~. - 1

(/) • 1

1 ~ al ·o 0,20

1 e al -e o (/) ..e <( 0,18 •

o 10 20 30

Masa de modificador (IJQ)

Fig. 4. Efecto de cantidades crecientes de nitrato de lantano sobre la absorbancia integrada

de 50 pg de estroncio. Las condiciones se indican en la Tabla l.

Cantidades de lantano mayores a 20 J.Lg tienen efecto negativo sobre la sensibilidad y

sobre la calidad del perfil analítico, hecho discutido también por otros autores quienes

reconocen que se debe evitar el uso de modificador en exceso<9). La misma cantidad de

lantano añadido como su cloruro, deprime la señal, posiblemente debido a la formación de

algún compuesto volátil de estroncio y cloro que se pierde antes de la etapa de atomización.

El mecanismo de atomización de este elemento ha sido poco estudiado y no es del todo

elucidado en la bibliografia consultada. Existen algunas evidencias de la formación de

óxidos e hidróxidos<7,lO) así como de carburos<7

) en el horno de grafito. Aparentemente,

estas especies moleculares juegan un papel importante en el proceso de atomización del

estroncio(7). En presencia de lantano, la respuesta sobre la pared de grafito experimentó un

incremento, con respecto a la obtenida sin modificador, de 40, 42 y 25 % para el patrón de

estroncio (50 pg), sangre completa y orina, respectivamente (Fig. 5). Como se mencionó

50

María Di Bernardo ESTRONCIO

anteriormente, no fue necesario usar modificador con el PE-41 OOZL.

-!/)

~ tU ·o e tU € o !/) .o <(

a b 0,5

0,4

0,3 ~~.__..__~. La _.......·- La

0,2 1 -~·-· wm •-• wm

0,1.--- y 1000 1500 2000 2500 3000 1000 1500 2000 2500

e 0,5

0,4

0,3

0,2 ~o-o la ..a-o La o-u- /

o,1

:=::=.---·-· wm ~·-• wm

1000 1500 2000 2500 3000

Temperatura (0 C}

Tesis de Maestria

3000

Fig. 5. Curvas de pirólisis y atomización para estroncio, utilizando atomización sobre la

pared de grafito sin corrección de fondo: a) patrón de estroncio (5 J.~.g L'1) b) 1:10

sangre completa, y e) 1:20 orina, en presencia de lantano como modificador (La) y

sin modificador (wm).

4.5.2. Programa de temperatura

Los experimentos iniciales de optimización del programa de temperatura se llevaron a

cabo para un patrón de estroncio de 5 J.lg L"1 y luego, las condiciones fueron variadas para

obtener las mismas señales para las muestras y para el patrón solo. Para asegurar una

evaporación lenta del solvente, sin perdidas de analito por salpimienta, fueron necesarios

dos y tres pasos de secado con el PE-4100ZL y con el PE-2100, respectivamente. Los

51

Maria Di Bernardo ESTRONCIO Tesis de Maestría

mejores resultados se han obtenido para un tiempo de secado largo (hold time hasta 30 s),

combinado con estadía rápida (S 5 s). Con el objeto de establecer un programa de

temperatura único para las matrices en estudio, se han construido las curvas de pirólisis

(entre 500 y 2000 °C) y de atomización (entre 2000 y 3000 °C), en presencia y en ausencia

de lantano como modificador. Los resultados en la Figura 5 muestran un máximo de

absorbancia para 1500 °C y 2700 oc como temperaturas de pirólisis y atomización,

respectivamente. Con el corrector de fondo Zeeman y atomización sobre la plataforma

integrada, la sensibilidad es menor pero, en cambio, la absorbancia integrada es menos

dependiente de la matriz en un rango mas amplio de temperatura (Fig. 6).

0,14

• • ·------------- a ·-·----· • , ---, ''-... a

0,12 e ~ '-_

.~· ·-· ./' ~e ./ .

1 - 0,10 f/)

~ CIJ

i ·o e: 0,08 CIJ ..e ..... o • f/) ..e <( 0,06

b

0,04 ....-----"' ... ------... ~ ... ~ b ...----------- /. ',•

0,02 1000 1200 1400 1600 2000 2200 2400 2600

Temperatura (0 C}

Fig. 6. Curvas de pirólisis y de atomización para estroncio en: a) patrón acuoso, b) sangre

completa 1:1 O y e) orina 1 :20 obtenidas con el equipo PE 41 OOZL.

En consecuencia, para el PE-41 OOZL, las temperaturas de 1300 oc y 2400 oc fueron

52

María Di Bernardo ESTRONCifJ Tesis de Maestria

consideradas óptimas para pirólisis y atomización, respectivamente. La estadia lenta (20 s)

del paso de pirólisis permitió que el material depositado sobre la plataforma hierva

suavemente, asegurándose una mezcla íntima de la muestra con el modificador11 J 2• Dada la

similitud en los resultados obtenidos para patrones solos y muestras diluidas con cada

instrumento, se han usado programas de temperatura idénticos en todos los experimentos

siguientes (Tabla 1). Sin embargo, para diluciones menores, estos parámetros se deben

revisar y adecuar a la presencia de mayores cantidades de materia orgánica y constituyentes

inorgánicos dentro de los tubos de grafito. A pesar de que en el programa de temperatura

está incluido un paso de limpieza (2800 °C) con la intención de eliminar cualquier resto de

matriz, se ha observado cierto efecto de memoria con el uso de los tubos. Este efecto

sugiere la posible formación de carburos refractarios de estroncio en tubos viejos.

Igualmente, es conocido que el lantano es uno de los modificadores que atacan el grafito<2),

de manera que la vida útil de los tubos usados en este trabajo fue de aproximadamente 250

quemadas

4.5.3. Evaluación de interferencias

Es muy común que la matriz interfiera en ET AAS, causando severa disminución de la

señal analítica. Para corregir este efecto, se aplican métodos de adición de patrón o

simulación de matriz, con la consecuente alza en los costos y del tiempo de análisis. La

señal de estroncio fue evaluada en presencia y ausencia de algunos componentes conocidos

de las matrices en estudio. Elementos como sodio, potasio, calcio, magnesio, aluminio,

hierro, cobre y zinc fueron añadidos como nitratos, mientras que el fósforo se añadió como

:fosfat6 de amonio. Grandes cantidades de sodio, calcio, magnesio, aluminio y fosfato

d.epcimen la respuesta del estroncio; sin embargo, a los niveles calculados para las

4il.uciones realizadas para cada muestra ( 1 : 1 O y 1 :20 para sangre y orina, respectivamente),

ninguno de estos elementos interfiere. Este análisis selectivo de estroncio en los fluidos

biológicos es posible gracias a la combinación adecuada de modificación de matriz y

programación de las etapas de temperatura en el horno.

53


4.5.4. Características analíticas

Siguiendo el procedimiento general descrito anteriormente bajo las condiciones

consideradas óptimas, se han construido las curvas de calibración cuyas ecuaciones se

presentan en la Tabla 2. La misma Tabla contiene el rango lineal, coeficientes de variación

(~), detección límite (defmida como la concentración de estroncio que corresponde a tres

desviaciones estándar (DS) del blanco, masa característica (tno) y la precisión (calculada

como la desviación estándar relativa (DER) % para diez lecturas consecutivas de la misma

solución), obtenidos para ambos instrumentos. Estas características analíticas permiten la

determinación directa de estroncio en las muestras diluidas sin la necesidad de recurrir a

procedimientos de. adición de estándar o simulación de matríz. También muestran que la

sensibilidad obtenida con el equipo PE-2100 es mejor (comparando las pendientes de las

rectas de calibración) que la del PE-41 OOZL.

Tabla 2. Características analíticas

Equipo Tipo de atomización Ecuación de regresión Rango r D.L.n m o DERC

(modificador) lineal a (pg) (%)

PE-2100 Pared A= 0.0064 + 0.059 [Sr] 0.4- 15.0 0.9992 0.13 0.82 0.9

(La)

PE-2100 Pared A= 0.0048 + 0.034 [Sr] 2.4-20.0 0.9987 0.71 1.3 3.1

(wm)

PE-4100ZL Plataforma integrada A= 0.0020 + 0.026 [Sr] 0.5-25.0 0.9990 0.30 2.2 0.5

(wm)

a J..lg L-1; bDetección Limite in J..lg L-1

; e Desviación Estándar Relativa en%; m0 =masa característica; wm =sin modificador; [Sr]= concentración de estroncio en J..lg e 1

; r =coeficiente de correlación.

El envejecimiento del tubo de grafito solo afecta la sensibilidad y no la precisión de los

resultados.

Debido a que no hay fluidos biológicos certificados para el estroncio, la validación de los

54


resultados se realizó a través de estudios de recuperación (Tabla 3) y también por

comparación de los dos métodos ET AAS desarrollados en este trabajo.

Tabla 3. Estudios de recuperación

Concentración de estroncio (J..tg L -I)

Muestra Añadido Encontrado Recuperado (%)

Sangre completa 2 1.89 94.5

4 3.77 94.3

6 6.05 100.8

8 8.20 102.5

Orina 2 1.98 99.0

4 3.95 98.8

6 5.96 99.3

8 8.12 101.5

a El contenido endógeno se especifica en el texto.

Se observa concordancia entre los valores obtenidos con atomización sobre la pared en

presencia de modificador sin corrección de fondo y los obtenidos sobre la plataforma

integrada sin modificador pero con corrección Zeeman. La prueba t-Student aplicada a los

resultados de la Tabla 4 arrojó los valores experimentales: 2.58 y 0.82 para sangre completa

y orina, respectivamente, mientras que el valor teórico de t, calculado para cuatro grados de

libertad y p = 0.05 fue de 2.78. Esto indica que los resultados obtenidos por ambos métodos

no difieren significativamente entre si, de manera que dependiendo de las facilidades y la

dotación de los laboratorios analíticos, se puede aplicar cualquiera de los procedimientos

optimizados en este trabajo.

55


Tabla 4. Niveles de estroncioa en muestras reales (Promedio ± DS)

Muestra PE 2100 PE 4100 ZL

Sangre completa 27.9 ± 0.9 26.0 ± 0.8

(n= 20)

Orina 83.0 ± 3.0 81.0 ± 2.5

(n = 20)

4. 6. Aplicaciones analíticas

Es bien conocido que los niveles de cualquier elemento presente en fluidos biológicos

pueden variar con la ubicación geográfica o la ingesta diaria<10) así como con cualquier

tratamiento médico<11'12

) o enfermedad<13'14

). La metodología desarrollada en este trabajo se

aplicó a la determinación de estroncio en sangre y orina de 25 sujetos . Los resultados

analiticos obtenidos se muestran en el Anexo 2.

4. 7. Análisis estadístico de resultados y discusión

Es bien conocido que los niveles de cualquier elemento presente en fluidos biológicos

pueden variar con la ubicación geográfica o la ingesta diaria(IO) así como con cualquier

tratamiento médico<11J 2) o enfermedad<13

'14

). La metodología desarrollada en este trabajo se

aplicó a la determinación de estroncio en sangre y orina de 25 sujetos, 15 de sexo femenino

y 10 de sexo masculino, con edades comprendidas entre 47 y 58 años Los resultados

obtenidos se muestran en el Anexo 2.

El contenido promedio de estroncio en sangre y orina fue de 30.12±11. 72 J.tg L"1 y 89.80

± 37.45 J.tg L-1, respectivamente. El coeficiente de correlación de 62.35% es altamente

significativo (p < 0.001) para un intervalo de confianza del99%.(Tabla 1)

El análisis estadístico evidencia una proporción mayor de estroncio en el sexo

masculino,(Figura 7 y 8) aun en edades comparativas. Los niveles encontrados están en

buena concordancia con los obtenidos por otros autores. En sangre completa han reportado

56


valores de 27.0 ±0.9 J..Lg L"1 OS) con un rango de 17.0-42.5 J..Lg L"1

). Versieck y

colaboradores(16) reportaron valores de 22.2 ± 4.8 J..Lg L-1 en suero con un rango de 14.4-

30.7 J..Lg L-1 para un n=15. Leeuwenkamp y colaboradores(ll) en estudios realizados en

plasma sanguíneo encontraron valores de 16±8.0 J..Lg L"1en un rango de 10-55 ± J..Lg L"1 para

un n=6. En orina algunos autores<11'14

) han reportados valores entre 82.5 ± 2.5 J..Lg L-1 con un

rango de 25.55 ± 6.0 J..Lg L-1• De existir diferencias significativas podrían deberse, a que

estos sujetos de una u otra forma presentan problemas óseos, relacionados con

desmineralización marcada con la consecuente perdida de masa ósea. Un análisis más

completo de estos datos será objeto de trabajo posterior.

I'BIQ1ImiCY 11

10

24 36 48 60 24 36 48 60 SB_l!LCOI) MmPOIII'l

j------- ~ ---j j------- H ---j BIXD

Figura 7. Contenido de estroncio en sangre en relación con el sexo

30 60 90 120 30 60 90 120 llli_Ulll:IIZ laDPOIII'l!

1--- .. ---1 1--- 11 ---1 ""l!Q

Figura 8. Contenido de estroncio en orina en relación con el sexo

57


4.8. Conclusiones

En base a los resultados obtenidos en este trabajo se puede concluir lo siguiente:

• para determinar bajos niveles de estroncio en fluidos biológicos se

puede utilizar un programa único de temperatura, independiente de la matriz

estudiada.

• Se recomienda el lantano como modificador de matriz para

determinar estroncio en fluidos biológicos con atomización sobre la pared de

grafito y sin corrección de fondo.

• No es necesario usar modificadores de matriz para determinar

estroncio en fluidos biológicos con atomización sobre plataforma integrada y con

corrección de fondo Zeeman

• El procedimiento analítico permite calibración acuosa, evitando

métodos engorrosos de adición de patrón o simulación de matriz.

• El procedimiento analítico es sensible, preciso y exacto y se puede

aplicar rutinariamente para análisis de estroncio en las matrices estudiadas en este

trabajo y en otras, tales como: huesos, dientes, tejidos blandos, etc.

• La concentracióQ qe estroncio eQ scwgre y orina es mayor en el sexo

masculino, independientemente de la eqad.

• La concentración de estroncio, independientemente de la patología de

estos sujetos, es más bajo en el sexo femenino.

• Estudios analíticos, clínicos y análisis estadísticos más contundentes

hacen falta, para predecir que, realmente el cpntenido de estroncio en sangre es

representativo del contenido de estroncio en dqposito en el organismo.

. ' . .

58


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59


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activation analysis. J. Radioanal. Nuclear Chem., Articles, 168 (1993) 243-248.

60

ANEXOS

ANEXOJ

Tabla de resultados analiticos obtenidos en las muestras óseas analizadas

Muestra Edad Sexo Sr (codigo) (J.lg g"l)

39 42 M 50.25±1.10 10 45 F 40.45±3.70 62 47 M 35.24±2.20 24 49 F 48.21±2.70 76 49 M 49.38±1.75 115 58 F 30.28±2.71 85 78 M 24.27±2.12 73 50 F 23.37±1.45 21 50 F 25.42±3.72 6 57 M 27.42±2.63

101 57 F 24.09±2.28 42 57 F 20.31±1.25 49 57 F 23.41±1.15 59 58 M 21.13±2.24 45 59 M 20.38±1.25 97 59 M 21.03±0.95 3 60 F 26.32±2.10

41 61 M 22.08±1.62 93 61 M 23.18±0.45 108 75 F 20.18±3.72 104 79 F 20.34±2.14 52 79 F 22.17±0.45 37 80 F 16.29±0.93 89 80 F 21.07±1.10 56 89 F 20.37±0.75 111 97 M 22.03±0.25 9 64 F 18.24±0.12

114 73 F 15.32±2.75 5 80 F 4.09±0.79

61 85 F 14.27±1.95 69 87 F 12.34±2.72

Muestra Edad Sexo Sr (codigo) (¡..tg g"l)

4 43 F 25.15±0.67 53 52 M 25.46±0.70 96 58 F 23.32±1.10 44 58 F 21.39±2.12 63 60 F 32.06±0.06 65 63 F 22.18±1.23 66 65 M 24.07±0.25 119 65 M 23.26±0.83 105 66 M 25.19±0.43 117 69 F 24.17±0.25 102 74 F 23.06±1.12 50 74 F 22.39±0.19 51 75 F 21.10±0.75 13 75 F 24.37±1.12 57 76 F 25.02±0.83 14 78 F 25.27±0.25 103 80 F 21.42±0.14 118 87 F 21.34±3.74 109 88 F 19.07±0.58 12 94 F 20.48±1.15

116 48 F 34.41±0.75 25 52 F 32.37±1.15 77 52 F 30.29±1.48 63 55 F 32.14±0.55 112 65 F 21.40±0.90 78 68 F 31.42±0.25 26 68 F 34.07±0.45 11 76 F 21.19±0.84 35 76 F 33.02±0.25 87 76 F 26.30±0.75 88 85 F 22.06±0.15 110 87 F 30.04±0.72 40 89 F 31.10±0.25 92 89 F 30.15±1.10 36 85 F 30.07±0.65 58 87 F 29.16±0.60

Muestra Edad Sexo Sr (codigo) (¡.tg g-1)

38 43 M 53.89±2.10 90 48 M 64.96±0.97 20 61 M 30.41±1.25 72 61 M 43.09±0.89 8 69 M 24.12±1.68

113 69 M 37.69±1.75 107 70 F 24.56±0.75 43 76 F 31.09±1.15 95 76 F 25.87±1.12 55 78 M 25.75±0.95 1 63 F 31.97±1.25 2 40 M 31.09±0.95 7) 36 M 78.32±0.25 16 87 F 27.68±2.71 18 48 F 41.94±3.24 19 48 F 40.65±2.73 22 46 F 64.75±4.23 23 97 F 31.19±1.75 34 40 F 67.59±2.43 47 41 M 33.95±4.28 48 39 M 40.07±2.72 54 65 F 29.25±0.96 60 60 M 24.75±1.12 60 60 M 24.06±0.90 67 70 F 21.05±0.75 68 75 F 20.32±1.16 70 46 F 51.69±4.56 71 48 M 60.12±3.45 74 46 M 57.78±2.75 75 97 F 18.35±1.10 86 40 F 80.58±0.75 91 41 M 78.09±4.72 99 41 M 68.09±2.75 100 39 M 72.06±0.75 106 60 F 29.75±1.15 120 63 F 30.05±0.50

Muestra Edad Sexo Sr (codigo) {¡.tg g"l)

27 52 F 30.87±2.10 28 78 F 30.25±0.95 29 76 F 24.78±1.15 30 59 F 29.68±0.75 31 60 M 32.08±1.35 32 46 M 80.55±2.57 33 78 M 28.72±0.25 46 62 M 27.13±0.50 79 52 M 46.84±2.15 80 78 F 38.36±1.25 81 76 F 35.12±0.75 82 60 F 36.59±1.12 83 60 M 37.95±2.35 94 57 F 52.07±1.45 98 62 M 36.17±2.72 84 46 M 73.12±4.65 125 51 M 38.75±2.75 17 38 F 88.05±3.72 122 59 M 47.96±1.35 121 45 F 34.57±0.96 123 46 F 30.75±0.75 124 48 M 40.21±0.25


ANEX02

Tabla de resultados analiticos obtenidos en fluidos biologicos (sangre y orina) analizados

Muestra Edad Sexo Sr san_gre(!!_g r1_ SD Sr orina(J.tg r1) SD

1 58 F 21.18 0.43 100.56 3.71 2 58 F 20.390.94 0.94 100.86 2.99 3 78 M 29.320.86 0.86 80.34 0.94 4 47 M 31.12 1.16 145.38 0.27 5 80 F 20.17 0.72 60.18 0.90 6 61 M 20.37 0.25 72.41 2.40 7 59 M 20.13 0.68 108.37 1.15 8 65 F 22.03 0.56 135.25 2.85 9 66 M 20.41 1.19 81.38 1.15 10 52 F 28.09 0.24 85.32 0.25 11 48 M 47.55 2.10 118.05 2.79 12 65 F 18.09 0.16 75.17 0.06 13 68 F 30.16 0.72 87.23 0.90 14 60 F 26.34 1.35 93.15 3.72 15 78 F 32.65 1.15 87.24 0.75 15 76 F 29.19 2.65 74.59 0.58 17 60 F 30.07 0.90 80.39 4.25 18 57 F 45.50 0.55 104.72 6.20 19 62 M 30.27 0.25 114.84 4.72 20 41 M 67.83 2.45 152.23 7.24 21 41 M 45.02 1.75 138.27 4.45 22 46 M 44.55 1.45 117.75 7.24 23 85 F 23.18 0.75 62.38 1.15 24 87 F 25.40 0.15 90.03 0.90 25 89 F 24.09 0.09 58.41 1.12

Agradecimiento

El momento es apremiante, la oportunidad es única y mi corazón está lleno de satisfacción. -Por que nadie alcanza la meta con un solo intento, ni recoge cosechas sin probar muchos sabores, enterrar muchas semillas y abonar mucha tierra. -Nadie consigue un ideal, sin haber pensado muchas veces que perseguía un imposible. -Nadie deja de llegar, cuando se tiene la claridad de un don. -Nadie deja de llegar, cuando de verdad se lo propone y ahora ..... . Cuando se hizo triunfo lo que fue una meta. Cuando se hizo gozo lo que fue fatiga. No me que queda mas que agradecerles a:

Dra. Marcela Burguera, de usted aprendí a perseverar y crecerme ante las dificultades. Que Dios la bendiga. Dr. Carlos Rondón, amigo tu ayuda fue fundamental. Profesores del Laboratorio de Espectroscopia Aplicada. Sr. Cergio Rivas Dra. Elizabeth Torres Amigos, compañeros del Post-Grado A La Universidad de los Andes, al PIQA. A ti, a todos mis amigos verdaderos.

LA META NO TERMINA AQUÍ, AUN ME FALTA MUCHO CAMINO POR RECORRER.

determinacion de estroncio en muestras biologicas …

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