determinaciÓn de compuestos activos de piper auritum kunth por cromatografia y anÁlisis ftir.docx
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DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS ACTIVOS DE PIPER AURITUM KUNTH POR CROMATOGRAFIA Y ANÁLISIS FTIR.
Objetivo General.
Identificación de los compuestos activos presentes en el aceite de P. auritum
kunth (hierba santa) mediante el análisis de sus grupos funcionales obtenidos por
medio de cromatografía y FTIR, dando énfasis en el contenido de la molécula
safrol y realizando una comparación con la literatura.
Objetivo específicos.
Comprobar que existen compuestos activos presentes en la planta por
Cromatografía y análisis FTIR.
Identificar la composición química del aceite esencial, identificando los
grupos funcionales del safrol por Cromatografía y análisis FTIR.
Planteamiento del problema.
En la actualidad en la industria se ha desarrollado un amplio interés por los
principios activos de diversas plantas. En México gran variedad de plantas
silvestres contienen compuestos activos de las cuales se conoce poca
información. El presente trabajo buscó obtener información de la composición
química de la planta “piper auritum kunth” comúnmente conocida como hierba
santa, utilizada en la cocina mexicana, dando énfasis en el compuesto activo
safrol. Al safrol se le atribuyen propiedades antibacterianas, además, tiene una
alta demanda en la industria de insecticidas y plaguicidas en sentido general.
Justificación.
Piper auritum kunth (hierba santa) es una planta que posee actividad
antiinflamatoria, antibacteriana, antifúngica y antidermatofítica generada por sus
fenilpropanoides, lignanos, sesquiterpenos y monoterpenos como son; el borneol,
alcanfor, cineol, eugenol, safrol y una amplia variedad de componentes
bencénicos.
Si bien uno de los compuestos activos más destacados de esta planta que se
encuentra en un 93% es el safrol. Su importancia también radica en sus
propiedades antibacterianas, además de tener una alta demanda en la industria
de insecticidas y plaguicidas.
El safrol, es un monoterpeno oxigenado, presente como compuesto mayoritario en
especies tales como, sassafras (70-80%) y Ocotea cymbarum (90%). Forma parte
de la lista de sustancias controladas por las autoridades, debido a su uso como
precursor en la síntesis de drogas de uso ilícito como MDMA y por su efecto
carcinogénico y citotóxico. No obstante, es útil en la hemisíntesis de compuestos
de elevada actividad biológica
*Generar información química de piper auritum kunth, para validar la existencia de
componentes activos, que sirva como instrumento para estudios posteriores de
variabilidad e implementación de tecnología para la explotación adecuada de este
recurso.
.
HIPOTESIS
Determinar que existen los principales componentes químicos del safrol en el
aceite esencial de la hierba santa
MARCO TEORICO
Los extractos vegetales son compuestos hechos a base de plantas de las cuales
se extraen metabolitos secundarios mediante varias técnicas de extracción como
la maceración, las tisanas e infusión, con la ayuda de solventes como agua,
etanol, metanol, etc. La calidad y concentración de las sustancias activas pueden
llegar a variar de una estación a otra o con la localización de la planta, edad y
madurez del material vegetal con el que se prepara el extracto. La sustancia activa
se encuentra a menudo concentrada en una parte especifica de la planta, aunque
frecuentemente se localiza en hojas, flores y semillas (Gutiérrez, 1988)
Las sustancias que se extraen de las plantas, en general, son moléculas orgánicas
que tienen carbonos en su estructura principal, además de hidrógenos, oxígenos y
a veces nitrógenos, entre otros elementos. En algunas plantas estos elementos se
combinan bajo ciertas condiciones, formando sustancias toxicas.
La extracción de las sustancias activas de especies vegetales se hace
comúnmente con agua, pero con la necesidad de extraer compuestos activos de
fase intermedia, de acuerdo a la polaridad de los compuestos, se utilizan otros
solventes de mayor capacidad de arrastre, como lo es el alcohol o etanol, esto
debido a que las plantas tienen distintas polaridades y se considera que el etanol
es un solvente de extracción media. Ortega y Schuster (2000) menciona que la
conveniencia de utilizar compuestos polares en la extracción (como es el caso de
los extractos vegetales) radica en la disminución de efectos colaterales además de
los costos de producción.
Los aceites esenciales son también desechos del metabolismo de la planta,
comprende las esencias vegetales y resinas. Se presentan en emulsiones que
tienden a formar gotas y son los compuestos que dan perfume a los vegetales.
Los monoterpenoides son compuestos de los aceites vegetales (alfa pineno, 3-
careno, gosipol y cucurbitacina), cuyos efectos se han estudiado en la conducta,
fisiología sensorial, y metabolismo de insectos. Los alcaloides poseen un sabor
amargo, son componentes nitrogenados cuya función en la planta no está bien
determinada. La química vegetal es compleja y se le clasifica según a la
composición del núcleo, órganos o según su especie vegetal.
PARTE EXPERIMENTAL
Material. Se utilizó extracto de las hojas de P. auritum como materia prima, la cual
fue recolectado de arboles ubicados en la zona sur del estado de Morelos. Como reactivos
se empleó lo siguiente: acetato de etilo (AcEt, Merk CAS: 141-78-6), Hexano (reactivos
Karal CAS:1310-73-2), ácido sulfúrico (Sigma-Aldrich CAS: 7664-93-9), cloruro de
cobalto 97% (Sigma-Aldrich CAS: 7646-79-9). Placas de cromatografía con revelador UV,
columna de vidrio de 50 cm, silica gel 60 para columna (0.2-0.5 mm, Merk CAS: 7631-86-
9). Yodo sublimado (Faga-Lab, CAS: 7553-56-2)
Equipo. El instrumental utilizado fue: Parrilla con agitador magnético, modelo
MS400 Magnetic Stirer, marca Science MED. Lampara UV con longitud de onda dual 254
nm/366 nm Marca Camag. FT–IR marca PerkinElmer modelo Spectrum Two.
Metodología.
Obtención del extracto. Se recolecto la hoja de P. auritum en la región de
Tlaltizapan, Morelos. Se prepararon extractos uno con agua y otro con etanol. El tiempo de
ebullición con agua fue de 2 h y con alcohol de 15 min.
Cromatografía en papel: La separación de compuestos que absorben en la luz
visible del extracto de P. auritum en agua y en etanol se llevó cabo mediante la técnica de
absorción de papel filtro, la cual consiste en mostrar la separación de compuestos
visibles, logrando visualizar sus distintas tipos de clorofilas. Los extractos analizados
fueron posteriormente concentrados.
Cromatografía de capa fina: Los dos extractos de P. auritum en etanol y agua se
concentraron con él rota vapor, posteriormente se les agregó acetato de etilo esperando una
separación de fases, y se lavó con agua destilada, obteniendo 6 muestras A, B, C, D, E y F,
(ver figura 2), las cuales fueron colocadas sobre una placa de cromatografía con indicador
con diferentes sistemas de elución, Acetato de etilo 100%, 70:30, 10:90 y 50:50 de Acetato
de Etilo/Hexano.
Figura 2. Muestras obtenidas en los lavados.
Cromatografía en columna: una vez identificados la cantidad de componentes
presentes en cada una de las muestras A, B, C, D, E y F, así como el sistema adecuado para
la elución, se escogió la muestra B que contenía mayor número de componentes y se colocó
dentro de una columna cromatográfica previamente empaquetada. La muestra se dejó eluir
en un sistema de acetato de etilo – hexano 50:50, recolectando las fracciones obtenidas. A
estas fracciones se les volvió a tomar placa para identificar las fracciones idénticas.
Espectroscopia Infrarroja por Transformadas de Fourier (FTIR): las fracciones
idénticas fueron concentradas y analizadas por espectroscopia infrarroja por Transformada
de Fourier.
RESULTADOS
Cromatografía en papel: No se logró observar la separación de las clorofilas en el
extracto que estaba en agua, en cambio el extracto en etanol si se observaron (ver figura 3).
Figura 3. Cromatografía en papel, del extracto en etanol.
A B C D E F
Cromatografía de capa fina:
Para la preparación de las muestras el proceso se realizó cortando placas de silica gel
de 5x7 cm. Una vez que se llevo a cabo la elución se revelaron con la lámpara UV, y
posteriormente en yodo sublimado, encerrando los componentes que se lograran observar,
por último se aplico solución reveladora de ácido sulfúrico, cloruro de cobalto y agua,
calentando la placa observando los colores de los componentes que están presentes en cada
una de las muestras.
En la tabla 1 se observan las placas que contienen los resultados para la selección de
muestras con las que se lograron trabajar para el análisis de componentes, el sistema de
elución 50% acetato de etilo – 50% hexano fue la seleccionada para trabajar
posteriormente.
Tabla 1. Factores de retención para las muestras en 4 sistemas de elución diferentes.
Sistema de elución Placa Factor de retención
70% acetato de etilo - 30% hexano
A: 0.94 cmB: 0.978 cmC: 0.94 cm
100% acetato de etilo
B: 0.923C:0.076D:0.184
10% acetato de etilo - 90% hexano
B: 0.225cm
50% acetato de etilo - 50% hexano
B: 0.923
Cromatografía en columna: La muestra B se colocó dentro de una columna
cromatográfica previamente empaquetada con sílica gel y como fase móvil acetato de etilo-
hexano 50:50. Se dejó eluir la muestra recolectando un total de 26 fracciones. A estas
fracciones se les volvió a tomar placa para identificar las fracciones idénticas. Las cuales se
juntaron y se concentraron etiquetándolas de la siguiente manera F2-3, F15-20 y F21-23
(ver figura 4).
Figura 4. Cromatografía en columna de la muestra B.
Espectroscopia Infrarroja por Transformadas de Fourier (FTIR): Las fracciones
obtenidas se analizaron por FTIR, así como las muestras obtenidas que no se separaron en
cromatografía en columna, obteniendo como resultado los siguientes espectros (ver figura
3):
a) b)
Figura 3. FTIR de Muestras a) A, b) C, c) D y d) E, sin separación por columna.
En la figura 3 para todos los casos se observaron las señales correspondientes a la región alifática de estiramiento y flexión de los 3000-2800 cm-1 y 1450-1200 cm-1, así como en la región de los 3500 – 3300 cm-1 el estiramiento del hidrógeno enlazado al oxígeno para las 4 muestras. Para la figura 3a se observa en los 1700 cm -1 la señal correspondiente a C=O, en 1600 cm-1 C=C y en 1000 cm-1 C-O. Para la figura 3b) se observa en 3700 cm-1 la vibración correspondiente al H-N, en 1650 cm-1 el estiramiento de los hidrógenos enlazados al nitrógeno y en la región de los 1100-900 cm -1 C-O. Para la figura 3c), se observa en 1600 cm-1 una señal que puede corresponder a un C=C o hidrogeno enlazado a nitrógeno. En la región de 1100–900 cm-1 la señal correspondiente a C-O. Y para la figura 3d) se observa la presencia de C=C en los 1600 cm-1.
En la figura 4, se observa la primer fracción (F2-3) de la muestra B separada por cromatografía de columna. En los 3500 cm-1 se observa la señal correspondiente del hidrógeno enlazado a al oxígeno, de los 3000-2800 cm-1 se observa el estiramiento asimétrico y simétrico del CH3 y CH2, en 1750 cm-1 se observa el estiramiento de C=O, el cual puede corresponder al grupo carbonilo del acetato de etilo con el cual fue separada esta fracción.
c) d)
Figura 4. FTIR de fracción F2-3
En la figura 5, se observa el FTIR de la segunda fracción F15-20, en la cual podemos observar en los 3700 cm-1 una señal que puede corresponder a un carbono – carbono triple enlace o un nitrógeno-carbono triple enlace. En los 3400 cm -1 la señal correspondiente para hidrógeno enlazado al oxígeno. En la región de 3000–2800 cm-1 se observa el estiramiento asimétrico y simétrico del CH3 y CH2. En 1750 cm-1 el estiramiento C=O. de los 1500 -1200 cm-1 las vibraciones correspondientes a la flexión de balanceo del CH3, tijereteo del CH2 y sombrilla del CH3. En la región de 1100–900 cm-1 C-O.
Figura 5. FTIR de fracción F15-20
En la figura 6, se observaron las señales correspondientes a la región alifática de estiramiento y flexión de los 3000-2800 cm-1 y 1450-1200 cm-1. En los 1750 cm-1 se observó la señal correspondiente a C=O y en 1000 cm-1 C-O.
Figura 6. FTIR de fracción F21-23
CONCLUSIONES
La muestra B debido a su mayor cantidad de componentes revelados por cromatografía
en capa fina fue la seleccionada para su separación en cromatografía en columna. De
acuerdo a los resultados de espectros de las figuras 5 y 6, en estas fracciones se pudiera
encontrar la molecula llamada safrol la cual es reportada que existe en la planta Piper. Las
técnicas cromatografías demuestran que son viables para demostrar que se pueden obtener
buenos resultados. Por medio de estudios realizados previamente se pudo identificar y
comparar ciertos compuestos de P. auritum kunth, la cual en un futuro puede servir para
realizar un estudio más completo acerca de las propiedades y beneficios de esta. Entre los
compuestos a los que se le atribuyen propiedades antibacterianas, componente principal al
safrol. El safrol, además, tiene una alta demanda en la industria de insecticidas y
plaguicidas en sentido general.
Hasta este momento, las variables estudiadas y los resultados obtenidos aportan
información valiosa para continuar con este tema de investigación, se sugiere continuar con
análisis de Resonancia Magnética Nuclear de H1 (RMN) y espectrometría de masas (MS),
para corroborar las moléculas ya encontradas.
BIBLIOGRAFIA
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