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DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

PRESENTES EN LA AHUYAMA Y EL TOMATE CHONTO POR MÉTODOS

ANALÍTICOS COMUNES Y TÉCNICAS ELECTROQUÍMICAS

IRMA MARÍA GARCÍA GIRALDO

GRUPO QUÍMICO DE INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO AMBIENTAL (QIDEA)

PROGRAMA DE MAESTRÍA EN QUÍMICA

FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS Y TECNOLOGÍAS

UNIVERSIDAD DEL QUINDÍO

ARMENIA – QUINDÍO

2015

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DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

PRESENTES EN LA AHUYAMA Y EL TOMATE CHONTO POR MÉTODOS

ANALÍTICOS COMUNES Y TÉCNICAS ELECTROQUÍMICAS


Químico Puro

DIRECTORES:

HENRY REYES PINEDA Ph. D.

y

JHON ALEXANDER RODRIGUEZ ESPINOSA MSc.

Trabajo de investigación presentado para optar al título de MAGÍSTER EN

QUÍMICA

GRUPO QUÍMICO DE INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO AMBIENTAL (QIDEA)

PROGRAMA DE MAESTRÍA EN QUÍMICA

FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS Y TECNOLOGÍAS

UNIVERSIDAD DEL QUINDÍO

ARMENIA – QUINDÍO

2015

DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE PRESENTES EN LA AHUYAMA Y EL TOMATE CHONTO POR

MÉTODOS ANALÍTICOS COMUNES Y TÉCNICAS ELECTROQUÍMICAS

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AGRADECIMIENTOS

Quiero empezar por agradecerle primero que todo a Dios el cual ha sido el principal baluarte para poder culminar satisfactoriamente este peldaño de formación que me permite obtener otro gran éxito en mi vida. A mi esposo Manuel José que más que un apoyo ha sido el pilar principal para que yo pudiera realizar esta maestría, ya que siempre estuvo dispuesto a colaborarme de todas las formas posibles y cuando estuve a punto de decaer él fue mi principal motivación para seguir adelante. A mis padres José Arsenio García y Ana Lucía Giraldo, por estar siempre a mi lado en los buenos y malos momentos, y aunque mi padre ya no se encuentre en este mundo sé que estuvo guiando mis pasos en el momento que lo necesité, y mi madre que siempre ha sido un apoyo en todo lo que me propongo. A mi director Henry Reyes Pineda el cual siempre estuvo pendiente en el proceso de realización de mi proyecto brindándome sus conocimientos y su gran poder de gestionar cuando más lo necesité. A todos mis compañeros, en especial a Alejandra Echeverry que más que una gran amiga y colega fue un gran apoyo en todas y cada una de las etapas de la maestría. Agradezco también a mi compañerito Luis Salazar quien no sólo dispuso el laboratorio para el desarrollo de mi investigación, sino también me dedicó tiempo y sus conocimientos para ayudarme en este grato proceso. Y a todas las personas que hicieron parte de este gran triunfo como es convertirse en Magister de una prestigiosa Universidad como la Universidad del Quindío. Mil Gracias.


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TABLA DE CONTENIDO

RESUMEN ..................................................................................................................................... 9

1. INTRODUCCION ................................................................................................................. 11

2. OBJETIVOS .......................................................................................................................... 12

2.1. OBJETIVO GENERAL ................................................................................................. 12

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................... 12

3. ANTECEDENTES ................................................................................................................ 13

4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .............................................................................. 15

5. JUSTIFICACION .................................................................................................................. 17

6. REFERENCIAS .................................................................................................................... 18

7. CAPÍTULO 1 ........................................................................................................................ 19

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE VITAMINA C EN TOMATE CHONTO

(Lycopersicum esculentum) .......................................................................................................... 19

7.1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................... 21

7.2. METODOLOGÍA .......................................................................................................... 21

7.2.1. Caracterización Fisicoquímica de las muestras ...................................................... 21

7.2.2. Cuantificación de la Vitamina C por análisis espectrofotométricos. ...................... 23

7.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................... 24

7.3.1. Color ....................................................................................................................... 25

7.3.2. Acidez Titulable .......................................................................................................... 27

7.3.3. Análisis Espectrofotométrico Uv-Visible. .................................................................. 27

7.4. CONCLUSIONES ......................................................................................................... 29

7.5. LIMITACIONES ........................................................................................................... 29

7.6. REFERENCIAS ............................................................................................................. 30

8.1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 33

8.2. METODOLOGÍA ............................................................................................................. 35

8.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...................................................................................... 38

8.3.1. Electrodeposición controlada de las vitaminas a potencial constante ....................... 45

8.3.2. Cuantificación de las vitaminas C y E para las muestras de tomate y ahuyama. ....... 48

8.4. CONCLUSIONES ............................................................................................................. 50

8.5. LIMITACIONES ............................................................................................................... 50

8.6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................... 51

9. CAPÍTULO 3. ....................................................................................................................... 52

COMPARACIÓN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EN EL

TOMATE CHONTO Y LA AHUYAMA POR LOS MÉTODOS ABTS, DPPH Y

VOLTAMPEROMETRÍA CÍCLICA ........................................................................................... 52

9.1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 53

9.2 METODOLOGÍA ............................................................................................................... 61

9.2.1 Cuantificación del contenido polifenoles con el índice de Folin-Ciocalteu en los

extractos metanólicos del tomate y la ahuyama. ................................................................... 61

9.2.2 Toma de muestras y del blanco en el espectrofotómetro de UV-VIS. ......................... 62

9.2.3 Construcción de la recta estándar usando ácido gálico (A.G) ..................................... 63



5

9.2.4 Determinación de la actividad antioxidante por medio del catión radical del ácido

2,2‟azinobis-(3- etilbenzotiazolina)-6-sulfónico (ABTS•+) ................................................. 63

9.2.5. Determinación de la actividad antioxidante por el método del (1,1-Difenil-2-

picrilhidrazilo) DPPH●. ........................................................................................................ 64

9.2.6. Preparación de las muestras de tomate y ahuyama. .................................................... 64

9.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................................................... 65

9.3.1. Determinación de fenoles totales. ............................................................................... 65

9.3.2. Determinación de la actividad antioxidante por el método ABTS●+ ......................... 67

9.3.3. Determinación de la actividad antioxidante (AA) por el método del DPPH .............. 68

9.4. ANÁLISIS EXPERIMENTAL .......................................................................................... 70

9.4.1. Análisis univariable – ANOVA .................................................................................. 70

9.5. CONCLUSIONES ............................................................................................................. 72

9.6. LIMITACIONES ............................................................................................................... 73

9.7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................... 73

10. CONCLUSIONES GENERALES ........................................................................................ 76

11. RECOMENDACIONES ....................................................................................................... 77

6

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Orden de Preparación de los Reactivos en la Determinación de la Vitamina C ............. 23

Tabla 2. Análisis fisicoquímicos de la pulpa del tomate chonto................................................... 24

Tabla 3. Parámetros del Color ...................................................................................................... 26

Tabla 4. Valores de desviación estándar y concentración de acido ascórbico .............................. 28

Tabla 5. Parámetros utilizados en los análisis Voltamétricos ....................................................... 36

Tabla 6. Parámetros para el cálculo de vitamina C y vitamina E. ................................................ 49

Tabla 7. Contenido de fenoles totales en tomate y ahuyama. ....................................................... 66

Tabla 8. Porcentaje de Actividad Antioxidante por el método de ABTS. .................................... 68

Tabla 9. Porcentaje de Actividad Antioxidante por el método de DPPH. .................................... 69



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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Representación del Espacio Cromático Cilíndrico CIE-L, C, h .................................... 26

Figura 2. Curva de Calibración de la Vitamina C ......................................................................... 28

Figura 3. Montaje de la celda para voltametría cíclica ................................................................. 36

Figura 4. Ensayo con semilla de ahuyama 1. ................................................................................ 38

Figura 5. Ensayo con semilla de ahuyama 2. ............................................................................... 39

Figura 6. Ensayo con pulpa de tomate 1. ...................................................................................... 39

Figura 7. Ensayo con pulpa de tomate utilizando agua desionizada............................................. 40

Figura 8. Voltamograma de vitamina C sobre electrodo de Pb-Sn en H2SO4 0,01 M a 60mV/s. 41

Figura 9. Voltamograma de vitamina E sobre electrodo de Pb-Sn en H2SO4 0,01 M a 60mV/s. 41

Figura 10. Voltametría cíclica de Vitamina C en H2SO4 0,01 M a 600 mV/s. ........................... 42

Figura 11. Comparación de los escaneos 50 (rojo) y 100 (azul) mV/s para vitamina C y vitamina

E. ................................................................................................................................................... 42

Figura 12. Curva de polarización catódica. .................................................................................. 43

Figura 13. Curva de polarización anódica. ................................................................................... 44

Figura 14. Linealización de la cinética del reactor. ...................................................................... 44

Figura 15. Cronoamperograma de Vitamina C en H2SO4 0,01 M. ............................................. 46

Figura 16. Cronoamperograma de Vitamina E en H2SO4 0,01 M. .............................................. 46

Figura 17. Grafica de linealidad de |A| vs t^(-1/2) para calcular D en el reactor. ........................ 47

Figura 18. Grafica de linealidad de |A| vs t-1/2 para calcular D en el reactor para la vitamina E. 48

Figura 19. Procesos de oxidación para la vitamina E y la vitamina C.......................................... 56

Figura 20. Estructura del ABTS.................................................................................................... 57

Figura 21. Estructura del DPPH.................................................................................................... 58

Figura 22. Muestras de ahuyama y tomate con el reactivo de folling ciocalteu. .......................... 62

Figura 23. Curva de calibración del ácido gálico ........................................................................ 66

Figura 24. Análisis de Tukey para el tomate .............................................................................. 71

Figura 25. Análisis de Tukey para la ahuyama. ............................................................................ 71

8

LISTA DE ECUACIONES

Ecuación 1. Expresión de Tafel .................................................................................................... 45

Ecuación 2. Coeficiente de Difusión ............................................................................................ 47

Ecuación 3. Ecuación de Cottrel. .................................................................................................. 48

9

RESUMEN

El presente proyecto de investigación se desarrolló en tres capítulos para dar cumplimento al

objetivo general el cual fue determinar la capacidad antioxidante presentes en la ahuyama y el

tomate chonto por métodos analíticos comunes y técnicas electroquímicas

En el primer capítulo se realizó la caracterización fisicoquímica del tomate chonto, con el fin de

determinar parámetros tales como: color, actividad de agua, grados brix, potencial de hidrógeno

y acidez, también se realizaron análisis espectrofotométricos UV-Visible, obteniéndose que el

tomate chonto tiene un porcentaje considerable de acidez el cual se le atribuye una gran parte al

L-ácido ascórbico y con los análisis espectrofotométricos se pudo determinar la concentración de

vitamina C presente en dicho fruto.

En el segundo capítulo se determinó por el método electroquímico de voltamperometría cíclica la

capacidad antioxidante presente en la ahuyama y el tomate chonto, otorgándole dicha propiedad

a la vitamina C presente en el tomate y la vitamina E en la ahuyama por ser estas dos vitaminas

las más abundantes en dichos frutos, obteniéndose varios voltamperogramas donde se visualizan

la reacciones de oxido-reducción que se dan para cada caso, de esta manera se pudo comprobar

que este método es muy efectivo, económico y sensible para determinar la capacidad

antioxidante presente en la ahuyama y el tomate chonto dos verduras típicas del departamento

del Quindío

10

Finalmente en el tercer capítulo se hizo la comparación de los análisis espectrofotométricos y

electroquímicos que se le realizaron al tomate chonto, obteniéndose que el método

electroquímico es mucho más fácil, sensible y económico para determinar la capacidad

antioxidante de dicha hortaliza.



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1. INTRODUCCION

Las vitaminas constituyen un factor muy importante en la salud humana, gracias a su capacidad

antioxidante y las virtudes que cumplen en funciones específicas dentro del organismo.

Teniendo en cuenta que el efecto de la globalización en la actualidad genera estrés en la mayoría

de personas, (Euroresidentes, 2012) estas sustancias químicas se vuelven esenciales en la

prevención de múltiples enfermedades de tipo cardiovascular, envejecimiento prematuro, cáncer

y demás que ponen en riesgo la vida (R & H, 1993). Por esta razón verduras como la ahuyama

(Cucurbita maxima) y el tomate chonto (Lycopersicum esculentum) que son frecuentemente

cultivadas en el Quindío, resultan ser muy ricas en L- ácido ascórbico y α-Tocoferol centraron

nuestra atención debido a la importancia de la injesta de estos componentes para el beneficio de

los consumidores (Consumer, 2010)

Teniendo en cuenta que los procedimientos analíticos cuantitativos comunes no son lo

suficientemente efectivos, se seleccionó un método electroquímico como es el caso de la

voltamperometría cíclica que se basa en el estudio de la dependencia de la corriente de

polarización del voltaje aplicado a una célula electroquímica cuando el potencial del electrodo de

trabajo difiere significativamente del valor de equilibrio. Estas técnicas constituyen el mayor

grupo de métodos electroquímicos de análisis y se utiliza comúnmente para la determinación de

compuestos en soluciones, por lo tanto es un método muy novedoso, económico, rápido y

sensible; suficiente para analizar de la ahuyama y el tomate, dos especies propias de nuestro

departamento, el instante de su desarrollo en el que alcanzó el mayor punto de concentración de

Vitaminas E y C, con el fin de aprovechar dichos elementos en la en la dieta de los consumidores

(L., 2008).

12

2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GENERAL

Determinar la capacidad antioxidante presentes en la ahuyama y el tomate chonto por

métodos analíticos comunes y técnicas electroquímicas.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Caracterizar fisicoquímicamente las muestras de tomate chonto en sus estados de pos-

cosecha.

Determinar la capacidad antioxidante presentes en la ahuyama y el tomate chonto por

voltametría cíclica.

Comparar cual es el mejor método para determinar la capacidad antioxidante del tomate

chonto y la ahuyama en los estados de madurez óptimos.



13

3. ANTECEDENTES

1998

C. Bravo-DõÂaz, E. GonzaÂlez-Romero (Departamento de Química y Física, Universidad de

Vigo, España) Determinaron vitamina C en jugos naturales de naranja por análisis

electroquímico.

2003

M. García Alonso, S. Celestino Santos, J. Rivas Gonzales. (Facultad de farmacia, Universidad de

Salamanca, España). Evaluaron las propiedades antioxidantes de algunas futas propias del país

por métodos espectro fotométricos.

2006

R. Thangamuthu, S.M. Senthil Kumar, K. Chandrasekara Pillai (Departamento de física y

química, Universidad de Madras, India). Determinaron el L- acido ascórbico y polifenoles

presentes en jugos de frutas por medio de análisis electroquímicos.

2008

F. Rautenbach, I. Venter (Facultad de ciencias aplicadas, Universidad Tecnológica, Sur África).

Determinaron la capacidad antioxidante de algunas vitaminas presentes en las frutas, verduras,

granos y legumbres propias de sur áfrica por medio de técnicas espectrofotométricas.

2010

14

M. Drach, J. Narkiewicz-Michałek, A. Sienkiewicza M. Szymulaa, C. Bravo-Diaz (Facultad de

química, Universidad Marie Curie, Polonia). Determinaron las propiedades antioxidativas de las

Vitaminas C y E en sistemas de microemulsiones por análisis espectrofotométricos.



15

4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En el mercado actual se comercializa de diferentes formas las vitaminas “C” y “E, pero su

determinación y cuantificación resulta ser costosa y poco eficiente, lo que nos impulsa a

implementar nuevos procedimientos para su obtención, como es el caso de los análisis

electroquímicos que son rápidos, accesibles y sensibles frente a otros métodos de análisis

cuantitativo.

El ser humano debe incorporar en su dieta cantidades de vitamina C y vitamina E necesarias que

ayuden a realizar procesos metabólicos tales como estimular el sistema inmunológico para

combatir virus y bacterias, acción anticoagulante, creación de ATP, dopamina, hormonas

peptídicas y tirosina entre otras. Por lo tanto la ingesta de las mismas debe ser regular y lo más

natural posible.

Por esta razón verduras como la ahuyama (Cucurbita maxima) y el tomate chonto (Lycopersicum

esculentum) que son frecuentemente cultivadas en el Quindío, resultan ser muy ricas en L- ácido

ascórbico y α-Tocoferol centran mi atención debido a la importancia de la extracción de estos

componentes para el beneficio de los consumidores.




de personas, estas sustancias químicas se vuelven esenciales en la prevención de múltiples

16

enfermedades de tipo cardiovascular, envejecimiento prematuro, cáncer y demás que ponen en

riesgo la vida.

Por lo tanto esta investigación nace como objeto de responder la siguiente pregunta:

Es posible determinar y cuantificar por métodos electroquímicos y espectrofotométricos la

capacidad antioxidante presente en la ahuyama y el tomate chonto dos especies típicas del

Quindío?



17

5. JUSTIFICACION

El presente proyecto parte de la necesidad de generar un mejor aprovechamiento de los recursos

de la región, al implementar un nuevo procedimiento en la determinación y cuantificación de dos

vitaminas presentes en dos verduras típicas del Quindío, obteniendo de una manera más eficiente

y menos costosa un producto de alta calidad y de vital importancia en la salud humana, que

permitirá a largo plazo la generación de industria impulsando el desarrollo de nuestra región.

Estos antioxidantes como son las vitaminas E y C, cumplen una tarea esencial en el metabolismo

de los seres vivos, por lo tanto representan una necesidad para el consumidor. Por consiguiente

se hace necesario la búsqueda de nuevas técnicas capaces de llenar dichas expectativas.

Teniendo en cuenta que los procedimientos analíticos cuantitativos comunes no son lo

suficientemente efectivos, se seleccionará un método electroquímico el cual es muy novedoso,

económico, rápido y sensible; suficiente para analizar de la ahuyama y el tomate, dos especies

propias de nuestro departamento, el instante de su desarrollo en el que alcanza el mayor punto de

concentración de Vitaminas E y C, con el fin de aprovechar dichos compuestos en la en la dieta

de los consumidores.

En el caso de la ahuyama, se aprovechará un desecho agrícola “semillas” para extraer la mayor

cantidad de vitamina E presente, permitiendo establecer las bases para la creación de un nuevo

suplemento alimenticio que pudiera incursionar en el mercado colombiano

18

6. REFERENCIAS

Barros et al, 2008; Blasco, Rogerio, González, y Escarpa, 2005; Cosio, Buratti, Mannino, y

Benedetti, 2006.

Barros, L., Falcão, S., Baptista, P., Freire, C., Vilas-Boas, M., & Ferreira, I. C. F. R.

(2008).Antioxidant activity of Agaricus sp. Mushrooms by chemical, biochemical and

electrochemical assays. Food Chemistry, 111, 61–66.

Leubolt, R., Klein,H. Determination of sulphite and ascorbic acid by high-performance liquid

chromatography with electrochemical detection, J. Chromatogr. 640 (1993) 271–277.

Sarubin Fragaakis A, Thomson C. The Health Professional's Guide to Popular Dietary

Supplements. 3rd ed. Chicago, Il: American Dietetic Association; 2007.

SKOOG, Douglas A; HOLLER, F.James; NIEMAN Timothy A. Principios de Análisis

Instrumental. Quinta edición. Madrid, España. McGRAW-HILL/Interamericana de España,

S.A.U. 1992.

WEBGRAFÍA

Sitio en internet. Octubre 10 del 2012.

http://verduras.consumer.es/documentos/hortalizas/tomate/intro.php

Sitio en internet. Noviembre 20 del 2012.

http://www.euroresidentes.com/Alimentos/vitaminas/vitamina-e.htm

http://verduras.consumer.es/documentos/hortalizas/tomate/intro.php

http://www.euroresidentes.com/Alimentos/vitaminas/vitamina-e.htm



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7. CAPÍTULO 1.

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE VITAMINA C EN TOMATE CHONTO

(Lycopersicum esculentum)

QUANTITATIVE DETERMINATION OF VITAMIN C IN CHONTO TOMATO

(Lycopersicum esculentum)

García Giraldo Irma María1; Reyes Pineda Henry

2

Grupo químico de investigación y desarrollo ambiental (QIDEA), Programa de

Maestría en Química, Facultad de Ciencias Básicas y Tecnologías, Universidad del

Quindío, Armenia – Quindío

RESUMEN

En la actualidad la importancia de los antioxidantes como la vitamina C aumenta su relevancia

por los efectos que tiene en la salud humana. Teniendo en cuenta esto, la investigación fue

realizada con muestras de tomate chonto en la etapa de pos-cosecha en el municipio de Filandia,

Quindío, efectuándose la caracterización físico-química: potencial de hidrógeno (pH), sólidos

solubles (°Brix), actividad de agua (aw), color, acidez. Se utilizó la técnica de

espectrofotometría, UV-Visible para cuantificar la vitamina C. Con los datos obtenidos se

concluye que: a) la aw está muy cercana al valor teórico permitiendo establecer que este tomate

20

tiene una textura más jugosa, tierna y masticable b) los °brix obtenidos nos indican la cantidad de

sólidos solubles disueltos presentes en el tomate chonto c) el potencial de hidrógeno nos indica la

gran acidez del tomate, demostrada posteriormente con los valores de la acidez titulable d) los

resultados del color también reflejaron un tomate saludable rico en nutrientes; se tomó como

referencia los grados de coloración en la madurez del tomate descritos en la NTC 1103-1 e) los

análisis espectrofotométricos me permitieron saber la concentración de vitamina C en el tomate

chonto. Esta investigación se hace con el fin de determinar la capacidad antioxidante del tomate

chonto y así darle un valor agregado al producto.

Palabras clave: Tomate, Espectrofotometría UV-Visible, Vitamina C.

ABSTRACT

Today the importance of antioxidants such as vitamin C increases its relevance for the effects in

human health. Considering this, research was carried out with samples chonto tomato on

postharvest stage in the town of Filandia, Quindío and was carried out physicochemical

characterization: potential of hydrogen (pH), soluble solids (° Brix), water activity (aw), color,

acidity. It was used UV- Visible spectrophotometry technique to quantify vitamin C. Findings to

be concluded that: a) the aw is very close to the theoretical value; therefore, is possible to

establish that this tomato has a juicy texture, tender and chewy b) °Brix obtained indicate the

amount of soluble solids present in the chonto tomato c) Potential hydrogen indicates the high

acidity of the tomato, subsequently demonstrated with the titratable acidity values. d) Color

results also showed a nutrient rich and healthy tomato; reference was made to the degrees of

coloration in tomato maturity described in NTC 1103-1. e) Spectrophotometric analysis allowed



21

us to know the concentration of vitamin C in tomatoes. This research is done in order to

determine the antioxidant capacity of tomato chonto and to give added value to the product

Keywords: Tomato, UV-Visible Spectrophotometer, vitamin C.

7.1. INTRODUCCIÓN




de personas, (Euroresidentes, 2012) estas sustancias químicas se vuelven esenciales en la

prevención de múltiples enfermedades de tipo cardiovascular, envejecimiento prematuro, cáncer

y demás que ponen en riesgo la vida (R & H, 1993). Por esta razón el fruto como el tomate

chonto (Lycopersicum esculentum) frecuentemente cultivado en el Quindío, resulta ser muy rico

en L- ácido ascórbico, por lo cual centra mi atención debido a la importancia de la cuantificación

de este componente para el beneficio de los consumidores (Consumer, 2010).

El objetivo de este capítulo es carcterizar los parametros fisicoquímicos del tomate chonto y la

determinación de vitamina C por Espectrofotometría UV-Visible. (L., 2008).

7.2. METODOLOGÍA

7.2.1. Caracterización fisicoquímica de las muestras

22

Para realizar la caracterización físico-química se recolectaron las muestras del tomate chonto en

un sector cercano al municipio de Filandia Quindío en la etapa de pos-cosecha, en este caso se

escogió el tomate maduro dado que en esta etapa de madurez tiene mayores índices de

antioxidantes; posteriormente se realizó la determinación de los siguientes parámetros: actividad

de agua (aw), potencial de hidrógeno (pH), grados brix (°Brix), color y acidez titulable. Para

cada uno de las variables medidas se tomaron 9 tomates de forma aleatoria y se dividieron en tres

bloques los cuales fueron escogidos completamente al azar.

La actividad de agua se pudo determinar tomando las muestras de tomate y macerándolas hasta

homogenización, teniendo ya las muestras maceradas se llevaron al higrómetro a una

temperatura de ± 23,7°C y se tomaron las lecturas respectivas.

En la determinación de grados brix (cantidad de azúcar), se licuó el fruto, se filtró y se puso en

un vaso precipitado de 150 ml, después se tomó una gota de la muestra y se colocó en el

refractómetro, se observó en dirección de la luz y se tomó la lectura para cada una de las

muestras basándose en la escala que tiene el aparato.

En cuanto los valores de color, se tomó muestras de los tomates previamente licuados, se

colocaron en el colorímetro y se midieron los parámetros que se describirán más adelante.

Para la acidez titulable las muestras de tomate fueron licuadas y filtradas tres veces de tal manera

que no quedaran residuos sólidos en la solución, antes de realizar la titulación se estandarizó el

hidróxido de sodio con biftalato de potasio, después de tener las soluciones de las muestras de

tomate (1ml de jugo de tomate/9 ml de agua destilada), se les agregaron dos gotas de

fenolftaleína y se procedió a la titulación con hidróxido de sodio.

Por último para el potencial de hidrógeno, las muestras antes licuadas se filtraron y se colocaron

en beackers de 100ml y por último se leyeron los valores de pH en el pH-metro.



23

7.2.2. Cuantificación de la vitamina C por análisis espectrofotométricos.

Después de determinar los análisis físico-químicos se procedió a realizar los análisis

espectrofotométricos los cuales se determinaron por el método colorimétrico de la 2-nitroanilina.

estandarizado en el Departamento de Química, U.N., Bogotá. Para este análisis se tomaron 5

tomates al azar. Se tomó una solución patrón de acido ascórbico preparada en acido oxálico al

0,15% en concentración de vitamina/cm3.

Se filtró sobre gasa el zumo de tomate, en un vaso de precipitados de 100 cm3 previamente

tarado y con una pipeta de 5cm3 se midieron 5cm del jugo libre de semillas y hollejos;

posteriormente a 1cm3 de jugó se le agregaron 4cm

3 de solución de acido oxálico al 0,15%, se

agitó y se dejó en reposo por unos 3 minutos. Por último se filtró con papel filtro seco y este

constituyó el extracto problema.

Para la preparación de la curva de calibración se rotularon 10 tubos de ensayo y se adicionaron

en su orden los siguientes reactivos:

Tabla 1. Orden de preparación de los reactivos en la determinación de la vitamina C

24

Se leyeron cada una de las muestras a 540nm ajustando el 100% de trasmitancia.

Con los valores de absorbancia en las ordenadas y concentración en mg de vitamina C/cm3 en las

abscisas, se construyó una curva de calibración, posteriormente se interpoló el valor de la

absorbancia y se hallaron las concentraciones de las soluciones problema, los cálculos fueron

expresados en mg de ácido ascórbico/100cm3 de zumo.

7.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En la tabla 2 se evidencian todos los valores promedio de cada uno de los análisis fisicoquímicos

realizados a la pulpa del tomate chonto.

Tabla 2. Análisis fisicoquímicos de la pulpa del tomate chonto.

Parámetros Fisicoquímicos

Valores promedio

± Desviación Estándar

aw 0,988

°Brix 8,5

pH 4,44

La actividad de agua (aw) es la cantidad de agua libre en el alimento, disponible para el

crecimiento de microorganismos y diferentes reacciones químicas. Tiene un valor máximo de 1 y

un valor mínimo de 0 (F & F, 2004). Por lo tanto, los datos obtenidos indicaron valores de

actividad de agua altos, otorgándole a este fruto una textura muy jugosa y tierna, sin embargo



25

con probabilidad de ataque de ciertos microorganismos, lo cual puede ser contralado con simples

técnicas como la refrigeración.

Los grados Brix miden la cantidad de sólidos solubles presentes en un jugo o pulpa expresados

en porcentaje de sacarosa. Están compuestos por los azúcares, ácidos, sales y demás compuestos

solubles en agua presentes en los jugos de las células de una fruta o verdura.

La cantidad de sólidos solubles presentes en el fruto depende del potencial fisiológico y genético

de éstos para desarrollarlos. También tienen que ver con el grado de madurez y el valor nutritivo

de las frutas y verduras, el porcentaje de sólidos totales en el fruto de tomate corresponde de 5 a

8,5%. Dentro de los sólidos, el 25% está dado por compuestos insolubles, como celulosa y

proteínas; el 75% restante corresponde a sólidos solubles, los cuales son de gran importancia

para la calidad industrial del tomate. Como se observa en la tabla 2 el valor promedio de los

grados brix, muestran que el tomate chonto indicó tener un grado alto de madurez y ser un fruto

sano y nutritivo (F & F, 2004).

Los resultados del pH demostraron la gran acidez del fruto debido al estado de madurez en el que

se encontraba y las síntesis químicas que ocurrieron en esta etapa de maduración.

7.3.1. Color

Los parámetros de color L*, a* y b* en una muestra de alimento, designan: L*, la luminosidad

(0=negro y 100=blanco); a*, el color rojo (valores positivos) o verde (valores negativos) y b*, el

color amarillo (valores positivos) o azul (valores negativos). Los cambios de coloración durante

la maduración de los frutos de tomate resultan en cambios de los valores L*, a* y b*. Los valores

26

positivos de (a) mostraron el grado de coloración del tomate, es decir las grandes proporciones

de licopeno, lo que señala que la maduración del tomate chonto analizado tiende a los de los

rojizos. Los valores de (L) tienden a disminuir de la escala de 0-100, esto indicó que ocurrió un

oscurecimiento o disminución de la luminosidad causado por la síntesis de los pigmentos rojos,

igual para la coordenada (b) que posee valores pequeños debido a la disminución del color

naranja y la aparición del color rojo como se muestra en la tabla 3.

Tabla 3. Parámetros del Color

En la figura 1, se puede observar la representación del espacio cromático en la maduración del

tomate.

Figura 1. Representación del espacio cromático cilíndrico CIE-L, C, h.

Color ± Desviación Estándar

Bloque 1 Bloque 2 Bloque 3

a 14,3 13,2 15

L 38,7 40,9 40,3

b 9,9 10,8 11,7

c 17,4 17 19,1

h 34,7 39,3 38



27

7.3.2. Acidez titulable

Para los cálculos del porcentaje de acidez presente en el jugo de tomate se tuvo en cuenta la

reacción que se presenta a continuación:

C6H8O6 + 2Na C6H6O6Na2 + 2H2O

Acidez: 1,0007g/L= 0,25%.

Estos resultados indicaron que el tomate posee 0,25% de ácidos libres, en este caso el ácido

ascórbico que es el más abundante en esta verdura, con esta determinación se pudo comprobar la

presencia de ácido ascórbico en el tomate chonto.

7.3.3. Análisis espectrofotométrico UV-Visible.

El análisis espectrofotométrico UV-Visible se efectuó para determinar las concentraciones de

vitamina C presentes en el tomate chonto de esta manera se realizó una curva de calibración y

posteriormente el análisis de la muestra problema y se obtuvieron los resultados que se

encuentran a continuación. Más adelante, en estudios posteriores estos resultados serán

comparados con los obtenidos por estudios electroquímicos.

En la figura 2 se encuentran contenidos los datos de la curva de calibración de la vitamina c, en

el eje X se hallan los valores de la concentración en mg/mL y en el eje Y se hallan los valores de

la absorbancia.

28

Figura 2. Curva de calibración de la vitamina C

En la tabla 4, están contenidos los valores de concentración y absorbancia obtenidos en el

análisis espectrofotométrico realizado, estos valores nos indican que las concentraciones de ácido

ascórbico presentes en el jugo de tomate chonto están en el rango de 0,001 y 0,002 mg de ácido

ascórbico/ml de zumo analizado.

Tabla 4. Valores de desviación estándar y concentración de acido ascórbico

Acido Ascórbico

Promedio ± Desviación

Estándar

Concentración (mg/ml)

Tomate 1 0,07592 0,0010

Tomate 2 0,07665 0,0015

Tomate 3 0,08070 0,0010

Tomate 4 0,06199 0,0015

Tomate 5 0,o8409 0,0015



29

Al comparar estos resultados con los obtenidos por otros autores se observa que la concentración

es similar, debido posiblemente al estado de maduración de la especie vegetal, lo cual indica una

alta solubilidad de ácido ascórbico.

7.4. CONCLUSIONES

Los parámetros de caracterización físico-químicos analizados han demostrado que el tomate

chonto es un alimento rico en nutrientes, posee una textura muy jugosa tierna y masticable.

También se pudo establecer que en la etapa de madurez analizada había un porcentaje de ácidos

libres como el acido ascórbico contribuyendo a la posterior cuantificación del mismo.

El análisis espectrofotométrico UV-Visible, permitió cuantificar las concentraciones de acido

ascórbico presentes en el jugo de tomate chonto, de esta manera se pudo establecer que en el

zumo de esta verdura hay concentraciones entre 0,001 y 0,002 mg/ml de vitamina C, lo que

permitirá en estudios posteriores establecer la capacidad antioxidante de los mismos por métodos

electroquímicos como la voltamperometría y se comparará con la espectrofotometría UV-Visible

ya analizada, para así determinar cuál es el mejor método de análisis cuantitativo para este fruto

típico del Quindío.

7.5. LIMITACIONES

La facilidad con que el ácido ascórbico se oxida, fue un factor limitante en el desarrollo de este

capítulo, dado que para mantener las condiciones necesarias en la realización de la

cuantificación de la vitamina C por el método de la 2-nitroanlinina por espectrofotometría UV-

30

Visible, es necesario un cuarto obscuro, envolver los tubos de ensayo en papel aluminio y hacer

pasar las muestras lo más rápido posible por el espectrofotómetro.

Otro limitante fue la cantidad de reactivos que hubo que utilizar, lo que hace que realizar este

método se lleve mucho tiempo y sea costoso con respecto a otros.

7.6. REFERENCIAS

Consumer, E. (10 de Octubre de 2010). Eroski Consumer Guia de Hortalizas y Verduras.

Recuperado el 4 de Enero de 2014, de Eroski Consumer Guia de Hortalizas y Verduras:

http://www.verduras.consumer.es/documentos/hortalizas/tomate/intro.php

Euroresidentes. (20 de Noviembre de 2012). Euroresidentes Alimentos-Vitamina E.

Recuperado el 15 de Junio de 2013, de Euroresidentes Alimentos-Vitamina E:

http://www.euroresidentes.com/alimentos/vitaminas/vitamina e.htm.

F, A. C., & F, A. H. (2004). Tratamientos de Postrecolección del Tomate Fresco. España:

Ediciones de Horticultura S.L. Reus.

L., B. S.-B. (2008). Antioxidant activity of agaricus sp. Mushrooms by chemical,

biochemical and electrochemical assays. Food Chemestry , 111, 61-66.

R, L., & H, K. (1993). Determination of sulphite and ascorbic acid by high-performance

liquid chromotagrphy with electrochemical detction. J. chromatography , 271-277.

http://www.verduras.consumer.es/documentos/hortalizas/tomate/intro.php

http://www.euroresidentes.com/alimentos/vitaminas/vitamina%20e.htm



31

8. CAPÍTULO 2.

EVALUACIÓN DE LA CINÉTICA DE REDUCCIÓN ELECTROQUÍMICA DEL L-

ÁCIDO ASCÓRBICO, VITAMINA C Y α-TOCOFEROL, VITAMINA E, PRESENTES

EN LA AHUYAMA Y EL TOMATE CHONTO.

EVALUATION OF THE ELECTROCHEMICAL REDUCTION KINETICS L-

ASCORBIC ACID VITAMIN C AND Α-TOCOPHEROL VITAMIN E, PRESENTS IN

THE TOMATO CHONTO AND PUMPKIN.


2

Grupo químico de investigación y desarrollo ambiental (QIDEA), Programa de


Quindío, Armenia – Quindío

RESUMEN

Teniendo en cuenta la importancia de los antioxidantes presentes en frutas y verduras y el efecto

que ejercen contra algunas enfermedades tales como el cáncer y trastornos cardiovasculares, se

buscó implementar una técnica económica, novedosa, rápida y sensible para hallar la capacidad

antioxidante de la ahuyama y el tomate chonto dos frutos altamente producidos en el

departamento del Quindío. De esta manera se realizaron dos diluciones a partir del jugo de

semillas de ahuyama y de la pulpa de tomate debidamente licuados; la primer dilución se hizo

32

tomando un mililitro del jugo de cada solución llevándolo hasta 100mL con H2SO4 0,01M

(dilución 1:100), y la segunda solución se realizó tomando un mililitro de la primer solución y

llevándolo hasta 50mL con agua desionizada. (dilución 1:50). A partir de estas soluciones se

hicieron mediciones de voltametría cíclica con un potenciostato Gamry Interface 1000®

usando

diferentes parámetros de medición especificados en tiempo de equilibrio: 60s, velocidad de

escaneo: 50mV, rango de escaneo: 2mV, Número de ciclos: 5, Límites del ciclo (mV): 0 4 0 0.

Los voltamperogramas obtenidos proporcionaron una información cualitativa y cuantitativa de

los antioxidantes presentes, se pudo observar que existe un mecanismo de reducción que consta

de dos etapas, se le atribuye también a dichas gráficas que el tipo de reacción que ocurre para

cada una de las diluciones de tomate y ahuyama es reversible. De esta manera se pudo

determinar la capacidad antioxidante y la concentración del l-ácido ascórbico del tomate y al α-

tocoferol presentes en la ahuyama.

Palabras clave: Ahuyama, Tomate, Capacidad Antioxidante, Voltametría cíclica.

ABSTRACT

Given the importance of antioxidants in fruits and vegetables and their effect against some

diseases such as cancer and cardiovascular disorders, he sought to implement a new, rapid and

sensitive economic technique, to find the antioxidant capacity of the pumpkin and the highly

chonto two tomato fruits produced in the department of Quindío. Thus two dilutions were made

from the juice of seed pumpkin and tomato pulp liquefied properly; the first dilution was made

by taking one milliliter of each solution bringing it juice to 100mL with 0.01 M H2SO4 (1: 100

dilution), and the second solution was made by taking one milliliter of the first solution and



33

bringing to 50mL with deionised water. (1:50 dilution). From these solutions cyclic voltammetry

measurements were made with a potenciostato Gamry 1000® Interface using different

measurement parameters specified in Balancing time: 60s, Scan speed: 50mV, scanning range:

2mV, Number of cycles: 5, Limits cycle (mV) 0 4 0 0. The voltammograms obtained provided

qualitative and quantitative information of the antioxidants, it was observed that there is a

reduction mechanism consisting of two stages, it was also attributed to these graphs type reaction

that occurs for each of the dilutions is reversible squash and tomatoes. Thus it was determined

the antioxidant capacity allocated to ascorbic l-acid tomato α-tocopherol and present in the

pumpkin.

Keywords: Pumpkin, Tomato, Antioxidant Capacity, cyclic voltammetry.

8.1. INTRODUCCIÓN

Las técnicas electroanalíticas como la voltamperometría cíclica son altamente utilizadas para

brindar información cualitativa y cuantitativa acerca de las reacciones electroquímicas que

ocurren en diversos tipos de muestras. Esto resulta de la habilidad que tiene dicha técnica para

proveer rápidamente información en procesos termodinámicos donde ocurren reacciones con

transferencia de electrones, reacciones químicas y procesos de adsorción (WANG, 2001). La

voltamperometría cíclica consiste en escanear linealmente el potencial de un electrodo de trabajo

estacionario (en una solución sin agitar), utilizando la forma de potencial de onda triangular.

Dependiendo de la información que se busca, se pueden utilizar ciclos individuales o múltiples

34

los cuales pueden ser observados en forma de gráficas que se denominan voltamperogramas

cíclicos.

Debido a que esta técnica es rápida económica, sensible y no requiere de grandes cantidades de

muestra, es ampliamente utilizada en la determinación de antioxidantes presentes en muestras de

alimentos. Teniendo en cuenta que los parámetros de las reacciones redox son inherentes en los

análisis de la voltamperometría cíclica, esto me permite atribuir a los compuestos que se reducen

la capacidad antioxidante de los mismos.

Dado que los antioxidantes son de gran importancia en la nutrición y en la salud humana y

teniendo en cuenta que vitaminas hidrosolubles como las vitaminas C (ácido ascórbico) es

conocida por sus propiedades reductivas, siendo fácilmente oxidado a ácido dehidroascórbico el

cual actúa como un poderoso antioxidante que lucha contra las enfermedades de los radicales

libres inducidos además el ácido ascórbico se utiliza con frecuencia como un antioxidante en la

industria alimentaria para prevenir cambios no deseados en color o sabor. Como un donante de

electrones, el ácido ascórbico sirve como uno de los antioxidantes de peso molecular pequeño

más importantes que contribuye a la capacidad antioxidante total un indicador importante de la

calidad de alimentos y bebidas (Bard A.J., 2001). Debido al papel crucial de la vitamina C en la

bioquímica y en aplicaciones industriales, la determinación de vitamina C todavía presenta

interés para la investigación. Monitoreo rápido de los niveles de vitamina C durante las etapas de

producción y control de calidad son muy importantes (P.F.Hsu, 2008) y las vitaminas

liposolubles como la vitamina E participan en múltiples procesos bioquímicos en el organismo

que cumplen funciones vitales tales como; prevención de enfermedades como el cáncer, evitan el



35

envejecimiento (Horton, 1996) prematuro, evitan enfermedades de tipo cardiovascular y demás,

el estudio de dichos compuestos toma cada vez más fuerza en la industria de los alimentos.

Es por eso que verduras como la ahuyama y el tomate que son ricas en antioxidantes son de gran

importancia en la nutrición de los consumidores, ya que su injesta proporciona beneficios para la

salud del ser humano, de manera económica y muy asequible. Es por ello que la finalidad de este

capítulo es evaluar la cinética de reducción electroquímica del l- ácido ascórbico, vitamina c y α-

tocoferol, vitamina e, presentes en la ahuyama y el tomate chonto.

8.2. METODOLOGÍA

Se realizaron dos diluciones a partir del jugo de semillas de ahuyama y de la pulpa de tomate

debidamente licuados; la primer dilución se hizo tomando un mililitro del jugo de cada solución

llevándolo hasta 100mL con H2SO4 0,01M (Dilución 1:100), y la segunda solución se realizó

tomando un mililitro de la primer solución y llevándolo hasta 50mL con agua desionizada.

(Dilución 1:50). A partir de estas soluciones se hicieron mediciones de voltametría cíclica con un

potenciostato Gamry Interface 1000® usando diferentes parámetros de medición especificados en

la tabla 5. La celda se instaló en un balón de tres bocas fondo redondo, en presencia de un

pequeño flujo de nitrógeno en la atmósfera y poniendo platino como electrodo de trabajo, grafito

como contra electrodo y un electrodo de referencia de Hg/HgSO4, cerrando el circuito por un

puente realizado con un caimán adicional para evitar la sobrecarga de la celda y proporcionar

mayor estabilidad a las mediciones como se muestra en la figura 3.

36

Figura 3. Montaje de la celda para voltametría cíclica

En la tabla 5 que se encuentra a continuación podemos observar todos los parámetros que se

midieron para los ensayos de voltametría cíclica para las semillas de ahuyama y la pulpa del

tomate chonto.

Tabla 5. Parámetros utilizados en los análisis Voltamperométricos



37

Muestra Parámetros de medición

Nombre del archivo

Observaciones

Semillas de

ahuyama en

dilución 1:100 y 1:50

Tiempo de equilibrio: 60s

Velocidad de escaneo: 40mV

Rango de escaneo: 2mV Número de ciclos: 4

Límites del ciclo (mV): 0 3 -

3 0

IG-14 Medición exitosa

Semillas de

ahuyama en


Tiempo de equilibrio: 60s Velocidad de escaneo: 40mV

Rango de escaneo: 2mV

Número de ciclos: 4

Límites del ciclo (mV): 0 3 -3 0


Semillas de

ahuyama en






3 0


Semillas de

ahuyama en







Pulpa de tomate en






4 0

IG-18 La celda se sobrecarga a partir de

3,1V

Pulpa de tomate en







Pulpa de tomate en



Velocidad de escaneo: 60mV Rango de escaneo: 2mV



3 0


Pulpa de tomate en





Número de ciclos: 4 Límites del ciclo (mV): 0 3 -

3 0


Agua desionizada Tiempo de equilibrio: 60s

Velocidad de escaneo: 60mV Rango de escaneo: 2mV



3 0


Pulpa de tomate en

dilución 1:100




IG-23 La celda se sobrecarga en 1,3V

38




A continuación se observan los voltamperogramas cíclicos para las muestras de pulpa de tomate

chonto y semillas de ahuyama los cuales fueron obtenidos teniendo en cuenta los parámetros

establecidos en la tabla 5 de este capítulo.

Figura 4. Ensayo con semilla de ahuyama 1.



39

Figura 5. Ensayo con semilla de ahuyama 2.

Figura 6. Ensayo con pulpa de tomate 1.

40

Figura 7. Ensayo con pulpa de tomate utilizando agua desionizada.

En las gráficas que exhiben los voltamperogramas para cada una de las muestras de semillas de

ahuyama y pulpa de tomate se puede observar claramente que se da un tipo de reacción redox

reversible que consta de dos etapas, ambas muestras presentan mecanismos de reducción por lo

tanto se puede decir que existe una actividad antioxidante para estas dos verduras, lo cual se

pudo confirmar en los análisis posteriores.

Para establecer el potencial de deposición de ácido ascórbico, se evaluó los comportamientos

electroquímicos de estos iones en la sal fundida del ácido sulfúrico (H2SO4) que contiene los

iones. Las figuras 8 y 9 muestran los voltamperogramas registrados en el electrodo de Pb-Sn a

una velocidad de escaneo de 60 mV/s.

La figura 8 muestra un voltamperograma para la vitamina C mostrando la reducción del ácido

ascórbico sobre el electrodo de trabajo y otro en la onda de oxidación a un voltaje de 0,5 V.



41

Por último, en la figura 9 se aprecian igualmente dos picos; un pico alrededor de -0,34 V durante

la exploración catódica que se atribuye a la reducción de la vitamina E.

Figura 8. Voltamperograma de vitamina C sobre electrodo de Pb-Sn en H2SO4 0,01 M a

60mV/s.

Figura 9. Voltamperograma de vitamina E sobre electrodo de Pb-Sn en H2SO4 0,01 M a

60mV/s.

42

Para el segundo análisis se tomó la muestra de tomate, se hizo una dilución del mismo sistema,

empleando una velocidad de escaneo de 60mV/s, tal como se muestra en la figura 10 donde se

pueden apreciar nuevos picos en la voltamperometría del ácido ascórbico, mostrando que al

disminuir la velocidad se pueden detectar otras reacciones electroquímicas y químicas.

Figura 10. Voltamperometría cíclica de vitamina C en H2SO4 0,01 M a 600 mV/s.

Al comparar los dos escaneos de vitamina C y vitamina E se puede apreciar la aparición de un

nuevo pico en la zona de oxidación y dos nuevos picos en la zona de reducción (figura 11).

Figura 11. Comparación de los escaneos 50 (rojo) y 100 (azul) mV/s para vitamina C y

vitamina E.



43

El nuevo pico en la zona de oxidación se puede atribuir a la oxidación del electrodo de Pb-Sn, es

decir cambia de Pb0 a Pb

+2 en solución.

El primer pico en la zona de reducción de derecha a izquierda, coincide con los valores de la

reducción de la vitamina C como se puede apreciar en la figura 8. Sin embargo la orientación del

pico hacia arriba indica que es una oxidación debida a una reacción química pues a velocidades

de escaneo mayores aparece esta señal, a valores de escaneo más negativos para este elemento

figura 8. Para el siguiente pico en la zona de reducción sus valores indican la reducción de

vitamina E, tal como se observa en la figura 9.

Se realizó los cálculos del coeficiente de transferencia del reactor electroquímico con los tres

electrodos, para lo cual se utiliza la técnica de extrapolación de Tafel para las dos vitaminas.

Donde ambas curvas de polarización anódica y catódica exhiben pequeñas partes lineales, tal

como se observa en las figuras 12 y 13 respectivamente.

Figura 12. Curva de polarización catódica.

44

Figura 13. Curva de polarización anódica.

Para determinar las zonas lineales se graficó E – E0 vs Ln |i| figura 14.

Figura 14. Linealización de la cinética del reactor.

De acuerdo a la expresión de Tafel :



45

Ecuación 1. Expresión de Tafel

Remplazando en (1):

Se determinó α = 0,47 lo cual indica que el sistema está en equilibrio de oxidación y reducción;

donde la reducción es un proceso electroquímico y la oxidación se debe a una reacción química;

muestra una simetría respecto a la energía de activación para la reducción y oxidación de las

especies de vitamina C y E corroborando lo mostrado en la figura 11.

8.3.1. Reducción controlada de las vitaminas a potencial constante

De la observación de la superficie del electrodo de trabajo durante las mediciones de

voltamperometría cíclica, se supuso que los potenciales de reducción de las dos vitaminas se

encuentran dentro del rango de -0,34 a -1,05 V. La capa de vitamina C se reduce a un potencial

de -1,05, a potenciales inferiores a -0,7 V.

No se formó un esquema de reducción de Vitamina E estable y puro (A., 1994), sin embargo se

obtuvo mediante la electrólisis a un potencial constante de -0,5 V. No había ningún potencial de

reducción en valores superiores de -0,6 V.

Para los análisis de cronoamperometría para la cuantificación de vitamina C en la muestra de

tomate y vitamina E en ahuyama, se aplicó un pulso de corriente al sistema con lo cual se analizó

46

el coeficiente de difusión empleando la ecuación de Cottrell para electrodos cilíndricos. En las

figuras 15 y 16 se aprecia el cronoamperograma experimental.

Figura 15. Cronoamperograma de Vitamina C en H2SO4 0,01 M.

Figura 16. Cronoamperograma de Vitamina E en H2SO4 0,01 M.



47

Al realizar la gráfica de |A| vs t^(-1/2), tal como se observa en la figura 17, se calculó el

Coeficiente de difusión D, utilizando la expresión (2):

Ecuación 2. Coeficiente de Difusión

Figura 17. Grafica de linealidad de |A| vs t^(-1/2) para calcular D en el reactor.

Reemplazando los valores en la ecuación (2) se determinó D = 0,0139192 cm2/s evidenciando el

transporte de masa por movimiento atómico de los iones que se forman debido al pulso de

corriente (Edmund J., 2008) , permitiendo la migración de átomos de vitamina C y E sobre el

electrodo de Pb-Sn con relativa facilidad.

Para la vitamina E, en la Figura 18, se muestra la linealización de A vs t - ½

48

Figura 18. Grafica de linealidad de |A| vs t-1/2 para calcular D en el reactor para la

vitamina E.

Con un valor de D = 0,00254 cm2/s

8.3.2. Cuantificación de las vitaminas C y E para las muestras de tomate y ahuyama.

De acuerdo al perfil de concentración establecido para cuantificar la concentración molar tanto

de las dos vitaminas, mediante ésta técnica electroquímica, se establece una ecuación

característica, denominada Ecuación de Cottrell (WANG, 2001), la cual se expresa de la

siguiente forma:

Ecuación 3. Ecuación de Cottrel.

En donde:

El control por difusión conduce a una dependencia del tiempo t ½

.

I= Amperios , A=Cm2

C = moles/cc D0=cm

2

/s t = s

La intensidad es inversamente proporcional a la raíz cuadrada del tiempo.



49

A partir de la pendiente se puede determinar el área A, D0 o Representando Ixt

1/2

vs t se puede

determinar D0 a partir de la ordenada en el origen ya que es una constante igual a nFA D

0/π

½

si

se conoce el área del electrodo. De manera alternativa puede medirse el área electroquímica del

electrodo A si se conoce D0 y

De acuerdo a lo anterior se tiene para las dos vitaminas los siguientes datos expresados en la

tabla 6.

Tabla 6. Parámetros para el cálculo de vitamina C y vitamina E.

VITAMINA i

(mA)

n F

(Col/

mol)

A

(Cm2)

D

(Cm2/s)

t

(s)

C

calculada

(Mol/L)

Masa

(g)

C 1.5x10-

5

2 96500 0.1 0.0139 0.694 2.86x10- 4

0.00225

E 5.2x10-

5

2 96500 0.1 0.0025

4

0.694 1.56x10- 3

0.036

Los valores obtenidos para la vitamina C se encuentran dentro de los rangos reportados por otros

autores (A.M. Pisoschi, 2008), observándose que la concentración de Tocoferol (Vitamina E)

presente en esta especie de semillas de ahuyama es mayor a la de la vitamina C de la pulpa del

tomate, lo cual es un indicio de que la capacidad antioxidante de la vitamina E, es mayor. Sin

embargo, debido a que no se cuenta con reportes científicos, es necesario recurrir a otro tipo de

pruebas.

50

8.4. CONCLUSIONES

La electrodeposición de vitamina C y E sobre un electrodo de Pb-Sn, estudiada por los métodos

de voltametría cíclica y cronoamperometría demuestra que la electrodeposición de las especies

eléctricamente activas procede a través de una nucleación instantánea y un mecanismo de

crecimiento progresivo, este proceso describe la deposición catódica de las dos vitaminas sobre

la superficie del electrodo de plomo-estaño.

La medición de voltametría cíclica con el electrodo de plomo-estaño sumergido en la solución

electrolítica de 0,1 M de H2SO4 muestra que a velocidades de escaneo menores se facilitan las

reacciones químicas generando el proceso de oxidación, disminuyendo la eficiencia del proceso,

en especial para la vitamina E. El valor de α revela el equilibrio de oxidación química y

reducción electroquímica.

El proceso de reducción ocurrido para ambas muestras de tomate y ahuyama corroboran la

actividad antioxidante de dichas verduras, esto se puede demostrar con los valores del coeficiente

de difusión, ya que este valor es inversamente proporcional a la actividad antioxidante; es decir a

valores más pequeños del coeficiente de difusión mayor va a ser la actividad antioxidante, por lo

tanto se pudo apreciar una mayor de esta actividad para la vitamina E con un coeficiente de

difusíon D=0,00254cm2/s, a su vez se pudo observar también en el cálculo de la masa obtenida

ya que este valor es directamente proporcional a la actividad antioxidante; es decir entre mayor

sea la masa obtenida mayor es su actividad antioxidante, por lo cual se obtuvo un valor mayor de

masa para las semillas de ahuyama M=0,036g, lo que ratifica que este subproducto de la

ahuyama es el que tiene mayor actividad antioxidante atribuida a la alta concentración de α-

tocoferol en las semillas de la misma.

8.5. LIMITACIONES

Las principales limitaciones para la formulación de este capítulo fueron la inestabilidad de las

muestras de tomate debido a la alta sensibilidad del acido ascórbico y a su facilidad para oxidarse



51

por lo que se tuvo que tener muchas precauciones y preparar varias veces la muestra hasta que se

obtuvieran unos valores estables. Otra limitación son los cuidados que se deben tener con el

equipo en el que se realizaron los ensayos de voltametría cíclica ya que es muy sensible al ruido

y tendía a sobrecargarse lo que llevó algún tiempo realizar las mediciones.

8.6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

A., S. G. (1994). Introduction to Surface chemestry and catalysis. Wiley , 667.

A.M. Pisoschi, A. D. (2008). Ascorbic acid determination in commercial fruit juice

samples by cyclic voltammetry. J. Autom. Methods. Manag. Chem , 7-8.

Bard A.J., F. L. (2001). Electrochemical methods: Fundamentals and Aplications. Wiley ,

864.

Edmund J., D. F. (2008). Chronoamperometry and Cyclic voltammetry at Conical

Electrodes, Microelectrodes and Electrode Arrays. J. Phys. Chem , 4059-4066.

Horton, H. M. (1996). Principles of Biochemestry. New Jersey: Prentice-Hall.

P.F.Hsu, W. C. (2008). Study poliviologen and the aplication of poliviologen modified

glassy carbon electrode an amperometric detection of vitamin C. J Appl Electrochem , 38.

WANG, J. (2001). Analytical Electrochemestry. New York: Wiley-VCH.

52

9. CAPÍTULO 3.

COMPARACIÓN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EN EL

TOMATE CHONTO Y LA AHUYAMA POR LOS MÉTODOS ABTS, DPPH Y

VOLTAMPEROMETRÍA CÍCLICA

QUANTITATIVE COMPARISON OF ANTIOXIDANT ACTIVITY IN TOMATE

CHONTO AND PUMPKIN BY ABTS, DPPH METHODS AND CYCLIC

VOLTAMMETRY


2

Grupo Químico de Investigación y Desarrollo Ambiental (QIDEA), Programa de


Quindío, Armenia – Quindío.

RESUMEN

Se prepararon varios extractos de ahuyama y tomate para determinar su actividad

antioxidante. Para esto se tomaron tres muestras sólidas de pulpa de tomate y semillas de

ahuyama se diluyeron en metanol y a los extractos se les realizaron las pruebas de Folling

Cicoalteu para la determinación de fenoles totales, el contenido total de polifenoles fue

estimado como equivalentes de ácido gálico. Posteriormente, se obtuvieron los extractos

etanólicos de las mismas muestras para realizar las pruebas de ABTS y los extractos



53

metanólicos para las pruebas de DPPH, obteniéndose una mayor actividad antioxidante en las

semillas de ahuyama expresada como vitamina E. Estos análisis permitieron la comparación

de los dos métodos con la voltametría cíclica abordada en el capítulo anterior.

Palabras claves: Tomate, Ahuyama, ABTS, DPPH, Voltametría cíclica.

ABSTRACT

Several pumpkin and tomato extracts were prepared to determine its antioxidant activity. To

this three solid samples of tomato pulp and seeds of pumpkin were diluted in methanol and

the extracts were performed tests folling cicoalteu for determination of total polyphenols,

total polyphenols content was calculated as gallic acid equivalents were taken. Subsequently

the ethanol extracts of these samples were obtained for testing of ABTS and the methanol

extracts for testing DPPH to obtain a higher antioxidant activity in pumpkin seeds expressed

as vitamin E. This analyzes enabled comparison of the two methods with cyclic voltammetry

addressed in the previous chapter.

Keywords: Tomato, Ahuyama, ABTS, DPPH, cyclic voltammetry.

9.1. INTRODUCCIÓN

Los antioxidantes fueron comunes en la industria química y de alimentos durante los siglos

XIX y XX. En la industria química se habían estudiado los antioxidantes, un grupo de

compuestos caracterizados por su capacidad de oxidarse en lugar de otras sustancias

54

presentes en el medio de reacción. Su uso vario, pasando de aditivos en la vulcanización del

caucho hasta conservantes de alimentos. Sin embargo, fue solo hasta los años 60 cuando algunos

estudios revelaron la importancia de los antioxidantes en la salud, con publicaciones acerca del

efecto de los flavonoides, el acido ascórbico y el estrés oxidativo en el cáncer (Cameron. E.,

1978). La expansión en la investigación de los antioxidantes se vería en las décadas

subsiguientes, en donde varios investigadores se dedicaron a estudiar el efecto protector de los

antioxidantes en diferentes patologías, intentando entender sus mecanismos y blancos

moleculares (Willett. W., 1984). En cuanto los hallazgos se difundían, el mercado crecía. Para

los años 90 el uso de los antioxidantes se había popularizado en los Estados Unidos de América,

de tal manera que la mitad de la población consumía suplementos dietarios, un tercio tomaba

multivitamínicos y alrededor de una octava parte de la población consumía periódicamente

suplementos de vitaminas E y C (Radimer.K, 2004).

La suplementación con antioxidantes está fundamentada en estudios epidemiológicos y clínicos

que demuestran la estrecha relación entre factores como: dieta, estilo de vida, exposición a

radiación, metales, pesticidas, tóxicos, y algunos medicamentos; con la aparición y desarrollo de

enfermedades como cáncer, diabetes, aterosclerosis, desordenes neurodegenerativos y

envejecimiento. Todas estas condiciones patológicas están asociadas a un estado conocido como

“estrés oxidativo”, es decir, un aumento en las especies oxidantes (principalmente Especies

Reactivas del Oxigeno–EROs) y/o una disminución en los mecanismos de detoxificacion de

ellas.

Las ERO, según su propio nombre, presentan una reactividad más alta que el oxigeno molecular.

Algunas de ellas pueden ser radicales libres, es decir, moléculas o fragmentos moleculares que

contienen uno o más electrones desapareados en orbitales atómicos o moleculares. Este electrón



55

desapareado confiere un grado considerable de reactividad al radical libre logrando además que

pueda existir de forma independiente por cortos periodos de tiempo (M., 2007).

Antioxidantes no enzimáticos:

Vitamina E

Este es el nombre genérico de una familia homogénea de compuestos que tienen en su estructura

una porción hidroquinona metilada en mayor o menor grado y una cadena isoprenoide. El α-

tocoferol, el componente mas abundante de la vitamina E, es bien conocido y representa la

mayor posibilidad de prevención de la peroxidación de membrana por estabilización de radicales

peróxilo. La vitamina E tiene un grupo hidroxilo fenólico responsable de su actividad

estabilizadora de radicales libres y una cadena (C16H33) que favorece su inserción en la región

lipídica de la bicapa. En sistemas biológicos, una molécula de vitamina E permite proteger

10.000 moléculas de ácidos grasos insaturados (Traber. M., 2007). Como se muestra en la

figura 19A, la vitamina E puede reaccionar con radicales lipídicos peróxilo, para formar

vitamina E radical que es poco reactiva como para reaccionar con ácidos grasos poliinsaturados,

actuando en la reacción de peroxidación lipídica como terminador de cadena. La vitamina E

radical producida es estable porque el electrón desapareado del átomo de oxigeno puede ser

deslocalizado dentro de la estructura del anillo aromático.

Vitamina C (Ácido ascórbico)

La vitamina C es un antioxidante que actúa en medios acuosos, como el líquido pleural, el fluido

ocular y el espacio intersticial. Actúa en combinación con otros antioxidantes primarios como la

vitamina E y los carotenoides, así como en conjunto con las enzimas antioxidantes. La vitamina

C coopera con la Vitamina E regenerando el α-tocoferol desde el radical α-tocoferil o en

membranas y lipoproteínas. La mayoría de plantas y animales sintetizan acido ascórbico a partir

56

de la glucosa; sin embargo, los humanos son incapaces de sintetizarlo y requieren obtenerlo de la

dieta.

El acido ascórbico es requerido como un cofactor para la actividad enzimática, y su deficiencia

dietética causa una enfermedad conocida como escorbuto.

Como se aprecia en la figura 19 B, la donación de un electrón por el acido ascórbico produce el

radical semidihidroascorbil, que puede ser nuevamente oxidado para dar dihidroascorbato. El

acido ascórbico es el único antioxidante endógeno en plasma que puede proteger contra el daño

peroxidativo inducido por radicales peroxilo (Griffiths, 2001).

Figura 19. Procesos de oxidación para la vitamina E y la vitamina C.

Métodos para medir actividad antioxidante

Por definición, la actividad antioxidante es la capacidad de una sustancia para inhibir la

degradación oxidativa (por ejemplo, la peroxidación lipídica). En las fuentes dietarias, la

presencia de antioxidantes depende, entre otros factores, de la parte del alimento en cuestión. Por

ejemplo, los monofenoles (tocoferoles principalmente) tienden a ser más abundantes en semillas



57

donde hay grandes cantidades de grasas; por su parte los monoterpenos aromáticos son los

principales componentes de las fracciones volátiles, mientras que los polifenoles, con mayor

polaridad, están presentes en frutas y constituyen una de las principales fuentes de antioxidantes

dietarios.

Método ABTS (azinobis 3-etilbenzotiazolina-6-acido sulfónico)

Este metodo fue reportado inicialmente por Miller y colaboradores, y se fundamenta en la

capacidad de un antioxidante para estabilizar el radical catión coloreado ABTS•+, el cual es

formado previamente por la oxidación del ABTS (2,2´-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6- acido

sulfonico)) (Figura20) por metamioglobina y peroxido de hidrogeno. Los resultados son

expresados como equivalentes de Trolox o TEAC (por su nombre en ingles, Trolox Equivalent

Antioxidant Capacity).

Figura 20. Estructura del ABTS

Método DPPH (Difenil Picril Hidrazilo)

Este ensayo fue propuesto originalmente por Brand–Williams. El DPPH• (figura 21) es uno de

los pocos radicales orgánicos estable, presenta una fuerte coloración violeta, es comercialmente

disponible y no tiene que ser generado in situ como el ABTS•+. El ensayo se fundamenta en la

58

medición de la capacidad de un antioxidante para estabilizar el radical DPPH•, esta medición

puede hacerse espectrofotométricamente siguiendo el decaimiento de la absorbancia a 517 nm.

La reacción de estabilización se considera que transcurre principalmente mediante un mecanismo

TE (transferencia de electrones), con un aporte marginal de TAH (transferencia de átomos de

hidrógeno) (Brand-Williams. W., 1995).

Figura 21. Estructura del DPPH.

Los resultados se suelen expresar como EC50, es decir, la concentración de antioxidante

necesaria para estabilizar un 50% del DPPH•. Sin embargo, han surgido otros parámetros como

la eficiencia anti-radicalaria (EA) basada en la cinética de la reacción y que involucran, además

de la concentración de antioxidante, el tiempo necesario para ejercer su efecto.

Otros métodos para determinar actividad antioxidante

Voltamperometría cíclica



59

La voltamperometría cíclica es un procedimiento reportado recientemente como una herramienta

promisoria para evaluar la actividad antioxidante (Firuzi.O., 2005).

En este método, la muestra es introducida en una celda con un sistema de tres electrodos:

electrodo de trabajo (por ejemplo carbono vítreo), electrodo de referencia de plata/cloruro de

plata (Ag/AgCl) y electrodo auxiliar (platino).

El potencial es aplicado bidireccionalmente al electrodo de trabajo a una velocidad constante

(100 mV/s, generalmente), detectando el flujo de corriente (voltamperograma cíclico). El poder

reductor de una muestra está compuesto por dos parámetros: el pico de potencial (Ep) y la

corriente anódica (CA). El Ep se mide como el potencial en la mitad de la corriente de cada onda

anódica y cuando es calculado de esta forma se expresa como (E1/2). En general un bajo valor de

E1/2 significa una mayor capacidad de la sustancia para donar electrones al electrodo de trabajo.

Por su parte, la CA correlaciona con la concentración de la sustancia que está siendo evaluada;

adicionalmente, la reversibilidad del proceso de oxido-reducción se puede determinar por la

aparición de picos anódicos y catódicos, y es un buen antioxidante aquel que presenta procesos

anódicos irreversibles (Kilmartin. P., 2000). Los estudios de voltamperometría cíclica aplicados

a mezclas complejas no permiten la determinación de antioxidantes individuales pero dan

información valiosa acerca de la cantidad de grupos funcionales responsables de los picos en el

voltamograma (M, 2006).

Método de Foling-Ciocalteau

La determinación del contenido total de compuestos fenolicos, utilizando el método

originalmente propuesto por Folin en 1927 y modificado por Singleton y Rossi (Singleton,

1965), no es considerada en sí misma una metodología para medir actividad antioxidante, a

pesar de que su principio se basa en la capacidad redox de los polifenoles. Sin embargo, la

60

alta correlación de los resultados con otros métodos como CARO y DPPH ha hecho que este

método se popularice como una herramienta simple y rápida para predecir actividad

antioxidante, principalmente en matrices complejas, donde la cantidad de compuestos

fenólicos mas que la composición especifica de estas sustancias determinan la actividad

antioxidante.

El método se fundamenta en la oxidación de los compuestos fenólicos presentes en una

muestra, por la acción del polianión molibdotungstofosforico para generar un producto

coloreado con un máximo de absorción a 765 nm.

Una de las modificaciones al método propuesta por Singleton implica el uso de ácido gálico

como compuesto fenólico de referencia, de tal manera que los resultados se expresan en

equivalentes de ácido gálico (EGA). Sin embargo, múltiples trabajos han utilizado igual

variedad de estándares, entre los que se cuentan: catequina, acido tánico, acido clorogénico,

ácido cafeico, ácido protocatecuico y ácido ferúlico, lo cual imposibilita la comparación

entre muestras, además de las variaciones que implica la no estandarización del método en

cuanto a condiciones críticas como proporciones de reactivos, temperatura y tiempo de

lectura (Prior, 2007).

Pese a esto, actualmente el método de Folin-Ciocalteau es ampliamente utilizado,

principalmente en complemento con otros métodos para medición de actividad antioxidante,

puesto que ya se conoce el valor de EGA para una amplia cantidad de frutas, vegetales,

bebidas76; por lo tanto, es posible la comparación de una muestra con estos datos, siempre y

cuando se sigan los procedimientos reportados.

En este capítulo se compararan métodos comunes como el DPPH, ABTS y folin-ciocalteau,

con el método de voltamperometría cíclica y de esta manera determinar cuál es el mejor



61

método para determinar la actividad antioxidante en la ahuyama y el tomate chonto dos

frutos típicos del Quindío.

9.2 METODOLOGÍA

Se determinó la capacidad antioxidante de la ahuyama y el tomate por los métodos de folin-

ciocalteu, DPPH y ABTS los cuales serán comparados con los análisis de Voltametría cíclica

obtenidos en el capitulo anterior esto se realizará por medio de un análisis estadístico ANOVA y

un análisis multivariado que nos permitirá decidir cuál es el mejor y más económico método para

determinar la capacidad antioxidante de estos dos frutos.

A continuación se describen las metodologías utilizadas para la determinación cuantitativa de la

capacidad antioxidante presentes en la pulpa del tomate y la pulpa y semillas de la ahuyama por

medio de las técnicas de folin, DPPH y ABTS.

9.2.1 Cuantificación del contenido polifenoles con el índice de Folin-Ciocalteu en los

extractos metanólicos del tomate y la ahuyama.

El contenido total de polifenoles fué estimado como equivalentes de ácido gálico (GAE). A

saber, se tomaron las soluciones de los extractos y los estándares fueron mantenidos a 20ºC en

un rango de ± 2ºC, una alícuota de 1mL de cada una de las soluciones fueron transferidas a

diferentes tubos de ensayo que contenían 6mL de agua destilada. Luego, se adicionaron 500μL

del reactivo Folin-Ciocalteu a cada tubo de ensayo. Después de cinco minutos, se añadieron

62

1,5mL de la solución de carbonato de sodio al 20 %. Luego de 45 minutos de reacción a

temperatura ambiente y alejada de la radiación solar pudimos observar la formación de la

coloración a través de la lectura de un blanco preparado al mismo tiempo (figura 23). Se aforó

los estándares y la muestra a 10mL. Los resultados obtenidos se reportaron como mg A.G (ácido

gálico)/100g de muestra.

Figura 22. Muestras de ahuyama y tomate con el reactivo de folling ciocalteu.

9.2.2 Toma de muestras y del blanco en el espectrofotómetro de UV-VIS.

Se utilizó un espectrofotómetro ultravioleta-visible (UV-VIS) con arreglo de diodos Hewllet

Packard modelo HP-8453, el cual se programó el software en la opción de cuantificación, donde

se determinó el barrido entre una frecuencia de 400-1100nm, fijando la banda de análisis a los

750nm. Se acomodaron las unidades de respuesta en orden de concentración de mg/L (ppm) para

compararlo con una curva de calibración o recta estándar realizada con un blanco de ácido gálico

(A.G).



63

9.2.3 Construcción de la recta estándar usando ácido gálico (A.G)

Una recta estándar a partir de diluciones de ácido gálico con concentración conocida, fue usada

para cuantificar el contenido de polifenoles disponibles en los extractos metanólicos, ya que

poseía un porcentaje de pureza reconocible y un esqueleto molecular similar a las estructuras de

interés, así la solución stock se preparó disolviendo 50mg de ácido gálico en un matraz aforado

de 100mL y se procedió a aforar el balón con agua destilada, esta mezcla se almacenó hasta por

dos semanas en el refrigerador a 4°C. La construcción de la curva de calibración se realizó

disolviendo la solución de ácido gálico desde 500mg/L hasta 0, 1, 2, 3, 4, 5mg/L (relación

V1*C1=V2*C2) de polifenol conocido. El equipo de UV-VIS identificó éste blanco y

posteriormente se pudieron cuantificar los analitos, los valores hallados del contenido total de

polifenoles (mg A.G/100g de muestra) se reportaron como equivalentes de ácido gálico (GAE)

reconocidas como “sustancias reductoras del reactivo de Folin-fenol”.

9.2.4 Determinación de la actividad antioxidante por medio del catión radical del ácido

2,2’azinobis-(3- etilbenzotiazolina)-6-sulfónico (ABTS•+)

9.2.4.1 Generación de radical catión ABTS•+

Se pesó 77.6 mg del reactivo ABTS y se adicionó 20 mL de agua destilada para obtener una

concentración de 7 mM en solución acuosa. Posteriormente se pesó 13.2 mg de persulfato de

potasio (2.45 mM) y se hizo reaccionar en un frasco ámbar con la solución de ABTS•+, dichas

soluciones se homogenizaron y se cubrió con papel aluminio. La solución se dejó incubar

64

durante 16 horas a temperatura ambiente; por último se diluyó la solución de ABTS•+ en etanol

absoluto hasta obtener una absorbancia inicial de 0.7 ± (0.02) a 732 nm.

9.2.5. Determinación de la actividad antioxidante por el método del (1,1-Difenil-2-

picrilhidrazilo) DPPH●.

9.2.5.1. Preparación de la solución de DPPH●

Para cada ensayo se preparó en un matraz completamente cubierto en papel aluminio la solución

del radical libre 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo (DPPH•) a 20 mg/L en metanol grado analítico. El

volumen a preparar dependía de la cantidad de muestras a evaluar y subsiguientemente se

transfirió a un frasco ámbar cubierto con papel aluminio para evitar su rápida degradación.

Para la preparación de la solución del DPPH, se pesó 1,4 mg del DPPH, luego se le adicionó

70ml de metanol, posteriormente se ajustó en el espectrofotómetro a una longitud de onda de

529nm hasta obtener una absorbancia de ± 1,000.

9.2.6. Preparación de las muestras de tomate y ahuyama.

La determinación de la actividad antioxidante de los diferentes extractos vegetales se llevó a

cabo de acuerdo con el método propuesto por (Brand-Williams B., 1997), con ligeras

modificaciones como se describe a continuación. Cada ensayo se realizó 3 veces y su vez cada

muestra por triplicado (Murillo, 2004).

Se pesaron 5g de semillas de ahuyama y pulpa de tomate, se maceraron y fueron aforados a 25

ml con etanol absoluto, luego cada una de las muestras fueron llevadas a un agitador recíproco

durante una hora, se extrajo el sobrenadante y se llevaron a una centrífuga a 1500rpm durante 20



65

minutos, se recogió el sobrenadante y se aforó nuevamente a 25 ml con etanol, estos fueron

unidos con el precipitado y el mismo procedimiento se llevó a cabo 3 veces más.

Cuando ya se tenían los extractos de tomate y ahuyama se procedió a determinar su capacidad

antioxidante para lo cual se tomaron 50 µl de los extractos y se les agregaron 1450µl de ABTS y

fueron llevados al espectrofotómetro a una longitud de onda de 732nm. Para los ensayos de

DPPH, se tomaron 0,5 ml de los extractos y se le adicionaron 2ml de la solución de DPPH y

fueron llevados al espectrofotómetro a una longitud de onda de 529nm.

A partir de las absorbancias obtenidas se determinó el porcentaje de actividad antioxidante con la

ecuación que se presenta a continuación:

% Actividad Antioxidante= Abs.I – Abs.M

Abs.I

Donde Abs.I, son las absorbancias iniciales para los reactivos ABTS y DPPH y Abs.M son las

absorbancias obtenidas para cada una de las muestras de tomate y ahuyama.


9.3.1. Determinación de fenoles totales

La determinación de los fenoles totales presentes en los extractos de semillas de ahuyama y

pulpa de tomate se efectuó por el método de Folin-Ciocalteau (Magalhaes L.M., 2010), Se

realizó la curva de calibración del ácido gálico, con un coeficiente de correlación de 0,9956

66

(figura ); la cual permitió determinar el contenido de fenoles totales para los extractos de dichas

verduras.

Figura 23. Curva de calibración del ácido gálico

En la tabla 7 se presenta el contenido de fenoles totales (CFT) en equivalentes de acido gálico

(EAG) (mg de ácido gálico/g de muestra) para cada una de las muestras de ahuyama y tomate

obtenidas.

Tabla 7. Contenido de fenoles totales en tomate y ahuyama.

NOMBRE DE LA VERDURA CFT (mg de ácido gálico/100g de la muestra)

Tomate 1 5,086

Tomate 2 5,031

Tomate 3 5,103

Ahuyama 1 5,548

Ahuyama 2 5,623

Ahuyama 3 5,176



67

El contenido de fenoles totales para cada una de las muestras de pulpa de tomate y semillas de

ahuyama no varía mucho entre sí. Se puede observar que las muestras que presentaron el mayor

contenido de fenoles totales expresado en equivalentes de ácido gálico (EAG) fueron las de

ahuyama con valores entre 5,176 y 5,623 mg de ácido gálico/100g de la muestra.

Muchos reportes han mostrado una cercana relación entre el contenido de fenoles y la actividad

antioxidante de las plantas. La correlación de los datos obtenidos fueron una gran fuente de

información para predecir la actividad antioxidante en las verduras, sin embargo, no se puede

considerar que la actividad antioxidante se deba solo a la presencia de compuestos fenólicos,

puesto que en su composición química pueden existen otros metabolitos secundarios que debido

a su estructura contribuyan a su eficacia antioxidante (Amzad M., 2011).

9.3.2. Determinación de la actividad antioxidante por el método ABTS●+

El ensayo ABTS●+ se basa en la transferencia de electrones; por lo cual los diferentes compuestos

antioxidantes presentes en los extractos, donan uno o dos electrones para reducir el radical catión

(figura 24), dando una medida precisa de la capacidad antioxidante total en el punto final de

reacción (Wooton-Beard P.c., 2011). La formación del radical catión ABTS●+ fue inducida

mediante la adición del persulfato de potasio; se incubó durante 16 horas y se almacenó en la

oscuridad, puesto que este es muy sensible a la luz y se degrada rápidamente.

Para este ensayo se midió el porcentaje de actividad antioxidante de cada extracto frente al

ABTS●+ radical catión. En la tabla 8 se presenta el porcentaje de actividad antioxidante por el

método de ABTS●+ para los extractos de semillas de ahuyama y pulpa de tomate.

68

Tabla 8. Porcentaje de actividad antioxidante por el método de ABTS.

Tomate ABTS

% Actividad Antioxidante

Promedio %

AA

Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3

23,42 28,42 30,14 24,75

24,57 28,57 31,42 28,56

26,28 28,71 31,57 31,04

Ahuyama ABTS

36,28 40,57 41,85 36,90

37,14 41,00 42,00 41,00

37,28 41,44 42,28 42,04

Los extractos de pulpa de tomate y semillas de ahuyama evaluados mostraron un

comportamiento muy similar entre los valores obtenidos de la actividad antioxidante de estas

dos verduras, el valor promedio del porcentaje de actividad antioxidante más alto se le atribuye

a las semillas de ahuyama con un valor de 42,04%. Uno de los ensayos de tomate fue el que

presentó el valor promedio más bajo de actividad antioxidante de 24,75%.

9.3.3. Determinación de la actividad antioxidante (AA) por el método del DPPH

Para determinar la actividad antioxidante por el ensayo DPPH●, el rango de longitudes de onda

varía entre los 515 y 540 nm (Murillo, 2004); para este trabajo se midió a 529 nm donde

presenta su máxima absorción. La solución de DPPH● se preparaba minutos antes de realizar el

ensayo, debido a que tiende a degradarse rápidamente por efectos de la luz y la temperatura.



69

En la tabla 9 se muestran los porcentajes de actividad antioxidante obtenidos para cada uno de

los extractos de pulpa de tomate y semillas de ahuyama evaluados.

Tabla 9. Porcentaje de Actividad Antioxidante por el método de DPPH.

Tomate DPPH

% Actividad Antioxidante

Promedio %

AA

Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3

80,32 81,85 82,45 84,48

80,4 82,02 82,7 82,02

80,74 82,19 82,87 82,67

Ahuyama DPPH

97,87 98,29 98,46 98,04

98,04 98,38 98,55 98,37

98,21 98,46 98,63 98,54

Los extractos de metanol de las verduras evaluadas que presentaron los porcentajes más altos de

actividad antioxidante como se muestra en la tabla 8 fueron atribuidas a las semillas de ahuyama

con un valor promedio de 98,54%.

En el diseño experimental que se presenta a continuación se puede observar que los extractos de

metanol fueron más efectivos frente al radical DPPH● comparados con los extractos de etanol

para ABTS , por sus porcentajes de actividad antioxidante significativamente altos para los

extractos metanólicos podemos observar que en todas las pruebas evaluadas para hallar

capacidad antioxidante las semillas de ahuyama presentan una mayor actividad que la pulpa de

tomate, esto puede se puede atribuir a la alta concentración de α-tocoferol (vitamina E) que se

encuentra concentrado en las semillas de la ahuyama y también a otros metabolitos tales como:

70

xantonas, flavonoides, lactonas y ácidos orgánicos que pueden contribuir a denotar la alta

actividad antioxidante de las semillas de esta verdura.

9.4. ANÁLISIS EXPERIMENTAL

Los resultados obtenidos para cada una de las muestras de semillas de ahuyama y pulpa de

tomate se sometieron a un análisis estadístico con el fin de establecer si había una diferencia

significativa en cuanto a la actividad antioxidante obtenida por los métodos de ABTS y DPPH.

La comparación se hizo mediante la técnica ANOVA por medio del programa estadístico STAT

GRAPHICS.

9.4.1. Análisis univariable – ANOVA este análisis se realizó para tres ensayos de semilla de

ahuyama y tres ensayos de semilla de pulpa que a su vez cada una de ellas se hizo por triplicado.

Se planteó la hipótesis nula y la hipótesis alterna que se muestran a continuación con un nivel de

significancia de α=0,05

Ho: μ0 = μK (la capacidad antioxidante para todas las muestras de tomate y ahuyama es igual)

Hi: μ0 ≠ μi (al menos una de los valores de la capacidad antioxidante para las muestras de

tomate y ahuyama es diferente)



71

ABTS DPPH

Means and 95,0 Percent Tukey HSD Interv als

Método

27

37

47

57

67

77

87A

cti

vid

ad

an

tio

xid

an

te T

om

ate

ABTS DPPH

Means and 95,0 Percent Tukey HSD Interv als

Método

39

59

79

99

119

Acti

vid

ad

an

tio

xid

an

te A

hu

ya

ma

Figura 24. Análisis de Tukey para el tomate

Figura 25. Análisis de Tukey para la ahuyama.

72

En el análisis estadístico se obtuvo que tanto para el tomate como para la ahuyama hay una

diferencia altamente significativa entre métodos con un valor p=0,000, donde el método de

DPPH es representativamente superior al método de ABTS, esto puede deberse a que el patrón

para estos análisis es trolox un derivado de la vitamina E, por lo tanto es más específico y

abundante en las semillas de ahuyama ya que presentan una gran concentración de vitmina E.

9.5. CONCLUSIONES

Las pruebas de Folin-Cicoalteu evaluadas para las semillas de ahuyama y la pulpa de tomate

evidenciaron que estos extractos podían presentar actividad antioxidante debido a la cantidad de

polifenoles obtenida, observándose un mayor contenido de estos metabolitos en las semillas de

ahuyama con un valor de contenido de polifenoles totales de CFT= 5,623 mg de ácido

gálico/100g de muestra.

En el caso de los ensayos de ABTS y DPPH para hallar la actividad antioxidante de las dos

verduras, se pudo observar que ambas pruebas denotan una alta actividad antioxidante, siendo

más preponderante en el análisis del reactivo DPPH. De esta manera se obtuvo una mayor

actividad antioxidante para las semillas de ahuyama con valores de porcentaje de actividad

antioxidante para ABTS de %AA= 42,04% y porcentaje de actividad antioxidante de DPPH

igual a %AA= 98,54%.

Al momento de realizar la comparación de las pruebas de ABTS y DPPH frente a voltametría

cíclica se puede evidenciar claramente que con ambos tipos de análisis se puede determinar la



73

actividad antioxidante, sin embargo el método de voltametría cíclica resulta ser más económico,

rápido, sensible y utiliza menor cantidad de muestra que con los análisis de DPPH y ABTS.

9.6. LIMITACIONES

La principal limitación de este capítulo fue la obtención de los reactivos de DPPH y ABTS, ya

que su comercialización resulta ser muy costosa y la adquisición de dichos compuestos que eran

vitales para la ejecución de este proyecto demoró mucho tiempo retrasando la obtención de

resultados.

9.7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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76

10. CONCLUSIONES GENERALES

Las caracterizaciones fisicoquímicas para las muestras de tomate chonto en sus estados de

pos-cosecha, reflejaron que esta especie posee un grado alto de madurez con una textura

jugosa, presentando una alta actividad de agua, factor que resulta determinante para la

calidad de la verdura. Además los grados Brix permitieron medir los sólidos solubles

disueltos en la pulpa de tomate; a su vez el grado de acidez, demostró tener un porcentaje

de ácidos entre ellos el ácido ascórbico que posteriormente se cuantificó con el método de

espectrofotometría UV-visible, obteniéndose una concentración de vitamina C entre

0.0010 y 0.0015 molar.

La determinación de la capacidad antioxidante presentes en las semillas de ahuyama y la

pulpa del tomate chonto por voltametría cíclica, arrojó como resultado que en ambas

verduras se da un proceso de óxido-reducción. Al momento de cuantificar las vitaminas

C y E presentes en estas dos verduras, se obtiene una mayor concentración de vitamina E

en las semillas de ahuyama, lo que comprueba que éste subproducto posee una mayor

capacidad antioxidante con respecto al tomate.

La presente tesis permitió comparar el mejor método para determinar la capacidad

antioxidante del tomate chonto y las semillas de ahuyama en los estados de madurez

óptimos, arrojando como resultado que el método de voltametría cíclica es superior en

términos de eficiencia ya que es más económico, rápido, sensible y requiere menor gasto

de muestra que los otros métodos analizados.



77

11. RECOMENDACIONES

Se recomienda continuar con los estudios de investigación de la vitamina E por el método de

voltametría cíclica en otras verduras, teniendo en cuenta el escaso número de estudios reportados

para esta vitamina.

Se sugiere a los consumidores de vitamina E, incluirla en su dieta a través del la ingesta de

semillas de ahuyama, las cuales pueden prepararse como pasa bocas tal y como se ha venido

utilizando en algunos países europeos.

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