deteksi mutasi gen egfr menggunakan pna-lna pcr clamp pada

_________________________________________________________________________________________

Departemen Pulmonologi & Ilmu Kedokteran Respirasi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia 1 RS Persahabatan - Jakarta, 2012

DETEKSI MUTASI GEN EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR (EGFR)

MENGGUNAKAN METODE PNA-LNA PCR CLAMP

PADA CELL LINE PC9, PC3, H1975 DAN H1299

Ferry Dwi Kurniawan1, Toshihiro Nukiwa2, Koichi Hagiwara3 1Department of Pulmonology and Respiratory Medicine, Faculty of Medicine, University of Indonesia, Persahabatan

Hospital, Jakarta, Indonesia 2Department of Respiratory Oncology and Molecular Medicine, Tohoku University, Sendai, Japan 3Department of Respiratory Medicine, Saitama Medical School, Saitama, Japan

Background: Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) signaling pathway play a role in regulation of cell

proliferation, survival, differentiation and tumor progression. Tyrosin kinase domain within exon 18-21 of EGFR

gene mutation had significantly correlated with clinical response to Tyrosine Kinase Inhibitor (TKI). Thus, EGFR

gene mutation become a biomarker predictor to Non Small Cell Lung Cancer (NSCLC) treatment. However, the

gold standar in detecting EGFR gene mutation is direct sequencing method which requires mostly cancer cells, low

sensitivity and non uniform technical handling. This research aim is to observe PNA-LNA PCR Clamp method as

an alternative method to detect EGFR gene mutation on PC9, PC3, H1975, and H1299 cell lines.

Method: This research design is an experimental study using four cell lines which are PC9 (lung adenocarsinoma),

PC3 (prostate adenocarsinoma), H1975 (NSCLC), and H1299 (NSCLC). The samples are isolated to extract DNA then the consentration adjusted to 25 ng thus the final consentration is 1 ng/µl. The PCR primer within exon 18 to

21 along with Peptide Nucleic Acid (PNA) which designed to attach to wild type alleles and Locked Nucleic Acid

(LNA) designed to attach with mutant alleles and also exTaq enzyme are added to the samples. Then the samples are

running on SmartCycler real time PCR. The method could detect EGFR gene mutations which are G719S and

G719C in exon 18, seven types of exon 19 deletion, T790M in exon 20, also L858R and L861Q in exon 21.

Result: This method reveals the mutations which are E746-A750del-1p (type 1) in PC9, exon 19 deletion in PC3,

T790M and L858R in H1975 while no mutation in H1299.

Conclusion: The PNA-LNA PCR Clamp could detect EGFR gene mutation on PC9, PC3, H1975 and H1299 cell

lines.

Key word: epidermal growth factor receptor mutation; peptide nucleic acid; locked nucleic acid; polymerase chain

reaction

PENDAHULUAN

Walau telah banyak perkembangan

bermakna dalam terapi sistemik, radiasi onkologi

serta teknik pembedahan namun pasien kanker

masih belum sepenuhnya dapat diobati.1 Berdasarkan

laporan Direktorat Jenderal Pelayanan Medik tahun

2004, kanker paru menempati peringkat keenam

diantara sepuluh penyakit neoplasma ganas terbanyak

pasien rawat inap di rumah sakit di Indonesia dengan

jumlah penderita 2.757 orang atau dengan proporsi

3,2%. Angka ini meningkat menjadi 5,8% pada tahun

2005.2

Secara umum kanker paru terdiri dari

Kanker Paru Karsinoma Sel Kecil (KPKSK)

sebanyak 10% dan Kanker Paru Karsinoma Bukan

Sel Kecil (KPKBSK) sebanyak 90%.3 Jauh

sebelumnya, KPKBSK dianggap satu entitas penyakit

saja karena klasifikasi histologi sub tipe seperti

adenokarsinoma, skuamosa dan sel besar terlihat

mempunyai faktor etiologi yang sama, karakteristik

klinis yang sama serta hasil terapi yang juga sama.

Sehingga penatalaksanaan untuk pasien KPKBSK

juga sama. Namun ternyata KPKBSK merupakan

suatu entitas penyakit yang kompleks. Hal ini dapat

dilihat dari profil genetik yang ditemukan pada

KPKBSK. Salah satu yang berperan dalam

patogenesis ini adalah mutasi gen Epidermal Growth

Factor Receptor (EGFR).4

Gen EGFR berperan dalam patogenesis

adenokarsinoma paru yang berawal dari lesi pre

neoplastik yang disebut sebagai hiperplasia

adenomatosa atipikal yang kemudian berkembang

_________________________________________________________________________________________


menjadi bronchioloalveolar carcinoma (BAC).

Fokus invasi berkembang dari pusat fibrotik BAC

yang kemudian berubah menjadi adenokarsinoma

invasif walaupun elemen non invasif masih berada di

perbatasan tumor. Pada beberapa penelitian

ditemukan mutasi gen EGFR sudah terjadi pada awal

patogenesis dengan ditemukan mutasi ini pada epitel

saluran napas normal yang berdekatan dengan tumor.

Walaupun demikian, mutasi gen EGFR tetap lebih

banyak ditemukan di lesi pre neoplastik dan lesi pre

invasif dibandingkan dengan epitel normal.

Heterogenitas mutasi pada tumor sangat kecil sehigga

mutasi gen EGFR berkontribusi besar dalam

patogenesis tumor. Sementara itu amplifikasi gen

EGFR ternyata terjadi pada fase akhir karsinogenesis

dan lebih sering ditemukan pada saat metastasis yang

mencerminkan amplifikasi gen EGFR lebih berperan

pada fenotip metastasis. Sementara itu epiregulin

loop terjadi pada fase tumor invasif namun lebih

sering juga ditemukan pada saat metastasis. Sehingga

dapat disimpulkan mutasi gen EGFR telah berperan

sejak awal karsinogenesis.5

Dengan ditemukannya agen terapi target

yang bekerja menghambat jalur sinyal EGFR yaitu

Tyrosin Kinase Inhibitor (TKI) maka telah terjadi

pergeseran paradigma terapi. Sasaran terapi

konvensional tidak hanya sel kanker tetapi juga sel

normal sehingga dengan pemberian terapi target

maka hanya sel kanker saja yang akan menjadi

sasaran.6 Mutasi gen EGFR dengan domain tirosin

kinase pada ekson 18-21 berkorelasi secara bermakna

terhadap pemberian TKI.7,8 Sehingga mutasi gen

EGFR berperan sebagai faktor prediktif pemberian

TKI.9

Kendala dalam praktek sehari-hari adalah

sampel yang didapat untuk menegakkan diagnosis

kanker paru baik itu sediaan histopatologi berupa

biopsi bronkus ataupun sediaan sitologi berupa

sikatan bronkus, bilasan bronkus, ataupun efusi

pleura sangatlah sedikit. Terlebih lagi sediaan berupa

biopsi bronkus jugalah tidak mudah didapat namun

sediaan sitologi lebih sering didapatkan. Sebagai

dasar diagnosis, sediaan baik histopatologi ataupun

sitologi akan disimpan sebagai arsip sehingga sampel

yang tersisa untuk pemeriksaan mutasi gen pun

semakin sedikit.9

Standar baku emas pemeriksaan mutasi gen

EGFR adalah menggunakan metode direct

sequencing. Metode ini telah lama digunakan secara

luas serta mempunyai spesifisitas hingga 100%

namun sensitifitas metode ini hanya 30-50%. Metode

ini membutuhkan sampel dengan kandungan sel

kanker yang banyak dengan pengerjaan sekitar 3-5

hari dengan teknik bervariasi dan biaya yang

mahal.9,10

Salah satu metode alternatif pemeriksaan

mutasi gen EGFR adalah metode PNA-LNA PCR

Clamp yang menggunakan Peptide Nucleic Acid

(PNA) sebagai klem primer yang menghambat

amplifikasi alel wild type dan Locked Nucleic Acid

(LNA) sebagai probe deteksi alel mutan yang akan

diamplifikasi menggunakan mesin real time

Polymerase Chain Reaction (real time PCR). Klem

primer dan probe mutan terletak pada urutan basa

yang mengalami mutasi poin yang dilambangkan

dengan huruf (X). Probe total mendeteksi fragmen

alel mutan dan alel wild type yang terletak

bersebelahan. Sedangkan pada delesi, hanya sebagian

klem primer yang menutupi delesi. Urutan pada

kedua ujung delesi dihubungkan sehingga

membentuk urutan probe mutan. Posisi primer dan

posisi probe dalam sistem PNA-LNA PCR Clamp

ditampilkan dalam gambar 1 (a). Selanjutnya proses

amplifikasi menggunakan sistem nested PCR yang

_________________________________________________________________________________________


membutuhkan primer luar dan primer dalam. Ketika

terjadi proses amplifikasi, klem primer akan

berikatan dengan alel wild type sehingga tidak terjadi

amplifikasi alel wild type. Ketika proses deteksi

terjadi, probe mutan berikatan dengan alel mutan

dan terjadi proses amplifikasi kemudian sinyal yang

dipancarkan dari probe akan ditangkap oleh mesin

real time PCR. Mekanisme kerja sistem PNA-LNA

PCR Clamp ditampilkan dalam gambar 1 (b).11

Rumusan masalah :

Apakah metode PNA-LNA PCR Clamp

dapat mendeteksi mutasi gen EGFR pada cell line

PC9, PC3, H1975, dan H1299?

Hipotesis Penelitian :

Metode PNA-LNA PCR Clamp dapat

mendeteksi mutasi gen EGFR pada cell line PC9,

PC3, H1975, dan H1299.

Tujuan Penelitian :

Tujuan Umum :

Melihat metode PNA-LNA PCR Clamp sebagai

metode alternatif pemeriksaan mutasi gen EGFR

pada cell line PC9, PC3, H1975, dan H1299.

Tujuan Khusus :

Mempelajari cara kerja metode PNA-LNA

PCR Clamp.

Mengetahui keunggulan dan kekurangan

metode PNA-LNA PCR Clamp.

Gambar 1. Posisi primer dan probe (a) dan

mekanisme kerja (b) dalam metode PNA-LNA PCR

Clamp.

Dikutip dari (11)

METODOLOGI PENELITIAN

Desain penelitian yang digunakan adalah

studi eksperimental. Penelitian dilakukan di

Respiratory Medicine Department, Saitama Medical

School pada bulan Februari 2010. Populasi target

penelitian adalah cell line tumor. Populasi terjangkau

penelitian ini adalah cell line tumor paru dengan jenis

adenokarsinoma atau Kanker Paru Karsinoma Bukan

Sel Kecil (KPKBSK) dan tumor selain tumor paru

dengan jenis adenokarsinoma.

Sampel penelitian adalah cell line PC9

(adenokarcinoma), PC3 (kanker prostat jenis

adenokarsinoma), H1975 (KPKBSK), dan H1299

_________________________________________________________________________________________


(KPKBSK). Cell line PC9 diperoleh dari IBL

(Takasaki, Japan), PC3 diperoleh dari Japanese

Collection of Research Bioresources (Tokyo, Japan),

H1975 diperoleh dari the American Type Culture

Collection (Rockville, MD, USA), dan H1299

diperoleh dari Japanese Collection of Research

Bioresources (Tokyo, Japan). Cell line dibiakkan

dalam media RPMI-1640 yang mengandung 10%

fetal calf serum di dalam inkubator dengan suhu 370C

dengan kandungan CO2 sebesar 5% di atmosfer.

Cara Kerja

Sampel cell line dikumpulkan lalu dilakukan

isolasi DNA. Setelah itu dilakukan pemeriksaan

kadar DNA dengan spektrofotometer dan konsentrasi

yang dibutuhkan adalah 25 ng sehingga konsentrasi

akhir adalah 1 ng/µl.

Reagen dan Premix

Reaksi ini membutuhkan dua campuran

yaitu Premix A dan Premix B. Premix A merupakan

campuran isolat DNA dan enzim ExTaq, Takara.

Sedangkan Premix B merupakan campuran primer

luar dan dalam, Nihon Gene Research Lab (masing-

masing 200nM), LNA sebagai probe florogenik, IDT

Lab (masing-masing 100nM), dan PNA sebagai klem

primer, Panagene (masing-masing 5mM). Kemudian

Premix A dibagi ke dalam 6 tabung reaksi dan

selanjutnya Premix B ditambahkan sesuai dengan

jenis reaksi. Reaksi PCR yang dijalankan terdiri dari

6 jenis reaksi yaitu R1 (ekson 18: G719C; G719S),

R2 (ekson 19: E746-A750del tipe 1; E746-A750del

tipe 2; L747-A750del T751S), R4 (ekson 21: L858R),

R5 (ekson 21: L861Q), R6 (ekson 20: T790M) dan

PCR Check sebagai kontrol kualitas sampel.

Reaksi PCR

Reaksi PCR dijalankan secara real time

menggunakan mesin SmartCycler II, Cepheid. Siklus

PCR yaitu dipertahankan pada suhu 950C selama 30

detik lalu sebanyak 45 siklus dengan suhu 950C

selama 3 detik lalu 620C (ekson 18; R1), 560C (ekson

19 & 21; R2, R4, R5, PCR Check), 580C (ekson 20;

R6) selama 30 detik.

Analisis hasil

Analisis hasil menggunakan piranti lunak

SmartCycler II. Sebelum menentukan hasil, perlu

dilakukan dahulu kontrol kualitas yang menggunakan

Probe total untuk ekson 21 pada reaksi PCR Check.

Apabila Probe total berpendar maka hal ini

menandakan bahwa sampel yang diperiksa adekuat

dan layak untuk dianalisis lebih lanjut. Selanjutnya

dilihat bila Probe total masing-masing ekson

berpendar maka hal ini menandakan terdapat mutasi

atau delesi pada ekson tersebut. Kemudian untuk

mengetahui jenis mutasi yang terjadi di ekson

tersebut dilihat probe florogenik apa yang berpendar.

Gambar 2 menampilkan alur metode PNA-LNA PCR

Clamp.

Gambar 2. Alur penelitian deteksi mutasi gen EGFR

menggunakan PNA-LNA PCR Clamp.

HASIL PENELITIAN

Dengan metode ini dideteksi mutasi gen

EGFR yaitu delesi ekson 19 E746-A750del tipe 1

pada PC9, delesi ekson 19 pada PC3, mutasi T790M

dan L858R pada H1975 dan tidak ditemukan mutasi

pada H1299. Tabel 1 menampilkan ringkasan

pendaran probe total dan probe mutan semua sampel.

_________________________________________________________________________________________


Tabel 1. Ringkasan hasil pemeriksaan.

PEMBAHASAN

Penelitian ini merupakan penelitian dengan

desain eksperimental. Pengerjaan sampel dilakukan

berulang-ulang kali sehingga didapatkan hasil yang

memuaskan. Di awal proses pengerjaan, hasil yang

didapat sangat tidak memuaskan. Hal tersebut

disebabkan karena proses isolasi DNA yang tidak

baik, ataupun pencampuran reagen yang tidak hati-

hati hingga terjadi kontaminasi reagen. Proses

pengerjaan ini pun berkali-kali menggunakan

berbagai konsentrasi sehingga didapatkan konsentrasi

yang optimal agar didapatkan hasil yang memuaskan.

Sampel

Sampel yang digunakan yaitu cell line PC9,

PC3, H1975 dan H1299 yang dibiakkan berulang

kali. Sebagai aplikasi metode ini secara klinik maka

sampel cell line yang dipilih adalah jenis KPKBSK

yang diperoleh dari donor orang Jepang.

Rasionalisasi pemilihan ini adalah karena tingkat

mutasi gen EGFR lebih sering ditemukan pada orang

Jepang sehingga kami mempertimbangkan mutasi

juga akan lebih sering ditemukan pada cell line. Di

sisi lain, proses kultur sel yang berulang-ulang kali

menggambarkan kanker stadium lanjut. Salah satu

alasan mengapa cell line ynng dipilih karena isolat

DNA yang didapat berupa isolat dari sitologi yang

mencerminkan hasil pemeriksaan yang bisa didapat

dalam praktek sehari-hari yaitu bilasan bronkus,

sikatan bronkus, sputum ataupun cairan pleura.11,12

Konsentrasi sampel

Konsentrasi DNA masing-masing sampel

diupayakan sebesar 25 ng/μl sehingga konsentrasi

akhir sebesar 1 ng/μl untuk masing-masing hasil.

Konsentrasi sebesar 1 ng/μl setara dengan 8000

genom haploid sehingga jumlah sel yang dibutuhkan

sebanyak 8000 sel. Karena sistem ini mampu

mendeteksi alel mutan di antara alel wild type hingga

perbandingan 1:1000 maka alel mutan yang dapat

diperiksa sekurangnya 8 alel mutan. Jumlah ini cukup

sedikit mengingat sampel yang didapat dalam praktek

sehari-hari baik itu berupa jaringan dari biopsi

bronkus ataupun sitologi dari dari sikatan brokus,

bilasan bronkus ataupun efusi pleura juga tidak

banyak.11,12

Siklus PCR

Pengukuran konsentrasi isolat DNA dengan

spektrofotometer perlu dilakukan sebelum

menjalankan metode PNA-LNA PCR Clamp. Hal ini

diperlukan sebagai standarisasi dalam menganalisis

hasil. Sistem ini memerlukan konsentrasi DNA

sekurangnya 1 ng/μl sebagai konsentrasi akhir.

Sehingga dalam sampel yang akan diperiksa

mengandung 8000 salinan DNA. Jumlah salinan

DNA sebanyak ini akan terlihat di monitor berupa

grafik yang meningkat seiring dengan fungsi log pada

siklus ke 27. Grafik yang meningkat sebelum siklus

Sampel

PCR

Check

(siklus)

Cy5

Probe

total

(siklus);

Reaksi

Cy5

Probe

mutan

(siklus);

Reaksi;

Pewarna

Kesimpulan

PC9 25,7 24,3;

Reaksi 2

25,12;

Reaksi 2;

FAM

delesi ekson

19 tipe 1

(E746-

A750del)

PC3 27 29;

Reaksi 2

- delesi ekson

19 jenis pasti

belum

diketahui

H1975 28,6 28,7;

Reaksi 6

29;

Reaksi 4

29,3;

Reaksi 6;

FAM 28,5;

Reaksi 4;

FAM

ekson 20

T790M dan

ekson 21

L858R

H1299 23,9 - - tidak ada

mutasi ekson

18, 19, 20 &

21

_________________________________________________________________________________________


ini menandakan sampel yang diperiksa mengandung

konsentrasi lebih dari 1 ng/μl. Sedangkan apabila

siklus meningkat lebih dari 27 maka konsentrasi

sampel kurang dari 1 ng/μl. Rentang konsentrasi yang

optimal akan terlihat peningkatan siklus berkisar 20

hingga 33 bila menggunakan mesin SmartCycler real

time PCR. Pada keempat sampel didapatkan rentang

siklus antara 23,9 hingga 29,3. Rentang siklus

keempat sampel ini masih dalam batas konsentrasi

yang optimal sehingga dapat disimpulkan semua

hasil peningkatan siklus baik dan adekuat.13

PC9

Pada cell line ini DNA yang didapat cukup

adekuat yang dibuktikan dengan peningkatan siklus

ke-25,7 pada PCR Check. Pada probe total terdapat

peningkatan pada siklus 24,3 di Reaksi 2 sehingga

dapat disimpulkan terdapat mutasi delesi ekson 19.

Hasil temuan ini dikuatkan oleh probe mutan yang

menunjukkan peningkatan siklus ke-25,12 Reaksi 2

pada pewarna FAM sehingga dapat disimpulkan

terdapat mutasi delesi ekson 19 tipe 1 (E746-

A750del).

PC3

Hasil temuan pada PCR Check yang

menunjukkan peningkatan pada siklus 27

menunjukkan bahwa DNA yang didapat cukup

adekuat dan tepat 1 ng/µl. Pada probe total terdapat

peningkatan pada siklus 29 di Reaksi 2 sehingga

dapat disimpulkan terdapat mutasi delesi ekson 19.

Namun tidak ditemukan peningkatan siklus pada

probe mutan. Jenis pasti mutasi yang ada pada

sampel PC3 belum diketahui hanya informasi delesi

ekson 19 saja yang dapat diketahui pasti. Perlu

dilakukan pemeriksaan lanjutan seperti direct

sequencing pada produk PCR yang didapat untuk

mengetahui jenis mutasi pasti pada sampel PC3.

H1975

Pada cell line ini DNA yang didapat cukup

adekuat yang dibuktikan dengan peningkatan siklus

ke-28,6 pada PCR Check. Pada probe total terdapat

peningkatan pada siklus 28,7 di Reaksi 6 dan siklus

29 di Reaksi 4 sehingga dapat disimpulkan terdapat

mutasi pada ekson 20 dan ekson 21. Hasil temuan ini

dikuatkan oleh probe mutan yang menunjukkan

peningkatan siklus ke-29,3 di Reaksi 6 pada pewarna

FAM sehingga dapat disimpulkan terdapat mutasi

ekson 20 T790M dan terdapat peningkatan siklus ke-

28,5 di Reaksi 4 pada pewarna FAM sehingga dapat

disimpulkan terdapat mutasi ekson 21 L858R.

H1299

Hasil temuan pada PCR Check yang

menunjukkan peningkatan pada siklus 23,9

menunjukkan bahwa DNA yang didapat sangat

adekuat. Namun pada probe total tidak terdapat

peningkatan siklus. Hasil temuan ini juga dikuatkan

dengan tidak ditemukannya peningkatan siklus pada

probe mutan. Jadi pada sampel H1299 tidak

ditemukan ada mutasi gen EGFR pada ekson 18, 19,

20 atau 21 dengan kata lain sampel H1299

mempunyai genotip wild type.

PNA sebagai PCR Clamp

Salah satu komponen terpenting sistem ini

adalah penggunaan klem primer. Penggunaan klem

prime bertujuan untuk menghambat amplifikasi alel

wild type. Tentunya dengan penghambatan

amplifikasi inilah yang menyebabkan alel mutan saja

yang akan teramplifikasi sehingga dapat dideteksi.

Pemilihan Peptide Nucleic Acid (PNA) sebagai klem

_________________________________________________________________________________________


primer berdasarkan atas sifat PNA yang resisten

terhadap aktifitas 5` nuklease dalam hal ini DNA

polimerase. Di sisi lain, ikatan heterodupleks antara

PNA-DNA ternyata lebih stabil dan mempunyai T

melting yang lebih tinggi dari ikatan DNA-DNA.14

LNA sebagai probe fluorogenik

Komponen lain yang penting adalah

penggunaan probe fluorogenik untuk mendeteksi alel

mutan. Salah satu bahan yang handal untuk

digunakan adalah Locked Nucleic Acid (LNA).

Struktur molekul yang unik pada jembatan metilen

membuat konformasi struktur terkunci yang

mengakibatkan ikatan heterodupleks LNA-DNA juga

cukup stabil dan mempunyai T melting yang lebih

tinggi. Salah satu keunggulan lain adalah penggunaan

fluorogenik sebagai reporter dan quencher yang

dapat dilekatkan pada ujung LNA. Jadi penggunaan

LNA sangatlah tepat dalam sistem ini.15,16

Mesin SmartCycler real time PCR

Mesin yang digunakan adalah mesin

SmartCycler real time PCR. Mesin ini digunakan

karena mempunyai beberapa keunggulan yaitu dapat

menjalankan sampel secara simultan dengan protokol

yang berbeda-beda serta dengan waktu yang cepat

sekitar 30-40 menit. Mesin PCR yang digunakan

adalah jenis real time dengan berbagai optik karena

jenis mutasi yang dirancang mencapai 12 jenis mutasi

yang dapat dijalankan sekaligus. Piranti lunak yang

disediakan dapat membantu mengidentifikasi

peningkatan siklus bahkan dapat dilakukan analisis

2nd derivative graphic. Hal inilah yang menjadi

alasan mengapa mesin yang dipakai adalah

SmartCycler real time PCR.13

Kelebihan dan kekurangan metode PNA-LNA

PCR Clamp

Metode PNA-LNA PCR Clamp ini mampu

mendeteksi mutasi gen EGFR dengan perbandingan

1:1000 terhadap sel dengan genotip wild type.11

Dalam suatu uji klinik lanjutan tingkat sensitifitas

dan spesifitas metode ini sebesar 97% dan 100%.12

Lama pengerjaan isolasi DNA dari sampel sekitar 2

jam sedangkan untuk hasil yang optimal sekitar 1

malam (10 jam) termasuk proses pencampuran dan

pengukuran konsentrasi. Sedangkan lama pengerjaan

menjalankan mesin SmartCycler real time PCR

hanya sekitar 40 menit per sampel.13

Metode PNA-LNA PCR Clamp ini mampu

mendeteksi mutasi gen EGFR seperti terlihat dalam

reaksi yang ditampilkan pada gambar 2 atau dengan

kata lain sistem ini tidak dapat mendeteksi jenis

mutasi di luar itu. Namun sistem ini mampu

mendeteksi sebagian besar jenis mutasi gen EGFR

karena 95% mutasi gen EGFR terjadi pada mutasi

delesi ekson 19 dan mutasi ekson 21.17 Reagen PNA

dan LNA sangat rapuh, sangat sensitif terhadap

cahaya dan suhu sehingga dalam proses pengenceran

PNA dan LNA diperlukan kehati-hatian yang tinggi

agar reagen tidak rusak.14-16 Setiap kali

mengencerkan reagen dalam jumlah banyak

diperlukan kontrol positif dan kontrol negatif sebagai

jaminan mutu kualitas. Kontrol positif dan negatif

membutuhkan kultur sel dan plasmid yang

membutuhkan infrastruktur untuk melakukan kultur

sel dan plasmid. Biaya produksi untuk mendeteksi

apakah ada mutasi gen EGFR pada setiap sampel

klinik menggunakan metode PNA-LNA PCR Clamp

adalah sekitar $20 pada tahun 2010.12 Bila

dibandingkan dengan pengerjaan mennggunakan

direct sequencing, tentu metode ini menawarkan

biaya produksi yang jauh lebih hemat. Kelebihan dan

_________________________________________________________________________________________


kekurangan metode PNA-LNA PCR Clamp dalam

mendeteksi mutasi gen EGFR ditampilkan dalam

tabel 2.10

Tabel 2. Kelebihan dan kekurangan metode PNA-

LNA PCR Clamp.

KESIMPULAN


mendeteksi mutasi gen EGFR pada cell line

PC9, PC3, H1975, dan H1299.

Cell line PC9 mengandung mutasi delesi

ekson 19 tipe 1 (E746-A750del), PC3

mengandung mutasi delesi ekson 19, H1975

mengandung mutasi ekson 20 T790M dan

ekson 21 L858R sedangkan H1299 tidak

mengandung jenis mutasi.


digunakan sebagai metode alternatif dalam

mendeteksi mutasi gen EGFR pada cell line.

SARAN

Karena penelitian ini belum menggunakan sampel

klinis maka perlu penelitian lanjutan untuk melihat

metode PNA-LNA PCR Clamp apakah dapat

mendeteksi mutasi gen EGFR pada sampel klinis

baik itu histopatologi ataupun sitologi.

DAFTAR PUSTAKA

1. Dutta PR, Maity A. Cellular responses to EGFR inhibitors and their relevance to cancer therapy.

Cancer Lett. 2007;254:165–77.

2. Departemen Kesehatan RI. Profil kesehatan

Indonesia 2004. Jakarta: Depkes RI; 2005.p.13-

22.

3. Alberg AJ, Ford JG, Samet JM. Epidemiology

of lung cancer. Chest. 2007;132(:29S-55S.

4. Mok TSK. Personalized medicine in lung cancer:

what we need to know. Nat Rev Clin Oncol.

2011;8:661–8.

5. Gazdar AF, Minna JD. Deregulated EGFR signaling during lung cancer progression:

mutations, amplicosns, and autocrine loops.

Cancer Prev Res. 2008;1:156-60.

6. Gazdar AF. Personalized medicine and inhibition

of EGFR signaling in lung cancer. N Engl J

Med. 2009;361(10):1018-20.

7. Lynch TJ, Bell DW, Sordella R,

Gurubhagavatula S, Okimoto RA, Brannigan

BW, et al. Activating mutations in the EGFR

underlying responsiveness of NSCLC to

gefitinib. N Engl J Med. 2004;350(21):2129-39.

8. Paez JG, Janne PA, Lee JC, Tracy S, Greulich H, Gabriel S, et al. EGFR mutations in lung cancer:

correlation with clinical response to gefitinib

therapy. Science. 2004;304(1497):1497–500.

9. Eberhard DA, Giaccone G, Johnson BE.

Biomarkers of response to EGFR inhibitors in

NSCLC working group: standardization for use

in the clinical trial setting. J Clin Oncol.

2008;26(6):983-94.

10. Angulo B, Conde E, Suárez-Gauthier A, Plaza C,

Martínez R, et al. A Comparison of EGFR

mutation testing methods in lung carcinoma: direct sequencing,rReal-time PCR and

immunohistochemistry. PLoS ONE. 2012;7(8):

e43842.

11. Nagai Y, Miyazawa H, Huqun, Tanaka T,

Udagawa K, Kato M, et al. Genetic

heterogeneity of the EGFR in NSCLC cell lines

revealed by a rapid sensitive detection system,

the PNA-LNA PCR Clamp. Cancer Res. 2005;

65: 7276-82.

12. Tanaka T, Nagai Y, Miyazawa H, Koyama N,

Matsuoka S, Sutani A, et al. Reliability of the PNA-LNA PCR Clamp test for EGFR mutations

integrated into the clinical practice for NSCLC.

Cancer Sci. 2007;98(2):246-52.

Kelebihan Kekurangan

Proses pengerjaan cepat

sekurangnya 2 jam 40 menit (2 jam isolasi DNA, 40 menit PCR)

Infrastruktur

laboratorium yang mendukung kultur sel dan plasmid sebagai kontrol kualitas metode

Sampel klinik yang dibutuhkan tidak banyak; jumlah DNA @ reaksi 25 ng

= 8.000 genom haploid

Butuh kehati-hatian dan ketrampilan dalam mengerjakan metode

ini Sensitifitas 97% dan spesifitas 100%

Jenis mutasi gen EGFR hanya yang tertera dalam sistem ini

Biaya produksi dibandingkan menggunakan metode standar baku emas lebih hemat

_________________________________________________________________________________________


13. Cepheid Technical Support. Optimizing and

analyzing real-rime assays on the SmartCycler®

II System. Cepheid. 2005.p.1-6.

14. Nielsen PE, Egholm M. An introduction to

Peptide Nucleic Acid. Current Issues Molec

Biol. 1999;1(2):89-104. 15. Braasch DA, Corey DR. Locked nucleic acid

(LNA) : fine-tuning the recognition of DNA and

RNA. Chem Biol. 2001;8(1):1-7.

16. Petersen M, Wengel J. LNA: a versatile tool for

therapeutics and genomics. Trends Biotechnol.

2003;21(2):74-81.

17. Sharma SV, Bell DW, Settleman J, Haber DA.

Epidermal growth factor receptor mutations in

lung cancer. Nat Rev Cancer. 2007; 7: 169–81.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Petersen%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12573856

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Wengel%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12573856

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12573856

deteksi mutasi gen egfr menggunakan pna-lna pcr clamp pada

Documents