detector for lc
TRANSCRIPT
Độ chính xác, độ đúng
Ñaùp öùng(response)
Khoaûng tuyeán tính
Ñoä nhaïy(S>2N)
Specific detector
Transport detector
Những yêu cầu cơ bản của detector
Bulk property detectorRID, ECD…
Solute property detectorUV. Fluorescense
Detector noise
1. Short term noise (grass) Nguyên nhân: Detector, recorder electronics.Khắc phục: sử dụng noise filter
2. Long term noise -> seriousKhó phân biệt với peak chất tan Nguyên nhân: sự không ổn định detector làm
thay đổi môi trường xung quanh.(VD: RID detector độ nhạy phụ thuộc
nhiệt độ và áp suất)
3. Drift Nguyên nhân: -Mất cân bằng trong detector do Nguồn điện cung cấp cho detector dẫn đến slowly changing output.Thay đổi nhiệt độ xung quanh.- Thay đổi pha động -> cân bằng trên cột không hoàn toàn
sensitivity
4. Total noise (tổng hợp 3 loại trên
Các loại detector noise
ND = v1.A = v1/Sv1 ( mV) đo trên recorder scale.
A : attenuation factorS : amplification factor
Specific detector(UV, Fluorescence)
Chất tan có tình chất đặc biệt mới được dò tìm.Hạn chế trong việc lựa chọn dung môi.Độ nhạy cao, khoảng tuyến tính rộng,
- Dung môi được loại bỏ nhờ quá trình bay hơi- Chất tan được dò tìm nhờ quá trình đốt cháy hay nhiệt phân…..-> Không hạn chế lựa chọn dung môi (reasonably volatile)- Thích hợp cho việc rửa giải gradient- Ít nhạy hơn specific detector- Khoảng tuyến tính tương đối rộng.
Transport detector
NOTE: Cả hai đều yêu cầu về độ tinh khiết của dung môi.
UV DetectorUV Detector
Conductivity DetectorConductivity Detector (CDD).(CDD).
Rafractive index Detector Rafractive index Detector (RID)(RID)
Fluorescense Detector Fluorescense Detector (Đầu dò huỳnh quang)(Đầu dò huỳnh quang)
Detector for LC
UV DetectorUV Detector
Hợp chất (olefin, vòng thơm, >CO, >CS, -N=O, -NΞN-, hấp thu vùng UV (200-350 nm)
Đầu dò bước sóng cố địnhĐầu dò bước sóng cố định
Đầu dò đa bước sóng Đầu dò đa bước sóng
Electrochemical DetectorElectrochemical Detector
Mối liên hệ giữa cường độ ánh sáng UV truyền qua cell đo và nồng độ chất tan
IT = Io e-kLC
Io : cường độ ánh sáng tới cell.IT : cường độ ánh sáng truyền qua.
L: chiều dài của cell đo.C: nồng độ chất tan.
k: hệ số dập tắt phân tử (chất tan, bước sóng).Ln IT = Ln Io- kLC
Độ nhạy - k: (chất tan, bước sóng) <- Lựa chọn- Chiều dài đường truyền ánh sáng qua cell-> L (không tăng vô hạn) gây ra sự phân tán peak (band dispersion)
Hình 1: Mô tả đầu dò bước sóng cố định
Detecto Alltech Model 450Ñoä tuyeán tính : 0,005-1ñôn vò haáp thu AUCuvet chuaån : 13µlTroâi ñöông neàn : < 5x10-5AU/giôøNhieãu : 2x 10-5AU
Kích thước Cell đo (L=1-10 mm, bk = 1mm)
Đèn : Đèn hơi thủy ngân (253.7 nm) -> đầu dò nhạy với nhiều chất tan
Đèn hơi kẽm (212.9 nm và 307.6 nm)Đèn hơi Cd (228.8, 326.1, 340.3, 346.6 nm)
Ưu điểm : Độ nhạy cao (5x10-5 mg/ml), độ chọn lọc cao
Khoảng tuyến tính (5x10-5 to 5x10-1 mg/ml)Response Index (0.98 – 1.02)
Đầu dò bước sóng cố định
1- Đầu dò phân tán đa bước sóng 2- Đầu dò diode array
Ưu điểm : độ nhạy cao (10-4 mg/ml), độ chọn lọc caoKhoảng tuyến tính (5x10-4 to 5x10-1 mg/ml)
Response Index (0.97 – 1.03)
Đầu dò đa bước sóng
Đầu dò phân tán giám sát chất tan chỉ ở Đầu dò phân tán giám sát chất tan chỉ ở một bước sóngmột bước sóngƯu điểm : độ nhạy cao, độ linh hoạt và đáp Ưu điểm : độ nhạy cao, độ linh hoạt và đáp ứng tuyến tính thỏa đáng.ứng tuyến tính thỏa đáng.Kích thước lớn do không gian quang học Kích thước lớn do không gian quang học bên trong tương đối lớnbên trong tương đối lớn
1- Đầu dò phân tán đa bước sóng
2- Đầu dò diode array Ghi lại thời gian của một peak đặc trưng, phổ đồ của chất tan
1- Đầu dò phân tán đa bước sóng
Detecto Model 200 Variable UV/VIS,AlltechÑoä haáp thu : 0,0005-2AUÑoä tuyeán tính :<1%-2AUÑoä chính xaùc : ±1nmÑoäñuùng :±1nmTroâi neàn : 2x10-4AU/giôøNhieãu neàn : <±1x10-5AUôû 254nmCuvet : 9µl
D2 or Xenon
2- Đầu dò diode array
Cho cuøng luùc thôøi gian löu cuûa hoaù chaát, phoåUV hay Vis cuûa hoaù chaát
Chiều dài Chiều dài cộtcột
Bề rộng Bề rộng peakpeak
Flow cell đề nghịFlow cell đề nghị
<=5cm<=5cm 0.025 phút0.025 phút Micro flow Micro flow cellcell
10cm10cm 0.05 phút0.05 phút Semimicro Semimicro flow cellflow cell
20cm20cm 0.1 phút0.1 phút Flow cell Flow cell chuanchuan
>=40cm>=40cm 0.2 phút0.2 phút
Tỉ lệ dòngTỉ lệ dòng 0.05-0.2 0.05-0.2 ml/minml/min
0.2-0.4 0.2-0.4 ml/minml/min
0.4-0.8 0.4-0.8 ml/minml/min
1-2 ml/min1-2 ml/min
Đường kính cộtĐường kính cột 1 mm1 mm 2.1 mm2.1 mm 3 mm3 mm 4.6 mm4.6 mm
Flow cell lớn – giới hạn phát hiện tốt.Flow cell nhỏ - độ phân giải peak tốt.
Dispersion ảnh hưởng nghiêm trọng đến phản ứng sau cột
Turbulence (sự xáo trộn) trong detector connecting tube hoặc cell gây ra sự khuyếch tán của chất tan
Tăng noise -> giảm độ nhạy
Khắc phục: Thay đổi hính dạng của ống
Hạn chế: dễ dàng gây tắc nghẽn -> tạo áp suất ngược trên cột
-> lựa chọn kích thước cho phù hợp
Ảnh hưởng của nhiệt đến cell
From column
Sự khác biệt khi sử dụng heat exchanger
Methanol Absorption Spectrum
If dissolved oxygen concentration becomes high, organic If dissolved oxygen concentration becomes high, organic solvent absorbance becomes high. solvent absorbance becomes high.
This effect is pronounced in short wavelength region. This effect is pronounced in short wavelength region.
Air saturation
Degassed
Thay đổi background trong UV detectorPha động
Detection: UV- 210nm
The difference in dissolved air quantities in mobile phase and The difference in dissolved air quantities in mobile phase and sample solvent solutions can be expressed as peaks. sample solvent solutions can be expressed as peaks.
Degassed mobile phase
Mobile phase not degassed
Oxygen bubbling
Air saturation
He bubbling
Oxygen bubbling
Air saturation
He bubbling
Không khí hòa tan trong pha động ảnh hưởng peak trong UV detector
In general, spectrum shape is affected by ambient temperature.In general, spectrum shape is affected by ambient temperature.
Measurement wavelength
Spectrum at high temperature
Absorbance difference due to temperature change
Spectrum at low temperature
Abs
orba
nce
Ảnh hưởng của nhiệt độ cell đến detector UV
Comparison of peak area values without temperature control Comparison of peak area values without temperature control (34(34C)C)
0.9680.9680.9850.985p-p-toluic acidtoluic acid
0.9860.9860.9910.991Benzoic acidBenzoic acid
0.9910.9910.9940.994PhenolPhenol
50ºC50ºC40ºC40ºC
Peak Area Ratios Compared with Areas at 34ºCPeak Area Ratios Compared with Areas at 34ºC
ColumnColumn : Shim-Pack VP-ODS (150mm L. x 4.6mm I.D.) : Shim-Pack VP-ODS (150mm L. x 4.6mm I.D.)
Mobile phase : 10mM acetic acid (sodium) buffer solution (pH 4.5) /Mobile phase : 10mM acetic acid (sodium) buffer solution (pH 4.5) / Methanol = 7/3, (v/v) Methanol = 7/3, (v/v)
Flow rateFlow rate : 1mL/min : 1mL/min
Temperature : 40ºCTemperature : 40ºC
DetectionDetection : UV-VIS (260nm) : UV-VIS (260nm)
Ảnh hưởng của nhiệt độ cell đến detector UV
Ưu điểm của UV detector- Được sử dụng rộng rãi và nhiều nhất.
- Độ chọn lọc tương đối cao.- Khoảng tuyến tính rộng.
-Có sự kết hợp tốt giữa độ nhạy, độ tuyến tính và độ tin cậy-Thiết bị không mắc tiền, tương đối đơn giản
-Thể tích chết tương đối nhỏ nên UV detector kết hợp hiệu quả với cột hiệu năng cao
Hạn chế của UV detector:Không xác định được hợp chất không phân cực, không hấp thu as UV-VIS
DETECTO HUYØNH QUANG DETECTO HUYØNH QUANG ( Fluorescence Detector)( Fluorescence Detector)
1.Duøng tia1.Duøng tia UV UV ñeå kích thích hoaù chaát, hoaù chaát ñeå kích thích hoaù chaát, hoaù chaát vôùi caáu truùc thích hôïp seõ phaùt huyønh quang ôû vôùi caáu truùc thích hôïp seõ phaùt huyønh quang ôû böôùc soùng daøi hôn so vôùi böôc soùng kích thích, böôùc soùng daøi hôn so vôùi böôc soùng kích thích, ngöôøi ta ño cöôøng ñoä phaùt huyønh quang ñeå töø ngöôøi ta ño cöôøng ñoä phaùt huyønh quang ñeå töø ñoù tính ra ñöôïc noàng ñoä chaát caàn phaân tích ban ñoù tính ra ñöôïc noàng ñoä chaát caàn phaân tích ban ñaàu.ñaàu.
2.Ñaàu doø huyønh quang thuoäc loaïi coù ñaëc tính 2.Ñaàu doø huyønh quang thuoäc loaïi coù ñaëc tính choïn loïc cao,choïn loïc cao,
chæ coù chaát coù tính huyønh quang môùi ñöôïc phaùt chæ coù chaát coù tính huyønh quang môùi ñöôïc phaùt hieän vaø ño ñöôïc. Nhö vaäy, hoaëc chaát coù tính hieän vaø ño ñöôïc. Nhö vaäy, hoaëc chaát coù tính huyønh quang töï nhieân, hoaëc thöïc hieän phaûn huyønh quang töï nhieân, hoaëc thöïc hieän phaûn öùng tröôùc hay sau coät saéc kyù loûng ñeå taïo daãn öùng tröôùc hay sau coät saéc kyù loûng ñeå taïo daãn xuaát coù tính huyønh quang roài môùi ño.xuaát coù tính huyønh quang roài môùi ño.
3. Ñaàu doø huyønh quang raát nhaïy, coù theå ño 3. Ñaàu doø huyønh quang raát nhaïy, coù theå ño löôïng hoaù chaát raát nhoû. löôïng hoaù chaát raát nhoû.
ÑAÀU DOØ HUYØNH QUANGÑAÀU DOØ HUYØNH QUANG
The fluorescence signal (If) is given by If = ө Io (1– e -kcl) ө: is the quantum yields (the ratio of the number of photons emitted and the number of photons absorbed), (Io) is the intensity of the incident light, (c) is the concentration of the solute, (k) is the molar absorbance, (l) is the path length of the cell.
The Single Wavelength Excitation Fluorescent Detector
low-pressure mercury lamp 253.7 nm
1.Ñeøn XENON, 150w1.Ñeøn XENON, 150w 2.Khoaûng böôùc soùng : 200-650 hoaëc 2.Khoaûng böôùc soùng : 200-650 hoaëc
200-900nm200-900nm 3.Ñoä chính xaùc : ±0,2nm3.Ñoä chính xaùc : ±0,2nm 4. Ñoä ñuùng : ±2nm4. Ñoä ñuùng : ±2nm 5. Ñoä nhaïy : S/N 300 hay hôn cho vaïch 5. Ñoä nhaïy : S/N 300 hay hôn cho vaïch
RAMAN cuûa nöôùcRAMAN cuûa nöôùc 6. Cuvet : 12µl6. Cuvet : 12µl
ÑAÀU DOØ HUYØNH QUANG ÑAÀU DOØ HUYØNH QUANG RF-10AXL SHIMADZURF-10AXL SHIMADZU
Sử dụng thấu kính để tập trung ánh sáng huỳnh quang
Sử dụng gương parabol để tập trung ánh sáng huỳnh quang vào ống nhân quang tăng độ nhạy
The Multi Wavelength Fluorescence Detector
2 monochromators, 1 cái để chọn bước sóng kích thích và cái còn lại để chọn bước sóng huỳnh quang
Lựa chọn bước sóng kích thích và bước sóng phát huỳnh quang
để tăng độ nhạy
1 Naphthalene 9 Chrysene 2 Acenaphthene 10 Benzo(b)fluoranthene 3 Fluorene 11 Benzo(k)fluoranthene 4 Phenanthrene 12 Benzo(a)pyrene 5 Anthracene 13 Dibenz(a,h)anthracene6 Fluoranthene 14 Benzo(ghi)perylene 7 Pyrene 15 Indeno(123-cd)pyrene 8 Benz(a)anthracene
Time Wavelength of Wavelength of Excitation Light Emitted Light 0 280 nm 340 nm 220 290 nm 320 nm 340 250 nm 385 nm 510 260 nm 420 nm 720 265 nm 380 nm 1050 290 nm 430 nm 1620 300 nm 500 nm
min0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
mAU
0
100
200
300
400
BPA
Degassed
Not degassed* Analysis of bisphenol A by fluorescence detection
Degassing : Helium purging
Mobile phase degassing may affect fluorescence Mobile phase degassing may affect fluorescence intensity.intensity.
Ảnh hưởng của hệ thống đuổi khí đến detector huỳnh quang
Gas-liquid membrane separation degasser takes time to get
degassing result.
0
1
2
3
4
5
0 10 20 30 40 50 60Time from start of degassing (min)
Pea
k A
rea
Val
ue
(×
106 )
Degasser OFF
Degasser ONColumnColumn : Shim-Pack VP-ODS : Shim-Pack VP-ODS
(150mm L x 4.6mm I.D.) (150mm L x 4.6mm I.D.)Mobile Phase: acetonitrile/HMobile Phase: acetonitrile/H22O = 4/1 O = 4/1
(v/v)(v/v)Flow rateFlow rate : 1mL/min : 1mL/minTemperature : 40ºCTemperature : 40ºC
Analyte Analyte : Pyrene: Pyrene
DetectionDetection : Fluorescence : Fluorescence (Ex 310nm, Em 390nm) (Ex 310nm, Em 390nm)
Degassin :Degassin :Gas-liq. separation Gas-liq. separation membranemembrane
Ảnh hưởng của hệ thống đuổi khí đến detector huỳnh quang
Ảnh hưởng của nhiệt độ cell đến detector huỳnh quang
Thông thường nhiệt độ càng tăng, độ nhạy của detector càng giảm
Analysis result of acridine (Temp. effect on fluorescence intensity)
Areas 20→25C13.5% decrease
Without temperature control (RF-10AXL) With temperature control (RF-10AXLsuper)
Areas at 20→25C2.2% decrease
InstrumentInstrument :: Shimadzu Amino Acid Analysis SystemShimadzu Amino Acid Analysis System (Post-column derivitization using (Post-column derivitization using o-phthaladehyde) o-phthaladehyde)
DetectionDetection :: RF-10AXL SuperRF-10AXL Super (Ex 350nm, Em 450nm) (Ex 350nm, Em 450nm) (Cell temperature ; (Cell temperature ; 20ºC20ºC, , 40ºC40ºC))
0.770.7791101791101711855141185514LEULEU
0.770.771126683112668314573401457340ILEILE
0.770.7779001379001310268391026839METMET
0.780.781226042122604215654401565440VALVAL
0.780.78138426138426177078177078CYSCYS
0.770.771203529120352915585601558560ALAALA
0.790.791924900192490024407722440772GLYGLY
0.860.86436522436522505373505373PROPRO
0.770.771017768101776813154621315462GLUGLU
0.770.771204273120427315707431570743SERSER
0.770.771143925114392514784471478447THRTHR
0.780.781165757116575715004271500427ASPASP
4040ººCC2020ººCC
Area RatioArea RatioAA4040/A/A2020
Peak AreaPeak Area Area RatioArea RatioAA4040/A/A2020
Peak AreaPeak Area
4040ººCC2020ººCC
0.760.7683918383918311055301105530ARGARG
0.690.69336837336837487433487433LYSLYS
0.790.791431665143166518196751819675HISHIS
0.760.7699583299583213154791315479PHEPHE
0.740.7485097685097611568501156850TYRTYR
Ảnh hưởng của nhiệt độ cell đến detector huỳnh quang
Fluorescence Spectrum of Bisphenol A in Each Solvent (Excitation wavelength 270nm, with background correction)
Methanol
Acetonitrile
Wavelength(nm)
Ảnh hưởng của dung môi đến độ nhạy detector huỳnh quang
ÑAÀU DOØ CHÆ SOÁ KHUÙC ÑAÀU DOØ CHÆ SOÁ KHUÙC XAÏ RIDXAÏ RID
Electrochemical detector ( đầu dò điện hóa):
Xác định hợp chất hoặc chất chứa nhóm chức có tính oxi hóa hay khử
Ưu điểm:Độ nhạy cao.
Độ chọn lọc cao.Có khả năng áp dụng rộng rãi
Note: 1- Cấu trúc cell đo (1,2 ảnh hưởng dòng đo)2- Tốc độ dòng chảy của chất rửa giải sử dụng bơm chuyển động dạng pittong-> pulse free constant flow3- Hệ thống pha đảo hay hệ thống chỉ có một chất điện phân?
- Dung môi và dung dịch chất phân tích phải được loại trừ bọt khí, không chứa vết tạp chất kim loại - Sản phẩm của phản ứng điện hóa có thể tạo ra sản phẩm làm thay đổi tính chất của bề mặt điện cực, gây noise drift, giảm đáp ứng
Detector với hệ 3 điện cực:- Reference electrode Ag/AgCl hay calomen bão hòa
- Working electrode trơ về mặt hóa học,dẫn điện tốt,không mắc, dãy thế làm việc rộng -0.8V 1.3V (cacbon paste, vàng)
- Auxiliary electrode glassy cacbon, platinum, thép không gỉ
(n) is the number of electrons per molecule in the reaction, (F) is the Faraday Constant, (A) is the area of the working electrode, (KT) is the limiting Mass Transfer Coefficient, (c) is the solute concentration, (u) is the linear velocity of the mobile phase over the surface of the electrode, (a) is a constant usually taking a value between 1/3 and 1/2.
Mối quan hệ giữa dòng đo được và nồng độ chất phân tích
Different Electrode Configurations
A và B (thông dụng):Làm tăng u, bề mặt điện cực
luôn được làm sạch
Electrical Conductivity Detector(bulk property detector)
can only detect those substances that ionizeinorganic acids, bases and saltsorganic acids and bases
- Detector sensor cell: a few micro-liters in volume containing two electrodes (platinum, noble metal, stainless steel) two or three millimeters apart - Đầu dò rất nhạy với nhiệt độ nên cần thermostatic control.
mobile phase leaving the column must be removed(passing through short reverse phase column )
only ions of interest enter detector minimal background conductivity.
- Sensitivity of detector (minimum detectable concentration) of about 5 x 10-9 g/ml - Linear dynamic range of about 200 where 0.97 < r < 1.03. - 95% of all analyses involving ion exchange procedures to separate inorganic and organic ions.