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Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS
ANALÍTICOS PARA A DETERMINAÇÃO DE
GATIFLOXACINO EM COMPRIMIDOS
Dissertação para obtenção do título de mestre
Comissão examinadora
Profa. Dra. Hérida Regina Nunes Marona
Profa. Dra. Simone Cardoso Gonçalves
Dra. Luciana Polese
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICASCAMPUS - ARARAQUARA
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOSANALÍTICOS PARA A DETERMINAÇÃO DE
GATIFLOXACINO EM COMPRIMIDOS
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Orientadora: Profa. Dra. Hérida Regina Nunes Marona
Araraquara – SP
Dissertação apresentada ao Programa dePós-Graduação em Ciências Farmacêuticas,Área de Pesquisa de Desenvolvimento deFármacos e Medicamentos, da UNESP,como parte dos requisitos para obtenção doTítulo de Mestre em Ciências Farmacêuticas
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICASCAMPUS - ARARAQUARA
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOSANALÍTICOS PARA A DETERMINAÇÃO DE
GATIFLOXACINO EM COMPRIMIDOS
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Araraquara-2003
AgradecimentosÀ minha avó (in memorian), mulher corajosa, nascida no interior do RN em 1902, com
uma percepção incomum às mulheres da sua época. Obrigada por sempre escutar minhas
preces e me confortar nos momentos difíceis.
Ao meu sogro, Francisco das Chagas e Silva, e à minha sogra, Maria Creusa, pela ajuda
emocional e apoio sempre constante, para que eu e Angelo realizássemos nosso sonho.
À minha tia Eunice, pelas orações em minha intenção, e pelo amor dedicado a mim e à
minha família
À minha Tia Aldeiza e ao Tio Laércio, pelo apoio oferecido, e por ter reunido a família
para me ajudar. Obrigado por tudo que vocês já fizeram por mim.
Aos meus amigos de mestrado, Rubiana, Fernando, Fátima, Tina, Inaiara, pelas angústias,
dúvidas, inseguranças, opiniões e aperreios compartilhados.
A todos os outros colegas de turma de mestrado que conviveram comigo durante esse
período de aprendizagem e crescimento.
Aos meus amigos Alexandra e Tadeu, que tornaram esses dois anos em Araraquara mais
agradáveis e felizes
À minha querida estagiária Maria Beatriz Bastos Luchessi, Bia, pela amizade e auxílio no
doseamento microbiológico.
Aos meus familiares que me ajudaram, financeiramente e emocionalmente, para que eu
pudesse realizar meu sonho, e viajar tranqüila para Araraquara.
À Luciene, pelos momentos agradáveis compartilhados no laboratório, e pela ajuda nos
experimentos realizados.
À Dona Maria, exemplo de dedicação e amor ao trabalho realizado no laboratório.
Obrigado por socorrer-me e ajudar-me no laboratório
Ao Prof. Dr. Luís Vitor Sacramento, pela amizade construída nesses anos que estive em
Araraquara.
À Profa. Dra. Chung Man Chin, pela disponibilidade em ajudar-me e pela amizade,
construída nesses anos.
Ao Prof. Dr. Manoel Lima de Menezes, do Instituto do Trabalhador e da Faculdade de
Ciências de Bauru, UNESP, por ter concedido o equipamento para realização das análises
em CLAE e a coluna phenomenex.
Ao Prof. Dr. Keiji Ukijawa, por disponibilizar o espectrofotômetro para análises no UV.
À Profa. Dra. Magali Benjamin de Araújo, EFOA-Alfenas, pelas sugestões e orientações,
fornecidas para a minha dissertação.
À Profa. Dra. Márcia da Silva, UNESP-Araraquara, pelas sugestões e orientações,
fornecidas para a minha dissertação.
Aos funcionários da biblioteca, em especial a Moacyr, Queila, Ana e Laura, pela amizade e
os bons momentos de convívio durante esses dois anos.
Às funcionárias da secretaria de pós-graduação, pela dedicação, paciência e simpatia no
atendimento e dúvidas solucionadas, durante este período.
A Bristol-Myerrs Squibb, pela doação da substância de referência e comprimidos de
gatifloxacino.
À CAPES, pelo apoio financeiro concedido.
A Deus.............
Os momentos difíceis foram tantos........... Mas a fé, a esperança e o otimismo de dias menos
angustiados, deram-me força para continuar e concluir minha dissertação. O Senhor foi meu
grande aliado, principalmente nos dias, que a vontade era de jogar tudo para cima.
Ao grande amor da minha vida, Nathan
A sua existência torna tudo mais objetivo
A sua presença era um motivo a mais para continuar
O seu olhar puro e ingênuo dava-me forças para não desistir
As decepções era menores ao seu lado
Desculpe-me pelos momentos ausentes, cansados, sonolentos,
que eu não pode estar com você
Ao meu amor, Angelo
Ao amigo e companheiro.
Esse anos não foram só flores, mas ao seu lado ficava fácil continuar
Com certeza não foi fácil agüentar meu temperamento difícil
Obrigado por sempre me apoiar e estar sempre ao meu lado nos momentos de alegrias e tristezas.
Amo você!
À minha mãe, pelo apoio, amor e compreensão dedicados a mim.
Sem a sua força ,incentivo e ajuda, eu não conseguiria.
A minha irmã, Christinni, por me apoiar e ajudar nos momentos que eu precisei.
Ao meu pai, por me apoiar, ajudar e incentivar.
À Profa. Dra. Hérida Regina Nunes Marona
Um dos melhores presentes nestes últimos dois anos foi ganhar você como orientadora. Além de me
orientar, mostrou-se uma pessoa amiga, determinada e amável, conquistando minha amizade e
confiança neste período. Você é maravilhosa!
“Se alguém lhe bloquear a porta, não gaste energia com o confronto: procure as janelas.Lembre-se da água: ela nunca discute com seus obstáculos, apenas os contorna.
Portanto, quando alguém lhe ofender ou frustrar, contorne-o sem discutir.”Desconhecido
SUMÁRIO
Lista de Abreviaturas
Lista de Figuras
Lista de Tabelas
Lista de Quadros
Resumo
Abstract
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...................................................................................3
2.1.Quinolonas e fluorquinolonas.............................................................................3
2.2. Gatifloxacino.........................................................................................................6
2.2.1. Descrição...........................................................................................................11
2.2.1.1. Substância de referência ......................................................................12
2.2.1.2. Forma farmacêutica .............................................................................12
2.3. Doseamento microbiológico ...............................................................................13
2.4. Espectrofotometria..............................................................................................20
2.5. Métodos cromatográficos .................................................................................20
2.5.1. Cromatografia em camada delgada (CCD) ................................................20
2.5.2. Cromatografia líquida de alta eficiência ....................................................23
2.6. Método titrimétrico.............................................................................................26
2.7. Métodos analíticos para fluorquinolonas em formas farmacêuticas............. 28
2.8. Validação de métodos analíticos........................................................................33
3. OBJETIVOS .............................................................................................................40
4. MATERIAL E MÉTODO .........................................................................................41
4.1. MATERIAL...........................................................................................................41
1 Solventes, matérias-primas e reagentes.......................................................41
2. Equipamentos.................................................................................................42
4.2. MÉTODO.............................................................................................................44
4.2.1. Doseamento em meio não-aquoso utilizando ácido perclórico 0,1 M em meio com
ácido acético.........................................................................................................44
4.2.1.1. Exatidão do método.......................................................................................44
4.2.1.2. Precisão do método........................................................................................44
4.2.1.3. Determinação do teor de gatifloxacino na forma farmacêutica
comprimido..................................................................................................................44
4.2.2. Metodologia analítica por espectrofotometria na região UV........................45
4.2.2.1. Espectro de absorção de GATX-SR..............................................................45
4.2.2.2. Construção da curva de Ringbom.................................................................45
4.2.2.3. Construção da curva padrão para gatifloxacino.........................................46
4.2.2.4. Análise estatística ...........................................................................................47
4.2.2.5. Exatidão do método proposto. .......................................................................47
4.2.2.6. Precisão do método..........................................................................................48
4.2.2.7. Determinação de gatifloxacino nos comprimidos ........................................48
4.2.2.7.1. Preparo da solução de gatifloxacino substância de referência.................48
4.2.2.7.2. Preparo das amostra de comprimidos........................................................49
4.2.3. Cromatografia líquida de alta eficiência..........................................................52
4.2.3.1. Construção da curva padrão..........................................................................52
4.2.3.2. Análise estatística............................................................................................53
4.2.3.3. Exatidão do método proposto........................................................................53
4.2.3.4. Precisão do método........................................................................................54
4.2.3.5. Determinação de gatifloxacino nos comprimidos.......................................54
4.2.3.5.1. Preparo da solução de gatifloxacino substância de referência...............54
4.2.3.5.2. Preparo das amostra de comprimidos.......................................................55
4.2.4. Doseamento microbiológico..............................................................................56
4.2.4.1. Preparo das soluções-padrão..........................................................................57
4.2.4.2. Preparo das soluções de gatifloxacino na forma farmacêutica...................58
4.2.4.3. Preparo do inóculo..........................................................................................58
4.2.4.4. Ensaio...............................................................................................................58
4.2.4.5. Cálculo da potência do medicamento...........................................................60
4.2.4.6. Construção da curva padrão..........................................................................60
4.2.4.7. Exatidão do método.........................................................................................60
4.2.4.7.1. Preparo das soluções....................................................................................60
4.2.4.8. Precisão do método..........................................................................................62
4.2.5. Cromatografia de camada delgada ..................................................................62
4.2.5.1. Preparo das placas......................................................................................62
4.2.5.2. Preparo da solução-padrão de gatifloxacino............................................62
4.2.5.3. Preparo da solução amostra de gatifloxacino..............................................62
4.2.5.4. Preparo da solução de esparfloxacino..........................................................63
4.2.5.5. Preparo de solução de ciprofloxacino...........................................................63
4.2.5.6. Preparo de solução de lomefloxacino............................................................63
4.2.5.7. Preparo da solução de levofloxacino..............................................................63
4.2.5.8. Sistemas de fases móveis.................................................................................64
4.2.5.9. Ensaio..............................................................................................................64
4.2.5.10. Execução do ensaio com as cinco fluorquinolonas....................................64
4.2.6. Espectrofotometria de absorção na região de infravermelho.......................65
4.2.7. Análise térmica de gatifloxacino......................................................................65
5. RESULTADOS.........................................................................................................66
5.1. Doseamento de gatifloxacino em meio não-aquoso utilizando ácido perclórico 0,1 M
em meio de ácido acético glacial......................................................................66
5.1.1. Teste de recuperação de gatifloxacino na análise titrimétrica......................66
5.1.2. Precisão do método em análise titrimétrica....................................................67
5.1.3.Teor de gatifloxacino nos comprimidos............................................................67
5.2. Metodologia analítica por espectrofotometria na região UV............................68
5.2.1. Espectro de absorção da substância de referência GATX ............................68
5.2.2. Curva de Ringbom de GATX utilizando água deionizada como solvente...69
5.2.3. Construção da curva padrão de GATX utilizando água deionizada como
solvente. ......................................................................................................................71
5.2.4. Análise estatística .............................................................................................73
5.2.5. Parâmetros do tratamento estatístico sobre os valores experimentais obtidos para
a curva padrão....................................................................................................78
5.2.6. Teste de recuperação para GATX ..................................................................79
5.2.7. Precisão do método...........................................................................................79
5.2.8.Valores experimentais obtidos na determinação do teor de gatifloxacino nos
comprimidos por espectrofotometria na região UV. ..............................................80
5.3. Cromatografia líquida de alta eficiência...........................................................80
5.3.1. Cromatograma de GATX-SR e GATX-comp. ...............................................80
5.3.2. Curva padrão.....................................................................................................82
5.3.3. Análise estatística ..............................................................................................84
5.3.4. Parâmetros do tratamento estatístico sobre os valores experimentais obtidos para
a curva padrão.....................................................................................................89
5.3.5. Teste de recuperação para GATX ...................................................................90
5.3.6. Precisão do método a partir dos valores experimentais obtidos na determinação
de gatifloxacino nos comprimidos por CLAE....................................91
5.3.7.Teor dos comprimidos em CLAE.......................................................................92
5.4. Doseamento microbiológico .................................................................................93
5.4.1. Doseamento microbiológico de gatifloxacino em delineamento 3 x 3............93
5.4.2. Análise estatística do doseamento microbiológico...........................................99
5.4.3. Curva padrão de GATX do no doseamento microbiológico .......................102
5.4.4. Construção da curva padrão de GATX-SR no doseamento microbiológico pelo
método de difusão em ágar, cilindros em placa ..............................................103
5.4.5. Teste de recuperação de gatifloxacino no doseamento
microbiológico.............................................................................................................104
5.4.6. Potência dos comprimidos de gatifloxacino no doseamento
microbiológico.............................................................................................................105
5.5. Identificação de gatifloxacino em cromatografia de camada delgada............105
5.6. Identificação de gatifloxacino utilizando a cromatografia em camada delgada e
diferenciação deste fármaco frente a outras fluorquinolonas............................112
5.7. Espectro de absorção na região do infravermelho..........................................119
5.8. Análise térmica de gatifloxacino.......................................................................121
6. DISCUSSÃO..........................................................................................................126
6.1. Desenvolvimento de metodologia analítica por titrimetria em meio
não-aquoso..........................................................................................................................1
29
6.2. Desenvolvimento e validação de metodologia analítica em espectrofotometria
UV...............................................................................................................................130
6.3. Doseamento de gatifloxacino de difusão em ágar cilindros em placa ..........132
6.4. Cromatografia em camada delgada..................................................................134
6.5. Cromatografia líquida de alta eficiência..........................................................137
6.5. Espectro de absorção na região de infravermelho e análise térmica.............139
7. CONCLUSÃO.........................................................................................................138
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................141
LISTA DE ABREVIATURAS
ANVISA – Agência nacional de vigilância sanitária
BV – Balão volumétrico
CCD – Cromatografia em camada delgada
CIPX - Ciprofloxacino
CLAE - Cromatografia líquida de alta eficiência
DSC – Calorimetria exploratória diferencial
GATX-SR - Gatifloxacino substância de referência
GATXcomp - Gatifloxacino comprimidos
LEVX - Levofloxacino
LOME – Lomefloxacino
Rf – fator de resposta
THF - Tetrahidrofurano
UV- Ultravioleta
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura geral de quinolona ..........................................................................4
Figura 2. Estrutura química de norfloxacino..................................................................4
Figura 3. Estrutura química ciprofloxacino....................................................................5
Figura 4. Estrutura química lomefloxacino....................................................................5
Figura 5. Estrutura química de esparfloxacino...............................................................5
Figura 6. Estrutura química de levofloxacino.................................................................5
Figura 7. Estrutura química de ofloxacino .....................................................................5
Figura 8. Estrutura química de moxifloxacino................................................................5
Figura 9. Estrutura química de gatifloxacino..................................................................6
Figura 10. Estrutura química tridimensional de gatifloxacino......................................36
Figura 11. Representação do preparo das soluções da amostra utilizada no método
espectrofotométrico na região de ultravioleta a 287 nm................................................47
Figura 12. Delineamento 3 x 3, demonstrando a disposição das soluções padrão (P) e
amostra (A) na placa de Petri, onde P1 (4 µg/mL); P2 (8 µg/mL); P3 (16 µg/mL) e A1 (4
µg/mL); A2 (8 µg/mL); A3 (16 µg/mL)..........................................................................56
Figura 13. Espectro de absorção de solução de GATX-SR, na concentração de 24 g/mL,
por espectrofotometria na região do UV, utilizando água deionizada como
solvente...........................................................................................................................65
Figura 14. Curva de Ringbom para gatifloxacino substância de referência utilizando água
deionizada como solvente.....................................................................................67
Figura 15. Representação gráfica da curva padrão e o coeficiente de correlação das soluções
de gatifloxacino em concentrações de 4,0 a 14,0 µg/mL pelo método espectrofotométrico na
região de ultravioleta a 287nm. ...............................................69
Figura 16. Cromatograma obtido por CLAE para solução aquosa de GATX-SR (A) e
comprimidos (B) (12 g/mL). Fase móvel: ácido acético 5%: metanol: acetonitrila
(70:15:15); coluna phenomenex C18 (250 x 4,6 mm); tempo de retenção 4,5 min......80
Figura 17. Representação gráfica da curva padrão e o coeficiente de correlação das soluções
de gatifloxacino em concentrações de 4,0 a 14,0 µg/mL pelo método em CLAE, com
detecção à 287 nm. ..................................................................................83
Figura 18. Curva padrão do GATX-SR obtida no doseamento microbiológico em difusão em
ágar, cilindros em placa............................................................................103
Figura 19. Cromatogramas do sistema solvente diclorometano: metanol: hidróxido de
amônio: acetonitrila (6:4:1:2, V:V:V:V) analisado...................................................105
Figura 20. Cromatograma no sistema solvente diclorometano: metanol: acetonitrila: ácido
acético 5% (6:4:4:2, V:V:V:V)........................................................................106
Figura 21. Cromatograma de diclorometano: metanol: acetonitrila: ácido acético 5%
(6:4:2:2, V:V:V:V)...................................................................................................107
Figura 22. Cromatograma do sistema clorofórmio: metanol: ácido fórmico: água (16:7:3:0,5,
V:V:V:V) analisado..................................................................................108
Figura 23. Cromatograma do sistema clorofórmio: metanol: ácido fórmico (18:7:1, V:V:V)
analisado.........................................................................................................109
Figura 24. Cromatograma do sistema clorofórmio: metanol: ácido fórmico: água (33:7:3:0,5,
V:V:V:V) analisado.................................................................................110
Figura 25. Cromatograma do sistema n-butanol: ácido acético: água (40:10:50, V:V:V)
analisado.......................................................................................................................111
Figura 26. Cromatograma das cinco fluorquinolonas (GATX, SPAX, CIPX, LOME, LEVX)
em sistema solvente clorofórmio: metanol: ácido fórmico: água (16:7:3:0,5,
V:V:V:V)......................................................................................................................112
Figura 27. Cromatograma das cinco fluorquinolonas (GATX, SPAX, CIPX, LOME, LEVX)
em sistema solvente clorofórmio: metanol: ácido fórmico (18:7:1,
V:V:V)..........................................................................................................................113
Figura 28. Cromatograma das cinco fluorquinolonas (GATX, SPAX, CIPX, LOME, LEVX)
em sistema solvente clorofórmio: metanol: ácido fórmico: água (33:7:3:0,5, V:V:V:V).
....................................................................................................................114
Figura 29. Cromatograma das cinco fluorquinolonas (GATX, SPAX, CIPX, LOME, LEVX)
em sistema solvente diclorometano: metanol: acetonitrila: ácido acético 5% (6:4:4:2,
V:V:V:V). .....................................................................................................115
Figura 30. Cromatograma das cinco fluorquinolonas (GATX, SPAX, CIPX, LOME, LEVX)
em sistema solvente diclorometano: metanol: acetonitrila: ácido acético 5% (6:4:2:2,
V:V:V:V). .....................................................................................................116
Figura 31. Cromatograma das cinco fluorquinolonas (GATX, SPAX, CIPX, LOME, LEVX)
em sistema solvente butanol: ácido acético 5%:água (40:10:50, V:V:V).......117
Figura 32. Cromatograma das cinco fluorquinolonas (GATX, SPAX, CIPX, LOME, LEVX)
em sistema solvente diclorometano: metanol: hidróxido de amônio: acetonitrila (6:4:1:2,
V:V:V:V). .....................................................................................................118
Figura 33. Espectro na região do infravermelho para GATX-SR em pastilha de
KBr...............................................................................................................................119
Figura 34. Espectro de absorção na região do infravermelho de GATX-comp. em pastilha de
KBr.............................................................................................................120
Figura 35. Curva de DSC de gatifloxacino substância de referência sob atmosfera de
nitrogênio, em razões de aquecimento de 20o C...........................................................121
Figura 36. Curva de DSC de gatifloxacino na forma farmacêutica comprimidos sob
atmosfera de nitrogênio, em razões de aquecimento de 20o C.....................................122
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Determinações requeridas para o processo de validação, seguindo diretrizes da
ICH...........................................................................................................................34
Tabela 2. Preparação das soluções para obtenção da curva padrão de gatifloxacino por meio
de espectrofotometria no UV a 287 nm, em água
deionizada......................................................................................................................44
Tabela 3. Preparação das soluções para o teste de recuperação aplicado à amostra de
gatifloxacino para o método espectrofotométrico na região UV a 287 nm, em água
deionizada. ....................................................................................................................45
Tabela 4. Condições cromatográficas utilizadas no método por CLAE........................49
Tabela 5. Soluções-padrão de gatifloxacino utilizadas na obtenção da curva padrão em
CLAE..............................................................................................................................50
Tabela 6. Preparação das soluções para o teste de recuperação aplicado à amostra de
gatifloxacino para método por CLAE............................................................................51
Tabela 7. Parâmetros utilizados para a avaliação de gatifloxacino por ensaio microbiológico -
método de difusão em ágar- cilindros em
placas..............................................................................................................................53
Tabela 8. Parâmetros estabelecidos na padronização de gatifloxacino no ensaio
microbiológico................................................................................................................54
Tabela 9. Preparação das soluções para análise do teste de recuperação para gatifloxacino no
doseamento microbiológico difusão em ágar cilindros em
placa...............................................................................................................................58
Tabela 10. Valores obtidos no doseamento de GATX-comp em meio não-aquoso utilizando
a titrimetria com ácido perclórico 0,1 M em ácido acético glacial................63
Tabela 11. Teste de recuperação de gatifloxacino na forma farmacêutica comprimidos
obtidos pela titulação em meio não-aquoso utilizando ácido perclórico 0,1 M em ácido
acético glacial. ...............................................................................................................63
Tabela 12. Valores experimentais da amostra obtidos no doseamento titrimétrico.....64
Tabela 13. Valores obtidos para construção da curva de Ringbom para GATX-SR em água
deionizada..............................................................................................................66
Tabela 14. Valores experimentais obtidos na construção da curva padrão para GATX
........................................................................................................................................68
Tabela 15. Parâmetros estatísticos obtidos na construção da curva padrão para GATX-SR,
utilizando água deionizada. ....................................................................................70
Tabela 16. Desvio de linearidade dos valores experimentais utilizados na construção da curva
padrão para gatifloxacino.....................................................................................71
Tabela 17. Análise variância (ANOVA) dos valores experimentais utilizados para a obtenção
da curva padrão...............................................................................................72
Tabela 18. Valores experimentais utilizados para o cálculo do coeficiente de correlação da
curva de calibração do método espectrofotométrico de gatifloxacino na região UV.
........................................................................................................................................73
Tabela 19. Análise de variância das absorvâncias determinadas na obtenção da curva padrão
de gatifloxacino em espectrofotometria UV......................................................74
Tabela 20. Parâmetros do tratamento estatístico sobre os valores experimentais obtidos para
a curva padrão. ......................................................................................................75
Tabela 21. Valores experimentais obtidos no teste de recuperação para GATX-SR utilizando
a espectrofotometria UV a 287 nm. .............................................................76
Tabela 22. Valores experimentais dos comprimidos, obtidos por espectrofotometria na
região UV e a precisão do método representado pelo coeficiente de
variação...........................................................................................................................77
Tabela 24. Valores experimentais dos comprimidos, obtidos por espectrofotometria na
região UV. .....................................................................................................................80
Tabela 25. Áreas absolutas obtidas para construção da curva padrão por CLAE........82
Tabela 26. Parâmetros estatísticos obtidos na construção da curva padrão para GATX-SR,
utilizando água deionizada, em CLAE....................................................................84
Tabela 27. Desvio de linearidade dos valores experimentais utilizados na construção da curva
padrão para gatifloxacino em CLAE....................................................................85
Tabela 28. Análise variância (ANOVA) dos valores experimentais utilizados para a obtenção
da curva padrão em CLAE.............................................................................86
Tabela 29. Valores experimentais utilizados para o cálculo do coeficiente de correlação da
curva de calibração em CLAE...................................................................................87
Tabela 30. Análise de variância das absorvâncias determinadas na obtenção da curva padrão
de gatifloxacino em CLAE...............................................................................88
Tabela 31. Parâmetros do tratamento estatístico sobre os valores experimentais obtidos para
a curva padrão em CLAE. ....................................................................................89
Tabela 32. Valores experimentais obtidos no teste de recuperação para GATX-SR em
CLAE. ..........................................................................................................................90
Tabela 33. Valores experimentais dos comprimidos, obtidos por CLAE...................91
Tabela 34. Teor de gatifloxacino nos comprimidos em CLAE. ................................92
Tabela 35. Valores correspondente ao ensaio da amostra 1, no doseamento de gatifloxacino
(comprimido), difusão em ágar cilindros em placa, delineamento 3 x 3..
......................................................................................................................................93
Tabela 36. Valores correspondente ao ensaio da amostra 2, no doseamento de gatifloxacino
comprimido, difusão em ágar cilindros em placa, delineamento 3 x 3...95
Tabela 37. Valores correspondente ao ensaio da amostra 3, no doseamento de gatifloxacino
comprimido, difusão em ágar cilindros em placa, delineamento 3 x 3....97
Tabela 38.Valores resultante da análise estatística do ensaio da amostra 1 (Tabela 35), no
doseamento de gatifloxacino, difusão em ágar cilindros em placa, delineamento 3 x
3....................................................................................................................................99
Tabela 39. Valores resultantes da análise estatística do ensaio da amostra 2 (Tabela 34), no
doseamento de gatifloxacino, difusão em ágar cilindros em placa, delineamento 3 x
3..............................................................................................................................100
Tabela 40. Valores resultantes da análise estatística do ensaio da amostra 3 (Tabela 35), no
doseamento de gatifloxacino, difusão em ágar cilindros em placa, delineamento 3 x 3.
............................................................................................................................101
Tabela 41. Valores médios obtidos no doseamento microbiológico de gatifloxacino, em
difusão em ágar cilindros em placa, para obtenção da curva de calibração...........102
Tabela 42. Valores experimentais obtidos no doseamento microbiológico de gatifloxacino no
teste de recuperação para o ensaio das três amostras (R1, R2 e R3)...104
Tabela 43. Valores experimentais obtidos para o teste de recuperação de gatifloxacino no
doseamento microbiológico difusão em ágar cilindros em placa............................104
Tabela 44. Valores experimentais obtidos para o doseamento de comprimidos de
gatifloxacino, através do ensaio microbiológico difusão em ágar, cilindros em
placa..............................................................................................................................105
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Cálculo da potência de gatifloxacino no ensaio da amostra 1, no doseamento
microbiológico em difusão em ágar cilindros em placa.............................95
Quadro 2. Cálculo da potência de gatifloxacino no ensaio da amostra 1, no doseamento
microbiológico em difusão em ágar cilindros em placa.............................97
Quadro 3. Cálculo da potência de gatifloxacino no ensaio da amostra 1, no doseamento
microbiológico em difusão em ágar cilindros em placa.............................99
RESUMO
As quinolonas constituem um grupo de antimicrobianos de largo espectro de ação, sendo
utilizadas no tratamento de infecções causadas por bactérias Gram-positivas, Gram-negativas
e contra microrganismos pouco sensíveis a muitos fármacos. O gatifloxacino é um
antimicrobiano da classe das fluorquinolonas, de geração avançada, com um amplo espectro
de ação, tanto para bactérias Gram-positivas, Gram-negativas, anaeróbios, bactérias atípicas e
fastidiosas, bem como micobactérias. O uso abusivo de antimicrobianos, nos últimos anos,
favoreceu o aparecimento de várias cepas resistentes a antibióticos, fazendo com que a
indústria farmacêutica investisse no mercado de desenvolvimento de novas moléculas com
atividade antimicrobiana, as quais mostrassem um amplo espectro de ação contra várias
bactérias. O gatifloxacino, um novo agente antimicrobiano, é um promissor fármaco contra
várias patologias, inclusive tuberculose. O gatifloxacino, até o presente momento, não possui
monografia oficializada. A proposta deste trabalho consiste em desenvolver e validar
metodologias analíticas para matéria-prima e a forma farmacêutica comprimidos, utilizando:
(i) titrimetria em meio não-aquoso utilizando ácido perclórico 0,1 M em meio de ácido
acético glacial, em que obtivemos precisão e exatidão, com um coeficiente de variação médio
de 0,32% para os comprimidos e também um teor médio de 100,42% (ii) espectrofotometria
na região do UV a 287 nm, na faixa de concentração de 4,0 a 14,0 µg/mL, cuja análise
apresentou linearidade, precisão e exatidão, com teor médio nos comprimidos de 98,32 %;
(iii) CLAE, em que utilizamos como fase estacionária uma coluna de C18 de fase reversa, e
fase móvel com a seguinte composição, ácido acético 5%: metanol: acetonitrila (70:15:15,
V/V/V), onde obtivemos linearidade, precisão, exatidão e especificidade, com um teor médio
obtido nos comprimidos de 99,84 % (iv) determinação da potência microbiológica, pelo
método de difusão em ágar cilindros em placa, utilizando cepas de Bacillus subtilis ATCC
9372, em que obtivemos um teor médio nos comprimidos de 100,29%. Os resultados foram
analisados estatisticamente pela análise da variância (ANOVA), que permite a aplicação dos
métodos analíticos no controle de qualidade de preparações farmacêuticas. Para a
identificação do fármaco, foram utilizadas técnicas como espectrofotometria no
infravermelho, cromatografia em camada delgada e análise térmica.
ABSTRACT
The quinolones constitute a group of antibiotics of wide spectrum of action, being used in the
treatment of infections caused by Gram-Negative, Gram-Positive bacteria and against
microorganisms sensible to many drugs. Gatifloxacin is an antibiotic of the class of the
fluoroquinolones with a broad spectrum of action, as much for Gram-Negative,
Gram-Positive bacteria, anaerobic, atypical and fastidious bacteria, as well as mycobacteria.
In the last years, the abusive use of antibiotics favored the appearance of several resistant
strains to antibiotics, making with that the pharmaceutical industry invested in the market of
development new molecule with antimicrobial activity, which showed a broad spectrum of
action against some bacteria. Gatifloxacin, an advanced generation of fluoroquinolones, is an
excellent drug useful in several pathologies, inclusive tuberculosis. This fluoroquinolone, until
the present moment, does not possess officially established monograph. The proposal of this
work consists of developing and validation of analytical methods for raw material and tablets,
using: (i) Nonaqueous titration of gatifloxacin in pharmaceutical formulations using perchloric
acid 0.1 M in glacial acetic environment of acid, in that we obtain precision and accuracy,
with a coefficient of variation of 0.32%; (ii) spectrophotometric procedure at 287 nm was
developed for raw material and tablets. The Lambert-Beer law was obeyed in the
concentration range of 4.0 to 14.0 µg/mL. The UV-analysis describes a precise and accurate
method, with medium content compressed of 98.32%; (iii) HPLC, in that we utilize like
stationary phase a C18 column, and mobile phase with the following composition, acetic acid
5%: methanol: acetonitrile (70:15:15, V/V/V), where do we obtain linearity, precision,
accuracy and specificity, with a 99.84% medium content. Method validation included range,
linearity, precision, accuracy, specificity and recovery; (iv) determination from the
microbiological assay, for the method of diffusion in agar cylinders in plate, using strains of
Bacillus subtilis ATCC 9372. The results were analyzed statistically by the analysis of the
variance (ANOVA), that it allows the application of the analytical methods in the quality
control of pharmaceutical preparations. A prospective validation showed that the method was
linear, precise and accurate. For the identification of gatifloxacin, infrared spectrometry, thin
layer chromatography and thermal analysis were utilized. The proposed qualitative and
quantitative methods are simple and adequate to be used in pharmaceutical laboratory routine
analysis.
1. Introdução
De acordo com a literatura, o gatifloxacino é uma fármaco com um amplo espectro de
ação contra bactérias Gram-positivas, Gram-negativas, anaeróbias e bactérias que se
mostraram resistentes a vários fármacos contra doenças comumente conhecidas pela
comunidade médica, como pneumonia e tuberculose. A excelente biodisponibilidade oferece
maior segurança no tratamento e a facilidade na posologia (administração 1 vez ao dia),
conferindo maior adesão ao tratamento pelo paciente. O gatifloxacino é classificado como
uma fluorquinolona, de amplo espectro de ação, e por alguns autores, como sendo de quarta
geração. O gatifloxacino é um fármaco bastante estudado farmacologicamente e quanto aos
aspectos de ação microbiológica, mas existem poucos resultados na literatura em relação ao
desenvolvimento de metodologia analítica para esta substância, e até o momento, não há
monografia oficial deste fármaco.
Trabalhos científicos envolvendo este fármaco começaram a ser publicados em 1990, e
os resultados positivos, levaram este fármaco rapidamente ao mercado farmacêutico mundial.
O controle de qualidade na indústria farmacêutica para identificação do teor de principio
ativo, é de fundamental importância para garantir a qualidade do produto final, e
consequentemente confirmar a qualidade do medicamento comercializado ao
consumidor/paciente.
Esta dissertação teve por objetivo desenvolver metodologias analíticas para o
gatifloxacino, incluindo análises físico-químicas e microbiológicas, bem como dispor de
técnicas de identificação qualitativa para forma farmacêutica comprimido e matéria-prima.
O gatifloxacino é comercializado no Brasil, na forma farmacêutica comprimidos e
solução injetável, com o nome de Tequin®, pelo laboratório Bristol-Myers Squibb. Esse
medicamento ainda se encontra sobre patente e o seu registro foi aprovado e liberado para
comercialização pelo FDA em 17 de dezembro de 1999 (FDA, 2003). Recentemente, em 28
de março de 2003, foi aprovado e liberado para comercialização pelo FDA o Zymar®, colírio
contendo como substância ativa o gatifloxacino, e comercializado pela indústria farmacêutica
Allergan produtos farmacêuticos LTDA. Apesar da comprovada eficácia e segurança no seu
tratamento, este fármaco, até então, não possui uma metodologia de análise padronizada em
compêndios oficiais. Este fato justifica novas pesquisas nessa área para desenvolvimento de
metodologia analítica para esta fluorquinolona.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Quinolonas e Fluorquinolonas
As quinolonas representam uma classe de antimicrobianos composta por fármacos
estruturalmente semelhantes, sintéticos e altamente eficazes, utilizadas no tratamento de
várias infecções, causadas por bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.
O desenvolvimento das quinolonas teve início com o ácido nalidíxico (LESHER et al.,
1962), fármaco utilizado somente no tratamento de infecção urinária, devido às suas limitadas
propriedades farmacocinéticas. Desde a síntese do ácido nalidíxico, numerosas pesquisas têm
sido realizadas, a fim de melhorar a potência e o espectro de atividade antimicrobiana
(ASAHINA et al., 1992), uma vez que esse precursor possui utilidade terapêutica limitada e
facilidade no desenvolvimento de resistência bacteriana (MANDELL e PETRI Jr., 1996). O
núcleo quinolônico e o grupo carboxila (Figura 1) na posição 3 são comuns a esta classe de
compostos, sendo, freqüentemente, chamadas de quinolonas. Os derivados diferem entre si
nos substituintes do anel e da cadeia lateral. A introdução do grupo piperazínico, além de
reduzir a neurotoxicidade e melhorar a estabilidade de metabólitos, confere atividade contra
Pseudomonas aeruginosa (APPELBAUM e HUNTER, 2000; BERTINO e FISH, 2000).
Com este objetivo surgiu, em 1978, o norfloxacino (Figura 2), que possui um átomo de
flúor na posição 6 e um grupamento piperazínico na posição 7 do anel quinolônico. As
quinolonas que possuem um átomo de flúor na posição 6 são designadas por fluorquinolonas.
Estes substituintes aumentaram a potência e o espectro de atividade (GOLDSTEIN,
1987), dando início à nova era de derivados quinolônicos (KOGA et al., 1980). Em vários
trabalhos verifica-se que este grupo de fluorquinolonas possui baixa potência contra
Streptococcus pneumoniae (GORDON e KAUFFMAN, 1990; BARTLETT e MUNDY,
1995; ZHANNEL et al., 1999), constituindo um importante obstáculo para a sua maior
utilização em infecções respiratórias, especialmente as formas adquiridas na comunidade, em
que o pneumococo representa o agente etiológico mais freqüente (MUNDY et al., 1995;
RUIZ et al., 1999). O ciprofloxacino (Figura 3) é uma fluorquinolona especialmente eficaz
contra Pseudomonas aeruginosa. Após a introdução no mercado de antimicrobianos, como
Figura
Figura 2. Estrutura química de norfloxacinoFigura 1. Estrutura geral das
norfloxacino e ciprofloxacino (Figura 3), surgiram várias fluorquinolonas, como:
lomefloxacino (Figura 4), esparfloxacino (Figura 5), levofloxacino (Figura 6), ofloxacino
(Figura 7), moxifloxacino (Figura 8) entre outras, todas comercializadas no Brasil, exceto o
esparfloxacino.
As Figuras 3 a 8 apresentam as estruturas químicas das fluorquinolonas
Figura 3. Estrutura química Figura 4. Estrutura química
2.2. Gatifloxacino
Recentemente surgiu um novo grupo de quinolonas, classificadas como de terceira
geração, ou quinolonas de geração avançada. O gatifloxacino é a 1-ciclopropil-
6-flúor-7-piperazina-8-metóxi-fluorquinolona (Figura 9), que possui um amplo espectro de
ação contra bactérias Gram-negativas e Gram-positivas (HOSAKA et al., 1992;
BAUERNFEIND, 1997; WISE et al., 1997; JONES e PFALLER, 1998; DIEKEMA et al.,
Figura 5.Estrutura química de
Figura 6. Estrutura química de
Figura 8. Estrutura química deFigura 7. Estrutura químicade ofloxacino
1999; BLONDEAU et al., 2000) e também contra muitos organismos atípicos
(BLONDEAU, 1999), bem como micobactérias (DONG et al., 1998).
Este fármaco tem três importantes substituições estruturais: uma metil-piperazina no
carbono 7, um grupamento metóxi na posição 8 e um grupamento ciclopropila no anel N-1.
E s t a s mudanças estruturais têm
expandido o espectro de ação,
incluindo organismos Gram-positivos e alguns anaeróbios, melhorando a eficácia in vivo,
aumentando a potência, a meia-vida e a biodisponibilidade oral e reduzindo significativamente
o risco de fototoxicidade e reações adversas no sistema nervoso central (DOMAGALA,
1994).
Lu e col. (1999) verificaram que o grupo metoxila no carbono 8 (C-8) contribuía para o
aumento da atividade do gatifloxacino contra DNA-girase de cepas mutantes e resistentes a
outras quinolonas. Além disto, este substituinte aumentou a letalidade nas infecções causadas
por Staphylococcus aureus (ZHAO et al., 1998). Em 2001, Yamamoto e col., demonstraram
em estudo in vitro, comparativo com outras fluorquinolonas, que, todas possuíam potencial
fototóxico. No entanto, o gatifloxacino demonstrou um potencial não fototóxico para
nenhum dos três métodos in vitro analisados (citotoxicidade contra células mamárias, lise de
Figura 9. Estrutura química de gatifloxacino
eritrócitos e quebra do DNA). Estes resultados correspondem às observações relatadas por
Matsumoto et al. (1992), Marutani et al. (1993) e Rosen et al. (1997) de que fluorquinolonas
com um grupo metoxila na posição 8 do anel quinolônico são resistentes à fotoirradiação e
não induzem à fototoxicidade.
Em estudos farmacocinéticos verificou-se uma excelente biodisponibilidade, com
meia-vida de 7-8 horas e a concentração sérica máxima de 3,35 a 5,41 g/mL em doses de
400 mg e 600 mg, respectivamente; apenas uma pequena proporção (20%) do fármaco
apresenta ligação protéica (NAKASHIMA et al., 1995). Em muitos tecidos, a concentração
de gatifloxacino é mais alta do que no soro. Níveis até duas vezes à concentração encontrada
no soro são detectáveis na mucosa brônquica, no parênquima pulmonar, na mucosa sinusal
(GRASELA, 2000) e na próstata (NABER et al., 2001).
O gatifloxacino penetra adequadamente no líquor, mesmo na ausência de inflamação
meníngea, e é efetivo como simples agente na terapia experimental de meningite, causada por
Streptococcus pneumoniae resistente à cefalosporina (LUTSAR et al., 1998), e igualmente
eficaz na terapia experimental de meningite causada por Escherichia coli (LUTSAR et al.,
1999).
Em estudos farmacodinâmicos com o gatifloxacino, verificou-se que o fármaco,
encontrava-se em altas concentrações intracelulares nas células infectadas por um patógeno.
Esta característica é muito importante na eficácia clínica contra patógenos intracelulares
facultativos ou obrigatórios como Staphylococcus aureus, Legionella spp e Mycobacterium
spp. Yamamoto e col., em 1996, verificaram que a concentração intracelular do gatifloxacino,
em células fagocitárias, foi maior que a concentração extracelular, sugerindo que este
fármaco pode ser utilizado, com sucesso, no tratamento de infecções causadas por patógenos
intracelulares, como o Mycobacterium tuberculosis.
A tuberculose é uma doença endêmica, que até o final dos anos 80, parecia estar
controlada. Nos últimos anos, a tuberculose passou a ser um problema mundial, devido a
vários fatores epidemiológicos, como: debilitação imunológica provocada pelo vírus da AIDS
(GARCÍA et al., 1994), desenvolvimento e disseminação de cepas multi-resistentes aos
fármacos utilizados na terapia, e a elevada imigração no mundo têm contribuído para a
disseminação mais rápida da doença (CROFTON, 1997; DUNCAN, 1997).
Estima-se que 2 bilhões de pessoas estejam infectadas com M. tuberculosis e com
outras espécies de Mycobacterium, e que 3 milhões morram anualmente por complicações da
doença em todo mundo (SHINNICK et al., 1995).
Quinolonas de geração avançada são recomendadas como fármacos de segunda escolha
para o tratamento de cepas multi-resistentes a antimicrobianos, apresentando potente
atividade contra o Mycobacterium tuberculosis (ZHAO et al., 1999; SINDELAR et al.,
2000).
Em estudos comparativos de gatifloxacino com quinolonas de geração avançada
verificou-se que este fármaco exibiu uma atividade muito potente contra M. tuberculosis, e
foi 8 vezes mais ativo contra cepas de M. tuberculosis multi-resistentes a fármacos
(MDR-TB), sugerindo que esta fluorquinolona poderia ser utilizada em controle clínico da
MDR-TB (TOMIOKA et al., 1999). É necessário solidificar no mercado mundial,
antimicrobianos potentes e que tenham comprovada eficácia clínica para combater as
micobactérias.
O gatifloxacino também demonstrou comprovado resultado clínico na pneumonia
adquirida na comunidade (PAC), que constitui um sério problema de saúde entre adultos,
mundialmente. Os organismos mais comumente responsáveis pela PAC são Streptococcus
pneumoniae, Haemophilus influenzae e Moraxella catarrhalis (THORNSBERRY et al.,
2002). Também são importantes os agentes atípicos, particularmente Mycoplasma
pneumoniae, Chlamydia pneumoniae e Legionella spp (HONEYBOURNE, 2001; MARRIE
et al., 1996). Recentemente, a prevalência mundial de cepas de S. pneumoniae resistentes à
penicilina (JONES e PFALLER, 1998; MOSS e FINCH, 2000), continua sendo um sério
problema no ambiente clínico.
A resistência a outros agentes antimicrobianos, como cefalosporinas, macrolídeos e
sulfametoxazol-trimetoprima também tem aumentado (HOBAN et al., 2001;
THORNSBERRY et al., 2002). A emergência de cepas multi-resistentes a certos fármacos
tem proporcionado a necessidade de alternativas terapêuticas para tratar a PAC (COYLE et
al., 2001; FUNG-TOMC et al., 2001). Em estudos, verificou-se que o gatifloxacino possui
uma potente atividade antipneumonoccal (HOELLMAN et al., 1999; ODLAND et al., 1999)
e a seleção de cepas mutantes é menos freqüente do que outras fluorquinolonas (FUKUDA et
al., 2001).
Este fármaco possui excelente atividade contra todas as espécies de estreptococos
(JONES et al., 1999), bem como para H. influenzae e M. catarrhalis (JONES et al., 1999;
LODE e ALLEWETT, 2002), sendo também uma alternativa de tratamento para infecções
por Streptococcus pneumoniae penicilina resistente (TOMIZAWA et al., 1998), que são
associados com uma alta concentração inibitória mínima (CIM) para beta-lactâmicos
(inclusive cefalosporinas) e macrolídeos (FILE , 1999).
Para êxito no combate às doenças causadas por bactérias anaeróbias, é necessária a
seleção de agentes antimicrobianos adequados ao tratamento. As bactérias anaeróbias que
devem ser analisadas e estudadas são aquelas que apresentam, freqüentemente, resistência a
certos agentes antimicrobianos e alta virulência (HECHT et al., 1999; ODOU et al., 2001;
PESTANA et al., 1999). A atividade do gatifloxacino foi avaliada em vários microrganismos
anaeróbios patogênicos, em diferentes estudos na literatura, verificando-se que o fármaco
possui excelente atividade para vários anaeróbios (ALEXANDER et al., 2000; EDNIE et al.,
1998; SCHAUMANN et al., 1999; WEXLER et al., 2001).
Apesar deste fármaco ser altamente estudado e pesquisado no que concerne à atividade
antimicrobiana, farmacocinética, farmacodinâmica, toxicidade e relação estrutura atividade,
há poucos estudos na literatura em relação ao desenvolvimento de metodologia analítica para
esta fluorquinolona, e pesquisas envolvendo métodos analíticos, são de fundamental
importância e altamente relevante para otimizar sua análise na indústria farmacêutica e
garantir a qualidade do produto a ser comercializado.
2.3. Doseamento microbiológico
O doseamento microbiológico pode empregar meio de cultura sólido inoculado,
distribuído em placas, em sistema de mono ou bicamada, através do qual a substância-teste se
difunde. A substância–teste é aplicada sobre a superfície deste meio, em cilindros de aço,
vidro ou porcelana, em orifícios ou discos de papel, e as placas são, então, incubadas.
O crescimento do microrganismo ocorre respeitando, porém, áreas onde tenha ocorrido
a difusão do antibiótico, gerando contraste e resultando a chamada zona de inibição de
crescimento. Tal fenômeno origina toda teoria que embasa o método de difusão. O emprego
de bicamada de meio de cultura, em que a camada basal busca uniformização, enquanto a de
superfície contém o inóculo, surgiu com o trabalho de Reilly e Sobers, em 1952, onde estes
pesquisadores estudaram a possibilidade do uso de ágar simples para camada basal. Para isso,
empregaram 15 mL de meio basal e após sua solidificação, 10 mL de meio nutriente
inoculado com microrganismo adequado para cada antibiótico.
O diâmetro das zonas de inibição produzido pela estreptomicina, metotrexato e
antibiótico 1377, colocados nas placas por meio de discos de papel, foi medido e comparado.
As zonas de inibição produzidas nas placas com ágar simples mostraram-se mais claras e
definidas.
Loo e colaboradores (1945) relataram que somente as substâncias hidrossolúveis
poderiam ser testadas pelo método de difusão em ágar. Entretanto, Stanly, em 1952, realizou
trabalho consistindo de tratamento de discos de papel de filtro com volume padronizado do
agente antimicrobiano em solvente orgânico de baixa solubilidade em água. Após evaporação
do solvente, os discos de papel foram colocados sobre o ágar para a incubação.
A Farmacopéia Brasileira 4a edição descreve a metodologia em difusão em ágar, assim
como procedimentos estatísticos aplicáveis aos ensaios biológicos. O ensaio por difusão,
desenvolvido para antibióticos, é fundamentalmente um método físico, no qual um
microrganismo é usado como revelador. O doseamento de difusão em ágar cilindros em placa
considera algumas variáveis quanto ao desenvolvimento do método, como: meio utilizado,
microrganismo, difusão da substância, temperatura de incubação, solução tampão, leitura e
cálculo dos resultados (COOPER, 1963; ANDREWS, 1999).
A difusão da substância no ágar é um fator fundamental para o desenvolvimento do
método. A substância analisada deve difundir no ágar, e a combinação de diferentes
condições técnicas permite evidenciar o fenômeno da difusão de substância de uma região
para outra, até que no tempo infinitamente longo haverá concentração constante da mesma.
Os estudos envolvendo ensaios de difusão para antibióticos eram inicialmente restritos, não
permitindo extrapolações abrangentes aos novos antimicrobianos que surgiam.
Assim, justificava a investigação dos fatores de interferência sobre zonas de inibição e
tratamento teórico quanto à inclinação das curvas dose-resposta. Este enfoque iniciou-se com
Cooper e Woodman, em 1946, que estudando a teoria de difusão em ágar utilizaram solução
de cristal violeta em tubos. Os autores pesquisaram a difusão de anti-sépticos e da penicilina
através do ágar e, quando utilizado o cilindro como reservatório da solução-teste
encontraram boa correlação entre o diâmetro da zona de inibição de crescimento estabelecido
teoricamente e àquele obtido na prática. Contudo, a fórmula derivada para o estudo
considerou a difusão linear e não radial.
No estudo de Humphrey e Lightbown (1952), considerou-se a difusão radial do
antibiótico em placas de Petri a partir de recipientes colocados na superfície do meio de
cultura, bem como a espessura da camada de ágar. A concentração do antibiótico ao redor da
fonte, onde colocado, pode ser expressa teoricamente por equação envolvendo a
concentração inicial e a uma dada distância, a espessura da camada de ágar, a constante de
difusão e o tempo envolvido. Os autores mostraram que a distância de difusão ao quadrado
estava relacionada com o logaritmo da espessura do ágar. Quando camadas do meio com
espessura menor que 1 cm foram utilizadas, o tamanho das zonas de inibição de crescimento
apresentava menor sensibilidade a variações deste elemento. Foram determinados também os
valores do tamanho do halo de inibição de crescimento após variar o período de difusão. O
fator determinante na inclinação da curva dose-resposta é a constante de difusão do
antibiótico, bem como o tempo, pois quando prolongado, poderia aumentar a inclinação.
A constante de difusão do antibiótico no meio de cultura foi estabelecida por Friedman
e Kraemer (1930) através de dados obtidos experimentalmente. No trabalho de Humphrey e
Lightbown (1952), foi verificado que a expressão teórica daqueles autores estava incorreta,
pois a validade da equação foi testada pelo estudo da distância de difusão esperada para
vários antibióticos, com diferentes períodos de pré-difusão.
Com a equação proposta para estudo da difusão, Cooper e Woodman (1946)
relacionaram o diâmetro da zona de inibição a certos parâmetros usados para avaliar a
influência das variações técnicas dos ensaios. Analisaram o tempo de pré-difusão, densidade
do inóculo em relação à sua influência sobre o tamanho dos halos, composição e espessura do
meio de cultura.
Num estudo similar, Brady e Katz (1990), consideraram a constituição do meio, volume
do cilindro, espessura de ágar e temperatura de incubação como sendo fatores que
determinam a otimização do ensaio. Os autores verificaram que ao diminuir a temperatura de
incubação e nível de nutrientes normalmente utilizados, as zonas de inibição foram maiores,
utilizando clortetraciclina e Bacillus cereus. A espessura do ágar foi o fator que mais
influenciou a variabilidade da resposta, pois quanto mais fina a camada, maior o efeito do
volume contido no cilindro sobre a distância de difusão. O conteúdo dos cilindros, desde que
integralmente preenchidos com a solução, pouco influenciou a inclinação da curva
dose-resposta.
A concentração crítica e população crítica são decisivas na definição da posição do
limite da zona de inibição de crescimento. A concentração crítica corresponde à concentração
mínima capaz de inibir o crescimento da população microbiana em questão. Segundo Hewitt
(1977), a concentração crítica é 4 vezes maior em relação à concentração inibitória mínima. O
tempo crítico, isto é, o tempo de incubação no qual o tamanho dos halos são definidos, é
dependente da fase “lag” de crescimento e do tempo de geração do microrganismo, sendo,
portanto, dependente também da temperatura e do tamanho do inóculo inicial. Por outro
lado, a concentração do antibiótico não interfere no tempo crítico (HEWITT, 1977). Assim,
concentração crítica e população crítica são decisivas na definição da posição do limite da
zona de inibição de crescimento.
Gavin (1956) estudou diferentes aspectos da difusão de substâncias no ágar e as
interferências físicas sobre o fenômeno. Portanto, a espessura e a uniformidade do ágar para
uma série de placas é fundamental, sendo conseguido através da seleção de placas com fundo
plano, tamanho uniforme, mesmo diâmetro e controle rigoroso do volume de ágar transferido
para cada placa.
O crescimento adequado do microrganismo tem como exigência básica o pH da
solução-teste, cujo valor da faixa adequada é favorável, também, para atividade e estabilidade
das substâncias testadas. Assim, foi recomendada a utilização de solução-teste com pH
próximo àquele de crescimento ótimo do microrganismo como condição ideal, embora o
tamanho das zonas de inibição de crescimento variem com o pH.
Abraham e Duthie (1946) estudaram o efeito do pH do meio na atividade da
estreptomicina e penicilina através dos métodos de diluição seriada e cilindros em placa.Foi
verificado que o aumento de acidez do meio diminuía a atividade antibacteriana de
substâncias básicas como estreptomicina; por outro lado, provocava aumento da atividade
das substâncias ácidas como a penicilina.
Sendo a velocidade de difusão da substância no ágar determinante do tamanho da zona
de inibição, Gavin (1956) considerou que somente após a difusão da substância testada, antes
da multiplicação microbiana, ocorre a formação do halo de inibição de crescimento. Assim,
zonas de inibição maiores podem ser obtidas alterando a fase “lag” do microrganismo através
da refrigeração das placas ou mantendo as placas à temperatura ambiente após a colocação
das soluções-teste.
Um dos aspectos problemáticos relacionado ao contraste entre halo de inibição de
crescimento e o restante do meio onde existe a massa celular resultante da incubação é o
aparecimento de halos duplos devido a diferentes fatores. Hewitt esclareceu este problema
através da teoria de difusão. Devido ao restrito volume da solução-teste no reservatório, a
concentração do antibiótico cai rapidamente ao valor abaixo do original não ocorrendo
gradiente, o que possibilita a formação de halos duplos. Entre outros casos, a influência da
anaerobiose no meio de cultura em profundidade provoca o aparecimento de halo duplo uma
vez que na superfície a distância de difusão revelada pela população microbiana é maior que
da profundidade. Em todos os casos, o aparecimento do halo duplo não invalida o ensaio,
desde que a leitura seja padronizada para a medida de um dos halos formados e este
fenômeno, seja comum para padrão e amostra.
Harris, em 1955, publicou uma revisão de trabalhos exaltando o emprego de métodos
de ensaio microbiológico de antibióticos, vitaminas e aminoácidos em vários tipos de
materiais, com a indicação das vantagens e desvantagens dos métodos de diluição seriada, de
turbidimétrica e de difusão em placas. Alertou para possíveis alterações na precisão dos
resultados dos ensaios quando a curva dose-resposta traçada visualmente desviasse da
verdadeira relação dose-resposta.
Um estudo mais preciso foi realizado por Deutschberger e Kirshbaum, em 1959,
empregando cálculos dos mínimos quadrados ou linha de regressão, levando em consideração
as faixas de concentração adequadas das soluções do padrão, recomendaram que as
concentrações das soluções-teste devem ser diluídas na mesma razão do padrão e que o
número de observações seja o mesmo para cada ponto.
Kavanagh (1974) apresentou um estudo sobre a equação de Cooper, relacionando o
diâmetro das zonas de inibição a diversos parâmetros. As variáveis estudadas foram espessura
do ágar, temperatura, composição do meio, sendo que foram estabelecidos como influências
da maior importância o tempo de pré-difusão e a concentração da carga microbiana.
Kavanagh sugeriu o enchimento dos cilindros em série crescente de concentrações. No
entanto, este procedimento implica em difusão do antibiótico antes do início de incubação,
em vista disso, este trabalho dá orientações de como minimizar o erro, no doseamento
microbiológico. A diminuição na temperatura de incubação causou o aumento do tamanho
das zonas de inibição e a espessura do ágar, influenciou os resultados quando foi utilizado o
meio em sistema de bicamada, provocando erro significativo pela alteração na concentração
bacteriana em cada placa. Todos os fatores mencionados afetam diretamente o tempo de
geração do microrganismo-teste. Assim, mudanças de 10 vezes na quantidade do inóculo
podem causar diferença de 3 mm no tamanho do halo, sendo que placas com inóculos
menores apresentam maiores zonas de inibição de crescimento. O autor sugeriu para
minimizar erros, deve-se espalhar o meio nas placas apoiadas em superfície nivelada e colocar
as soluções nos reservatórios da placa em tempo inferior a 1 minuto.
Os procedimentos envolvendo ensaios microbiológicos de antibióticos e vitaminas
foram detalhadamente discutidos e descritos por Kavanagh e Ragheb (1979), com objetivo de
assegurar a exatidão dos testes. Considerando os procedimentos turbidimétricos e de difusão
em ágar, destacou o trabalho humano como fator limitante, salientando a necessidade de
seleção e treinamento cuidadoso dos analistas, além de equipamentos, materiais e operações
que podem levar a erros.
2.4. Espectrofotometria
A espectrofotometria é qualquer processo que utiliza a luz para medir as concentrações
químicas. Para um composto ser analisado por espectrofotometria, ele deve absorver luz, e
essa absorção deve ser distinguível daquela oriunda de outras substâncias presentes na
amostra. A maioria dos compostos absorve a radiação ultravioleta; a absorvância ultravioleta
tende a não ser conclusiva, e a análise, geralmente, fica restrita ao visível. Se não houver
espécies interferentes, contudo, a absorvância ultravioleta pode ser usada (HARRIS, 2001).
A absorção molecular na região do ultravioleta e do visível do espectro depende da
estrutura eletrônica da molécula. A absorção de energia é quantizada e conduz à passagem
dos elétrons de orbitais de maior energia em um estado excitado. A espectrofotometria no
ultravioleta é limitada, na maior parte, aos sistemas conjugados (SILVERSTEIN et al.,
1994).
A espectrofotometria no infravermelho corresponde à parte do espectro situada entre as
regiões do visível e das microondas. No espectro de infravermelho a correlação pico a pico é
uma excelente evidência para a identidade da amostra. Embora o espectro seja característico
da molécula como um todo, certos grupos de átomos dão origem a bandas que ocorrem mais
ou menos na mesma freqüência, independente da estrutura da molécula (SILVERSTEIN et
al., 1994).
2.5. Métodos Cromatográficos
2.5.1. Cromatografia em camada delgada (CCD)
A cromatografia em camada delgada (CCD) tem sido considerada tradicionalmente
como um método simples, rápido e econômico para separação, identificação experimental e
semi-quantificação visual de uma ampla variedade de substâncias (FRIED e SHERMA,
1994). A CCD permite analisar e identificar qualitativamente, um largo número de amostras
simultaneamente. Esta técnica requer uma modesta utilização de equipamentos e recursos,
que demonstra ser um procedimento ideal, para áreas sem eletricidade e para operadores com
treinamento limitado (KENYON et al., 1995).
As amostras utilizadas na CCD são aplicadas normalmente com volumes entre 1 e10,0
L na origem da placa. Quando a concentração do soluto é conhecida, a solução aplicada é
usualmente na concentração de 0,01-1,00 g/ L. Se a quantidade de amostra aplicada é
muito pequena, o composto de interesse pode não ser detectado. Inversamente, se bastante
amostra é aplicada, o material pode não ser absorvido totalmente, pela espessura da camada,
conduzindo à sobrecarga da amostra e diminuindo a resolução (ADAMOVICS e
ESCHBACH, 1997; FRIED e SHERMA, 1994). Normalmente, este método de detecção
possui sensibilidade na escala de microgramas ou nanogramas, mas quantidades em
picogramas algumas vezes podem ser detectadas (FRIED e SHERMA, 1994).
A detecção em CCD pode ser qualitativa ou quantitativa. Procedimentos qualitativos
requerem que o produto seja identificado na placa cromatográfica, utilizando o valor de Rf
para identificação e tendo sobre igual magnitude o valor da substância de referência. A
determinação semiquantitativa pode ser comparada visualmente pelo tamanho e intensidade
da mancha frente a várias concentrações da substância de referência. Procedimentos
quantitativos requerem um densitômetro ou a extração dos componentes da sílica, para
posterior análise por espectrofotometria. Vários fármacos são detectados na luz ultravioleta
(254 nm) com a fase estacionária impregnada por fósforo. Compostos que são naturalmente
fluorescentes podem ser detectados no comprimento de onda na luz UV-350 nm
(ADAMOVICS e ESCHBACH, 1997).
Antes da aplicação da amostra, as placas devem ser ativadas de 70 –110oC por 30
minutos. A linha de origem para aplicação das amostras é usualmente localizada entre 1,5-2,5
cm do começo da placa. A migração de 10 cm do solvente é conveniente, quando valores de
Rf são calculados (FRIED e SHERMA, 1994). A aplicação da amostra é um passo crítico
para a obtenção de uma boa resolução e quantificação em CCD (POOLE e DIAS, 2000).
A fase móvel pode ser escolhida considerando a natureza do analito e da camada
adsorvente que será utilizada. Substâncias polares requerem um solvente polar para que
ocorra migração na sílica gel. Um solvente forte aumenta valores de RF e no caso de CCD de
fase normal, o solvente adequado para uso seria, polar. Na CCD de fase-reversa, substâncias
apolares são fortemente atraídas pela camada, e fase móvel apolar são requeridas para que
ocorra a migração. Neste caso, solventes fortes são os mais apolares (FRIED e SHERMA,
1994). A vantagem da mistura de solventes, é que a resolução e seletividade podem ser
melhoradas. A porcentagem de ácido acético ou amônia é adicionada para prevenir zonas de
cauda (FRIED e SHERMA, 1994).
Um sistema solvente clássico e comprovadamente versátil para a separação de
substâncias polares e apolares consiste de hidrocarboneto-acetona-clorofórmio. Um típico
exemplo é hexano-acetona-clorofórmio (65:30:5). Pentano, isooctano ou benzeno são outros
hidrocarbonetos adequados para substituir o hexano para melhorar a seletividade. Para
substâncias muito polares, uma pequena porcentagem de metanol é incluída, e pequenas
quantidades de ácido ou base são adicionadas para controlar a ionização dos solutos. O efeito
do clorofórmio parece ser o controle da evaporação dos vários solventes utilizados, durante o
desenvolvimento do equilíbrio do processo (FRIED e SHERMA, 1994).
Segundo Geiss (1968), dentre os parâmetros que influenciam a separação das
substâncias por CCD, afetando a reprodutibilidade dos resultados, encontram-se: fase
estacionária, fase móvel, tipo de cuba utilizada para revelação, saturação da cuba e da camada
com o vapor do solvente, diâmetro da partícula da fase estacionária, volume da amostra e
tamanho da mancha inicial, umidade relativa (ativação da placa), velocidade do solvente,
temperatura, espessura da placa (tamanho e uniformidade), solventes impuros, pH.
RENGER, em 1993, discutiu o modelo de CCD como ferramenta para análise farmacêutica.
Avanços na instrumentação, camadas e metodologias têm aumentado a utilização da CCD
permitindo melhoria da confiabilidade, exatidão e reprodutibilidade.
2.5.2. Cromatografia líquida de alta eficiência
A cromatografia pode ser conceituada como um método físico-químico de separação,
no qual os constituintes da amostra a serem separados são particionados entre duas fases,
uma estacionária, geralmente de grande área, e a outra um fluído insolúvel, na fase
estacionária, que percola através da primeira (CIOLA, 1998). Embora a cromatografia
líquida, tradicionalmente seja classificada dentro de diferentes modelos de separação, de fato
todas as separações dependem de dois parâmetros básicos: a estrutura e a composição da fase
estacionária e a natureza da interação entre a fase móvel e a fase estacionária com
determinados mecanismos de separação (HANCOCK e SPARROW, 1984). O emprego de
CLAE para solucionar problemas analíticos ou preparativos necessita, além da
instrumentação adequada, a combinação correta das condições experimentais, tais como: tipo
de coluna (fase estacionária), fase móvel (sua composição e vazão), temperatura, quantidade
da amostra injetada e outros parâmetros (CIOLA, 1998).
Dentre as fases estacionárias, encontram-se a fase com superfície de sílica, com a
cobertura de grupos silanóis, em que 5% dos grupos silanóis são particularmente reativos nas
ligações de hidrogênio intramolecular (HANCOCK e SPARROW, 1984). Estes grupos são
ligeiramente ácidos (com um pKa de 5 a 7 dependendo da quantidade de hidrogênio
intramolecular na coluna) e interagem facilmente com amostras polares (KOCH e
KISSINGER, 1979). Sob o ponto de vista cromatográfico, os grupos silanóis são os mais
importantes, devido à sua polaridade, facilidade de fazer pontes de hidrogênio e capacidade
de induzir dipolos em outras moléculas (CIOLA, 1998). A sílica gel é pouco solúvel nos
solventes orgânicos normalmente empregados em cromatografia (metanol, acetonitrila,
cloreto de metileno, THF, etc), porém dependendo do pH ela pode ser apreciavelmente
solúvel em água, limitando o uso de fases móveis com pH acima de 8 ou 9, fato que leva sua
desativação prematura.
Esta propriedade dos grupos silanóis interagir com as substâncias da fase móvel, é
utilizada na cromatografia de adsorção, onde os componentes polares da mistura são retidos
na fase estacionária devido à interação com os grupos silanóis. Atualmente, têm sido
desenvolvidas fases estacionárias quimicamente ligada à sílica, que assumiram nos últimos
anos cerca de 98% das aplicações analíticas cromatográficas. Os grupos ligados à sílica
podem produzir tipos distintos de fases estacionárias, dependendo da sua natureza polar, não
polar, iônica, ou mesmo complexante. Podemos classificar essas fases em polares e não
polares (CIOLA, 1998):
(a) Fases não polares: mais importantes da atualidade, em que há grupos alquílicos
com cadeias de 2, 4, 8, 18 e em alguns casos 22 átomos de carbono. Existem
também grupos fenilas ligados à sílica, porém com poucas aplicações.
(b) Fases polares: os grupos ligados à sílica são amino, ésteres, carboxilas, fenóis.
Tradicionalmente, por razões históricas, as fases não polares são chamadas de fase
reversa, ao contrário das polares que são chamadas de fase normal. A separação perfeita de
misturas, empregando a cromatografia a líquido, somente terá sucesso se for possível acoplar
uma fase móvel correta a uma fase estacionária conveniente. A seleção dos solventes deve ser
feita de maneira que eles satisfaçam os requisitos necessários para o seu manuseio seguro,
eficiente e econômico.
A separação dos compostos em CLAE, deve-se principalmente aos seguintes
fenômenos que ocorrem na interface fase estacionária/fase móvel: adsorção, partição e
exclusão por tamanho molecular. Adsorção é um fenômeno que ocorre quando duas fases
imiscíveis são postas em contato, ocorrendo uma tendência de acumulação de uma substância
sobre a superfície de outra (CIOLA, 1998). Os processos de adsorção são classificados em
dois tipos: adsorção física e adsorção química.
A adsorção física ocorre com todos os sólidos, principalmente a baixas temperaturas.
Os adsorventes polares, como a sílica, possuem grupos hidroxila que podem fazer pontes de
hidrogênio com álcoois, aminas e ácidos carboxílicos. A adsorção química envolve a
formação de ligações químicas entre a fase sólida e líquida.
A partição envolve um sistema de dois líquidos imiscíveis ou parcialmente miscíveis, em que
o soluto irá se distribuir entre estes líquidos, de modo que o quociente entre as concentrações
do soluto nas duas fases é uma constante. A constante é denominada de coeficiente de
partição. O movimento de solutos de uma fase para outra depende da afinidade do soluto por
cada fase, expressa no coeficiente de partição (NETZ e ORTEGA, 2002).
Considerando que as substâncias se movem dentro da coluna somente quando elas
estão na fase móvel, a velocidade de eluição dentro da coluna será sempre inversamente
proporcional ao valor do coeficiente de partição, isto é, o tempo de retenção necessário para
eluir as substâncias dentro da coluna, desde o instante da injeção até o máximo do pico, será
tanto menor quanto menor for o coeficiente de partição e maior for a velocidade da fase
móvel (CIOLA, 1998). Por esses motivos é que na cromatografia a líquido a fase móvel tem
um papel extremamente importante, pois rege a distribuição dos compostos entre as duas
fases e, portanto, a ordem de eluição e tempo de retenção dos picos.
2.6. Método titrimétrico
A análise titrimétrica refere-se à análise química quantitativa efetuada pela
determinação do volume de uma solução, cuja concentração é exatamente conhecida, que
reage quantitativamente com um volume conhecido da solução que contém a substância a ser
determinada (VOGEL, 1992). Os métodos titrimétricos podem ser classificados de acordo
com a reação utilizada. Na titulação em meio não-aquoso, aplica-se a teoria de ácidos e bases
de Bronsted-Lowry, para explicar as reações que ocorrem durante este tipo de titulação.
A teoria de Bronsted-Lowry considera ácido qualquer substância que tenha tendência a
doar um próton e base a substância que aceitará um próton. As substâncias que proporcionam
pontos finais indefinidos, em virtude de serem ácidos fracos, ou bases fracas, em solução
aquosa, freqüentemente proporcionam pontos finais mais satisfatórios quando as titulações
são efetuadas em meios não aquosos. Os solventes não-aquosos são classificados em quatro
grupos: solventes apróticos, solventes protofílicos, solventes protogênicos e solventes
anfipróticos (VOGEL, 1992).
Solventes Apróticos: incluem substâncias que podem ser consideradas
quimicamente neutras e praticamente inertes. As substâncias possuem constantes
dielétricas baixas, não provocam ionização dos solutos e não sofrem reações com
os ácidos ou com as bases. Exemplo: benzeno e tetracloreto de carbono.
Solventes Protofílicos: são substâncias como a amônia líquida, as aminas e as
cetonas, que possuem alta afinidade por prótons.
Solventes Protogênicos: possuem natureza ácida e doam prótons com facilidade.
Exemplo: ácidos anidros, como o fluoreto de hidrogênio e o ácido sulfúrico; em
virtude da respectiva força, e da capacidade de doar prótons, realçam a força das
bases fracas.
Solventes Anfipróticos: são ligeiramente ionizados e combinam as propriedades
protogênicas e protofílicas, pois são capazes de doar e receber prótons. Assim, o
ácido acético exibe propriedades ácidas na dissociação em que liberta prótons:
Porém, em presença de ácido perclórico, que é um ácido muito mais forte, o ácido
acético aceitará um próton:
O íon
CH3COOH2+ que se forma pode reagir prontamente com uma base.
Portanto, uma base fraca terá as suas propriedades básicas realçadas, e por isso as
titulações entre bases fracas e o ácido perclórico podem ser feitas, muitas vezes e com
facilidade, no ácido acético como solvente.
CH3COOH CH3COO- + H+
CH3COOH + HClO4 CH3COOH2+ +
2.7. Métodos analíticos para fluorquinolonas em formas farmacêuticas
Na literatura há vários métodos analíticos desenvolvidos para análise de
fluorquinolonas, onde destacamos alguns métodos mais comumente utilizados como:
cromatografia líquida de alta eficiência, doseamento microbiológico, espectrofluorimetria,
espectrofotometria no UV, espectrofotometria no visível e métodos titrimétricos.
A Farmacopéia Americana (USP 25, 2002), relata as monografias somente de três
fluorquinolonas: ciprofloxacino, em solução injetável, solução oftálmica e comprimidos
quantificado por HPLC utilizando fase móvel ácido fosfórico 0,025 M e acetonitrila (87:13);
norfloxacino, em solução injetável, solução oftálmica e comprimidos quantificado por
titrimetria potenciométrica utilizando ácido perclórico 0,1 N em meio com ácido acético;
ofloxacino, solução oftálmica, quantificado por titrimetria potenciométrica utilizando ácido
perclórico 0,1 N em meio com anidrido acético.
No suplemento 3 da Farmacopéia brasileira editado em 2002 constam as seguintes
monografias de fluorquinolonas: ciprofloxacino matéria-prima, comprimidos, solução
injetável e solução oftálmica; norfloxacino matéria-prima e comprimidos, e ofloxacino
matéria-prima, comprimidos e solução injetável (F. Bras. 2002).
Os códigos oficiais apresentam poucos métodos para análise de fármacos da classe
das fluorquinolonas tanto na matéria-prima, como em formas farmacêuticas. Por isso, o
desenvolvimento de metodologias analíticas para essa classe de fármacos é bastante
importante na área de controle de qualidade. Na literatura há vários métodos analíticos
sugeridos para as fluorquinolonas, começando pelo doseamento microbiológico, que utilizam
uma variedade de microrganismo como indicador, incluindo Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae, Micrococcus luteus e Bacillus subtilis.
White e colaboradores (1999) relatam doseamento microbiológico para
ciprofloxacino, utilizando como microrganismo indicador Escherichia coli e tampão pH 7,2
para dissolver as soluções aplicadas ao teste. Os mesmos autores também sugeriram ensaio
microbiológico para norfloxacino, utilizando como microrganismo indicador Klebsiella
pneumoniae. Froelich e Schapoval, em 1990, realizaram doseamento microbiológico de
norfloxacino, em comprimidos e matéria-prima, utilizando Bacillus subtilis ATCC 6633, em
tampão fosfato pH 8,0, com concentrações de 10, 20 e 40 g/mL com meio inoculado a 1%.
Outras duas fluorquinolonas, ciprofloxacino (FRATINI, 1993) na forma farmacêutica
comprimidos e em soluções para infusão e pefloxacino (SOUZA, 1995), também foram
desenvolvidos método microbiológico para análise. Ensaio microbiológico de difusão em
ágar, cilindros em placa, foi desenvolvido para ofloxacino, em soluções injetáveis, utilizando
como microrganismo indicador Micrococcus luteus ATCC 9341, em concentração de 12-27
µg/mL (EV, 1997). O esparfloxacino, em comprimidos, também foi doseado utilizando
Micrococcus luteus ATCC 9341, como microrganismo indicador, em concentração de 4-25
µg/mL (MARONA e SCHAPOVAL, 1998).
A espectrofotometria no UV é um método analítico utilizado para análise das
fluorquinolonas, principalmente devido à estrutura química desses fármacos, que absorvem na
luz UV. Em 1999, Marona e Schapoval desenvolveram e validaram um método analítico para
esparfloxacino, em comprimidos, utilizando espectrofotometria no UV, com absorção em 292
nm, onde a linearidade foi observada entre 2-12 µg/mL.
Carlucci e colaboradores (1993), utilizaram espectrofotometria no UV derivada, 297
nm, para quantificar ofloxacino, em comprimidos, colírios e soluções otológicas. O
coeficiente de correlação obtido foi de 0,9995.
Inúmeros artigos publicados na literatura utilizam espectrofotometria no visível para
fluorquinolonas. Kapetanovic e colaboradores (1996), publicaram um estudo demonstrando a
complexação de ofloxacino com íons cobre II, em diferentes valores de pH, com investigação
polarográfica, para quantificação do fármaco em comprimidos.
Três métodos na região do visível foram desenvolvidos por Issa e colaboradores (1997)
para quantificação de ofloxacino e lomefloxacino em comprimidos, utilizando azul de
bromofenol (BPB), azul de bromotimol (BTB) e púrpura de bromocresol (BCP). Neste artigo
os autores fizeram um estudo da complexação de ofloxacino e lomefloxacino com
bromofenol, azul de bromotimol e púrpura de bromocresol em diferentes valores de pH.
Ofloxacino e lomefloxacino foram quantificados, separadamente, com absorção máxima em
410 nm para os complexos formados com BPB e BCP e 415 nm para BTB. Os comprimidos
encontravam-se em formulações diferentes.
O esparfloxacino, em comprimidos, foi quantificado utilizando azul de bromotimol, em
pH 3,2 (MARONA e SCHAPOVAL, 2001b). Enrofloxacino, solução oral, e pefloxacino,
comprimidos e solução injetável, também foram determinados espectrofotometricamente
utilizando azul de bromofenol e alaranjado de metila (AM) em solução tampão pH 2,3-2,5 no
caso de BPB e pH 3,6 para alaranjado de metila. Os produtos foram quantificados a 420 nm e
424 nm, para BPB e AM, respectivamente (MOSTAFA et al., 2002).
Bhowal e Das (1991) desenvolveram método espectrofotométrico para determinação de
norfloxacino e ciprofloxacino, em comprimidos e cápsulas, utilizando cloreto férrico em meio
metanol-dimetilsulfóxido. As absorvâncias máximas para norfloxacino e ciprofloxacino foram
442 nm e 440 nm.
Fratini e Schapoval (1996), desenvolveram um método no visível para ciprofloxacino na
forma farmacêutica comprimidos e em soluções para infusão, utilizando nitrato férrico 1% em
HNO3 1%. O complexo formado obteve absorção máxima em 435 nm, sendo estável por 60
minutos.
Foi desenvolvido um método espectrofotométrico para ciprofloxacino e norfloxacino,
separadamente, em comprimidos, utilizando íons ferro III, em meio com ácido sulfúrico, em
que a medida de absorvância dos complexos formados, correspondem a 447 nm e 430 nm,
respectivamente. A estequiometria e a constante de formação do complexo também foram
analisadas neste estudo (SULIMAN e SULTAN, 1996).
Nagaralli e colaboradores (2002) determinaram ciprofloxacino, complexando-o com tris
(o-fenantrolina) ferro II (absorvância 510 nm) e trisbipiridil ferro II (absorvância 522 nm). O
ciprofloxacino foi quantificado em comprimidos e cápsulas.
Foi desenvolvido um método titrimétrico para determinação de esparfloxacino em
comprimidos, utilizando ácido perclórico 0,1 M em meio com ácido acético (MARONA e
SCHAPOVAL, 2001a).
Recentemente foi desenvolvido um método espectrofluorimétrico para moxifloxacino,
uma nova 8-métoxi-fluorquinolona, da mesma geração do gatifloxacino. Os autores diluíram
o fármaco em solução de tampão fosfato - ácido fosfórico pH 8,3, com absorvância máxima a
287 nm. Este estudo foi aplicado em comprimidos de moxifloxacino (OCAÑA et al., 2000).
Em relação aos métodos cromatográficos, a cromatografia líquida de alta eficiência é o
método mais comumente aplicado para análise das fluorquinolonas. Carlucci e colaboradores
(1993) quantificaram por CLAE ofloxacino, utilizando como fase móvel tampão fosfato 0,05
M pH 7,0/acetonitrila (20:80 V/V). A detecção foi realizada a 297 nm, com tempo de
retenção de 10,4 minutos. O ofloxacino foi analisado em comprimidos, colírios e soluções
otológicas.
Em 2002, Souza e colaboradores desenvolveram e validaram um método em CLAE
para enrofloxacino, solução injetável. A fase estacionária utilizada foi uma coluna C18 e a
fase móvel acetato de sódio pH 4,7 0,1 M/acetonitrila (60:40, V/V), com fluxo de 1,5
mL/min. A detecção foi a 278 nm e o tempo de retenção de 1,278 minutos.
Solução oftálmica e comprimidos de ciprofloxacino foram quantificados por CLAE
em fase reversa, utilizando detecção fluorescente com λexc= 300 nm e λemi = 458 nm. A fase
móvel empregada consistem de acetonitrila: metanol: tampão acetato (pH 3,60; 0,05 M)
(10:30:60 V/V/V) contendo 1% de ácido acético. O tempo de retenção foi 4,98 minutos para
solução oftálmica e 5,11 minutos para os comprimidos (ZOTOU e MILTIADOU, 2002).
O método para determinação de esparfloxacino, em comprimidos, foi desenvolvido e
validado por Marona e Schapoval (1999), utilizando cromatografia em fase reversa, com fase
móvel composta de ácido acético 5 %: metanol: acetonitrila (70:15:15, V/V/V).
Em relação ao gatifloxacino, não há até o momento, desenvolvimento de métodos
analíticos para determinação do fármaco em formas farmacêuticas. Os trabalhos que
encontramos na literatura, relacionam-se com determinação em fluidos biológicos. Um dos
primeiros artigos científicos na literatura, quantifica gatifloxacino no soro e urina, utilizando
CLAE - fase reversa com detecção fluorimétrica. A fase móvel utilizada foi acetonitrila:
fosfato de tetrabutilamônio: água (17:10:83), ajustando a solução para pH 3,48 com ácido
fosfórico. O tempo de retenção foi de 4,5 minutos no soro e 4,6 minutos na urina (BORNER
et al., 2000).
Em 2001, Vishwanathan e colaboradores, desenvolveram e validaram um método para
quantificar gatifloxacino no plasma humano. Foi utilizado cromatografia líquida de alta
eficiência, com detecção por espectrometria de massas, em que a fase móvel utilizada foi
ácido fórmico 0,1% e o tempo de retenção foi de 2,07 minutos. Outro método desenvolvido
para identificação de gatifloxacino envolveu a determinação simultânea de várias
fluorquinolonas, como levofloxacino, ciprofloxacino, moxifloxacino, trovafloxacino e
cinoxacino. A determinação em CLAE, envolveu detecção fluorimétrica, utilizando coluna de
fase reversa e fase móvel constituída de 10 mM sulfato de sódio/ 10 mM de acetato de
tetrabutilamônio/ 25 mM de ácido cítrico com 43 % de acetonitrila pH 3,5 (LIANG et al.,
2002).
2.8. Validação de métodos analíticos
Os métodos analíticos têm por objetivo fornecer informações confiáveis quanto à
natureza e à composição dos materiais submetidos à análise. Sabe-se, entretanto, que um
certo grau de variabilidade está atrelado a todas as avaliações. Portanto, um dos objetivos de
garantia de qualidade é manter em patamar mínimo esta variabilidade. A validação é parte
importante do programa de garantia de qualidade, sendo os procedimentos incluídos nas
normas de Boas Práticas de Fabricação (BPF) exigidas pela Food and Drug Administration
(FDA) dos Estados Unidos, e aplicadas nas indústrias farmacêuticas, devendo, também
ocorrer conforme as boas práticas de laboratório (BPL), do inglês, Good Laboratory
Practice (GLP). Recentemente a ANVISA, na resolução no 899, de 29 de Maio de 2003,
divulgou aspectos relacionados a validação de métodos analíticos (BRASIL, 2003). Os
métodos de ensaio devem ser descritos de forma clara para evitar a interpretação errônea dos
resultados analíticos.
A escolha do método deve levar em consideração fatores como sua adequação à
substância analisada, em determinada forma farmacêutica. Precisão, exatidão, sensibilidade e
especificidade (ERMER, 2001; USP 25, 2002), são características fundamentais de um
método analítico, porém outras como a disponibilidade de instrumentos e equipamentos,
rapidez, custo reduzido, simplicidade e baixo risco ocupacional devem também ser
consideradas.
A validação envolve, não apenas os procedimentos do processo produtivo, mas todos
os métodos empregados no controle de qualidade, incluindo a comparação do método
estudado com o método oficial ou outro método anteriormente validado.
Esta variabilidade aumenta quando as determinações são realizadas por diferentes
analistas em diferentes laboratórios (TAYLOR, 1983). Para minimizar os erros, é necessário
que os métodos de análise sejam descritos de forma objetiva, simples e clara, de modo que
mesmo o profissional pouco treinado possa realizar os ensaios corretamente. Outro atributo,
a robustez, para cromatografia líquida de alta eficiência, corresponde à capacidade de um
método não ser afetado por uma pequena e deliberada modificação em seus parâmetros,
como a composição orgânica da fase móvel, pH, força iônica, temperatura (ICH, 1996;
SWARTZ e KRULL, 1998; HEYDEN et al., 2001), permitindo redução da variabilidade
analítica.
As farmacopéias americana (2002) e britânica (2001) fazem referência à validação
analítica de forma destacada, incluindo a definição dos termos e parâmetros analíticos
envolvidos nos ensaios de validação. Os atributos do método analítico ou parâmetros de
validação estão descritos em inúmeras publicações (VESSMAN, 1996; WOOD, 1999;
ERMER, 2001; HEYDEN et al., 2001; PERSON e VESSMAN, 2001).
O procedimento de validação depende do tipo de metodologia analítica utilizada. Os
métodos analíticos são classificados por tipo ou categoria (USP 25, 2002), ou seja, categoria
I (quantificação), II (teste para determinação de impurezas ou produtos de degradação), III
(determina a característica de desempenho) e IV (testes de identificação). Para a categoria I,
atributos como precisão, exatidão, especificidade, linearidade, intervalo de quantificação e
robustez devem ser estudados na validação. A categoria II envolve ensaios de quantificação e
ensaios limite. Nos ensaios limites não é necessário realizar testes de precisão, limite de
quantificação e linearidade. No ensaio de quantificação, não há necessidade de realizar o
limite de detecção. Na categoria III, são exigidos apenas a precisão e robustez do método
analítico. Na categoria IV, só é necessário teste de especificidade.
A ICH (The International Conference on the Harmonization of the Technical
Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use) harmoniza requerimentos
em duas diretrizes: no primeiro documento orienta definições de características sobre
validação necessários para vários tipos de procedimentos (ICH, 1994), e no segundo
documento inclui dados experimentais requeridos e algumas interpretações estatísticas (ICH,
1996).
Estas diretrizes servem como bases internacionais tanto para a indústria farmacêutica,
para academia e para autoridades regulamentares. As características de validação são
normalmente avaliadas para diferentes procedimentos (ICH, 1994) e obedecem um número
mínimo de determinações requeridas para cada processo de validação (Tabela 1).
Tabela 1. Determinações requeridas para o processo de validação, seguindo diretrizes da
ICH.
Parâmetros devalidação
Número mínimo Procedimento testeIdentificação Impurezas
Quantitativo LimiteEnsaioa
Especificidade b _ Sim Sim Sim Sim
Linearidade 5 concentrações Não Sim Não Sim
Intervalo - Não Sim Não Sim
Exatidão 9 determinaçõessobre 3 níveis de
concentração (3 x 3)
Não Sim Não Sim
PrecisãoRepetibilidade
6 determinações de100% ou 9
determinações (3x 3)
Não Sim Não Sim
Precisãointermediária/
reprodutibilidadec2 séries
Não Sim Não Sim
Limite dedetecção -
Não Nãod Sim Não
Limite dequantificação
- Não Sim Não Não
a Incluindo dissolução
b Falta de especificidade de um procedimento analítico pode ser compensado por outro procedimento
analítico
c A precisão intermediária é suficiente para submissão
d Pode ser necessário em alguns casos
A exatidão, um dos atributos primordiais, expressa a medida do desvio dos valores
obtidos por um determinado método analítico, e indica a diferença entre valor médio obtido
de uma série de valores experimentais e valor verdadeiro (ICH, 1994; USP 25, 2002). Uma
forma de determinar a exatidão é através do teste de recuperação, que consiste em adicionar
à solução-teste uma quantidade conhecida da substância padrão acima e abaixo daquela
esperada na amostra (ALTESOR et al., 1994; CAUSON, 1997). Neste caso, a exatidão é
calculada pela diferença da concentração entre a solução adicionada do padrão e da amostra
sem adição de padrão. O teste de recuperação permite, além da determinação da exatidão do
método, verificar a interferência dos componentes da formulação quando não é possível
omiti-los da formulação, ou quando não se conhece a composição desta formulação.
Outro importante atributo, a precisão do método, é definida como a medida da
proximidade dos resultados do ensaio, obtidos individualmente de várias amostras de um lote,
sendo expressa como variância, coeficiente de variação ou desvio padrão dos valores
observados (DEAN e DIXON, 1951; CAUSON, 1997). A precisão pode ser considerada em
três níveis diferentes: repetibilidade, precisão intermediária e reprodutibilidade (ICH, 1996;
USP 25, 2002).
Na repetibilidade ou precisão intra-dia ou intra-ensaio, é considerada a variação que
ocorre quando da realização de réplicas do ensaio, em um curto período de tempo nas
mesmas condições operacionais. A precisão intermediária está relacionada com análises
realizadas em diferentes dias, analistas, instrumentos e reagentes (ICH, 1996). A
reprodutibilidade está relacionada com procedimentos realizados por dois ou mais
laboratórios, como ocorre em estudos colaborativos. Assim, a repetibilidade é considerada
como ensaios realizados em condições repetidas, enquanto que a reprodutibilidade em
condições comparativas.
Na linguagem farmacopéica, a precisão é entendida como a concordância entre os
valores de uma série, obtida de análises múltiplas da mesma amostra homogênea sob as
condições de ensaio estabelecidas. A precisão reflete a capacidade de reproduzir o mesmo
método, mas não necessariamente o resultado correto ou o esperado, toda vez em que seja
realizado conforme padronizado (USP 25, 2002). Portanto, o método analítico adequado
deve apresentar exatidão e precisão.
A especificidade de um método analítico representa sua capacidade de avaliar e
quantificar de forma inequívoca a substância em exame, mesmo quando presente, na amostra,
interferentes como os excipientes, compostos de estrutura química semelhantes, produtos de
degradação (VESSMAN, 1996; PERSSON e VESSMAN , 2001). O método analítico que
apresenta sensibilidade possui a capacidade de responder adequadamente e detectar
quantidades decrescentes da substância.
A averiguação da sensibilidade do método inclui a determinação dos limites de
detecção, específica para teste qualitativo, e quantificação, empregada nas determinações
quantitativas das impurezas. O limite de detecção é a menor quantidade da substância que é
detectada, mas não necessariamente quantificada (BRITAIN, 1998; ICH, 1996; USP 25,
2002), enquanto que o limite de quantificação é a menor concentração ou quantidade que
pode ser determinada pelo método.
O procedimento de validação engloba também a construção da curva de calibração e a
verificação de sua linearidade. Através da linearidade pode ser comprovado que o método
analítico produz resposta diretamente relacionada com a quantidade ou concentração da
substância analisada. O intervalo de linearidade é definido como o intervalo entre a
concentração mais baixa e mais alta em que o método analítico apresenta exatidão, precisão e
linearidade. Esta linearidade precisa ser determinada na faixa de concentração em que será
realizado o ensaio.
A introdução de métodos analíticos exige a adoção de procedimentos de validação que
conferem a confiabilidade necessária para a aplicação das técnicas de quantificação. O
desenvolvimento de metodologias que permitam quantificar fármacos em matérias-primas e
produtos acabados são fundamentais para o controle de qualidade destes produtos tanto no
âmbito da indústria farmacêutica nacional e internacional como em farmácias magistrais
públicas e privadas.
3. OBJETIVOS
O gatifloxacino é comercializado no Brasil desde 1999 na forma farmacêutica
comprimido e, ainda não possui metodologia de análise descrita em compêndios oficiais,
embora faça parte do arsenal terapêutico mundial. Uma vez que impulsiona uma indústria
farmacêutica de bilhões de dólares e possui ampla atividade antimicrobiana, torna-se
necessário o estabelecimento de métodos analíticos para análise quantitativa e procedimentos
de análise qualitativa para a identificação do fármaco em formas farmacêuticas.
Objetivos:
- Desenvolver método volumétrico em meio não-aquoso utilizando ácido
perclórico em meio com ácido acético.
- Desenvolver e validar método de análise espectrofotométrico na região UV para
gatifloxacino na matéria-prima e na forma farmacêutica comprimido.
- Desenvolver e validar metodologia empregando cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE).
- Desenvolver e validar método microbiológico de doseamento para o gatifloxacino por
meio de método de difusão em ágar-cilindros em placa.
- Desenvolver método qualitativo e semiquantitativo para gatifloxacino em
cromatografia em camada delgada (CCD).
- Identificar por espectrofotometria na região de infravermelho e análise térmica o
gatifloxacino na forma farmacêutica comprimidos e matéria-prima.
4. MATERIAL e MÉTODO
4.1. MATERIAL
4.1.1. Descrição
Nome genérico: gatifloxacino (Figura 10).
Descrição: pó cristalino, inodoro, levemente amarelo
Nome químico:
1-ciclopropil-6-flúor-1,4-dihidro-8-metóxi-7-(3-metil-1-piperazinil)-4-oxoquinolino-3-carbox
ílico
Nomes: gatifloxacin, gatifloxacino
Nome comercial: Tequin (Bristol-Myers Squibb)
Siglas: AM-1155 (MERCK, 2001)
CG-5501 (ODLAND et al., 1999)
BMS –206584 (FUKUDA et al., 1998)
CAS: 160738-57-8 (PEREIRA, 2002)
Número de registro no D.C.I.: 7423
Categoria: Fluorquinolona antibacteriana
Figura 10. Estrutura tridimensional de gatifloxacino
Fórmula molecular: C19H22FN3O4
Massa molecular: 375,39
Análise elementar:
C (60,79%); H (5,91%); F (5,06%); (11,19%); O (17,05%)
Ponto de fusão:162o C (MERCK, 2001)
Solubilidade: água, etanol, metanol
4.1.1.2. Substância de Referência
Foi utilizado gatifloxacino1, substância de referência, com teor estimado em 99,99%, e
identificado pelo lote: 0003000330.
4.1.1.3. Forma Farmacêutica
Comprimidos revestidos2 contendo 400 mg de gatifloxacino sesquiidratado (teor
rotulado), sob nome comercial de Tequin e identificado pelo lote de número
0005000543.
Fórmula unitária: gatifloxacino (400 mg), hidroxipropilmetilcelulose, estearato de
magnésio, metilcelulose, celulose microcristalina, polietilenoglicol, polissorbato 80,
simeticona, glicolato de amido sódico, ácido sórbico, dióxido de titânio (DEF, 2001/02).
1 GATX-SR foi gentilmente doado pela indústria farmacêutica Bristol-Myers Squibb
2 GATX-Comprimidos foi gentilmente doado pela indústria farmacêutica Bristol-Myers Squibb
2. Solventes, matérias-primas e reagentes
Ácido acético (Merck, Alemanha)
Ácido fórmico (Synth, Brasil)
Ácido perclórico – (Sigma, Alemanha)
Acetonitrila (Merck, Alemanha)
Acetonitrila grau HPLC - VETEC
Ágar no 11 (Merck, Alemanha)
Biftalato de potássio (Synth, Brasil)
Butanol (Synth, Brasil)
Ciprofloxacino, matéria-prima, gentilmente doado pelo laboratório EMS, Brasil.
Cloreto de metilrosaníleo 0,1% em ácido acético
Clorofórmio (Merck, Alemanha)
Diclorometano (Merck, Alemanha)
Etanol (Synth, Brasil)
Esparfloxacino, substância de referência – gentilmente doado pelo laboratório
Rhone-Poulenc Rorer, EUA.
Fosfato de potássio monobásico (Reagen, Brasil)
Gatifloxacino substância de referência (Bristol-Myers Squibb)
Hidróxido de amônio (Synth, Brasil)
Hidróxido de sódio (Synth, Brasil)
Levofloxacino: comprimidos. Indústria Jassen-cilag.
Lomefloxacino: solução oftálmica. Indústria cibavision ophthalmics.
Metanol (Merck, Alemanha)
Metanol grau HPLC (Merck, Alemanha)
Sílica gel 60 F254 - (Merck, Alemanha)
Tequin® 400mg comprimidos (Bristol Myers Squibb)*
TSB - Tryptic soy broth (DIFCO, EUA)
4.1.3 Equipamentos
Agitador de Tubos, PHOENIX, modelo AP56
Seringa HAMILTON, 100 L
Aparelho de sonicação “SONICATOR – ULTRASONIC LIQUIDPROCESSOR”,
HEAT SYSTEMS –mod.XL 2020
Autoclave, PHOENIX
Balança analítica, METTLER, modelo H10
Balança analítica METTLER, modelo AE100
Balança semi-analítica, MARK-BEL
Balança semi-analítica, micronal B160
Câmara UV 254 nm Contador de colônias, PHOENIX, modelo CP600
Cromatógrafo líquido Varian 2550, equipado com detector UV-Vis, integrador
Spectra-physics, modelo chromjet integrator, injetor Rheodyne (Loop 20 L)3 e
Coluna de aço inox Phenomenex4, luna 5 C18 (2), 250 x 4,6 mm, EUA.
3 O equipamento foi gentilmente cedido pelo instituto do trabalhor em Bauru, UNESP, pelo Prof. Dr. ManoelLima de Menezes4 A coluna Phenomenex foi gentilmente cedida pelo Prof. Dr. Manoel Lima de Menezes, UNESP-Bauru.
Estufa de incubação, ODONTOBRÁS, modelo ECB 1.2
Estufa de secagem e esterilização, NOVA ÉTICA
Espectrofotômetro UV-VIS SHIMADZU 1603
Espectrofotômetro UV-Vis BEECHMAN
Módulo DSC 2910 (TA Instruments), com taxa de aquecimento programável de 0,01
a 200O C/min, sensibilidade máxima de 0,2 W.
Lâmpada UV
Micropipetas, BOECO
pH metro – METTLER – mod. Delta 345
Paquímetro, STARRET, modelo digital eletrônico série 727
Pipeta automática
4.2. MÉTODO
4.2.1. Doseamento em meio não-aquoso utilizando ácido perclórico 0,1 M em meio com
ácido acético
Para a análise quantitativa de gatifloxacino foi desenvolvido o método titrimétrico em
meio não aquoso utilizando ácido perclórico em ácido acético glacial padronizado frente ao
biftalato de potássio como titulante. Foi realizado ensaio em branco para correção do volume
gasto no doseamento.
4.2.1.1. Determinação do teor de gatifloxacino na forma farmacêutica comprimido
Vinte comprimidos (602,805mg), foram pesados individualmente, para determinação do peso
médio. Em seguida, os comprimidos foram triturados em gral de porcelana e dessecados em
estufa a 105o C por duas horas. O equivalente ao peso médio dos comprimidos foi
transferido para erlenmeyer de 250 mL. Adicionaram-se 40 mL de ácido acético glacial, 5
gotas de cloreto de metilrosanílio 0,1% SI (cristal violeta) em ácido acético. Titulou-se com
ácido perclórico 0,1 M até o ponto de equivalência. Foi realizado a titulometria com o
branco, para as devidas correções. Este procedimento foi realizado em triplicata, durante 3
dias consecutivos. O teor de gatifloxacino na forma farmacêutica comprimidos foi
determinado pela equação abaixo:
Onde: v = volume (mL) de ácido perclórico 0,1 M; dmEq = decimiliequivalente de GATX; m
= peso de GATX (g), em que 1 mL de ácido perclórico 0,1 M eqüivale a 37,54 mg de
GATX-SR.
4.2.1.2. Exatidão do método
A exatidão do método foi avaliada pelo teste de recuperação que foi realizado
adicionando quantidades conhecidas de GATX-SR nas amostras de gatifloxacino
comprimidos. Foram incorporados 10,1 mg, 20,3 mg e 39,7 mg de GATX-SR, em diferentes
erlenmeyers, ao equivalente à 400 mg de gatifloxacino nos comprimidos. Adicionaram-se 40
mL de ácido acético glacial, 5 gotas de cloreto de metilrosanílio SI (cristal violeta) 0,1% em
ácido acético. Titulou-se com ácido perclórico 0,1 M até o ponto de equivalência. O ensaio
foi realizado em 3 dias consecutivos e em triplicata.
4.2.1.3. Precisão do método
A precisão do método foi avaliada pelo coeficiente de variação, utilizando gatifloxacino
analisados nos comprimidos. O ensaio foi realizado em três diferentes dias diferentes e em
triplicata.
4.2.2. Metodologia analítica por espectrofotometria na região UV
V x dmEq x 100Teor do fármaco (%) =
m
4.2.2.1. Espectro de absorção de GATX-SR
O espectro de absorção de GATX-SR foi obtido em água deionizada, em concentração
de 24 µg/mL na região UV. As leituras foram realizadas entre 200–400 nm em
espectrofotômetro UV-Vis Shimadzu, utilizando-se cubetas com 10mm de caminho óptico.
4.2.2.2. Construção da curva de Ringbom
A curva de Ringbom foi obtida com o objetivo de estabelecer a faixa de concentração
na qual o método espectrofotométrico na região de ultravioleta apresenta linearidade. Foram
pesados, analiticamente, 10 mg de GATX-SR, previamente dessecados em estufa a 105oC
durante duas horas, e transferidos para balão volumétrico de 100 mL. A substância foi
dissolvida em água deionizada e mantida em ultra-som por 10 minutos. O volume do balão,
foi completado, obtendo-se solução com concentração final de 100 μg/mL. A partir desta
solução, foram transferidas alíquotas para balões volumétricos, obtendo-se a curva com 22
pontos, com concentrações variando de 0,5 a 50,0 μg/mL de GATX-SR. A curva de
Ringbom foi obtida plotando-se os valores de transmitância e de concentração em escala
logarítmica.
4.2.2.3. Construção da curva padrão para gatifloxacino
Para a obtenção da curva padrão, foram pesados analiticamente 10 mg de GATX-SR,
previamente dessecados em estufa a 105oC durante duas horas, transferidos para balão
volumétrico de 100 mL, dissolvidos em água deionizada e mantidos em aparelho de
ultra-som, para melhor solubilização. Com a utilização de bureta foram obtidas soluções com
concentrações de 4,0 a 14,0 μg/mL de gatifloxacino substância de referência (Tabela 2). As
leituras das soluções foram efetuadas a 287 nm, utilizando água deionizada como branco. A
curva padrão foi construída em três diferentes dias e em triplicata, utilizando o programa
Sigma plot 4,01.
Tabela 2. Preparo das soluções para obtenção da curva padrão de gatifloxacino por meio de
espectrofotometria no UV a 287 nm, em água deionizada.
gatifloxacino 100 µg/mL (mL) água (mL) concentração final
(µg/mL)
0,4 9,6 4,0
0,6 9,4 6,0
0,8 9,2 8,0
1,0 9,0 10,0
1,2 8,8 12,0
1,4 8,6 14,0
4.2.2.4. Análise estatística
A representação gráfica da equação da reta foi determinada pela análise de regressão
linear através do método dos mínimos quadrados. As absorvâncias utilizadas na determinação
da curva padrão foram estatisticamente avaliadas pela análise de variância (ANOVA).
4.2.2.5. Exatidão do método proposto
Foi preparada solução de gatifloxacino substância de referência com concentração de
100 µg/mL. As soluções da amostra foram preparadas com concentração de 60 µg/mL a
partir da solução de gatifloxacino comprimidos com concentração de 1200 µg/mL. As
soluções foram transferidas para balão volumétrico de 100 mL, completando-se o volume
com água deionizada. A Tabela 3 apresenta as soluções obtidas para o teste de recuperação
de GATX-SR para o método espectrofotométrico na região UV.
Tabela 3. Preparação das soluções para o teste de recuperação aplicado à amostra de
gatifloxacino para o método espectrofotométrico na região UV a 287 nm, em água
deionizada.
Vol. Sol. da amostra 60 µg/mL
(mL)
Vol. Sol. GATX-SR. 100
µg/mL (mL)
Concentração
(μg/mL)
A 10,0 - 6,0
R1 10,0 2,0 8,0
R2 10,0 4,0 10,0
R3 10,0 6,0 12,0
P - 6,0 6,0
A percentagem de recuperação (R%) foi calculada através da expressão descrita abaixo
(AOAC, 1997):
Onde:
R% = [(CF - CA)/CP] . 100
CF = concentração da substância de referência + amostra
CA = concentração da amostra
CP = concentração da substância de referência adicionada
4.2.2.6. Precisão do método
A precisão do método foi avaliada pelo coeficiente de variação de gatifloxacino. O
ensaio foi realizado em três diferentes dias e em triplicata.
4.2.2.7. Determinação de gatifloxacino nos comprimidos
4.2.2.7.1. Preparo da solução de gatifloxacino substância de referência
Foram transferidos 6,0 mL de solução de gatifloxacino substância de referência com
concentração de 100 µg/mL para balão volumétrico de 100 mL. O volume foi completado
com água deionizada para a obtenção da solução com concentração de 6,0 µg/mL.
4.2.2.7.2. Preparo das amostra de comprimidos
Foram pesados 20 comprimidos para a determinação do peso médio (603,605 mg).
Após triturados manualmente em gral, uma quantidade de pó equivalente a 3 pesos médios do
comprimido foi exatamente pesada e transferida para balão volumétrico de 1000 mL. Foram
adicionados 500 mL de água deionizada e a solução foi mantida em aparelho de ultra-som
por 20 minutos. O volume foi completado com água deionizada para a obtenção de solução
com concentração de 1200 µg/mL. Foram transferidas alíquotas de 5,0 mL para balões
volumétricos de 100 mL e o volume completado com água (concentração teórica de 60
µg/mL). Dessa solução retiraram-se alíquotas de 10 mL para balões volumétricos de 100 mL
e os volumes foram completados com água deionizada para a obtenção de soluções com
concentrações teóricas de 6,0 µg/mL (Figura 11).
As leituras das soluções foram realizadas em espectrofotômetro a 287 nm, utilizando-se
cubetas de quartzo com 10 mm de caminho óptico e água deionizada como branco.A Figura
11 apresenta como foram realizadas as diluições para a preparação das soluções-amostra
utilizadas no método espectrofotométrico na região de ultravioleta a 287 nm.
1200 µg/mL
5,0 mL/BV* 100 mL
60 µg/mL
Figura 11. Representação do preparo das soluções da amostra utilizada no método
espectrofotométrico na região UV a 287 nm.*BV = Balão volumétrico
A concentração da solução amostra foi determinada pela equação abaixo:
Onde:
CA = concentração da amostra (µg/mL)
CSR = concentração da substância de referência (µg/mL)
AA = absorvância da amostra
10,0 mL/ BV 100 mL
6 µg/mL
CA = AA . CSR/ASR
ASR = absorvância da substância de referência
O teor percentual de gatifloxacino nas amostras foi calculado pela equação:
Onde:
CA = concentração de gatifloxacino encontrada na amostra (µg/mL)
Ct = concentração teórica de gatifloxacino na amostra (µg/mL)
4.2.3. Cromatografia líquida de alta eficiência
A Tabela 4 informa as condições cromatográficas utilizadas na padronização do método.
A fase móvel foi filtrada através de membrana com poro de 0,45 µm e 47 mm de diâmetro,
sob vácuo, desgaseificada no ultra-som, durante 30 minutos. Após a estabilização do sistema,
foram injetados 20,0 µL, previamente filtrados em membrana com poro de 0,45 µm e 13 mm
de diâmetro.
Tabela 4. Condições cromatográficas utilizadas no método por CLAE.
Fase móvel Ácido acético 5%: acetonitrila: metanol
(70:15:15,V:V:V)
CA% = CA . 100/Ct
Coluna Phenomenex, Luna 5 m C18 (2)
Comprimento de onda 287 nm
Fluxo 1,0 mL/min
Volume de injeção 20,0 µL
Velocidade de registro 0,5 cm/min
Temperatura 25o C ± 1o C
4.2.3.1. Construção da curva padrão
Para realização da curva padrão, foram pesados, analiticamente, 10,0 mg de
gatifloxacino substância de referência, previamente dessecados em estufa a 105o C durante
duas horas, transferidos para balão volumétrico de 100 mL e completando-se o volume com
água deionizada. A representação das soluções para obtenção da curva padrão, está
apresentado na Tabela 5. A curva padrão foi construída em três diferentes dias e em triplicata,
utilizando o programa Sigma plot 4,01.
Tabela 5. Preparo das soluções-padrão de gatifloxacino utilizadas na obtenção da curva
padrão em CLAE.
Volume da solução GATX
(mL) 100 µg/mL
Volume BV*
utilizado (mL)
Concentração (µg/mL)
1 1,0 25 4,0
2 1,5 25 6,0
3 2,0 25 8,0
4 2,5 25 10,0
5 3,0 25 12,0
6 3,5 25 14,0
* Balão volumétrico
4.2.3.2. Análise estatística
A representação gráfica da equação da reta foi determinada pela análise de regressão
linear através do método dos mínimos quadrados. As áreas utilizadas na determinação da
curva padrão foram estatisticamente avaliadas pela análise de variância (ANOVA).
4.2.3.3. Exatidão do método proposto
Foi preparada solução de gatifloxacino substância de referência com concentração de
100 µg/mL. As soluções da amostra foram preparadas com concentração de 240 µg/mL a
partir da solução de gatifloxacino comprimidos com concentração de 2400 µg/mL. A Tabela
6 apresenta as soluções obtidas para o teste de recuperação de GATX-SR em CLAE.
Tabela 6. Preparação das soluções para o teste de recuperação aplicado à amostra de
gatifloxacino para método por CLAE.
Volume da solução-amostra Volume da Solução GATX-SR Concentração
240 µg/mL (mL) 100 µg/mL (mL) (μg/mL)
A 1,0 - 9,6
R1 1,0 0,1 10,0
R2 1,0 0,2 10,4
R3 1,0 0,4 11,2
R4 1,0 0,6 12,0
P - 2,4 9,6
4.2.3.4. Precisão do método
A precisão do método foi avaliada pelo coeficiente de variação de gatifloxacino nas
amostras de comprimido em três diferentes dias. Em cada dia foram preparadas seis soluções
da amostra e da substância de referência.
4.2.3.5. Determinação de gatifloxacino nos comprimidos
4.2.3.5.1. Preparo da solução de gatifloxacino substância de referência
Foram transferidos 6,0 mL de solução de gatifloxacino substância de referência com
concentração de 100 µg/mL para balão volumétrico de 50 mL. O volume foi completado com
água deionizada para a obtenção da solução com concentração de 12,0 µg/mL.
4.2.3.5.2. Preparo das amostras de comprimidos
Foram pesados 20 comprimidos para a determinação do peso médio (607,81 mg). Após
triturados manualmente em gral, uma quantidade de pó equivalente a 3 pesos médios do
comprimido foi exatamente pesada e transferida para balão volumétrico de 500 mL. Foram
adicionados 250 mL de água deionizada e a solução foi levada ao aparelho de ultra-som por
20 minutos. O volume foi completado com água deionizada para a obtenção de solução com
concentração de 2400 µg/mL. Foram transferidas alíquotas de 10,0 mL para balões
volumétricos de 200 mL completando-se os volumes com água. As soluções preparadas têm
concentrações teóricas de 120 µg/mL de gatifloxacino. Dessa solução retiraram-se alíquotas
de 5,0 mL para balões volumétricos de 50,0 mL e os volumes foram completados com água
deionizada para a obtenção de soluções com concentrações teóricas de 12,0 µg/mL .
A concentração da solução amostra foi determinada pela seguinte equação:
Onde:
CA = concentração da amostra (µg/mL)
CSR = concentração da substância de referência (µg/mL)
AA = área da amostra
ASR = área da substância de referência
CA = AA . CSR/ASR
O teor percentual de gatifloxacino nas amostras foi calculado pela equação:
Onde:
CA = concentração de gatifloxacino encontrada na amostra (µg/mL)
Ct = concentração teórica de gatifloxacino na amostra (µg/mL)
4.2.4. Doseamento microbiológico
Foram realizados ensaios preliminares para o desenvolvimento de metodologia de
análise para gatifloxacino na forma farmacêutica comprimidos alternando-se alguns
parâmetros (Tabela 7).
Tabela 7. Parâmetros utilizados para a avaliação de gatifloxacino por ensaio microbiológico -
método de difusão em ágar- cilindros em placas.
Parâmetros Descrição
MicrorganismosStaphylococcus aureus ATCC 6538
Bacillus subtilis ATCC 9372Escherichia coli ATCC 25922
Meio de cultura Meio no 11 de Grove-Randall
Soluções diluentes Solução tampão pH 6,0Solução tampão pH 8,0
Concentrações das soluçõespadrão (μg/mL)
4,0; 10,0; 25,0 4,0; 8,0; 16,0
CA% = CA . 100/Ct
Os parâmetros estabelecidos para o doseamento microbiológico estão apresentados na
Tabela 8.
Tabela 8. Parâmetros estabelecidos na padronização de gatifloxacino no ensaio
microbiológico
Parâmetros Descrição
Microrganismo Bacillus subtilis ATCC 9372
Meio de cultura Meio no 11 de Grove-Randall
Solução diluente Tampão fosfato pH 6,0
Concentração do inóculo 2%
Concentrações da solução padrão (µg/mL) 4,0; 8,0; 16,0
Temperatura de incubação ( oC) 35 ± 2
Tempo de incubação (horas) 18
4.2.4.1. Preparo das soluções-padrão
Foram transferidos 10,0 mg de gatifloxacino substância de referência, exatamente
pesados, para balão volumétrico de 100 mL e dissolvidos em água para obtenção de solução
com 100 µg/mL.
A solução foi levada ao ultra-som por 10 minutos, para melhor solubilização. A partir
desta solução foram transferidos, analiticamente, 1,0, 2,0 e 4,0 mL para balões volumétricos
de 25 mL, completando-se o volume dos balões com solução tampão pH 6,0 para obtenção
de soluções com concentrações de 4,0, 8,0 e 16,0 µg/mL.
4.2.4.2. Preparo das soluções de gatifloxacino na forma farmacêutica
A partir do peso médio dos comprimidos (607,15 mg), pesou-se o equivalente a 10,0
mg de gatifloxacino, preparando-se solução da amostra com concentração de 100 µg/mL.
Seguiu-se o mesmo procedimento na preparação das soluções padrão, obtendo-se soluções
com concentrações de 4,0, 8,0 e 16,0 µg/mL.
4.2.4.3. Preparo do inóculo
O microrganismo-teste Bacillus subtilis ATCC 9372 foi mantido em meio TSB à 35o ±
2oC, durante 24 horas. A padronização foi realizada em espectrofotômetro a 580 nm com
transmitância de 25% ± 2% (F. Bras., 1988). Após a padronização, o inóculo foi utilizado a
2% em meio no 11 de Grove-Randall mantido em banho de vapor à 47oC ± 1oC.
4.2.4.4. Ensaio
Foram utilizadas 18 placas de Petri para o doseamento de gatifloxacino em
comprimidos. Em cada ensaio foram utilizadas 6 placas de Petri, e os resultados analisados
estatisticamente. Em capela de fluxo laminar, foram transferidos para cada placa, com auxílio
de pipetador automático, 20 mL de meio no 11 para a camada base. Após a solidificação
desta camada, foram adicionados através de pipetador automático, 5 mL de meio no 11
contendo 2% inóculo. Após a solidificação da camada semeada, foram distribuídos,
eqüidistantemente, 6 cilindros de aço inoxidável por placa. Cada cilindro recebeu com auxílio
de pipetador automático, 200 µL das soluções do padrão ou da amostra (comprimido), em
delineamento 3 x 3 (Figura 12).
As placas foram colocadas em estufa incubadora à 35oC ± 2oC. Após 18 horas, foram
realizadas as medidas dos diâmetros dos halos de inibição ao centésimo de milímetro, com
auxílio de paquímetro. Em cada ensaio os resultados foram analisados estatisticamente e a
potência de cada doseamento calculada. A potência do medicamento foi calculada pela
equação de Hewitt (1977).
Figura 12. Delineamento 3 x 3, demonstrando a disposição das soluções padrão (P) e
amostra (A) na placa de Petri, onde P1 (4 µg/mL); P2 (8 µg/mL); P3 (16 µg/mL) e A1 (4
µg/mL); A2 (8 µg/mL); A3 (16 µg/mL).
4.2.4.5. Cálculo da potência do medicamento
A potência do fármaco foi determinada pela equação de HEWITT (1977). Os ensaios
foram realizados em dias diferentes, e cada amostra corresponde à média de seis
determinações.
Equação de HEWITT
4.2.4.6. Construção da curva padrão
A curva padrão foi construída em gráfico logarítmo da concentração versus diâmetro
dos halos de inibição, com as médias dos diâmetros de cada uma das concentrações da
substância de referência. A curva foi construída utilizando o programa Sigma Plot 4.01.
4.2.4.7. Exatidão do método
Onde:
F= 1/3[(A1 +A2 + A3) - (P1+P2+ P3)]
I = logaritmo da razão das doses
T/R (%) = Antilog M x 100
M=F/b b = E/I
O teste de recuperação para o método microbiológico foi realizado para comprovar a
exatidão do método proposto.
4.2.4.7.1. Preparo das soluções
Neste ensaio, preparou-se uma solução de substância de referência com concentração
de 100 g/mL. A solução amostra adicionada da substância de referência foi preparada
pesando-se o equivalente a 10 mg, que foram transferidos para balões volumétricos de 100
mL. Em cada balão adicionaram-se 50 mL de água levando ao ultra-som para melhor
solubilização. Adicionou-se alíquota de 0,5 mL da solução-padrão no balão 1 (recuperação
1), 1,0 mL de solução-padrão no balão 2 (recuperação 2) e 1,5 mL no balão 3 (recuperação
3). A Tabela 9 representa o esquema de preparo das amostras no teste de recuperação.
Tabela 9. Preparo das soluções para análise do teste de recuperação para gatifloxacino no
doseamento microbiológico difusão em ágar cilindros em placa
Quantidade da
amostra
adicionada (mg)
Quantidade da solução
padrão adicionada 0,1
mg/mL (mL)
Concentração teórica de
amostra + padrão mg/ 100
mL
1 10,0 0,5 10,5
2 10,0 1,0 11,0
3 10,0 1,5 11,5
A partir destas soluções foram transferidos analiticamente, 1,0, 2,0 e 4,0 mL para
balões volumétricos de 25 mL, completando os volumes dos balões com tampão fosfato pH
6,0, para obtenção das seguintes concentrações teóricas:
Para o teste de recuperação 1: 4,2; 8,4 e 16,8 g/mL
Para o teste de recuperação 2: 4,4; 8,8 e 17,6 g/mL
Para o teste de recuperação 3: 4,6; 9,2 e 18,4 g/mL
Após a execução do ensaio, as placas foram colocadas em estufa incubadora à 35oC ±
2oC. Após 18 horas, foram realizadas as medidas dos diâmetros dos halos de inibição ao
centésimo de milímetro, com auxílio de paquímetro. A potência do antimicrobiano foi
calculada pela equação de Hewitt (1977), e a partir do valor encontrado, foi calculada a
concentração experimental da solução amostra adicionada de padrão.
4.2.4.8. Precisão do método
A precisão do método proposto foi avaliada pelo coeficiente de variação da
concentração de gatifloxacino nos comprimidos, realizada em três diferentes dias e em
triplicata.
4.2.5. Cromatografia em camada delgada
4.2.5.1. Preparo das placas
As placas utilizadas para identificação do fármaco, foram preparadas com sílica-gel 60
F254 (20 x 20 cm), com espessura de 0,25 mm e ativadas em estufa a 105o C por uma hora.
4.2.5.2. Preparo da solução-padrão de gatifloxacino
Pesou-se o equivalente 5 mg de substância de referência, previamente dessecados em
estufa a 105oC, durante duas horas, transferindo para balão volumétrico de 50 mL, e
dissolvidos com etanol, para obtenção de solução com concentração final de 100 µg/mL.
4.2.5.3. Preparo da solução amostra de gatifloxacino
Foram pesados o equivalente a 5 mg de gatifloxacino da amostra de comprimidos,
transferindo-os para balão volumétrico de 50 mL, dissolvendo a solução em etanol, para
obtenção de solução com concentração final de 100 µg/mL.
4.2.5.4. Preparo da solução de esparfloxacino
Foram utilizados esparfloxacino matéria-prima para a preparação da solução de
comparação. Pesaram-se, analiticamente, 5 mg de esparfloxacino, transferindo para um balão
volumétrico de 50 mL, dissolvendo o fármaco em etanol, para obtenção de solução com
concentração final de 100 µg/mL.
4.2.5.5. Preparo de solução de ciprofloxacino
Para preparação desta solução, foi utilizado ciprofloxacino matéria-prima. Pesaram-se 5
mg do fármaco, analiticamente, que foram transferidos para balão volumétrico de 50 mL,
para obtenção de solução com concentração final de 100 µg/mL de ciprofloxacino.
4.2.5.6. Preparo de solução de lomefloxacino
Foram utilizados comprimidos de lomefloxacino para a preparação da solução de
comparação. Pesaram-se, analiticamente, o equivalente a 5 mg do fármaco que foram
transferidos para balão volumétrico de 50 mL, obtendo solução com concentração final de
100 µg/mL.
4.2.5.7. Preparo da solução de levofloxacino
Foi utilizada, a forma farmacêutica colírios contendo levofloxacino, para a preparação
da solução de comparação. O equivalente a 5 mg do fármaco, foi transferido para balão
volumétrico de 50 mL, para obtenção de solução com concentração final de 100 µg/mL.
4.2.5.8. Sistemas de fases móveis
Foram testados inicialmente os sistemas de fases móveis somente com solução-padrão e
solução-amostra de gatifloxacino e posteriormente com outras fluorquinolonas em placas de
sílica gel 60 F254.
1) Diclorometano: metanol: hidróxido de amônio: acetonitrila (6:4:2:1) V:V:V:V
2) Diclorometano: metanol: acetonitrila: ácido acético 5% (6:4:2:2) V:V:V:V
3) Diclorometano: metanol: acetonitrila: ácido acético 5% (6:4:4:2) V:V:V:V
4) Clorofórmio: metanol: ácido fórmico: água (16:7:3:0,5) V:V:V:V
5) Clorofórmio: metanol: ácido fórmico: água (33:7:3:0,5) V:V:V:V
6) Clorofórmio: metanol: ácido fórmico (18:7:1) V:V:V
7) n-Butanol: ácido acético: água (40:10:50) V:V:V
4.2.5.9. Ensaio
Procedeu-se, inicialmente à saturação da placa com o sistema de fase móvel. Com
auxílio de seringa de 100 µL transferiram-se as soluções com concentrações crescentes de
gatifloxacino padrão e amostra, para as placas procedendo-se à cromatografia. Após
migração da fase móvel, a placa foi retirada da cuba de vidro, deixando o solvente evaporar.
As placas foram reveladas na câmara UV, para a comparação das manchas quanto a forma,
posição e tamanho. Foi determinado o Rf de cada fármaco.
4.2.5.10. Execução do ensaio com as cinco fluorquinolonas
Após a saturação da cuba com o sistema solvente foi colocada a placa de sílica-gel com
as aplicações das soluções preparadas no dia da análise. As soluções foram transferidas para a
placa com uma seringa de 100 µL. Foram aplicados 10 µL de cada solução na placa
(gatifloxacino substância de referência, gatifloxacino comprimidos, ciprofloxacino,
lomefloxacino e levofloxacino) com exceção de esparfloxacino, em que foram aplicados 30
µL da solução. Após a migração da fase móvel, a placa foi retirada da cuba de vidro,
deixando o solvente evaporar. A placa foi revelada na câmara UV.
4.2.6. Espectrofotometria de absorção na região de infravermelho
Os espectros foram obtidos com 1,5 mg de gatifloxacino substância de referência e
gatifloxacino comprimidos, utilizando-se pastilhas de 150 mg de brometo de potássio
dessecado a 105o C durante duas horas.
A amostra extraída dos comprimidos foi obtida pelo preparo de solução aquosa 1000
µg/mL, que após, filtrada, foi levada à secura em evaporador rotatório em temperatura
inferior a 60o C.
4.2.7. Análise térmica de gatifloxacino
As amostras, GATX-SR e GATX-comp, foram colocadas em frascos de vidro e secas
em estufa a 95OC por oito horas. Foram pesadas analiticamente aproximadamente 3 mg de
cada uma das amostras e colocadas em cadinhos de alumínio para realização das análises.
Cada amostra foi analisada separadamente em aparelho de calorimetria exploratória
diferencial (DSC 2910 – TA Instruments), previamente calibrado de acordo com os seguintes
parâmetros: razão de aquecimento de 20OC/minuto; variação de temperatura de 40-450OC e
vazão de nitrogênio a 90 mL/minuto. Utilizou-se um cadinho de alumínio vazio no forno de
referência.
5. RESULTADOS
5.1. Doseamento de gatifloxacino em meio não-aquoso utilizando ácido perclórico 0,1 M
em meio de ácido acético glacial.
A Tabela 10 apresenta os valores experimentais obtidos para o doseamento de
GATX-comp.
Tabela 10. Valores obtidos no doseamento de GATX-comp em meio não-aquoso utilizando
a titrimetria com ácido perclórico 0,1 M em ácido acético glacial.
Dia 1(%)
Dia 2
(%)
Dia 3
(%)
I 100,48 99,72 101,37
II 100,85 100,02 101,32
III 99,65 99,72 100,79
Média intra-dia 100,28 99,82 101,16
Média inter-dia (%) 100,42
5.1.1. Teste de recuperação de gatifloxacino na análise titrimétrica
A Tabela 11 apresenta os valores experimentais obtidos no teste de recuperação para
GATX-comp. no doseamento titrimétrico.
Tabela 11. Teste de recuperação de gatifloxacino na forma farmacêutica comprimidos
obtidos por titrimetria em meio não-aquoso utilizando ácido perclórico 0,1 M em ácido
acético glacial.
Substância de referência
adicionada (mg)
Substância de referência
recuperada (mg)
Recuperação
(%)
10,1 9,91 98,1
20,3 20,42 100,6
39,7 39,56 99,6
5.1.2. Teor de gatifloxacino nos comprimidos e precisão do método em análise
titrimétrica
A Tabela 12 apresenta os valores experimentais da amostra de gatifloxacino nos
comprimidos, obtidos no doseamento titrimétrico, bem como a precisão do método pelo
valor do coeficiente de variação.
Tabela 12. Valores experimentais da amostra obtidos no doseamento titrimétrico.
Dia 1 (%) Dia 2 (%) Dia 3 (%) Teor médio (%)
1 100,48 99,72 101,37
2 100,85 100,02 101,32
3 99,65 99,72 100,79
Desvio
padrão 0,61 0,17 0,32
CV % 0,61 0,17 0,32
Média 100,28 99,82 101,16 100,42
5.2. Metodologia analítica por espectrofotometria na região UV
5.2.1. Espectro de absorção da substância de referência GATX
O espectro de absorção na região UV de GATX-SR com concentração de 24 g/mL em
água deionizada está representado na Figura 13.
Figura 13. Espectro de absorção de solução de GATX-SR, na concentração de 24 g/mL,
por espectrofotometria na região do UV, utilizando água deionizada.
5.2.2. Curva de Ringbom de GATX utilizando água deionizada como solvente
A Tabela 13 apresenta os valores utilizados na construção da curva de Ringbom para
GATX-SR utilizando água deionizada como solvente e a Figura 14 a curva de Ringbom
correspondente.
Tabela 13. Valores obtidos para construção da curva de Ringbom para GATX-SR em água
deionizada.
Solução de
GATX-SR
100 g/mL (mL)
Volume do balão
volumétrico (mL)
Concentração
( g/mL)
Absorvância 100-T%
1,0 200 0,5 0,035 7,74
1,0 100 1,0 0,079 16,63
1,0 50 2,0 0,157 30,33
1,5 50 3,0 0,217 39,32
1,0 25 4,0 0,316 51,69
0,5 10 5,0 0,389 59,16
0,6 10 6,0 0,456 65,00
0,7 10 7,0 0,565 72,77
0,8 10 8,0 0,633 76,72
0,9 10 9,0 0,701 80,09
1,0 10 10,0 0,790 83,78
1,2 10 12,0 0,932 88,3
1,4 10 14,0 1,108 92,2
1,6 10 16,0 1,229 94,09
1,8 10 18,0 1,406 96,07
2,0 10 20,0 1,555 97,21
2,4 10 24,0 1,823 98,49
2,8 10 28,0 2,128 99,25
3,2 10 32,0 2,422 99,62
3,6 10 36,0 2,709 99,80
4,0 10 40,0 2,960 99,89
5,0 10 50,0 3,311 99,95
Figura 14. Curva de Ringbom para gatifloxacino substância de referência utilizando água
deionizada como solvente.
5.2.3.Construção da curva padrão de GATX utilizando água deionizada como solvente.
A Tabela 14 apresenta os valores experimentais obtidos na construção da curva padrão
para GATX-SR, utilizando água deionizada como solvente, e a Figura 15 a curva padrão
correspondente.
Tabela 14. Valores experimentais obtidos na construção da curva padrão para GATX.
Concentração
(µg/mL)
Absorvância* Absorvância média
± e.p.m.
Desvio
padrão
CV%
4,0
0,311
0,323
0,321
0,318 ± 0,0037 0,0064 2,02
0,470
6,0 0,468
0,474
0,470 ± 0,0017 0,0030 0,60
8,0
0,619
0,622
0,646
0,629 ± 0,0085 0,0147 2,35
10,0
0,767
0,769
0,790
0,775 ± 0,007356 0,0127 1,60
12,0
0,921
0,938
0,962
0,940 ± 0,0118 0,0205 2,19
14,0
1,070
1,072
1,117
1,086 ± 0,0153 0,0265 2,44
*Média de três leituras
e.p.m. - erro padrão da média
CV% - coeficiente de variação percentual
Figura 15. Representação gráfica da curva padrão (e o coeficiente de correlação) das
soluções de gatifloxacino em concentrações de 4,0 a 14,0 µg/mL pelo método
espectrofotométrico na região de ultravioleta a 287nm.
5.2.4. Análise estatística
A Tabela 15 apresenta os valores experimentais obtidos para GATX na construção da
curva padrão.
Tabela 15. Parâmetros estatísticos obtidos na construção da curva padrão para GATX-SR,
utilizando água deionizada.
X
(μg/mL)
Absorvância(
Y)
x-(xmédio
)
x-(xmédio).y x-(xmédio
)2
ymédio
observado
ymédio
calculado
4 0,311 -5 -1,555 25
4 0,323 -5 -1,615 25
4 0,321 -5 -1,605 25
0,318 0,318
6 0,470 -3 -1,410 9
6 0,468 -3 -1,404 9
6 0,474 -3 -1,422 9
0,470 0,472
8 0,619 -1 -0,619 1
8 0,622 -1 -0,622 1
8 0,646 -1 -0,646 1
0,629 0,626
10,0 0,767 1 0,767 1
10,0 0,769 1 0,769 1
10,0 0,790 1 0,790 1
0,775 0,780
12,0 0,921 3 2,763 9
12,0 0,938 3 2,814 9
12,0 0,962 3 2,886 9
0,940 0,934
14,0 1,070 5 5,35 25
14,0 1,072 5 5,36 25
14,0 1,117 5 5,585 25
1,086 1,088
Σ =162 Σ = 12,66 Σ = 16,186 Σ = 210 Σ = 4,218
X =9 X =0,703
O valor de ymédio calculado foi obtido pela equação abaixo:
ycalculado = a +(b.(X1 – XM), onde:
a = média do yobservado b = Soma x-(xmédio).y/Soma x-(xmédio)2
b = 16,186/210
A Tabela 16 apresenta o desvio de linearidade dos valores experimentais utilizados na
construção da curva de calibração de GATX-SR em água deionizada.
Tabela 16. Desvio de linearidade dos valores experimentais utilizados na construção da curva
padrão para gatifloxacino
X(μg/mL) yobs ycalculado (ycalc –yobs) (ycalc – yobs)2 n(ycalc – yobs)2
4 0,318 0,318 0,0 0,0 0,0
6 0,470 0,472 -0,002 0,000004 0,000012
8 0,629 0,626 0,003 0,000009 0,000027
10 0,775 0,780 -0,005 0,000025 0,000075
b = 0,077076a = 0,703
12 0,940 0,934 0,006 0,000036 0,000108
14 1,086 1,088 -0,002 0,000004 0,000012
SOMA 0,000078 0,000234
A Tabela 17 apresenta a análise variância dos valores utilizados na curva padrão.
Tabela 17. Análise variância (ANOVA) dos valores experimentais utilizados para a obtenção
da curva padrão
X(µg/ml) 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0
Y1 0,311 0,470 0,619 0,767 0,921 1,070
Y2 0,323 0,468 0,622 0,769 0,938 1,072
Y3 0,321 0,474 0,646 0,790 0,962 1,117
ΣY 0,955 1,412 1,887 2,326 2,821 3,259
Ymédio 0,318 0,470 0,629 0,775 0,940 1,086
(ΣY)2 0,912 1,993744 3,560769 5,410276 7,958041 10,621081
Y2 0,096721 0,2209 0,383161 0,588289 0,848241 1,1449
Y2 0,104329 0,219024 0,386884 0,591361 0,879844 1,149184
Y2 0,103041 0,224676 0,417316 0,6241 0,925444 1,247689
n = 3
ΣY2 0,304091 0,6646 1,187361 1,80375 2,653529 3,541773
T 12,66 SQdesvios(VT) = 1,250904
T2 160,2756 SQentre(VE) = 1,2471
Σ 10,155104 SQdentro(res) = 0,003804
Equações utilizadas para calcular os valores de T, Σ, Sqdesvios (VT), Sqentre (VE) e
Sqdentro(res).
T= Soma ΣY
Σ = Soma ΣY2
SQdesvios(VT) = Σ – (T2/18)
SQentre(VE) = ((ΣY)2/3) – T2/18
SQdentro(res) = VT – VE
A Tabela 18 apresenta o cálculo do coeficiente de correlação da curva de calibração do
método espectrofotométrico de GATX-SR na região UV.
Tabela 18. Valores experimentais utilizados para o cálculo do coeficiente de correlação da
curva de calibração do método espectrofotométrico de gatifloxacino na região UV.
Dx dy dx.dy dx2 dy2
-5 -0,385 1,925 25 0,148225
-3 -0,233 0,699 9 0,054289
-1 -0,074 0,074 1 0,005476
1 0,072 0,072 1 0,005184
3 0,237 0,711 9 0,056169
5 0,383 1,915 25 0,146689
SOMA 5,396 70 0,416032
O valor de Dy, Dx e r, foram obtidos através das
seguintes fórmulas:
A validade da regressão linear da curva padrão média obtida foi calculada através de
análise de variância (ANOVA) dos valores de absorvância determinados na obtenção da
Dx = x- (xmédio)
r = (soma dx.dy)/RAIZ(somadx2 x somady2)r = 5,396/RAIZ (70 x 0,416032)r = 0,9999r2 = 0,9998
Dy = ymédioobs – média ymédioobs
curva padrão de gatifloxacino pelo método espectrofotométrico na região UV está
apresentada na Tabela 19.
Tabela 19. Análise de variância das absorvâncias obtidas na curva padrão de gatifloxacino
por espectrofotometria UV.
Fontes de
variação
gL Soma dos
quadrados
Variância Fcalc Ftab
Entre 5 1,2471 0,24942 786,81* 3,11
Regressão linear 1 1,246866 1,246866 3933,33* 4,75
Desvio de
linearidade
4 0,000234 0,0000585 0,18 3,26
Resíduo 12 0,003804 0,000317
Total 17
*Significativo p< 0,05
5.2.5. Parâmetros do tratamento estatístico sobre os valores experimentais obtidos para
a curva padrão
A Tabela 20 apresenta os parâmetros do tratamento estatístico sobre os valores
experimentais obtidos para a curva padrão.
Tabela 20. Parâmetros do tratamento estatístico sobre os valores experimentais obtidos para
a curva padrão.
Parâmetros Resultados
(nm) 287
Faixa de concentração utilizada (μg/mL) 4,0 - 14,0
Equação: y = bx + a y = 0,077x + 0,703
a 0,703
b (sensibilidade) 0,077
r (coeficiente de correlação) 0,9998
n 6
5.2.6. Teste de recuperação para GATX
A Tabela 21 apresenta os valores obtidos no teste de recuperação para GATX-SR
utilizando a espectrofotometria UV a 287 nm.
Tabela 21. Valores obtidos no teste de recuperação para GATX-SR utilizando a
espectrofotometria UV a 287 nm.
Concentração teórica
adicionada
(µg/mL)
Concentração
Recuperada
(µg/mL)
Recuperação
(%)
R1 2,0 1,96 98,00
R2 4,0 3,97 99,25
R3 6,0 5,91 98,50
5.2.7. Precisão do método e valores experimentais obtidos na determinação do teor de
gatifloxacino nos comprimidos por espectrofotometria na região UV
A Tabela 22 apresenta os valores experimentais dos comprimidos obtidos pelo método
espectrofotométrico na região UV para gatifloxacino, bem como a precisão do método.
Tabela 22. Valores experimentais dos comprimidos, obtidos por espectrofotometria na
região UV e a precisão do método representado pelo coeficiente de variação.
Quantidade
encontrada (mg)
Teor (%) Teor médio
(%)
Desvio
padrão
CV%
1 392,20 98,05
2 387,70 96,90
3 397,58 99,40
4 393,40 98,30
5 393,70 98,40
6 394,30 98,60
98,32 0,81 0,83
5.3. Cromatografia líquida de alta eficiência
5.3.1. Cromatogramas de GATX-SR e GATX-comp.
As Figuras 16 e 17 apresentam os cromatogramas de GATX-comp. e GATX-SR.
Figura 16. Cromatograma obtido por CLAE para solução aquosa de comprimidos (12
g/mL). Fase móvel: ácido acético 5%: metanol: acetonitrila (70:15:15); Coluna phenomenex
C18 (250 x 4,6 mm); Tempo de retenção 5,00 min.
Figura 17. Cromatograma obtido por CLAE para solução aquosa de GATX-SR (12
g/mL). Fase móvel: ácido acético 5%: metanol: acetonitrila (70:15:15); Coluna phenomenex
C18 (250 x 4,6 mm); Tempo de retenção 5,00 min.
5.3.2. Curva padrão
A Tabela 23 apresenta os valores experimentais obtidos na construção da curva padrão
para GATX-SR por CLAE e a Figura 18 a curva padrão correspondente.
Tabela 23. Áreas absolutas obtidas para construção da curva padrão por CLAE
Concentração
( g/mL)
Áreas absolutas Área absolutas média ±
e.p.m.
CV %
4,0
179639
182206
175806
179217 ± 1859,53 1,80
6,0
278896
274408
273642
275648,70 ± 1638,65 1,03
8,0
368751
363621
384585
372319,00 ± 6309,26 2,94
10,0
454490
453480
457082
453985,30 ± 1072,72
0,41
12,0
556075
547162 553096,30 ± 2967,17 0,93
(B)
556052
14,0
644872
654550
652066
650496,00 ± 2901,99 0,77
e.p.m.=erro padrão da média
CV% = coeficiente de variação
y = 46861,80x + 414299,05r2= 0,9995
Figura 18. Representação gráfica da curva padrão (e o coeficiente de correlação) das
soluções de gatifloxacino em concentrações de 4,0 a 14,0 µg/mL pelo método em CLAE,
com detecção à 287 nm.
5.3.3. Análise estatística
A Tabela 24 apresenta os valores experimentais obtidos para GATX na construção da
curva padrão.
Tabela 24. Parâmetros estatísticos obtidos na construção da curva padrão para GATX-SR
em CLAE
x(μg/mL) Áreas(y) x-(xmédi
o)
x-(xmédio).y x-(xmédio)
2
ymédio
observado
ymédio
calculado
4 179639 -5 -898195,00 25
4 182206 -5 -911030,00 25
4 175806 -5 -879030,00 25
179217,00 179990
6 278896 -3 -836688,00 9
6 274408 -3 -823224,00 9
6 273642 -3 -820926,00 9
275648,667 273714
8 368751 -1 -368751,00 1
8 363621 -1 -363621,00 1
8 384585 -1 -384585,00 1
372319,00 367437
10,0 454490 1 454490,00 1
10,0 453480 1 453480,00 1
10,0 457082 1 457082,00 1
455017,33 461161
12,0 556075 3 1668225,00 9
12,0 547162 3 1668156,00 9
12,0 556052 3 1668156,00 9
553096,33 554884
14,0 644872 5 3224360,00 25
14,0 654550 5 3272750,00 25
14,0 652066 5 3260330,00 25
650496,00 648608
Σ =162 9840979 Σ = 210 Σ = 2485794
Média =
414299,0556
O valor de ymédio calculado foi obtido pela equação abaixo:
ycalculado = a +(b.(X1 – XM), onde:
a = média do yobservado b = Soma x-(xmédio).y/Soma x-(xmédio)2
b = 9840979/210
A Tabela 25 apresenta o desvio de linearidade dos valores experimentais utilizados na
construção da curva de calibração de GATX-SR em água deionizada.
a = 414299,0556 b = 46861,80
Tabela 25. Desvio de linearidade dos valores experimentais utilizados na construção da curva
padrão para gatifloxacino em CLAE.
X (μg/mL) yobs ycalculado ( y c a l c
–yobs)
(ycalc – yobs)2 n(ycalc –
yobs)2
4 179217 179990 773,03 597578,080 1792734,24
6 275648,67 273714 -193,035 3744323,286 11232969,86
8 372319 367437 -4881,75 23831475,314 71494425,94
10 455017,33 461161 6143,53 37742923,805 113228771,41
12 553096,33 554884 1788,14 3197432,171 9592296,51
14 650496 648608 -1887,92 3564244,324 10692732,97
Σ 72677976,980 218033930,94
A Tabela 26 apresenta a análise variância dos valores utilizados na curva padrão emCLAE.
Tabela 26. Elementos para análise variância (ANOVA) dos valores experimentais utilizados
para a obtenção da curva padrão em CLAE.
X 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0
Y1 179639 278896 368751 454490 556075 644872
n = 3
Y2 182206 274408 363621 453480 547162 654550
Y3 175806 273642 384585 457082 556052 652066
ΣY 537651 826946 1116957 1365052 1659289 1951488
Ymédi
o
179217 275649 372319 455017 553096 650496
(ΣY)2 2,8906 x
1011
6 , 8 3 8 3 x
1011
12,4759
x 1011
18,6336 x
101127,5323 x 1011 38,0830x
1011
Y2 3 , 2 2 7 0 x
1010
7 , 7 7 8 2 x
1010
1,3597
x 1011
2 , 0 6 5 6 x
1011
3,092194056 x
1011
4 , 1 5 8 5 x
1011
Y2 3 , 3 1 9 9 x
1010
7,5299 x
1010
1 , 3 2 2 2 x
1011
2 , 0 5 6 4 x
1011
2,9938
x 1011
4,2843
x 1011
Y2 3,0907 x
1010
7,4879 x
1010
1 , 4 7 9 0 x
1011
2 , 0 8 9 2 x
1011
3,0919
x 1011
4,2519
x 1011
ΣY2 0,9637 x
1011
2 , 2 7 9 6 x
1011
4 , 1 6 1 0 x
1011
6 , 2 1 1 2 x
1011
9,1779
x 1011
12,6948
x 1011
T 7457383 SQdesvios(VT) = 4,592704183x1011
T2 5,5612561
21x1013
SQentre(VE) =4,588844627x 1011
Σ 3,5488571
52x1012
SQdentro(res) =385955600
Equações utilizadas para calcular os valores de T, Σ, Sqdesvios (VT), Sqentre (VE) e
Sqdentro (res).
T= Soma ΣY
Σ = Soma ΣY2
SQdesvios(VT) = Σ – (T2/18)
SQentre(VE) = ((ΣY)2/3) – T2/18
SQdentro(res) = VT - VE
A Tabela 27 apresenta o cálculo do coeficiente de correlação da curva padrão obtida para
gatifloxacino em CLAE.
Tabela 27. Valores experimentais utilizados para o cálculo do coeficiente de correlação da
curva de calibração em CLAE.
Dx dy dx.dy dx2 dy2
-5 -235082,0556 1175410,30 25 55263572844
-3 -138650,3889 415951,17 9 19223930339
-1 -41980,0556 41980,056 1 1762325068
1 40718,2777 40718,278 1 1657978139
3 138797,2777 416391,83 9 19264684319
5 236197,9444 1180985,7 25 55788996565
Σ = 3271436,3 70 1,52961 x 1011
O valor de Dy e r foram obtidos através das seguintes fórmulas:
A validade da regressão linear da curva padrão média obtida foi calculada através de
análise de variância (ANOVA) dos valores das áreas determinadas na construção da curva
padrão de gatifloxacino em CLAE estão apresentados na Tabela 28.
Tabela 28. Análise de variância das áreas determinadas na obtenção da curva padrão de
gatifloxacino em CLAE.
Fontes de
variação
gL Soma dos
quadrados
Variância Fcalc Fobs
Entre 5 4,58884x1011 91776892366 2853,4848* 3,11
R e g r e s s ã o
linear
1 45866596610 45866596610 14260,6450* 4,75
Desvio de
linearidade
4 218033931 54508482,75 1,6948 3,26
Resíduo 12 385955600 32162966,67
Total 17 45927041830
*Significativo p<0,05
r = (soma dx.dy)/RAIZ(somadx2 x somady2)r = 3271436,3/RAIZ (70 x 1,52961 x 1011)r = 0,9998
Dy = ymédioobs – média ymédioobs
5.3.4. Parâmetros do tratamento estatístico sobre os valores experimentais obtidos para
a curva padrão
A Tabela 29 apresenta os parâmetros do tratamento estatístico sobre os valores
experimentais obtidos para a curva padrão em CLAE.
Tabela 29. Parâmetros do tratamento estatístico sobre os valores experimentais obtidos para
a curva padrão em CLAE.
Parâmetros Resultados
Faixa de concentração utilizada (μg/mL) 4,0 - 14,0
Equação: y = bx + a y = 46861,80x + 414299,05
a 414299,05
b (sensibilidade) 46861,80x
r (coeficiente de correlação) 0,9995
n 6
5.3.5. Teste de recuperação para GATX
A Tabela 30 apresenta os valores experimentais obtidos no teste de recuperação para
GATX-SR utilizando CLAE.
Tabela 30. Valores experimentais obtidos no teste de recuperação para GATX-SR em
CLAE.
Concentração teórica
adicionada
(µg/mL)
Área absoluta
Concentração
encontrada
(µg/mL)
Recuperação
(%)
R1 0,4 463375,25 0,39 99,47
R2 0,8 480829,33 0,78 97,50
R3 1,6 521831,33 1,67 104,79
R4 2,4 553724,33 2,37 98,94
5.3.6. Precisão do método a partir dos valores experimentais obtidos na determinação
de gatifloxacino nos comprimidos por CLAE.
A Tabela 31 apresenta as áreas obtidas na determinação de gatifloxacino nos comprimidos
por CLAE.
Tabela 31. Valores das áreas dos comprimidos, obtidos por CLAE.
Áreas Média Desvio padrão CV%
1
534228
542679,7
550305
2
558050
554826
565591
3
530464
522962
524222
4
541990
541924,5
551313
542404,20
559489
525882,70
545078,80
8042,04
5524,88
4017,25
5401,64
1,48
0,98
0,76
0,99
5.3.7. Teor dos comprimidos em CLAE
A Tabela 32 apresenta o teor de gatifloxacino nos comprimidos analisados.
Tabela 32. Teor de gatifloxacino nos comprimidos em CLAE.
Quantidade encontrada
de comprimido (mg)
Áreas absolutas Teor (%) Teor médio
(%)
1 12,04
534228,00
542679,70
550305,0099,01
2 12,42
558050,00
554826,00
565591,00102,13
3 11,67
530464,00
522962,00
524222,0097,30
4 12,10
541990,00
541924,50
551313,00100,91
99,83
5.4. Doseamento microbiológico
5.4.1. Doseamento microbiológico de gatifloxacino em delineamento 3 x 3
A Tabela 33 apresenta o ensaio da amostra 1, no doseamento de gatifloxacino, em difusão
em ágar cilindros em placa, delineamento 3 x 3.
Tabela 33. Valores correspondentes ao ensaio da amostra 1, no doseamento de gatifloxacino
(comprimido), difusão em ágar cilindros em placa, delineamento 3 x 3.
Placas P1 P2 P3 A1 A2 A3
1 19,96 21,60 23,27 19,64 21,43 23,27
2 19,79 21,76 23,13 19,79 21,65 23,14
3 20,00 21,51 23,11 20,03 21,58 23,22
4 19,84 21,50 23,27 19,83 21,49 23,26
5 19,82 21,67 23,23 19,82 21,72 23,22
6 19,75 21,53 23,21 19,75 21,58 23,29
Média 19,86 21,60 23,20 19,81 21,58 23,23
CV % 0,50 0,48 0,30 0,65 0,49 0,23
O Quadro 1 apresenta cálculo da potência de gatifloxacino no ensaio da amostra 1, no
doseamento microbiológico em difusão em ágar cilindros em placa, utilizando a equação de
H E W I
T T
(1977).
Quadro 1. Cálculo da potência de gatifloxacino no ensaio da amostra 1, no doseamento
microbiológico em difusão em ágar cilindros em placa.
A Tabela 34 apresenta o ensaio da amostra 2, no doseamento de gatifloxacino, em difusão
em ágar cilindros em placa, delineamento 3 x 3.
Tabela 34. Valores correspondentes ao ensaio da amostra 2, no doseamento de gatifloxacino
comprimido, difusão em ágar cilindros em placa, delineamento 3 x 3
Placas P1 P2 P3 A1 A2 A3
1 19,66 21,82 23,18 19,81 21,82 23,12
2 19,63 21,28 23,18 19,91 21,12 23,21
3 19,70 21,14 23,03 19,70 21,14 23,10
4 19,96 21,92 23,05 19,77 21,56 23,10
5 20,00 21,49 23,08 20,03 21,49 23,10
6 19,78 21,79 23,07 19,78 21,80 23,25
F = 1/3 [(A3 + A2 +A1) - (P1 + P2 +P3)]F = 1/3 [( 19,81 + 21,58 + 23,23)] – (19,86 + 21,60+ 23,20)]F = -0,013333
I = log2 I = 0,301E = ¼ [(A3 + P3) - (A1 + P1)]E = ¼ [(23,23 + 23,20) – (19,81+ 19,86)]E = 1,69b= 1,69/0,301 b = 5,61
Média 19,79 21,57 23,10 19,83 21,49 23,15
CV % 0,79 1,48 0,28 0,60 1,43 0,29
O Quadro 2 apresenta cálculo da potência de gatifloxacino no ensaio da amostra 2, no
doseamento microbiológico em difusão em ágar cilindros em placa, utilizando a equação de
HEWITT (1977).
Quadro 2. Cálculo da potência de gatifloxacino no ensaio da amostra 2, no doseamento
microbiológico em difusão em ágar cilindros em placa.
A Tabela 35 apresenta o ensaio da amostra 3, no doseamento de gatifloxacino, em difusão
em ágar cilindros em placa, delineamento 3 x 3.
Tabela 35. Valores correspondente ao ensaio da amostra 3, no doseamento de gatifloxacino
comprimido, difusão em ágar cilindros em placa, delineamento 3 x 3
Placas P1 P2 P3 A1 A2 A3
1 19,47 21,24 23,13 19,45 21,24 23,22
2 19,66 21,38 23,18 19,65 21,41 23,38
3 19,46 21,47 23,19 19,59 21,48 23,36
4 19,32 21,43 23,10 18,79 21,53 23,11
F = 1/3 [(A3 + A2 +A1) - (P1 + P2 +P3)]F = 1/3 [(19,83 + 21,49 + 23,15)] – (19,79 + 21,57+ 23,10)]
F = 0,0033
I = log2 I = 0,301E = ¼ [(A3 + P3) - (A1 + P1)]E = ¼ [(23,15 + 23,10) – (19,83+ 19,79]E = 1,6575b= 1,6575/0,301 b = 5,506
5 19,58 21,24 23,22 19,66 21,39 23,32
6 19,44 21,40 23,20 19,72 21,31 23,30
Média 19,49 21,36 23,17 19,48 21,39 23,28
CV % 0,61 0,46 0,20 1,79 0,50 0,43
O Quadro 3 apresenta cálculo da potência de gatifloxacino no ensaio da amostra 3, no
doseamento microbiológico em difusão em ágar cilindros em placa, utilizando a equação de
HEWITT (1977)
Quadro 3. Cálculo da potência de gatifloxacino no ensaio da amostra 3, no doseamento
microbiológico em difusão em ágar cilindros em placa.
5.4.2. Análise estatística do doseamento microbiológico
A Tabela 36 apresenta os valores correspondentes da análise estatística do ensaio da
amostra 1 (Tabela 33), no doseamento de gatifloxacino, difusão em ágar cilindros em placa,
delineamento 3 x 3.
F = 1/3 [(A3 + A2 +A1) - (P1 + P2 +P3)]F = 1/3 [(19,48 + 21,39 + 23,28)] – (19,49 + 21,36+ 23,17)]
F = 0,0433
I = log2 I = 0,301E = ¼ [(A3 + P3) - (A1 + P1)]E = ¼ [(23,28 + 23,17) – (19,48+ 19,49)]E = 2,0b= 2/0,301 b = 6,6445M = 0,0433/6,6445 M = 0,00721
Tabela 36. Análise estatística do ensaio da amostra 1, no doseamento de gatifloxacino,
difusão em ágar cilindros em placa, delineamento 3 x 3.
Fontes de variação gL SQ QM Fcal Ftab.
Preparação 1 0,002 0,002 0,156 4,24
Regressão 1 68,682 68,682 6679,941* 4,24
Desvio de paralelismo 1 0,010 0,010 0,934 4,24
Quadrático 1 0,027 0,027 2,648 4,24
Diferença de quadrático 1 0,000 0,000 0,019 4,24
Entre doses 5 68,720 13,744 1336,739* 2,6
Entre placas 5 0,020 0,004 0,384 2,6
Dentro (erro) 25 0,257 0,010 ........ ........
Total 35 69,00 ........... ......... .........
*Significativo para p <0,05
A Tabela 37 apresenta os valores correspondentes da análise estatística do ensaio da
amostra 2 (Tabela 34), no doseamento de gatifloxacino, difusão em ágar cilindros em placa,
delineamento 3 x 3.
Tabela 37. Análise estatística do ensaio da amostra 2, no doseamento de gatifloxacino,
difusão em ágar cilindros em placa, delineamento 3 x 3.
Fontes de variação gL SQ QM Fcal Ftab.
Preparação 1 0,000 0,000 0,002 4,24
Regressão 1 65,803 65,803 2014,283* 4,24
Desvio de paralelismo 1 0,000 0,000 0,001 4,24
Quadrático 1 0,033 0,033 1,008 4,24
Diferença de quadrático 1 0,035 0,035 1,061 4,24
Entre doses 5 65,871 13,174 403,271* 2,6
Entre placas 5 0,398 0,080 2,438 2,6
Dentro (erro) 25 0,817 0,033 ........ .......
Total 35 67,09 ........... ......... ........
*Significativo para p<0,05
A Tabela 38 apresenta os valores correspondentes da análise estatística do ensaio da
amostra 3 (Tabela 35), no doseamento de gatifloxacino, difusão em ágar cilindros em placa,
delineamento 3 x 3.
Tabela 38. Análise estatística do ensaio da amostra 3, no doseamento de gatifloxacino,
difusão em ágar cilindros em placa, delineamento 3 x 3.
Fontes de variação gL SQ QM Fcal Ftab.
Preparação 1 0,018 0,018 0,738 4,24
Regressão 1 84,075 84,075 3492,271* 4,24
Desvio de paralelismo 1 0,023 0,023 0,948 4,24
Quadrático 1 0,004 0,004 0,168 4,24
Diferença de quadrático 1 0,001 0,001 0,023 4,24
Entre doses 5 84,120 16,824 698,830* 2,6
Entre placas 5 0,242 0,048 2,008 2,6
Dentro (erro) 25 0,602 0,024
Total 35 84,96
*Significativo para p<0,05
5.4.3. Curva padrão de GATX no doseamento microbiológico
A Tabela 39 apresenta os valores obtidos na construção da curva padrão no doseamento
microbiológico para gatifloxacino.
Tabela 39. Valores médios obtidos no doseamento microbiológico de gatifloxacino, em
difusão em ágar cilindros em placa, para obtenção da curva de calibração.
Concentração
de GATX-SR
(µg/mL)
Diâmetro dos halos de
inibição*(mm)
Diâmetro
médio (mm)
Desvio
padrão
CV
(%)
PADRÃO
P1 4,0
19,79
19,86
19,49
19,71 0,196554 1,00
P2 8,0
21,57
21,60
21,36
21,51 0,130767 0,61
P3 16,0
23,10
23,20
23,17
23,15 0,051316 0,22
* Cada valor corresponde a média de 6 halos de inibição
CV% - coeficiente de variação percentual
5.4.4. Construção da curva padrão de GATX-SR no doseamento microbiológico pelo
método de difusão em ágar, cilindros em placa
A curva padrão no doseamento microbiológico pelo método de difusão em ágar,
cilindros em placa de GATX-SR está representada na Figura 19.
Figura 19. Curva padrão do GATX-SR obtida no doseamento microbiológico em
difusão em ágar, cilindros em placa.
5.4.5. Teste de recuperação de gatifloxacino no doseamento microbiológico
A Tabela 40 apresenta os valores experimentais obtidos no teste de recuperação do ensaio
microbiológico das três amostras do gatifloxacino.
Tabela 40. Valores experimentais obtidos no doseamento microbiológico de gatifloxacino no
teste de recuperação para o ensaio das três amostras (R1, R2 e R3).
Quantidade
da amostra
adicionada
(mg)
Valor da
substância
padrão
adicionada
(mg)
Concentração
teórica da
amostra + padrão
(mg)
Potência em
cada ensaio
(%)
Concentração
encontrada
(mg)*
R1 10 0,5 10,5 105,30 10,530
R2 10 1,0 11,0 110,05 11,005
R3 10 1,5 11,5 115,31 11,531
*O cálculo é realizado levando em consideração o valor de amostra adicionada.
A Tabela 41 apresenta os valores experimentais obtidos para o teste de recuperação de
gatifloxacino no doseamento microbiológico difusão em ágar cilindros em placa.
Tabela 41. Valores experimentais obtidos para o teste de recuperação de gatifloxacino no
doseamento microbiológico difusão em ágar cilindros em placa.
Concentração de
substância de referência
adicionada (mg)
Atividade de padrão
recuperada (mg)
Recuperado (%)
1 0,5 0,501 100,20
2 1,0 0,976 97,60
3 1,5 1,501 100,13
5.4.6. Potência dos comprimidos de gatifloxacino no doseamento microbiológico
A Tabela 42 apresenta os valores experimentais obtidos para o doseamento de
comprimidos de gatifloxacino, através do ensaio microbiológico.
Tabela 42. Valores experimentais obtidos para o doseamento de comprimidos de
gatifloxacino, através do ensaio microbiológico difusão em ágar, cilindros em placa.
Amostra Valor encontrado
(mg/comp)
Teor (%) Média CV%
1 396,88 99,22
2 400,52 100,15 100,29 1,14
3 406,04 101,51
5.5. Identificação de gatifloxacino por cromatografia em camada delgada
A Figura 20 apresenta o cromatograma de GATX-SR e GATX-comp. analisados no
sistema solvente diclorometano: metanol: hidróxido de amônio: acetonitrila (6:4:1:2,
V:V:V:V).
Figura 20. Representação gráfica do cromatograma de GATX-SR e GATX-comp. no
sistema solvente diclorometano: metanol: hidróxido de amônio: acetonitrila (6:4:1:2,
V:V:V:V). 1-solução padrão de GATX. 2-solução-amostra de GATX. Valor de Rf = 0,20.
A Figura 21 apresenta o cromatograma de GATX-SR e GATX-comp. analisados no
sistema solvente no sistema solvente diclorometano: metanol: acetonitrila: ácido acético 5%
(6:4:4:2, V:V:V:V).
Figura 21. Representação gráfica do cromatograma de GATX-SR e GATX-comp. no
sistema solvente diclorometano: metanol: acetonitrila: ácido acético 5% (6:4:4:2, V:V:V:V).
1-solução padrão de GATX. 2-solução-amostra de GATX. Valor de Rf = 0,65.
A Figura 22 apresenta o cromatograma de GATX-SR e GATX-comp. analisados no
sistema solvente diclorometano: metanol: acetonitrila: ácido acético 5% (6:4:2:2, V:V:V:V).
Figura 22. Representação gráfica do cromatograma de GATX-SR e GATX-comp. no
sistema solvente diclorometano: metanol: acetonitrila: ácido acético 5% (6:4:2:2, V:V:V:V).
1-solução padrão de GATX. 2-solução-amostra de GATX. Valor de Rf = 0,55.
A Figura 23 apresenta o cromatograma de GATX-SR e GATX-comp. analisados no
sistema clorofórmio: metanol: ácido fórmico: água (16:7:3:0,5, V:V:V:V).
Figura 23. Representação gráfica do cromatograma de GATX-SR e GATX-comp. no
sistema solvente clorofórmio: metanol: ácido fórmico: água (16:7:3:0,5, V:V:V:V). 1-solução
padrão de GATX. 2-solução-amostra de GATX. Valor de Rf = 0,74.
A Figura 24 apresenta o cromatograma de GATX-SR e GATX-comp. analisados no
sistema clorofórmio: metanol: ácido fórmico (18:7:1, V:V:V).
Figura 24. Representação gráfica do cromatograma de GATX-SR e GATX-comp. no
sistema solvente clorofórmio: metanol: ácido fórmico (18:7:1, V:V:V).1-solução padrão de
GATX. 2-solução-amostra de GATX. Valor de Rf = 0,55.
A Figura 25 apresenta o cromatograma de GATX-SR e GATX-comp. analisados no
sistema clorofórmio: metanol: ácido fórmico: água (33:7:3:0,5, V:V:V:V).
Figura 25. Representação gráfica do cromatograma de GATX-SR e GATX-comp. no
sistema solvente clorofórmio: metanol: ácido fórmico: água (33:7:3:0,5, V:V:V:V). 1 -
solução padrão de GATX. 2 - solução-amostra de GATX. Valor de Rf = 0,7.
A Figura 26 apresenta o cromatograma de GATX-SR e GATX-comp. analisados no
sistema n-butanol: ácido acético: água (40:10:50, V:V:V).
Figura 26. Representação gráfica do cromatograma de GATX-SR e GATX-comp. no
sistema solvente n-butanol: ácido acético: água (40:10:50, V:V:V). 1- solução padrão de
GATX. 2 - solução-amostra de GATX. Valor de Rf = 0,22.
A Tabela 43 apresenta os Rf dos diversos sistemas solventes empregados na análise de
GATX-SR e GATX-comp.
Tabela 43. Sistemas de fases móveis testados para GATX-SR e GATX-comp.
Sistema solvente GATX-SR e GATX-comp. (Rf)
Diclorometano: metanol: hidróxido de
amônio: acetonitrila (6:4:1:2, V:V:V:V) 0,20
Diclorometano: metanol: acetonitrila: ácido
acético 5% (6:4:4:2, V:V:V:V). 0,65
Diclorometano: metanol: acetonitrila: ácido
acético 5% (6:4:2:2, V:V:V:V). 0,55
Clorofórmio:metanol:ácido fórmico:água
(16:7:3:0,5, V:V:V:V) 0,74
Clorofórmio:metanol:ácido fórmico (18:7:1,
V:V:V) 0,55
Clorofórmio:metanol:ácido fórmico:água
(33:7:3:0,5, V:V:V:V) 0,70
n-butanol:ácido acético:água (40:10:50,
V:V:V) 0,22
5.6. Identificação de gatifloxacino utilizando a cromatografia em camada delgada e
diferenciação deste fármaco frente a outras fluorquinolonas.
A Figura 27 apresenta o cromatograma das cinco fluorquinolonas (GATX, SPAX,
CIPX, LOME, LEVX) em sistema solvente clorofórmio: metanol: ácido fórmico: água
(16:7:3:0,5, V:V:V:V).
Figura 27. Representação gráfica do cromatograma das cinco fluorquinolonas (GATX,
SPAX, CIPX, LOME, LEVX) em sistema solvente clorofórmio: metanol: ácido fórmico:
água (16:7:3:0,5, V:V:V:V). Valores de Rf: 1 - GATX-SR e 2- GATXcomp Rf = 0,74; 3 -
SPAX Rf = 0,82; 4 - CIPX Rf = 0,57; 5 - LOME Rf= 0,74; 6 - LEVX Rf = 0,42.
A Figura 28 apresenta a representação gráfica do cromatograma das cinco
fluorquinolonas (GATX, SPAX, CIPX, LOME, LEVX) em sistema solvente clorofórmio:
metanol: ácido fórmico (18:7:1, V:V:V).
Figura 28. Representação gráfica do cromatograma das cinco fluorquinolonas (GATX,
SPAX, CIPX, LOME, LEVX) em sistema solvente clorofórmio: metanol: ácido fórmico
(18:7:1, V:V:V). Valores de Rf: 1 - GATX-SR e 2 - GATX comp Rf = 0,55; 3 - SPAX Rf =
0,70; 4 –
CIPX Rf = 0,24; 5 - LOME Rf= 0,55; 6 - LEVX Rf = 0,21.
A Figura 29 apresenta a representação gráfica do cromatograma das cinco
fluorquinolonas (GATX, SPAX, CIPX, LOME, LEVX) em sistema solvente clorofórmio:
metanol: ácido fórmico: água (33:7:3:0,5, V:V:V:V).
Figura 29. Representação gráfica do cromatograma das cinco fluorquinolonas (GATX,
SPAX, CIPX, LOME, LEVX) em sistema solvente clorofórmio: metanol: ácido fórmico:
água (33:7:3:0,5, V:V:V:V). Valores de Rf: 1 - GATX-SR e 2 - GATXcomp Rf = 0,70; 3 -
SPAX Rf = 0,73; 4 - CIPX Rf = 0,58; 5 - LOME Rf= 0,65; 6 - LEVX Rf = 0,49.
A Figura 30 apresenta a representação gráfica do cromatograma das cinco
fluorquinolonas (GATX, SPAX, CIPX, LOME, LEVX) em sistema solvente diclorometano:
metanol: acetonitrila: ácido acético 5% (6:4:4:2, V:V:V:V).
Figura 30. Representação gráfica do cromatograma das cinco fluorquinolonas (GATX,
SPAX, CIPX, LOME, LEVX) em sistema solvente diclorometano: metanol: acetonitrila:
ácido acético 5% (6:4:4:2, V:V:V:V). Valores de Rf: 1 - GATX-SR e 2 - GATXcomp Rf =
0,65; 3 - SPAX Rf = 0,79; 4 - CIPX Rf = 0,47; 5 - LOME Rf = 0,55; 6 - LEVX Rf = 0,43.
A Figura 31 apresenta a representação gráfica do cromatograma das cinco
fluorquinolonas (GATX, SPAX, CIPX, LOME, LEVX) em sistema solvente diclorometano:
metanol: acetonitrila: ácido acético 5% (6:4:2:2, V:V:V:V).
Figura 31. Representação gráfica do cromatograma das cinco fluorquinolonas (GATX,
SPAX, CIPX, LOME, LEVX) em sistema solvente diclorometano: metanol: acetonitrila:
ácido acético 5% (6:4:2:2, V:V:V:V). Valores de Rf: 1 - GATX-SR e 2 - GATX comp Rf =
0,55; 3 - SPAX Rf = 0,66; 4 - CIPX Rf = 0,39; 5 - LOME Rf = 0,50; 6 - LEVX Rf = 0,31.
A Figura 32 apresenta a representação gráfica do cromatograma das cinco
fluorquinolonas (GATX, SPAX, CIPX, LOME, LEVX) em sistema solvente butanol: ácido
acético 5%:água (40:10:50, V:V:V).
Figura 32. Representação gráfica do cromatograma das cinco fluorquinolonas (GATX,
SPAX, CIPX, LOME, LEVX) em sistema solvente butanol: ácido acético 5%:água
(40:10:50, V:V:V). Valores de Rf: 1 - GATX-SR e 2 - GATXcomp Rf = 0,22; 3 - SPAX Rf
= 0,28; 4 - CIPX Rf = 0,22; 5 - LOME Rf = 0,25; 6 - LEVX Rf = 0,22.
A Figura 33 apresenta a representação gráfica do cromatograma das cinco
fluorquinolonas (GATX, SPAX, CIPX, LOME, LEVX) em sistema solvente diclorometano:
metanol: hidróxido de amônio: acetonitrila (6:4:1:2, V:V:V:V).
Figura 33. Representação gráfica do cromatograma das cinco fluorquinolonas (GATX,
SPAX, CIPX, LOME, LEVX) em sistema solvente diclorometano: metanol: hidróxido de
amônio: acetonitrila (6:4:1:2, V:V:V:V). Valores de Rf: 1 - GATX-SR e 2 - GATXcomp Rf
= 0,20; 3 - SPAX Rf = 0,20; 4 - CIPX Rf = 0,12; 5 - LOME Rf = 0,18; 6 - LEVX Rf = 0,18.
A Tabela 44 apresenta os diferentes Rfs das fluorquinolonas encontrados nos diversos
sistemas de fases móveis testados.
Tabela 44. Apresentação dos diferentes Rfs de várias fluorquinolonas analisadas em CCD.
Sistema solvente
GATX-SR e
GATX-comp
. (Rf)
SPAX
(Rf)
CIPX
(Rf)
LOME
(Rf)
LEVX
(Rf)
Diclorometano: metanol:
hidróxido de amônio:
acetonitrila (6:4:1:2,
V:V:V:V)
0,20 0,20 0,12 0,18 0,18
n-butanol:ácido
acético:água (40:10:50,
V:V:V)
0,22 0,28 0,22 0,25 0,22
Diclorometano: metanol:
acetonitrila: ácido acético
5% (6:4:2:2, V:V:V:V).
0,55 0,66 0,39 0,50 0,31
Clorofórmio:metanol:ácid
o fórmico (18:7:1, V:V:V) 0,55 0,70 0,24 0,55 0,21
Diclorometano: metanol:
acetonitrila: ácido acético
5% (6:4:4:2, V:V:V:V).
0,65 0,79 0,47 0,55 0,43
Clorofórmio:metanol:ácid
o fórmico:água
(33:7:3:0,5, V:V:V:V)
0,70 0,73 0,58 0,70 0,49
Clorofórmio:metanol:ácid
o fórmico:água
(16:7:3:0,5, V:V:V:V)
0,74 0,82 0,57 0,74 0,42
5.7. Espectro de absorção na região do infravermelho
A Figura 34 apresenta o espectro de absorção na região do infravermelho de
GATX-SR.
Figura 34. Espectro na região do infravermelho para GATX-SR em pastilha de KBr.
A Figura 35 apresenta o espectro de absorção na região do infravermelho para
GATX-comp.
Figura 35. Espectro na região do infravermelho para GATX-comp. em pastilha de KBr.
5.8. Análise térmica de gatifloxacino
A calorimetria diferencial de varredura (DSC) permite a análise entre o fluxo de calor para
uma amostra e para uma célula referência que são submetidas as condições de temperatura.
A Figura 36 apresenta o DSC de gatifloxacino substância de referência
Figura 36. Curva de DSC de gatifloxacino substância de referência sob atmosfera de
nitrogênio, em razões de aquecimento de 20o C
A Figura 37 apresenta o DSC de gatifloxacino comprimidos
Figura 37. Curva de DSC de gatifloxacino na forma farmacêutica comprimidos sob
atmosfera de nitrogênio, em razões de aquecimento de 20o C.
6. DISCUSSÃO
Para a análise de fármacos e medicamentos existem várias metodologias nos
compêndios oficiais, que vão desde a cromatografia líquida de alta eficiência a métodos
titrimétricos. Seguindo as diretrizes de validação de métodos analíticos, foram desenvolvidos
e validados, metodologias analíticas para o gatifloxacino, utilizando espectrofotometria-UV,
cromatografia líquida de alta eficiência, doseamento microbiológico difusão em ágar cilindros
em placa e também foi desenvolvido método titrimétrico para análise de gatifloxacino. Além
disto, foi desenvolvido sistema de cromatografia em camada delgada, para identificação do
gatifloxacino, qualitativamente e semi-quantitativamente, em comprimidos, como também sua
diferenciação perante outras fluorquinolonas. A espectrofotometria de absorção na região de
infravermelho e a análise térmica, foram realizadas com o objetivo de identificar o GATX-SR
e GATX-comp.
A escolha dos métodos analíticos para quantificação de gatifloxacino nesta dissertação
seguiu em acordo com os trabalhos publicados na literatura e as monografias padronizadas
nas farmacopéias para fluorquinolonas, empregando doseamento titrimétrico para
norfloxacino e ofloxacino, e CLAE para ciprofloxacino. O doseamento microbiológico foi
realizado com o objetivo de verificar a potência antimicrobiana do gatifloxacino. Há poucos
estudos na literatura em relação ao desenvolvimento de metodologia analítica para esta
fluorquinolona, e pesquisas envolvendo métodos analíticos são de fundamental importância e
altamente relevantes para otimizar sua análise na indústria farmacêutica e garantir a qualidade
do produto a ser comercializado.
O gatifloxacino é comercializado no Brasil, na forma farmacêutica comprimidos e
solução injetável, com o nome de Tequin®, pelo laboratório Bristol-Myers Squibb. O FDA
aprovou e liberou a comercialização do gatifloxacino em 19 de dezembro de 1999, portanto
esta molécula ainda encontra-se sobre patente, na forma farmacêutica comprimidos e solução
injetável. Recentemente, a indústria Allergan produtos farmacêuticos LTDA, colocou no
mercado farmacêutico brasileiro um colírio, de nome comercial Zymar®, tendo como
substância ativa o gatifloxacino. Este produto farmacêutico foi aprovado pelo FDA em 28 de
março de 2003, e no Brasil, seu registro foi aceito pela ANVISA, em agosto de 2003
(BRASIL, 2003).
Apesar da comprovada eficácia e segurança no seu tratamento, este fármaco, até então,
não possui uma metodologia de análise padronizada em compêndios oficiais. Este fato
justifica novas pesquisas nessa área para desenvolvimento de metodologia analítica para esta
fluorquinolona. Os trabalhos encontrados na literatura envolvendo este fármaco estão
relacionados à quantificação em fluidos biológicos. Um dos primeiros trabalhos determinando
esta substância em fluidos biológicos, foi o de Borner (2000) e colaboradores, utilizando
CLAE em fase reversa, com detecção fluorimétrica. Em 2001, Vishwanathan e
colaboradores, desenvolveram e validaram um método para quantificar gatifloxacino no
plasma humano. Em 2002, Liang e colaboradores analisaram várias fluorquinolonas
simultaneamente em CLAE, utilizando uma fase móvel com vários solventes e detecção
fluorimétrica.
O desenvolvimento de metodologia analítica para fármacos e medicamentos é de
fundamental importância para determinação do teor de substância ativa, possíveis
contaminações, produtos de degradação ou falsificações. Vários órgãos oficiais (ICH, 1994;
ICH, 1996; AOAC, 1997; USP 25, 2002) apresentam as diretrizes para a validação de
métodos analíticos e o registro de novos medicamentos. O planejamento dos estudos de
validação é fundamental para garantir que os resultados obtidos reflitam a operação dos
procedimentos analíticos e que o método forneça informações confiáveis. Foram encontrados
na literatura inúmeros materiais que analisam e discutem sobre as definições e parâmetros
para a validação de métodos analíticos. Em muitos artigos publicados, há controvérsia com os
termos seletividade x especificidade. Uma definição bastante pragmática descreve a
seletividade como uma separação (física) de misturas de substâncias, como, por exemplo,
cromatografia e eletroforese, determinando um analito misturado com outras substâncias. A
determinação individual de uma substância na presença de outras substâncias (sem influência
significativa de outras substâncias ou classes de substâncias) é definido como específico
(RILEY, 1996). Os termos seletividade x especificidade são definições que invariavelmente
são citadas em artigos científicos de forma inadequada. É necessário que os termos utilizados
na validação de métodos analíticos sejam adequadamente utilizados, para evitar erros
sistemáticos.
Nos três métodos analíticos desenvolvidos e validados, bem como o método em meio
não aquoso, verificamos que os mesmos são adequados para análise do gatifloxacino em
comprimidos. Realizando uma análise comparativa dos quatro métodos estudados,
observamos que o teor médio encontrado nos comprimidos em cada método variou de
98,00% a 101%. No método titrimétrico encontramos um valor médio de 100,42%, no
método espectrofotométrico na região UV, o teor foi de 98,32%, em CLAE o resultado
obtido foi 99,83% e a potência microbiológica encontrada foi de 100,29%.
6.1. Desenvolvimento de metodologia analítica por titrimetria em meio não-aquoso
A análise titrimétrica é um método químico quantitativo, relativamente antigo, utilizado
largamente nos compêndios oficiais. Com advento de novos métodos analíticos de controle
de fármacos e medicamentos, e com as apresentações sobre validação de métodos analíticos,
esqueceu-se um pouco desta técnica de análise. Entretanto, a titrimetria em meio não aquoso
é a análise volumétrica mais utilizadas nas monografias farmacopéicas. Esta técnica pode ser
utilizada no doseamento de bases fracas ou de ácidos fracos, sendo o doseamento de bases
fracas com ácido perclórico em ácido acético o mais usado. Este agente titulante compete
menos com a substância a ser analisada pela doação ou recepção dos prótons (WATSON,
1999). Nas monografias oficiais de algumas fluorquinolonas, são preconizados métodos
titrimétricos para sua análise. A Farmacopéia Americana (USP 25, 2002) recomenda para o
doseamento de ofloxacino e norfloxacino titulação potenciométrica, dissolvendo o fármaco
em anidrido acético e titulando com ácido perclórico 0,1 M. Na literatura científica,
encontra-se artigo abordando está técnica para outra fluorquinolona, o esparfloxacino
(MARONA e SCHAPOVAL, 2001b).
O gatifloxacino demonstra caráter de dissociação protônica no grupo carboxílico do
carbono 3 e na metilpiperazinila do carbono 7. A reação entre gatifloxacino e o meio não
aquoso com ácido acético glacial é uma reação ácido-base, em que o ácido forte pode doar
um próton ao nitrogênio do anel piperazínico. Desta forma, foi possível realizar este
procedimento, o qual apresentou, desvio padrão e coeficiente de variação no método
titrimétrico desenvolvido menor que 1%, demonstrando que o método possui uma boa
repetibilidade. O teste de recuperação demonstrou que a titulação em meio não aquoso é
exata, tendo um valor absoluto de 99,4%.
O teor médio de gatifloxacino encontrado nos comprimidos foi de 100,42%, em que
verificamos, que os excipientes não interferiam na análise da substância ativa. A linearidade
do gatifloxacino no método titrimétrico não foi realizada, por falta de substância de referência
disponível para a realização da curva padrão. Precisaríamos de pelo menos 4,0 g de
GATX-SR para construir a curva padrão. Devido a esta limitação, não foi possível validar
este método de acordo com as diretrizes de validação estabelecidas. Entretanto, a partir dos
dados obtidos nesta dissertação, como precisão, exatidão e teor de comprimidos,
encaminhamos diretrizes para a validação de gatifloxacino pelo método titrimétrico. A
titulometria é um método econômico, que não precisa de mão de obra especializada e o
tempo para análise é relativamente curto. Tais características são importantes para o controle
de qualidade em farmácias magistrais, preconizado recentemente pela RDC 33 (BRASIL,
2001) que normaliza que estes estabelecimentos realizem controle de qualidade para as
matérias-primas e produto acabado. A titulometria é um método que pode ser facilmente
aplicável a uma farmácia magistral, pois utiliza materiais e vidrarias de simples manipulação e
técnica de análise reduzida. No método desenvolvido, não utilizamos solventes orgânicos
tóxicos, facilitando assim, a aplicação deste método em farmácias magistrais. Uma maneira de
melhorar o método e torná-lo mais especifico ou seletivo, é acoplar um potenciômetro no
erlenmeyer para verificar o ponto de equivalência com maior especificidade para a substância
doseada.
6.2. Desenvolvimento e validação de metodologia analítica em espectrofotometria UV
A espectrofotometria é um método largamente utilizado para determinação de vários
compostos orgânicos (HARGIS et al., 1996). A literatura registra alguns trabalhos utilizando
a espectrofotometria no ultravioleta para análise fluorquinolonas (CARLUCCI et al., 1993;
CAZALLAS et al., 1994; MARONA e SCHAPOVAL, 1999) e a Farmacopéia Americana
(USP 25, 2002) recomenda para análise de cinoxacino cápsulas, a espectrofotometria no UV,
utilizando solução de borato de sódio. Com o conhecimento da estrutura química de
gatifloxacino (Figura 9) e verificando que esta molécula possuía ligações que absorvem luz,
desenvolvemos um método analítico na região UV para este fármaco. Para desenvolver o
método na região UV, primeiramente, verificamos a solubilidade do GATX-SR em água e
etanol, verificando-se que a molécula era solúvel nos dois solventes. Procurando um método
simples, e a utilização de solventes de baixa toxicidade, optamos pela água, por ser um
solvente atóxico e de fácil acesso. O método desenvolvido e validado para gatifloxacino
demonstrou linearidade, precisão e exatidão. O espectro de absorção para gatifloxacino
mostrou um pico de absorção máxima a 287 nm, utilizando solução aquosa de GATX-SR em
concentração de 24 μg/mL. Com o objetivo de verificar-se a faixa de concentração que a
solução de GATX-SR era linear, foi realizada a construção da curva de Ringbom. De acordo
com a lei de Lambert-Beer, o intervalo de concentração de 4,0 - 14,0 μg/mL, mostrou-se
linear, apresentando coeficiente de correlação de 0,9998, entre as concentrações estabelecidas
e as absorções lidas. A equação da reta,obtida porregressão linear através do método dos
mínimos quadrados, foi y = 0,077x + 0,0092 .
A exatidão do método foi verificada pelo teste de recuperação (AOAC, 1997), em que
obtivemos uma recuperação média do GATX-SR de 98,60%. Com este resultado,
comprovamos a exatidão do método proposto, que é um dos requisitos obrigatórios na
validação de métodos analíticos. A precisão do método foi obtida utilizando 6 determinações
de comprimidos de GATX. O coeficiente de variação foi de 0,83 %, demonstrando a precisão
do método com os valores das amostras.
A análise estatística dos resultados das absorvâncias obtidas foi matematicamente
verificada pela análise de variância. Os resultados obtidos, com F significativo para o desvio
de linearidade e regressão, valida o método na região do UV para o gatifloxacino. O teor de
gatifloxacino nos comprimidos foi 98,32%, demonstrando a sensibilidade do método para
quantificar a substância ativa nos comprimidos, não ocorrendo interferência dos excipientes
na absorção do gatifloxacino. O teste de recuperação permite, além da determinação da
exatidão do método, verificar a interferência dos componentes da formulação quando não é
possível omiti-los da formulação.
6.5. Cromatografia líquida de alta eficiência
A cromatografia líquida de alta eficiência é um método analítico, que nos últimos anos
domina as técnicas de análise e determinação de medicamentos, alimentos, ensaios biológicos,
entre outros. A Farmacopéia Americana (USP 25, 2002), dedica a esta técnica, a análise da
maior parte de produtos com monografias neste compêndio. Atualmente, prioriza-se a análise
de produtos farmacêuticos por CLAE, devido a especificidade e seletividade relacionadas à
utilização desta técnica.
Uma das limitações da utilização de CLAE, é o alto custo da análise de um
medicamento por este método, que emprega solventes orgânicos de alta pureza admitidos
para uso e padrões de referências. Entretanto, este método analítico é mais específico, pois
possui coluna de separação que determina o composto analisado, originando uma
identificação mais específica. O método analítico desenvolvido por CLAE, teve como
referência a tese de doutorado de Marona (2000), que validou um método por CLAE com
fase móvel simples, sem a utilização de tampão, que torna as análises em CLAE mais
trabalhosas, pois o sais inorgânicos podem danificar o equipamento e a coluna.
A fase móvel utilizada neste trabalho foi ácido acético 5%: metanol: acetonitrila
(70:15:15,V:V:V). Utilizamos uma fase móvel já conhecida, verificando o tempo de retenção
do gatifloxacino para este sistema solvente, com a coluna de fase reversa. O tempo de
retenção obtido, foi de 5,0 minutos, facilitando o doseamento, pois o tempo gasto para
análise é curto. Em relação à outra fluorquinolona, esparfloxacino, em que foi utilizada a
mesma fase móvel, com coluna de fase reversa, observamos um tempo de retenção de 7,23
minutos, diferindo do GATX, que foi 5,02 minutos. A utilização de ácido acético na fase
móvel, como dito anteriormente, mantém esta substância na forma não dissociada ,
facilitando a eluição de gatifloxacino na fase móvel.
Observamos que este método possui linearidade, precisão, exatidão e especificidade.
Para determinar a linearidade do método foram injetadas soluções entre 4,0 e14,0 µg/mL,
apresentando coeficiente de correlação de 0,9995. A precisão do método foi demonstrado
pelo coeficiente de variação médio de 1,05% entre as amostras do gatifloxacino analisadas. O
estudo de recuperação demonstrou a exatidão do método.
O teor médio encontrado nas amostras analisadas em CLAE, foi de 99, 83%. Os
resultados obtidos demonstraram que este método é adequado para análise de gatifloxacino
em comprimidos e pode ser empregado em análises de rotina em laboratório de controle de
qualidade.
6.3. Doseamento de gatifloxacino de difusão em ágar cilindros em placa
O doseamento microbiológico por difusão em ágar, cilindros em placa, é um método
específico para antibióticos, antimicrobianos e antifúngicos. O ensaio microbiológico vem
sendo utilizado em laboratórios clínicos desde a introdução de antibióticos e outros agentes
antimicrobianos. Na terapêutica, muitos métodos de ensaio foram elaborados pela própria
indústria farmacêutica para controle das preparações comerciais (ANDREWS, 1999).
Embora os métodos microbiológicos demonstrem um desempenho relativamente simples
muitos aspectos devem ser considerados no seu desenvolvimento, para assegurar que eles
sejam suficientemente seguros e exatos. Tais métodos necessitam de mão de obra
especializada e técnica apurada. Deve-se observar vários aspectos durante o desenvolvimento
do método, como temperatura de incubação, espessura do ágar, microrganismo utilizado, pH
da solução diluente, entre outras características para garantir que o método desenvolvido
demonstre uma resposta eficiente. Na literatura, encontramos alguns artigos que relatam o
doseamento de difusão em ágar cilindros em placa, utilizando diferentes classes de
antibióticos e antimicrobianos como gentamicina (RATCLIFF et al., 1981; DELANEY et al.,
1982), cefalosporinas (BIEDENBACH et al., 1993), esparfloxacino (MARONA e
SCHAPOVAL, 1998), azitromicina (BREIER et al., 2002) e ofloxacino (EV e
SCHAPOVAL, 2002).
Para desenvolvermos e validarmos o método, iniciamos realizando alguns testes no
doseamento microbiológico, utilizando vários parâmetros, como por exemplo, diferentes
cepas bacterianas. As bactérias selecionadas para padronização do método foram,
Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli ATCC 25922 e Bacillus subtilis ATCC
9372. As três cepas responderam adequadamente ao método, no entanto, pelo fato do
Staphylococcus aureus ATCC 6538 ser uma cepa de alta virulência para o ser humano,
decidimos utilizá-la caso as outras cepas não respondessem adequadamente, quando os
outros parâmetros fossem analisados.
A espécie bacteriana Escherichia coli ATCC 25922 foi analisada utilizando vários
parâmetros, mas a resposta do crescimento microbiano foi irregular. Posteriormente
utilizamos o Bacillus subtilis ATCC 9372, que obteve um crescimento satisfatório e
uniforme. As concentrações utilizadas no desenvolvimento e validação do método foram
estipuladas, de acordo com a facilidade de diluição das soluções.
A solução tampão escolhida foi em pH 6,0, pois quando preparávamos soluções com
tampão pH 8,0 os halos de inibição do antimicrobiano interpolavam-se e com isso invalidava
o método microbiológico. Isso ocorria, provavelmente devido ao caráter básico do
gatifloxacino, que em pH 8,0, potencializava seu efeito. O doseamento em difusão em ágar
cilindros em placa desenvolvido e validado para gatifloxacino demonstrou ser um método
preciso, exato, linear e sensível. Para assegurar a validade do ensaio microbiológico na
determinação da potência de gatifloxacino, foram utilizadas três concentrações diferentes
para amostra, idênticas às da substância de referência, em delineamento 3 x 3. Estas doses
estão em progressão geométrica (razão 2,0) já que o sistema utilizado possui relação linear
entre o logaritmo da concentração da substância analisada e o diâmetro dos halos de inibição.
Em cada ensaio foram utilizadas seis placas, efetuando-se a leitura dos halos de inibição. Com
os resultados obtidos foi construída a curva de calibração para GATX-SR, calculando-se o
erro padrão da média (Tabela 39) e o coeficiente de correlação (r2 = 0,9992).
A potência dos comprimidos foi calculada pela equação de HEWITT (HEWITT,
1977), em que os resultados obtidos foram excelentes para analisar o teor de gatifloxacino em
comprimidos, obtendo-se um coeficiente de variação de 1,12%. O teste de recuperação foi
efetuado com o objetivo de comprovar a exatidão do método proposto. Desta forma,
quantidades conhecidas da substância de referência foram adicionadas nas soluções de
gatifloxacino comprimidos, para quantificação da substância. Os resultados obtidos
demonstraram que o método desenvolvido apresenta exatidão, precisão e linearidade. O
ensaio foi validado, através de análise estatística, utilizando análise de variância, descrita na
Farmacopéia Brasileira, 1988.
6.4. Cromatografia em camada delgada
A cromatografia em camada delgada foi empregada com o objetivo de identificar e
semi-quantificar o gatifloxacino, nos comprimidos, e distinguir o gatifloxacino, perante outras
fluorquinolonas, em vários sistemas solventes analisados. O gatifloxacino apresenta, na luz
UV, uma mancha bem característica, verde fluorescente, facilmente identificável
separadamente, ou com, as outras fluorquinolonas utilizadas neste ensaio. A maioria dos
sistemas solventes testados foram adequados para identificar e semi-quantificar o
gatifloxacino em comprimidos, com exceção de diclorometano: metanol: hidróxido de
amônio: acetonitrila (6:4:1:2,V:V:V:V) com Rf = 0,20 e n-butanol: ácido acético e água
(40:10:50, V:V:V) com Rf = 0,22.
O gatifloxacino é uma molécula altamente ionizável. Segundo Marona (2000), o
esparfloxacino, uma fluorquinolona com estrutura química semelhante ao GATX, possui dois
grupamentos na molécula ionizáveis com pKa= 6,27 e pKa = 8,80. O gatifloxacino possui
esses dois grupamentos, 3-carboxílico e 7-metil-piperazínico, que semelhantes ao
esparfloxacino também se dissociam. Quando se adiciona um composto básico na fase móvel,
o equilíbrio da dissociação tende a favorecer a maior formação do grupamento 3-carboxílico
ionizável, fazendo com que o fármaco possua maior afinidade pela fase estacionária, sílica, do
que pela fase móvel. Por isso que o Rf neste sistema é tão baixo, diferenciando-se do sistema
com diclorometano, metanol, ácido acético 5 % e acetonitrila. Neste caso a utilização da fase
móvel ácida permitiu que o equilíbrio da dissociação favorecesse a formação da forma H2Q+
.
A polaridade elevada do sistema de solvente que utiliza butanol, ácido acético e água, a
baixa solubilidade de butanol em água, a viscosidade do butanol e a migração lenta da fase
móvel tornam este sistema de solvente inadequado.
Em relação aos sistemas contendo diclorometano, metanol, acetonitrila e ácido acético
5%, diminuímos a polaridade do sistema, adicionando acetonitrila para observarmos a
influência na migração de gatifloxacino. No sistema que possuía uma maior quantidade de
acetonitrila (diclorometano: metanol: acetonitrila: ácido acético 5 %; 6:4:4:2; V/V/V/V),
sistema mais polar, o Rf de GATX-SR e GATX-comp. foi mais elevado (Rf = 0,65), do que o
mesmo sistema com quantidade de ACN menor, Rf = 0,55 (6:4:2:2; V/V/V/V), sistema
menos polar.
Em relação aos sistemas contendo clorofórmio, metanol e ácido fórmico, estudamos a
influência do clorofórmio (solvente menos polar) e ácido fórmico na migração de GATX-SR
e GATX-comp. no sistema de solvente testado. No sistema solvente clorofórmio: metanol:
ácido fórmico: água (33:7:3:0,5;V/V/V/V) Rf = 0,70, que contém o dobro de clorofórmio,
em relação ao sistema clorofórmio: metanol: ácido fórmico: água (16:7:3:0,5,V/V/V/V) Rf =
0,74, verificamos que o Rf dos dois sistemas não diferiram significativamente, apesar de
termos dobrado o valor do solvente menos polar, clorofórmio. Isto ocorreu provavelmente,
pois a quantidade de água no sistema (solvente mais polar) não diferiu nos dois sistemas.
Agora em relação a quantidade de ácido fórmico adicionada, verificamos uma diferença
significativa nos sistemas solventes analisados,. O sistema clorofórmio: metanol: ácido
fórmico (18:7:1, V/V/V/V), apresentou Rf = 0,50, enquanto que o sistema clorofórmio:
metanol: ácido fórmico: água (16:7:3:0,5,V/V/V/V), apresentou Rf = 0,74. Em relação ao
ácido fórmico, a diferença da migração deve-se a maior ionização do grupamento
7-metil-piperazínico, fazendo com que o gatifloxacino possua maior afinidade pela fase
móvel, e com isso ocorrendo um maior deslocamento da substância no sistema.
A identificação do gatifloxacino perante outras fluorquinolonas foi realizada com os
mesmos sistemas utilizados para a semi-quantificação do GATX-comp. Os sistemas
inadequados foram diclorometano: metanol: hidróxido de amônio: acetonitrila (6:4:1:2) com
Rf = 0,20 e butanol: ácido acético e água (40:10:50) com Rf = 0,22. Apenas o levofloxacino
apresenta uma mancha com a mesma cor do GATX, mas o seu Rf é bem menor em relação
ao Rf de GATX, em todos os sistemas analisados. Nos outros sistemas estudados
verificaram-se que as fluorquinolonas foram adequadamente identificadas.
6.5. Espectro de absorção na região de infravermelho e análise térmica
O espectro de absorção na região IV, para o GATX-SR, identifica uma banda larga a
3500 cm-1, característica de hidroxila na molécula, bem como o espectro de GATX-comp.,
que também possui esta banda. A molécula de gatifloxacino possui um grupamento carboxila
no carbono 3 do anel carboxílico. Os dois espectros na região de IV para as duas substâncias
foram praticamente idênticos, confirmando o propósito desta técnica, que é a identificação da
molécula por comparação com um padrão de referência.
Os espectros de IV de gatifloxacino substância de referência e comprimidos
apresentados na Figura 34 e 35, respectivamente, permitem as seguintes atribuições:
A calorimetria exploratória diferencial (DSC) é uma técnica similar a (DTA),
introduzida em 1963 por Watson e O´neil, diferindo pelo fato de a amostra e a substância de
referência se encontrarem em células (fornos) diferentes e possuírem, também, resistências
distintas.
Atualmente, o recurso da análise térmica no domínio farmacêutico é considerável, não
só para o estudo do polimorfismo, mas também pela sua versatilidade em outras aplicações,
tais como: (a) Estudos de compatibilidade fármaco-fármaco e fármaco-excipiente em
pré-formulações; (b) Estudo de polimorfismo, compostos de inclusão e dispersões sólidas; (c)
Determinação da pureza química; (d) Estudo de reações no estado sólido (estabilidade
térmica e parâmetros cinéticos) e (d) Análise de formas farmacêuticas sólidas. Controle de
qualidade.
Em relação às curvas de DSC para gatifloxacino, a forma hemiidrato se apresenta como
prismas amarelo-pálido provenientes de metanol, em que o ponto de fusão é de 162o C. O
pico endotérmico que caracteriza o gatifloxacino encontra-se a 195 – 200o C. A DSC
permitiu caracterizar a presença de gatifloxacino na forma farmacêutica comprimidos
conforme é observado nas Figuras 36 e 37. Desta forma, a DSC pode ser utilizada nas
monografias de fármacos em determinação da faixa de fusão de substâncias, permitindo a
caracterização quanto a aspectos como pureza e poliformismos (GIRON-FOREST et al.,
1989).
7. CONCLUSÃO
Foi desenvolvido análise titrimétrica em meio não-aquoso utilizando ácido acético glacial
em ácido perclórico 0,1 M. O método de análise titrimétrica é simples, rápido e
econômico e pode ser aplicado para determinação de gatifloxacino em matéria-prima e
comprimidos. O método desenvolvido possui bons resultados, incluindo precisão e
exatidão. Verificou-se que os excipientes no comprimido comercial não interferem no
ensaio.
Foi desenvolvido e validado um método em espectrofotometria UV para gatifloxacino,
utilizando água como solvente. O método demonstrou ser linear, preciso e exato. Os
excipientes do comprimido comercial não interferem no ensaio.
Foi desenvolvido e validado método microbiológico por difusão em ágar cilindros em
placa para gatifloxacino em comprimidos, em que o método mostra-se linear, preciso e
exato.
Foi desenvolvido e validado método em CLAE, utilizando como fase móvel ácido
acético5%: acetonitrila: metanol (70:15:15,V:V:V), e como fase estacionária coluna de
fase reversa. O método demonstrou ser linear, preciso e exato.
Foram analisados vários sistemas solventes para identificação de gatifloxacino em CCD.
Cinco sistemas analisados demonstraram boa resolução e identificação de gatifloxacino
em CCD, bem como sua distinção perante outras fluorquinolonas. Os sistemas adequados
para análise de gatifloxacino foram:
- Clorofórmio: metanol: ácido fórmico: água (16:7:3:0,5) V:V:V:V
- Clorofórmio: metanol: ácido fórmico: água (33:7:3:0,5) V:V:V:V
- Clorofórmio: metanol: ácido fórmico (18:7:1) V:V:V
- Diclorometano: metanol: acetonitrila: ácido acético (6:4:4:2) V:V:V:V
- Diclorometano: metanol: acetonitrila: ácido ácético (6:4:2:2) V:V:V:V
Dois sistemas analisados em CCD para detecção de gatifloxacino e identificação em
presença de outras fluorquinolonas, não foram adequados.
- Diclorometano; metanol: hidróxido de amônio: acetonitrila (6:4:1:2) V:V:V:V
Butanol: ácido acético 5%: água (40:10:50) V:V:V
A espectrofotometria na região do infravermelho foi utilizada para identificar o composto
nos comprimidos.
A análise térmica permitiu determinar a substância na forma farmacêutica e seu ponto de
fusão.
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