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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL REI UFSJ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIAS PARA O
DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL
ALESSANDRA TEIXEIRA FÉLIX
DESENVOLVIMENTO DE BIOSSENSORES IMPRESSOS DE
TRANSISTORES DE EFEITO DE CAMPO COM GATILHO
ESTENDIDO (EGFET) UTILIZANDO PENTÓXIDO DE VANÁDIO
PARA DETECÇÃO DE GLICOSE
OURO BRANCO- 2016
i
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL REI UFSJ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIAS PARA O
DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL
ALESSANDRA TEIXEIRA FÉLIX
DESENVOLVIMENTO DE BIOSSENSORES IMPRESSOS DE TRANSISTORES
DE EFEITO DE CAMPO COM GATILHO ESTENDIDO (EGFET) UTILIZANDO
PENTÓXIDO DE VANÁDIO PARA DETECÇÃO DE GLICOSE
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Tecnologias para o
Desenvolvimento Sustentável (PPGTDS) da
Universidade Federal de São João Del Rei
como requisito parcial para a obtenção do
grau de Mestre
Área de Concentração:
Química
Orientadora:ProfªDrª.Elídia Maria Guerra
Co-orientador: Prof. Dr.Marcelo Mulato
OURO BRANCO- 2016
ii
Ficha catalográfica elaborada pela Divisão de Biblioteca (DIBIB) e Núcleo de Tecnologia da Informação (NTINF) da
UFSJ, com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)
Félix, Alessandra Teixeira.
F316d DESENVOLVIMENTO DE BIOSSENSORES IMPRESSOS DE TRANSISTORES DE EFEITO DE CAMPO COM GATILHO ESTENDIDO (EGFET) UTILIZANDO PENTÓXIDO DE VANÁDIO PARA DETECÇÃO DE GLICOSE / Alessandra Teixeira Félix ; orientadora Elídia Maria Guerra; coorientador Marcelo Mulato. -- Ouro Branco, 2016.
73 p. Tese (Doutorado - Programa de Pós-Graduação em
Tecnologias para o Desenvolvimento Sustentável) -- Universidade Federal de São João del-Rei, 2016.
1. biossensor. 2. Glicose. 3. EGFET. I. Guerra,
Elídia Maria , orient. II. Mulato, Marcelo, co orient. III. Título.
iii
iv
AGRADECIMENTOS
Inicialmente gostaria de agradecer a Deus, ao Criador e mantenedor da minha vida.
Ao meu marido, Diego Alberto, pelo apoio, compreensão e cuidado.
Aos meus pais, Maria Aparecida e José Luiz, e à minha irmã Franciele, pelo suporte,
carinho, preocupação e principalmente pelo amor que é recíproco.
À minha orientadora prof. Elídia Maria Guerra, por ter acreditado no tema deste
trabalho, apoiado e incentivado quando necessário, pela compreensão e pela
dedicação em discussões durante as análises dos resultados e correções feitas, me
instruindo com argumentos sólidos para defesa dos meus objetivos.
Ao meu co-orientador prof. Marcelo Mulato, por ter cedido seu espaço físico na USP,
auxiliando na obtenção de diversos resultados apresentados neste trabalho, por
suas correções, preciosas sugestões e por, mesmo de longe, ter me apoiado no
desenvolvimento deste.
A professora Hállen Daniel Resende Calado, por me introduzir no mundo científico,
cedendo seu tempo e laboratório durante a graduação.
A banca examinadora da qualificação e defesa, pelo tempo dedicado nas correções
e sugestões que fizeram desse trabalho mais completo e melhor.
Ao programa PPGTDS, por ter aberto um mundo de possibilidades.
Aos meus colegas de curso e grupo de pesquisa ProDeMat, pela amizade e apoio.
Aos meus amigos da Igreja, ao meu pastor e demais líderes, que me auxiliaram e
continuam me ensinando, pelo zelo, preocupação e pelas orações.
A todos, o meu sincero e grato muito obrigada.
v
"Sou um cristão, isto significa: creio na
divindade de Jesus Cristo juntamente com Tycho
Brahe, Copérnico, Descartes, Newton, Fermat,
Leibniz, Pascal, Grimaldi, Euler, Guldin,
Boscowitsch, Gerdil, com todos os grandes
astrônomos, todos os grandes pesquisadores das
ciências naturais, todos os grandes matemáticos dos
séculos passados. E se porventura me perguntarem
pela razão, terei prazer em explicá-la. Verão que
minha convicção é resultado de estudo cuidadoso e
não de preconceitos."
Augustin Louis Cauchy (1789-1857)
vi
Lista de Figuras
Figura 1 – Desenho esquemático de um biossensor .................................................. 9
Figura 2 – Exemplos de analitos, reconhecedores e transdutores atualmente
utilizados em biossensores [11] ................................................................................ 10
Figura 3 – Esquema de um MOSFET com suas regiões destacadas ....................... 11
Figura 4 – Diagrama de bandas de energia do MOSFET, onde Ec corresponde a
energia da banca de condução, Ei nível de energia intrínseca, Ef nivel de Fermi e Ev
banda de valência ..................................................................................................... 12
Figura 5 – Respostas típicas do MOSFET. VDS, com tensão Vgs fixa. ................... 13
Figura 6 – Esquema de um ISFET com suas regiões destacadas ............................ 14
Figura 7 – Esquema de um EGFET com suas regiões destacadas .......................... 14
Figura 8 - Desenho esquemático do dispositivo EGFET. [j] ..................................... 15
Figura 9 - Resposta típica da medição de VDS e sua relação com o pH .................. 16
Figura 10 – Esquema de montagem da célula analítica com os três eletrodos
(eletrodo de trabalho, eletrodo de referência e contra eletrodo), para medição de
voltametria cíclica. ..................................................................................................... 17
Figura 11 – Reação biocatalisada da glicose pelo oxigênio ...................................... 18
Figura 12 – Esquema ilustrativo dos tipos básicos de métodos de imobilização
enzimáticos: a) adsorção, b) ligação covalente, c) encapsulação, e d) ligação
covalente cruzada. .................................................................................................... 19
Figura 13 – Relação entre VGS e pH da solução para o xerogel de V2O5 [22]. .......... 20
Figura 14 – V2O5 sol-gel ............................................................................................ 21
Figura 15 – Representação da produção do filme de V2O5/FTO. .............................. 22
Figura 16 – Imagem do sensor comercial C110 (a) sem o filme (b) após a adição de
V2O5/Gox. .................................................................................................................. 26
Figura 17 – Fotografias do aparelho usado no teste de VC (a) sensor comercial com
V2O5 testado sobre temperatura controlada usando banho maria, (b) computador e
potenciostado acoplado. ........................................................................................... 26
Figura 18 – Representação de um exemplar de cristal de quartzo piezelétrico. ....... 27
Figura 19 – Sensor EGFET. À direita temos o circuito amplificador instrumental e à
esquerda temos a representação do filme sensível e da solução tampão mensurada
[40]. ........................................................................................................................... 29
vii
Figura 20 – Difratograma da matriz de pentóxido de vanádio (V2O5.nH2O). ............. 30
Figura 21 – Difratograma do filme V2O5/GOx/GLU.................................................... 31
Figura 22 – Micrografia da matriz V2O5 ..................................................................... 33
Figura 23 – Infravermelho do filme de V2O5 antes e após a imobilização com Gox .. 34
Figura 24 – Voltamograma obtido durante os 100 ciclos do filme de V2O5 antes e
após a imobilização de Gox, a 20 mV, na faixa de potencial de -0,5 a 1,0 V, PBS
pH=5,0 glicose 4,4 mmol/L. ....................................................................................... 35
Figura 25 – Variação da carga durante 50 ciclos a 20 mV, na faixa de potencial de -
0,5 a 1,0 V, PBS pH5 glicose 4,4mmol/L, do filme de V2O5 (a) antes e (b) após a
imobilização de Gox. ................................................................................................. 36
Figura 26 – Variação da frequência na faixa de potencial de -0,5 a 1 V durante 50
ciclos a 20 mV, eletrólito PBS, pH 5 e concentração de glicose 4,4mmol/L, do filme
de V2O5 antes (em preto) e após a imobilização de Gox (em vermelho). ................. 37
Figura 27 – Variação da massa na faixa de potencial de -0,5 a 1 V durante 50 ciclos
a 20 mV, eletrólito PBS, pH 5 e concentração de glicose 4,4 mmol/L, do filme de
V2O5 antes (em preto) e após a imobilização de Gox (em vermelho). ...................... 38
Figura 28 - Variação da massa na faixa de potencial de -0,5 a 1 V durante 50 ciclos
a 20 mV, eletrólito PBS, pH 5 e concentração de glicose 4,4mmol/L, do filme de V2O5
após a imobilização de Gox com a adição de Nafion (em vermelho) e sem a adição
de Nafion (em preto). .............................................................................................. 39
Figura 29 – Fotografia do sistema utilizados nos testes do EGFET .......................... 40
Figura 30 – Fotografia (a) disposição dos nos filmes em banho maria, (b) sensores
de vidro com FTO e fio de cobre colado com cola prata e (c) sensores do o filme de
V2O5 depositado ........................................................................................................ 40
Figura 31 – Gráfico de resposta variando a corrente com relação tempo, fixando o
pH em (a) 5,0; (b) 5,2; (c) 5,5 e (d) 5,8. ..................................................................... 43
Figura 32 – Corrente por concentração de glicose, fixando o pH em (a) 5.0, (b) 5.2,
(c) 5.5 e (d) 5.8. ......................................................................................................... 44
Figura 33 – Voltamogramas obtidos durante os 100 cilcos do filme de V2O5 antes e
após a imobilização de Gox, a 20 mV, na faixa de potencial de -0,5 a 1,0 V, PBS 5,0
glicose (a) 4,4 (b) 5,0 (c) 5,5 (d) 6,0 e (e) 6,6. ........................................................... 48
viii
Figura 34 – Variação de carga durante 50 ciclos a 20 mV na faixa de potencial -0,5
a 1,0 V, PBS pH 5,0 do filme ante e após a imobilização com Gox nas
concentrações de glicose (a) 4,4 (b) 5,0 (c) 5,5 (d) 6,0 e (e) 6,6. .............................. 50
ix
Lista de Tabelas
Tabela 1 – Picos de oxidação e redução obtidos na VC antes e após a imobilização
da enzima. ................................................................................................................. 45
x
Lista de Abreviaturas e Siglas
EGFET - Transistores de Efeito de Campo com Gatilho Estendido
VC - Voltametria Cíclica
DRX - Difração de Raios-X
EQCM - Microbalança de Cristal de Quartzo Eletroquímica
Gox - Glicose Oxidase
ISFET - Transistores de Efeito de Campo Sensíveis a Íons
FET - Transistores de Efeito de Campo
MOSFET- Metal Oxide Semicondutor Field Effect Transistor
V2O5 - Petóxido de Vanádio
ZnO - Óxido de Zinco
SnO2 - Dióxido de Estanho
WO3 - Trióxido de Tungstênio
TiO2 - Dióxido de Titânio
NTC - Nanotubos de Carbono
OMS - Organização Mundial de Saúde
Vds - Tensão aplicada entre dreno e a fonte do MOSFET
Vgs - Tensão entre a porta e a fonte
Vref - Tensão de referência
Ids - Corrente entre o dreno e a fonte
AlO3 - Trióxido de Alumínio
PtO2 - Dióxido de Platina
IrO3 - Trióxido de Iridio
Glu - Glutaraldeído
NaVO3 - Metavanadato de Sódio
FTO - Óxido de Estanho dopado com Flúor
xi
NaH2PO4- Fosfato monossódico
Na2HPO4- Fosfato dissódico
xii
SUMÁRIO
1)Resumo ---------------------------------------------------------------- 1
2) Abstract ---------------------------------------------------------------- 2
3) Introdução ---------------------------------------------------------------- 3
4) Objetivos ---------------------------------------------------------------- 6
5) Revisão Teórica ---------------------------------------------------------------- 7
5. 1 Biossensores ---------------------------------------------------------------- 7
5.2 Dispositivos por Efeito de Campo ---------------------------- 10
5.3 Voltametria Cíclica ---------------------------------------------------------- 16
5.4 Glicose ---------------------------------------------------------------- 17
5.4.1 Imobilização enzimática ------------------------------------- 18
6) Procedimento Experimental ------------------------------------------------------- 21
6.1. Preparação do Pentóxido de Vanádio pelo Processo Sol-Gel 21
6.2. Confecção do gatilho estendido -------------------------------------- 21
6.2.1. Rota de Imobilização -------------------------------------- 23
6.3. Métodos de caracterização -------------------------------------- 23
6.3.1. Difração de Raios-X -------------------------------------- 24
6.3.2. Espectrometria na região do infravermelho com
transformada de Fourier ---------------------------------------------------------------- 24
6.3.3. Microscopia Eletrônica de Varredura -------------------- 25
6.3.4. Voltametria Cíclica -------------------------------------- 25
6.3.5.Microbalança de Cristal de Quartzo Eletroquímica---- 27
6.3.6.Transistor de Efeito de Campo com Gatilho Estendido 28
7) Resultados e Discussão -------------------------------------------------------- 30
7.1. Análise da estrutura de V2O5 pela técnica de Difração de Raios-X
------------------------------------------------------------------------------------------- 30
7.2. Estudo da Micrografia do filme de V2O5 ----------------------------- 32
7.3.Análise do aparecimento e deslocamento dos principais picos no
Infravermelho antes e após a imobilização da enzima -------------------- 33
7.4. Estudo do Voltamograma e a possível perda de massa com o
processo -------------------------------------------------------------------------------- 34
xiii
7.5. Variações de massa comprovadas pelo teste de EQCM
(Microbalança de Cristal de Quartzo Eletroquímica) -------------------- 37
7.6. Estudo elétrico do comportamento do biossensor sob diferentes
condições------------------------------------------------------------------------------------- 39
7.7. Estudo eletroquímico do comportamento do biossensor sob
diferentes condições ----------------------------------------------------------------- 44
8) Conclusões -------------------------------------------------------------------------- 51
9) Referências Bibliográficas --------------------------------------------------------- 54
1
1) RESUMO
Félix, A. T. Desenvolvimento de Biossensores impressos de transistores de efeito de campo com gatilho estendido
(EGFET) utilizando Pentóxido de Vanádio para detecção de Glicose.2016. 72 f. Dissertação (Mestrado) - Universidade
Federal de São João Del Rei, Minas Gerais,2016
____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Este trabalho apresenta o desenvolvimento de biossensores impressos de
Transistores de Efeito de Campo com Gatilho Estendido (EGFET), utilizando
pentóxido de vanádio para detecção de Glicose. Os filmes do óxido condutor de
vanádio foram produzidos por spin-coating,e utilizados como membrana para
imobilização da enzima glicose oxidase (Gox) por ligação covalente cruzada. O
material foi depositado sobre um substrato de vidro revestido com FTO (óxido de
estanho dopado com flúor) para os testes no EGFET, e sobre um sensor
comercial Dropsens, modelo C110, para os testes de voltametria cíclica (VC).As
técnicas de caracterização estrutural e morfológica utilizadas foram difratografia
por raios-X, espectrometria na região do infravermelho com transformada de
fourier (FTIR) e microscopia eletrônica de varredura (MEV). Para caracterização
eletroquímica foram utilizadas a voltametria cíclica, microbalança de cristal de
Quartzo Eletroquímica (EQCM) e EGFET, na qual esta última trata-se de medida
elétrica. Os filmes foram testados na faixa de pH de 5,0 a 5,8 variando a
concentração de glicose de 4,4 a 6,6 mmol/L.Os testes no EGFET permitiram
verificar que no pH 5,0, o biossensor obteve melhor resposta eletroquímica,
sendo capaz de identificar a diferença de concentração de glicose no meio com
diferentes valores de corrente. Com intuito de comparar as técnicas de
caracterização eletroquímica com a elétrica, o biossensor produzido foi testado
pela técnica de voltametria cíclica no pH 5,0 e, apesar da mesma linearidade não
ter sido notada nos resultados, a variação dos picos de oxidação e redução antes
e após a imobilização da Gox no filme de V2O5. Melhorias no dispositivo foram
propostas durante a análise parcial dos resultados, outras ainda podem ser
propostas, contudo os resultados obtidos até aqui demonstraram que o
biossensor desenvolvido é capaz de detectar a presença de glicose, gerando
sinais eletroquímicos como resposta.
Palavras-chave:1. V2O5; 2. Glicose;3. Biossensor; 4. Gox; 5. EGFET; 6.VC
2
2) ABSTRACT
This work presents the development of printed biosensors of Extended Gate
Field-Effect Transistor (EGFET) using vanadium pentoxide for glucose detection.
The vanadium conductive oxide films were produced by spin coating, and used as
a membrane for immobilization of the glucose oxidase enzyme (Gox) by covalent
cross-link. The material was deposited on a glass substrate coated with FTO
(Fluorine doped with tin oxide) for EGFET tests; and on a commercial sensor
Dropsens, model C110, for Cyclic Voltammetry (CV) tests. The structural and
morphological characterization techniques used were X-Ray Diffractography,
Fourier Transform Infrared (FTIR) Spectroscopy, and Scanning Electron
Microscope (SEM). For electrochemical characterization were used CV, Quartz
Crystal Electrochemistry Microbalance(EQCM), and EGFET. The films were
tested at a range of pH from 5.0 to 5.8 varying the glucose concentration from 4.4
to 6.6 mmol/L. The EGFET tests allowed verify that at pH 5.0 the biosensor
obtained better electrochemical response, being able to identify the glucose
concentration differences in environments with different electric current values. In
order to compare the electrochemical and electrical characterization techniques,
the produced biosensor was testes by CV technique at pH 5.0 despite the same
linearity was not noted in the results, the variation of oxidation and reduction
peaks before and after the Gox immobilization in the V2O5films. Improvements in
the device were proposed during the partial analyses of the results, others can
also be proposed, however the results obtained until now demonstrate that the
biosensor developed isable to detect the glucose presence generating
electrochemical signals as response.
Key Words: 1. V2O5; 2. Glucose; 3. Biosensor; 4. Gox; 5. EGFET; 6.CV
3
3) INTRODUÇÃO
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Um biossensor é um sensor químico cujo reconhecedor é um componente
biológico ativo usado para detecção de um analito. Existe uma corrida científica na
pesquisa e desenvolvimento desses sensores pelo fato de transcreverem
fenômenos da natureza com sensibilidade e seletividade. Tais sensores biológicos
também são vantajosos por serem construídos como dispositivos de fácil operação,
com diminuição do limite de detecção, permite análise em tempo real com elevado
grau de reprodutibilidade [1].
A busca por dispositivos cada vez menores e que utilizem um menor volume
de amostra vem sendo explorada por pesquisadores da área de química clínica,
processos industriais e medicina. No campo da medicina a necessidade de métodos
rápidos, baratos, confiáveis e que tenham especificidade para a determinação de
substâncias em fluidos biológicos, tais como, as concentrações sanguíneas de
glicose, colesterol, lactato, uréia, creatinina, ácido úrico e hemoglobina, tornou
imprescindível o desenvolvimento de novos sensores bioeletroanalíticos capazes de
realizar esse tipo de tarefa.
Com a finalidade de detectar tais concentrações em fluídos biológicos,
diversos materiais vêm sendo propostos na literatura.Entre eles encontram-se os
óxidos de zinco (ZnO) [2], de estanho (SnO2) [3,4], de tungstênio (WO3) [5], e de
titânio (TiO2) [6]. O uso de nanotubos de carbono (NTC) [7] tem se tornado uma
tendência devido as suas propriedades condutoras, porém algumas propriedades
dos óxidos, como o óxido de vanádio, podem torná-los muito atraentes para serem
usados em sensores biológicos.
O uso de óxido de vanádio obtido pelo método sol-gel apresenta versatilidade
devido à sua estrutura lamelar, a qual pode ser intercalada uma ampla gama de
espécies orgânicas e inorgânicas, resultando em propriedades eletrônicas
adquiridas devido à presença de valência mista, bem como propriedades iônicas
resultantes da difusão de prótons na fase aquosa [8]. Adicionalmente, o sol-gel de
pentóxido de vanádio apresenta maior flexibilidade em sua rede inorgânica. Tal
propriedade proporciona maior controle sobre o tamanho dos poros do
material,facilitando assim a difusão do analito até que este alcance o reconhecedor
biológico.Essa difusão facilitada permite que a integridade da estrutura
4
tridimensional das enzimas e,conseqüentemente, a atividade catalítica, sejam
amplamente preservadas durante os testes biológicos [9].
Dispositivos potenciométricos são largamente utilizados para transformação
do sinal químico proveniente das reações enzimáticas em sinais elétricos
mensuráveis.Assim, são os dispositivos baseados em efeito de campo.Os FETs
(transistores por efeito de campo) foram empregados pela primeira vez em 1970
pelo cientista e professor Piet Bergveld para realização de medidas neurofisiológicas
[10].
Transistores com sensibilidade a íons foram os primeiros a serem
desenvolvidos e são denominados Transistores de Efeito de Campo Sensíveis a
Íons, ou ISFET como sigla para o respectivo em inglês Ion Sensitive Field Effect
Transistor. Tais transistores apresentam pequenas dimensões e são baseados em
dispositivos semicondutores. Quando comparados com outros tipos de
biossensores, os ISFETs apresentam as seguintes vantagens: miniaturização, alta
sensibilidade, baixo custo e potencial para multi-detecção[11]. No entanto, como
desvantagem, os ISFETs podem apresentar problemas com o isolamento do
sistema FET em relação à solução, e o contato entre ambos é prejudicial às
medidas; além disso, o contato entre o sistema FET e a solução dificulta a
reutilização desse tipo de dispositivo. Adicionalmente, o processo de construção
desse dispositivo é oneroso e árduo. O primeiro material a ser utilizado como
dielétrico sensível a pH nesses dispositivos foi o dióxido de silício (SiO2) [11].
Tendo em vista as dificuldades de operação apresentadas pelo ISFET tornou-
se necessário aprimorar os sistemas de detecção dos sensores, O Transistor de
Efeito de Campo com Gatilho Estendido, cuja sigla EGFET é correspondente ao
nome em inglês Extended Gate Field Effect Transistor, surgiu com a finalidadede
aprimorar a construção dos sensores e proporcionar a reutilização do sistema. Uma
membrana responsável pela detecção dos íons é depositada sobre um substrato e
conectada ao transdutor comercial MOSFET do termo em inglês Metal Oxide
Semicondutor Field Effect Transistor, por um fio, sendo por isso chamado de porta
estendida [12]. Esse formato permite o isolamento total do FET em relação à
solução. No caso de biossensores a superfície de um EGFET é modificada
acrescentando sobre ela uma camada de material biológico capaz de reconhecer o
analito.
5
Existem biossensores para os quais é necessário utilizar uma matriz de
imobilização para que o material biológico não se desprenda da superfície do
EGFET durante o procedimento de análise e detecção do analito, o pentóxido de
vanádio foi utilizado nesse trabalho como membrana para imobilização da enzima
glicose oxidase (Gox). A enzima foi utilizada afim de detectar glicose em fluidos
biológicos de forma reprodutível, também foi verificada a sensibilidade do dispositivo
à detecção de glicose.
Quando se imobiliza uma enzima por ligação cruzada sobre a matriz de
imobilização, pode-se fazer de 200 a 1000 detecções com o uso de apenas uma
membrana com o material biocatalítico, esse tipo de imobilização garante a
aderência da enzima da matriz e sua reutilização [13].
A reutilização de um biossensor pode representar um considerável ganho
sócio ambiental, visto que de acordo com a Organização Mundial da Saúde, OMS,
cerca de 350 milhões de pessoas em todo o mundo sofrem de diabetes; e que no
Brasil esse número é de aproximadamente 12 milhões. Tais pacientes utilizam por
dia,no mínimo, uma fita reativa para dosagem de glicose através do próprio material
biológico,gerando,portanto,um descarte estimado de pelo menos12 milhões de fitas
diariamente. Dessa forma, considerando que um portador de diabetes use seu
biossensor 200 vezes, número que representa o mínimo possível de reutilizações
por dispositivo, a cada 200 dias 2,4 trilhões de fitas com material biológico
potencialmente contaminante deixariam de ser descartadas no meio ambiente. Logo,
o reuso dos sensores poderia ser considerado um avanço econômico e social não
só para os portadores de diabetes, mas para a população como um todo.
Sensores comerciais acessíveis à maioria da população são também doados
pelo governo a portadores de diabetes, esses sensores são fitas de papel contendo
o reconhecedor biológico. Porém, no Brasil essas fitas ainda são caras para o
governo e para a população porque o país ainda não produz esse material.Além
disso, o grande número de fitas que a população demanda torna essa
disponibilização ainda mais onerosa.
Ao consumidor final, para cada detecção,no mínimo uma tira é descartada por
dia, resultando em um custo médio de 1 a 2 reais. Pacientes que necessitam de um
maior controle, chegam a utilizar de três a cinco fitas diárias
6
Deve-se ainda levar em consideração que acidentes podem acontecer com os
encarregados de recolher o lixo doméstico, e também com as pessoas que catam
lixo nos aterros sanitários, pois trata-se de um material biológico descartado em
grande volume. Quantidade essa a qual é acrescida o número de seringas, agulhas
e lancetas utilizadas.
Considerando a importância do desenvolvimento dos biossensores como
descrito acima, e com base em trabalhos da literatura aqui usados como referenciais
teóricos, este trabalho apresenta a síntese e caracterização do filme de pentóxido de
vanádio (V2O5), via sol-gel, a imobilização da enzima glicose oxidase (Gox) para
produção do biossensor, e a sua caracterização.Como caracterizações estruturais
foram utilizadas as técnicas de Difração de Raios-X (DRX), Espectrometria na
Região do Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR), Microscopia
Eletrônica de Varredura (MEV), e para as caracterizações elétricas foram utilizados o
Transistor de Efeito de Campo com Gatilho Estendido(EGFET), Voltametria Cíclica
(VC) e Microbalança de Cristal de Quartzo Eletroquímica (EQCM).
No decorrer deste trabalho a imobilização da enzima na membrana foi
confirmada pelos métodos de caracterização empregados e listados acima. A
sensibilidade do dispositivo na faixa de pH de 5,0 a 5,8 variando a concentração de
glicose de 4,4 a 6,6 mmol/L também foi apresentada. Os testes permitiram o
aprimoramento da rota de construção do dispositivo biossensor, e a definição das
melhores condições de operação e de resposta do dispositivo.
7
4) OBJETIVOS
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Objetivo Geral
Desenvolver um biossensor impresso de transistores de efeito de campo com
gatilho estendido (EGFET) utilizando pentóxido de vanádio e glicose oxidase afim de
detectar a concentração de glicose em solução.
Objetivos específicos:
1. Preparar o pentóxido de vanádio a partir da rota sol-gel;
2. Caracterizar o óxido através das técnicas de difração de raios-X, microscopia
eletrônica de varredura, infravermelho com transformada de Fourier;
3. Promover a imobilização da enzima Gox nos filmes em estudo;
4. Estudar o sensor no EGFET para detecção de glicose.
5) REVISÃO TEÓRICA
___________________________________________________________________
A revisão teórica desse trabalho apresenta o embasamento técnico-científico
para realização desse projeto. Estão transcritos aqui os principais referenciais
teóricos sobre os biossensores enzimáticos, processos de imobilização, utilização, e
vantagens da membrana de imobilização utilizada (V2O5), bem como o processo de
caracterização EGFET utilizado e ainda pouco explorado na literatura.
5.1. Biossensores
Um sensor é um dispositivo capaz de converter um sinal de entrada em outro
tipo de sinal mensurável [14], podendo ser classificado em seis grupos distintos
entre si: químicos, elétricos, magnéticos, mecânicos, radioativos e térmicos. Os
sensores químicos são extremamente importantes, pois são capazes de determinar
as substâncias químicas presentes no meio e quantificá-las[15].
Biossensores são considerados dispositivos indispensáveis na área
médica.Existe uma crescente demanda de aprimoramento e expansão da
aplicabilidade, disponibilidade e viabilidade desses sensores para melhor
atendimento e tratamento de pacientes [16,17]. O monitoramento de parâmetros
8
como colesterol, lactato, uréia, ácido úrico, hemoglobina, dentre outros faz parte de
uma demanda reconhecida internacionalmente [18].
Um biossensor é um sensor químico cujo reconhecedor é um componente
biológico capaz de reconhecer um determinado analito, convertendo uma
informação química em um sinal elétrico detectável. Para construção desse
dispositivo, diversos materiais já foram propostos na literatura. Como reconhecedor
podem ser usados materiais biológicos como enzimas, anticorpos, antígenos,
células, organelas e outros; conectados a um transdutor, ou seja, um dispositivo
capaz de converter um tipo de sinal em outro [19, 20]. Quando o material biológico
utilizado é uma enzima, estes sensores são denominados biossensores enzimáticos,
capazes de fazer uso da atividade enzimática desse tipo de proteína como sinal a
ser monitorado no processo de identificação do analito [21].
Os biossensores podem ser classificados em três distintas gerações de
acordo com o mecanismo utilizado na transferência de elétrons: primeira, segunda
ou terceira. No primeiro caso, os biossensores de primeira geração,o sinal
amperométrico surge como resultado da oxidação ou redução do substrato sobre a
superfície do eletrodo. O substrato é definido como a molécula na qual a enzima age
de maneira específica. Por conseguinte, os dispositivos de segunda geração são
utilizados contando com o auxílio de mediadores livres em solução, ou imobilizados
na enzima, capazes de reduziras interferências causadas por outros compostos que
estão presentes em solução e são capazes de oxidar a superfície do eletrodo e
inativar o centro ativo da enzima. Os biossensores de terceira geração, por sua
vez,são classificados pela transferência direta de elétrons entre a superfície do
eletrodo e a enzima [22].
Um esquema básico do funcionamento de um biossensor pode ser visto na
Figura1, onde a superfície seletiva, o bioreceptor, reconhece o sinal biológico e o
converte em sinal elétrico pelo transdutor [23].
9
Figura 1–Desenho esquemático de um biossensor
Diferentes substâncias e espécie e grandezas podem ser detectadas por
sensores.Dentre elas constam: elétrons, íons, calor, massa, absorbância e luz. Para
cada um dos itens detectáveis existe um ou mais tipos de transdutor capaz de
transformar o sinal biológico em sinal elétrico.A escolha do transdutor está baseada
no tipo de resposta gerada pelos diferentes organismos biológicos.Quando a
grandeza a ser detectada é, por exemplo, a luz, deve-se usar um transdutor ótico.No
caso de sinais provenientes de fontes de calor, o transdutor deve ser calorimétrico e
assim por diante. A Figura 2 sumariza o tipo de transdutor adequado a ser utilizado
de acordo com a grandeza detectada, proveniente de diversos materiais biológicos.
Portanto, o primeiro passo para construção de um biossensor é definir o tipo
de detecção requerido, isto é, qual tipo de analito necessita ser mensurado. O
segundo passo deve-se então escolher o tipo de material que se encaixa ao tipo do
biossensor, buscando atingir alta sensibilidade, menor influência possível na reação
de interesse e alta especificidade, a escolha do material biológico é importante pois
determinará tais fatores. O terceiro passo é a escolha do transdutor, essa está
diretamente relacionada com a grandeza a ser detectada.
O aperfeiçoamento dos biossensores enzimáticos, requer o aperfeiçoamento
dos métodos de imobilização, preservando a atividade das biomoléculas e suas
condições particulares como concentração, pH e temperatura. Para escolha do
biomaterial,diversas técnicas de caracterização podem ser úteis, como a voltametria
cíclica para testes eletroquímicos e infravermelho e DRX para testes estruturais.
10
ANALITO (SUBSTRATO) MATERIAL
BIOLÓGICO GRANDEZA DETECTADA
TRANSDUTOR
EL
ET
RÔ
NIC
A
ANTICORPOS
ANTÍGENOS
ENZIMAS
GASES
ÍONS
METABÓLITOS
MICRORGANISMOS
PROTEÍNAS
ANTICORPOS
ANTÍGENOS
CÉLULAS
ENZIMAS
MEMBRANAS
ORGANELAS
ORGANISMOS
TECIDOS
ELÉTRONS
ÍONS
CALOR
MASSA
ABSORBÂNCIA
LUZ
AMPEROMÉTRICO
POTENCIOMÉTRICO
CONDUTIMÉTRICO
EMFET
CALORIMÉTRICO
PIEZELÉTRICO
ÓTICO
Figura 2–Exemplos de analitos, reconhecedores e transdutores atualmente utilizados em biossensores [12]
Outra forma de classificar os biossensores os divide em 4 classes:
eletroquímicos, são aqueles capazes de detectar elétrons ou íons, os calorimétricos
são responsáveis por detectar calor, os biossensores óticos detectam grandezas
como absorbância e luz e os piezelétricos diferença de massa. Dentro desses tipos
existem subclasses, no caso dos sensores eletroquímicos eles podem ser divididos
de acordo com o tipo de transdutor, podem ser amperométricos, potenciométricos,
condutométricos e os baseados em Transistor de Efeito de Campo (FETs) [24].
5.2. Dispositivos por Efeito de Campo
Os FETs surgiram como uma alternativa aos transdutores de detecção de
íons, tais transdutores utilizavam eletrodos de vidro para fabricação de sensores,
esses eletrodos apresentavam diversas desvantagens, entre elas estão a alta
impedância, o alto custo, o tamanho, fragilidades mecânicas características desse
material cerâmico e,conseqüentemente, o formato limitado; essas limitações
acabaram por reduzir significativamente o campo de uso desse material. Os FETs
têm como característica básica o controle de uma corrente por um campo elétrico
aplicado. Esses transistores de efeito de campo possuem três terminais chamados
porta (G, do inglês, gate), dreno(D, do inglês, drain), e a fonte (S, do inglês, source)e
11
possuem como vantagem a sua alta impedância de entrada, não necessitando de
praticamente nenhuma corrente de entrada na porta para o controle de corrente do
dreno.
A base de fabricação de qualquer biossensor é composta por um MOSFET, o
MOSFET é um dos dispositivos mais importantes na composição do biossensor é
baseado no efeito de campo. Esse dispositivo possui uma estrutura composta por
três partes. A primeira é um substrato de material semicondutor (S), dopado tipo-p
(portadores positivos, buracos); essa parte é tipicamente feita de silício. A segunda é
uma camada de material isolante, esta encontra-se sobre o substrato, ela é
tipicamente constituída de algum tipo de óxido (O). A terceira parte encontra-se
sobre a camada de óxido e é constituída por uma camada metálica (M). O MOSFET
possui três terminais, como mostrado na Figura 3: a fonte, o dreno – ambos
semicondutores dopados do tipo-n (portadores negativos, elétrons) – e a porta A
chamada VDS é a tensão aplicada entre dreno e a fonte do MOSFET, e a chamada
VGS, é a tensão entre a porta e a fonte. VREF é a tensão de referência, aplicada no
eletrodo de referência. A corrente medida é a chamada IDS, pois é a corrente entre o
dreno e a fonte.
Figura 3– Esquema de um MOSFET com suas regiões destacadas
Em função da tensão aplicada sobre a porta (gate) o MOSFET pode
comportar-se de maneira diferente, como demonstrado na Figura 4. Nas
configurações que se seguem a acumulação ocorre quando um potencial negativo é
aplicado à porta do transistor, temos buracos, ou seja cargas positivas, se
acumulando na superfície do semicondutor. A depleção ocorre quando a polarização
é inversa, positiva, sobre a porta, levando os buracos para longe do semicondutor,
formando assim uma região de depleção.
nível de Fermi para o metal é tão baixo que os elétrons da banda de condução do
semicondutor são atraídos para a região adjacente do isolante, até que essa região
passe a ter características de um semicondutor do tipo n.
Ao se aplicar um campo perpendicular ao plano da folha na região de
inversão, o condutor passa a ter resistência extremamente baixa,
portanto, o nome de canal tipo n
princípio de funcionamento o campo elétrico aplicado a ele.
Figura 4–Diagrama de bandas de energia do MOSFET, onde Econdução, Ei nível de energia intrínseca, E
A porta do MOSFET é isolada do restante do transistor pelo óxido, podendo
controlar a corrente entre o dreno e a f
aplicada na porta. As respostas típicas do MOSFET estão demonstradas na
5.
Configuração de
acumulação
acumulando na superfície do semicondutor. A depleção ocorre quando a polarização
é inversa, positiva, sobre a porta, levando os buracos para longe do semicondutor,
assim uma região de depleção. Na terceira configuração, a inversão,
nível de Fermi para o metal é tão baixo que os elétrons da banda de condução do
semicondutor são atraídos para a região adjacente do isolante, até que essa região
ter características de um semicondutor do tipo n.
Ao se aplicar um campo perpendicular ao plano da folha na região de
inversão, o condutor passa a ter resistência extremamente baixa,
o nome de canal tipo n [24]. Com isso o dispositivo formado tem como
de funcionamento o campo elétrico aplicado a ele.
Diagrama de bandas de energia do MOSFET, onde Ec corresponde a energia da banca de nível de energia intrínseca, Ef nível de Fermi e Ev banda de valência
A porta do MOSFET é isolada do restante do transistor pelo óxido, podendo
controlar a corrente entre o dreno e a fonte devido a uma
aplicada na porta. As respostas típicas do MOSFET estão demonstradas na
Configuração de
depleção
Configuração de
inversão
12
acumulando na superfície do semicondutor. A depleção ocorre quando a polarização
é inversa, positiva, sobre a porta, levando os buracos para longe do semicondutor,
terceira configuração, a inversão, o
nível de Fermi para o metal é tão baixo que os elétrons da banda de condução do
semicondutor são atraídos para a região adjacente do isolante, até que essa região
Ao se aplicar um campo perpendicular ao plano da folha na região de
inversão, o condutor passa a ter resistência extremamente baixa, recebendo,
o formado tem como
corresponde a energia da banca de banda de valência
A porta do MOSFET é isolada do restante do transistor pelo óxido, podendo
onte devido a uma variação de tensão
aplicada na porta. As respostas típicas do MOSFET estão demonstradas na Figura
Configuração de
inversão
13
Figura 5 –Respostas típicas do MOSFET. VDS, com tensão VGS fixa.
As curvas apresentam dois estágios, primeiro linear e segundo atingem a
saturação onde mesmo aumentando os valores de VDS os valores de corrente
permanecem inalterados. Dependendo exclusivamente dos valores de VGS aplicado.
Os eletrodos de íons seletivos são comumente utilizados ISFET (Ion Sensitive
Field Effet Transistor), onde basicamente a porta do metal do MOSFET é substituída
por uma camada sensível a íons.
O ISFET capaz de detectar mudanças de pH, surgiram 1970 fabricado por
Bergveld [25]. O seu funcionamento está baseado na combinação do MOSFET com
um eletrodo sensível a íons que introduzido no seio da solução, através da alteração
do campo elétrico na interface isolante-semicondutor que ocorre devido à
concentração de íons presentes na solução, modula-se então a intensidade da
corrente elétrica através do MOSFET [26]. Eletrodo sensível a íons são eletrodos
que permitem a determinação da atividade de espécies iônicas na presença de
outros íons [26]. O esquema de um ISFET pode ser visto na Figura6.
A capacidade de miniaturização do ISFET e a possibilidade de se utilizar
processos de microfabricação são características importantes de um FET [28].
Porém apresenta dificuldade de encapsulamento, devido ao contato da porta com a
solução sem, porém, o corpo do transistor estar em contato, além disso não é
possível a troca da camada sensível, tendo que ser trocado todo o dispositivo a cada
análise.
14
Figura 6– Esquema de um ISFET com suas regiões destacadas
Frente a diversas desvantagens do ISFET como instabilidade, devido ao
contato entre o FET e a solução iônica, e baixa sensibilidade a corrente, surge um
novo avanço no aprimoramento dos FETs que é elaboração do EGFET (Extended
Gate Field-Effect Transistor), neste tipo de sensor a porta é estendida permitindo
isolamento total do FET em relação à solução, o que permite a reutilização do
MOSFET, a camada sensível a íons é conectado ao MOSFET comercial por um fio
estendendo a porta para fora do dispositivo [29]. Por isso, o EGFET é utilizado como
uma poderosa ferramenta para o estudo de materiais que possam ser utilizados
como sensores de pH e biossensores. O esquema de um EGFET pode ser visto na
Figura7.
Figura 7 – Esquema de um EGFET com suas regiões destacadas
15
No sistema EGFET o eletrodo de referência e o filme sensível são imersos
dentro da solução de interesse e o sensor é conectado na porta do MOSFET
comercial. Analogamente ao MOSFET, a tensão aplicada entre o dreno e a fonte é
chamada VDS,VGS é a tensão entre a porta e a fonte e VREF é a tensão de referência
aplicada no eletrodo de referência. A corrente IDS é a corrente medida entre o dreno
e a fonte. Um esquema da montagem do EGFET pode ser visto na Figura 8, onde é
possível identificar o FET utilizado, bem como o eletrodo de referência e o sensor
imersos na solução tampão de PBS (solução salina, contendo cloreto de
sódio, fosfato de sódio)
Figura 8 -Desenho esquemático do dispositivo EGFET. [31]
Segundo a literatura [30], existe uma tendência dos óxidos se ligarem aos
íons hidroxila, ao entrarem em contato o sensor com a solução as moléculas de
água são atraídas para a superfície da amostra pelo óxido, formando uma camada
neutra de água que serve como sítios de ligação capazes de adsorver íons H+
formando íons hidrônios (H3O+), ou seja as cargas positivas da solução se deslocam
para perto do filme sensível a íons criando uma barreira de cargas positivas entre o
filme e a solução ficando na solução um excesso de cargas positivas, dessa maneira
observa-se um ΔV (variação de potencial) entre a superfície do filme e o interior da
solução devido à separação de cargas [31-33]. Quando se aplica uma diferença de
potencial à solução pelo eletrodo de referência com relação à fonte, obtemos o
chamado VREF, ou seja, o valor observado da diferença de potencial da amostra em
relação a fonte (VGS) será o valor do VREF acrescido do valor ΔV (VGS = VREF + ΔV).
16
Portanto, quanto maior a oferta de íons H+, maior será ΔV e a corrente medida terá
uma maior amplitude.
Mantendo-se VGS constante e variando VDS é possível medir VDS, dessa
maneira se pode observar o resultado típico de um EGFET e sua relação com o pH
do meio na Figura 9.
Figura 9 - Resposta típica da medição de VDS e sua relação com o pH
5.3 Voltametria Cíclica
A técnica de voltametria cíclica se baseia na variação de potencial elétrico
controlada em um sistema eletroquímico. Esse potencial é aplicado no eletrodo de
trabalho variando ciclicamente em função do tempo, a corrente é obtida como
resposta. Como ocorre a repetição dos ciclos, a técnica recebe o nome de
voltametria cíclica. O resultado da voltametria obtido é expresso em um
voltamograma, ou seja, um gráfico de tensão versus corrente.
O número de elétrons transferidos durante as reações de oxidação e redução
que ocorrem na superfície do eletrodo de trabalho pode ser determinado pela
equação 1, onde é necessário introduzir os valores de potencial de pico anódico
(Epa) e potencial de pico catódico (Epc).
∆� = ��� − ��� =�,���
�
(equação 1)
17
O esquema da Figura 10 mostra os três eletrodos (eletrodo de trabalho,
eletrodo de referência e contra eletrodo) inseridos em uma solução para medição de
voltametria cíclica. Cada um dos três eletrodos possui uma função na obtenção dos
resultados. Sobre o eletrodo de trabalho é aplicado o potencial, nele ocorrerão as
reações envolvendo o analito. O eletrodo de referência permite o controle do valor
de potencial aplicado sobre o eletrodo de trabalho, mantendo o potencial constante
na célula eletroquímica. O contra eletrodo ou eletrodo auxiliar é utilizado para
completar o circuito eletroquímico, pois permite o fluxo de corrente entre o eletrodo
de referência e o eletrodo de trabalho. Ao se aplicar a ddp (diferença de potencial)
entre o eletrodo de trabalho e o eletrodo de referência, ocorre o aumento da
resistência no eletrodo de referência e a diminuição no contra eletrodo, permitindo a
passagem da corrente entre o eletrodo de trabalho e o contra eletrodo[34].
Figura 10–Esquema de montagem da célula analítica com os três eletrodos (eletrodo de trabalho, eletrodo de referência e contra eletrodo), para medição de voltametria cíclica.
5.4 Glicose
Alguns materiais vêm sendo utilizados como membrana sensível a íons: AlO3,
PtO2, IrO3, TiO2[5], V2O5/WO3 [35] SnO2[36], ZnO [2], polímeros [37], nanotubos [38],
e o V2O5 [25], entre outros. O óxido de vanádio obtido pelo método sol-gel[40]
18
apresenta uma estrutura lamelar, onde podem ser intercaladas espécies orgânicas e
inorgânicas, conferindo ao material propriedades eletrônicas e também iônicas
através da difusão de prótons no eletrólito [7]. Outra vantagem nesse processo de
síntese é um maior controle sobre o tamanho dos poros, facilitando a difusão do
analito até o reconhecedor biológico [41].
5.4.1. Imobilização enzimática
A imobilização de moléculas sobre a matriz confere aos biossensores uma
característica importante que é a especificidade [13, 53]. Diversos estudos buscam
imobilizar enzimas para confecção de sensores [43,44]. Um importante exemplo é a
imobilização da enzima glicose oxidase (Gox) que necessita da presença da
molécula de glicose para funcionar, através de um artifício bioquímico conhecido
como "chave-fechadura".
Biossensores sensíveis à glicose são baseados na oxidação biocatalisada da
glicose pelo oxigênio molecular na presença da Gox. O ácido glucônico resultante
torna o meio mais ácido através da dissociação de prótons [8]. A reação pode ser
vista na Figura 11.
Figura 11 – Reação biocatalisada da glicose pelo oxigênio
A imobilização do material biológico sobre a matriz diminui consideravelmente
o custo da análise, isso porque o material não é difundido para solução,
conseqüentemente não é necessário recuperá-lo para realizar análises posteriores.
É importante que a imobilização não desnature o centro ativo da enzima, alguns
métodos são descritos na literatura[14], (a) oclusão em gel, onde a enzima é
confinada dentro de espaços intersticiais das ligações covalentes cruzadas de um
polímero insolúvel; (b) microencapsulação, nesse processo a enzima é confinada em
β - D Glicose D- Glicose- δ- lactona D- ácido glucônico
19
pequenas esferas de membranas semi permeáveis com micro poros que permitem a
movimentação de substrato e produtos da reação enzimática; (c) na adsorção física
e/ou química ocorrem interações entre a enzima e a matriz que geralmente
apresenta uma superfície ativa favorável à adsorção; (d) ligação química covalente,
nesse tipo de imobilização grupos funcionais não ativos da enzima se ligam de
forma covalente a grupos reativos da matriz; (e) a maneira mais vantajosa de
imobilização por meio de ligação química cruzada, isso porque a adição de
reagentes bifuncionais favorece a formação de partículas macroscópicas através da
formação de ligações covalentes cruzadas entre a enzima, o suporte e o reagente
adicionado. Na literatura o principal reagente utilizado nesse tipo de imobilização é o
glutaraldeído (Glu). O glutaraldeído garante a estabilidade da enzima frente a
variações de pH, temperatura, solvente, etc. Os tipos básicos de imobilização
enzimática podem ser vistos na figura 12 a seguir.
Figura 12– Esquema ilustrativo dos tipos básicos de métodos de imobilização enzimáticos: a) adsorção, b) ligação covalente, c) encapsulação, e d) ligação covalente cruzada.
Na confecção do EGFET sobre o gatilho estendido adiciona-se a matriz de
imobilização, neste trabalho a matriz utilizada foi o V2O5, e sobre ela a enzima Gox
foi imobilizada utilizando glutaraldeído. Uma alternativa explorada no decorrer deste
trabalho é a utilização de Nafion sobre o filme após a imobilização. Essa opção foi
explorada afim de verificar as condições em que o filme permanece estável sobre o
sensor.
Para funcionar com o sensor no EGFET o filme utilizado deve apresentar
características como boa sensibilidade ao analito de interesse, linearidade e
insensibilidade a fatores indesejáveis, ou seja, elementos interferentes. Ao se
produzir um biossensor enzimático buscou-se eliminar a interferência de tais fatores,
visto que a reação entre a enzima e substrato é altamente seletiva.
20
A sensibilidade da membrana foi testada na literatura como demonstrado na
Figura 13 [25], para o filme de V2O5a sensibilidade da membrana pode ser obtida
através da relação entre ID e VGS. Como pode ser observado na Figura 13, a
sensibilidade média (58.1 ± 0.8 mV/pH) é muito próxima ao valor teórico de 59.2 mV
[23].
Figura 13–Relação entre VGS e pH da solução para o xerogel de V2O5 [22].
2 4 6 8 10 12
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
Sensibilidade = 58.1 mV/pH
VDS
= 0.3 V
IDS
= 463 A
Carbono Vitreo
VG
S (
V)
pH
21
6) PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
___________________________________________________________________
6.1. Preparação do Pentóxido de Vanádio pelo Processo Sol-Gel
O gel de pentóxido de vanádio (V2O5·nH2O) foi preparado,conforme síntese
descrita da literatura [44] (Figura 14),via acidificação de uma solução aquosa de
metavanadato de sódio 0,1 mol.L-1. A solução de NaVO3 é transparente e contém
espécies de polivanadatos como [V4O12], a qual foi percolada numa coluna de resina
de troca iônica (Dowex-50x8) na forma ácida. A solução obtida após a passagem do
NaVO3pela coluna foi deixada em repouso por 7 dias obtendo-se por meio de uma
reação autocalítica uma solução viscosa de coloração vermelha escura (o gel de
pentóxido de vanádio). Em seguida, o xerogel foi obtido a partir da secagem do gel
por evaporação simples, a temperatura ambiente, formando assim o V2O5nH2O (n
1,8) [45].
Figura 14 – V2O5 sol-gel
6.2. Confecção do gatilho estendido
Para a confecção do gatilho estendido, foi escolhido o substrato de vidro de
10 mm x 10 mm de área superficial revestida com FTO (Fluorine doped Tin Oxide).
Os eletrodos vidro/FTO foram preparados e limpos com sucessivos banhos de
ultrasson. Cada banho durou 10 min, o primeiro foi feito na presença de água
destilada, para o segundo utilizou-se álcool etílico e o terceiro propanona. Após
secos, o fio condutor de cobre foi colado com cola prata e o contato foi isolado com
époxi. Os eletrodos foram então pesados afim de se ter um controle de massa do
22
filme de V2O5 adicionado. Com a utilização de uma micropipeta, foram gotejados
150�� de pentóxido de vanádio V2O5 xerogel sobre o FTO, controlando assim a
massa do filme. Os filmes foram secos na estufa a 80 ºC, afim de secar o excesso
de água, sem porém interferir na água de hidratação entre as camadas
doV2O5,obtendo-se no fim uma massa de V2O5 de 2,0 mg. Desta forma, somente o
filme fino entrou em contato com as soluções com diferentes pHs e concentrações
de glicose utilizadas (Figura15).
Figura 15– Representação da produção do filme de V2O5/FTO.
Cada filme foi feito em triplicata, foram escolhidos 4 diferentes valores de pHs
(5,0; 5,2; 5,5 e 5,8), esses valores foram escolhidos baseados em informações do
fornecedor da enzima, a temperatura ambiente de melhor atividade enzimática
ocorre no pH 6,1, como o objetivo do biossensor é a análise de fluidos corpóreos e a
temperatura corporal de 36,5 ºCo pH ideal também sofre alteração, dessa maneira
foram testados os pHs acima em tampão PBS , afim de verificar em qual pH se
obtém a melhor atividade da enzima
As concentração de glicose no eletrólito foram de (0; 4,4; 5,0; 6,0; 6,6)
mmol/L, onde zero de concentração serviu como um branco do processo.Já os
valores de 4,4 e 6,6 mmol/L representam valores limítrofes associados à
hipoglicemia e hiperglicemia, consecutivamente [45,46,53]. As demais
concentrações escolhidas de forma aleatória encontram-se dentro da faixa de
concentração de um indivíduo saudável, esses valores foram escolhidos afim de
determinar o funcionamento e sensibilidade do biossensor em toda faixa desejável
de detecção de glicose.
EPÓXI
FIO DE
COBRE
VIDRO/FTO VIDRO/FTO/V2O5
23
Em todos os testes feitos, a temperatura do sistema foi controlada e mantida
a 36,5 ºC, afim de se aproximar da temperatura em que se encontram os fluidos
corpóreos. Dessa maneira para o teste de EGFET obteve-se um total de 72
eletrodos para o teste em triplicata.
6.2.1. Rota de Imobilização
Neste trabalho utilizou-se a rota de imobilização da glicose oxidase via ligação
covalente cruzada com o V2O5 segundo procedimento abaixo:
A adição na enzima sobre o filme foi feita por spincoating na superfície da
amostra usando a razão 1:1, sendo uma camada de solução enzima glicose oxidase
(Gox) 1,5 mg/mL em solução PBS e uma solução de 5 % v/v de glutaraldeído (Glu),
somando 100�� da mistura. Em seguida, após a solução ser gotejada nos filmes
vidro/FTO/V2O5, os mesmos foram secos em um refrigerador com temperatura em
média de 4º C para que fosse mantida a atividade enzimática da Gox.
A solução de fosfato de sódio (PBS) foi preparada em pH=6,1 adicionando
fosfato monossódico (NaH2PO4) e fosfato dissódico (Na2HPO4) ambos em
concentração 0,1mol/L.
6.3. Métodos de caracterização
Neste tópico serão apresentadas as técnicas e métodos de investigação
utilizados na análise e caracterização dos materiais preparados, assim como,
quando conveniente, as condições empregadas nas mesmas.
Os equipamentos utilizados nas análises pertencem a diferentes
universidades que gentilmente colaboraram cedendo sua estrutura para realização
dos experimentos. O testes de Difração por Raios-X foram feitos na UFSJ/DCNAT, a
Espectrometria na Região do Infravermelho com Transformada de Fourier foi feita na
UFOP, a Microscopia Eletrônica de Varredura, Microbalança de Cristal de Quartzo
Eletroquímica e EGFET, foram feitas na USP, no laboratório do prof. Marcelo Mulato
e os testes de Voltametria Cíclica (VC) foram feitos na UFSJ/CAP.
24
6.3.1. Difração de Raios-X
Para a realização de medidas de Difração de Raios-X, pelo método do pó, foi
empregado um aparelho SIEMENS D5005 que utiliza cátodo de cobre e
monocromador de grafite para selecionar a região de emissão K do cobre ( =
1,5418 Å). O potencial na fonte foi de 40 kV e a corrente de 40 mA. Os padrões de
raios-X foram obtidos na faixa compreendida entre 2oa 50o (2) e em um passo de
0,2o a cada segundo. Para a obtenção dos difratogramas, as amostras foram
preparadas em substratos de vidro. De posse dos difratogramas seus picos foram
analisados utilizando a equação de Bragg para determinar a distância entre os
espaçamentos interlamelares. A lamelaridade do material pode ser obtida pela
comparação dos valores das distâncias interlamelares (dhkl) obtidas para cada um
dos picos basais. Esta distância pode ser calculada pela equação de Bragg:
n = 2 dhklsen
(Equação 2)
onde n é a ordem de reflexão do pico, dhkl o espaçamento interlamelar para o pico
hkl e o ângulo de Bragg, determinado pelo pico de difração. A repetição do valor d,
para n = 1, 2, 3,....n, demonstra a lamelaridade do material.
6.3.2.Espectrometria na região do infravermelho com transformada de
Fourier
As amostras para análise no infravermelho foram preparadas usando a
amostragem em pastilha de KBr. As pastilhas desta mistura foram obtidas utilizando-
se um pastilhador numa pressão de 107Pa.
Os espectros no infravermelho foram obtidos usando espectrofotômetro
infravermelho por transformada de Fourier, modelo Bomem MB-100, com
20acumulações, na faixa de 400 – 4000cm-1.Este método é baseado na interferência
da radiação entre dois feixes resultando um interferograma. Um interferograma é o
registro do sinal produzido pela combinação das múltiplas freqüências possíveis de
obter com a transformada de Fourier. A conversão do interferograma para espectro
é conseguida pelo tratamento matemático com transformadas de Fourier.
25
6.3.3. Microscopia Eletrônica de Varredura
A morfologia do V2O5 sol gel foi analisada por um microscópio eletrônico de
varredura JOEL modelo JSM6610LV. As amostras foram fixadas no porta-amostra
com uma fita de carbono. Uma cobertura fina de ouro ( 20Å) foi aplicada sobre as
amostras por 120s visto que o V2O5 é um material semicondutor. Esta camada é
responsável por conferir condutividade elétrica suficiente para a geração de boas
imagens.
6.3.4.Voltametria Cíclica
A voltametria cíclica permite a observação dos processos de oxidação e
redução que ocorrem nos sítios localizados na estrutura do material
eletroquimicamente ativo do eletrodo, é uma das técnicas eletroanalíticas mais
usadas no processo de caracterização eletroquímica.
Os experimentos de voltametria cíclica foram feitos num
Potenciostato/Galvonostato AutoLab III interfaciado a um computador. O eletrodo
utilizado nos testes é comercial Dropsens®, modelo C110, sendo constituído por um
eletrodo de trabalho de carbono vítriocom4 mm de diâmetro, um eletrodo auxiliar de
carbono e um contra eletrodo de prata e contatos elétricos também de prata, como
pode ser observado na Figura16 A e B.Como eletrólito utilizou-se para o primeiro
teste PBS pH 5,0 glicose 4,4mmol/L, essa concentração foi inicialmente escolhida
dentre da série de concentrações a serem testadas, como descrito na rota de
imobilização. Demais testes de VC foram feitos em diferentes concentrações de
glicose após se escolher o pH ideal para o biossensor segundo os resultados
obtidos no EGFET.
Os potenciais utilizados foram os referentes à região de transferência de
carga, conforme observado nos voltamogramas cíclicos, com velocidade de
varredura, , de20 mVs-1. Para se obter voltamogramas com picos de oxidação e
redução bem definidos, diversas velocidades de varreduras foram testadas,
obtendo-se melhores resultados a 20mV.s-1. A faixa de potencial também foi testada
de -3,0 a 3,0 V, e posteriormente reduzida aos valores onde são possíveis observar
o par redox. Sobre o eletrodo comercial foi depositado 0,2 mg de V2O5 e para
26
imobilização 100�� na mistura de Gox e Glu. Esse eletrodo foi escolhido afim de se
aproximar o máximo possível dos sensores já comercializados.
A montagem utilizada para os testes de Voltametria Cíclica pode ser vista na
Figura 17 A e B, onde o potenciostato/galvanostato usado no teste de VC é
acoplado com computador e ao sensor comercial com V2O5, imerso em solução PBS,
sobre temperatura controlada usando banho maria.
Figura 17– Imagem do potenciostato/galvanostato usado no teste de VC (a) sensor comercial com V2O5 testado sobre temperatura controlada usando banho maria, (b) computador.
A B
Figura 16– Imagem do sensor comercial C110 (a) sem o filme (b) após a adição de V2O5/Gox.
A) B)
27
6.3.5.Microbalança de Cristal de Quartzo Eletroquímica
Para medida de variação de massa foi utilizado como sensor pizoelétrico uma
Microbalança de Cristal de Quartzo Eletroquímica, ou seja, a microbalança foi
acoplada a um potenciostato. Nessa técnica oscilações mecânicas ressonantes são
geradas uma vez que a perturbação elétrica aplicada também possuía propriedades
oscilatórias, ou seja, ocorreu deformações na estrutura do cristal de quartzo.
Para esse estudo foram usados cristais de quartzo disponíveis
comercialmente, esses cristais possuem uma fina camada de ouro eletrodepositada
nas duas faces. A lâmina de quartzo apresenta 13,9 milímetros de diâmetro,o
eletrodo de ouro possui 6 milímetros de diâmetro, com uma espessura na faixa de
3.000 A 10.000 Å, como representado na Figura 18. A faixa de potencial utilizada foi
de -0,5 V a 1,0 V com uma velocidade de varredura de 20mV/s em PBS pH 5 e
concentração de glicose 4,4 mmol/L.
Depositou-se 2mg de V2O5sol gel sobre a superfície do cristal, após seco a na
estufa a 80ºC foram realizados 50 ciclos na faixa de potencial de -0,5 V a 1,0 V,
sobre o mesmo filme adicionou-se Gox/Glu como descrito na rota de imobilização e
50 ciclos foram novamente feitos.
Afim de testar se é possível melhorar a estabilidade dos filmes sobre o
eletrodo, os testes foram novamente repetidos com novos filmes adicionando-se
sobre eles 25 µL de Nafion após a imobilização da enzima pela mesma técnica
usada na fabricação de filme de V2O5de spincoating.
Figura 18– Representação de um exemplar de cristal de quartzo piezelétrico.
28
Frequências fundamentais ressonantes são geradas nos cristais piezelétricos,
podendo sofrer alterações (∆� ) de acordo coma variação de massa total (∆�) ,
presente no sitema. Sendo assim, existe uma relação de linearidade entre ∆� e ∆� ,
que pode ser expressa em termos matemáticos pela equação de Sauerbrey.
∆� = −2,3. 10��
20∆�
�
(Equação 3)
sendo:
∆� = variação da frequência (Hz)
F0 = freqüência fundamental ressonante da lâmina de quartzo (MHz)
∆� = variação de massa total depositada nos eletrodos presentes nas faces
do cristal (g)
A= área do eletrodo que pode ou não ser recoberta por modificador químico
(cm2)
A equação 2 foi usada para analisar os resultados obtidos pela técnica de
EQCM, pois através dela podemos inferir que quanto maior for o valor da vibração
de massa total do sistema, menor será o valor da freqüência de vibração
ressonante.
6.3.6.Transistores de Efeito de Campo com Gatilho Estendido
O sensor eletroquímico potenciométrico utilizado [47], baseia-se no circuito
amplificador instrumental utilizando o amplificador operacional (AmpOp) CA3140.
AFigura19 mostra o sistema experimental do sensor que por sua vez encontrou-se
interligado a um computador que recebia os dados obtidos pelos equipamentos,
sendo estes dados tratados com o programa licenciado OriginPro 8.
O filme sensível de V2O5foi conectado à entrada principal e imerso na solução
enquanto a segunda entrada foi aterrada, bem como um eletrodo de referência
(Ag/AgCl) imerso na solução. O potencial gerado pelas cargas em solução foi
mensurado pelo sistema para cada valor de pH por 900 segundos gerando um total
de 450 pontos. A caracterização foi repetida por 24 vezes, compreendendo todos os
valores de pH e concentração de glicose citados no processo de confecção do
29
gatilho estendido. Cada teste foi feito em triplicata de maneira simultânea, imergindo
no eletrólito três gatilhos, cada um conectado separadamente ao sistema de
amplificação. Após os testes com o filme de pentóxido de vanádio, a enzima Gox foi
imobilizada sobre os mesmos, após seco cada sensor recebeu 25 µL de Nafion.
Figura 19– Sensor EGFET. À direita temos o circuito amplificador instrumental e à esquerda temos a representação do filme sensível e da solução tampão mensurada [46].
30
7) RESULTADOS E DISCUSSÃO
___________________________________________________________________
7.1. Análise da estrutura de V2O5 pela técnica de Difração de Raios-X
O difratograma que caracteriza o pentóxido de vanádio é apresentado a
seguir. Na Figura 20 é possível observar que mesmo após a secagem do material a
estrutura lamelar é mantida, tal observação é provada pela presença do pico intenso
de difração (001) e três picos de menor intensidade eqüidistantes, característico de
um material lamelar.
10 20 30 40 50
00l25 cps
Inte
nsi
dad
e / u
. a
.
2 / Graus
Figura 20 – Difratogramada matriz de pentóxido de vanádio (V2O5.nH2O).
003
004 005
001
31
Através do cálculo da lei de Bragg, é possível verificar que a distância
interplanar foi de d=1,17 nm sugerindo que as moléculas de água estão intercaladas
em uma razão de 1,8, temos então a seguinte hidratação V2O5.1,8H2O, este
resultado pode também ser observado na literatura [48].
Na Figura 21 está representado o difratograma do filme com a glicose oxidase
já imobilizada com glutaraldeído. Pode-se observar o deslocamento dos picos para
ângulos maiores e uma diminuição na intensidade,com isso o espaçamento
interlamelar é diminuído, devido a diminuição da cristalinidade como conseqüência
da imobilização. Nota-se que a estrutura lamelar do V2O5 foi preservada pela
presença dos picos eqüidistantes003,004 e 005, porém a superfície ficou menos
cristalina após a imobilização.
Figura 21–Difratograma do filme V2O5/GOx/GLU
V2O5/ Glu/Gox
003
004 005
001
32
7.2. Estudo da Micrografia do filme de V2O5
A imagem referente à micrografia do V2O5 xerogel, está demonstrada na
Figura 22. Nesta Figura 22, pode-se observar a presença de aglomerados fibrosos
interconectados. Esses aglomerados podem estar associados com os centros de
nucleação. O crescimento é promovido, primeiramente, por oligômeros e, no
segundo estágio, há a formação e crescimento de fibras resultando em uma cadeia
polimérica organizada de V2O5.nH2O.
O V2O5.nH2O consiste de cadeias poliméricas localizadas no plano da
superfície de orientação ainda não estudas, porém, a distância entre as camadas é
bem definida e depende da quantidade das moléculas de água intercaladas. De
acordo com a literatura [49], em decorrência do processo de nucleação e
crescimento ocorre a produção de espécies coloidais fibrosas,durante a evolução
estrutural causada pela gelação do ácido vanádico, ocorre a formação de partículas
whisker (monocristais muito fino, de alta perfeição, que possui uma razão
comprimento/diâmetro extremamente grande). Após a reação de olação e oxolação,
formam-se fibras que se entrelaçam e são descritas como fitas planas exibindo uma
estrutura bidimensional [50].
As fibras, formadas pela reação de condensação do ácido vanádico,
provavelmente, apresenta uma estrutura VO5 piramidal e, durante o crescimento há
a formação de cátions de dioxovanadio. No crescimento dessa matriz pode ocorrer
também a formação da estrutura esferulita com cadeias poliméricas. Esse tipo de
configuração consiste de um cristalcom algumas regiões amorfas interligadas
geradas na etapa de nucleação [51].
Figura 22
Afim de comparar a morfologia do filme de V
ainda será necessário fazer novos testes de MEV após a imobilização com Gox,
complementando os resultados já obtidos pela DRX
7.3. Análise do aparecimento e deslocamento dos principais picos no
Infravermelho antes e após a imobilização da enzima
O espectro na região do
mostrado na Figura 23. A banda em 1010 cm
referente ao grupo vanadila (V=O), e a banda em 762 cm
νassim(V–O–V). A banda em 536 cm
νsim(V–O–V) associados com as pontes de ligação formadas pelo vanádio
oxigênio[52].
Para o V2O5 com a glicose imobilizada, representado pela curva preta
Figura 23, nota-se o aparecimento
C-O ao grupo carbolina dos aminoácidos que formam
A banda do ácido
intensa e larga porém,
moléculas de hidratação do V
estiramento no N-H das aminas formadas a partir das ligações peptídicas dos
aminoácidos que aparecem na região de 3300 a 350
22– Micrografia feita da superfície da matriz de V
Afim de comparar a morfologia do filme de V2O5 antes e após a imobilização,
ainda será necessário fazer novos testes de MEV após a imobilização com Gox,
complementando os resultados já obtidos pela DRX e o FTIR.
Análise do aparecimento e deslocamento dos principais picos no
após a imobilização da enzima
na região do infravermelho da membrana de V
. A banda em 1010 cm−1 está relacionada ao estiramento V
referente ao grupo vanadila (V=O), e a banda em 762 cm
V). A banda em 536 cm−1 é devido aos modos de vibração do
V) associados com as pontes de ligação formadas pelo vanádio
com a glicose imobilizada, representado pela curva preta
se o aparecimento de uma banda em1120 cm−1, referente a vibração
ao grupo carbolina dos aminoácidos que formam a molécula de glicose oxidase
A banda do ácido carboxílico entre 3300 e 2500 cm−
sobrepõem a banda de O-H entre 3200 e 2500
moléculas de hidratação do V2O5. O mesmo é possível ocorrer com as vibrações de
H das aminas formadas a partir das ligações peptídicas dos
aminoácidos que aparecem na região de 3300 a 3500cm−1.
33
V2O5
antes e após a imobilização,
ainda será necessário fazer novos testes de MEV após a imobilização com Gox,
Análise do aparecimento e deslocamento dos principais picos no
infravermelho da membrana de V2O5xerogel é
cionada ao estiramento V–O
referente ao grupo vanadila (V=O), e a banda em 762 cm−1 é referente a
é devido aos modos de vibração do
V) associados com as pontes de ligação formadas pelo vanádio-
com a glicose imobilizada, representado pela curva preta da
, referente a vibração
a molécula de glicose oxidase.
−1aparece de forma
H entre 3200 e 2500cm−1 das
. O mesmo é possível ocorrer com as vibrações de
H das aminas formadas a partir das ligações peptídicas dos
34
Para as bandas presentes antes e após a imobilização da enzima observa-se
um pequeno deslocamento em média de 4 cm−1, evidenciando a imobilização da
enzima sobre a matriz de V2O5. A imobilização da enzima com o auxílio do
glutaraldeído é evidenciada devido ao deslocamento das vibrações do V2O5que
passaram de 1010cm−1no estiramento V–O referente ao grupo vanadila (V=O) para
1006cm−1,a banda em 762 cm−1 é referente a νassim(V–O–V) passa a aparecer em
759cm−1 e a banda em 536 cm−1referente aos modos de vibração do νsim(V–O–V), se
desloca para 530cm−1.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
(C
-O)
(V
OV
) s
(V
OV
) a
(V
=O
)
tra
nsm
itân
cia
/u
.a.
Numero de ondas /cm-1
V2O
5 / Gox
V2O
5
Figura 23– Espectro de infravermelho do filme de V2O5 antes e após a imobilização com Gox
7.4. Estudo do Voltamograma e a possível perda de massa com o
processo
Os resultados dos voltamogramas cíclicos estão representados pelos ciclos 1,
2, 25 e 50 do filme de V2O5 antes da imobilização e pelos ciclos 1, 2, 25 e 50 do
mesmo filme após a imobilização de Gox, na Figura 24. Para o filme de antes da
35
imobilização é possível observar um pico catódico em 0,26 V e um pico anódico em -
0,30 V correspondente ao par VV/IV. A área coberta do eletrodo comercial foi de
aproximadamente 1,0 cm2, utilizou-se como eletrólito o tampão PBS pH 5,0 com
glicose 4,4 mmol/L.
A intensidade de corrente diminui a medida em que se aumenta o número de
ciclos até atingir estabilidade, que será melhor explorada nas Figuras 25 A e 25 B,
ao se comparar o primeiro com o segundo ciclo ocorre uma brusca mudança na
intensidade de corrente, devido as reações de inserção e desinserção de elétrons no
filme, consequentemente, a carga total diminui a medida que ocorrem os ciclos. Com
a adição da glicose oxidase o filme V2O5/Gox apresentou um novo comportamento
devido à atividade da enzimática da Gox, frente à glicose presente no meio.O novo
material (V2O5/Gox), passa a apresentar novas características eletroquímicas,
características essas, particulares de cada material, a transferência de cargo ocorre
em outra região devido a mudança da estrutura.Nesse caso pode-se observar um
novo pico catódico em 0,19V e anódico em 0,01V que também tende à estabilidade.
Com a possível estabilização estrutural do filme antes da imobilização as mudanças
observadas no voltamograma depois da adição de Gox indicam uma possível
imobilização da enzima no substrato. O mesmo procedimento deve ser repetido em
diferentes concentrações de glicose esperando diferentes perfis voltamétricos.
-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
-0,0012
-0,0010
-0,0008
-0,0006
-0,0004
-0,0002
0,0000
0,0002
0,0004
0,0006
V2O
5 ciclo 1
V2O
5 ciclo 2
V2O
5 ciclo 25
V2O
5 ciclo 50
V2O
5/Gox ciclo 1
V2O
5/Gox ciclo 2
V2O
5/Gox ciclo 25
V2O
5/Gox ciclo 50
potencial /V
j /
A.c
m-2
Figura 24– Voltamograma obtido durante os 100 ciclos do filme de V2O5 antes e após a imobilização de Gox, a 20 mV, na faixa de potencial de -0,5 a 1,0 V, PBS pH=5,0 glicose 4,4 mmol/L.
36
As Figuras 25 A e 25 B foram obtidas a partir do voltamograma cíclico do
V2O5 antes e após a imobilização de Gox, pode-se notar que taxa de variação da
carga diminui à medida em que se aumenta o número de ciclos, ou seja, as reações
de transferência de carga tendem a ficar estáveis devido à reestruturação do V2O5
com inserção e desinserção de íons, atingindo um equilíbrio dinâmico na superfície
do eletrodo, mantendo a estrutura do material.Porém, pequenas oscilações podem
ser observadas principalmente antes da adição de Gox. Isso se dá a uma provável
perda de massa, ou seja, uma nova camada do filme eletroativa é exposta, com isso
ocorre um aumento na transferência de carga que anteriormente tendia à
estabilização.
Com a adição de Gox nota-se uma tendência na diminuição de carga sem
tantas variações, isso porque a adição de glicose oxidase com glutaraldeído ocorre
por ligações covalentes cruzadas, dificultando a perda de massa e exposição de
camadas internas do filme. Essa melhora na estabilidade estrutural ajuda a
confirmar a eficácia na imobilização da enzima. A partir do ciclo 40 nota-se um
aumento no valor da carga provavelmente a uma nova perda de massa e exposição
de camadas internas do filme ocorreu, com isso nota-se que a imobilização dificultou
a perda de massa porém não a impediu, tal observação será melhor explorada pela
técnica de EQCM a seguir.
0 10 20 30 40 50
5
10
15
20
25
30
35
Número de ciclos
Qto
tal /
mC
.cm
-2
0 10 20 30 40 50
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Número de ciclos
Qto
tal /
mC
.cm
-2
Figura 25–Variação da carga durante 50 ciclos a 20 mV, na fapixa de potencial de -0,5 a 1,0 V, PBS pH5 glicose 4,4mmol/L, do filme de V2O5 (a) antes e (b) após a imobilização de Gox.
a) b)
37
7.5.Variações de massa comprovadas pelo teste de EQCM (Microbalança
de Cristal de Quartzo Eletroquímica)
Através da equação de Sauerbrey podemos inferir que quanto maior for o
valor da vibração de massa total do sistema, menor será o valor da freqüência de
vibração ressonante.
O principal objetivo dos estudos com a microbalança de quartzo foi avaliar a
possível perda de massa do filme durante as ciclagens eletroquímicas antes e após
a imobilização da Gox. Isso porque durante o processo notou-se uma tendência de
aumento da carga do material. Na Figura 26 podemos observar que o valor da
freqüência é aumentado à medida em que ocorre a ciclagem do material na faixa de
potencial de -0,5 V a 1,0 V, pela equação de Sauerbrey podemos dizer que ocorre
uma perda de massa do filme. O que justifica o aumento de carga observado no
voltamograma devido à exposição de camadas mais internas do filme, ou ainda não
ativas. É provável que a perda de massa pode ser devido a saída da enzima
imobilizada deixando a superfície do V2O5 diretamente exposta. Entretanto, para
confirmar essa hipótese, será necessário fazer uso de técnicas capazes de conferir
o que realmente está presente na superfície como, por exemplo, MEV e EDX.
-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
fre
qu
ên
cia
/ H
z
potencial/ V
V2O
5
V2O
5 / Gox
Figura 26– Variação da frequênciana faixa de potencial de -0,5 a 1 V durante 50 ciclos a 20 mV, eletrólito PBS, pH 5 e concentração de glicose 4,4mmol/L, do filme de V2O5 antes (em preto) e após a
imobilização de Gox (em vermelho).
38
Na Figura 27, podemos notar que a enzima confere ao filme uma menor
perda de massa, representada pelos valores negativos no eixo y, ou seja, o filme se
torna mais estável, evidenciando a eficiência das ligações cruzadas entre a enzima,
o substrato e o glutraldeído, dessa maneira o filme é capaz de resistir por mais
tempo. É possível observar semelhantemente ao resultado da voltametria onde o
valor da carga é mais estável após a adição de Gox que existe uma maior
estabilidade do filme quanto à perda de massa após a imobilização, o que é
favorável na construção de um biossensor capaz de ser utilizado por diversas vezes.
Na Figura 28, temos a relação da perda de massa durante os 50 ciclos de
varredura, porém para esse teste, após seguido o protocolo de imobilização da Gox
formam adicionados 25 µL de Nafion, que funciona como uma membrana
conferindo mais aderência do filme ao elétrodo, permitindo a interação entre a
enzima(Gox) e a glicose do meio. Comparando-se os dois resultados obtidos nota-
se uma diminuição na perda de massa com a adição do Nafion, que passou de
-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
-590
-585
-580
-5
-4
-3
-2
-1
0
V2O
5/ Gox
V2O
5
mass
a /g
potencial/ V
Figura 27– Variação da massa na faixa de potencial de -0,5 a 1 V durante 50 ciclos a 20 mV, eletrólito PBS, pH 5 e concentração de glicose 4,4 mmol/L, do filme de V2O5 antes (em preto) e após a
imobilização de Gox (em vermelho).
39
uma variação de aproximadamente -13 µg para -4 µg. Dessa maneira podemos
afirmar que a adição de Nafion é uma etapa que deve ser acrescentada ao
procedimento de montagem do biossensor, após a imobilização da enzima.
7.6. Estudo elétrico do comportamento do biossensor sob diferentes
condições
Para os testes no EGFET foram utilizadas todas as combinações de pH e
concentração de glicose pré estabelecidas, afim de definir as condições ideais em
que o filme melhor responde à presença de glicose.
O equipamento utilizado para obtenção dos resultados que se seguem pode
ser visto na Figura 29, onde o sistema foi mantido a temperatura constante utilizando
-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
-18
-16
-14
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
ma
ssa
/ g
potencial aplicado/ V
V2O
5/ Gox
V2O
5/ Gox/ Nafion
Figura 28- Variação da massa na faixa de potencial de -0,5 a 1 V durante 50 ciclos a 20 mV, eletrólito PBS, pH 5 e concentração de glicose 4,4mmol/L, do filme de V2O5 após a imobilização de
Gox com a adição de Nafion (em vermelho) e sem a adição de Nafion (em preto).
40
banho-maria. A Figura 30 A, B e C mostra a disposição dos filmes para teste em
triplicata simultânea, o sensor produzido antese após a adição do filme.
Figura 29 – Imagem do sistema utilizado nos testes do EGFET
Figura 30 – Imagens (a) da disposição dos nos filmes em banho maria, (b) dos sensores de vidro com FTO e fio de cobre colado com cola prata e (c) de sensores do o filme de V2O5 depositado
NaFigura31 A-D em cada uma delas o valor do pH do eletrólito foi fixado, em
5,0; 5,2; 5,5 e 5,8 respectivamente, em todos os casos observou-se que a corrente
obtida como resposta diminui após a adição de Gox de pelo menos 0,1 A quando
A) B) C)
41
comparada o valor da corrente antes da adição de glicose oxidase, evidenciando a
imobilização da enzima.
Em todas as figuras é possível também observar que após a imobilização da
enzima independente da concentração de glicose no meio ocorre um decaimento da
corrente nos primeiros instantes tendendo no decorrer do experimento à estabilidade
pois, após 200s os valores de corrente praticamente não variam.
Nos primeiros 200 segundos iniciais a estabilidade do filme é menor, no caso
do filme sem a Gox os valores de corrente primeiro crescem para depois atingir a
estabilidade, já nos filmes com a enzima imobilizada existe uma tendência inicial de
decréscimo nos valores de correm para depois atingirem a estabilidade. Essa
diferença se dá devido às reações enzimáticas que ocorrem após a imobilização,
observadas também na VC com o deslocamento dos picos de oxidação e redução. É
muito provável que ocorra uma estabilização/acomodação da estrutura, similar ao
que ocorre nos estudos eletroquímicos.
Figura 31 A – Corrente com relação tempo, fixando o pH em 5,0
0 100 200 300 400 500 600
0,45
0,50
0,55
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
V2O
5 - 0,0 mM
V2O
5 - 4,4 mM
V2O
5 - 5,0 mM
V2O
5 - 5,5 mM
V2O
5 - 6,0 mM
V2O
5 - 6,6 mM
V2O
5/Gox - 0,0 mM
V2O
5/Gox - 4,4 mM
V2O
5/Gox - 5,0 mM
V2O
5/Gox - 5,5 mM
V2O
5/Gox - 6,0 mM
V2O
5/Gox - 6,6 mM
Corr
ente
/ A
Tempo /s
A)
42
Figura 32 B– Corrente com relação tempo, fixando o pH em 5,2.
Figura 33 C – Corrente com relação tempo, fixando o pH em 5,5.
0 100 200 300 400 500 600
0,45
0,50
0,55
0,75
V2O
5 - 0,0 mM
V2O
5 - 4,4 mM
V2O
5 - 5,0 mM
V2O
5 - 5,5 mM
V2O
5 - 6,0 mM
V2O
5 - 6,6 mM
V2O
5/Gox - 0,0 mM
V2O
5/Gox - 4,4 mM
V2O
5/Gox - 5,0 mM
V2O
5/Gox - 5,5 mM
V2O
5/Gox - 6,0 mM
V2O
5/Gox - 6,6 mM
Corr
ente
/ A
Tempo / s
0 100 200 300 400 500 600
0,40
0,45
0,50
0,55
0,75
0,80
V2O
5 - 0,0 mM
V2O
5 - 4,4 mM
V2O
5 - 5,0 mM
V2O
5 - 5,5 mM
V2O
5 - 6,0 mM
V2O
5 - 6,6 mM
V2O
5/Gox - 0,0 mM
V2O
5/Gox - 4,4 mM
V2O
5/Gox - 5,0 mM
V2O
5/Gox - 5,5 mM
V2O
5/Gox - 6,0 mM
V2O
5/Gox - 6,6 mM
Corr
ente
/ A
Tempo (s)
B)
C)
43
Figura 34 D – Corrente com relação tempo, fixando o pH em 5,8.
Após a estabilidade dos valores de corrente é possível realizar a
correspondência de cada corrente final com relação à concentração de glicose
presente no meio 0,0, 4,4, 5,0, 5,5, 6,0 e 6,6 (mol/L),como pode ser observado na
Figuras 32 A-D. Para isso foi utilizado o último valor de corrente registrado no tempo
final igual a 450s das figuras 31 A -D. Observa-se na Figura 32 A que para o
primeiro valor de pH de 5,0 após a adição da enzima nota-se uma tendência na
diminuição da corrente ao aumentar-se a concentração de glicose. Dessa maneira,
podemos utilizar esse pH como referência para realização de experimentos
posteriores no equipamento EGFET a fim de verificar se o efeito permanece quando
os filmes são utilizados repetidas vezes.
0 100 200 300 400 500 600
0,45
0,50
0,55
0,60
0,75
0,80
V2O
5 - 0,0 mM
V2O
5 - 4,4 mM
V2O
5 - 5,0 mM
V2O
5 - 5,5 mM
V2O
5 - 6,0 mM
V2O
5 - 6,6 mM
V2O
5/Gox - 0,0 mM
V2O
5/Gox - 4,4 mM
V2O
5/Gox - 5,0 mM
V2O
5/Gox - 5,5 mM
V2O
5/Gox - 6,0 mM
V2O
5/Gox - 6,6 mM
Corr
ente
/ A
Tempo / s
D)
44
a)
-1 0 1 2 3 4 5 6 7
0,45
0,50
0,55
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
V2O
5
V2O
5 / Gox/ Nafion
Co
rre
nte
Fin
al (
A)
[ ] de glicose (mmol/L)
b)
-1 0 1 2 3 4 5 6 7
0,45
0,50
0,55
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
V2O
5
V2O
5 / Gox/ Nafion
Co
rre
nte
Fin
al (A
)
[ ] de glicose (mmol/L)
c)
-1 0 1 2 3 4 5 6 7
0,45
0,50
0,55
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
V2O
5
V2O
5 / Gox/ Nafion
Co
rre
nte
Fin
al (
A)
[ ] de glicose (mmol/L)
d)
-1 0 1 2 3 4 5 6 7
0,45
0,50
0,55
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
V2O
5
V2O
5 / Gox/ Nafion
Co
rre
nte
Fin
al (
A)
[ ] de glicose (mmol/L)
Figura 35 – Corrente por concentração de glicose, fixando o pH em (a) 5.0, (b) 5.2, (c) 5.5 e (d) 5.8.
7.7 Estudo eletroquímico do comportamento do biossensor sob
diferentes condições
De posse dos resultados obtidos no EGFET, novos testes de VC foram
realizados no pH em que melhor respondeu ao biossensor, afim de comparar os
resultados obtidos em ambas as técnicas. Adicionou-se ao filme V2O5/Gox o Nafion®
afim de impedir a exposição de novas camadas do filme e estabilizar os valores de
corrente e carga. Fixando o pH em 5,0 variou-se a concentração de glicose nas
45
concentrações de(4,4, 5,0, 5,5, 6,0 e 6,6,) mmol/L os voltamogramas obtidos estão
na Figura33 A, B, C, D, e E, respectivamente.
Para os testes de voltametria o sensor impresso comercial C110, foi escolhido
no lugar do FTO afim de se aproximar aos modelos de sensores de glicose
disponíveis no mercado. Como já explanado esse sensor possui três eletrodos
(referência, trabalho e contra-eletrodo), diferentemente da técnica de EGFET que
possui dois eletrodos (trabalho e referência).
Com a mudança da técnica e mudança do tipo de eletrodo, pretendeu-se
observar em quais circunstâncias o biossensor produzido responderia melhor, ou
seja, apresentaria melhor correlação eletroquímica ao se variar a concentração de
glicose e pH do meio.
Em todos os resultados notou-se que a intensidade de corrente diminuiu com
o aumento do número de ciclos tendendo a estabilidade, exceto na concentração de
glicose 5,5 mol/L,onde ocorreu o aumento na intensidade de corrente e carga, com o
aumento do número de ciclos, tal fator pode ser associado a exposição de novas
áreas no filme, ou seja é provável que o Náfion® adicionado não tenha coberto toda
a superfície permitindo a exposição de áreas mais internas no filme.
Com a imobilização da glicose um novo comportamento foi observado, devido
a reação enzimática,pode-se notar o deslocamento do pico anódico para valores de
menor potencial relacionados nas segunda e terceira coluna da Tabela 1, onde se
observam-se, também, os picos catódicos após a imobilização referente a redução
da enzima.
Tabela 1 – Picos de oxidação e redução obtidos na VC antes e após a
imobilização da enzima.
Concentrações de glicose (mmolL-1)
Picos anódicos V2O5(V)
Picosanódicos V2O5/ Gox (V)
Picos catódicos V2O5/ Gox (V)
4,4 0,18 -,009 0,19 5,0 0,08 -0,06 0,32 5,5 0,09 -0,01 0,27 6,0 0,18 -0,06 0,27 6,6 0,11 -0,05 0,23
46
-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
-0,0004
-0,0003
-0,0002
-0,0001
0,0000
0,0001
0,0002
0,0003
potencial / V
j /
A.c
m-2
V2O
5 ciclo 1
V2O
5 ciclo 2
V2O
5 ciclo 25
V2O
5 ciclo 50
V2O
5/Gox ciclo 1
V2O
5/Gox ciclo 2
V2O
5/Gox ciclo 25
V2O
5/Gox ciclo 50
-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
-0,0003
-0,0002
-0,0001
0,0000
0,0001
0,0002
potencial / V
j /
A.c
m-2
V2O
5 ciclo 1
V2O
5 ciclo 2
V2O
5 ciclo 25
V2O
5 ciclo 50
V2O
5/Gox ciclo 1
V2O
5/Gox ciclo 2
V2O
5/Gox ciclo 25
V2O
5/Gox ciclo 50
A)
B)
Figura 36 A –Voltamograma obtido durante os 100 ciclos do filme de V2O5 antes e após a
imobilização de Gox, a 20 mV, na faixa de potencial de -0,5 a 1,0 V, PBS 5,0 glicose 4,4 mmol/L.
Figura 37 B –Voltamograma obtido durante os 100 ciclos do filme de V2O5 antes e após a
imobilização de Gox, a 20 mV, na faixa de potencial de -0,5 a 1,0 V, PBS 5,0 glicose 5,0 mmol/L.
47
-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
-0,0004
-0,0003
-0,0002
-0,0001
0,0000
0,0001
0,0002
0,0003
0,0004
potencial / V
j /
A.c
m-2
V2O
5 ciclo 1
V2O
5 ciclo 2
V2O
5 ciclo 25
V2O
5 ciclo 50
V2O
5/Gox ciclo 1
V2O
5/Gox ciclo 2
V2O
5/Gox ciclo 25
V2O
5/Gox ciclo 50
-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
-0,0004
-0,0003
-0,0002
-0,0001
0,0000
0,0001
0,0002
0,0003
0,0004
0,0005
j /
A.c
m-2
V2O
5 ciclo 1
V2O
5 ciclo 2
V2O
5 ciclo 25
V2O
5 ciclo 50
V2O
5/Gox ciclo 1
V2O
5/Gox ciclo 2
V2O
5/Gox ciclo 25
V2O
5/Gox ciclo 50
potencial / V
C)
D)
Figura 39 C –Voltamograma obtido durante os 100 ciclos do filme de V2O5 antes e após a
imobilização de Gox, a 20 mV, na faixa de potencial de -0,5 a 1,0 V, PBS 5,0 glicose 5,5 mmol/L.
Figura 38 D –Voltamograma obtido durante os 100 ciclos do filme de V2O5 antes e após a
imobilização de Gox, a 20 mV, na faixa de potencial de -0,5 a 1,0 V, PBS 5,0 glicose 6,0 mmol/L.
48
-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
-0,0003
-0,0002
-0,0001
0,0000
0,0001
0,0002
j /
A.c
m-2
V2O
5 ciclo 1
V2O
5 ciclo 2
V2O
5 ciclo 25
V2O
5 ciclo 50
V2O
5/Gox ciclo 1
V2O
5/Gox ciclo 2
V2O
5/Gox ciclo 25
V2O
5/Gox ciclo 50
potencial / V
Figura 40–Voltamograma obtido durante os 100 ciclos do filme de V2O5 antes e após a
imobilização de Gox, a 20 mV, na faixa de potencial de -0,5 a 1,0 V, PBS 5,0 glicose 6,6
mmol/L.
Nas Figura 34 A, B, C, D e E,obtidas a partir do voltamogramas anteriores,
podem-se notar que a taxa de variação de carga diminui a medida que o número de
ciclos aumenta, tendendo a estabilidade, exceto na concentração de 5,5, onde é
provável que o Náfion® não tenha impedido a exposição de camadas mais internas
do filme através da inserção e desinserção de íons durante o processo de ciclagem.
A tendência na estabilidade dos valores de corrente carga demonstram que o
biossensor criado pode ser utilizado repetidas vezes sem a perda na qualidade no
resultado. Como uma tendência na linearidade dos resultados na VC não podem ser
observadas, observou-se a necessidade de testar a técnica para valores de pH
diferentes, afim de obter uma linearidade, tal qual observou-se no teste do EGFET.
Para os valores de pH e concentração de glicose escolhidos a técnica de
EGFET mostrou-se mais eficaz na detecção do analito, pois foi possível observar
uma melhor correlação entre o resultado elétrico obtido e a concentração de glicose
no meio, outro fator importante para a obtenção dos resultados além da mudança de
E)
49
técnica pode estar associada a mudança no tipo de eletrodo, já que o eletrodo de
trabalho utilizado no EGFET foi de vidro recoberto com FTO e na Voltametria cíclica
foi utilizado um sensor impresso comercial com eletrodo de trabalho de carbono
vítreo. Dessa maneira propor novos teste, com utilizando o mesmo eletrodo de
trabalho pode favorecer a comparação das técnicas e alterar os resultados obtidos.
0 10 20 30 40 50
2
4
6
8
10
12
14
Número de ciclos
Qto
tal /
mC
.cm
-2
V2O
5
V2O
5/Gox
Figura 41 A – Variação de carga durante 50 ciclos a 20 mV na faixa de potencial -0,5 a 1,0 V, PBS pH 5,0 do filme ante e após a imobilização com Gox na concentração de glicose 4,4mmol/L
0 10 20 30 40 50
2
4
6
8
10
Número de ciclos
Qto
tal /
mC
.cm
-2
V2O
5
V2O
5/Gox
Figura 42 B – Variação de carga durante 50 ciclos a 20 mV na faixa de potencial -0,5 a 1,0 V, PBS pH 5,0 do filme ante e após a imobilização
com Gox na concentração de glicose 5,0 mmol/L
0 10 20 30 40 50
2
4
6
8
10
12
14
Número de ciclos
Qto
tal /
mC
.cm
-2
V2O
5
V2O
5/Gox
Figura 43 C – Variação de carga durante 50 ciclos a 20 mV na faixa de potencial -0,5 a 1,0 V, PBS pH 5,0 do filme ante e após a imobilização
com Gox na concentração de glicose 5,5 mmol/L
0 10 20 30 40 50
5
10
15
20
25
Número de ciclos
Qto
tal /
mC
.cm
-2
V2O
5
V2O
5/Gox
Figura 44 D – Variação de carga durante 50 ciclos a 20 mV na faixa de potencial -0,5 a 1,0 V, PBS pH 5,0 do filme ante e após a imobilização
com Gox na concentração de glicose 6,0 mmol/L
A) B)
C) D)
50
0 10 20 30 40 50
2
4
6
8
10
12
14
16
Qto
tal /
mC
.cm
-2
Número de ciclos
V2O
5
V2O
5/Gox
Figura 45 E – Variação de carga durante 50 ciclos a 20 mV na faixa de potencial -0,5 a 1,0 V, PBS pH 5,0 do filme ante e após a imobilização com Gox na concentração de glicose 6,6 mmol/L
.
E)
51
8) CONCLUSÕES
___________________________________________________________________
No presente trabalho, foi demonstrada a adequação de emprego do filme de
V2O5,usado como matriz de imobilização da enzima glicose oxidase por ligação
covalente cruzada com glutaraldeído, para o desenvolvimento de biossensores
eletroquímicos enzimáticos. Inicialmente foi realizada a construção do sensor
através da deposição por spincoating do filme de V2O5, sobre os eletrodos de
trabalho de carbono vítreo para o teste de voltametria cíclica e sobre o eletrodo de
vidro recoberto com FTO para o teste no EGFET. Após a coleta dos resultados de
ambas as técnicas a imobilização de glicose oxidase sobre os mesmos filmes foi
feita afim de comparar os resultados obtidos e provar a efetiva imobilização da
enzima na matriz.
A imobilização da enzima por ligação covalente cruzada representou um
grande desafio e foi testada diversas vezes variando a concentração de
glutaraldeído e Gox, até a obtenção dos resultados satisfatórios apresentados pelas
técnicas de caracterização utilizadas.A falta de referências que evidenciassem a
imobilização dificultou o trabalho, por isso inúmeros testes preliminares foram feitos,
alterando a ordem de adição entre a enzima e o glutaraldeído e mistura entre elas.
Outro parâmetro também testado foi a concentração e quantidade necessária das
soluções para imobilização.
A técnica utilizada para testar inicialmente a imobilização foi a voltametria
cíclica, essa foi feita exaustivamente até que se observou o padrão apresentado
neste trabalho, onde ocorreu os deslocamentos do picos característicos do
voltamograma de cada material.Essa técnica se mostrou eficaz para tal finalidade,
visto que representou o meio mais rápido para visualizar a mudança de resposta
eletroquímica com a adição de Gox, além disso o potenciostato utilizado era de fácil
acesso, diferentemente das demais técnicas utilizadas.
O V2O5 xerogel foi caracterizado pela técnica de espectroscopia de FTIR
onde as principais bandas foram observadas, após a imobilização com Gox os
espectros foram contrapostos e novas bandas apareceram referentes a presença de
Gox. Na DRX, foi possível identificar que após a adição da enzima houve
alteraçãoda estrutura evidenciando a imobilização da enzima na matriz de
imobilização. A MEV possibilitou a caracterização morfológica do filme de V2O5, bem
52
como a visualização das fibras no filme, como previsto na literatura. Assim sendo, as
técnicas de caracterização morfológica se mostraram suficientes e eficazes para
caracterização do biossensor.
Nas caracterizações eletroquímicas os voltamogramas apresentaram perfil
diferenciado antes e após a adição de Gox, sendo possível identificar a imobilização,
porém um decaimento no valor da carga foi observado, como esse fator contrapunha
os resultados esperados, onde a carga deveria tender a estabilidade, favorecendo a
reutilização do biossensor. Esse decaimento da carga total pode estar relacionado a
reestruturação do V2O5 devido a inserção e desinserção de íons durante o processo
de ciclagem. Dessa maneira apesar da técnica ter se mostrado eficaz para avaliar o
comportamento eletroquímico do biossensor na presença do analito, foi necessário
complementar os estudos utilizando a técnica de EQCM para avaliar o motivo do
decaimento da carga e suas oscilações.
A EQCM permitiu avaliar a perda de massa do filme ao longo dos 50 ciclos
experimentais estipulados para técnica de VC.Através da técnica foi possível
aprimorar o processo de montagem do sensor acrescentando-se Nafion após a
imobilização afim de diminuir a perda de massa, motivo pelo qual observava-se o
aumento da carga no voltamograma.
Foram observados nos estudos com EGFET, que através da técnica foi
possível selecionar o melhor valor de pH, ou seja, onde o pH ideal onde o
biossensor é capaz de funcionar em toda faixa de concentração de glicose, pré
selecionada com base na literatura [47,48].
De posse dos resultados obtidos no EGFET, foram feitos testes de VC com o
pH de 5,0 que demonstrou ser o melhor por apresentar resultados mais lineares que
correlacionaram a concentração de glicose ao valor de corrente. Contudo os
resultados na VC não demonstraram a mesma tendência,pois apresentaram
variação dos picos de oxidação e redução aleatoriamente.Demais valores de pH
podem ainda ser testados afim de identificar se é possível identificar um valor de pH
onde os picos de oxidação e redução sejam proporcionais aos valores de glicose.
Apesar de não ser possível correlacionar os valores de corrente com os de
concentração de glicose na técnica de voltametria cíclica, foi possível observar a
eficácia no aprimoramento da montagem do biossensor com Nafion, pois nota-se a
tendência a estabilidade da carga durante os 50 ciclos, como esperado .
53
De posse todos os resultados obtidos até o presente momento pode-se
identificar a imobilização da Gox sobre o filme de V2O5 e o funcionamento do
biossensor na identificação de glicose, como era desejado.
O biossensor obtido após aprimoramentos é capaz de responder a
concentração de glicose no meio com diferentes valores de corrente, novos testes
devem ser programados afim de verificar toda abrangência dos resultados obtidos, a
fim de extrapolar as condições experimentais já propostas.
Buscando a sustentabilidade ambiental, menor descarte de materiais
potencialmente contaminantes, o uso de biossensores capazes de responder a
concentração de glicose em fluídos corpóreos pode representar um avanço
científico. É importante ressaltar que de maneira análoga outras enzimas podem ser
testadas afim de identificar demais analitos de interesse, isso porque as
propriedades eletroquímicas do V2O5 são potencialmente interessantes para esse
tipo de aplicação.
54
8) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
___________________________________________________________________
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