V

C

EP

Z

Pn

100 μm

VC

EP

B

100 μm

C

A

B

100 μm

B

B

G

100 μm

D

G

B

100 μm

E

100 μm

F

Figura 3. (Columna Izquierda) Primeras etapas del desarrollo. (A) Estadio de 1 célula. (B) Estadio de 2 células. (C) Estadio de 8 células. (D) Estadio de 32 a 64 células. Las blastómeras se observan en el polo animal. (E) Migración de las blastómeras hacia el polo vegetal. (F) Dispersión. Nótese las formas geométricas de las células (flechas). B: blastómeras; C: corion; EP: espacio perivitelino; Pn: pronúcleos; G: gota lipídica; V: vitelo; Z: zigoto

Figura 4. (Columna derecha) Etapas medias y tardías del desarrollo. (A) Reagregado temprano. En el recuadro superior se observa a mayor aumento la aglomeración de blastómeras.; RT. G: gota lipídica. (B) Reagregado medio; RM. G: gota lipídica. Aumenta la densidad celular en el reagregado. Las células se tornan redondeadas. (C) Reagregado tardío; RTa.

DESARROLLO EMBRIONARIO DE PECES ANUALES Expresión de genes relacionados con la reproducción

Autores*: Magdalena Benítez, Jennyfer Martínez, Mathías Martínez, Lourdes Rariz, Mauro Rodríguez (en orden alfabético)

Departamento de Biología Celular y Molecular Sección Biología Celular

Docentes: Nibia Berois, Nicolás Papa, Silvana D’Alessandro

INTRODUCCIÓN Uno de los propósitos de nuestro Seminario fue hacer un seguimiento de los diferentes estadios del desarrollo embrionario de Austrolebias charrua; especie con ciclo de vida anual perteneciente al orden Cyprinodontiformes. Esta especie habita en masas de agua dulce temporales de Uruguay y sur de Brasil, las cuales se secan durante el verano, lo que provoca la muerte masiva de la población adulta. En cambio, sus embriones sobreviven quedando enterrados en el sustrato, ya que poseen la capacidad de resistir la desecación, eclosionando en la siguiente estación lluviosa. Su desarrollo embrionario presenta características únicas, que lo diferencian de peces teleósteos no anuales: una fase de dispersión-reagregación de blastómeras interpuesta entre los estadios de segmentación y organogénesis así como la capacidad de experimentar detenciones en el desarrollo en tres momentos bien definidos (diapausas) (Wourms, 1964). Luego de reconocer y estudiar la morfología de los diferentes estadios del desarrollo embrionario, así como también la de adultos, nos aproximamos a un análisis molecular utilizando las técnicas de RT-PCR. El grupo de investigación en el cual desarrollamos el Seminario utiliza estas técnicas con el fin de demostrar el posible rol del gen dmrt1bY/DMY en la determinación del sexo. Este gen fue caracterizado en Oryzias latipes (medaka) en el año 2002 por dos grupos de investigación, Nanda et al. (dmrt1bY) y Matsuda et al. (DMY).

MATERIALES Y MÉTODOSComenzamos con la observación de los adultos en el acuario y estudiamos su comportamiento durante la etapa reproductiva. Los huevos se encuentran en la turba (lugar donde la hembra y el macho liberan sus gametos produciéndose la fecundación); extrajimos los huevos con pipetas Pasteur depositándolos en cajas de cultivo. Luego de limpiarlos con pinceles los observamos en microscopios para reconocer en que estadios se encontraban y los detallamos en planillas para su seguimiento. Fotografiamos los diferentes estadios utilizando un microscopio con cámara incorporada Olympus-Vanox. Ubicamos los embriones en placas de cultivo en solución de Yamamoto (NaCl: 7.5 gr.; KCl: 0.2 gr.; CaCl2.H2O: 0.3 gr.; penicilina G: 0.060 gr./lt agua destilada), y los llevamos a la estufa de cultivo a 25°C. Luego hicimos un seguimiento del desarrollo de los embriones a lo largo de varios días y fotografiamos diferentes estadios. Observamos embriones en etapas más avanzadas, actualmente en cultivo en el laboratorio, para poder diferenciar los últimos estadios del desarrollo. A partir del ARN total aislado de embriones de A. charrua se procedió a la síntesis de ADNc (retrotranscripcion) y al control de la calidad del mismo mediante la amplificación por PCR utilizando cebadores para el gen de actina. Asimismo analizamos los productos de PCR obtenidos utilizando cebadores para DMY (Matsuda el al, 2002).Para interpretar los resultados de las PCR realizamos electroforesis en geles de agarosa.

Figura 2. Hembra de Austrolebias charrua

1.- ADNc 0-10 somites2.- ADNc 10-20 somites3.- ARN total 0-10 somites4.- ARN total 10-20 somites5.- control negativo mix6.- marcador pares bases

OligosRSA-1: 5´GCC GGT TTT GCT GGA GAT GAT 3´RSA-2: 5´ATG GCAGGG GTG TTG AAG GTC3´

1 2 3 4 5 6

Productos de PCR utilizando oligos de actina

1.- ADNc pre-eclosión2.- ADNc + 30 somites3.- ADNc 20-30 somites4.- ADN genómico O. latipes5.- control negativo mix6.- marcador pares bases

OligosPG17.19: GAA CCA CAG CTT GAA GAC CCC GCT GA PG17.20: GCA TCT GCT GGT ACT GCT GGT AGT TG

1 2 3 4 5 6

Productos de PCR utilizando oligos para DMY (Matsuda et al, 2002)

Figura 5. (a) Productos de PCR utilizando oligos de actina ; la flecha señala la banda de actina (b) Producto de PCR utilizando oligos para DMY (Matsuda et al, 2002). Los carriles 1-3 muestran las 2 bandas presuntamente correspondientes a la secuencia DMY

RESULTADOSLos estadios del desarrollo de A. charrua se presentan en la figura 3 y 4. Se destaca la etapa especial de dispersión-reagregación (flechas)

A partir de la imagen obtenida del gel para actina (Fig. 5a), corroboramos que el ADNc correspondiente a embriones de 0-10 somites es funcionante, no así el de 10-20 somites. En el mismo gel se constató que la muestra de ARN extraída inicialmente no estaba contaminada con ADN genómico. En el gel obtenido de la electroforesis de productos de PCR utilizando oligos para DMY se verifican 2 bandas en todos los estadios (Fig. 5b).

Figura 1. Macho de Austrolebias charrua

DISCUSIÓN Y PERSPECTIVASComparando los diferentes estadios con otros peces anuales y no anuales, pudimos observar que A. charrua presenta un patrón de desarrollo similar al descrito para otras especies del género Austrolebias durante el cual se presenta una serie de diapausas especificas del modelo (Arezo et al, 2005). En este género, la diapausa III parece ser obligatoria y observamos las consecuencias que su escape representa para el fenotipo de especímenes de laboratorio (Papa, com. pers.).El análisis y seguimiento del desarrollo nos permitió aprender una herramienta morfológica aplicable al estudio de especies de peces que carecen de datos al iniciar una investigación.Con respecto al gen DMY se estima que el gen parálogo dmrt1bY/DMY se originó, hace unos diez millones de años, de una duplicación a partir de dmrt1 autosómico en dos de las especies del género Oryzias: O.latipes y O. curvinotus. Este gen se encuentra específicamente localizado en el cromosoma Y, siendo el único gen funcional en el locus SD (sex-determining locus) (Matsuda et al., 2002) y no se expresa en hembras. En adultos, se expresa exclusivamente en las células de Sertoli testiculares (Nanda et al., 2002). El grupo de investigación en el cual desarrollamos el presente Seminario, se ha planteado la posible expresión del gen DMY durante las etapas tempranas del ciclo de vida en A. charrua. Estos estudios se enmarcan en el análisis de los mecanismos de determinación del sexo en peces anuales y los resultados aquí presentados forman parte de los análisis en curso.

AGRADECIMIENTOSSe agradece la colaboración de la Lic. Nuria Lahuerta porla gentil colaboración en el armado de las fotos de los embriones

BIBLIOGRAFÌA*Alberts, B.; Johnson, A.; Lewis, J.; Raff, M.; Roberts, K.; Walter, P. Molecular Biology of the cell. New York and London: Garland Science; 2002Methods → Ch. 8. Manipulating Proteins, DNA and RNA*Arezo, M. J., D’Alessandro, S., Papa, N., Sà, R., Berois, N. Sex Differentiation pattern in the annual fish Austrolebias charrua (Cyprinodontiformes: Rivulidae). Tissue and Cell 2007; 39: 89-98. * Arezo, M. J., Pereiro, L., Berois, N. Early development in the annual fish Cynolebias viarius. Journal of Fish Biology (2005) 66, 1357-1370. * Matsuda, M., Nagahama, Y., Shinomiya, A., Sato, T., Matsusa, C., Kobayashi, T. DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish. Nature. 2002; 417: 559-563. * Nanda, I., Kondo, M., Hornung, U., Asakawa, S., Winkler, C., Shimizu, A., et al. A duplicated copy of DMRT1 in the sex-determining region of the Y chromosome of the medaka, Oryzias latipes. PNAS. 2002; 99: 11778-11783