desarrollo de un producto dermatológico

UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA FARMACOLÓGICA Y

TOXICOLÓGICA

LABORATORIO DE PRODUCTOS NATURALES

DESARROLLO DE UN PRODUCTO

DERMATOLÓGICO A PARTIR DE UN

EXTRACTO ESTANDARIZADO OBTENIDO

DESDE LAS HOJAS DE UGNI MOLINAE TURCZ.

MEMORIA PARA OPTAR AL TÍTULO DE

QUÍMICO FARMACÉUTICO

NICOLÁS RODRIGO PEREDO SANDOVAL

PROFESORA PATROCINANTE DIRECTORES DE MEMORIA

PROF. EDDA COSTA C. PROF. CARLA DELPORTE V.

PROF. OLOSMIRA CORREA B.

SANTIAGO DE CHILE

2008

- 3 -

TABLA DE CONTENIDO

Contenido Página

Resumen 10

Summary 11

Capítulo I

1.1 Introducción. 12

Capítulo II

Antecedentes Generales. 13

2.1 Clasificación taxonómica. 13

2.2 Descripción botánica. 13

2.3 Distribución geográfica. 14

2.4 Usos en la medicina popular. 15

2.5 Otros usos. 15

2.6. Estudios químicos anteriores. 15

2.7 Estudios farmacológicos in vivo anteriores. 16

2.8 Estudios farmacológicos in vitro anteriores. 16

Capítulo III

2.1 Hipótesis. 17

Capítulo IV

3.1 Objetivo general. 18

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3.2 Objetivos específicos. 18

Capítulo V

Materiales y métodos. 19

5.1 Recolección. 19

5.2 Obtención de los extractos. 19

5.3 Estandarización química del EAE. 20

5.4 Evaluación de la actividad antimicrobiana de ácido corosólico y

ácido alfitólico aisladas desde EAE, usando el método de bioautografía. 21

5.5 Desarrollo de formulaciones. 23

5.5.1 Estudio de solubilidad de EAE. 23

5.5.2 Diseño de formulación de emulsión. 23

5.5.3 Diseño de formulación de emulsión gel. 24

5.6 Estudios in vivo. 25

5.6.1 Aspectos éticos a considerar para el trabajo con animales. 25

5.6.2 Determinación de la actividad antiinflamatoria tópica. 25

5.6.3 Estudio de irritación dérmica en conejos. 27

Capítulo VI

Resultados. 29

6.1 Obtención de los extractos. 29

6.2 Estandarización química del EAE. 30

6.3 Bioautografía de ácido corosólico y ácido alfitólico. 31

6.4 Desarrollo de las formulaciones. 35

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6.4.1 Estudio de solubilidad del EAE. 35

6.4.2 Diseño de formulación de emulsión. 36

6.4.3 Diseño de formulación de emulsión gel. 40

6.5 Estudio de actividad antiinflamatoria tópica. 45

6.6 Estudio de irritación dérmica en conejos . 47

Capítulo VII

7.1 Discusión. 48

7.2 Conclusiones. 52

Capítulo VIII

Bibliografía. 53

- 6 -

ÍNDICE DE TABLAS

Página

Tabla 1: microorganismos utilizados para todas las pruebas microbiológicas. 21

Tabla 2: secado de hojas frescas de murtilla. 29

Tabla 3: rendimiento extractivo con solventes. 29

Tabla 4: resultados de la actividad de ácido corosólico contra el crecimiento

microbiológico. 31

Tabla 5: resultados de la actividad de ácido alfitólico contra el crecimiento

microbiológico. 32

Tabla 6: solubilidad por gramo de extracto acetato de etilo. 35

Tabla 7: formulaciones F1 hasta F5. 36

Tabla 8: formulación F7. 37

Tabla 9: formulaciones F8 hasta F12. 38

Tabla 10: formulaciones G1 hasta G12. 40



Tabla 13: contenido de ácido asiático y ácido corosólico del EAE obtenido desde hojas

recolectadas en diferentes zonas geográficas y en distinta épocas 46

Tabla 14: actividad antiinflamatoria tópica del EAE obtenido desde hojas recolectadas

en julio y sus formulaciones, comparadas con el EAE obtenido desde hojas recolectadas

en abril 46

Tabla 15: resultados de la prueba de irritación dérmica en conejos. 47

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ÍNDICE DE FIGURAS

Página

Figura 1: flores, frutos y hojas de murtilla. 14

Figura 2: cromatograma de la elución de ácido asiático. 30

Figura 3: cromatograma de la elución de ácido corosólico. 30

Figura 4: bioautografía de Klebsiella pneumoniae en placa de ácido corosólico. 32

Figura 5: bioautografía de Bacillus subtilis en placa de ácido alfitólico. 33

Figura 6: bioautografía de Escherichia coli en placa de ácido alfitólico. 34

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ÍNDICE DE ANEXOS

Anexo I 56

Materias primas utilizadas en la formulación de productos dermatológicos.

Anexo II 62

Método de manufactura de los productos dermatológicos.

Anexo III 66

Formulación de controles de productos dermatológicos.

Anexo IV 67

Ensayo de irritación dérmica: Interpretación y cálculo de resultados.

Anexo V 69

Tablas estadísticas de la evaluación de la actividad antiinflamatoria frente a TPA.

Anexo VI 72

Presentación en primer simposio de farmacología de productos naturales y BLACPMA.

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ABREVIATURAS

AA: ácido araquidónico.

EAE: extracto acetato de etilo.

EDCM: extracto diclorometano.

EH: extracto hexano.

ED50: dosis eficaz 50%.

MTT: 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide

m.s.n.m: metros sobre el nivel del mar.

PII: primary irritation index.

RMN: resonancia magnética nuclear.

TPA: 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato.

U.V.: ultravioleta.

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RESUMEN

Ugni molinae Turcz. de nombre común murtilla, es una especie endémica de la zona

comprendida entre la VII y la X Región de Chile, donde crece especialmente en la

Cordillera de la Costa y en la Precordillera, en terrenos de pobre nutrición, poco aptos

para el cultivo de otras especies. De su planta se aprovecha el fruto, el cual es

comestible.

Las hojas de murtilla fueron usadas por los pueblos primigenios para curar heridas y

mejorar la piel deteriorada. En los estudios que se realizaron sobre las hojas de esta

planta, se demostró que estas propiedades farmacológicas se deben a la presencia de

triterpenos y de flavonoides. Entre los triterpenos figura el ácido asiático, el ácido

corosólico, y el ácido alfitólico. Las acciones farmacológicas demostradas abarcan

efectos analgésicos, antiinflamatorios, antimicrobianos y cicatrizantes.

Se evaluaron el ácido alfitólico y el ácido corosólico en pruebas microbiológicas, en

donde se comprobó la actividad inhibitoria en el crecimiento de Escherichia coli y

Bacillus subtilis por el primero, e inhibición de Klebsiella pneumoniae por el segundo.

Basándose en estos postulados demostrados, se desarrollaron varias formulaciones

dermatológicas en base a un extracto acetato de etilo, estandarizado químicamente en

ácido asiático y ácido corosólico, de las cuales se eligieron dos formulaciones que

tienen buenas propiedades de estabilidad físicas. Estas formulaciones se ensayaron in

vivo en un estudio de inflamación aguda en orejas de ratón, dando resultados

satisfactorios. Estas mismas formulaciones se ensayaron en piel de conejo, en donde se

comprobó que las formulaciones dermatológicas no son irritantes para la piel.

- 11 -

SUMMARY: DEVELOPMENT OF A DERMATOLOGIC PRODUCT

FROM A STANDARDIZED EXTRACT, OBTAINED FROM LEAVES

OF UGNI MOLINAE TURCZ.

Ugni molinae Turcz., the common name is murtilla, is an endemic specie of the zone

between the VII and X Region of Chile, where it grows- specially in the Cordillera de la

Costa and the Precordillera, in lands of poor nutrition, unsuitable for growing to other

species. From its plants the fruit is used, wich is eatable.

The murtillas’s leaves were used by native people to heal wounds and improve the

damaged skin. In the realized studies about the leaves of this plant, it was demonstrated

that these pharnacological properties are due to the presence of triterpenes and

flavonoids. Among the triterpenes figures the asiatic acid, corosolic acid, and the

alfitolic acid. The pharmacological demonstrated actions include analgesic effects,

antiinflamatory, antimicrobial, and scar healing.

It was evaluated the alfitolic and corosolic acid in microbiological tests, where it was

confirmed the inhibitory action of the growing of Escherichia coli and Bacillus subtilis

by the first acid, and inhibition of Klebsiella pneumoniae by the second acid.

Based on the demonstrated postulates, it was developed various dermatological

formulations with an extract of ethyl acetate basis, chemical standardized in asiatic and

corosolic acid, of wich are chosen two formulations that have good properties of

physical stability. These formulations were tested in vivo in a study of acute

inflammation in mouse ears, giving satisfactory results. These same formulations were

tested in rabbit skin, where established that the dermatological formulations are not

irritating to the skin.

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Capítulo I

1.1 Introducción

La defensa de nuestro patrimonio cultural y nuestro acervo genético debe realizarse en

forma activa, ya que la mejor manera de conocer y guardar nuestros recursos es

utilizándolos, a través de la investigación científica para conocer en profundidad los

detalles de cada especie, y los potenciales beneficios que nos pueda otorgar, creando

nuevos elementos basados en aquellas especies que ya han sido investigadas y a las

cuales efectivamente se les ha encontrado un potencial de uso, llegando finalmente a la

valoración práctica de una especie en su uso por parte de toda la sociedad, que al ver el

nuevo beneficio adquirido pondrá mayor vigor en apreciarlo.

La ciencia farmacéutica que basa su accionar en productos naturales, debe poner

atención a las voces de los pueblos ancestrales que han convivido por cientos de años en

contacto con estas especies, y que ellos observando el actuar de la naturaleza han

aprendido a utilizarlas. Queda entonces por demostrar y avalar en una base científica el

uso que hasta ese momento se le venía dando a determinada planta, y si es posible

mejorar su acción, a través de una selección adecuada de los genes, de la selección de la

mejor época de recolección, seleccionando la parte adecuada de la planta, y optimizando

su acción usando tecnología adecuada, entre otros.

El estudio completo de una especie y su manera en que ésta puede utilizarse, requiere

un manejo transversal de distintas profesiones, las que complementándose entre sí,

pueden dar como fruto un trabajo integral.

Los estudios realizados con el extracto de acetato de etilo obtenido desde las hojas

recolectadas en el mes de abril, de Ugni molinae, Myrtaceae, de nombre vulgar,

murtilla; por el grupo de investigación del laboratorio de productos naturales de la

facultad, demuestran que esta especie presenta actividades antiinflamatoria y analgésica,

ambas por vía tópica, además de actividad antimicrobiana y cicatrizante, atribuible a

varios principios activos, principalmente triterpenos, destacando entre ellos el ácido

asiático(Aguirre et al., 2006). Basándose en estos estudios, en esta memoria se

desarrollará un producto dermatológico de carácter antiinflamatorio en base a hojas de

murtilla y se determinará la variación estacional de los principios activos.

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Capítulo II

Antecedentes Generales

2.1 Clasificación Taxonómica (Montenegro, 2000)

Nombre científico : Ugni molinae Turcz.

Sinonimias : Myrtus ugni Mol., Eugenia ugni Hook.et Arn.

Nombres vulgares : murta, murtilla, uñi o üñü (voz mapuche), chilean guava

(inglés), chilean cranberry (inglés).

Familia : Myrtaceae.

Orden : Myrtales.

Clase : Magnoliopsida.

División : Magnoliophyta.

2.2 Descripción Botánica

Es un arbusto perenne, de diverso tamaño según la humedad del terreno, puede alcanzar

hasta los dos metros de altura.

Las hojas son muy brillantes y de un tono verde oscuro en su epidermis superior y un

tono de verde más claro en su epidermis inferior. Son pecioladas, opuestas, sin

estípulas, de forma aovada oblonga y con el ápice agudo, de unos 2 a 2,5 cm. En la cara

inferior del limbo foliar se pueden apreciar las glándulas presentes.

Las flores son de color rosado blanquecino y nacen en las axilas de las hojas. Presentan

pedúnculos largos y tienen forma de campana. Son solitarias y hermafroditas. Tienen 5

sépalos, unidos por la base y doblados hacia fuera formando un cáliz rojizo gamosépalo

que contrasta con el color pálido de los pétalos. La corola está compuesta por 5 pétalos,

estambres numerosos y de un largo menor que el estilo. Florece entre los meses de

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noviembre y diciembre. Su fruto de agradable sabor y aroma, es una baya de colores

blanquecinos, rojos, y rosadas, con la característica de llevar 5 pétalos apegados en el

ápice (Montenegro, 2000).

Figura 1: flores, frutos y hojas de murtilla.

2.3 Distribución geográfica

Se desarrolla en forma silvestre en el sur de Chile, se distribuye entre la VII y X Región,

especialmente en la Cordillera de la Costa y parte de la Precordillera Andina.

En cuanto a sus requerimientos, esta especie se adapta a suelos marginales, lo que

implica terrenos de baja fertilidad, pero con buen drenaje, con pH del suelo entre 5,6 y

6,0 (Seguel y Avendaño, 2001).

La murtilla crece habitualmente en terrenos despejados, en bordes de ríos, formando

parte del matorral. En la parte norte de su área de dispersión habita principalmente en la

cordillera de la costa formando parte del bosque maulino. Más hacia el sur y hacia el

interior del territorio forma parte de la densa formación arbustiva que crece a orillas de

los bosques (Montenegro, 2000).

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2.4 Usos en la medicina popular

En la medicina popular se le atribuyen propiedades aromáticas, estimulantes, y

astringentes (Muñoz et al., 1981).

La infusión de sus hojas se emplea para suavizar el cutis reseco y aumentar la

elasticidad de la piel. La infusión de sus ramas se usa para aliviar dolencias de las vías

urinarias (Montenegro, 2000).

2.5 Otros usos

Debido a las propiedades organolépticas de los frutos de murtilla, se utilizan también en

los preparados de tipo alimentarios como mermeladas, licores y repostería en general

(Montenegro, 2000).

2.6 Estudios químicos anteriores

En los estudios previos realizados a las hojas de murtilla recolectadas en abril, se han

aislado e identificado mediante técnicas espectroscópicas los siguientes compuestos:

- Del extracto diclorometano purificado se aislaron, purificaron e

identificaron mediante técnicas espectroscópicas: ácido oleanólico, ácido

ursólico, ácido alfitólico y ácido corosólico (Aguirre et al., 2006).

- Del extracto acetato de etilo se han encontrado moléculas con grupos

químicos polifenólicos como flavonoides, cumarinas, taninos, y ácidos

fenólicos como ácido gálico y catequina. Se aisló, e identificó por métodos

espectroscópicos el ácido asiático. También se identificó ácido alfitólico y

ácido corosólico (Aguirre et al., 2006).

- Del extracto metanol se han encontrado moléculas con grupos químicos

polifenólicos como flavonoides, cumarinas, taninos, y ácidos fenólicos

como ácido gálico y catequina. Heterósidos de los flavonoides miricetina,

canferol y quercetina. Se vio la presencia de ácido corosólico y de ácido

asiático (Aguirre et al., 2006).

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2.7 Estudios farmacológicos in vivo anteriores

El grupo de investigadores del laboratorio de productos naturales demostró que distintos

extractos y compuestos aislados desde las hojas de Ugni molinae recolectadas en abril,

presentan efectos antiinflamatorios tópicos frente a ácido araquidónico (AA) y

tetradecanoilforbol acetato (TPA) (Aguirre et al., 2006); y efectos analgésicos frente a

diferentes modelos in vivo (Delporte et al., 2007).

El ácido asiático exhibió un efecto dosis dependiente frente a la inflamación inducida

por TPA con un efecto máximo de 92,5 ± 2 % (Delporte et al., 2007).

2.8 Estudios farmacológicos in vitro anteriores

Los estudios in vitro realizados en las hojas de Ugni molinae recolectadas en abril

(Aguirre et al., 2006) evidencian una alta actividad antioxidante de los extractos más

polares: extracto acetato de etilo, extracto metanol, extracto metanol/agua e infuso, los

cuales se ha encontrado que están constituidos principalmente por compuestos

polifenólicos (flavonoides y taninos), que presentan la capacidad de atrapar radicales

libres y quelar metales (Pietta, 2000).

El EAE obtenido desde las hojas recolectadas en julio, mostró buenos resultados en

cuanto a estimular la velocidad de proliferación, mejorar la capacidad migratoria y el

depósito de colágeno tipo I en la matriz extracelular de fibroblastos de piel humana, en

ensayos realizados in vitro (Lobos, 2006).

- 17 -

Capítulo III

3.1 Hipótesis

El producto dermatológico desarrollado a partir del extracto acetato de etilo desde las

hojas de Ugni molinae es eficaz como antiinflamatorio.

El contenido de principios activos de las hojas de murtilla, varía de acuerdo con la

época de recolección.

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Capítulo IV

4.1 Objetivo General

Desarrollar un producto dermatológico a partir de un extracto de acetato de etilo

estandarizado obtenido desde las hojas de murtilla recolectadas en julio del año 2005, y

evaluar su eficacia como agente antiinflamatorio e inocuidad al ser aplicado en piel.

4.2 Objetivos Específicos

Obtener desde las hojas recolectadas en julio del año 2005, un extracto con acetato de

etilo (EAE).

Estandarizar química y farmacológicamente el EAE.

Determinar la variación estacional de los principios activos de los EAE obtenidos con

hojas recolectadas en abril y julio.

Evaluar los efectos antimicrobianos de los ácidos corosólico y alfitólico, presentes en

el EAE.

Desarrollar distintas formulaciones dermatológicas en base al EAE.

Seleccionar la formulación que solubilice el EAE en forma óptima y que sea más

estable desde el punto de vista fisicoquímico.

Evaluar la capacidad antiinflamatoria tópica de las formulaciones dermatológicas

seleccionadas.

Evaluar la capacidad irritante de la piel de las formulaciones dermatológicas

seleccionadas.

- 19 -

Capítulo V

Materiales y métodos

5.1 Recolección

La parte aérea de murtilla fue recolectada en julio del año 2005 en Carillanca (38°41´

latitud sur, 70°38´ longitud oeste, 200 m s. n. m.), localidad que se ubica en la IX

Región, en las cercanías de Temuco. La recolección e identificación fue realizada por la

bióloga Ivette Seguel. Se guardó un testigo numerado como SQF- 22260 en el Herbario

de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas.

5.2 Obtención de los extractos

El material vegetal se recibió fresco, por lo que se procedió a secar en una corriente de

aire a temperatura ambiente. Posteriormente se separaron las hojas. Estas hojas secas

fueron molidas en un molino de martillo.

Este material vegetal particulado fue extraído hasta agotamiento con disolventes de

polaridad creciente en extractores de acero inoxidable de 90 L.

Se inició la extracción seriada con el disolvente menos polar, hexano (EH). El extracto

obtenido se concentró y se llevó a sequedad. A continuación se procedió de la misma

manera para obtener el extracto de diclorometano (EDCM) y de acetato de etilo (EAE).

Todos los extractos secos fueron pesados para determinar el rendimiento.

El extracto seco obtenido como producto de la maceración con acetato de etilo, fue de

interés para el desarrollo de un producto dermatológico.

Para poder tener homogeneidad en el tamaño de partícula del EAE pulverizado, éste fue

molido en equipo Ultraturrex a 24000 rpm, y luego se tamizó por tamiz Mesh 60,

obteniendo partículas con un tamaño menor a 250 µm.

- 20 -

5.3 Estandarización química del EAE

Debido a la significativa actividad antiinflamatoria, analgésica y cicatrizante,

demostrada para el EAE en los estudios previos, y su buen rendimiento, este extracto

fue seleccionado para el desarrollo de un producto dermatológico. Con este fin fue

necesario estandarizarlo químicamente.

El contenido de los triterpenos, ácido asiático y ácido corosólico, se determinó por

HPLC, siguiendo la metodología establecida por Aguirre et al (2006). Las condiciones

cromatográficas fueron: columna Genesys (Inertsil ODS-3, 5 mm, 250 x 4,6 mm

i.d.),fase móvil: acetonitrilo:agua (H3PO4 0,1 % v/v) = 60:40, flujo 0,7 mL/min,

detección a 201 nm en un equipo HPLC Waters 600 con detector fotodiodo Waters 996.

- 21 -

5.4 Evaluación de la actividad antimicrobiana de ácido corosólico y

ácido alfitólico aislados desde EAE, usando el método de bioautografía

Con este bioensayo se evaluó la capacidad antimicrobiana y antifúngica de dos

moléculas, aisladas desde EAE, estas son ácido corosólico y ácido alfitólico, dichas

moléculas fueron aisladas y confirmadas sus identidades por RMN.(Aguirre et al.,

2006).

Los microorganismos utilizados se encuentran indicados en farmacopea (USP XXII)

para la valoración de antibióticos, obtenidos de American Type Culture Collections.

Tabla 1: microorganismos utilizados para todas las pruebas microbiológicas.

Número ATCC

Bacterias Gram negativas Escherichia coli ATCC 8739

Pseudomonas aeruginosa ATCC 14207

Salmonella aviatum ATCC 12228

Klebsiella pneumoniae Muestra clínica

Bacterias Gram positivas Staphylococcus aureus ATCC 6538P

Micrococcus flavus ATCC 10290

Bacillus subtilis ATCC 14884

Hongo Candida albicans

Muestra clínica aislada desde el

laboratorio de microbiología de la

Fac. de Cs. Qcas. Y Farmacéuticas,

Universidad de Chile.

Levadura Saccharomyces cerevisiae

Muestra aislada del ambiente desde el

laboratorio de microbiología de la

Fac. de Cs. Qcas. y Farmacéuticas,

Universidad de Chile.

- 22 -

Los compuestos aislados fueron sembrados en placa de gel de sílice 60 (Merck) y la

fase móvil usada correspondió a la utilizada para Centella asiatica (n-butanol:acetato de

etilo:NH3:H2O, 60:40:5:10).

Se prepararon caldos de cultivo de las diferentes cepas, utilizando como medio líquido

de cultivo TSB (triptona soy broth) para bacterias y PDB (potatoes dextrose broth) para

hongos. Cada microorganismo en estudio fue resuspendido en duplicado mediante un

asa de micrón estéril en 3 mL de su correspondiente medio según sea bacteria u hongo,

los cuales fueron obtenidos de una siembra de agar inclinado.

Las bacterias fueron incubadas a 37 °C por 24 horas y los hongos a 28 °C por 48 horas.

Los cromatogramas fueron expuestos a la luz U.V. (λ 254 nm), durante 30 minutos con

el fin de esterilizarlos previo a realizar el ensayo.

En un tubo estéril se adicionaron 350 µL de caldo de cultivo de cada microorganismo al

cual se agregó 7 mL de agar fundido, TSA (triptone soy agar) para bacterias y PDA

(potatoes dextrose agar) para hongos, se homogenizaron en agitador mecánico y esta

solución se dejó escurrir sobre los cromatogramas los cuales se encontraban dentro de

una cápsula de Petri. Una vez solidificado la solución sobre la placa, se adicionanron

350 µL de agua destilada estéril a cada lado con el fin de evitar el resecamiento de las

placas.

Las placas se dejaron incubar por 24 horas a 37 °C para bacterias y por 48 horas a 28 °C

en el caso de hongos. Transcurrido este tiempo, las placas fueron reveladas con el

reactivo MTT, el cual reconoce una deshidrogenasa bacteriana dando una coloración

azul/violeta, se consideró por lo tanto, como resultado positivo de actividad

antimicrobiana si en la placa se observaba halo de inhibición, caracterizado por la

ausencia de coloración (Erazo et al., 2002).

- 23 -

5.5 Desarrollo de formulaciones

El diseño de las formulaciones para productos dermatológicos se realizó utilizando un

5% de EAE, debido a que en los estudios anteriores se demostró la actividad analgésica

a esta concentración del extracto. También se realizaron formulaciones conteniendo un

3,7% de EAE, que corresponde al ED50 para el estudio analgésico tail flick (Inostroza,

2006).

El listado de materias primas utilizadas en el desarrollo de las formulaciones, está

detallado en el Anexo I.

5.5.1 Estudio de solubilidad de EAE

Este estudio se realizó a 25 °C, y con la ayuda de un equipo ultrasónico, para lograr la

disolución del extracto. Se utilizaron los sistemas de disolventes más comunes en el

diseño de medicamentos dermatológicos: glicerina, polietilenglicol 400, aceite mineral,

propilenglicol, etanol y agua.

5.5.2 Diseño de la formulación de emulsión

Esta etapa se inició con el desarrollo de formulaciones clásicas para sistemas

emulsionados con emulgentes no iónicos y con emulgentes aniónicos. Luego se trabajó

con emulsiones que contienen siliconas y solubilizantes de alto contenido de óxido de

etileno.

El método de manufactura consistió en emulsionar en caliente, en donde se funden las

materias primas de las fases a 70°C, y luego se mezclan. El EAE se agregó suspendido

en alguna de las materias primas líquidas a temperatura ambiente de la formulación.

Se realizó un estudio preliminar de estabilidad acelerada tipo screening, manteniendo

muestras a 40°C por 7 días, observando si había separación de fases. De esta forma se

descartaron los productos que no eran adecuados por su mala estabilidad física. Para los

productos seleccionados de este ensayo se realizó un estudio de estabilidad de estantería

manteniendo las muestras por tres meses a 25°C y un estudio de estabilidad

manteniendo las muestras a 40°C por tres meses.

También se midió la viscosidad con un viscosímetro Brookfield RV, aguja número 7, a

50 rpm. El pH se midió con un peachímetro.

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5.5.3 Diseño de formulación de emulsión gel

Estas formulaciones comenzaron con el uso de un sistema viscosante como carbomer en

agua, las que luego se modifican con otros viscosantes, junto con mejorar su sistema

solvente, y la sustancia adecuada para ajustar el pH. Luego se agregó un emulgente con

características solubilizantes, el que también se va ajustando según requerimiento de

estabilidad y solubilización del EAE.

Estas formulaciones se fabricaron a temperatura ambiente, si las materias primas eran

líquidas a dicha temperatura, sólo se disolvía y humectaba el gelificante. Si las materias

primas involucradas eran sólidas a temperatura ambiente, entonces las formulaciones se

fabricaban en caliente, en donde se fundían las materias primas sólidas y luego se

mezclaban y se emulsionaban. El EAE se agregó suspendido en etanol.

Se realizó un estudio prelimininar de estabilidad acelerada tipo screening, manteniendo

muestras a 5°C por 7 días, observando si había precipitado ; y muestras a 40°C por 7

días observando si había separación de fases. De esta forma se descartaron los productos

que no eran adecuados por su mala estabilidad física. Para los productos seleccionados

de este ensayo se realizó un estudio de estabilidad de estantería manteniendo las

muestras por tres meses a 25°C.

También se midió la viscosidad con un viscosímetro Brookfield RV, aguja 7, a

velocidad de 50 rpm. El pH se midió con un peachímetro.

- 25 -

5.6 Estudios in vivo

5.6.1 Aspectos éticos a considerar para el trabajo con animales

Los estudios realizados in vivo, se realizaron en dependencias de la Unidad de Pruebas

Biológicas del Instituto de Salud Pública.

En virtud al trato ético y mitigador del dolor de los animales utilizados en esta

investigación, se consideran las “Normas Internacionales en Investigación Biomédicas

que involucra el uso de animales”. Esta reglamentación ha sido elaborada por el

Consejo de Organizaciones Internacionales de Ciencias Médicas en Ginebra (Boletín

Oficina Sanitaria Panamericana, 1986), y son aplicadas por la Unidad de Pruebas

Biológicas del Instituto de Salud Pública de Chile (ISP), lugar donde se desarrollaron

las pruebas farmacológicas.

5.6.2 Determinación de la actividad antiinflamatoria tópica

Para cada ensayo se utilizaron 10 ratones de la cepa CF1, no consanguíneos, de sexo

masculino, de entre 20 a 25 g de peso y de 30 a 35 días de edad, los cuales fueron

mantenidos en ayuno y con agua ad libitum durante 12 horas previo al estudio. De éstos

diez, dos se dejaron como control, los que fueron agregados al grupo control que quedó

constituido por un total de 16 animales.

Se evaluó la capacidad antiinflamatoria del EAE y de las formulaciones seleccionadas

G30 y F11 frente a 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA), el cual al ser aplicado

localmente produce una reacción inflamatoria aguda caracterizada por aumento de la

permeabilidad vascular, edema e influjo celular (Lloret y Moreno, 1995).

Una vez determinado el peso de cada ratón, se le aplicó la muestra a evaluar en ambas

caras de la oreja derecha mientras que en ambas caras de la oreja izquierda se aplicó el

vehículo de la muestra a evaluar. En seguida se aplicó el TPA en ambas caras de la oreja

derecha.

Se mantuvieron los ratones en sus jaulas por 4,5 horas, finalizado este tiempo los

ratones se sacrificaron por dislocación cervical y con la ayuda de un sacabocado de 6

mm de diámetro, se obtuvieron secciones de idéntico tamaño de cada oreja del animal,

éstas se pesaron en una balanza analítica y se registraron sus pesos.

- 26 -

La actividad antiinflamatoria tópica de cada extracto se obtuvo comparando el edema

alcanzado por el grupo control con el edema de los animales que recibieron la muestra.

Por lo tanto, el porcentaje de efecto antiinflamatorio tópico (%EAIT), está dado por la

siguiente fórmula:

El fármaco de referencia utilizado para evaluar la actividad antiinflamatoria tópica

inducida por TPA fue indometacina, que a una dosis de 0,5 mg/20 µL provocó un efecto

antiinflamatorio máximo de 92,9 % (Aguirre et al, 2006).

La cantidad del EAE a ensayar fue de 3 mg disuelto en 20 µL de acetona, esta se dividió

en dos porciones colocando 10 µL por cada lado de la oreja derecha. Para mantener la

relación de cantidad del EAE aplicado, las formulaciones se estudiaron de manera tal de

contener 3 mg de EAE al aplicar sobre la oreja del ratón en estudio. En la oreja

izquierda se aplicó sólo el vehículo del EAE. A continuación y de la misma forma se

aplicaron en la oreja derecha, 20 µL de una solución conteniendo 5 µg de TPA en

acetona; dividida en dos, es decir 10 µL para cada lado de la oreja, y en la izquierda se

aplicó sólo acetona.

Para evaluar las actividades antiinflamatoria tópica de F11 y G30, ambas fueron

aplicadas a la dosis de 0,02 mL en la oreja derecha y en la izquierda se aplicó sólo el

vehículo de las formulaciones, que se encuentra detallado en el Anexo III.

%EAIT = (Pcontrol - Pmuestra) 100

Pcontrol

P control = (OD - OI)controles ± SEM P muestra = (OD - OI)muestra ± SEM

SEM = σ / √¯n

P muestra= edema de los

animales tratados

P control= edema de

los animales control

donde σ corresponde a la desviación típica

y “n” es el número de animales.

- 27 -

La significancia de los efectos fue calculada por el método Wilcoxon para datos

independientes y fueron considerados estadísticamente significativos con un p ≤ 0,05

(Hollander y Wolfe, 1973).

5.7 Estudio de irritación dérmica en conejos

Se realizó de acuerdo a las especificaciones entregadas por la ASTM F 719-81 con

algunas modificaciones que se señalan a continuación. Se seleccionaron 6 conejos

angora de sexo femenino que pesaban entre 2 y 2,5 Kg. Cada conejo fue puesto en jaula

individual y no hubo restricción de agua o comida para la realización del ensayo.

El día de la realización del ensayo se rasuró con un clipper eléctrico el pelaje del lomo

de cada conejo. Se trazó una línea con un marcador quirúrgico que definió dos lados del

lomo. Luego se limpió la zona con una solución de alcohol al 70%. Un lado del lomo se

erosionó pasando una aguja suavemente en la piel con la finalidad de romper la

continuidad del estrato córneo. El otro lado se mantuvo intacto.

Se utilizaron para esta prueba cámaras de aluminio de 20 µL de capacidad (Finn

Chambers on Scanpor®) las cuales constan de 10 cámaras por parche dispuestas en dos

columnas de 5 cámaras.

Si la sustancia a evaluar es de carácter líquida entonces debe ser adsorbida en pequeños

discos de papel filtro para que quede fijo dentro de la cámara y no se vierta su

contenido. Si la sustancia es de carácter semisólido no es necesario fijarla en ningún

soporte anexo y puede ser colocado directamente en el interior de la cámara.

Los parches con las cámaras llenas fueron acomodados en el lomo del animal. Después

de 24 horas se hace una observación en búsqueda de eritema y edema en los lugares de

la piel que tuvieron contacto con las cámaras. Se colocan nuevas cámaras llenas de los

mismos elementos y se colocan en el mismo lugar del lomo de tal manera que se

mantenga la misma zona de la piel en contacto con el mismo elemento. Se hacen otras

dos observaciones a las 48 horas del día inicial y a las 72 horas, manteniendo las

cámaras en contacto con la piel (Mazzanti y Daniele, 2005). La evaluación del grado de

eritema y edema se realiza según tabla de puntuación que utiliza ASTM.

- 28 -

Se ensaya de esta manera, el control de la formulación F11, la formulación F11

(5%EAE), el control de la formulación G30, la formulación G30 (5%EAE), y una

solución saturada de 2,7% de EAE en etanol; además se ensaya un control con cámara

vacía.

La manera de interpretar y valorar las irritaciones o lesiones que se producen, y el

tratamiento aritmético de estos valores, se encuentra detallado en el anexo IV.

- 29 -

Capítulo VI

Resultados

6.1 Obtención de los extractos

Tabla 2: secado de hojas frescas de murtilla.

Rendimiento Cantidad Porcentaje de rendimiento

Peso de hojas frescas 14,4 Kg 100%

Agua 7,73 Kg 53,7%

Peso de hojas secas 6,67 Kg 46,3 %

Tabla 3: rendimiento extractivo con solventes.

Rendimiento Cantidad Porcentaje de rendimiento

EH 115,1 g 1,73%

EDCM 202,9 g 3,04%

EAE 412,7 g 6,19%

Porcentaje de rendimiento en base a hoja seca.

De las tablas se deduce que el extracto que se obtiene en mayor porcentaje es el EAE, lo

que acompañado al hecho de que contiene una alta cantidad de ácido asiático, justifica

su estandarización química y el desarrollo de formulaciones dermatológicas basadas en

este extracto.

- 30 -

6.2 Estandarización química del EAE

El análisis cromatográfico entrega como resultado que el EAE de la murtilla recolectada

en julio del año 2005, contiene un 5,03% de ácido asiático resultado obtenido a los 10,3

minutos; y un 10,2 % de ácido corosólico, resultado obtenido a los 35,2 minutos de

elución.

Figura 2: cromatograma de la elución de ácido asiático.

Figura 3: cromatograma de la elución de ácido corosólico.

- 31 -

6.3 Bioautografía de ácido corosólico y alfitólico

Los siguientes son los resultados que se encontraron en el estudio microbiológico acerca

de la actividad del ácido corosólico y ácido alfitólico para inhibir el crecimiento

microbiano de los siguientes microorganismos.

Tabla 4: resultados de la actividad de ácido corosólico contra el crecimiento

microbiológico.

Cepa Ácido corosólico

Gram - Escherichia. coli -

Gram - Pseudomonas aeruginosa -

Gram - Salmonella aviatum -

Gram - Klebsiella pneumoniae +

Gram + Bacillus subtilis -

Gram + Staphylococcus aureus -

Gram + Micrococcus flavus -

Hongo Candida albicans -

Levadura Saccharomyces cereviceae -

+ : Indica actividad. Hay halo de inhibición.

- : Indica ausencia de actividad. No hay halo de inhibición.

El ácido corosólico sólo posee actividad antimicrobiana contra el microorganismo Gram

negativo Klebsiella pneumoniae.

- 32 -

Figura 4 : bioautografía de Klebsiella pneumoniae en placa de ácido corosólico.

Tabla 5: resultados de la actividad de ácido alfitólico contra el crecimiento

microbiológico.

Cepa Ácido alfitólico

Gram - Escherichia coli +

Gram - Pseudomonas aeruginosa -

Gram - Salmonella aviatum -

Gram - Klebsiella pneumoniae -

Gram + Bacillus subtilis +

- 33 -

Gram + Staphylococcus aureus -

Gram + Micrococcus flavus -

Hongo Candida albicans -

Levadura Saccharomyces cereviceae -

+ : Indica actividad. Hay halo de inhibición.

- : Indica ausencia de actividad. No hay halo de inhibición.

El ácido alfitólico posee actividad antimicrobiana contra el microorganismo Gram

negativo Escherichia coli y el microorganismo Gram positivo Bacillus subtilis.

Figura 5: bioautografía de Bacillus subtilis en placa de ácido alfitólico.

- 34 -

Figura 6 : bioautografía de Escherichia coli en placa de ácido alfitólico.

El ensayo de bioautografía entrega la cualidad de una sustancia de ser inhibitoria en el

crecimiento de un microorganismo, pero no puede afirmarse a partir de que

concentración posee aquella actividad, ni si su actividad es por ser bactericida o

bacteriostática.

- 35 -

6.4 Desarrollo de formulaciones dermatológicas

6.4.1 Estudio de solubilidad de EAE

Tabla 6: solubilidad por gramo de extracto acetato de etilo.

Solvente mL requeridos para

solubilizar 1 g de EAE.

Glicerina 2000

Polietilenglicol 400 1592

Aceite mineral 804

Propilenglicol 104

Etanol 37

Agua Insoluble

Con estos resultados, se puede apreciar que por si solo, ninguno de los solventes

estudiados fue adecuado para disolver un 5% de extracto en forma de polvo.

También se puede notar que el principal solvente utilizado en el desarrollo de productos

dermatológicos, el agua, no puede disolver el extracto.

Otro tema notable, es que el mejor solvente corresponde a etanol, un buen solvente de

uso común en productos dermatológicos, pero que en altas concentraciones puede ser

irritante a la piel.

- 36 -

6.4.2 Diseño de formulación de emulsión

Tabla 7: formulaciones F1 hasta F5.

Formulación F1 F2 F3 F5

Materia prima % % % %

Aceite mineral 10 10

Petrolato blanco 5 5

Alcohol cetílico 2 2 10 10

Alcohol estearílico 5

Monoestearato de glicerilo neutro 3 3

Polisorbato 80 c.s. c.s.

Monooleato de sorbitán c.s. c.s.

Lauril sulfato de sodio 1 1

Carbomer 940 1% neutro 0,5 0,5

Metilparabeno 0,1 0,1 0,1 0,1

Propilparabeno 0,2 0,2 0,1 0,1

Agua c.s.p.100% c.s.p.100% c.s.p.100% c.s.p.100%

Propilenglicol 5 10 10 10

EAE 5 5 5 5

En las formulaciones F1 y F2 se ocuparon emulgentes no iónicos, estos productos se

separaron a las 24 horas en estufa. La única diferencia entre F1 y F2, es que esta última

tiene 5% más de propilenglicol que F1, que se utilizó para ayudar a incorporar el

extracto.

- 37 -

En la formulación F3 se ocupó un emulgente aniónico, el extracto se agregó en la fase

grasa, quedando suspendido. Se realizó una formulación denominada F4, con idéntica

fórmula a F3, en la que el único cambio fue que el EAE se agregó en la fase acuosa; en

este caso también el EAE quedó suspendido. Ambas tuvieron una viscosidad muy alta.

Con la finalidad de disminuir la viscosidad de la formulación F3, se realizó la

formulación F5 en la que el extracto se solubilizó en la fase grasa, y una denominada F6

en la que el extracto se solubilizó en la fase acuosa. La viscosidad efectivamente

disminuyó, pero los ésteres grasos empleados no fueron adecuados para disolver el

extracto, quedando este suspendido.

Tabla 8: formulación F7.

Formulación F7

Materia prima %

Glyceryl stearate y ceteareth-20 y ceteareth-12 y

cetearyl alcohol y cetyl palmitate

4,5

Ceteareth-20 1

Dicaprilil éter 5

EAE 5

Agua c.s.p.100

Se realizó la formulación F7, una emulsión de carácter fluido, los resultados indicaron

que era mejor en cuanto a la capacidad de disolver el EAE, aunque no logró disolverlo

en su totalidad. La escasa viscosidad provocaba que se separaran sus fases en la prueba

de estabilidad en estufa. Para ser los primeros resultados con ingredientes

polietoxilados, estos son bastante auspiciosos, en cuanto a la capacidad de solubilizar el

extracto, y se retomará este tipo de materias primas en las formulaciones de emulsión

gel.

- 38 -

Tabla 9: formulaciones F8 hasta F12.

Formulación

F8 F9 F10 F11 F12

Materia

prima

% % % % %

Ciclometicona 15 15 10 10 11

Ciclometicona

y dimeticona

copoliol

10 10 10 12 12

Propilenglicol 57 50 57 57 57

Etanol 13 13 15 13 13,3

EAE 5 5 5 5 3,7

Glycereth-26 7

Alcohol

estearílico

3 3 3

En F8, se obtuvo como resultado una microemulsión de baja viscosidad, muy untuosa,

con fuerte olor a etanol, de color verde oscuro y con algunas partículas del extracto que

aún permanecían en suspensión. No era estable en estufa a 40°C.

En F9 se agregó como solubilizante glycereth-26, pero no mejoró la solubilidad del

extracto y se mantuvo la baja viscosidad y la separación de las fases.

En la formulación F10 se agregó un 3% de alcohol estearílico para mejorar la viscosidad

y la estabilidad. El resultado es una formulación en la que se disolvió casi la totalidad

del extracto, de buena viscosidad, de buen aspecto y pH.

- 39 -

En F11 se aumentó la concentración del emulgente (ciclometicona/dimeticona copoliol)

con lo que se obtuvo una microemulsión de silicona en alcohol que cumplía la

estabilidad acelerada y de estantería, en la que el extracto se disolvió completamente en

la microemulsión, El producto obtenido tiene buena apariencia, presenta un leve olor a

etanol, y al aplicar en la piel, el extracto absorbe rápidamente, dejando una capa

oclusiva sobre ella.

F12 es similar a F11, variando sólo la cantidad de extracto, disminuyéndolo de un 5 a

un 3,7%, que corresponde al ED50 para el extracto acetato de etilo.

Como resultado de este estudio de solubilidad del extracto activo en la formulación y la

estabilidad de las emulsiones, resultaron exitosas las formulaciones F11 conteniendo un

5% de EAE y la formulación F12 conteniendo un 3,7% de EAE. Debido a estos

resultados y tomando en cuenta las consideraciones éticas en el trato a animales de

experimentación, se seleccionó la formulación F11 para el estudio antiinflamatorio y el

ensayo de irritación dérmica.

40

6.4.3 Diseño de formulación de emulsión gel

Tabla 10: formulaciones G1 hasta G12.

Formulación G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10 G11 G12

Materia prima % % % % % % % % % % % %

Carbomer 1 1 1 1 1 1 1 0,75 1 1 1 1

Etanol 40 39 35 45 49,5 60 80 70 55 60 60 60

EAE 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

Agua c.s.p.100 c.s.p.100 c.s.p.100 c.s.p.100 c.s.p.100 c.s.p.100 c.s.p.100 c.s.p.100 c.s.p.100 c.s.p.100 c.s.p.100 c.s.p.100

Propilenglicol 1 5 5 0,5

NaOH c.s. c.s. c.s. c.s.

Trietanolamina c.s. c.s. c.s. c.s. c.s. c.s. c.s. c.s.

Polisorbato 80 5 10

Glycereth-26 10

Ciclometicona y

dimeticona

copoliol

10

41

En todas las formulaciones de la tabla se usó carbomer del tipo Carbopol Ultrez 10®.

Desde las formulaciones G1, hasta la formulación G4, se probaron distintas cantidades

de etanol y de propilenglicol para disolver el extracto (EAE), pero éste no se disolvió

en ninguno de ellos. Neutralizar este sistema con hidróxido de sodio, provocó pérdida

de la homogeneidad del producto.

Desde G5, el neutralizante ocupado fue una solución de trietanolamina al 20%, la que

resolvió levemente el problema que causaba agregar hidróxido de sodio.

Se aumentó la cantidad de etanol en la formulación con un 60% en G6 y un 80% en G7,

pero no se alcanzó a disolver totalmente el extracto. Y era dificultoso lograr la

dispersión del carbomer.

Una disminución del porcentaje de carbomer como en G8, no aliviaba la dificultad para

hidratarlo, y tampoco era capaz de disolver el extracto.

En G9 se utilizó la técnica de dispersar previamente el EAE en un emulgente, como lo

es el polisorbato 80, y de esta manera se agregó al sistema, pero la disolución a pesar de

mejorar, no era completa; y al momento de aplicar sobre la piel, dejaba un residuo

verdoso, indicando la falta de penetración del extracto en la piel. Además la sensación al

aplicar era desagradable. Aumentar la concentración de polisorbato 80 y de etanol,

como se hizo en G10, no mejoraba esta formulación con respecto a G9.

Cambiar el emulgente por glycereth-26, como en G11, o por ciclometicona y

dimeticona copoliol, como en G12; no mejoraba tampoco esta formulación con respecto

a G9.

42


Formulación G13 G14 G15 G16 G17

Materia prima % % % % %

Acrylates

C10/C30 Alkyl

Acrylate

Crosspolymer

0,5 1 1 1 1

Etanol 75 75 70 70 70

EAE 5 5 3,7 3,7 3,7

Agua 19,5 19 25,3 30,3 20,3

Trietanolamina c.s c.s. c.s. c.s. c.s.

Polisorbato 80 5

Polietilenglicol,

Lanolina,

Lanolina

etoxilada

5

Desde G13 en adelante, se ha ocupado para las formulaciones Acrylates C10/C30 Alkyl

Acrylate Crosspolymer, del tipo Carbopol 20/20®.

En G13 se usó un 0,5% de Carbopol 20/20®, y en G14 un 1% de Carbopol 20/20®. En

ambas no se disolvió bien el extracto, pero se aumentó la viscosidad al aumentar la

cantidad de Carbopol 20/20®.

Ante la dificultad de formular al 5%, se formuló al 3,7%.

G 15 resultó incapaz de solubilizar un 3,7% de extracto. En G16 se agregó polisorbato

80, pero no logró disolver el polvo. En G17 se cambió el solubilizante por un producto

que es una mezcla de polietilenglicol, lanolina y lanolina etoxilada, pero tampoco logró

disolver el extracto completamente.

43


Formulación G18 G19 G20 G21 G22 G23 G24 G25 G26 G27 G28 G29 G30

Materia prima % % % % % % % % % % % % %

Acrylates C10/C30 Alkyl Acrylate

Crosspolymer

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Glyceryl stearate y ceteareth-20 y

ceteareth-12 y cetearyl alcohol y

cetyl palmitate

5 5 5 5 5 5 4,9 5 5,5 4,5 4,5

Ceteareth-20 1,5 1,5 4,3 3 3 3 2,9 1,5

Oleth-20 4,5 4,5

Dicaprilyl ether 5,3 5,3 2,5 3,8 3,8 3,8 3,7 5,3 4,3 4,5 4,5 4,5 3,2

EAE 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 5 5 3,7 3,7 3,7 3,7 5

Etanol 84,5 69 69 69 64 68 68 70 70 70,4 70,4 70,4 70,4

Agua 14,5 14,5 14,5 14,5 14,5 14,5 12,2 15,4 15,8 15,4 15,4 15,4

2-amino-2-metil-1-propanol c.s. c.s. c.s. c.s. c.s. c.s. c.s. c.s. c.s. c.s. c.s. c.s.

Propilenglicol 5 1

Metilparabeno 0,1 0,1

Mezcla de diazolidinil urea y

metilparabeno y propilparabeno y

propilenglicol

0,5 0,5 0,5

- 44 -

En G18 se probó una mezcla de emulgentes, la solubilidad que se obtuvo del extracto es

completa, pero tiene muy baja viscosidad.

En G19 se agregó Carbopol 20/20® a la formulación y se obtuvo una buena disolución,

de buena viscosidad, color verde claro brillante y de rápida absorción al aplicar en la

piel. Tenía buena estabilidad a temperatura ambiente y en estufa, pero al mantenerse a

5°C, se formaban partículas sólidas. Desde G19 en adelante se ocupó como

neutralizante, 2-amino-2-metil-1-propanol, más adecuado para neutralizar un sistema de

alto contenido de etanol.

Al enfriarse la mezcla se formaban partículas sólidas de ceteareth-20 y dicaprilil éter.

En la formulación G20 y G21 se cambió la proporción que hay entre ellos,

manteniéndose la cantidad total fija. Pero el precipitado se seguía formando tanto en

G20, como en G21.

En G22 se agregó un 5% de propilenglicol a la formulación obtenida en G21, este

producto perdió su capacidad de absorción en la piel dejando residuos sobre ella,

además el producto perdió cohesión. Se mantuvo el precipitado que se presentaba a

bajas temperaturas. En G23 se agregó un 1% de propilenglicol, pero se mantuvieron los

mismos resultados.

En G24 se aumentó el porcentaje de extracto a un 5% a la misma formulación obtenida

en G23, pero se obtuvo un producto de mala solubilidad de extracto, y con mala

absorción.

En G25, para disminuir el precipitado se disminuyó la cantidad de ceteareth-20 a un

1,5%. El producto obtenido tenía buena viscosidad, y buena absorción. Pero no eliminó

la presencia de precipitado.

Para G26 se retiró el ceteareth-20 de la formulación debido a su precipitación. Incluso

así apareció precipitado.

En G27 se ha rebajado la cantidad de Emulgade SE PF® (Glyceryl stearate y ceteareth-

20 y ceteareth-12 y cetearyl alcohol y cetyl palmitate), pero se mantuvo el precipitado.

En G28 se cambió el sistema preservante por uno líquido como Germaben II®, que es

una mezcla de diazolidinil urea y metilparabeno y propilparabeno y propilenglicol

- 45 -

En G29 se cambió el Emulgade SE PF®, por oleth-20, puesto que a temperatura

ambiente este último es de carácter semisólido, por lo tanto presenta menor posibilidad

que forme un precipitado en la formulación. Se obtuvo con esta formulación un

producto que era estable físicamente en las pruebas de estantería y acelerada y no

formaba precipitado a bajas temperaturas; en la que el EAE se disolvía completamente

en la formulación.

Se preparó G30, con idéntica composición a G29, pero conteniendo un 5% de EAE. Se

seleccionó esta formulación para realizar el estudio antiinflamatorio y el ensayo de

irritación dérmica.

6.5 Estudio de actividad antiinflamatoria tópica

Los resultados del estudio farmacológico demostraron que el EAE obtenido desde las

hojas recolectadas en julio presentó una actividad de 65%, G30 exhibió un efecto del

64,1%, y F11, presentó un efecto del 69,2% de actividad antiinflamatoria.

En el ensayo con las formulaciones dermatológicas se pudo apreciar una actividad

similar entre el EAE y la formulación G30. Para la formulación F11, la actividad se vio

aumentada por el excipiente que pudo promover o facilitar la entrada de los principios

activos responsables de la actividad antiinflamatoria. La evaluación de una posible

actividad antiinflamatoria, o la interferencia del vehículo en la experimentación al crear

un film que impidiese la absorción del agente inflamatorio usado, en este caso TPA,

quedó resuelto al ver los valores del porcentaje de inflamación producida por el TPA en

los animales controles de G30 y F11.

Aunque los valores de los efectos antiinflamatorios obtenidos con el EAE y las

formulaciones son menores al fármaco de referencia indometacina, (92,9 %), sus

actividades fueron importantes.

Se demostró que el EAE a la dosis de 3 mg/oreja obtenido desde las hojas recolectadas

en abril presentó una actividad antiinflamatoria de un 96,7 % (Aguirre et al., 2006). Esta

diferencia se pudo deber al cambio estacional de época de recolección de las hojas, y a

la diferencia genética que pueda existir entre dos plantas de la misma especie que se han

desarrollado en distintas condiciones ambientales.

- 46 -

Tabla 13: contenido de ácido asiático y ácido corosólico del EAE obtenido desde hojas

recolectadas en diferentes zonas geográficas y en distintas épocas.

Chanco 35°45´S, 72°33´W, abril 2002

Ácido asiático 209,8 mg/g EAE

Ácido corosólico 264,2 mg/g EAE

Carillanca 38°41´S, 70°38´W, julio 2005

Ácido asiático 50,3 mg/g EAE

Ácido corosólico 102 mg/g EAE

Aguirre et al. (2006) utilizó para su estudio farmacológico hojas que fueron

recolectadas en Chanco, VII Región en abril, al comienzo del periodo de lluvias y

después de la formación de los frutos. Como ya se había señalado en este estudio se

utilizaron las hojas de individuos que crecen en Carillanca, IX Región, en julio, a mitad

del período de lluvias. Como se puede observar en los resultados presentados en la

Tabla 14, la actividad antiinflamatoria del EAE depende del contenido en triterpenos

siendo este efecto dosis dependiente.

Tabla 14: actividad antiinflamatoria tópica del EAE obtenido desde hojas recolectadas

en julio y sus formulaciones, comparadas con el EAE obtenido desde hojas recolectadas

en abril

Muestra Actividad antiinflamatoria tópica

Indometacina 92,9 %

EAE Chanco, abril 96,7 %

EAE Carillanca, julio 65,0 %

Formulación G30 64,1 %

Formulación F11 69,2%

- 47 -

6.6 Estudio de irritación dérmica en conejos

Tabla 15: resultados de la prueba de irritación dérmica en conejos.

Valor PII, con

abrasión

Interpretación Valor PII, sin

abrasión

Interpretación

Control (cámara

vacía)

0 Irritación

imperceptible

0 Irritación

imperceptible

Vehículo crema 0 Irritación

imperceptible

0 Irritación

imperceptible

Crema 5% de

EAE

0 Irritación

imperceptible

0 Irritación

imperceptible

Vehículo gel 0,6 Irritación leve 0,6 Irritación leve

Gel al 5% de EAE 0,08 Irritación

imperceptible

0 Irritación

imperceptible

EAE al 2,7 % en

etanol

0,08 Irritación

imperceptible

0,03 Irritación

imperceptible

El control constituido por la cámara vacía, no irritó la piel, por lo que cualquier grado de

irritación que pudiese ocurrir no se debió al parche ni a la cámara.

El vehículo de F11 no irritó de ninguna manera la piel, siendo este el mejor excipiente

debido a la ausencia de irritación que manifiesta su aplicación. La formulación en crema

conteniendo un 5% de EAE tampoco fue irritante de la piel.

Los resultados del estudio de irritación producida por el vehículo de G30 mostró que

éste es levemente irritante debido probablemente a la alta cantidad de etanol de la

formulación y a que permaneció ocluido dentro de la cámara y adsorbido en la red

producida por el gelificante. La misma formulación pero conteniendo un 5% de EAE

disminuyó sustantivamente la irritación confirmando entonces su actividad protectora y

antiinflamatoria de la piel.

- 48 -

Capítulo VII 7.1 Discusión El EAE es un extracto que se obtiene con un buen rendimiento siendo el ácido

corosólico y el ácido asiático sus principales principios activos. La cantidad de EAE así

como su enriquecimiento relativo de estas moléculas, está condicionada por la época de

recolección, y a la variación fenotípica propia de las especies que crecen en un amplia

distribución geográfica, como resultado de la adaptación a un cambio continuo del

medio ambiente (Seguel, 2000; Delporte et al., 2006).

El aprovechamiento de las hojas de murtilla es una operación de buena proyección

económica, en la que se calcula que a partir de 6 kilos de hojas frescas de alto contenido

de triterpenos, se puedan elaborar 8 kilos de una formulación al 5 % de EAE.

Ya se ha demostrado que los preparados dermatológicos que contienen ácido asiático

obtenido desde Centella asiatica, la especie donde originalmente se describió la

presencia de este triterpeno, tienen propiedades cicatrizantes (Widgerow, 2000). El

ácido asiático es conocido por su capacidad de estimular la síntesis de colágeno

(Brinkhaus et al., 2000). Este efecto es mediado por cambios en la expresión de genes

involucrados en la angiogénesis y remodelamiento de la matriz extracelular y de genes

relacionados con factores de crecimiento (Coldren et al., 2003).

El EAE obtenido desde las hojas recolectadas en julio, mostró buenos resultados en

cuanto a estimular la velocidad de proliferación, mejorar la capacidad migratoria y el

depósito de colágeno tipo I en la matriz extracelular de fibroblastos de piel humana, en

ensayos realizados in vitro (Lobos, 2006).

El TPA, induce una respuesta inflamatoria tardía asociada con una marcada infiltración

celular y una elevada síntesis de eicosanoides. La liberación de los mediadores ocurriría

principalmente vía lipoxigenasas, además de inducir la activación de la óxido nítrico

sintetasa inducible y del factor nuclear kappa-B. (Lloret y Moreno, 1995; De Young et

al., 1989). Por ende los extractos y componentes de las hojas de murtilla podrían ejercer

su efecto antiinflamatorio tópico inhibiendo las enzimas involucradas en la síntesis de

prostaglandinas y leucotrienos. Además, el efecto antiinflamatorio también podría

- 49 -

deberse a una reducción en la actividad de los macrófagos y del complemento, o bien a

una inhibición del proceso oxidativo.

En el estudio realizado por Aguirre (2006) se demostró que el ácido corosólico además

de tener capacidad antinflamatoria por TPA, tiene capacidad antiinflamatoria tópica en

el ensayo realizado con ácido araquidónico, de la misma magnitud que el fármaco de

referencia nimesulida. No así el ácido asiático que sólo tiene capacidad antiinflamatoria

frente a TPA, de similar magnitud que el fármaco de referencia indometacina.

La inflamación producida por ácido araquidónico es de corta duración, caracterizada por

una rápida formación de edema y aumento de la permeabilidad vascular, una marcada

síntesis de prostaglandinas (fundamentalmente PGE2), con un mínimo influjo celular,

proceso que ocurriría fundamentalmente vía ciclooxigenasas (COXs). El ácido

araquidónico aplicado tópicamente se convierte en PGs y LTs por la COX y LO

respectivamente. (Kim et al., 2004).

El efecto antiinflamatorio observado en EAE, no se debe estrictamente a la presencia de

triterpenos, sino que también a los flavonoides y taninos presentes en ellos. Se ha

descrito que los flavonoides inhiben la PLA2, COXs, y LOs y de esa manera reducen

los eicosanoides. Además las sustancias antioxidantes reducen la lipoperoxidación. Si

bien no se han identificado las identidades de estos flavonoides, se cree por estudios

anteriores que correspondería a heterósidos de flavonoles, en particular de miricetina y

quercetina (Rubilar et al., 2006).

En este estudio se comprobó una actividad antimicrobiana contra el crecimiento de

Klebsiella pneumoniae por parte del ácido corosólico, y la inhibición del crecimiento de

Escherichia coli y Bacillus subtilis por parte del ácido alfitólico.

En un estudio anterior (Inostroza, 2005), se demostró que el EAE tiene actividad

inhibitoria en el crecimiento de Micrococcus flavus a la concentración de 200 ug/mL y

una inhibición parcial del crecimiento de Bacillus subtilis a la misma concentración; en

un estudio de siembra radial en placas de Petri. Dentro del mismo trabajo se demostró

inhibición del crecimiento de Bacillus subtilis por EAE, e inhibición del crecimiento de

Escherichia coli por EDCM, en un ensayo de bioautografía.

- 50 -

Esta memoria confirmó que la actividad antimicrobiana contra estas dos últimas cepas

se debe en gran medida al ácido alfitólico presente en EAE y en EDCM. Asimismo la

actividad inhibitoria del crecimiento de Micrococcus flavus se puede deber a la

presencia de ácido asiático, como lo confirmó el estudio realizado por Inostroza.

Luego viene la etapa del diseño del producto dermatológico, que debe ser capaz de

entregar eficientemente el extracto, liberándolo de su base, y este debe penetrar las

capas que forman el tejido dérmico, para que alcance el tejido blanco y expresen su

acción antiinflamatoria y analgésica. Además, que también actúe en el órgano de la piel,

inhibiendo el crecimiento de microorganismos y regenerándola debido a sus

propiedades cicatrizantes y regeneradoras (Lobos, 2006).

El vehículo en el cual el extracto activo está contenido, debe tener entonces

características especiales, debido a la naturaleza del mismo. Un extracto seco obtenido

por maceración con acetato de etilo, que tiene características medianamente polares, y

constituido principalmente por moléculas de alto peso molecular (ácido asiático, ácido

madecásico, ácido corosólico, ácido alfitólico, y sus correspondientes glicosilaciones

como el asiaticósido).

El producto finalmente, debe sus propiedades a la conjugación de la calidad del

vehículo y la actividad del extracto. Siendo su estabilidad química, física y

microbiológica, su compatibilidad con la piel, la completa solubilidad del extracto en el

vehículo, la liberación del extracto a partir de este, características básicas de la

exigencia del producto. A los que se añade la rapidez en la absorción, la agradable

sensación al aplicar, la limpieza de su aplicación, la ausencia de partículas residuales

después de su aplicación, la facilidad para extender el producto y finalmente la buena

apariencia global del producto, características deseables.

La formulaciones F11 y G30, tienen métodos de fabricación sencillas. En F11 no se

incluyó un agente preservante, puesto que la fórmula es anhidra. En la formulación G30,

a pesar de contener suficiente alcohol etílico como para prevenir el crecimiento

microbiológico, se agregó un sistema preservante. La calidad del producto final,

depende de las materias primas con las que se trabaje, incluyendo una materia activa de

pequeño tamaño de partícula, con una cantidad de principios activa conocida, y

cuidando la ausencia de los solventes extractivos. Respecto a este último, la normativa

- 51 -

nacional no establece límites para disolventes en productos dermatológicos. La

comunidad europea establece en su legislación (Cosmetic legislations; 1999) una

concentración máxima de un 0,2% de diclorometano como impureza en formulaciones

cosméticas. El EAE de este estudio contiene un 0,38% de acetato de etilo.

La formulación F11 de carácter untuoso, tiene la capacidad de mejorar levemente el

traspaso de los principios activos antiinflamatorios a través de la piel, y dejándola al

mismo tiempo, con una película suave y protectora sobre ella. Lo que puede ser

considerado una buena característica cosmética; pero también un medio de curación de

una herida, que al ocluir la zona injuriada, permite que el agua que libera la herida

permanezca en la zona, promoviendo una cicatrización más pronta en la zona dañada; lo

que sumado a la capacidad antibacteriana del ácido corosólico, alfitólico y asiático, da

origen a un preparado dermatológico que actúa como buen antiinflamatorio y que podría

funcionar como una terapia efectiva en el proceso de cicatrización de la piel

(Widgerow; 2000. Lobos, 2006).

- 52 -

7.2 Conclusiones

Conclusiones parciales

El EAE obtenido de las hojas de murtilla recolectada en julio del año 2005 en

Carillanca, contiene un 5,03% de ácido asiático y un 10,2% de ácido corosólico.

El contenido de los ácidos asiático y corosólico disminuye en las hojas recolectadas en

julio, comparadas con las hojas recolectadas en abril.

El ácido corosólico inhibe el crecimiento del microorganismo Gram negativo Klebsiella

pneumoniae, mientras el ácido alfitólico inhibe el crecimiento del microorganismo

Gram negativo Escherichia coli y del microorganismo Gram positivo Bacillus subtilis,

visualizado a través del bioensayo bioautografía.

Los compuestos ácido corosólico y ácido alfitólico son inactivos contra el crecimiento

del hongo Candida albicans y la levadura Sacharomyces cereviceae.

Las formulaciones G30 y la F11 son estables en su calidad fisicoquímica en el tiempo.

El EAE recolectado en julio del año 2005 es activo como agente antiinflamatorio tópico.

La formulación G30 mantiene la capacidad antiinflamatoria tópica del EAE.

La formulación F11 aumenta levemente la capacidad antiinflamatoria tópica de EAE.

El EAE y las formulaciones G30 y F11 presentan valores de PII que las clasifica como

no irritante para la piel.

El EAE puede disminuir una leve irritación en la piel.

Conclusión general

El producto dermatológico desarrollado a partir del extracto acetato de etilo (EAE)

obtenido desde las hojas de Ugni molinae es eficaz como agente antiinflamatorio.

El contenido de principios activos de las hojas de murtilla, varía de acuerdo con la

época de recolección.

- 53 -

Bibliografía

AGUIRRE, M.. ; Delporte, C. ; Backhouse, N. ; Erazo, S. ; Letelier, M. ; Cassels,

B. ; Negrete, R. Topical anti-inflammatory activity of 2-α-hydroxy pentacyclic

triterpene acids from the leaves of Ugni molinae. Bioorganic Medicinal Chemistry,

14(16): 5673-5677. 2006

AGUIRRE, María Cristina. Aislamiento e identificación de los principios activos

antiinflamatorios y antioxidantes de las hojas de Ugni molinae Turcz. Myrtaceae

(murtilla).obtención de un extracto estandarizado. Tesis (Doctora en Ciencias

Farmacéuticas). Santiago, Chile. Universidad de Chile, Facultad de Ciencias

Químicas y Farmacéuticas, 2006.

ASTM F 719-81: Standard practice for testing biomaterials in rabbits for primary

skin irritation. American Society for Testing and Materials, approved in 1981 and

reapproved in 1996.United States.

BRINKHAUS, S.; Lindner, M.; Schuppan, D.; Hahn, E.G. Chemical,

pharmalogical and clinical profile of the east asian medical plant Centella asiatica.

Phytomedicine. 7(5): 427-428, 2000.

COLDREN, C.D.; Hashim, P; Ali, J.M.; Oh, S.K.; Sinskey, A.J.; Rha, C. Gene

expression changes in the human fibroblast induced by Centella asiatica

triterpenoids. Planta Medica 69: 725-732, 2003.

COSMETIC LEGISLATIONS- EUROPEAN COMMISSION. The rules

governing cosmetics products in the European Union. Volume 1. Enterprise

Directorate-General Pharmaceuticals and cosmetics. 1999.

DELPORTE, C.; Negrete, R.; Saavedra, A.; Peredo, N.; Aguirre, M.; Silva, X.;

Erazo, S.; Apablaza, C.; Backhouse, N. Impacto de la variación estacional en la

eficacia de Ugni molinae y Buddleja globosa, especies nativas chilenas. Revista

Cubana de Farmacia, 40: 140. 2006.

- 54 -

DELPORTE, C.; Backhouse, N.; Inostroza, V.; Aguirre, M.; Peredo, N.; Silva, X.;

Negrete, R. Analgesic activity of Ugni molinae (murtilla) in mice models of acute

pain. Journal of Ethnopharmacology, 112(1):162-5, 2007.

ERAZO, S., Negrete, R., Zaldívar M., Backhouse N., Delporte C., Silva I.,

Belmonte E., López-Perez J.L., San Feliciano A. Methyl psilalate: A new

antimicrobial metabolite from Psila boliviensis. Planta Medica 68: 66-67, 2002.

HOLLANDER, M y Wolfe, D. En su: Nonparametric Statistical Methods. New

York, J. Wiley and Sons, 1973. pp 27-32; 62-70.

INOSTROZA, Viviana. Evaluación de las actividades analgésicas in vivo de Ugni

molinae Turcz. y sus potenciales efectos antimicrobianos e inhibitorios de la

xantino-oxidasa. Tesis (Química y Farmacia). Santiago, Chile. Universidad de

Chile, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, 2005.

KIM, H.P.; Son, K.H.; Chang, HW.; Kang, S.S. Antiinflamatory plant flavonoids

and cellular actions mechanisms. J Pharmacol Sci, 96(3):229-45, 2004.

KOLESNIKOV, Y.; Cristea, M.; Oksman, G.; Torosjan, A.; Wilson, R.

Evaluation of the tail formalin test in mice as a new model to asses local

analgesic effects. Brain Research, 1029: 217-223. 2004.

LIU, Jie. Pharmacology of oleanolic acid and ursolic acid. Journal of

Ethnopharmacology, 49(2):57-68, 1995.

LLORET S. y MORENO J.J. Effects of an antiinflammatory peptide (antiflammin

2) on cell influx, eicisanoid biosynthesis and oedema formation by arachidonic

acid and tetradecanoyl phorbol dermal application. Biochemical Pharmacology,

50(3): 347-353, 1995.

- 55 -

LOBOS, Alejandro. Evaluación de la actividad cicatrizante de Ugni molinae

Turcz, myrtaceae (murtilla) mediante ensayos de proliferación, depósitos de

proteínas de matriz extracelular y migración de fibroblastos de piel humana. Tesis

(Química y Farmacia). Santiago, Chile. Universidad de Chile, Facultad de Ciencias

Químicas y Farmacéuticas, 2006.

MAZZANTI, G ; DANIELE, C . Biological evaluation of polyvinyl siloxane

impression material. Dental materials. 21 : 371-374, 2005.

MONTENEGRO, G. En su: Chile nuestra flora útil. Guía de plantas de uso

apícola, en medicina floklórica, artesanal y ornamental. Santiago de Chile.

Ediciones Universidad Católica de Chile, 2000. pp 241-242.

MUÑOZ,M. BARRERA, E. MEZA, I. El uso medicinal y alimenticio de plantas

nativas y naturalizadas en Chile. Museo de historia natural,33:52-53, 1981.

PIETTA, P. Flavonoids as antioxidants. Journal of Natural Products. 63(7):1035-

42, 2000.

RUBILAR, M. ; Pinelo, M. ; Ihl, M. ; Scheuermann, E, ; Sinero, J. ; Niñez, M. ;

Murta leaves (Ugni molinae Turcz.) as a source of antioxidant

polyphenols. J.Agric.Food Chem. 54 :59-64, 2006.

SCHOTT, Hans. Rheology. En: Remington`s pharmaceutical sciences. Alfonso

Gennaro, USA. Editorial Mack, 1985. pp.330.

SEGUEL, I. y AVENDAÑO, L. 2001. Aprovechando lo nuestro, murta: Fruto

nativo de alta perspectiva comercial. Revista Sofo campo 4(32),2001.

WIDGEROW, A.; Chait, L.; Stals, R.; Stals, J. New innovations in scar

management. Aesthetic plastic surgery, 24(3):227-34, 2000.

- 56 -

Anexos

Anexo I

Materias primas utilizadas en la formulación de productos

dermatológicos

Ácidos grasos: la siguiente corresponde a una lista en la que se detalla el largo en la

cadena de carbonos y sus nombres.

C4 butírico

C6 caproico

C8 caprílico

C10 cáprico

C12 láurico

C14 mirístico

C16 palmítico, cetílico, hexadecílico, hexadecanoico.

C18 esteárico, cetilacético, octadecaoleico

C20 araquídico

C22 behénico.

C24 lignocérico

C26 cerótico

Acrylates C10/C30 Alkyl Acrylate Crosspolymer: Acrilatos/c10-30 Alquil Alquílico

de ligadura cruzada. El término “Acrylates” (acrilatos) se aplica a los copolímeros

lineales no entrecruzados que contienen combinaciones de ácido acrílico y ácido

metacrílico, junto con sus ésteres de metilo, etilo, propilo o butilo. El término “Cross-

polymer” (polímero entrecruzado) se aplica a los polímeros distintos del carbomer que

tienen enlaces cruzados. Polímero de ácido acrílico, fácil de dispersar. Usado para

- 57 -

espesar y suspender. Se recomienda para sistemas que contienen electrolitos y

surfactantes tanto aniónicos como anfotéricos.

Alcohol cetílico: Hexadecanol, Masa blanca cerosa, con débil olor propio. Es un factor

de consistencia que tiene propiedades estabilizantes, muy adecuado para cremas,

ungüentos y emulsiones líquidas farmacéuticas, así como para preparados en forma de

barra. Temperatura de fusión: entre 46 a 49 °C.

Alcohol estearílico: alcohol n-octadecílico. Masa cerosa, con débil olor propio. El

alcohol estearílico encuentra empleo en la industria cosmética y farmacéutica como

agente de consistencia no autoemulsificante, muy adecuado para cremas, ungüentos y

emulsiones líquidas farmacéuticas, así como para preparados en forma de barra

empleados en cosmética decorativa. La cantidad de empleo oscila entre el 1 y el 10%,

según la consistencia deseada. Temperatura de fusión: entre 55 y 57 °C.

Alcoholes grasos: los alcoholes grasos son insolubles en agua, para conferirle el

carácter hidrofílico deseado se hace reaccionar con polioxietileno.

Normalmente se usan mezclas de ellos (ejemplo: ceteareth-20 más ceteareth-12) porque

así aumenta la capacidad de estabilizar una emulsión. Son buenos detergentes, pero dan

una baja formación de espuma.

Ameroxol OE 20: Oleth-20. Corresponde a Oleil alcohol condensado con 20 moles de

oxido de etileno. Agente emulsificante O/W no iónico y solubilizante. De apariencia

pastosa y blanca, y escaso olor.

AMP-95: 2-amino-2-metil-1-propanol 95%, y 5% de agua. Amina orgánica con alto

poder neutralizante, se ocupa principalmente para la neutralización de polímeros

acrílicos de tipo Carbomer y Acrylates C10/C30 Alkyl Acrylate Crosspolymer.

Carbomer: Polímero de ácido acrílico entrecruzado con alil éteres de pentaeritritol y

alil éteres de sucrosa. El término “Carbomer” se aplica a los homopolímeros cruzados

de ácido acrílico de elevado peso molecular. El agente o agentes responsables de los

enlaces cruzados se indican en la definición monográfica del ingrediente. El carbomer

es un importante agente espesante y gelificante, además de actuar como estabilizador de

emulsiones y suspensiones. Se trata de una sustancia muy hidrofílica, soluble en agua,

alcohol y solventes polares.

- 58 -

Sus propiedades como espesante son eficaces en un rango de pH que va desde cinco a

diez; pero se ven reducidas por la presencia de electrolitos. Este producto es

incompatible con algunos tensioactivos catiónicos y algunos polímeros catiónicos.

Este polímero es resistente al ataque bacteriano, pero no soporta el crecimiento de

mohos; por lo que para su conservación se requieren otros componentes en la

formulación final.

Carbopol Ultrez 10 : ver Carbomer.

Carbopol ETD 20/20 : ver Acrylates C10/C30 Alkyl Acrylate Crosspolymer.

Ceteareth-12: cetil estearil alcohol + 12 moléculas de óxido de etileno. Es de carácter

sólido. Valor de BHL: 13,3. Temperatura de fusión: entre 34 y 37 °C.

Ceteareth-20: cetil estearil alcohol + 20 moléculas de óxido de etileno. Sustancia de

aspecto sólido de color blanco. Se ocupa como emulsificante no iónico O/W. Valor de

BHL: 15,9. Temperatura de fusión: entre 39 y 42 °C.

Cetearyl alcohol: mezcla de alcoholes cetílico y estearílico. De aspecto ceroso. Se

ocupa como factor de consistencia y estabilizante. Temperatura de fusión: entre 48 y 52

°C.

Cetiol OE: producto de marca producido por laboratorios Cognis. Ver dicaprilyl ether.

Cetyl palmitate: éster de alcoholes grasos saturados de cadena larga y ácidos grasos,

principalmente éster cetílico del ácido palmítico. De aspecto ceroso y blanco. Se usa

como factor de consistencia, para corregir la consistencia de una emulsión.Temperatura

de fusión: entre 46 a 51 °C.

Ciclometicona: Bajo este nombre existen distintos compuestos. Todos se caracterizan

por ser un anillo con unidad básica de siloxano. El número de unidades puede variar

entre tres y seis. Estos compuestos, dan al pelo suavidad y brillo sedoso, son solubles en

etanol, alcohol cetílico y disolventes alifáticos.

Sus funciones en la fórmula pueden ser: acondicionador capilar, reductor de la

sensación de pegajosidad, lubricante, proporciona brillo, emoliente, etc.

- 59 -

Esta silicona tiene un amplio rango de solubilidad, no mancha y es muy volátil (bajo

calor de vaporización).

Dicaprilyl ether: dioctil eter. Aceite casi incoloro y de olor débil. Provee una sensación

de sequedad, emoliente, repele el agua. Temperatura de fusión: -6,7°C. Temperatura de

ebullición: 286 °C. Densidad: 0,806 g/mL.

Dow Corning 345: ciclometicona. 95% tetrámero cíclico.

Dow Corning 3225 C: ciclometicona y dimeticona copoliol. Ciclometicona

autoemulsionable, se ocupa como emulsificante o coemulsificante. También se ocupa

para preparar productos transparentes. En productos para piel reduce la sensación de

pegajosidad.

Emulgade SE PF: producto de marca elaborado por laboratorios Cognis. Su nombre

INCI es glyceryl stearate y ceteareth-20 y ceteareth-12 y cetearyl alcohol y cetyl

palmitate. Sustancia de color blanco amarillento, olor débil, en forma de pellets. Es una

base autoemulsionante. Especial para la preparación de emulsiones O/W.

Eumulgin B2: producto de marca elaborado por laboratorios Cognis.Ver ceteareth-20.

Germaben II: preparación a base de propilenglicol, diazolidinil urea, metilparabeno y

propilparabeno, se usa como preservante antimicrobiano.

El Germaben II-E es un sistema conservador liquido, transparente con la siguiente

composición:

Germall II ( Diazolidinyl urea) 20 %

Metilparabeno 10 %

Propilparabeno 10 %

Propilenglicol 60 %

El Germaben II-E constituye un sistema conservador antimicrobiano de amplio espectro

que es efectivo contra las bacterias gram-positivas y gram-negativas, levaduras y

hongos.

- 60 -

Es compatible esencialmente con todos los ingredientes cosméticos incluyendo los

surfactantes noionicos y las proteinas. El Germaben II-E es un sistema conservador

completo, en forma de líquido transparente que ha sido desarrollado especialmente para

cremas y lociones cosméticas que contienen ingredientes que tienden a inactivar los

parabenos, (ejemplo: emulsificadores no iónicos, proteinas, compuestos etoxilados).

El método preferido de incorporación es añadirlo lentamente a la formulación después

de la emulsificación y justo antes de la incorporación del perfume.

Glycereth-26: Polyoxyethylene 26 glyceryl ether, Polietilen glicol eter de glicerina con

un promedio de 26 moles de óxido de etileno añadidos. Se ocupa como emoliente y

solubilizante.

Glicerina: propanotriol, glicerol. Preparado por hidrólisis de grasas y aceites, de donde

se obtienen ácidos grasos y glicerol.

Glyceryl stearate: monoestarato de glicerina. Sustancia de aspecto ceroso y de olor

débil, se puede encontrar con distinta pureza debido a que el estearato puede venir

acompañado de palmitato al formar el ester. Se emplea como factor de consistencia, en

emulsiones y también en preparados anhidros(barras, supositorios). Es neutro y

compatible con la piel.Temperatura de fusión: según su pureza, entre 53 y 58 °C.

Tween 20, 60, 80: (Polisorbato 20, 60, 80) serie de emulsionantes y agentes

tensoactivos. Son derivados de polioxietileno de ésteres parciales de ácido graso con

anhídrido de sorbitán. Esteres de sorbitan polioxiteilenicos

Span: esteres de sorbitan.

Lauril sulfato de sodio: El lauril sulfato sódico es el tensioactivo aniónico por

excelencia en cosmética; sus buenas propiedades detergentes, espumantes, humectantes,

dispersantes, así como su resistencia a las durezas del agua incluso a bajas temperaturas

y su afinidad con la piel, le permiten estar presente en la mayoría de preparaciones para

el cuidado e higiene capilar y dérmico. Es innumerable la cantidad de variantes de esta

sustancia que se pueden encontrar en el mercado, estas pueden variar el contenido en

sales, la pureza del alcohol graso del que proviene, la concentración de materia

detergente, aditivos adicionales, etc.

- 61 -

Una característica que le proporciona una gran versatilidad es su solubilidad en agua y

la conservación del poder espumante a bajas temperaturas; así los champús a base de

este compuesto se eliminan de forma fácil enjuagando el cabello. Su débil olor permite

un perfumado fácil y duradero.

El lauril sulfato sódico es compatible con casi todas las sustancias detergentes

empleadas en cosmética y con otros tipos de aditivos como azufre, ácido salicílico,

vitaminas, etc. Su sabor indiferente le permite ser empleado en pastas dentífricas y

preparaciones para la higiene oral como espumante.

Parabeno: Así denominados por ser derivados del ácido p-aminobenzoico. Son

conservantes de tipo fenólico. Su solubilidad en agua decrece a medida que aumenta el

largo de la cadena alilo. Su potencial antimicrobiano aumenta con el largo de la cadena

alilo, en donde el butilparabeno es el más eficiente contra Aspergillus fumigatus. Es

común mezclar un par de ellos en la formulación, puesto que así se aumenta la

capacidad antimicrobiana. Su poder antimicrobiano se ve disminuido en presencia de

moléculas de tensoactivo, debido a que se compleja con ellas, y su actividad se debe al

estado libre de ella.

Propilenglicol: Solvente. Líquido incoloro, inodoro, viscoso, higroscópico; de leve olor

característico. Densidad entre 1,0350 – 1,0370.

Solulan 75: PEG-75 Lanolina. Lanolina etoxilada. Sustancia cerosa de color amarillo

pálido. Se ocupa como emoliente, humectante y sobreengrasante.

- 62 -

Anexo II

Método de manufactura de los productos dermatológicos.

Se detallan los métodos de producción para fabricar las formulaciones F11, F12, G29 y

G30, que corresponden a aquellas aprobadas por su condición de estabilidad física.

F11

Materia prima % en peso

Ciclometicona 10

Ciclometicona y dimeticona copoliol 12


Propilenglicol 57

EAE 5

Etanol 13

F12


Ciclometicona 11



Propilenglicol 57

EAE 3,7

Etanol 13,3

- 63 -

Para fabricar tanto la formulación F11, como F12, se procede de la siguiente manera:

En un recipiente previamente tarado se coloca la cantidad de ciclometicona,

ciclometicona y dimeticona copoliol y el alcohol estearílico. La que se denomina fase

A.

En otro recipiente, se coloca el propilenglicol, el extracto acetato de etilo y la cantidad

de etanol requeridas. La que se denomina fase B.

La fase A y la fase B, se calientan lentamente hasta 70 grados Celsius, agitando

constantemente la fase A, y disolviendo el extracto en polvo en la fase B.

Cuando se ha comprobado la temperatura de las fases, se ha comprobado visualmente

que el alcohol estearílico se ha fundido, y que el extracto se ha disuelto mayormente. Se

vierte la fase B, sobre la fase A.

Se agita con fuerza mediana, a temperatura ambiente. Permitiendo que se enfríe

lentamente y sin dejar de agitar.

Finalmente se comprueba el peso, y se ajusta agregando etanol y agitando hasta

homogeneizar.

- 64 -

G29


Oleth-20 4,5

Dicaprilil éter 4,5

Etanol 70,4

EAE 3,7

Agua 15,4

Carbopol 2020 1

AMP-95 1 gota

Germaben II 0,5

G30


Oleth-20 4,5

Dicaprilil éter 3,2

Etanol 70,4

EAE 5

Agua 15,4

Carbopol 2020 1

AMP-95 1 gota

Germaben II 0,5

- 65 -

Para fabricar tanto G29 como G30, se procede de la siguiente manera:

Se necesitan 3 recipientes.

En un recipiente tarado se agrega la cantidad requerida de oleth-20 y de dicaprilil éter.

La que se denomina fase A.

En otro recipiente se prepara la que se denomina fase B. Consta de la cantidad requerida

de etanol junto con el extracto.

En otro recipiente, se prepara la fase C: el gelificante, este se prepara agregando la

cantidad que se necesita de Carbopol 20/20, junto con el agua y el Germaben II. Se

espera que se humecte y se agita hasta lograr homogeneidad.

Cuando están listas las tres fases, se procede de la siguiente manera.

La fase A y la fase B se calientan lentamente hasta 70 grados Celcius, luego la fase B se

agrega sobre la fase A. Se agita por un instante hasta lograr homogeneidad.

Sobre esta mezcla se agrega la fase C.

Se agita vigorosamente, hasta comprobar la completa distribución del gelificante en la

emulsión. Puede ayudarse por medio de un equipo como el Ultraturrex para este

objetivo.

Cuando se ha comprobado visualmente la homogeneidad y no se observa ningún grumo

de gelificante, se agrega el neutralizante AMP-95. En la cantidad necesaria para dar la

viscosidad, aproximadamente hasta pH 5,5.

El peso se ajusta agregando etanol.

Puede ser útil que la fase C, se prepare en exceso, manteniendo las proporciones de sus

componentes, y que al momento de mezclar con las otras dos fases, se use la cantidad

necesaria.

Si no se logra distribuir el gelificante en forma fácil en la mezcla, puede calentarse hasta

unos 50 grados Celcius y agitar.

- 66 -

Anexo III

Formulación de controles de productos dermatológicos.

Los controles que se ocuparon para las pruebas in vivo fueron fabricados con materias

primas del mismo número de lote de las que se usaron para fabricar las formulaciones

conteniendo el extracto; y se trabajó bajo las mismas condiciones de proceso.

Control de G30


Ameroxol OE20 4,5

Cetiol OE 3,2

Etanol 72,8

Agua 17,9

Carbopol 2020 1,1

Germaben II O,5

AMP-95 c.s.p.

Control de F11


Ciclometicona 10



Propilenglicol 59

Etanol 16

- 67 -

Anexo IV

Ensayo de irritación dérmica: Interpretación y cálculo de resultados.

Visualmente se da un puntaje a la zona que ha estado en contacto con la sustancia a la

que se le evalúa su poder irritativo, según la siguiente tabla.

Sistema de clasificación para reacciones en la piel

Grado de eritema Descripción Grado de edema Descripción

0 No hay eritema 0 No hay edema

1 Eritema levemente

perceptible

1 Edema levemente

perceptible

2 Eritema bien

definido

2 Edema bien definido

por un borde

marcado y un leve

solevantamiento de

piel

3 Eritema moderado

a severo

3 Edema moderado,

levantamiento de

piel de

aproximadamente 1

mm.

4 Eritema severo y

con formación de

llagas

4 Edema severo,

levantamiento de la

piel de más de 1 mm

y en toda el área

expuesta.

Se suman los puntajes por cada lado y cada parche en en forma independiente (lado de

piel intacto y lado abrasionado), para eritema y edema. De esta manera el máximo de

- 68 -

puntaje para cada cámara por día puede ser ocho. Se trata de este modo cada cámara por

los tres días consecutivos. Finalmente se suman estos valores y se divide por el número

de observaciones. Estos resultados se suman y se promedia por el número de conejos,

obteniéndose entonces el valor de índice de irritación primaria por sustancia evaluada en

piel normal y abrasionada.

Categorías de irritación en piel de conejo

Valor de P I I Categoría

0-0,4 Irritación imperceptible

O,5-1,9 Irritación leve

2-4,9 Irritación moderada

5-8 Irritación severa

Donde PII es primary irritation index.

- 69 -

Anexo V

Tablas estadísticas de la evaluación de la actividad antiinflamtoria

frente a TPA

Evaluación actividad antiinflamatoria tópica frente a TPA : Extracto estandarizado murtilla

Dosis: 3 mg/ 20 uL/ oreja en acetona Fecha: 28/07/2006

MUESTRA CONTROLES

Ratón O.derecha O izquierda (Od-Oi) %

INF % EAI Ranking O derecha O izquierda (Od-Oi) % Inflam. Ranking

1 0,0110 0,0099 0,0011 11,1 89,2 1,0 0,0119 0,0085 0,0034 40,0 5

2 0,0127 0,011 0,0017 15,5 83,3 2,0 0,0129 0,0079 0,0050 63,3 8,5

3 0,0111 0,0083 0,0028 33,7 72,4 3,0 0,0131 0,0069 0,0062 89,9 10

4 0,0155 0,0124 0,0031 25,0 69,5 4,0 0,0147 0,0078 0,0069 88,5 11

5 0,0131 0,0091 0,0040 44,0 60,6 6,0 0,0145 0,0075 0,0070 93,3 12

6 0,0143 0,0102 0,0041 40,2 59,6 7,0 0,0168 0,0086 0,0082 95,3 14

7 0,0155 0,0105 0,0050 47,6 50,7 8,5 0,0168 0,0074 0,0094 127,0 15

8 0,0165 0,0085 0,0080 94,1 21,2 13,0 0,0179 0,0078 0,0101 129,5 16

9 0,0181 0,0079 0,0102 129,1 17

10 0,0189 0,0086 0,0103 119,8 18

11 0,0210 0,0106 0,0104 98,1 19

12 0,0217 0,0075 0,0142 189,3 20,5

13 0,0239 0,0097 0,0142 146,4 20,5

14 0,0221 0,0073 0,0148 202,7 22

15 0,0264 0,0093 0,0171 183,9 23

16 0,0272 0,0096 0,0176 183,3 24

n 8 8 8 8 8 M 16 16 16 16

promedio 0,0130 0,0102 0,0037 38,9 63,3 0,0186 0,0083 0,0103 123,7

mediana 0,0137 0,0101 0,0036 37,0 65,0 0,0180 0,0079 0,0102 123,4

Desv. Std 0,0021 0,0014 0,0021 25,9 21,2 0,0047 0,0010 0,0042 47,4

SEM 0,0007 0,0005 0,0008 9,2 7,5 0,0012 0,0003 0,0011 11,9

W 44,5

% E con promedio 63,9

% E CON MEDIANA 65,0

mediana de controles 0,0102

mediana de muestra 0,0036 z = -3,40 Z = w-[n(m+n+1)/2]/RAIZ[m*n(m+n+1)/12]

% E FINAL CON MEDIANA

65,0 p = 0,0003

- 70 -

Evaluación actividad antiinflamatoria tópica frente a TPA: gel de extracto estandarizado murtilla 5%

Dosis: 80 uL/oreja del gel Fecha: 28/07/2006

MUESTRA CONTROLES

Ratón O.derecha O izquierda (Od-Oi) % INF % EAI Ranking O derecha O izquierda (Od-Oi) % Inflam. Ranking

1 0,0089 0,0082 0,0007 8,5 92,8 1,0 0,0129 0,0079 0,0050 63,3 7

2 0,0095 0,0082 0,0013 15,9 86,7 2,0 0,0131 0,0069 0,0062 89,9 8

3 0,0100 0,0071 0,0029 40,8 70,3 3,0 0,0147 0,0078 0,0069 88,5 9

4 0,011 0,0075 0,0035 46,7 64,1 4,5 0,0145 0,0075 0,0070 93,3 10

5 0,0109 0,0074 0,0035 47,3 64,1 4,5 0,0168 0,0086 0,0082 95,3 12

6 0,0107 0,0069 0,0038 55,1 61,0 6,0 0,0189 0,0105 0,0084 80,0 13,5

7 0,0153 0,0080 0,0073 91,3 25,1 11,0 0,0189 0,0105 0,0084 80,0 13,5

8 0,0172 0,0072 0,0100 138,9 -2,6 16,0 0,0168 0,0074 0,0094 127,0 15

9 0,0179 0,0078 0,0101 129,5 17

10 0,0181 0,0079 0,0102 129,1 18

11 0,0210 0,0106 0,0104 98,1 19

12 0,0217 0,0075 0,0142 189,3 20,5

13 0,0239 0,0097 0,0142 146,4 20,5

14 0,0221 0,0073 0,0148 202,7 22

15 0,0264 0,0096 0,0168 175,0 23

16 0,0264 0,0093 0,0171 183,9 24

n 8 8 8 8 8 M 16 16 16 16

promedio 0,0102 0,0076 0,0041 55,6 57,7 0,0190 0,0086 0,0105 123,2

mediana 0,0108 0,0075 0,0035 47,0 64,1 0,0185 0,0079 0,0098 112,6

Desv. Std 0,0029 0,0005 0,0031 42,0 31,7 0,0043 0,0013 0,0038 44,4

SEM 0,0010 0,0002 0,0011 14,9 11,2 0,0011 0,0003 0,0010 11,1

W 48,0




mediana de muestra 0,0035


64,1

z = -3,18 Z = w-[n(m+n+1)/2]/RAIZ[m*n(m+n+1)/12]

p = 0,0007

- 71 -

Evaluación actividad antiinflamatoria tópica frente a TPA: crema anhidra de extracto estandarizado murtilla 5%

Dosis: 80 uL/oreja de la crema Fecha: 28/07/2006

MUESTRA CONTROLES

Ratón O.derecha O izquierda (Od-Oi) %

INF % EAI Ranking O derecha O izquierda (Od-Oi) % Inflam. Ranking

1 0,0096 0,0094 0,0002 2,1 97,9 1,0 0,0129 0,0079 0,0050 63,3 6

2 0,0101 0,0088 0,0013 14,8 86,7 2,0 0,0131 0,0069 0,0062 89,9 7

3 0,0114 0,0086 0,0028 32,6 71,3 3,0 0,0147 0,0078 0,0069 88,5 8

4 0,011 0,0078 0,0032 41,0 67,2 4,5 0,0145 0,0075 0,0070 93,3 9,5

5 0,0127 0,0095 0,0032 33,7 67,2 4,5 0,0168 0,0086 0,0082 95,3 11

6 0,0146 0,0076 0,0070 92,1 28,2 9,5 0,0189 0,0105 0,0084 80,0 12,5

7 0,0189 0,0105 0,0084 80,0 12,5

8 0,0168 0,0074 0,0094 127,0 14

9 0,0179 0,0078 0,0101 129,5 15

10 0,0181 0,0079 0,0102 129,1 16

11 0,0210 0,0106 0,0104 98,1 17

12 0,0217 0,0075 0,0142 189,3 18,5

13 0,0239 0,0097 0,0142 146,4 18,5

14 0,0221 0,0073 0,0148 202,7 20

15 0,0264 0,0096 0,0168 175,0 21

16 0,0264 0,0093 0,0171 183,9 22

n 6 6 6 6 6 M 16 16 16 16

promedio 0,0116 0,0086 0,0030 36,0 69,7 0,0190 0,0086 0,0105 123,2

mediana 0,0112 0,0087 0,0030 33,1 69,2 0,0185 0,0079 0,0098 112,6

Desv. Std 0,0018 0,0008 0,0023 30,9 23,8 0,0043 0,0013 0,0038 44,4

SEM 0,0007 0,0003 0,0009 12,6 9,7 0,0011 0,0003 0,0010 11,1

W 24,5




mediana de muestra 0,0030


69,2

z = -3,28 Z = w-[n(m+n+1)/2]/RAIZ[m*n(m+n+1)/12]

p = 0,0005

- 72 -

Anexo VI: Presentación en primer simposio de farmacología de

productos naturales y BLACPMA.

Resumen:En el extracto de acetato de etilo de murtilla, los compuestos activos son ácidos

triterpenos pentaciclícos 2-α-hidroxi como los ácidos asiático, corosólico y alfitólico. Estos

triterpenos están en mayor proporción en las hojas recolectadas en otoño, en cambio, la

cuantificación de estos triterpenos en las hojas recolectadas en invierno, mostró un menor

porcentaje de estos triterpenos.

Conclusiones: De los resultados de este estudio, se concluye que es muy importante estandarizar

química y farmacológicamente un extracto activo, para el desarrollo de un producto

farmacéutico con efectos analgésicos y antiinflamatorios de máxima eficacia.

desarrollo de un producto dermatológico

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