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DEFICIENCIA DE ADHESION LEUCOCITARIA BOVINA (BLAD)

Trabajo presentado por Manuel Felez en la asignatura de Biotecnología aplicada a la patología molecular Profesora coordinadora : Pilar Zaragoza Fernández Índice: Descubrimiento e importancia de la enfermedad...............2 Síntomas y lesiones............................................................2 Base genético-fisiológica de la enfermedad.......................3 Diagnóstico de la enfermedad............................................7 Tratamiento de la enfermedad..........................................10 Bibliografía.......................................................................10

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B.L.A.D. Descubrimiento e importancia de la enfermedad

La deficiencia de adhesión leucocitaria bovina, más conocida como BLAD

(bovine leuckocyte adhesion deficiency) es una granulocitopatía bovina que fue descrita por primera vez en una vaquilla Holstein Friesian por Hagemoser et al. (1983) en EEUU. Esta patología se caracterizó por una susceptibilidad aumentada a la acción de agentes infecciosos durante los dos años de vida del animal. Estos autores documentaron en el animal estudiado una función alterada de los neutrófilos. Pese a una alta neutrofilia era incapaz de iniciar una respuesta inflamatoria. Posteriormente Nagahata et al. (1987) describieron en Japón una enfermedad similar, caracterizada por un síndrome granulocitopático, que afectó a terneros y vaquillas Holstein Friesian descendientes de ganado proveniente de EE.UU.

El BLAD es una grave enfermedad desde el punto de vista económico. Esta

enfermedad genética ha llegado a causar por sí sola tan grandes pérdidas económicas, que la declaración de los heterocigotos destinados a la reproducción es de obligado cumplimiento. Afecta fundamentalmente a la raza Holstein Friesian, la raza lechera más productiva a nivel mundial.

También se han descrito enfermedades similares en otras especies. En humanos

se llama LAD (deficiencia de adhesión leucocitaria), y el CLAD observado en los perros de la raza Setter irlandés también presentan síntomas muy parecidos.

Síntomas y lesiones

Los síntomas de esta enfermedad no se manifiestan hasta el séptimo día después

del nacimiento. Hasta entonces, los terneros pueden parecer totalmente sanos, pero tras la primera semana de vida, comienzan los siguientes síntomas y lesiones:

- Anorexia, caquexia y retrasos en el crecimiento - Infecciones bacterianas continuas y fiebre elevada - Dermatitis, úlceras de decúbito y alopecias - Neutrofilia progresiva y muy temprana en el curso de la

enfermedad - Neumonía crónica - Hipertrofia de los ganglios linfáticos superficiales - Úlceras e inflamaciones granulomatosas de las membranas

mucosas orales y gingivitis - Diarrea crónica recurrente - Muerte alrededor de las siete semanas, aunque en algunos casos

pueden sobrevivir durante meses Tras la muerte, en la necropsia a nivel macroscópico se puede observar lo

siguiente: - Adenitis y necrosis de ganglios linfáticos en la mayoría de las

vísceras, particularmente en el mesenterio - Pielonefritis granulomatosa - Serositis en rumen

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- Mucosa necrosada en íleon, con hiperplasia de folículos linfoides, e infiltración de células plasmáticas, linfocitos y macrófagos

- Edema en las áreas paracorticales del encéfalo - Congestión esplénica y calcificaciones en el estroma y vasos

esplénicos Y profundizando un poco más, a nivel microscópico, hallaríamos:

- Ausencia de neutrófilos en la lámina propia de tejidos inflamados - Macrófagos con estructuras citoplásmicas con restos bacterianos - Hiperplasia mieloide granulocítica - En los vasos sanguíneos del hígado, riñón, corazón, pulmón,

glándulas salivares, abomaso y encéfalo aparece una marcada leucocitosis neutrofílica

- Marcada retención neutrofílica en el bazo

Base genético-fisiológica de la enfermedad Para comprender un poco el mecanismo de esta enfermedad, deberemos recordar

algunos mecanismos fisiológicos vistos en otras asignaturas. Cuando un tejido del organismo de un vertebrado sufre alguna infección o

lesión, se produce una inflamación para combatir el agente causal del daño, si lo hubiese, y para reparar el tejido afectado.

Por un lado, se produce una vasodilatación, con aumento de la permeabilidad

capilar, lo que supone que entre al tejido fluido rico en complemento, inmunoglobulinas, y otras proteínas séricas.

También se origina una coagulación sanguínea local: las células endoteliales son inducidas a expresar moléculas que desencadenan la cascada enzimática de coagulación sanguínea, de modo que los capilares quedan ocluidos. Esto es importante como mecanismo para evitar que el microorganismo entre a circulación y se disemine a todo el cuerpo.

Mientras tanto, el fluido que se ha vertido al espacio tisular desde el plasma transporta al patógeno, bien solo o englobado por células fagocíticas y presentadoras de antígeno, por la linfa hasta los ganglios linfáticos regionales, donde se va a iniciar la respuesta inmune específica.

Por otro lado, el endotelio produce moléculas de adhesión celular. Ello hace que aumente la capacidad de los leucocitos polimorfonucleados (fundamentalmente neutrófilos) y de los monocitos a adherirse a dicho endotelio, lo que les llevará a la extravasación (paso al tejido inflamado). Una vez fuera del vaso, dichas células fagocíticas migran bajo el estímulo de las citoquinas quimioatrayentes, hasta que llegan al foco de la infección.

La extravasación de los leucocitos ocurre en cuatro fases:

- Fase de rodamiento: los leucocitos primero interactúan de modo débil con las células endoteliales (van "rodando" de una célula a otra). Esta primera interacción se debe a contactos entre carbohidratos de glucoproteínas del leucocito (como la s-LeX) y la E-selectina de las células endoteliales, inducida por el TNF-α.

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- Adhesión más fuerte, debida ahora a interacciones entre las moléculas de ICAM-1 también inducidas por el TNF-a en el endotelio y moléculas de integrinas del leucocito (como la LFA-1). Lo interesante aquí es resaltar que normalmente la interacción entre ICAM-1 y LFA-1 es débil, pero que la IL-8 secretada por macrófagos tisulares cercanos al endotelio induce un cambio conformacional en la LFA-1 del fagocito circulante que aumenta enormemente su afinidad hacia la ICAM-1.

- Diapédesis: el fagocito pasa entre dos células endoteliales, y entra al tejido.

- Migración del leucocito fagocítico hasta el lugar de infección bajo el influjo de citoquinas quimioatrayentes.

Aunque aparentemente sencillo, éste es un proceso complejo cuya eficacia

depende de numerosos factores. En primer lugar, debe haber leucocitos. Los leucocitos tienen que ser “llamados” mediante unas señales químicas que previamente han tenido que producir otras células, y éstos han de ser capaces de detectar dicho estímulo. Después, se tienen que adherir a la pared del vaso y realizar la diapédesis. Una vez fuera del vaso, deben migrar al lugar donde se encuentra la infección y ser capaces de combatirla. Un fallo en cualquiera de estos pasos y el proceso de la inflamación se podría ver drásticamente alterado. En el caso de esta enfermedad, el paso que falla es la adhesión al endotelio vascular.

Las responsables de las adhesiones entre las células son unas glicoproteínas

llamadas “moléculas de adhesión celular”. Estas moléculas se dividen en 5 familias: cadherinas, super gen inmunoglobulinas, selectinas, proteoglicano, e integrinas. Un defecto en una proteína de esta última familia es el causante del BLAD.

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Las integrinas son unas proteínas heterodiméricas transmembrana formadas por dos cadenas polipeptídicas unidas no covalentemente. Se unen a diferentes ligandos y transmiten señales a través del citoesqueleto. Estas moléculas son receptoras de matriz y son expresadas en una variedad de células hematopoyéticas y no hematopoyéticas. Su expresión se regula por la diferenciación celular y por el estímulo inflamatorio, y éstas modulan funciones celulares específicas:

- Crecimiento - Maduración - Migración - Proliferación - Citotoxicidad - Fagocitosis

De toda la familia de las integrinas, el grupo de moléculas cuya alteración

originarían el BLAD son las β-2-integrinas (Leu-CAM o CD11/CD18), que sólo se expresan en leucocitos. Éstas intervienen en:

- Funciones leucocitarias - Quimiotaxis de fagocitos - Adhesión de leucocitos a sustratos - Fagocitosis de microorganismos opsonizados - Adhesión leucocitaria al endotelio activado

Cada una de estas moléculas contiene dos subunidades, α y β, asociadas no

covalentemente, con una estructura α1β1. Todas estas glicoproteínas comparten una subunidad β idéntica (CD18) y se distinguen inmunológicamente por su subunidad α, designada CD11a, CD11b y CD11c, para LFA-1α, Mac-1α y p150.95α, respectivamente.

El BLAD se debe a un defecto de la expresión de la proteína CD18, por una

secuencia anormal del gen, que origina la falta de la subunidad α en una integrina β2 de las membranas de los neutrófilos aislados de animales enfermos.

Al realizar la secuenciación de la proteína CD18 se observa que en el alelo raro, aparecen dos puntos de mutación, una silenciosa y una transición que origina la sustitución de una adenina por una guanina. Los textos no coinciden en el lugar exacto del cambio de base en el que sucede dicha mutación, aunque todos coinciden que es en el aminoácido 128 de la secuencia de la proteína donde repercute la mutación, originando el cambio de una glicina por el ácido aspártico.

Se trata de una mutación autosómica recesiva (no he encontrado el cromosoma

donde sucede) que cumple perfectamente las leyes mendelianas al tener una penetrancia y expresividad completas. Así que si cruzásemos un animal sano con otro portador, la mitad de la descendencia sería sana y la otra mitad portadora, por lo que se podría controlar la enfermedad dirigiendo bien los cruces entre portadores. Sin embargo, si llegasen a cruzarse dos portadores, el 25% de la descendencia manifestaría la enfermedad y moriría. El hecho de intentar controlar los cruces siempre es un riesgo de que una línea reproductora pueda originar casi la mitad de los portadores de una cabaña, como sucedió en Estados Unidos a mediados de los noventa con la descendencia de C.M Ivanhoe Bell.

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Diagnóstico de la enfermedad

Para realizar el diagnóstico de enfermos y portadores, la técnica de la reacción

en cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki et al., 1988) acoplada a la digestión con enzimas de restricción (RFLP) ha demostrado que identifica inequívocamente el genotipo del ganado en un locus determinado (Kehrli et al., 1990; Shuster et al., 1992; Tammen et al., 1996; Felmer y Butendieck, 1996).

En primer lugar, se deberá proceder a la toma de muestras. Podremos optar entre

coger una muestra de sangre, de semen, o de leche, dependiendo del estado del animal. Si tomásemos muestra de sangre, la obtendríamos de la vena coccígea. La sangre debería ser entera, por lo que tendríamos que añadir EDTA como coagulante, ya que el citrato sódico o la heparina ejercen un efecto indeseable para el ADN a la hora de amplificarlo. El semen lo obtendríamos directamente de alguna de las pajuelas de inseminación que se hubiesen preparado del animal. También se podría tomar muestra de leche de una vaca en lactación. En este caso deberíamos coger dos muestras: una para la posterior extracción de ADN, utilizando bicromato potásico como conservante, y otra muestra para enviarla al laboratorio de referencia, conservada con bronopol, para conocer los distintos parámetros de composición de la leche de cada individuo, especialmente del número de células somáticas.

Una vez obtenidas las muestras, extraeremos el ADN de ellas. A partir de una

muestra de sangre, tendremos dos métodos de extracción: el método “standard” y el método “rápido”. El método “standard” se basa en seguir una serie de centrifugaciones y agitaciones que aíslen los leucocitos y dañen su membrana para posteriormente

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extraer su ADN con lavados de alcohol etílico y resuspendiendo en tampón T.E. En el método “rápido”, diseñado por OSTA y cols., (1994), se realizan sucesivos lavados con tampón N.E. con centrifugaciones tras cada lavado. Cuando tenemos los leucocitos disgregados, digerimos el precipitado con el alcohol y lo conservamos a muy bajas temperaturas. Cuando lo descongelemos para utilizar ese ADN, deberemos hacerlo a temperaturas próximas a 0ºC.

Si la muestra la tomamos de semen, existen tres métodos de extracción de ADN:

método “standard”, método “rápido” A y método “rápido” B. El método “standard” es muy similar al citado anteriormente para la sangre, con la particularidad de que trabajaremos con tubos que tengan las paredes siliconadas para que no perdamos los espermatozoides en el proceso. En el método “rápido” A, la muestra se lava y centrífuga con NaCl y después se resuspende en una solución de NaOH y DITHIOTREITOL para luego someterla a 100ºC durante 10 minutos. Una vez hecho esto, se resuspende en tampón TrisClH para neutralizar la muestra, y se recoge el sobrenadante. El método “rápido” B, como el método “rápido” de la muestra de sangre, también estaría destinado para conservar en congelación.

En el caso de que la muestra sea de leche, sólo existe el método “rápido”. En

este caso, se comienza centrifugando la muestra para eliminar la grasa y el suero y quedarnos con las células. Luego se efectúan los lavados con el tampón, se resuspende en una solución de digestión a temperaturas muy bajas y una vez digerida se sube la temperatura a 99ºC para inactivar la proteinasa K. Finalmente, se vuelve a congelar a temperaturas bajo cero para su conservación.

Una vez extraído el ADN, se amplifica in vitro mediante PCR. Para ello

utilizaremos agua pura, tampón de Taq polimerasa, Cl2Mg, los dNTP’s, la Taq DNA polimerasa, y los cebadores. En este caso, las secuencias de los cebadores, en dirección 5’-3’, serán las siguientes:

5’ TCCGGAGGGCCAAGGGCTA 3’ 5’ GAGTAGGAGAGGTCCATCAGGTAGTACAGG 3’ Tampoco olvidaremos añadir unas gotas de aceite mineral para evitar la

evaporación de la muestra. El proceso se iniciará con una temperatura de unos 94ºC para la desnaturalización del ADN, y luego cada ciclo estará formado por tres fases: desnaturalización (94ºC 30 segundos), hibridación (56ºC 60 segundos) y extensión (72ºC 30 segundos). Una vez realizados los ciclos deseados, se reducirá la temperatura a 4ºC hasta que se extraigan los tubos del termociclador, para conservar el material amplificado.

Finalmente, realizaremos la digestión del producto realizado y la visualización

de los resultados. En este caso, para diferenciar las variantes alélicas, se utilizan dos enzimas de restricción: Taq I y Hae III. Taq I reconoce en el alelo normal la secuencia que contiene la base que puede mutar y sólo cortará cuando el alelo no esté mutado. Por ello, en el homocigoto normal aparecerán 2 bandas en la electroforesis posterior, 3 aparecerán en el heterocigoto, y una en el homocigoto mutado. En el caso de Hae III, tiene 2 puntos de unión. Uno es la secuencia en la que se produce la mutación y, a diferencia de Taq I, cortará cuando tenga lugar el cambio de base. En la otra secuencia reconocida por Hae III (que es la misma secuencia que la de la mutación, sólo que en otro lado del gen), como es una zona estable, cortará prácticamente siempre por ahí. De

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este modo, en el homocigoto normal aparecerán 2 bandas, en el heterocigoto aparecerán 4 y en el homocigoto mutante aparecerán 3.

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Tratamiento de la enfermedad

La enfermedad en sí, a nivel individual no se puede curar; sin embargo, sí se podría prevenir en la población, haciendo una selección negativa contra el alelo defectuoso. Si un individuo destinado a la reproducción es portador de BLAD, el propietario está obligado a declararlo. Aun así, no es tan fácil erradicar dicha enfermedad, puesto que los individuos que la portan han sido muy seleccionados y son muy productivos, por lo que mientras quepa la posibilidad de intentar dirigir los cruces para no tener homocigotos enfermos, los propietarios anteponen la rentabilidad de su ganado.

Bibliografía: · FELMER D., Ricardo, BUTENDIECK B., Norberto, BUTENDIECK B., Bárbara et al. DETECCIÓN DE UN DEFECTO GENÉTICO EN BOVINOS MEDIANTE UNA PRUEBA DE ADN. Agric. Téc. [online]. ene. 2001, vol.61, no.1 [citado 10 Mayo 2007], p.42-50. Disponible en la World Wide Web: <http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0365-28072001000100005&lng=es&nrm=iso>. ISSN 0365-2807. · Arch. Zootec. 49: 505-508. 2000 OBTENCIÓN DE DNA PARA EL ESTUDIO DE BLAD EN TOROS DE ARGENTINA Y ESPAÑA Schifferli, C.2, M. Villaroel1, M.V. Arruga1, ·Moléculas Adhesión. T.M. MsC Juan Luis Castillo N. Departamento de Especialidades Médicas Facultad de Medicina Universidad de Concepción http://www.inflamacion.co.cl/pdf/adhesion.pdf · Curso de Inmunología General Enrique Iánez Pareja Departamento de Microbiología Universidad de Granada http://66.102.9.104/search?q=cache:jNNLcW6zttkJ:www.ugr.es/~eianez/inmuno/cap_17.htm+fases+de+la+extravasaci%C3%B3n+de+neutr%C3%B3filos+diap%C3%A9desis&hl=es&ct=clnk&cd=1&gl=es · “DETECCIÓN DE PORTADORES DE ENFERMEDADES HEREDITARIAS MEDIANTE BIOTECNOLOGÍA GENÉTICA. APLICACIÓN A UN EJEMPLO CONCRETO: BLAD (DEFICIENCIA DE ADHESIÓN LEUCOCITARIA BOVINA)” Memoria presentada por D. Francisco José Vázquez Bringas para optar al grado de Licenciado en Veterinaria. Zaragoza. 1994