dedicatoria - 148.206.53.84148.206.53.84/tesiuami/uami16061.pdf · recubrimientos a prueba de...
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DEDICATORIA
Dedico este trabajo de Titulación, principalmente a Dios porque me permitió culminar
mis estudios a pesar de todos los……………………………………………………………………………….obstáculos
surgidos durante este largo tiempo y al fin terminar mi carrera.
También quiero dedicárselos con todo mi amor y cariño a mi Mamá, a yiyi (mi segunda
Mamá), a mi hermana (mucs), por estar siempre conmigo en las buenas y en las malas, por su
apoyo incondicional y paciencia durante este largo camino. Las Amo y espero regresarles un
poco de lo mucho que me han dado. También se lo dedico a payis por el tiempo que estuvo
conmigo acompañándome en el D. F.
También quiero dar las gracias a todas las personas que me ayudaron a concluir este
trabajo.
Al Dr. Juan Morales Corona. Por haberme dado este proyecto y por su apoyo durante el
desarrollo de este mismo.
Todo tiene su tiempo, y todo lo que se quiere debajo del cielo tiene su hora. Eclesiastés 3:1.
Fin.
3
AGRADECIMIENTOS
Los autores agraden al Instituto de Ciencia y Tecnología del D. F., ICyT-DF, por el apoyo parcial a través del
proyecto PICSA11-14/2011.
Los autores también agradecen al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, CONACyT, por el apoyo parcial
brindado a través del proyecto CONACyT-155239 para la realización del presente trabajo.
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LISTA DE ILUSTRACIONES
ILUSTRACIÓN 1. PRIMER DISEÑO DE FUENTE DE ESTIMULACIÓN ELÉCTRICA. ...................................................... 14
ILUSTRACIÓN 2. SEGUNDO DISEÑO DE FUENTE . .......................................................................................... 15
ILUSTRACIÓN 3. ENSAMBLE DEL PPY-I CON LAS CONEXIONES ELÉCTRICAS PARA PRUEBAS DE CONDUCCIÓN. ............ 16
ILUSTRACIÓN 4. CIRCUITO UTILIZADO PARA OBTENER LAS CURVAS CARACTERÍSTICAS I VS V DE LA PELÍCULA DE PPY-I. 17
ILUSTRACIÓN 5. CURVA CARACTERÍSTICA CORRIENTE-VOLTAJE (I VS V) . .......................................................... 18
ILUSTRACIÓN 6. CURVA CARACTERÍSTICA CORRIENTE-VOLTAJE (I VS V) . .......................................................... 18
ILUSTRACIÓN 7. CURVA CARACTERÍSTICA CORRIENTE-VOLTAJE (I VS V) . .......................................................... 19
ILUSTRACIÓN 8. CURVA CARACTERÍSTICA CORRIENTE-VOLTAJE (I VS V) . .......................................................... 19
ILUSTRACIÓN 9. PORTAOBJETOS DE VIDRIO RECUBIERTOS CON PPY-I PARA LA ESTIMULACIÓN ELÉCTRICA DE HEPG2 21
ILUSTRACIÓN 10. CIRCUITO DE ESTIMULACIÓN ELÉCTRICA USADO CON LAS HEPG2. ........................................... 24
ILUSTRACIÓN 11. IMÁGENES CON LOS VALORES OBTENIDOS CON RESISTENCIA DE CARGA 10KΩ. .......................... 26
ILUSTRACIÓN 12. PUNTOS DONDE SE REALIZAN LAS MEDICIONES PARA DETERMINAR LA CORRIENTE APLICADA. ........ 26
ILUSTRACIÓN 13. IMÁGENES DE VALORES OBTENIDOS EN LOS PUNTOS DE PRUEBA (P1) Y (P2). ........................... 27
ILUSTRACIÓN 14. IMÁGENES CON LOS VALORES MEDIDOS CON RESISTENCIA DE CARGA 10KΩ. ............................. 28
ILUSTRACIÓN 15. IMÁGENES CON LOS VALORES MEDIDOS CON POLÍMERO DE PRUEBA. ....................................... 29
ILUSTRACIÓN 16. POLÍMERO CONECTADO AL INYECTOR DE CORRIENTE. ........................................................... 30
ILUSTRACIÓN 17. OSCILOSCOPIO CONECTADO EN PARALELO CON EL POLÍMERO PARA MEDIR SU VOLTAJE. .............. 31
ILUSTRACIÓN 18. CAJAS DE PETRI PREPARADAS CON EL SUBSTRATO DE PPY-I Y CON CÉLULAS HEPG2. ................... 32
ILUSTRACIÓN 19. CAJA DE PETRI PREPARADAS CON EL SUBSTRATO DE PPY-I Y CON CÉLULAS HEPG2. .................... 33
ILUSTRACIÓN 20. INYECTORES DE CORRIENTE ELÉCTRICA. ............................................................................. 33
ILUSTRACIÓN 21. MUESTRAS DE CONTROL. ............................................................................................... 34
ILUSTRACIÓN 22. MUESTRAS ESTIMULADAS DURANTE 15 MIN DIARIOS. .......................................................... 35
ILUSTRACIÓN 23. MUESTRAS ESTIMULADAS DURANTE 30 MIN DIARIOS. .......................................................... 36
ILUSTRACIÓN 24. MUESTRAS ESTIMULADAS DURANTE 45 MIN DIARIOS. .......................................................... 37
ILUSTRACIÓN 25. MUESTRAS ESTIMULADAS DURANTE 60 MIN DIARIOS. .......................................................... 38
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LISTA DE TABLAS
TABLA 1. RESISTENCIA CALCULADA EN LAS PRUEBAS. ................................................................................... 20
TABLA 2. TIEMPO DE ESTIMULACIÓN PARA CADA MUESTRA. .......................................................................... 22
TABLA 3. VALORES OBTENIDOS EN LAS MEDICIONES CON RESISTENCIA DE PRUEBA 10KΩ. ................................... 25
TABLA 4. VALORES OBTENIDOS EN PUNTOS DE PRUEBA P1 Y P2. ................................................................... 27
TABLA 5. VALORES OBTENIDOS EN LAS MEDICIONES CON RESISTENCIA DE PRUEBA 100KΩ. ................................. 28
TABLA 6. VALORES DE VOLTAJE MEDIDOS EN LOS PUNTOS (P1) Y (P2). ........................................................... 28
TABLA 7. VALORES OBTENIDOS EN LAS MEDICIONES CON POLÍMERO DE PRUEBA. ............................................... 29
TABLA 8. VALORES OBTENIDOS EN LOS PUNTOS (P1) Y (P2). ........................................................................ 30
TABLA 9. VALORES DE CORRIENTE CON LAS DISTINTAS PRUEBAS DE CARGA. ...................................................... 31
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INDICE GENERAL
DEDICATORIA ...................................................................................................................................................................................... 2
AGRADECIMIENTOS ............................................................................................................................................................................. 3
LISTA DE ILUSTRACIONES ..................................................................................................................................................................... 4
LISTA DE TABLAS .................................................................................................................................................................................. 5
INDICE GENERAL .................................................................................................................................................................................. 6
INTRODUCCION ................................................................................................................................................................................... 7
ANTECEDENTES.................................................................................................................................................................................. 12
HIPOTESIS. ......................................................................................................................................................................................... 13
DISEÑO DE FUENTES DE ESTIMULACIÓN ELÉCTRICA. ......................................................................................................................... 13
PRUEBA FUENTE DE ESTIMULACION ...................................................................................................................................................... 16
ELABORACION DE MUESTRAS. ........................................................................................................................................................... 21
PROTOCOLO DE EXPERIMENTO ......................................................................................................................................................... 22
DISEÑO ELECTRONICO Y PRUEBAS ..................................................................................................................................................... 23
PRUEBA 10KΩ. .......................................................................................................................................................................................... 25
PRUEBA 100KΩ. ........................................................................................................................................................................................ 28
PRUEBA CON POLÍMERO............................................................................................................................................................................... 29
DESARROLLO DEL EXPERIMENTO ....................................................................................................................................................... 32
RESULTADOS ..................................................................................................................................................................................... 34
MUESTRA CONTROL. ................................................................................................................................................................................... 34
MUESTRA ESTIMULADA 15 MIN. ................................................................................................................................................................... 35
MUESTRA ESTIMULADA 45 MIN. ................................................................................................................................................................... 37
MUESTRA ESTIMULADA 60 MIN. ................................................................................................................................................................... 38
CONCLUSIONES ................................................................................................................................................................................. 39
BIBLIOGRAFIA .................................................................................................................................................................................... 41
ANEXO 1 TRABAJO PRESENTADO EN MACROMEX 2011 .................................................................................................................... 42
MULTI-WELL ELECTRICAL CELL CULTURE ............................................................................................................................................... 42
ANEXO 2 TRABAJO PRESENTADO EN XXV CONGRESO NACIONAL DE POLIMEROS. ............................................................................ 48
INFLUENCIA DE LA CORRIENTE ELECTRICA SOBRE EL CRECIMIENTO CELULAR DE HEPATOCITOS SOBRE
POLIPIRROL SINTETIZADO POR PLASMA. ................................................................................................................................... 48
ANEXO 3 TRABAJO PRESENTADO EN XXV CONGRESO NACIONAL DE POLIMEROS. ............................................................................ 57
CELDA DE ELECTROCULTIVO CELULAR ..................................................................................................................................... 57
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INTRODUCCION
En los últimos años, la técnica de Polimerización por plasma ha ganando importancia por ser una
herramienta útil para modificar las propiedades de superficie de diferentes materiales. La polimerización por
plasma se usa para producir películas delgadas de polímeros orgánicos los cuales son difíciles de polimerizar
bajo condiciones químicas. El proceso de polimerización por plasma involucra el impacto de electrones con alta
energía cinética que pueden lograr la disociación y ionización de átomos y moléculas lo cual crea un ambiente
químico muy reactivo para llevar a cabo diferentes reacciones químicas de polimerización.
Las aplicaciones de películas de polímeros sintetizados por plasma incluyen recubrimientos
anticorrosivos, sensores de humedad, resistencias eléctricas, filtros ópticos, revestimientos protectores,
recubrimientos de barrera química, etc. Superficies metálicas de materiales sintéticos pueden ser protegidas
contra corrosión con una capa delgada de polímero depositada por medio de polimerización por plasma. El
proceso puede ser personalizado para producir películas de tipo hidrofóbico o hidrofílico (efecto antiniebla).
Recubrimientos a prueba de rayones han sido utilizados con éxito en lentes ópticos, pero en objetos de tres
dimensiones, tales como reflectores para automóvil y alumbrado industrial es difícil por el hecho que la
potencia de entrada no puede ser uniforme sobre toda la superficie del substrato durante el proceso de
polimerización.
La polimerización por plasma se realiza a baja presión, el plasma es producido por una descarga
luminiscente por medio de un gas orgánico o vapor y depende del flujo del monómero, de la presión y descarga
de energía entre otros parámetros tal como la geometría del sistema, la reactividad del monómero, frecuencia
de la señal de excitación y temperatura del substrato.
Toda la potencia de entrada en polimerización por plasma es usada para dos cosas: para la creación de
plasma y fragmentación del monómero. El plasma es la consecuencia directa de la ionización del gas presente
en el reactor. A medida que aumenta el voltaje de entrada aplicado a los dos electrodos en paralelo, un abrupto
aumento de corriente implica la ruptura del gas entre los dos electrodos.
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Electrones de alta energía chocan con moléculas de hidrocarburo para producir iones positivos, C+, CH+,
CH2+ etc., moléculas excitadas o fragmentos de átomos, radicales, nuevos compuestos, etc. Iones positivos son
acelerados hacia el cátodo produciendo la emisión de electrones secundarios. Átomos excitados emiten
fotones y crean brillo o luz, los iones positivos fluyen hacia el cátodo y crean el brillo más intenso en el reactor .
La columna positiva (espacio entre cátodo y ánodo) contiene electrones, iones y radicales, y es
eléctricamente neutra. Esto es plasma pero la mayoría de las personas lo llaman descarga luminiscente o
descarga de resplandor. El mayor depósito de polímero sucede sobre la superficie que hace contacto con el
brillo o luz. Aunque no todas las descargas luminiscentes producen depósito de polímero. El plasma de Ar, Ne,
O2, N2 son no poliméricas (no formadoras de polímero) aunque la formación de estas puede ser utilizada para
mantener el brillo en la cámara de vacío mientras el vapor del polímero es usado de manera eficiente para la
conversión de polímeros.
Aunque la polimerización por plasma sucede predominantemente en la región luminiscente, el volumen
del brillo no siempre es igual al volumen del reactor. Ambos, volumen de descarga luminiscente y la intensidad
de la luminiscencia dependen del modo de descarga, la energía de la descarga y la presión del sistema. Bajo las
condiciones de plasma, las moléculas de monómero experimentan fragmentación y reaccionan entre ellas para
formar las cadenas de polímero. El polímero sintetizado vía plasma no contiene unidades que se repiten, las
cadenas son ramificadas y terminadas con un alto grado de entrecruzamiento de manera aleatoria. Ellos se
adhieren bien a superficies sólidas.
Reacciones químicas que ocurren bajo las condiciones de plasma son generalmente muy complejas. La
polimerización de compuestos orgánicos procede de los radicales libres y el grado de ionización es pequeño. La
combinación y recombinación de estos radicales libres forma compuestos con alto peso molecular. Los
radicales libres son atrapados en estas películas que continúan reaccionando y cambiando la red del polímero
con el tiempo. Ya que los radicales son formados por la fragmentación del monómero algunos elementos y
grupos pueden estar ausentes en el polímero resultante.
El grado de fragmentación depende de la densidad de electrones o potencia de entrada y del flujo del
monómero. La reacción de interconexión sucede en la superficie o en la mayor parte de la nueva formación de
polímero por plasma. La película puede cambiar debido a la reacción con oxigeno y el vapor de agua de la
atmósfera.
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El depósito de polímero es linealmente dependiente de la densidad de corriente, la mínima potencia
necesaria para la polimerización por plasma de un monómero difiere de otro. Esto es debido a la descarga de
energía necesaria para iniciar la descarga luminiscente que varía de un polímero a otro. La interconexión en
polímeros sintetizados por plasma aumenta con la intensidad y energía de los iones. Si la distancia entre
electrodos es demasiado larga, entonces a cierta potencia aplicada, el campo eléctrico local en el plasma será
demasiado bajo para entregar suficiente energía a los electrones. Los electrones en el vacio viajan en línea
recta. Si existe un gas residual en la cámara, los átomos chocaran con el gas e irán en todas direcciones
perdiendo energía en forma de calor. A presiones altas el choque provocara que los átomos se condensen antes
de llegar a la superficie del substrato dando lugar a depósitos de polvo. [1]
Una de las aplicaciones de la polimerización por plasma de películas delgadas poliméricas es la
modificación de las propiedades superficiales de los substratos. Este tipo de modificación permite obtener
superficies que sean más biocompatibles y se tengan aplicaciones en el campo de los biomateriales. Estos
biomateriales proporcionan un sustrato para la adhesión celular y se pueden utilizar para conseguir un
suministro de células. Los biomateriales proporcionan soporte mecánico para diferentes tipos celulares en vivo,
manteniendo así una estructura predefinida durante el proceso de desarrollo del tejido. Los biomateriales se
puede cargar con señales bioactivas, tales como péptidos de adhesión celular y factores de crecimiento, que
pueden regular la función celular. El biomaterial debe ser capaz de controlar la estructura y función de la
ingeniería tejido en una forma prediseñada mediante la interacción con células trasplantadas o con las células
huésped. Generalmente, el biomaterial ideal debe ser biocompatible, promover la interacción celular y el
desarrollo del tejido, y poseer adecuadas propiedades mecánicas y físicas. [2]
Los polímeros por lo general no son conductores eléctricos, no tienen polaridad y no hay iones ni
electrones libres como en los metales. Sin embargo, tienen un grado de sensibilidad eléctrica y son buenos
aislantes eléctricos.
La conductividad eléctrica de los materiales es una propiedad que abarca una gama muy amplia que
puede juzgarse a partir de una tabla de conductividad, el subgrupo de los polímeros cae en los menos
conductores como el polietileno, politetrafluoroetileno y poliestireno conocidos como los mejores aislantes. Los
avances realizados en el desarrollo de polímeros conductores en los últimos treinta años del siglo veinte han
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logrado que los polímeros obtengan un carácter conductor para este subgrupo de materiales orgánicos como el
poliacetileno que puede obtenerse con un alto grado de conductividad eléctrica.
La conductividad en los polímeros conductores, aunque puede alcanzar valores metálicos (
>104 S/cm), es diferente de la conductividad metálica. En la mayoría de materiales poliméricos es difícil
observar cualquier conductividad eléctrica y si existe depende del movimiento ocasional de iones. Por
consiguiente cualquier mejora en la calidad de aislamiento es generalmente conseguida por una preparación y
purificación cuidadosa a fin de evitar tanto como sea posible la presencia de impurezas iónicas, incluyendo
residuos de catálisis, productos de oxidación y disociación de grupos finales. En los polímeros conductores ésta
sigue un proceso complejo que depende de la preparación y el dopado. Los polímeros conductores pueden
oxidarse o reducirse introduciendo iones negativos o positivos, o fotones. Estos métodos son llamados
dopado (electro) químico o fotodopado. El polímero se convierte así en conductor de electricidad. El cambio
de estado de los polímeros conductores debido al dopado puede tener varios efectos. Por ejemplo, el
estado electrónico cambia desde semiconductor a conductor, el color del polímero varía y también su
volumen. Se ha empleado el dopaje en diversos polímeros, como las polianilinas, polipirroles y politiofenos,
logrando nuevamente un aumento considerable de la conductividad eléctrica. Polvo conductivo de metal y
carbón negro se han utilizado para realizar materiales compuestos adecuados para usarlos en un número de
aplicaciones prácticas. [3]
En la literatura se encuentran reportes que indican que los polímeros sintetizados por plasma, como el
polipirrol y la polianilina, se pueden usar como biomateriales que permiten que diferentes tipos de células,
hepatocitos, osteoblastos, neuronal, se anclen, proliferen y se mantengan funcionales.
El cultivo primario de hepatocitos es un modelo in vitro ampliamente usado para investigar aspectos
físicos y patológicos del hígado. Tales cultivos han sido usados extensamente para evaluar el sentido y función
de enzimas metabolizadoras de drogas, metabolismo de drogas, interacción de droga-droga y mecanismos de
citotoxicidad y genotoxicidad. La mayoría de estos estudios se han realizado con hepatocitos de roedor.
Sin embargo debido a la especificidad de la especie la regulación y actividad de enzimas
metabolizadoras de drogas, la extrapolación de animales a humanos no es generalmente posible.
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Por esta razón, varios grupos han desarrollado sistemas de cultivo para hepatocitos. La técnica usada
para aislar hepatocitos humanos está basada en la técnica de perfusión de colagenasa de dos pasos introducida
por Berry y modificada por Seglen. Originalmente se realizo in situ para obtener hepatocitos de ratas adultas,
esta técnica de perfusión ha sido adaptada para el tratamiento ex vivo de tejido de hígado humano. El número
y calidad de hepatocitos aislados depende de la calidad del tejido usado, tipo y concentración de colagenasa.
[4]
Se han realizado estudios basados en polímeros conductores, los cuales actúan como una matriz donde
se cultivan las células deseadas, las cuales pueden ser nerviosas, epiteliales, de hueso y hepáticas. Una de las
ventajas más atractivas de utilizar polímeros conductores como biomaterial es la capacidad que tienen de ser
estimulados eléctricamente y permitir el crecimiento de células. El polipirrol es un polímero conductor que
muestra la capacidad de mantener y modular el crecimiento de células, el pirrol recubierto de PET se usa para
fabricar las prótesis vasculares ha mostrado reacción a tejidos que es comparable a la provocada por el PET de
control no recubierto. Estos resultados han resaltado el uso potencial del polipirrol en aplicaciones biomédicas
particularmente en ingeniería de tejidos.
Sin embargo es difícil utilizar polipirrol puro PPY in vivo porque generalmente es un material rígido y no
flexible, no procesable y no biodegradable. Se han realizados esfuerzos al impregnar pericardio porcino con
pirrol seguido de polimerización in situ pero el producto obtenido resulto ser no conductor.
Para usar el polipirrol se propuso un polímero conductor eléctrico biodegradable, este polímero
compuesto se preparo con poli (D,L-lactina)(PDLLA) o poli (glicólido)(PGA) y pirrol (PPy) para investigaciones in
vivo. En el estudio realizado se determina la estabilidad eléctrica in vivo y biodegradación del compuesto
conductor, se anticipo que los resultados serian de utilidad para comprender el comportamiento eléctrico así
como el mecánico involucrado en el deterioro de la conducción eléctrica en estos compuestos polímeros
particularmente en un ambiente biológico. [5]
12
ANTECEDENTES
En 1920 Ingvar realizó los primeros esfuerzos para demostrar el efecto de la corriente eléctrica en
cultivos de células nerviosas. Desde entonces se ha publicado una gran cantidad de literatura sobre la respuesta
in vivo e in vitro de células y tejido a campos eléctricos y electromagnéticos con particular énfasis en células
nerviosas, epiteliales y de hueso. [6]
La estimulación eléctrica es capaz de modificar la actividad celular tal como la migración celular,
adhesión celular, síntesis, ADN y secreción de proteínas. Esto hace a la estimulación eléctrica potencialmente
significativa en ingeniería de tejidos porque regula estas actividades celulares. En un andamio artificial es de
gran importancia controlar la regeneración de tejido dañado. Un andamio conductor por lo tanto puede ser
utilizado in vitro o in vivo para cultivar células que serán posteriormente estimuladas por la corriente eléctrica o
campo aplicado a través del andamio.
Se han realizado estudios basados en polímeros conductores, los cuales actúan como una matriz donde
se cultivan las células deseadas, las cuales pueden ser nerviosas, epiteliales y de hueso.
El PPy es un polímero conductor que muestra su capacidad de mantener y modular el crecimiento de
células. [7]
Sean realizado trabajos en el departamento de Ing. biomédica en la Universidad San Louis, Missouri,
donde se trabajo con células de hueso y células nerviosas las cuales por medio de una cámara hecha con
polietileno y dos electrodos de platino adheridos a sus extremos se estimularon con un pequeño voltaje, los
resultados obtenidos fueron que en las células nerviosas se observaba un mayor crecimiento de la célula en su
tamaño, mientras que en las de hueso aumentaba la proliferación pero no su tamaño. [8]
13
HIPOTESIS.
La estimulación, por medio de una corriente eléctrica, permitirá una mayor proliferación, adhesión
celular y anclaje celular de hepatocitos humanos, HepG2, sembrados sobre Polipirrol dopado con iodo.
DISEÑO DE FUENTES DE ESTIMULACIÓN ELÉCTRICA.
En esta sección se presentan dos distintos diseños de fuentes de estimulación eléctrica que se
propusieron para este proyecto. Estos dos diseños no se utilizaron en las pruebas finales, en la sección
correspondiente se muestra el diseño utilizado y se aprecian las modificaciones que se hicieron para que la
fuente fuera estable y enviara una corriente eléctrica constante a las muestras con cultivo celular.
La primera fuente de corriente eléctrica propuesta consiste de una fuente de corriente controlada por
voltaje, requiere los siguientes componentes:
Circuito integrado LM324
Potenciómetro de precisión (Trimpot)
Resistencias de 10KΩ.
LM324: Es un integrado que contiene 4 amplificadores operacionales.
Potenciómetro (Rs): Con este se ajusta la corriente deseada que aplicaremos al polímero.
Resistencias: Estas deben de tener un valor similar (igual) para que el circuito funcione de manera correcta,
por lo que hay que medir la resistencia de cada una de ellas y seleccionar las más cercanas en valor entre ellas.
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Ilustración 1. Primer diseño de fuente de estimulación eléctrica.
El primer diseño de fuente de corriente eléctrica se muestra en la il. 1. Como se puede apreciar en el
diagrama el voltaje de alimentación del circuito es V1 proporcionado por una fuente de voltaje de DC. Los
amplificadores operacionales A1 y A2 funcionan como inversores. La señal obtenida a la salida A1 es negativa (-
) y esta misma señal es tomada como entrada para A2 resultando en su salida la misma señal de entrada pero
con valor positivo (+). El amplificador A3 está en una configuración buffer o alta impedancia que garantiza que
toda la corriente que atraviese las Rs es la misma que llega al polímero. Para efectuar la estimulación a la
película de PPy-I utilizado en este proyecto, se utilizó una corriente de 10mA y un voltaje en V1 de 15Volts, el
problema que se detecto fue que si la resistencia del polímero (RL) variaba la corriente también lo hacia lo que
no era deseable ya que en esta configuración no se tiene una estabilidad eléctrica y al conectar varios
cubreobjetos con PPy-I la variación era mayor. Hay que recordar que el polímero con el que se trabajo varia su
resistencia dependiendo de la humedad, disminuye su valor en este caso.
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El segundo diseño de fuente de estimulación eléctrica propuesto es el siguiente:
Este diseño es similar al anterior, la diferencia está en que se agrego un transistor 2N3904 que permite
obtener mayor cantidad de corriente que atraviesa el polímero con este diseño podemos obtener hasta 20mA,
en las pruebas que se realizaron se encontró que la cantidad de corriente era demasiado alta, lo que podría
matar a las células sembradas en el polímero, sumando el problema de variación de Rs y por lo tanto de la
corriente.
Ilustración 2. Segundo diseño de fuente, el transistor Q1 permite obtener una mayor corriente eléctrica.
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PRUEBA FUENTE DE ESTIMULACION
Para probar el funcionamiento de la fuente de estimulación, se preparo un portaobjetos recubierto con
Pirrol-Iodo (PPy-I), sintetizado a 30W con un tiempo de síntesis de 30min y una presión de 2.5x10-2Torr. Una vez
sintetizada la película se colocaron cables unidos al polímero con un punto de pintura conductora de plata en
cada uno de los extremos del cristal recubierto con polímero, por donde se hizo pasar corriente, la resistencia
del polímero es demasiado grande para medirla con un multímetro si no hay humedad, por lo tanto el
portaobjeto fue colocado dentro de una caja de petri con una pequeña cantidad de agua, para evitar que el
polímero se mojara se coloco una pequeña base, al tapar la caja de petri lo que se busca es generar humedad
dentro de ella, el polímero Pirrol-Iodo disminuye su resistencia a medida que aumenta la humedad, esto se
pudo comprobar ya que rápidamente comenzó a registrarse lectura en el multímetro a pocos minutos de estar
dentro de la caja cerrada con agua.
Un diagrama de portaobjeto recubierto con PPy-I se muestra en la il.3.
Ilustración 3. Ensamble del PPy-I con las conexiones eléctricas para pruebas de conducción.
Se realizaron cuatro distintas combinaciones con los cables para hacer pasar corriente al polímero, las
cuales se muestran más adelante con los datos obtenidos.
El proceso de estimulación se llevo a cabo con una fuente de corriente controlada por voltaje. A
continuación se muestra el esquema general de la manera en que se conecto la fuente, polímero y dos
multimetros.
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Ilustración 4. Circuito utilizado para obtener las curvas características I vs V de la película de PPy-I.
El multímetro XMM1 mide la corriente aplicada al polímero, hay que recordar que el amplificador A3
garantiza que toda la corriente se dirija al polímero, otro factor es la resistencia interna del multímetro XMM1,
como es demasiado grande comparada con la del polímero, la corriente toma el camino con menos resistencia
siendo este el del polímero, el multímetro XMM2 mide el voltaje sobre el polímero. Lo que se hizo para probar
la fuente de corriente, fue variar el voltaje de entrada V1 de 2 a 22 volts, la resistencia Rs se dejo fija en un
valor de 2kΩ aproximadamente, este valor no es tan importante en este caso ya que el polímero no tenia
células sembradas, y sólo se necesitaba comprobar el funcionamiento de la fuente de corriente.
A continuación se muestran las combinaciones realizadas con los cables que es dónde se conectaron al
circuito eléctrico, también se muestran los datos obtenidos y su gráfica corriente-voltaje. Ver ils.5-8.
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Ilustración 5. Curva característica corriente-voltaje (I vs V), en la parte superior se aprecia las terminales de estimulación eléctrica.
Ilustración 6. Curva característica corriente-voltaje (I vs V), en la parte superior se aprecia las terminales de estimulación eléctrica.
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Ilustración 7. Curva característica corriente-voltaje (I vs V), en la parte superior se aprecia las terminales de estimulación eléctrica.
Ilustración 8. Curva característica corriente-voltaje (I vs V), en la parte superior se aprecia las terminales de estimulación eléctrica.
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Como se puede observar en las curvas características corriente-voltaje el comportamiento es lineal lo
que indica que se trata de un material óhmico y que el transporte de carga eléctrica es por medio de
electrones. Hay que recordar que el polímero tiene una resistencia grande y al entrar en contacto con la
humedad la resistencia comienza a bajar de manera considerable, resultando en un comportamiento similar al
de una resistencia de carbón. La resistencia del polímero varía dependiendo de la posición en la que
coloquemos los cables haciendo los cálculos de la pendiente de la curva características obtenemos la
resistencia de la muestra. A continuación se muestra el valor de resistencia del polímero (Rs) para cada caso.
Tabla 1. Resistencia calculada en las pruebas.
Combinación 1 1.46MΩ
Combinación 2 2.55MΩ
Combinación 3 428.37KΩ
Combinación 4 1.12MΩ
La resistencia de valor más pequeña fue en el caso 3 de 428.37 KΩ, lo que permito mayor cantidad de corriente
como se aprecia en la tercera tabla.
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ELABORACION DE MUESTRAS.
Por medio de la técnica de polimerización por plasma, substratos de vidrio se recubrieron con una
película delgada de polipirrol-PPy, durante 40 minutos a una potencia de 30 Watts, el contenedor de PPy
estuvo abierto todo el tiempo de síntesis mientras que el contenedor de yodo se abrió de forma intermitente, 6
minutos cerrado y 4 minutos abierto. El material sintetizado tiene características de semiconductor y a través
de él se estimularan las células hepáticas. Para este proyecto se elaboraron 8 muestras, una vez recubierto con
PPy-I el portaobjeto se dejo reposar por dos horas dentro del reactor con el fin de cerrar los radicales libres
abiertos al final de la polimerización. Posteriormente se añadieron los electrodos al polímero mediante pintura
conductora de plata por medio de los cuales se llevara a cabo la estimulación eléctrica. La pintura conductora
se dejo secar por 48 horas para eliminar cualquier solvente, se probó que hubiera continuidad entre los
electrodos y la pintura conductora, se recubrió la pintura conductora y parte del electrodo con silicón frio para
aislarlos del medio de cultivo, posteriormente se colocaron en 8 cajas de petri donde se realizará el cultivo de
hepatocitos.
En las siguientes imágenes (ils. 9 a y b) se observa el cubre objeto recubierto con PPy-I, los cables que
funcionan como electrodos y la pintura conductora de plata todo fue aislado con silicón frio para evitar que el
medio de cultivo actuara como conductor. Lo que se desea es que toda la corriente fluya a través del polímero.
Ilustración 9. Portaobjetos de vidrio recubiertos con PPy-I utilizados para la estimulación eléctrica de HepG2
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PROTOCOLO DE EXPERIMENTO
Se pretende estimular 4 muestras de células HepG2 previamente sembradas sobre una película delgada
de polipirrol-iodo. Para la estimulación eléctrica se utilizara un inyector de corriente con una intensidad de
10µA. Se colocarán las 4 muestras en serie con el inyector de corriente, para hacer pasar la misma corriente a
cada una de ellas. La Tabla 2 muestra el tiempo de estimulación diario aplicado a cada muestra de PPy-I
sembradas con hepatocitos humanos, la estimulación se realizo diariamente hasta completar hasta completar
una semana. El tiempo de estimulación variará para cada muestra. Tiempo de estimulación para cada muestra
de PPy-I recubierta con HepG2.
Tabla 2. Tiempo de estimulación para cada muestra.
Muestra núm. Tiempo de estimulación diario.
1 15min
2 30min
3 45min
4 1hr
Una vez sembradas las células sobre el polímero, se dejarán reposar por 24 hrs y comenzar a estimular
al día siguiente teniendo cuidado de respetar la parte positiva de la corrientes siempre conectando en la misma
posición al electrodo del polímero. Se tomará una imagen después de haber estimulado las células y dejarlas
reposar por 24 hrs para ver el efecto de la corriente en las células. Se pretende ver de qué manera la corriente
eléctrica afecta a las células HepG2.
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DISEÑO ELECTRONICO Y PRUEBAS
Funcionamiento fuente de estimulación.
La fuente de estimulación con la cual se trabajo, es una fuente de corriente controlada por voltaje, requiere
los siguientes componentes:
LM324 soporta voltaje de alimentación ±32Volts máximo.
Potenciómetro de precisión (Trimpot) de 5KΩ.
Resistencias de 10KΩ. (6 pzas) 120 KΩ. (1 pza).
LM324: Es un integrado que contiene 4 amplificadores operacionales.
Potenciómetro (Key=A): Con este se ajusta el voltaje de entrada del amplificador U1A en su pin inversor,
también se utiliza para ajustar la corriente junto con R5.
Resistencias: Las 6 resistencias deben de tener un valor similar para que el circuito funcione de manera
correcta, por lo que hay que medir la resistencia de cada una de ellas y seleccionar las más cercanas en valor
entre ellas.
R8: Es la resistencia de carga (Rs) que simula el polímero.
R5: Se propuso para obtener el valor de corriente deseado.
24
Ilustración 10. Circuito de estimulación eléctrica usado con las HepG2.
A continuación se describe el funcionamiento del circuito.
El circuito de la il.10 está alimentado con ±15 Volts. El potenciómetro (A) de 5KΩ controla el voltaje de
entrada en el pin inversor de U1A este amplificador trabaja de manera inversora con ganancia unitaria ya que
Ri y Rf son iguales, a la salida de este operacional tendremos un voltaje negativo (-) de dc. El amplificador
operacional U2B proporciona un voltaje de salida igual a la diferencia entre el voltaje o señal aplicada a la
entrada no inversora y el aplicado a la entrada inversora, multiplicada por una ganancia que va a depender de
los resistores, a la salida de este operacional veremos un voltaje positivo (+) de dc ya que invierte la señal, este
amplificador es el encargado de compensar el valor de voltaje para seguir conservando la corriente requerida.
El operacional U3C en configuración buffer o alta impedancia sirve para garantizar que toda la corriente que
proporciona la fuente sea aplicada a la resistencia de carga.
25
El valor de R5 se propuso para obtener el valor de la corriente deseada, con esta misma configuración y
variando el valor de R5 se alcanza una corriente de 100µA.
El valor de la corriente puede modificarse si cambiamos el valor de R5 y el voltaje de alimentación de
±15volts hasta alcanzar el valor deseado ya que el valor que podemos obtener variando el potenciómetro
también se incrementa, hay que recordar que los valores de (P1) y (P2) nunca podrán rebasar el voltaje de
alimentación proveniente de la fuente de voltaje que alimenta el circuito integrado LM324, es decir, nunca
pueden ser mayores de 32V o 15V en nuestro caso.
Para realizar las pruebas de esta fuente y comprobar que obtendremos la corriente requerida se
colocaron distintas resistencias de carga (Rs) de 10kΩ, 100kΩ y un polímero con electrodos igual al que se
utilizará en el experimento, lo que buscamos es ver que los amplificadores realicen su función de la forma en
que están configurados y en la resistencia de 120kΩ que está conectada al pin núm. 7 del circuito, medir el
voltaje en ambos extremos de la resistencia refiriéndonos a tierra.
Prueba 10KΩ.
Se midió el voltaje en el pin núm. 2 que es la entrada del amplificador, así como en el pin núm. 1 que
corresponde a la salida del primer amplificador, también se midió el voltaje en el pin núm. 7 correspondiente al
segundo amplificador inversor. Con los resultados de la tabla siguiente verificamos que los amplificadores
funcionaran de manera correcta.
Tabla 3. Valores obtenidos en las mediciones con resistencia de prueba 10kΩ.
Pin a medir. Voltaje.
Núm. 1 -1.25v
Núm. 2 1.26v
Núm. 7 1.34v
26
En las siguientes ils. se puede apreciar el valor obtenido en las mediciones.
Ilustración 11. Imágenes con los valores obtenidos con resistencia de carga 10kΩ.
Las mediciones que se realizan en la resistencia de 120kΩ son las utilizadas para calcular la corriente que
estimula a la resistencia de carga que en nuestro caso es el polímero.
Ilustración 12. Puntos donde se realizan las mediciones para determinar la corriente aplicada.
27
Tabla 4. Valores obtenidos en puntos de prueba P1 y P2.
Punto de prueba. Voltaje.
(P1) 1.34v
(P2) 63.2mv
Ilustración 13. Imágenes de valores obtenidos en los puntos de prueba (P1) y (P2).
Para saber el valor de la corriente utilizamos ley de ohm, tomando el voltaje de los puntos marcados
como (P1) y (P2), haciendo una resta de estos voltajes y después dividiendo entre la resistencia de 120kΩ.
28
Prueba 100kΩ.
Tabla 5. Valores obtenidos en las mediciones con resistencia de prueba 100kΩ.
Pin a medir. Voltaje.
Núm. 1 -1.25v
Núm. 2 1.26v
Núm. 7 2.21v
Ilustración 14. Imágenes con los valores medidos con resistencia de carga 10kΩ.
Tabla 6. Valores de voltaje medidos en los puntos (P1) y (P2).
Punto de prueba. Voltaje.
(P1) 2.21v
(P2) 984mv
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Utilizando ley de ohm nuevamente y tomando el voltaje de los puntos marcados (P1) y (P2).
Prueba con Polímero.
Tabla 7. Valores obtenidos en las mediciones con polímero de prueba.
Pin a medir. Voltaje.
Núm. 1 -1.25v
Núm. 2 1.26v
Núm. 7 3.28v
Ilustración 15. Imágenes con los valores medidos con polímero de prueba.
30
Tabla 8. Valores obtenidos en los puntos (P1) y (P2).
Punto de prueba. Voltaje.
(P1) 3.28v
(P2) 2.05v
Calculando la corriente aplicada al polímero.
Ilustración 16. Polímero conectado al inyector de corriente.
En la il.17 se aprecia el osciloscopio conectado en paralelo al polímero para medir su voltaje.
31
Ilustración 17. Osciloscopio conectado en paralelo con el polímero para medir su voltaje.
El valor obtenido con el osciloscopio fue de 1.69 volts y sabemos que estamos aplicando una corriente
de 10.2µA.
Este es el valor de resistencia del polímero que estábamos estimulando al momento de la prueba, hay
que recordar que el polímero varía su resistencia por lo que es un valor aproximado.
Tabla 9. Valores de corriente con las distintas pruebas de carga.
Resistencia de prueba. Valor de corriente.
10kΩ 10.6µA
100kΩ 10.2µA
Polímero 10.2µA
La variación obtenida en la corriente puede deberse a las resistencias ya que se buscaron las más
parecidas en valor para que el circuito funcionara de la mejo manera, con el potenciómetro que alimenta al
primer amplificador operacional se ajustó la corriente deseada hasta dónde fue posible, al estimular el
polímero se aprecia una diferencia de 0.2µA que no es demasiado significativa ya que esta cerca del valor que
se quiere utilizar siendo de 10µA.
32
DESARROLLO DEL EXPERIMENTO
Para este proyecto se utilizaron células hepáticas HepG2 base 88 (ATCC HB8065), Medio de cultivo
Williams tipo-E (Gibco 12551). Se preparó el medio de cultivo con 88% de medio Williams tipo-E (Gibco 12551),
10% suero fetal bobino (Gibco 16000), 1% l-glutamina (Sigma G-1517) y 1% antibiótico antimicótico (Gibco
15240). Una vez agregado todo se homogeniza la mezcla, se separan 3ml y se realizan pruebas de esterilidad
en cajas de petri de 25cm2.
Las cajas de petri con los cubre objeto recubiertos con polímero se dejaron 1 día bajo luz UV para
eliminar cualquier agente que pudiera contaminar las muestras. A cada muestra se le agregó 12 ml de medio de
cultivo Williams. Para el sembrado de las células HepG2 se utilizo la técnica de sembrado por suspensión, a
cada cubre objeto con polímero se agregó 5x105 células HepG2. Una vez sembradas las células se dejaron
anclar al polímero por 24 hrs. La estimulación de las células se realizó dentro de una incubadora a 37°C y 5% de
CO2. Las muestras únicamente se retiraron de la incubadora para tomar las imágenes después del tiempo de
estimulación eléctrica determinado al día siguiente y continuar con la estimulación. Se utilizaron 5 muestras,
una de ellas como control.
En las ils. 18 y 19 se observan muestras listas para introducirlas a la incubadora y dejar anclar las células
por 24 hrs.
Ilustración 18. Cajas de petri preparadas con el substrato de PPy-I y con células HepG2.
33
Se utilizaron 5 muestras, una de ellas como control.
Ilustración 19. Caja de petri preparadas con el substrato de PPy-I y con células HepG2.
Ilustración 20. Inyectores de corriente eléctrica.
En la il.20 se observa los inyectores de corriente para estimular las células que se encuentran dentro de
la incubadora. Al termino del tiempo determinado para cada muestra los inyectores de corriente eran
intercambiados a la siguiente muestra, uno de los inyectores estimulaba la muestra de 1hr y 15 min de manera
separada, es decir al termino de la muestra de 1hr se desconectaba y conectaba a la muestra de 15 min, para
las muestras de 45 min y 30 min el procedimiento fue el mismo pero utilizando el segundo inyector.
34
RESULTADOS
Los resultados obtenidos después de estimular las muestras el tiempo determinado fueron los
siguientes.
Muestra control.
La il.15 corresponde a la muestra utilizada como control durante los días que se realizo el experimento, donde los hepatocitos no fueron estimulados con corriente. Como se puede observar en las imágenes sólo se aprecia un aglomeración de células en la parte central. No hay proliferación uniforme sobre el polímero, ya que hay gran cantidad de espacios vacios sin células y no se logra la diferenciación de los hepatocitos.
Día 0. Día 1. Día 2.
Día 3. Día 4. Día 5.
Día 6.
Ilustración 21. Muestras de Control.
35
Muestra estimulada 15 Min.
La il.16 correspondiente a la muestra estimulada durante 15 min donde se observa un crecimiento de
manera espaciada y no uniforme, la proliferación celular no aumenta o disminuye, se aprecia una aglomeración
de células en ciertas zonas sobre el polímero pero son mínimas y no se logra la diferenciación de los
hepatocitos, esta muestra tiene similitudes con la de control.
Día 0. Día 1. Día 2.
Día 3. Día 4. Día 5.
Día 6.
Ilustración 22. Muestras estimuladas durante 15 min diarios.
36
Muestra estimulada 30 Min.
La il.23 corresponde a la muestra estimulada durante 30 min. Se observan ciertas zonas donde hay
aglomeración de células no permitiendo la diferenciación de las mismas, también se precia un aumento en la
proliferación de hepatocitos de manera casi uniforme sobre el polímero, ya que hay espacios vacios sin células ,
después del tercer día de estimulación se observo mayor proliferación de células y diferenciación de las mismas
en ciertas áreas del polímero, hay que notar que las células parecen orientarse en cierta dirección siendo más
evidente en las dos últimas imágenes del experimento.
Día 0. Día 1. Día 2.
Día 3. Día 4. Día 5.
Día 6.
Ilustración 23. Muestras estimuladas durante 30 min diarios.
37
Muestra estimulada 45 Min.
La il.24 corresponde a la muestra estimulada durante 45 min. Se observa mayor cantidad de células
sobre el polímero de manera uniforme, los espacios vacios sobre el polímero son mínimos; el aumento de la
proliferación celular y diferenciación comenzó a observarse después del tercer día de estimulación hasta
concluir el experimento. Había ciertas zonas de aglomeración de células pero eran insignificantes, esta muestra
fue la que mejores resultados obtuvo durante el experimento. También se puede apreciar que las células están
orientadas en una dirección en particular en las últimas imágenes.
Día 0. Día 1. Día 2.
Día 3. Día 4. Día 5.
Día 6.
Ilustración 24. Muestras estimuladas durante 45 min diarios.
38
Muestra estimulada 60 Min.
La il.25 correspondiente a la muestra estimulada durante una hora. Se observa un aumento en la
proliferación de hepatocitos de manera casi uniforme sobre el polímero, la diferenciación solo es posible en
algunas áreas del polímero, hay mayor cantidad de zonas con células aglomeradas, los espacios vacios
aumentaron en comparación con la muestras estimuladas durante 30 y 45 minutos, aunque se puede seguir
observando la dirección en que están orientadas las células.
Día 0. Día 1. Día 2.
Día 3. Día 4. Día 5.
Día 6.
Ilustración 25. Muestras estimuladas durante 60 min diarios.
39
CONCLUSIONES
Después de analizar las imágenes obtenidas de cada una de las muestras utilizadas en este experimento
se aprecia un efecto claro en los hepatocitos sembrados sobre el polímero, las muestras con mejores resultados
fueron la de 30 y 45min donde se observó menor cantidad de superficie del polímero sin hepatocitos, las zonas
de aglomeración de células eran pequeñas, la proliferación de células se observo en unos cuantos días después
de comenzar la estimulación eléctrica del polímero con hepatocitos anclados a este, también se logró
diferenciar los hepatocitos aunque no se aprecia su forma poliédrica ya que es de 30 m de diámetro.
En experimentos anteriores donde se ha realizado sembrado de células, se ha observado que los
hepatocitos se anclan mejor y mucho más rápido a la superficie del polímero cuando este presenta ciertas
grietas o ranuras en su superficie, las muestras utilizadas para estimulación eléctrica durante 30 y 45 min.
Mostraron esta característica y se sembró las células HepG2 en esas regiones así como donde no se
presentaban estas grietas.
En las muestras de control y 15 min no se logra un buen anclado de células esto puede deberse al
tiempo de sembrado y tipo de material, todas las muestras tuvieron el mismo tiempo de anclado, la diferencia
con estas últimas muestras fue que se fabricaron un par de días antes y estuvieron más tiempo bajo luz UV lo
que pudo envejecer el polímero.
La cantidad de corriente aplicada para estimular las muestras fue adecuada ya que no se presento
mortandad alguna de los hepatocitos que era lo que se temía que ocurriera con una cantidad de corriente
mayor, el tiempo de duración del experimento también fue adecuado ya que se observo que después del 6 día
el polímero comenzaba a levantarse del portaobjeto en ocasiones junto con los electrodos de estimulación,
debido a la humedad absorbida por el polímero durante el tiempo que duró el experimento, otra observación
notable es que los hepatocitos se aprecian alineados en una dirección en particular en las muestras donde la
proliferación de hepatocitos fue considerable, esto se atribuye a la corriente y magnitud que se utilizo, al ser de
tipo DC tiene un sentido y se tuvo cuidado de que siempre coincidiera la señal positiva de la corriente con la
posición del polímero hacia donde se pretendía dirigir a las células ya que se quería ver el comportamiento de
los hepatocitos al estimularlos en una dirección en particular.
40
Lo que resta por hacer es encontrar el valor de corriente, tiempo de estimulación y tiempo de anclado
óptimos, para en un futuro lograr una proliferación y diferenciación de hepatocitos adecuada en la menor
cantidad de tiempo, así como poder modificar la dirección en la que crecen los hepatocitos y poder diseñar
fibras de células hepáticas sembradas sobre polímeros donde se pueda modificar el tiempo de crecimiento,
proliferación y dirección de los mismos.
41
BIBLIOGRAFIA
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[8]. Megan Francis, Matthew Wood and Rebecca Kuntz Willits. Electrical Stimulation of Cells.Department of
Biomedical Engineering,Saint Louis University St.Louis,Missouri.
42
ANEXO 1 TRABAJO PRESENTADO EN MACROMEX 2011
MULTI-WELL ELECTRICAL CELL CULTURE
43
MACROMEX 2011
Second US-Mexico Meeting “Advanced Polymer Science” and XXIV SPM National Congress
Riviera Maya, Q. Roo, México. December 2011
Experimental Device Design
The design of the device consists basically of 5 units of cell culture and an observation point of
cell growth, with optical microscopy. Figure 1 shows the 5 electro-culture wells units arranged
around a central cylinder, where wires that applied the direct voltage to each pair of electrodes in
the well culture are joined. These wires also give back information on Injury potential
(regenerative potential). This arrangement of 5 electro-culture wells is basically a cylindrical
container with a heat bath which allows variation and temperature control. It has also a transparent
cover with a cut section, which allows optical microscope observation and manual control
allowing positioning a specific well of electro-culture under the optical microscope for
observation.
Figure 1
For clarity, Figure 2 (a) shows the position of silicon seals and (b) details of the deposit and the 5
well arrangements. By adapting two springs at each electrode we ensured good electrical contact.
The silicon seals around the electrodes avoid electrical contact of the electrodes with the
physiological fluid. Figure 3 shows a perspective drawing of the electro-well and a cross-sectional
view of this array. Figure 4 represents the dimensions of the container with the 5 wells on an
elevator support adapted to a microscope (Leika Dulp). In this figure, one can see the approaching
of the window´s well, in order to obtain the maximum amplification provided by this kind of
optical microscope.
469
44
MACROMEX 2011
Second US-Mexico Meeting “Advanced Polymer Science” and XXIV SPM National Congress
Riviera Maya, Q. Roo, México. December 2011
(a) Figure 2 (b)
Finally it is expected that with this device we can achieve an effect of cellular growth like the
showed schematically in Figure 5, and picture in Figure, [1]
470
45
MACROMEX 2011
Second US-Mexico Meeting “Advanced Polymer Science” and XXIV SPM National Congress
Riviera Maya, Q. Roo, México. December 2011
Figure 3
Figure 4
471
46
47
48
ANEXO 2 TRABAJO PRESENTADO EN XXV CONGRESO NACIONAL DE
POLIMEROS.
INFLUENCIA DE LA CORRIENTE ELECTRICA SOBRE EL CRECIMIENTO CELULAR DE
HEPATOCITOS SOBRE POLIPIRROL SINTETIZADO POR PLASMA.
H. González-Venegas1, Juan Morales-Corona
2*, R. Godinez-Fernandez
1, Roberto Olayo
2.
1 Departamento de Ingeniería Eléctrica,
2 Departamento de Física, Universidad Autónoma Metropolitana
Iztapalapa, Av. Michoacán y Purísima, Col. Vicentina-Iztapalapa, D.F., CP 09340, México D. F.
Resumen
En la literatura se encuentran reportes en dónde se ha aplicado una corriente eléctrica pequeña para estimular y
promover el crecimiento celular. Este estimulo eléctrico se puede hacer a través de un material semiconductor y
biocompatible como el polipirrol. El polipirrol sintetizado por plasma es un material semiconductor que al estar
inmerso en un ambiente húmedo responde elevando su conductividad eléctrica en varios ordenes de magnitud.
En este trabajo se deposito una película delgada de polipirrol dopado con yodo sobre portaobjetos de vidrio, las
condiciones de síntesis fueron: Potencia 20W, tiempo de síntesis 30 min, y presión 5x10-2
Torr. Estas muestras
fueron preparadas para el cultivo celular de hepatocitos humanos, HepG2. Una vez sembrados los hepatocitos se
estimularon, eléctricamente por una semana con una intensidad de corriente eléctrica de 10µA. Se tomaron 4
muestras y se estmularon por 15, 30, 45 y 60 min respectivamente. Las 4 muestras se conectaron en serie con el
inyector de corriente, para hacer pasar la misma corriente a través de cada una de ellas. Se tomo el registro
fotográfico de cada muestra después de haber estimulado las células y dejarlas reposar por 24 horas para ver el
efecto de la corriente en ellas. Los resultados indican que las muestran que se estimularon por 45 min diarios
tienen una mejor proliferación celular y llegan a formar una monocapa de HepG2.
Introducción
Los materiales sintéticos y naturales usados como implantes en aplicaciones médicas y destinados a interaccionar
con sistemas biológicos se conocen como biomateriales. Los biomateriales se implantan para reemplazar o
49
ayudar a restaurar tejidos biológicos y estos cumplan sus funciones. El biomaterial están expuestos temporal o
permanentemente a fluidos biológicos del cuerpo. El éxito de un biomaterial depende básicamente de 3 factores
principales: 1) biocompatibilidad, es decir, que la interfase implante-tejido biológico no sea toxica, que no
produzca efectos nocivos como: respuesta inflamatoria crónica y reacción a cuerpos extraños,
2) que efectué todas la funciones para las que ha sido diseñado y
3) que tenga un tiempo de vida razonable. Por lo tanto, es muy importante diseñar materiales (naturales o
sintéticos) con propiedades y características especificas que funcionen adecuadamente en el medio biológico que
los rodea.
La técnica de polimerización por plasma es un método efectivo para modificar las propiedades superficiales
manteniendo intactas las propiedades de bulto de cualquier material. Esta característica del plasma permite la
generación y/o modificación de biomateriales ya existentes [1,2,3]. Los campos eléctricos y magnéticos bajo
condiciones experimentales controladas se pueden usar para estimular el crecimiento de diferentes células in
vitro. La energía electromagnética que puede absorver una célula puede ser suficiente para provocar cambios en
su morfología, metabolismo, reproducción o tiempo de vida. Se a estudiado el efecto del campo electromagnético
sobre diferentes sistemas y tipos de células. Entre las células estudiadas se encuentran las células cromafines
suprarrenales y células PC12 derivadas de feocromocitomas (tumores de la médula suprarrenal) [4,5]. Al
someter a las células a campo se inducen cambios morfológicos y bioquímicos, similares a los producidos por el
factor de crecimiento nervioso (FCN) y otros factores tróficos. Las células cromafines y PC12 liberan diferentes
neuropetidos como catecolaminas, serotoninas, etc. Estos neuropetidos han presentado cambios al estimularlos
magnéticamente. Muchas teorías sugieren que los cambios que se presentan por el mecanismo de interacción
sistema biológico-Campo-Electromagnético son debido a los cambios generados en el transporte de iones [6,7].
Experimental
Diseño de la Fuente de estimulación eléctrica.
Funcionamiento fuente de estimulación.
El diagrama esquematico de la fuente de estimulación con la cual se trabajo se puede apreciar en la Fig. 1, es una
fuente de corriente controlada por voltaje, que cosiste de los siguientes componentes:
50
LM324 soporta voltaje de alimentación ±32Volts máximo.
Potenciómetro de precisión (Trimpot) de 5KΩ.
6 Resistencias de 10KΩ y 1 resistencia de 120 KΩ.
El circuito está alimentado con ±15 Volts. El potenciómetro (A) de 5KΩ controla el voltaje de entrada en el pin
inversor de U1A este amplificador trabaja de manera inversora con ganancia unitaria ya que Ri y Rf son iguales,
a la salida de este operacional tendremos un voltaje negativo (-) de dc. El amplificador operacional U2B
proporciona un voltaje de salida igual a la diferencia entre el voltaje o señal aplicada a la entrada no inversora y
el aplicado a la entrada inversora, multiplicada por una ganancia que va a depender de los resistores, a la salida
de este operacional veremos un voltaje positivo (+) de dc, ya que invierte la señal, este amplificador es el
encargado de compensar el valor de voltaje para seguir conservando la corriente requerida. El operacional U3C
en configuración buffer o alta impedancia sirve para garantizar que toda la corriente que proporciona la fuente
sea aplicada a la resistencia de carga.
Para estimular las células sembradas en el polímero la corriente se fijo en 10µA.
Síntesis de material polimérico.
El reactor de plasma usado para el recubrimiento superficial de cubreobjetos de vidrio con una película delgada
de polipirrol dopado con yodo se muestra en la Fig. 2. Consiste de un tubo de vidrio de 10cm de diámetro
externo sellado con dos bridas de acero inoxidable. En cada brida hay un acceso para el electrodo circular y dos
accesos para monómero o sistema de vacío. Las condiciones de síntesis del material fueron potencia de 20W,
presión de 5x10-2
Torr y tiempo de síntesis de 30 minutos.
Al final de la reacción se colocó en cada esquina del cubreobjetos un electrodo formado por pintura de plada y
alambre de cobre. Estos se recubrieron con silicon para evitar interacción y contaminación del medio de cultivo
celular.
51
Fig. 1. Circuito eléctrico de la Fuente de corriente Fig. 2. Reactor de polimerización por plasma.
para la estimulación de los hepatocitos.
Cultivo Celular de Hepatocitos.
Para este proyecto se utilizaron células hepaticas HepG2 base 88 (ATCC HB8065), y medio de cultivo celular.
Se preparó el medio de cultivo con 88% medio Williams tipo-E (Gibco 12551), 10% suero fetal bobino (Gibco
16000), 1% l-glutamina (Sigma G-1517) y 1% antibiótico antimicótico (Gibco 15240). Una vez agregado todo se
homogenizó la mezcla y se realizan pruebas de esterilidad en las cajas pequeñas de 25cm2. Las cajas de petri con
los cubreobjeto recubiertos con polímero se dejaron 1 día bajo luz UV para eliminar cualquier agente que pudiera
contaminar las muestras. A cada muestra se le agregó 12 ml de medio de cultivo. Para el sembrado de las células
HepG2 se utilizo la técnica de sembrado por suspensión, a cada cubreobjeto con polímero se agregó 5x105
células. Una vez sembradas las células se dejaron anclar al polímero por 24 hrs. La estimulación eléctrica de las
células se realizó dentro de una incubadora a 37°C y 5% de CO2. Las muestras únicamente se retiraron de la
incubadora para tomar las imágenes después del tiempo de estimulación. En la Fig. 3 se puede apreciar los
substrato de vidrio recubiertos con el polipirool y sembrados con hepatocitos, que se pusieron en la incubadora.
Resultados y Discusión
Caracterización del PPy-I.
Espectroscopia de Infrarrojo en Modo ATR.
52
En la Fig. 4 se muestra el espectro de infrarrojo en modo de reflexión total atenuada del polipirrol dopado con
iodo. El espectro muestra bandas de vibración anchas y complejas características de los materiales sintetizados
por plasma. En 3327 cm-1 se muestra la vibración de las aminas primarias y secundarias. El pico en 2976cm-1
representa la vibración de los carbones alifáticos. El pico en 2181cm-1 es una indicación del rompimiento de
algunos anillos aromáticos y es indicación del entrecruzamiento del polímero. El pico en 1677cm-1 corresponde
al enlace de los grupos amina de la estructura del pirrol mientras que en 1574cm-1está la vibración en el plano
del enlace C= y C=N de la estructura del pirrol.
Fig. 3. Substratos de vidrio recubiertos con Fig. 4 Espectro FTIR-ATR del PPy-I.
PPy-I en el medio de cultivo celular.
Análisis de XPS.
En XPS de barrido amplio (no se muestra) del PPy-I muestra la presencia de C, N, y O. El pico del carbón se
deconvoluciono con tres contribuciones, en 285.0eV se presentan los hidrocarbones C-C y C-H, en 286.7eV y se
asigna a los enlaces de C-N, C-O y C=N, el tercer pico centrado en 288.0eV presenta O=C-NH, C=O. El pico de
N1s se deconvolucionó con dos contribuciones uno (399.5eV) corresponde a los grupos amina –NH, el otro
(403.9eV) a un nitrógeno cargado –N+ y al grupo N=O. El pico de oxigeno O1s se deconvolucionó en un sólo
pico centrado en 532 eV que muestra la presencia de alcoholes y ketonas.
53
Estimulación eléctrica de las células HepG2.
Se estimularon 4 muestras de células HepG2 sembradas sobre una película delgada de polipirrol-iodo. Para la
estimulación eléctrica se utilizó un inyector de corriente con una intensidad de 10µA, acoplado al circuito
eléctrico que se diseño. Se colocarón las 4 muestras en serie con el inyector de corriente, para hacer pasar la
misma corriente a cada una de ellas. En la tabla 1 se muestra el tiempo de estimulación diario aplicado a cada
muestra por 5 días.
Tabla 1. Tiempo de estimulación diario para cada muestra.
Muestra núm. Tiempo de estimulación diario.
1 15min
2 30min
3 45min
4 1hr
Una vez sembradas las células sobre el polímero, se dejarán reposar por 24 hrs y continuo la estimulación al día
siguiente.
Se tomará una imagen después de haber estimulado las células y dejarlas reposar por 24 hrs para ver el efecto de
la corriente en las células.
54
Fig. 5 Crecimiento celular de hepatocitos sobre polipirrol sintetizado por plasma. (a) estimulo de 15 min. (b)
Estimulo de 30 min, (c) estimulo de 45 min y (d) estimulo de 60 min diarios por 5 dias.
La Fig. 5 muestra el crecimiento celular de hepatocitos estimulados a 15, 30, 45 y 60 minutos diarios durante 5
días. La Fig. 5(a) muestra el cultivo de 15 min x 5 dias, 75 minutos en total. Sólo se observan algunas células de
manera aislada y no se aprecia una diferenciación importante, una gran parte de estas células continuan siendo
esféricas lo que indica que no estan ancladas ni diferencidas en el substrato. Esto es una indicación que el
estimulo eléctrico es perjudicial para las células. En Fig. 5(b) se aprecia la muestra que fue estimulada con 30
minutos diarios durante 5 dias, 300 minutos de estimulo en total. Se observa un aumento en la proliferación de
hepatocitos, se encuentran distribuidos por zonas, hay zonas sobre el polímero donde el crecimiento es uniforme,
y otras donde hay poco crecimiento. En la muestra después del tercer día de estimulación (90min) se observo una
mayor proliferación de celular (no se muestra la imagen). En la Fig. 5 (c) se aprecia la muestra estimulada por 45
min diarios, 145 min en total. La foto de esta muestra corresponde al estimulo de 245 min. Se aprecia que los
hepatocitos estan distribuidos de manera uniforme sobre toda la superficie polimérica y además formaron ya una
monocapa celular. La proliferación celular pudo observarse después del segundo día de estimulación hasta
concluir el experimento. Otra característica que tiene es que las células se pueden ver alineadas, como si se
hubieran alineado con las líneas de fuerza del campo eléctrico. La estimulación eléctrica de 45 min diarios es la
55
que mejor proliferación, anclaje y diferenciación celular mostró. Imagen de la Fig. 5(d) corresponde a la muestra
estimulada durante una hora por cinco días, 300 min en total. Se observa un aumento en la proliferación de
hepatocitos de manera casi uniforme sobre el polímero, tiene espacios vacios lo que indica una pobre
proliferación celular.
Conclusiones
Se realizo la síntesis de polipirrol por plasma sobre substratos de vidrio y se aprovecho las propiedades de
semiconducción del material polimérico para estimular células hepaticas a través del material, no se transmitio
corriente a través del medio de cultivo. Los hepatocitos anclados sobre el material polimérico se estimularon
directamente, los mejores resultados se obtuvieron con un estimulo de 10 mA por 45 minutos diarios durante
cinco dias. Esta estimulación pudo anclar, proliferar y diferenciar los hepatocitos formando una monocapa
cubriendo el material polimérico.
Agradecimientos.
Los autores agraden al ICyT-DF a través del proyecto PICSA11-14/2011 y al CONACyT a través del proyecto
155239 por el apoyo parcial para la realización de este trabajo.
Referencias
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model for magnetic field interactions with PC-12 cells. Bioelectromagnetics 15:239-260.
56
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nigrostriatal lesioned rats. Mol. Cell. Neurosci. 5:485-498.
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cells. Int. Rev. Cytol 158: 279-338.
7. Karabakhtsian, Broude N, Shalts N, Kochlatyi S, Goodman R, Henderson AS (1994) Calcium is
necessary in the cell response to EM fields. FEBS Lett. 349:1-6.
57
ANEXO 3 TRABAJO PRESENTADO EN XXV CONGRESO NACIONAL DE
POLIMEROS.
CELDA DE ELECTROCULTIVO CELULAR
Raúl Montiel1, Olayo Roberto
1, Juan Morales
1, Heber A. González
1, Rafael Godínez
1.
1Área de Polímeros, Depto. de Física, DCBI, Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa, Av. San Rafael Atlixco
No.186, Col. Vicentina, Iztapalapa, D.F., 09340, México, D.F.
Se presenta los resultados obtenidos de un pozo de electro-cultivo celular, diseñado y fabricado en la UAM-Iz.t El
dispositivo hecho de material acrílico básicamente es un pequeño depósito cilíndrico que contiene dos discos del mismo
material. El primero soporta un vidrio cubre objetos el cual fue recubierto por Plasma, de un polímero conductor
(polipirrol) el cual contiene el cultivo celular que se va a analizar. El segundo disco contiene un par de electrodos de platino
rodeados por cellos delgados de teflón, y un soporte con un resorte de acero inoxidable, para dar presión a los sellos
evitando que el líquido fisiológico y los nutrientes toquen los electrodos. Se presenta la calibración y los resultados
preliminares de cultivos celulares en los cuales se varía el espesor de la película de polipirrol, el voltaje CC aplicado, y los
pulsos CA. Para la obtención de los resultados, se midió la asignación del campo eléctrico, se cumplieron con las normas
de protocolo se con el fin de asegurar la viabilidad de células sanas, evitando la contaminación del sistema para lograr un
óptimo crecimiento celular. Al constatar el funcionamiento de esta celda de electrocultivo, se procederá a la construcción
de otras 4 para tener más condiciones de células y condiciones de electrocultivo.
Introducción
Para obtener información a cerca de la condición fisiológica de las células, de los posibles efectos de los campos eléctricos
aplicados a ellas, y por lo tanto a los tejidos de los organismos de donde proceden, se diseñó y construyó una unidad de
celda de electro-cultivo, como parte de un conjunto mayor de cinco unidades Figura 1. Con este dispositivo, se podrá
estudiar la adhesión celular, difusión y la motilidad de las células. El experimento original y algunos estudios previos,
procede de Galvani [1]. En otras investigaciones, se ha encontrado que la aplicación de una estimulación por campo
eléctrico de estimulación “Electric Field Stimulation (EFs) promueve ciertas reacciones electroquímicas que contribuyen a
la regeneración de los tejidos vivos [2]. Para estudiar dicha información y con el diseño y construcción de una Celda de
Electro-Cultivo Celular, en este trabajo se discute el mapeo de las conductividades que se presentan en una pequeña área
de un polímero conductor (polipirrol), localizada entre dos electrodos de oro, a través de los cuales se aplica un gradiente
de Voltaje Directo (“DC”). La sección del polímero conductor en contacto con cada uno de los electrodos de oro; no se
mojan con el líquido fisiológico y nutrientes, que contienen el cultivo celular y que se encuentra entre dichos electrodos
Figura 2. Se espera que con dicho mapeo se pueda aplicar un voltaje directo o pulsado, dentro de los tejidos (campos
eléctricos endógenos), para estudiar cómo responden las células a estos gradientes y su papel en el desarrollo de la
reparación de los tejidos.
58
Figura 1 Figura 2
Discusión Teórica
La conductividad eléctrica de una solución es la expresión numérica de su capacidad para transportar una corriente
eléctrica. Esta capacidad depende de la presencia de iones en la solución, de su concentración total, de su movilidad, de
su carga o valencia y de las concentraciones relativas, así como de la temperatura a la cual se realiza la medición. De los
muchos factores que afectan el comportamiento de los iones en solución, las atracciones y repulsiones eléctricas entre
los iones y la agitación térmica, son quizá los más importantes. Estos efectos se expresan a través de un parámetro
conocido como “fuerza de la solución”,
; en donde Ci y Zi representan la concentración y la carga iónica del componente i. La mayoría de los
ácidos, bases y sales inorgánicas son relativamente “buenos conductores” de la corriente eléctrica. Inversamente, las
soluciones acuosas de solutos orgánicos, que no se disocian o se disocian muy poco en el agua, poseen conductividades
eléctricas muy bajas o similares a las del agua pura. Los conductímetros miden la resistencia de una solución (sistema
acuoso) al paso de una corriente eléctrica y convierte estos valores en unidades inversas de “conductividad eléctrica”.
Estas corrientes eléctricas son referenciadas al contenido de sólidos y una temperatura dada con respecto a la del NaCl.
Como la resistencia de un cuerpo es inversamente proporcional a su sección transversal y directamente proporcional a su
longitud, se considera como estándar de comparación la resistencia de un cubo de 1 cm de lado del material que se
examina, el reciproco de esta medida es la Conductancia Específica.
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Resistencia, Conductancia y Conductividad
Para un cierto volumen de una solución, su resistencia, R, viene dada por:
Donde ρ es la resistividad de la solución (en ohm.cm), A es el área a través de la cual se produce el flujo
eléctrico (en cm2) y l es la distancia entre las dos planos considerados (en cm). La resistividad, que normalmente
es una función de la temperatura, es una característica del material en el cilindro y es independiente de la forma
geométrica del material mientras que R depende de cuan largo y grueso es el cilindro. Tomando el recíproco de la
relación anterior se obtiene.
Cilindro de sección transversal A y longitud l. El cilindro puede ser un metal o una solución acuosa de un
electrolito. Se define la conductancia electrolítica (L) como la magnitud inversa de la resistencia (L=1/R) cuya
unidad son Siemens (S o Ω-1
). Definimos la inversa de la resistividad como la conductividad. Re-escribimos la
relación anterior como
Esta expresión es la Conductividad Específica. Las unidades de κ son entonces, S cm-1. De acuerdo con la
ecuación la expresión de ( ) la conductividad de una disolución es la conductancia de la misma
encerrada en un cubo de 1 cm3 (= 1cm, A = 1cm2). La razón (l/A) se define como la Constante de la Celda de
conductividad, K. La relación última relación, ahora se puede escribir:
= K * L El valor de κ no es una cantidad muy útil para comparar la conductividad de diferentes solutos en soluciones de
diferente concentración, esto es debido a que si una solución de un electrolito tiene mayor concentración que
otra, la más concentrada tendrá mayor conductividad por tener más iones. El estándar de calibración que
normalmente se usa es el KCl. La Constante de una celda en particular se calcula por medio de la siguiente
expresión:
C, cm-1 = 0.001412 RKCl[1 + 0.019(T-25)] ; en donde:
R KCl = resistencia medida en ohms, y T = temperatura en ºC. La equivalencia de unidades en esta expresión es
como sigue:
S/m = (ohms-m)-1
; mho/cm = (ohms-cm)-1
; µS/cm = µmho/cm; S – siemens DMEM growth medium buffer (conductivity, 14,507 μS).
Existen métodos y programas de computación donde se puede simular la distribución de las líneas de flujo de un
campo eléctrico Figura 3, sin embargo, en el diseño de nuestro dispositivo, los electrodos no hacen contacto
directo con el medio de cultivo, que es una solución electrolítica con nutrientes, (D-MEM con 0.37% NaHCO3,
60
Suero Fetal Bovino al 10% y suplementado con Antibiótico-Antimicótico), y una conductividad de 14,507 μS).
La conducción se establece a través de la película de Polipirrol la cual tiene un espesor del orden de d 100 m,
en este sentido, podemos suponer que nuestro sistema se puede procesar en dos dimensiones sin cometer mucho
error.
Figura 3 En un tejido lesionado, se entiende al potencial de lesión como la diferencia de potencial entre tejidos heridos y el
potencial de las zonas no heridas. Un potencial de lesión es un gradiente de voltaje con corriente constante de larga
duración (Corriente Directa, DC) inducido dentro de los espacios intracelulares y extracelulares por corrientes que fluyen
dentro y alrededor de una célula lesionada. Se sabe que la estimulación por campo eléctrico endógena, (EFs) está
presente muchas horas o días en heridas y en las áreas de migración durante el desarrollo y crecimiento de una célula
activa por lo tanto se considera que hay fuerte evidencia de que este tipo de estimulaciones son esenciales para regular
apropiadamente, el comportamiento de una célula durante la morfogénesis y regeneración del tejido [5].
Para estudiar el efecto de la corriente eléctrica en los tejidos, se diseñó una celda de electro-cultivo con un sistema
especial de electrodos que consisten en, placas delgadas de oro (4 x 20 x 0.3 mm) las cuales fueron colocadas dentro de
empaques de Silicón ajustados para que los electrodos tengan contacto eléctrico solo con la película de polipirrol. Lo
anterior, nos sirve para aplicar en una forma uniforme la estimulación de campo eléctrico (EFs), en una zona con límites
bien definidos, por ejemplo en la regeneración de un tejido por medio de una estructura de soporte o andamio, resulta
ventajoso utilizar como materiales de andamios un conductor orgánico biodegradable. Anteriormente se ha reportado la
obtención de películas de polipirrol por polimerización con plasma que presentan una superficie conductora que puede
ser usada como andamio, el cual puede ser conectado a un circuito eléctrico como un simple conductor en el que sólo las
células o en el andamio se ven afectadas por la estimulación eléctrica [3].
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Nivel del Líquido
Electrodos de oro x
V
Conclusiones
Por claridad y falta de espacio, los resultados del efecto de la estimulación del crecimiento celular por Campo eléctrico, se
presentan en el cartel con amplificación suficiente para observar dicho efecto.
Referencias
[1]. Guixin Shi, Mahmoud Rouabhia, Shiyun Meng, Ze Zhang., Journal of Biomadical Materials Research. Part A, 1026-
1037 (2007).
[2]. Trojanowicz M, Matuszewski W, Podsiadła M., Biosens Bioelectron. 5, 149-156
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(1990).
[3]. Lassalle N, Vieil E, Correia JP, Abrantes LM., Biosens Bioelectron. 16: 295–303,
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[4]. Geddes LA and Hoff HE. The discovery of bioelectricity and current electricity. The
Galvani-Volta controversy. IEEE Spectrum 8: 38–46, 1971.”
[5]. McCaig, Colin D., Ann M. Rajnicek, Bing Song, and Min Zhao. Controlling Cell
Behavior Electrically: Current Views and Future Potential. Physiol Rev 85: 943-978,
2005; Physiol Rev • VOL 85 • JULY 2005
[6]. G.J. Cruz, J. Morales, R. Olayo. Films obtained by plasma polymerization of pyrrole
Thin Solid Films, 342, 119-126, 1999