Arch. exper. Path. u. Pharmakol., Bd. 207, S. 525--539 (1949).

Aus der Medizinischen Klinik Kiel.

Darstellung und Eigenschaften yon Verdoglobinen. IV. Mitteilung *.

Kristalliner VerdNo2-porphyrindimethylester. Von

~ENS ALSLEV und MANFRED KIESE.

Mit 5 Textabbildungen.

(Eingegangen ant 23. April 1949.)

Aus dem Verd~o~, der prosthetischen Gruppe des VerdoglobinNo, 1, wurde in einer friiheren Untersuchung 2 ein Porpkyrindimethylester erhalten, der sich durch seine S£urelSslichkeit, Liehtabsorption und einige Reaktionen dem Spirographisporphyrindimethylester als sehr ~hnlich erwies. Eine Reinigung des Porphyrinesters bis zur Kristalli- sation konnte seinerzeit nicht durchgefiihrt w~rden. Wir haben jetzt. den Ester kristallin erhalten.

Es wurde zuntLchst versueht, aus grSBeren Ansgtzen der frtiher be- sehriebenen Art 2 den Ester zur Kristallisation zu bringen. Each Ent- eisenung des Verd~o~. und gleichzeitiger Veresterung in Methanol, das mit Chlorwasserstoff gesgttigt war, wurde der Farbstoff in Xther iiber- ftihrt und dureh fraktionierte Extraktion eine Trennung yon dem Protoporphyrindimethylester und geringen Mengen anderer Farbstoffe erreieht. Der VerdNo.-porphyrindimethylester wurde wieder in Xther getrieben, der Xther im Vakuum verjagt und der Ester in Chloroform aufgenommen, hTach Einengen des Chloroforms und Zugabe von Xther sollte der Ester zur Kristallisation gebraeht werden. Es fiel dabei zwar ein grtiner Farbstoff aus, der jedoch aueh nach wiederholtem AusFgllen aus Chloroform mit Ather nicht kristallisierte.

Erfolgreieh erwies sich dagegen eine Trennung der Enteisenung und Veresterung. Mit konzentrierter Ameisens~ure und Ferrum reductum wurde das Eisen aus dem VerdNo ~ und beigemisehtem H~m entfernt. Das Porphyringemisch wurde dann mit Methanol-HC1 verestert und aus -~ther mit Salzsgure fraktioniert. SchlieBlich wurden dann aus Chloro- form-Azeton einheitliche Kristalle mit konstantem Schmelzpunkt erhalten.

FISCHER und DEILMANN 3 konnten durch Chromatographie eine

Trennung yon Spirographisporphyrinester und Protoporphyrinester

* III. Mitteilung: Arch. exper. Path. 205, 747 (1948). 1 KIESE, M.: Arch. cxper. Path. u. Pharm~kol. $04, 385 (1947). 2Y~EsE, M.: Arch. exper. Path. u. Pharmakol. 204, 439 (1947). ~FlSCHER, H., u. K. O. DmLMA~N: Z. physiol. Chem. 280, 186 (1944).

35*

526 JENS ALSLEV undMA~rREDKIEsE:

durchfiihren. Da wir zun/~chst eine Identit/~t des Verdxo: und des Spirographisporphyrindimethylesters annahmen, versuchten wir eben- falls, durch Chromatographie den Proto- von dem Verdl~o-porphyrin- ester zu trennen. Das Estergemisch wurde in _Ather oder Chloroform ~/uf eine mit _~ther oder Chloroform eingeschlemmte Aluminiumoxyds/~ule gegeben und mit Ather oder Chloroform nachgewaschen. Die weitaus gr5Bte Menge des Farbstoffgemisches wanderte einheitlich ohne Schich-

tenbildung durch (lie S/~ule. Spektroskopisch waren beide Ester etwa in dem ursprting- lichen Verh~iltnis in der L5- sung nachweisbar. In der obersten Schichte der S/£ule wurde ein braunroter Farb- stoff adsorbiert, der mit ~ ther gar nicht, mi t Chloro- form nur sehr gering, da- gegen sehr gut mit Methanol aus der Si~ule zu eluieren war. Spektroskopisch lag in dem Methanol ebenfalls ein Gemisch yon Proto- und Verd~o -porphyrin vor. Wur- de dieses Gemisch erneut mit Methanol-Salzsi~ure ver- estert, in ~ ther iibergeftihn und chromatographiert , so ging diesmal die Haupt -

Abb. t. VerdNo2-porphyrindimethylester aus menge der Farbstoffe gleich- Chloroform-Azeton. Vergr. 1 : 480. mitBig dureh die Siiule. Es

scheint deshalb der SchluB gerechtfertigt, da6 es sich bei dem bei tier ersten Chromatographie in der obersten Schicht adsorbierten Farbstoff- gemisch um geringe Mengen unveresterten Porphyrins gehandelt hat. Zur Reinigung des Verd uo -porphyrinesters wurde deshalb die Chromato- graphie zweimal in den pri~parativen Arbeitsgang eingeschaltet.

Da sich der Verd~=o -porphyrinester chromatographisch anders ver- hielt als der Spirographisporphyrinester, sehien uns eine Identiti~t der beiden schon danach nicht mehr sehr wahrscheinlich zu sein. Eine Ent- seheidung konnte dutch die Kristallform und den Schmelzpunkt des Verd~-o-porphyrinesters getroffen werden. Der Spirographisporphyrin- ester yon FISCHER und DEILMANI~ und auch der analytische Spiro- graphisporphyrinester von WAI~t~G und NEGELEI~ 4 kristallisierte in

4WARBUI~O, O., u. :E. NEGELEII~: Biochem. Z. 244, 239 (1932).

Darstetlung and Eigenschaften yon Verdoglobinen. 527

gleichmi~l~igGn, sehri~g abgeschnittenen Prismen mit einem SGhmelzpunkt yon 282 283 o bzw. 280 281 o (Ko~ER). Der Verd~o2-porphyrinester kristallisierte aus Chloroform-AzGton in gleiGhmiil~igen rhombisGhen KristallGn, wobei der stumpfe Winkel des Rhombus abgerundet war und der spitze WinkG1 noehmal sGhri~g abgeschnitten ersehien (Abb. 1). Aus Chloroformi~ther kristallisierte der Ester in !anzettfSrmigen Kristal- len (Abb. 2). Bei beiden Kristallformen lag der Schmelzpunkt konstant bei 269 o (KorLER) und i~nderte sigh auGh naGh mehrmaliger Umkristalli- sation night. - - Das RSntgendia- gramm des VerdHo:porphyrindime- thylesters, (lessen genaue Auswer- tung bei der B6sehreibung der Versuche folgt, kann mit dem RSntgendiagramm des Spirographis- porphyrindimethylesters night ver- glichen werden, da FISCHER und DEILMANN aul]er einer verkleinerten Abbildung des RSntgendiagramms keine weiteren Daten mitgeteilt haben.

Das quanti tat ive Absorptions- spektrum der LSsung des kristallinen VGrdNo-porphyrinesters zeigte hin- siGhtliGh tier Maxima seiner Banden noGh gr6Bere l~bereinstimmung mit dem Spektrum des Spirographis- A b b . 2 . V e r d N o 2 - p o r p h y r i n d i m e t h y l e s t e r

porphyrinesters als das friihere Spek- aus Chloroform-~.ther. Vergr. 1 : ~:80.

t rum der lediglich durch Salzs~ure- ~therfraktionierung gewonnenen Esterl5sung (Tabelle 1). Ebenso wie der SpirographisporphyrinestGr zeigte das Spektrum des Verdso -por- phyrinesters Rhodotyp mit intensivster dritter Bande, die Reiherrtolge

Tubelle 1. Extinktionsmaxima des VerdNo-porphyrindimethylesters und des Spirographisporphyrindimethylesters in mt~.

VerdNo ,-porphyrindimethylester, Kristalle gel6st in Chloroform.

~LSLEV-~.IESE VerdNo~-porphvrin~methv|ester in ~ther, Dioxan und P3rridin

~F, SE ~

Spirographisporphyrind imet hyle ster in Chloroform WAm3uRo 4,

Spektrum identisch mit dem Spiro- graphisester yon FISCHER und

DEILMANN a

I 642, ][I 581, III 558, IV 518/19 Reihenfolge der Intensitaten:

III, II, IV, I 1 640, II 580, ]II 555, IV 512 Reihenfolge der Intensit/£ten:

III, :[I, IV, I 1 643, II 581,5 III 558, IV 517,5

Reihenfolge der Intensiti~ten: III, IV, II, I

528 JENS ALSLEV und MAN:FRED KI~SE:

der Intensit/iten in Chloroform wich allerdings yon der des Spirographis- porphyrinesters ab.

Nach katMytischer Hydrierung des VerdNo-porphyrinesters in Ameisens/~ure wurde ein Porphyrin erhalten, dessen Spektrum in Ather mit dem Spektrum des hydrierten Spirographisporphyrinesters 3 eben- fMls weitgehend fibereinstimmte. Da nach der Hydrierung des VerdNo - porphyrinesters ein Spektrum von reinem _Atiotyp resul$ierte, ist er- wiesen, dab der Rhodotyp des VerdNo.-porphyrinesters durch eine Carbonylgruppe in einer Seitenkette bedingt war. Wiirde er durch eine kernst/£ndigo Carboxylgruppe wie beim Rhodoporphyrin hervorgerufen, wiirde auch nach der Hydrierung der Rhodotyp erhalten bleiben. Diese

Tabelle2. Extinktionsmaxima des hydrierten VerdNo~-porphyrindimethylestem und des hydrierten Spirographisporphyrindimethylesters sowie des VerdNo.~-por- phyrinesteroxims und des (2.Desiithyl) - 2-azetylrhodoporphyrindimethylesteroxim,

in Dioxan.

Hydrierter VerdNoo-porphyrin- dimethylester in Ather

Hydrierter Spirographisporphyrin- dimethylester in Xtber,

FISCHER und DEILMAI~N a

VerdNo.-porphyrindimethylesteroxim in Chloroform

Oxim des (2 Des~thyl)-2-acetylrhodo- porphyrindimethylester in Dioxan

:[ 623, I I 571, I I I 529, IV 496 97 Reihenfolge der Intensiti~ten:

IV, 1II, II, I 1 625, I I 571, I I I 528,7, IV 496 Reihenfolge der Intensit~ten:

IV, III , I, I I 1 632, I I 577, I I I 547, IV 509 Reihenfolge der Intensit/iten:

III , IV, II, I 1 631, I I 575, I I I 548, IV 509 Reihenfolge der Intensit/~ten:

III , IV, II, I

Feststcllung hat insofern Bedeutung, als das Oxim des Verd~o-por- phyrinesters in Chloroform in soinem Spektrum mit dem des Oxim.s des (2-Des/~thyl)-2-acetylrhodoporphyrindimethylesters 5 iibereinstimmt (Tabelle 2), und wir darum auch die MSglichkeit erw/~gen muBten, dab bei der Bildung des VerdoglobinNo ~ eine Propions/£ure bis auf ein Carb- oxyl oxydativ abgebaut w/irde.

Bei verschiedener Kristallfbrm, abweichendem Schmelzpunkt und iibereinstimmendem Spektrum des Spirographisporphyrinesters und des VerdNo2-porphyrinesters sowie der hydrierten Porphyrinester w/~re es mSglich, dab es sich bei dem Verd,~o-porphyrinester um ein dem Spirographisporphyrinester isomeres Porphyrin handelte. Bei der t3ber- fiihrung des Protoporphyrindimethylesters in den Spirographispor- phyrindimethylester erhielten FISCHER und DEILMAN/~I 8 in geringen Mengen einen Porphyrinester, der sich bei abweichender Kristallform und anderem Schmelzpunkt in seinem Spektrum yon dem Spirographis-

5 STERN, A., u. H. WENDERLEI~: Z. phys. Chem. 176, 81 (1936).

Darstellung und Eigenschaften yon Verdoglobinen. 529

porphyrinester nieht untersehied. Genauere Angaben fiber diesen Ester fehlen, FISClIER und ])EILMANN bezeichnen ihn als Isospiro- graphisporphyrinester 3. Seine Kristallform, die sich genau wie beim Verd~o-porphyrinester fiber runde B1/ittehen entwickelt, /~hnelt der des Verd~o-porphyrinesters . Die Schmelzpunkte beider Porphyrine liegen dicht beieinander: Verd~o ~- porphyrinester 269 0 (KoFL]~R), Isospirographisporphyrinester 269°--2710 (KoFLER). ])a sich die Ester sowohl wie ihre Hydrierungsprodukte augerdem im Typ des Spektrums und der Lage der Banden gleiehen, ist es sehr wahrscheinlich, dab der VerdNo-poI3phyrinester mi t dem Isospirographisporphyrinester iden-

• tisch ist und nicht mit dem Spirographisporphyrinester. Bis die Iden- tit/~t jedoeh durch weitere Untersuchungen ganz sicher erwiesen ist,

Tabelle 3. Extinktionsmaxima des Porphyrins nach Resorcinschmelze des VerdNo~- f~orphyrindimethylesters und des Spirographishiimindimethylesters im Vergleich

zum Deuteroporphyrindimethylester.

Porphyrin des Verd?co~-porphyrin- dimethylesters nach Resoreinschmelze

in Pyridin-)[ther Porphyrinester des Spirographishamin- dimethylesters naeh Resorcinschmelze

in Pyridin-~ther, FISCHER und SEEMANI~ 6

Deuteroporphyrindimethylester in Chloroform

1 622/23, I I 570, 111 536, 1V 498 Reihenfolge der lntensit~ten:

1V, III , II, I 1 623, I I 568,5, I I I 525,1, IV 488

Reihenfolge der Intensitkten: IV, III , I, I I

1 619,9, I I 575,5, I I I 565, IV 529,8, V 496

Reihenfolge der Intensit/~ten: V, 1V, I, I11, 11

m6chten wir den yon uns beschriebenen Porphyrinester vorerst als VerdNo-~porphyrinester bezeichnen.

])as nach der Resorcinschmelze des Verd~o -porphyrinesters erhal- tene Porphyrin wich in seinem Spektrum in der 3. und 4. Bande yon dem des Porphyrinesters, der nach der Resorcinsehmelze des Spirographis- h/imindimethylesters erhalten wurde, ab% Beide Spektren zeigten dar- fiber hinaus aber deutliche Untersehiede yon dem zu erwartenden Spektrum des Deuteroporphyrindimethylesters ~, s (Tabelle 3).

Stiirkere Abweichungen in der Lage der Absorptionsbanden gegen- fiber den gleichen ])erivaten des Spirographisporphyrinesters zeigten das Oxim und das Nitril des VerdNo -porphyrinesters. Auf Zusatz von Hydroxylaminhydrochlorid und wasserfreiem Natr iumearbonat zu der LSsung des Esters in Pyridin t r a t Blauverschiebung der Banden ein. Es

CFIsc~.R, H., u. C.v. SEE~A~: Z. physiol. Chem. 242, 133 (1936). T SeHUMM, O.: Z. physiol. Chem. 176, 122 (1928). S FxscHER, It., u. G. ItUMMEL: Z. physiol. Chem. 181, 114 (1929).

530 JE~S ALSLEV und MA:NFRED K I E S E :

Tabelle4. Extinktionsmaxima der Oxime des VerdNo:-porphyrindimethylesters und de8 Spirographisporphyrins.

0xim des VerdNo~-porphyrindimethyl- esters in Chloroform

Oxim des Spirographisporphyrins in Ather (FIsCH]~I~ und SEEMA~ 6)

I 632, II 577, III 547, ]V 509 l~eihenfolge der Intensit~ten:

III, IV, II, I 1 638--40, II 579,8, ]II 543, IV 507

]:~eihenfolge der Intensit~ten: III, IV, II, I

blieb zwar der Rhodotyp des Spektrums mit intensivster dritter Bande erhalten, die vierte Bande fiberragte jetzt aber weitaus die zweite. Lage

¢, (-

Abb. 3. Ein yore VerdNo2-porphyr ind ime thy le s t e r abweichendes Po rphy r in , gewonnen aus V e r d N o -

Kr i s ta l l i s i e r t aus Chlorofo~ro Kther u n d Ghloroform-Aze ton .

der Maxima im Vergleich zum Spirographisporphy- rinesteroxim s. Tabelle 4

Unter Behandlung des Oxims mit EssigsKure- anhydrid, bei der sich wahr- s cheinlich das Nitril bildete~ trat Rotverschiebung der Banden mit deutlicherer Auspri~gung des Rhodotyps auf. AuBerdem war jetzt wieder, wie bei demVerdNo, - porphyrinester, Bande I I h6her als Ban@ IV. Hin- sichtlich der Lage der Ban- den zeigten sich auch bier deutliche Abweichungen vom Spirographisporphy-

rinnitril (Tabelle 5). Auf Behandlung der LSsung des VerdNo,-porphyrinesters in Pyridin

mit Benzoylchlorid, durch die bei Anwesenheit yon reaktionsf~higen Hydroxylgruppen eine Einfiihrung der Benzoylgruppc in die Molekel mit J~nderung des Spektrums zu erwal~en w~re, trat keine Xnderung des Spektrums auf. Danach sind reaktionsf~hige Hydroxylgruppen in der Molekel nicht anzunehmen.

Tabelle 5. Extinktionsmaxima der Nitrile des VerdNo~.porphyrindimethylester~ und des Spirographisporphyrins.

Nitril des VerdNo~-porphyrindimethyl- ! + esters in Chloroform

Nitril des Spirographisporphyrins in )~ther (FISCHER und SE~MA-n~ 6)

1 634, II 579, I II 55], IV 514 l~eihenfolge der ]ntensitaten:

III, II, IV, I I feh]t, II 581,2, I I I 548,6, IV 506

Reihenfolge der Intensit~ten: , I I I , IV, II, I fehlt

Darstellung und Eigenschaften yon Verdoglobinen. 581

Nicht immer ffihrte der eingangs dargestellte Arbeitsgang zum kristallinen VerdNo -porphyrinester. Aus uns zur Zeit nicht erkli~rliehen Grfinden erhielten wir einmal bei sonst gleichem Arbeitsgang ein Por- phyrin, das in sehr feinen sehriig abgesehnittenen Prismen kristallisierte und bis 3500 noch keinen Schmelzpunkt zeigte (Abb. 3).

V e r s u c h e .

A. Methodik.

1. Als Ausgangsmaterial ffir die Herstellung des VerdNo. wurden mit isotonischer KochsalzlSsung gewaschene rote l~inderblutk5rperchen

b e n u t z t . 2. Extinktionsmessungen im sichtbaren Geblet wurden mit dem

Spektrophotemeter yon ZeiB-Ikon durchgeffihrt, das vor den Messungen mit der Hg-, Cd- und Zn-Emission geeicht worden war. A|s Mal~ ffir die Extinktion wurde der spezffische Extinktionskoeffizient angegeben:

1 1 lo Io c d g 1 '

c = Konzentration in g/100 ml; d = Sehiehtdicke in Zentimeter. 3. Angaben fiber Sti~rke oder HShe yon Banden beziehen sich auf

spektrophotometrisehe Messungen, nieht auf Sehi~tzungen mit dem Auge im Spektroskop.

4. Die ehromatographisehe Adsorption wurde an einer Aluminium- oxyds~ule (A120 a standardisiert nach BROCK~AN~) yon 10 em Li~nge und 11/2 em Durchmesser bei m~l~igem Sog der Wasserstrahlpumpe vorgenommen.

5. Sehmelzpunkte wurden mit dem Mikroschmelzpunktapparat nach KOFLER bestimmt.

B. Darstellun9 des Verd~o.

Die Darstellung des VerdoglobinNo ~ aus H~imoglobin, Natrium- nitrit und Wasserstoffperoxyd bei einem pK yon 6,2 erfolgte in der bereits frfiher beschriebenen Weise 1, wobei lediglicb die Mengen der einzelnen Reaktionspartner vergrSSert wurden: 1500 ml gewaschene rote Rinderblutk6rperchen, 1000 ml Phosphatpuffer 0,1 ml, p ~ 6,2, 105g Natriumnitri t und 30- -50ml Wasserstoffperoxyd {30%). Der Ansatz bleibt zun~chst 6--8 Std bei Zimmertemperatur unter gelegent- lichem Umrfihren stehen und wird dann 3 4 Tage in Cellophan- sehl~uehen gegen fliefiendes Leitungswasser dialysiert. Es liegt dann der grfine Farbstoff als Verdiglobin vor. Zur Darstellung gr61~erer Mengen Verd~o ~ erweist sich dessen Abtrennung vom Globin mit salzsaurem Azeton als am ergiebigsten und sparsamsten, da die grS$te Menge des Azetons durch Destillation wiedergewonnen werden kann. 110 ml mit 2 ml 20%iger Salzs~ure anges/~uerte VerdiglobinlSsung werden aus

532 JENS ALSLEV und ~ANFR]~D ~IESE :

einer Pipette langsam unter stiindigem Umrfihren in 1000 ml mit 2 ml 36%iger Salzsiiure anges~uertes Azeton gegeben. Vom ausgeflockten, noeh etwas grfin erscheinenden Protein wird abfiltriert und die Aze- tonlSsung mit einigen ml Ammoniak alkaliseh gemacht. Dabei flockt naeh knrzer Zeit das VerdNo:, aus und setzt sich nach 24 Std ab. Das noch schwach grfin gef~rbte fiberstehende Azeton wird abgesaugt, der Rest abfiltriert und das abgetrennte VerdNo. bei 370 getrocknet. Aus- beute: yon 1500 ml roten Zellen 25 g rohes VerdNo ~ mit einem Eisen- gehalt yon 2 - -4%.

C. Darstellung des VerdNo-porphyrinmethylester~'. Zur Enteisenung werden 6 g Verd~o ~ in 300 ml 98%iger Ameisen-

s~ure (d = 1,22) unter gelindem Sieden gelSst. ~'ach dreimaliger Zu- gabe yon 2 g Ferrum reductum in Abstiinden yon 5 rain und nach weiterem Sieden fiber 15 min ist aus dem VerdNo ~ das Eisen abgespalten. Die jetzt leuchtend rote LSsung wird filtriert und mit 600 ml gesiittigter Ammonium- oder Natr~umazetatlSsung versetzt, wobei das braunrote Porphyrin ausflockt. Naeh Filtrieren und Wasehen mit reiehlich Wasser wird das Porphyrin bei 37 o getroeknet. Ausbeute an Porphyrin etwa 1,8 g.

Die vSllige Enteisenung des Verd~o 2 ist ffir die Isolierung des Por- phyrinesters sehr wichtig. Bei einem Ansatz wurde zur Enteisenung kein reines Ferrum reductum verwendet, so dab offensichtlich keine ~-611ige Abtrennung des Eisens aus der prosthetischen Gruppe erfolgte. Auch in diesem Ansatz wurde ebenso wie bei alleiniger Enteisenung durch Methanol-Salzs~ure die Kristallisation dureh die Anwesenheit eines grfinen Farbstoffes, der dltreh die weiteren Reinigungsschritte nicht zu entfernen war, gest6rt.

Das aus 6 g Verd~o ~ gewonnene Porphyrin wird in 1200 ml Methanol gebraeht, das bei Zimmertemperatur mit Chlorwasserstoff ges~ttigt worden ist. Nun wird 6 Std unter Rfickflul3kfihlung gekocht, wobei Veresterung des Porphyrins eintritt. Naeh dem Erkalten werden jeweils 200 ml in 600 ml Ather gegeben und bis zur alkalischen Reaktion mit 5 n Natronlauge versetzt. Von der waI~rigen L6sung wird abge- trennt, der ~ the r mehrmals mit Wasser gewaschen und schlieltlich mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Spektroskopisch zeigt der "4ther mindestens 5 Banden. Zwei im Rot gelegene Banden weisen dar- auf hin, dab ein Gemisch mindestens zweier Porphyrine vorliegt. Die langwelligere, im Rot gelegene Bande stellt die erste :Bande des Verd~oj porphyrinesters dar, w~thrend es sich bei der im kurzwelligen Teil des Rot liegenden Bands um die erste Bande des Protoporphyrinesters handelt. Bei der weiteren Aufarbeitung, die unter stiindiger spektro- skopischer Kontrolle erfolgt, bildet das Intensit~ttsverh~ltnis dieser

Darstellung und Eigenschaften yon Verdoglobinen. 533

beiden Banden ein Ma~ fiir die Reinheit des Verd~o-porphyrindi- methylesters.

Nach Chromatographie des -~[thers an Aluminiumoxyd, bei der in der obersten Schicht wenig unverestertes Porphyrin entfernt wird, wird dem _~ther zun~chst zweimal mit 150 ml 2%iger Salzsgure, dann zweimal mit 150 ml 3%iger und schliel~lich mit 150 ml 4%iger HC1 vorsiehtig der Protoporphyrinester entzogen. Spektroskopisch soll jetzt die Bande des Protoesters im Rot nicht mehr sicher nachweisbar sein. Mit jeweils 200 ml 8%iger ItC1 auf 300 ml Xther wird dem ~ther der VerdNo-porphyrinester entzogen und sofort wieder mit 5 n Natronlauge in 200 ml peroxydfreien, destil]ierten ~ ther getrieben. Nach mehrmaligem Waschen wird der ~ ther mit Natriumsuffat getrock- net. Der Mutter/ither, der noch schwach rotbraun gef/irbt ist, enth~lt in geringen Mengen andere, nicht welter isolierte Farbstoffe.

Zur weiteren Aufarbeitung wird, die ~therlSsung nochmals an Aluminiumoxyd chromatographiert, wobei jetzt in der obersten Schicht

'der S~ule nur Spuren unveresterten Porphyrins adsorbiert bleiben. Die XtherlSsung wird dann im Vakuum zur Trockne gebracht und der Riick- stand in wenigen ml Chloroform aufgenommen. Die Chloroforml6sung wird bis auf ein kleines Volumen eingeengt und mit der 2--3fachen Menge )[ther versetzt. Nach kurzem Stehen fKllt der Verd~co-porphy- rindimethylester aus. Eine einheitliche Kristalfform liegt zun~chst noch nicht vor. ])as Spektrum der 1Vfutterlauge zeigt noch die Anwesen- heir yon Protoporphyrinester. Erst nach 5--6maliger Umkristallisation aus Chloroform-~ther bilden sich gleichm~Bige, runde Kristalle aus, deren Sehmelzpunkt bei 255-2570 (KoFL~R) liegt. Zur weiteren Reinigung wird jetzt 3--4real aus Chloroform-Azeton umkristallisiert. Dabei Kndert sieh die Kristallform. Der VerdNo.-porphyrinester liegt jetzt in etwa rhombischen Kristallen mit abgerundeten stumpfen Winkeln vor (Abb. 1). Der Schmelzpunkt liegt jetzt bei 2690 (Ko~EI~) und ~ndert sich aueh bei weiterem Umkristallisieren nicht. Auch erneute Umkristallisation aus Chloroform-~ther fiihrt zu keinem hSheren Schmelzpunkt. Dabei kristallisiert der Ester jetzt in lanzettfSrmigen Kristallen, die vielfach in Rosettenform angeordnet sind (Abb. 2). Ausbeute: aus 10 g VerdNo, ~ etwa 2 mg Porphyrinester.

Bei der Darstellung des VerdoglobinNo 2 handelt es sich um eine Oxydation der prosthetischen Gruppe des Blutfarbstoffes. ])urch die l/ingere Behandlung des Verd~o ~ mit Ameisens~ure-Eisen erfolgt often- bar eine Reduktion, da sich sp~ter das Verh~ltnis des Verdso- porphyrinesters zum Protoester gegeniiber dem urspriinglichen Ver- h~ltnis Verdso ' zu Hi~m erheblich zu Ungunsten des VerdNo-porphy- rindimethylesters versehiebt. NebeR der Reduktion dutch Ameisen- s~ure-Eisen entstehen durch die unvollkommene Veresterung mit

534 JE~s ALSL]~V und. MA~I~D KIES~:

Methanol-Salzs~ure, die Salzsi~ure-~therfraktionierung und die sehr hi~ufige UmkristaUisation bis zur v511igen Reinigung des Verdso ~- porphyrindimethylesters grSBere Substanzverluste, so dab vorerst die Ausbeute bei der Darstellung des Verd ~o.:porphyrinesters sehr gering ist.

D. Chromatographisches Verhalten des Gemisches yon Proto- und VerdNo "- porph yrindimeth ylester.

1. AlcOa, standardisiert nach BROC~MAZ~, 10/11/2 cm, mit Methanol- HC1 pri£pariert. Das Gemisch yon Proto- und Verd~o-porphyrinester wird in Methanol-HC1 auf die S£ule gegeben. Es bildet sich eine m/~Big griin gefi~rbte Schicht, die keine Unterteilung aufweist. Nach Zugabe

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Wellenl~nge m ~ A b b . 4. E x t i n k t i o n d e s V e r d N o : - p o r p h y r i n d i m e t h y l -

e s t e r s i n C h l o r o f o r m . A b s z i s s e : W e l l e n l a n g o in r ag . O r d i n a t e : S p e z i f i s c h e r E x t i n k t i o n s k o e f f i z i e n t

1 1 I o e . . . . . c d " l o g ~ - , c K o n z e n t r a t i o u i n g /100 m ] ,

d S c h i c h t d i c k e i n Z e n t i m e t e r l

von salzsaurem Methanol wandert die Zone ohne Schichtenbildung ge- sehlossen abw~rts. Aus der S~ule erfolgt mit Chloroform gute Elut ion.

2. S~ulewie oben. Alu- miniumoxyd mit Xther eingesehlemmt. Das Ge- miseh der beiden Ester wird nach ~berfiihrung in Xther auf die Saule ge- geben und mit ~ther nach- gewasehen. Dabei wan- deft eine rote Farbzone

gleichm/~Big durch die S/iule. Spektroskopisch zeigt die /itherische FarblSsung ein doppeltes Porphyrinspektrum mit 2 intensiven Banden im Rot. In der obersten Schicht der S~ule bildet sich eine dunkel- braune Zone, die mi~ ~ther nicht, mit Chloroform sehr sehlecht, dagegen sehr gut mit Methanol aus der Schicht zu eluieren ist. Die MethanollSsung gibt das gleiehe doppelte Porphyrinspektrum wie die durchgelaufene ~therlSsung.

3. Nach l~berfiihren des Porphyringemisches aus Methanol in ~thev wird der ~ ther im Vakuum verjagt und der Rfiekstand in Chloroform aufgenommen. Die ChloroformlSsung zeigt gegenfiber der ~therlSsung unver/~ndertes doppeltes Porphyrinspektrum.

S~ule wie oben. Aluminiumoxyd mit Chloroform eingesehlemmt. Beim Durehlaufen der ChloroformlSsung ist dasselbe Verhalten wie bei der Chromatographie der ~therlSsung zu beobaehten. Eine rote Zone wandert auf Naehwaschen mit Chloroform oder ~ther gleich- m~13ig durch die S/~ule, eine Trennung der beiden Porphyrinester finder nicht start.

Darstellung und Eigenschaften yon Verdoglobinen. 535

4. Das Methanol, mit dem der in der obersten Schicht adsorbierte Farbstoff eluiert ist, wird mit Chlorwasserstoff ges~ttigt und 3 Std unter RiickfluBkiihlung gekocht. Nach l~berffihren in ~ther mit 5 n Natronlauge wird der ~ther wie oben an Aluminiumoxyd chromato- graphiert. Der grSl~te Teil des Farbstoffes wandert jetzt durch die S~ule, w~hrend in der obersten Schicht nur wenig brauner Farbstoff adsorbiert wird.

E. Spektrophotometrische Untersuchung des Verd~o-porphyrindimethyl- esters.

3,2 mg kristal l inerVerdso-porphyrindimethylester werden in 10 ml Chloroform geliSst. Von Verdiinnungen dieser LSsung werden quanti- tative Absorptionsspektren aufgenommen. Die Absorptionsmaxima ]iegen in allen Kurven bei 642, 581,558 und 518/19 mju. Das Spektrum zeigt Rhodotyp, Reihenfolge der Intensit~ten I I I , I I , IV, I (s. Abb. 4). Die gemessenen Extinktionen bei verschiedenen Wellenl~ngen sind in Tabelle 6 wiedergegeben.

TabeUe 6. Spezifische Extintctionslcoe//izienten des Verd~o~-Torphyr~ndimethylestera in Chloro]orm.

~ = ~ . ~-- log -, c Konzentration in g/100 ml, d Sehiehtdieke in Zentimeter.

(Mittelwert aus 2 Absorptionskurven versehiedener Konzentragion.)

~ V e l l e n l h n g e W e l l e n l ~ n g e s W e l l o n l h n g e e m.u n%u mD

650 645 642 640 635 630 625 620 615 610 605 600 595 590

31,6 585 40,6 581 43,9 580 38,7 575 30,5 570 20,3 565 18,5 56O 18,5 558 21,1 555 35,3 550 44,5 545 66,2 540 94,2 535

121,5 530

143,9 150,9 149,5 135,6 131,3 154,8 219,2 224,4 215,6 152,4 103,1 85,8 80,3 91,2

525 520

518/19 515 510 5O5 500 495 490 485 48O 475 470 465

114,0 131,7 134,7 125,0 92,9 68,3 54,1 41,7 34,4 26,1 21,9 20,6 21,4 40,0

F. RSntgenuntersuchung des Verd~o-porphyrindimethylesters. Die R5ntgenuntersuehung des Verd~o-porphyrindimethylesters

wurde yon Herrn Prof. Dr. J. LEONHARDT und Dr. W. BERDESINSKI, Mineralogisehes Inst i tut der Universit~t Kiel durchgefiihrt*. Sie gaben uns dariiber folgenden Befund:

* An dieser Stelle m(ichten wit Herrn Prof. Dr. J. L]~ONHARDT und Herrn Dr. BERDESINSKI fiir die Ausffihrung der Untersuchung danken.

536 JENS ALSLEV u n d M A N F R E D K I E S E :

Von dem uns iibergebenen Pri~parat wurden unter folgenden Aut- nahmebedingungen Debyeogramme angefertigt: Miiller-Mikro 60-RSnt- genapparatur, Cu-K:c-Strahlung, Ni-Filter, Blendendurchmesser 1,0 mm Kameradurchmesser 57,3 mm.

~kbb. 5. R f n t g e n d i a g r a m m des V e r d ~ T 0 2 - p o r p h y r i n d i m e t h y l e s t e r s . P r ~ p a r a t s e c h s m a l a u s C h l o r o f o r m - ~ . t h e r u n d anschl ie l~end f i i n f m a l a u s C h l o r o f o r m - A z e t o n u m k r i s t a l l i s i e r t .

Expositionszeiten 4 und 8 Std bei 40 KV und 20 mA. In der an- geh~ngten Tabelle (s. Tabelle 7) sind die jeweiligen geschKtzten Inten- sit , ten und die gemessenen v%Werte der auftretenden Linien auf-

gefiihrt. Die Zufiigung Tabelle 7. Auswertung des ~6ntgendiagramms des

VerdNo~-porphyrindimethylesters.

Lfd . Nr .

1 2 3 4 5 6 7 8 9

l0 l l 12 13 14 15 16 17 18 19 20

B e o b a c h t e t e Gescht~tzte ~ - W e r t e In tens i t~ , t G r a d

mittel s. stark

stark mittel stark

s. s. stark schwach schwach schwach

s. schwach mittel-schwach

schwach schwach

: schwach mittel-schwach

} i Intensit/tt so sehwaeh, dab genaue Winkel- Ii angabe nieht m6glieh

} 5,9 7,1 8,25 9,65

11,35 12,85 14,2 15,25 16,5 18,7 20,2 21,1 23,0 24,3 25,8

~27,9 ~29,8 ~34,0 ~41,5 ~45,0

einer Eichsubstanz mul l to unterbleiben, da das Pr/iparat noch zu wei- teren Untersuchungen benutzt werden sollte. Die vq-We~e der 16. und der folgenden Linien sind nur grSl~enord- nungsm/~$ig angegeben, da eine genaue Vermes- sung dieser Linien wegen ihrer/~uBerst schwachen Intensit/it niehti mSg- lich war. ])as RSntgen- diagramm ist in Abb. 5 wiedergegeben.

Die Symmetrie der Kristi~llchen kSnnte mit Riicksicht auf F o r e und optisches Verhalten monoklin sein. Diese

Frage konnte aber auf Grund des vorliegenden Materials nicht gekl/irt werden. Die Kristallpl~ittchen haben folgenden Querschnitt: an zwei gegenfiberliegenden Eeken verrundete, schiefwinklige Parallelogramme.

Darstellung und Eigenschaften yon Verdoglobinen. 537

G. Hydrierung des Verd~o.-porphyrindimethylesters.

Eine kleine Menge kristallinen VerdNo-porphyrinesters (weniger als 0,5 mg) wird in 4 ml wasserfreier Ameisens~ure gelSst und 50 mg 10%iger Palladiumasbest hinzugegeben. Es wird dann 2 Std bei Zimmertemperatur durch Einleiten yon Wasserstoff hydriert. Die ursprfinglich blauviolette Farbe der LSsung schl~gt dabei in eine mehr rStliche urn. Vom Palladiumasbest wird abffltriert und die Ameisen- s~ure in etwa 20---30 ml Ather gegeben. Nachdem der Ather bis zur neutralen Reaktion gewaschen worden ist, wird das Porphyrin dem ~ther mit l~oiger Salzs~ure entzogen und sofort wieder mit ges~ttigter NdtriumazetatlSsung in frischen ~ther getrieben. Der ~ther wird noch zweimal mit Wasser gewaschen und dann mit/qatriumsulfat getrocknet. Spektrum in~ther: I 623 II 571 III 529 IV 496/97 mju. Reihenfolge der Intensit~ten: IV, III, II, I.

H. Resorcinschmelze des VerdNo2-porphyrindimethylesters.

Eine kleine )/[enge kristallinen Verdso-porphyrinesters (weniger als 0,5 mg) wird mit 50 mg Resorcin vermischt und 20 min bei 180 bis 2000 geschmolzen. Die Schmelze wird in 0,5 ml Pyridin aufgenommen und anschlie~end in 15 ml Eisessig-Xther (1:3) gegeben. Durch reich- liches Waschen mit Wasser wird das Pyridin und der Eisessig entfernt. Die Waschfliissigkeit ist von gelber Farbe ohne ein bandenfSrmiges Spektrum. Dann wird dem Xther mit 3,6%iger Salzs~ure die Haupt- menge des Porphyrins entzogen und sogleich wieder mit ges~ttigter NatriumacetatlSsung in frischen Xther getrieben. Der Xther wird ge- waschen und mit Natrinmsulfat getrocknet. ~I)ie Fraktionierung wird mit 3,6%iger Salzsi~ure noch einmal wiederholt und anschlie•end die getrocknete XtherlSsung auf ein kleines Volumen eingeengt. Spektrum in Ather: I 622/23 II 570 I I I 536 IV 497/98m~u. Reihenfolge der Intensitiiten: IV, III, II, I.

I. Darstellung des VerdNoo-porphyrindimethylesteroxims.

1 mg kristalliner Verd~o/porphyrinester wird in einigen ml ana- lysenreinem Pyridin aufgenommen und bis zum gelinden Sieden erhitzt. Dann werden 80 mg Hydroxylaminhydrochlorid und 80 mg wasser- freies Natriumcarbonat hinzugegeben, noch 10 minim Sieden gehalten und heii~ filtriert. Im Vakuum wird auf 1--2 ml eingeengt und vorsich- tig mit hei~em Wasser versetzt. Nach lgngerem Stehen im Eisschrank tritt fast vollsti~ndige Ausflockung eines braunroten Farbstoffes auf, der abzentrifugiert und mehrfach mit Wasser und Methanol gewaschen wird. Mikroskopisch handelt es sich um kleinste, rund erscheinende

538 JENS ~LSLEV und ~A:NFRED KIESE:

Partikel. Der Versuch einer Kristallisation aus Chloroform-Methanol fiihrt ebenfalls zu diesen kleinsten Teilchem deren genaue Form infolge der Kleinheit nicht festzustellen ist.

Der Farbs toff wird in Chloroform aufgenommen und an Aluminium- oxyd (standardisiert nach BR()CKMAN~), das mit Chloroform in ein 15/1 cm Rohr eingesehle'mmt wurde, ehromatographiert. In der ober- sten Sehieht werden geringe Mengen eines braunen Farbstoffes ad- sorbiert, der mit Methanol zum Teil eluierbar ist, jedoch kein Banden- spektrum zeigt. Offenbar handelt es sich um Verunreinigungen. Da- gegen wandert eine gleichm~l~ige rosarote Zone unter Nachwaschen mit Chloroform geschlossen durch die S~tule. Wegen der geringen Menge wird yon dem Versuch einer Kristallisation abgesehen und lediglieh ein Absorptionsspektrum aufgenommen. Spektrum in Chloroform: I 632 I I 577 I I I 547 IV 509 mEc Reihenfolge der Intensit~ten: I I I , IV, I I , ].

J. Darstellung des Verdxo-porphyrindimethylesternitrils.

Die LSsung des VerdNo..-porphyrinesteroxims in Chloroform wird im Vakuum zur Troekne gebracht und das rficksti~ndige Oxim in einigen ml Essigs~ureanhydrid aufgenommen. Nachdem etwa 5 min bis zum Sieden erhitzt worden ist, wird das Essigs~ureanhydrid im Vakuum verjagt und der rfickst~ndige Farbstoff in Chloroform aufgenommen und wie das Oxim an AlcOa chromatographiert. Auch hier wandert unter Nachwaschen mit Chloroform eine gleichm~l~ige rosarote Zone durch die S~ule. Nach Einengen dieser FarblSsung wird das Spektrum auf- genommen. Spektrum in Chloroform: I 634 I I 579 I I I 551 IV 514 m/t. Reihenfolge der Intensit~ten: I I I , I I , IV, I.

K. Ein von dem VerdNo..-porphyrinester verschiedenes Porphyrin aus derl~ VerdNo .

Ein nach dem fibliehen Arbeitsgang gewonnener Ansatz von Verdxo,- porphyrinester zeigte nach dreimaliger Kristallisation aus Chloroform- ~ither noch keine einheitlichen Kristalle. Er wurde mehrere Woehen im Vakuumexsikkator im Eisschrank aufbewahrt und dann weiterver- arbeitet. Nach dreimaliger Umkristallisation aus Chloroform-Azeton t raten jetzt sehr schri~g abgeschnittene Kristalle auf, die auch bei weiterer Umkristallisation ihre Form nicht ~nderten. Ein Schmelzpunkt wurde bis 3500 nicht beobachtet. Spektrum in Chloroform: I 643 I I 590 I I I 558 IV 518 m#. geihenfolge der Intensit~ten: I I I , IV, I, I I . Auffallend hohe 1. Bande.

Weitere Untersuchungen mit diesem Porphyrin wurden bisher nicht durchgefiihrt.

Dars t e l l ung u n d E i g e n s c h a f t e n y o n Verdoglobinen. 5 3 9

Zusammenfassung. Aus dem VerdNo ~ wurde der bereRs friiher beschriebene Porphyrin-

dimethylester rein dargestellt. Nach der Kristallform, dem Schmelz- punkt und dem ehromatographischen Verhalten besteht keine Identit~t mit dem Spirographisporphyrindimethylester. Das Spektrum des Oxims und des Nitrils des VerdNo -porphyrinesters zeigt ebenfalls erhebliche Abweichungen yon den Spektren der entsprechenden Derivate des Spirographisporphyrinesters,

Dagegen besteht eine ~hnlichkeit beziiglich der Kristallform, des Schmelzpunktes und des spektralen Verhaltens mit dem Isospiro- grapbisporphyrindimethylester yon FISCHER und D E I L ~ N . Solange eine Identit~t dieser beiden Porphyrine jedoch nicht eindeutig bewiesen ist, bezeiehnen wir den von uns aus dem VerdNo~ dargestellten Por- phyrinester als den Verd~o/porphyrindimethylester.

Arch. exper. Pa th . u. PharmakoL, Bd. 207. 36