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C U R S O S E M B I O L O G I A , B I O Q U Í M I C A , B I O T E C N O L O G I A E E N G E N H A R I A B I O L Ó G I C A

Bioinformática

João [email protected]

Aula T11-T12

Esquema de anotação Annothaton

1. ORFs? Coordenadas? Quadro de leitura? Cadeia + ou -? (SMS ORF Finder)

2. Existem proteínas homólogas? (BLASTp, BLASTx)3. Existem domínios funcionais? Onde? (InterProScan)4. Qual o tamanho / massa molecular da proteína codificada

pela ORF em aa / kDa?5. A que organismo ou táxon pertencerá a sequência

metagenómica? (BLAST Taxonomy Report)6. Relações filogenéticas (MSA; Prof. Rita Castilho)7. Conclusões e Análise de Resultados (PONTO PRINCIPAL DA

AVALIAÇÃO)

BLAST Taxonomy Reports

Lineage Report

A importância do Organism Report

Valor EScore

Critérios de decisão de taxonomia da fontebiológica de sequências metagenómicas

� Escolher o táxon que tenha valores E e scores com diferenças significativas com os restantes taxa

� Caso haja apenas taxa com valores E e scores muitopróximos (não significativos) essa sequência não édiagnosticante para esse táxon; por isso escolher um táxon mais abrangente

Esquema de anotação Annothaton

1. ORFs? Coordenadas? Quadro de leitura? Cadeia + ou -? (SMS ORF Finder)

2. Existem proteínas homólogas? (BLASTp, BLASTx)3. Existem domínios funcionais? Onde? (InterProScan)4. Qual o tamanho / massa molecular da proteína codificada

pela ORF em aa / kDa?5. A que organismo ou táxon pertencerá a sequência

metagenómica? (BLAST Taxonomy Report)6. Relações filogenéticas (MSA; Prof. Rita Castilho)7. Conclusões e Análise de Resultados (PONTO PRINCIPAL DA

AVALIAÇÃO)

Temas da Aula T7

� Taxonomia (Annotathon)� Ontologia Génica (GO)� Conclusões (Annotathon)

Taxonomia

� Uma das funções das anotações (meta)genómicas é a definição do táxon da fonte de material genético

Tipos de Classificações

� Classificação hierárquica (de Lineu)� Classificação cladística

Classificação Hierárquica de Sistemas Biológicos

� Domínio� Superreino, Reino, Subreino� Superfilo, Filo (≈ divisão), Subfilo� (Superclasse,) Classe, Subclasse� Superordem, Ordem, Subordem (, Infraordem)� (Superfamília, Epifamília,) Família, Subfamília (, Tribo,

Subtribo, Infratribo)� Género, Subgénero� Espécie, Subespécie� Estirpe (≈ variedade)

Clades

Clades – ramos monofiléticos de uma árvore filogenética

Monofilia, Parafilia e Polifilia

� Grupo monofilético – grupo taxonómico que provém de um ancestral comum cujos descendentes se encontram incluídos neste grupo (≈ grupo holofilético)

� Grupo parafilético – grupo taxonómico que provém de um ascendente comum cujos descendentes se encontram parcialmente incluídos neste grupo

� Grupo polifilético – grupo taxonómico que provém de mais que um ascendente

Monofilia, Parafilia e Polifilia

Clades

NCBI Taxonomy Database

� Cada táxon tem um nº de identificação - NCBI numerical identifier ou Taxonomy ID

Taxonomia: Annotathon

� http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/

� Pesquisa por táxon ou identificador numérico

� Colocar o identificador numérico no campo Taxonomy para o táxon menos abrangente ao qual a sequênciadeverá pertencer com uma elevada probabilidade (analisarvalores E do BLAST e o nó imediatamente superior do ramo à qualpertence a sequência em estudo das árvores filogenéticas obtidas)

� Raramente se consegue identificar até à espécie a fontebiológica de sequências metagenómicas

Temas da Aula T11

� Taxonomia (Annotathon)� Ontologia Génica (GO)� Conclusões (Annotathon)

Ontologia Génica (GO)

� Componente celular (biologia celular)

� Função molecular / bioquímica (biologia molecular)

� Processo Biológico (biologia de sistemas)

Iniciativa bioinformática (geneontology.org) para definir termos GO em três domínios diferentes:

Componente Celular

� Localização do produto génico dentro e / ou fora da célula

� A localização é uma pista onde a proteína / RNA actua na célula, que por sua vez é uma pista para a sua função

Bioinformática da previsão do tráfico intracelular

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=mboc4.figgrp.2303

Tráfego Biossintético

Tráfego Retentivo

Tráfego Endocítico

Vias de tráfego biossintético, endocítico e retentivo

A via biossintético-secretora inicia-se no RER


Existência de péptido sinal numa sequência é indicadora de que a proteína é secretada ou está no sistema endomembranar


Existência de péptido sinal numa sequência é indicadora de que a proteína é secretada ou está no sistema endomembranar


Tráfego Biossintético-Secretor

Existência de um sinal de retenção ou domínios transmembranaresnuma sequência é indicadora de que a proteína é membranar

Tráfico intracelular para mitocôndrias e cloroplastos

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?highlight=Transport,Proteins,Mitochondria,Chloroplasts&rid=mboc4.section.2176

Proteínas com assinaturas de importação para mitocôndrias deverão ter localização mitocondrial


Proteínas com assinaturas de importação para cloroplastosdeverão ter localização plastidial


Ferramentas bioinformáticas para prever a localização intracelular de proteínas

�PSORThttp://psort.nibb.ac.jp/

�SignalP Web Serverhttp://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/

�TargetDBhttp://targetdb.pdb.org/

Ontologia Génica




Iniciativa bioinformática (geneontology.org) para definir termos em trêsdomínios diferentes:

Biologia molecular de um gene

� Função bioquímica / molecular de um gene e respectivo produto (RNA e / ou proteína) (por ex., catálise enzimática)

� Ligação a outras moléculas

Exs: lactase, acetil-CoA carboxilase, ligação a DNA

Ontologia Génica




Iniciativa bioinformática (geneontology.org) para definir termos em trêsdomínios diferentes:

Processos biológicos

� Metabolismo das purinas� Metabolismo de glícidos� Locomoção� Fototactismo / Fototaxia� Fotossíntese� Respiração� Etc.

Conjunto de eventos moleculares com princípio e fim bem definidos:

Exemplo de termo GO

� Gene product: Actin, alpha cardiac muscle 1, UniProtKB:P68032

� GO term: heart contraction ; GO:0060047

Utilização de termos GO no Annotathon

� Escolher a função molecular e / ou o processo biológico em que a proteína / RNA participa

� Para realizar esta anotação verificar quais os termos obtidos no BLAST e InterPro

� Caso não existem termos GO nas anotações do GenBank, analisar os valores E de sequências homólogas ou domínios funcionais homólogos e atribuir termos GO à sequência e explicar a vossa decisão em RESULT ANALYSIS

Annotathon: Análise de ResultadosCritérios de Avaliação

� ORFs� Massa Molecular� Domínios� BLAST e Lineage Report� MSA� Filogenia e Taxonomia� Ontologia� Conclusões

Critérios de Avaliação: ORFs e Análise de Resultados respectiva

� Codão START existe? Está correcto?� Codão STOP existe? Está correcto?� ORF contém codões STOP internos?� Discute qual o quadro de leitura e cadeia em que ela se

encontra?� Existem ORFs maiores? Se sim, discute porque não escolheu

essa para ser analisada?� Existem ORFs adicionais com significado biológico?� Determinou se a sequência é codificante ou não?� Disse que era não codificante quando o tamanho da sequência

não aponta para isso?� Discute quantas ORFs encontrou nas duas cadeias?� O protocolo está correcto e completo?

Critérios de Avaliação: Massa Molecular

� Não calculou a massa molecular da proteína quando a proteína está claramente completa?

� Calculou a massa molecular da proteína quando a proteína está claramente incompleta?

Domínios Proteicos e Análise de Resultados

� Discute a lista de domínios presente em RAW resultse respectivas funções?

� Discute os valores E respectivos?� Discute quais os domínios correctos e os domínios

redundantes (sobrepostos)?� Discute a função da proteína à luz dos domínios

encontrados?� Os domínios estão correctamente apresentados no

esquema gráfico?� Colocou os resultados todos em RAW RESULTS?

BLAST: Análise de Resultados

� A lista de resultados (hits) está completa?� A lista dos 12 melhores alinhamentos está completa? Tem

sequências a mais?� Analisa os valores E, o nº de hits e a localização das homologias nos

alinhamentos?� Analisa a função possível da proteína?� Analisa se a proteína tem proteínas homólogas conhecidas?� O protocolo está correcto?� Desistiu logo com resultados do BLASTp sem ter tentado análises

alternativas (por ex., BLASTx)?� Discute os resultados do Lineage Report?� Discute a escolha dos ingroups e outgroups?� Discute a escolha das sequências para fazer os alinhamentos

múltiplos?� Escolheu o nº máximo de hits correcto?

MSA: Análise de Resultados

� Determinou o início da ORF olhando para os resultados do MSA?

� Discutiu se as sequências no MSA têm o mesmo tamanho?

� Os resultados do MSA batem certo com os resultados dos domínios? Isso é discutido?

� O alinhamento MSA está correcto e bem apresentado (contém nomes fáceis de identificar, por ex.)?

� O alinhamento MSA contém sequências repetidas?� Adicionou a ORF desconhecida ao MSA? (erro

frequente!)

Filogenia e Taxonomia: Análise de Resultados

� O protocolo está correcto?� Apresentação da árvore está correcta? Colocaram os

nomes dos taxa (género, classe, por ex.) nas folhas da árvore?

� Discutiu a topologia das árvores?� Realizou a construção de árvores com os 2 métodos

(NJ e ML)?� Discutiu se as árvores são concordantes?� Seleccionou qual o grupo taxonómico mais provável?

Ontologia Génica

� Escolheu o processo biológico correcto?� Escolheu a função molecular correcta?

Conclusões

� Discutir argumentos a favor / contra a hipótese da sequência ser codificante ou não (usar números)

� Discutir a sua função bioquímica e a sua participação num dado processo biológico

� Discutir a classificação taxonómica

O que se deve EVITAR nas Conclusões

� A descrição em que botões se clicou� A descrição do método utilizado� Escrever conclusões mal estruturadas (escrita

telegráfica)� Pôr “palha” na esperança de obter melhor nota� Fazer plágio, copiando e colando descrições de funções

de páginas da Internet (implica anulação da anotação!)� Não relacionar conclusões dos vários campos da

anotação (por ex. Não relacionar os resultados do MSA com os resultados do InterPro)

� Pôr hipóteses sem as fundamentar (referências bibliográficas e / ou números)

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