CURSO NACIONAL DE ATUALIZACAO EM PNEUMOLOGIA

19 A 21 DE ABRIL DE 2007SÃO PAULO - SP

TUBERCULOSE NA ERA PÓS GENÔMICA

AFRANIO LINEU KRITSKIPrograma Acadêmico de Tuberculose

Faculdade de Medicina da UFRJ

0

50

100

150

1990 1995 2000 2005

Tendência da incidência de TB em nível mundial 1990–2004

WHO Report 2006. Global tuberculosis control. WHO/HTM/TB/2006.362

Inci

denc

e pe

r 10

0,00

0

Year

Prevalência de Infecção pelo HIV entre casos de TB em nível mundial

The boundaries and names shown and the designations used on this map do not imply the expression of any opinion whatsoever on the part of the World Health Organization concerning the legal status of any country, territory, city or area or of its authorities, or concerning the delimitation of its frontiers or boundaries. Dotted lines on maps represent approximate border lines for which there may not yet be full agreement. WHO 2005. All rights reserved

HIV prevalence in TB cases, 15-49 years (%)

0 - 45 - 1920 - 4950 or moreNo estimate

Taxas de TBMR entre os casos novos de TB

3 – 6 %

No estimate

> 6%

< 3%

The boundaries and names shown and the designations used on this map do not imply the expression of any opinion whatsoever on the part of the World Health Organization concerning the legal status of any country, territory, city or area or of its authorities, or concerning the delimitation of its frontiers or boundaries. Dotted lines on maps represent approximate border lines for which there may not yet be full agreement. WHO 2006. All rights reserved

TB – multirresistente primáriaTB – multirresistente primária

Tuberculose multirresistente Tuberculose multirresistente TB-MDR TB-MDR

Definição: cepas resistentes a rifampicina e a isoniazida.Definição: cepas resistentes a rifampicina e a isoniazida.

Emergiram na década de 80-90 nos EUA e Europa.Emergiram na década de 80-90 nos EUA e Europa.

No inquérito de 1996 no Brasil No inquérito de 1996 no Brasil TB-MDR primária 1% TB-MDR primária 1% excluiu os soropositivos eexcluiu os soropositivos e população de risco.população de risco.

Estudo global entre 1996-1999 (58 regiões) Estudo global entre 1996-1999 (58 regiões) > 3% dos casos novos. > 3% dos casos novos.

“ “hot spots” hot spots” Estônia (14,1%) China (10,8%)Estônia (14,1%) China (10,8%) Letônia (9%) Ivanovo Oblast (9,0%)Letônia (9%) Ivanovo Oblast (9,0%) Iran(5%) Moçambique(3,5%)Iran(5%) Moçambique(3,5%) India(3,4%)India(3,4%)

Estudo global entre 1999-2002 (77 países) Estudo global entre 1999-2002 (77 países) Europa Oriental e Ásia Central Europa Oriental e Ásia Central com 14% dos casos novos.com 14% dos casos novos.

OMS,2004OMS,200479% dos casos são resistentes a pelo menos 3 fármacos79% dos casos são resistentes a pelo menos 3 fármacos

Tuberculose multirresistente Tuberculose multirresistente TB-MDR TB-MDR (continuação).(continuação).

O RISCO PARA TB-MDRO RISCO PARA TB-MDR - usuários de drogas intravenosas (OR 4,68)- usuários de drogas intravenosas (OR 4,68)

- desabrigados (OR 2,55)- desabrigados (OR 2,55)

-viver em clínica de repouso (OR 2,05)-viver em clínica de repouso (OR 2,05)

- tuberculose anterior (OR2,03)- tuberculose anterior (OR2,03)

- prisões (OR 2,02)- prisões (OR 2,02)

- ser contato de paciente com TBMDR (OR 2,01)- ser contato de paciente com TBMDR (OR 2,01)

- imunossupressão sem HIV (OR 1,96)- imunossupressão sem HIV (OR 1,96)

- AIDS (OR 1,96)- AIDS (OR 1,96)

- trabalhador na área de saúde (OR 1,77)- trabalhador na área de saúde (OR 1,77) OR: OR: odds ratioodds ratio (razão de chance) (razão de chance)

Estudo em 4 paísesEstudo em 4 paísesda União Européia.da União Européia.

Casal Casal et alet al.,2005.,2005

Taxa de notificação de TB em grandes áreas Metropolitanas América Latina - 2004

Área Metropolitana

Taxa de incidência

/100,000

TB/HIV TB-MDR

País Metropi País Metrop País Metrop

Bnos. Aires 27 42,5 Não há vigilância Sistemática

?? 70%

Río de J. Cidade

45,2 114,3 8% 11.2% 42,6%

São Paulo 45,2 59,7 8% 19,5% 17,1%

Lima e Callao 108, 192,3 Não há vigilância Sistemática

?? 85%

Montevideo (1997)

18,8 26,3 Não vigilância Sistemática

ND

OPAS - 2004OPAS - 2004

Técnicas moleculares e suas contribuiçõesTécnicas moleculares e suas contribuições no controle da TBno controle da TB

1.1. Filogenia (SNPs, RDs, etc)Filogenia (SNPs, RDs, etc)

2.2. Determinar distribuição geográfica de cepas (Spoligotyping, etc).Determinar distribuição geográfica de cepas (Spoligotyping, etc).

3.3. Estudo da dinâmica de transmissão (RFLP, MIRU?) Estudo da dinâmica de transmissão (RFLP, MIRU?) (Investigação de surtos, desvendar cadeia de transmissão, (Investigação de surtos, desvendar cadeia de transmissão, conhecer a transmissão populações específicas, identificar fatores e grupos conhecer a transmissão populações específicas, identificar fatores e grupos de risco)de risco)

4.4. Diferenciar reinfecção exógena de reativação/infecção policlonal Diferenciar reinfecção exógena de reativação/infecção policlonal (RFLP, DR-PCR)(RFLP, DR-PCR)

5.5. Detectar contaminação laboratorial Detectar contaminação laboratorial (RFLP, DR-PCR)(RFLP, DR-PCR)

6.6. Detectar precocemente a TB por técnicas Amplificação Ácidos Detectar precocemente a TB por técnicas Amplificação Ácidos Nucléicos (i.e.: PCR)Nucléicos (i.e.: PCR)

7.7. Monitorar transmissão de cepas multirresistentes Monitorar transmissão de cepas multirresistentes (Innolipa, (Innolipa, GenotypeMTBDR)GenotypeMTBDR)

Elementos/Eventos genéticos identificados em Elementos/Eventos genéticos identificados em M.tuberculosisM.tuberculosis - bases das ferramentas moleculares. - bases das ferramentas moleculares.

Seqüências repetitivas DRs - SpoligotypingSeqüências repetitivas DRs - Spoligotyping

“ “Single –nucleotide polymorphisms” SNPsSingle –nucleotide polymorphisms” SNPs

Regiões de Deleção (RDs)Regiões de Deleção (RDs)

Seqüências de inserção - RFLP-ISSeqüências de inserção - RFLP-IS61106110

Elementos repetitivos de regiões intergênicas-MIRU-VNTRElementos repetitivos de regiões intergênicas-MIRU-VNTR

A importância de estudos populacionais de genotipagem A importância de estudos populacionais de genotipagem e caracterização integral dos genomas.e caracterização integral dos genomas.

““Single –nucleotide polymorphisms” SNPsSingle –nucleotide polymorphisms” SNPs polimorfismo de base única no gene polimorfismo de base única no gene katkatG códon 463 G códon 463 (Leu463Arg) e no códon 95 (Thr95Ser) do gene (Leu463Arg) e no códon 95 (Thr95Ser) do gene gyrgyrAA três grupos genéticos principais (PGG)três grupos genéticos principais (PGG)

Grupo 1Grupo 1 kat katG códon 463 CTG (Leu) e G códon 463 CTG (Leu) e gyrgyrA códon 95 ACC (Thr)A códon 95 ACC (Thr) AncestraisAncestrais

Grupo 2 Grupo 2 katkatG códon 463 CG códon 463 CGGG (Arg) e G (Arg) e gyrgyrA códon 95 ACC (Thr) ) A códon 95 ACC (Thr) ) LAMLAM

Grupo 3 Grupo 3 kakatG códon 463 CGG (Arg) e tG códon 463 CGG (Arg) e gyrgyrA códon 95 AA códon 95 AGGC (Thr) ) C (Thr) )

Sreevatsan Sreevatsan et alet al,1997,1997

Visão evolucionária proposta por Sreevatsan, 1997.Visão evolucionária proposta por Sreevatsan, 1997.

A contribuição da conhecimento das deleções noA contribuição da conhecimento das deleções nogenoma degenoma de M.tuberculosis M.tuberculosis

Seqüênciamento de Seqüênciamento de M.tuberculosisM.tuberculosis e e M.bovisM.bovis - - comparação genômicacomparação genômica

Identificação de regiões de deleção/inserçãoIdentificação de regiões de deleção/inserção

Ex: Ex: 10 regiões deletadas (RD1-RD10) em 10 regiões deletadas (RD1-RD10) em M.bovisM.bovis- - Pasteur estão presentes na cepa H37RvPasteur estão presentes na cepa H37Rv

dentre 7 regiões de deleções (RD4-RD3) emdentre 7 regiões de deleções (RD4-RD3) em M.bovis M.bovis verificou-se que RD1-RD3 sãoverificou-se que RD1-RD3 são específicasespecíficas

as regiões RD9 são exclusivas de as regiões RD9 são exclusivas de M.africanumM.africanum

Esquema evolucionário proposto por Esquema evolucionário proposto por Brosh Brosh et alet al, 2002, 2002

Grupo 1 Grupo 1 Grupo 2 Grupo 2 Grupo3Grupo3

EstirpesEstirpes modernasmodernas

M.tb M.tb evoluiu em paralelo ao evoluiu em paralelo ao M.bovis M.bovis

ESTUDOS DA DINÃMICA DA TRANSMISSÃO DE TBESTUDOS DA DINÃMICA DA TRANSMISSÃO DE TB

Método padrão ouro de genotipagem RFLP – Método padrão ouro de genotipagem RFLP – IS6110 IS6110 (cepas (cepas clustercluster))

““Mycobacterial Interspead Repetitive Units” Mycobacterial Interspead Repetitive Units” MIRU-VNTR:MIRU-VNTR:

Amplificação por PCR de elementos repetitivos dispersosAmplificação por PCR de elementos repetitivos dispersos em regiões intergênicas .em regiões intergênicas .

Repetições possuem 40 a 100pb e variam em número deRepetições possuem 40 a 100pb e variam em número de repetições e comprimento(VNTRs).repetições e comprimento(VNTRs).

12 loci e 15 loci.12 loci e 15 loci.

Manualmente seguida por gel de eletroforese ou automatizado.Manualmente seguida por gel de eletroforese ou automatizado.

Técnica mais fácil de realizar que o RFLP. Técnica mais fácil de realizar que o RFLP. Mas ainda não é considerada padrão ouro para análise de cluster no Mas ainda não é considerada padrão ouro para análise de cluster no

contexto clínico-epidemiológicocontexto clínico-epidemiológico

O método de genotipagem pelo MIRU-VNTR:O método de genotipagem pelo MIRU-VNTR:

Posição dos 41 MIRU-VNTR no cromossomo do M. tuberculosis H37Rv. O primeiro número indica a posição de cada lócus ocupado por um MIRU-VNTR. A letra c indica orientação contraria a estabelecida por Cole et al, em 1998. Algarismos romanos indicam o tipo de MIRU (I, II ou III). Os números seguintes indicam a localização de cada loci. A esfera em preto indica os 12 loci com número variável de MIRU-VNTR.

Reinfecção exógena de pacientes HIV. Tipagem por DRE-

PCR e RFLP

Lourenço Lourenço et alet al. 2000 no Brasil e Warren R, 2005 na Africa do Sul . 2000 no Brasil e Warren R, 2005 na Africa do Sul

Uso de técnicas moleculares para confirmar reinfecção com Uso de técnicas moleculares para confirmar reinfecção com nova cepa Mtb, mesmo em países em desenvolvimentonova cepa Mtb, mesmo em países em desenvolvimento

Países desenvolvidos – Década de 1990

Fatores de risco para agrupamento genotípico (“cluster”) – INFECÇÃO

RECENTE

• Atendimento anterior em Hospital sem biossegurança• Institucionalização prévia (prisão)• HIV e estágio • Idade • Drogadição

• Resistência • Doença cavitária

Small et al, 1994; Tabet et al., 1994; Shafer et al., 1995; Ferrazoli et al., 2000Diaz et al., 2001; Mc Conkey et al., 2002; Tudó et al., 2001; Barnes et al., 1997; French et al., 1998; Lockman et al., 2000

Estudos de epidemiologia molecular - Novo MilênioEstudos de epidemiologia molecular - Novo Milênio

“Spoligotyping”

Alguns genótipos de Mtb:• se disseminam com maior rapidez• são mais virulentas• mais associadas com falências e recidivas

RFLP

Daley CL. Clin Chest Med 26 (2005) 217 – 231

Bjune G, Clin Exp Immunol. 2006 Sep;145(3):389-97

Na América Latina, não há dados a respeito dos resultados do tratamento anti-TB; associaçao com fatores genotipicos das cepas M. tb; frequência de mutações dos genes de resistência

Estudos que avaliaram distribuição de cepas W/Beijing

Foi descrito associação de surtos MDR em hospitais e prisões

Relevância:• Identificar marcadores geneticos associados a

resistencia a drogas, doença, falência tratamento= desenvolvimento novos testes de identificação simples e rápidos

Kamerbeek et al, 1997Kamerbeek et al, 1997

A.A. Estrutura das DR no Estrutura das DR no genoma das micobactériasgenoma das micobactérias

B. Amplificação das DR B. Amplificação das DR por PCR por PCR

C. Padrões de hibridizaçãoC. Padrões de hibridização spoligo-tipos spoligo-tipos

““Spoligotyping”Spoligotyping”

Baseado no locus “direct-repear” DRBaseado no locus “direct-repear” DRcópia única com 10 a 50 cópia única com 10 a 50 repetições de DR com 36pb separadas por seqüênciasrepetições de DR com 36pb separadas por seqüências espaçadoras 37 a 41 pb (PCR + Hibridização reversa)espaçadoras 37 a 41 pb (PCR + Hibridização reversa)

Principais famílias/sub-famílias do Complexo Principais famílias/sub-famílias do Complexo M. tuberculosis:M. tuberculosis:

• East African and Indian”-5 sub-famíliasEast African and Indian”-5 sub-famílias• Haarlem – 3 sub-famíliasHaarlem – 3 sub-famílias• Middle Eastern Asian -2 sub-famíliasMiddle Eastern Asian -2 sub-famílias• ” ”T”, “S”, “X”T”, “S”, “X”• Latin America and Mediterranean” (LAM) - 10 sub-famíliasLatin America and Mediterranean” (LAM) - 10 sub-famílias• Beijing (sub-tipo antigo e moderno)Beijing (sub-tipo antigo e moderno)

“Spacer oligonucleotide typing” Spoligotyping

Distribuiçao de genótipo Beijing de tuberculose - 2005

Blue: stable, no drug resistance; Red: increasing, associated with drug resistance; Green: increasing, drug sensitive; Yellow: absent; Striped: trend and/or drug resistance not known

>29,000pacientes de 35países

Mutator gene mut, ogt

Relação entre TB resistente e W-genótipo Beijing em Archangel-

Russia - 2005

0%

20%

40%

60%

80%

W-Beijing non-Beijing W-Beijing non-Beijing

community prison

E H R S

Drobniewski F, JAMA 2005; 293 (22): 2726-2731.

8 genotype strains (2001)8 genotype strains (2001)17 genotype strains (2002)17 genotype strains (2002)

Em camundongo infectado com Em camundongo infectado com cepa Beijingcepa Beijing::• maior mortalidademaior mortalidade• maior n. de bacilos no pulmãomaior n. de bacilos no pulmão• menor produção de TNFmenor produção de TNF + + IFNIFN• menor proteção de vacinação menor proteção de vacinação com BCGcom BCG

Virulência de Virulência de M. tuberculosis em M. tuberculosis em camundongo Bcamundongo BALB/cALB/c

Rad M.E. EID 2003; 9:838-845Lopez B. Clin Exp Immunol 2003; 133:30-7.

Cepas resistentes a Isoniazida mais virulentas Cepas resistentes a Isoniazida mais virulentas Análise molecular - HolandaAnálise molecular - Holanda

• Holanda, 1993 - 2002 • 8334 pacientes, 59% estrangeiros• todos os isolados: TSA, IS6110 RFLP• determinação de katG315 de cepas INH resist

592 (7,1%) INH resistente 323 (54,6%) katG315 mutante 269 (45,4%) katG315 tipo selvagem

Transmissibilidade de cepa de M. tuberculosis resistente

Estudo populacional

Van Doorn HR, Clin Microbiol Infect 2006. 12 (8): 769-75

Relação entre perfil katG315 com a ocorrência de agrupamento (cluster)

entre cepas Mtb resistentes a INH

Cluster

SimNão

Odds ratio (95% CI)

INHr315wild

112157

0.69 (0.54-0.89)

INHs

39223818

Ref

INHr315mutant

163160

0.99(0.79-1.25)

Van Doorn HR, Clin Microbiol Infect 2006. 12 (8): 769-75

The population structure of Mycobacterium tuberculosis in different geographic areas

Beijing Beijing genotypegenotype

LAM; LAM; HaarlemHaarlem

LAM; LAM; BeijingBeijing

HaarlemHaarlem

Projects using spoligotyping

PhylogenySpol DB3 (Institut Pasteur, Guadeloupe; Filliol et al. JCM 2003)

(SpolDB4; Brudney et al. 2006)– 12.000 strains (+/- 150 Brazilian) (39.000)– > 90 countries (140)– population genetics, biogeographic distribution and

phylogeny of Mtb Complex

– Rio: 400 patients• >50% LAM

• 7% Haarlem

• 10% new LAM

• Only 2 Beijing

• Finetuning with MIRU-VNTR

MDR TB epidemic in Argentina:rise, decline, aftermaths

Buenos Aires

Rosario

Population

Country: 36,000,000

Buenos Aires: 11,000,000

Rosario: 1,100,000

AIDS association

Hospital setting

Explosive transmission

Rapid progression to disease

Fatal outcome

MDR TB outbreaks arose in the early ´90s in two overpolutated cities

MDR TB outbreakHospital Muñiz, Buenos Aires, 1991-

2000

Profile of outbreak MDR TB strains

Strain CityNumber of cases in

SubLineagekatG3151995 2005

MBuenos

Aires 150 51 Haarlem 2 mut

Ra Rosario 15 12 LAM3 mut

Rb Rosario 8 6T1

(Tuscany) wild

C Buenos Aires 15 1 T5 wild

Análise molecular demonstra a epidemia por TB-MDR de Análise molecular demonstra a epidemia por TB-MDR de cepas Mtb tipo Haarlem 2 na Argentinacepas Mtb tipo Haarlem 2 na Argentina

Papel de outros genótipos de M.tuberculosis em países em

desenvolvimento ?

• Genótipo Beijing infrequente na America Latina (<5%)

• Escassos dados sobre surtos de TB, resistência as drogas analisados com ferramentas moleculares

• Genótipo Haarlem também apresenta mutator gene e pode estar associado com maior virulência e/ou desenvolvimento de resistência

• Sympatric - allopatric

InteraçõesInterações diferentesdiferentes do bacilo comdo bacilo com hospedeirohospedeiro Homem ??Homem ??

Diagnóstico da TuberculoseDiagnóstico da TuberculoseMétodo Vantagens Desvantagens

Baciloscopia simples

rápido, custo sensibilidade baixa

(40% a 70%)

Cultura todas as TB sensível, específico

demorado trabalhoso

BACTEC igual a cultura

mais rápido custo

equipamento

Tuberculina custo baixo inespecífico

Radiológico rápido inespecífico

Amplificar ácido nucléico n

Rápido, elevada sensibilidade e especificidade

amostra respirat

Custo equipamento

Nucleic Acid Amplification Trials

Assay Author n Sens/Spec Smear + Sens Smear - Sens

Gen Probe Abe 135 92/100 100 77Miller 594 91/99 100 73Pfyffer 515 94/98 100 83O'Sullivan 555 91/99 100 75

Roche D’Amato 985 67/100 95 55Wobeser 1480 79/99 98 53Carpentier 2073 86/98 95 74Moore 1009 83/99 99 66Bergman 956 79/100 98 43Ichyama 530 89/100

BD Ichyama 530 95/99.8Pfyffer 799 98/96.5 100 92

Métodos Diagnósticos Amplificação de Ácidos Nucleicos (AAN) Kits commerciais E-MTD assay (Gen Probe Inc) aprovado pelo FDA: baar (-) (+) AMPLICOR MTB kit (Roche )* LC x Probe System (Abbot)* Strand Displacement Amplification** aprovados pelo FDA para escarro baar (+)

LCxLCx®® Mycobacterium tuberculosis Assay Mycobacterium tuberculosis Assay Cobas AmplicorCobas Amplicor™™ Mtb Test Mtb Test

Validados APENAS para:

1. amostras respiratórias

2. pacientes adultos,

3. HIV soronegativos,

4. não tratados para TB

Métodos de detecção da resistênciaMétodos de detecção da resistência

Métodos

Genotípicos

Métodos

Fenotípicos

DNA Heteroduplex Proporções (Canetti et al1963)

SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism)

Automatizados Bactec

460-TB, MGIT 960

Line Probe Assay (INNO-Lipa Rif TB)** LRP - Luciferase Report Phage

Teste Hain p/ INH e RIF ** E-test

Sequenciamento de DNA MIC (MABA,MTT, etc.)

* Padrão ouro; ** Comercializados na Europa* Padrão ouro; ** Comercializados na Europa

Molecular MDR screening with line probe

GenoType® MTBDR

INNO-LiPA Rif.TB

Company Hain Lifescience Innogenetics

M. tub detection Yes yes

Detection of RMP Resistance of M. tub Complex Yes yes

Detection Isoniazid Resistance of M. tub Complex Yes no

Strip Assay Yes yes

DNA-Basis: PCR Yes yes

Culture requested Yes yes

Direct assay No yes (modified version

M. tub-Komplex Detection: 23S-rRNA/16S-rRNA Yes yes

RMP-Resistance: rpoB gene Yes yes

INH-Resistance: katG gene Yes no

Universalcontrol Yes no

rpoB unicontrol Yes no

kat G unicontrol yes no

Comparison GenoType® MTBDR and INNO-LiPA Rif.TB

Prioridades para pesquisa e investimento em Tuberculose – 2006

OMS, UNICEF, Banco Mundial, Universidades de Harvard e da Zâmbia

Fonte: Lancet 367:940-42; march 2006

Melhorar o diagnóstico: otimizar os métodos existentes e implementar novos sob modelo de custo-efetividade

Desenvolvimento de novos fármacos e regimes terapêuticos

Remodelar estratégias de tratamento

Pesquisa social e agenda global: reduzir o risco e a vulnerabilidade

Capacitar unidades para ensaios clínicos

Prioridades para pesquisa e investimento em Tuberculose – 2006

OMS, UNICEF, Banco Mundial, Universidades de Harvard e da Zâmbia

Fonte: Lancet 367:940-42; march 2006

Melhorar o diagnóstico: otimizar os métodos existentes e implementar novos sob modelo de custo-efetividade

Desenvolvimento de novos fármacos e regimes terapêuticos

Remodelar estratégias de tratamento

Pesquisa social e agenda global: reduzir o risco e a vulnerabilidade

Capacitar unidades para ensaios clínicos

Nosso paciente com TBnao conta com novastecnologias, como outras pacientes com • Hepatite B, C• HIV• Doenças Cardíacas• Doenças Renais

PORQUE??

Obrigado

Cidade do Rio de Janeiro

OBRIGADO PELA ATENÇÃO

kritskia@gmail.com