UNIVERSITATEA BIOTERRA BUCURESTIFACULTATEA DE MANAGEMENT AGROTURISTIC

NICOLE-LIVIA ATUDOSIEI PAUL STEFANESCU

CURS MICROBIOLOGIE ALIMENTARAPENTRU UZUL STUDENTILOR IFR / ID

2003

UNIVERSITATEA BIOTERRA BUCURESTIFACULTATEA DE CONTROL SI EXPERTIZA A PRODUSELOR ALIMENTARE

NICOLE-LIVIA ATUDOSIEI PAUL STEFANESCU

CURS MICROBIOLOGIE GENERALAPENTRU UZUL STUDENTILOR IFR / ID

2003

PARTEA I NOTIUNI GENERALE DE MICROBIOLOGIE

Capitolul 1

INTRODUCERE IN MICROBIOLOGIE

In acest capitol va sunt prezentate: definitia microbiologiei microbiologia - stiinta a viitorului ? cand a aparut microbiologia ca stiinta individualizata date semnificative pentru istoricul microbiologiei

1.1 DEFINITIA MICROBIOLOGIEI

MICROBIOLOGIA (micros-mic, bios-viata, logos-vorbire) este stiinta care studiaza forma, structura (morfologia), genetica, procesele metabolice din organismele microscopice si submicroscopice. Microbiologia este o stiinta relativ tanara, care prezinta interes nu numai stiintific, ci si practic, pentru diferite domenii ale activitatii umane: medicina, agricultura, alimentatia, biotehnologia, etc. Fiind ea insasi o stiinta ce s-a putut dezvolta ca urmare a dezvoltarii tehnice si tehnologice, microbiologia a luat amploare abia in ultimele decenii ale acestui secol. Acumularile teoretice si practice din domeniile fizicii nucleare, ale biologiei celulare si moleculare, ale tehnicilor informationale, au condus la imbunatatirea logisticii microbiologiei si, implicit, la dezvoltarea rapida a microbiologiei ca stiinta de mare amplitudine. 3

In

unele

ramuri

industriale,

microbiologia

formeaza

cvasitotalitatea

proceselor tehnologice. Se pot exemplifica astfel industriile fermentative, panificatia, productia antibioticelor, s.a., domenii in care cunoasterea fiziologiei si a metabolismului microorganismelor permite dirijarea corecta a proceselor

tehnologice in vederea obtinerii unor produse utile vietii si activitatii umane, de calitate superioara si cu randamente ridicate. Principalele ramuri subordonate ale microbiologiei, cu statut aparte si avand preocupari specifice, sunt:

bacteriologia - se ocupa cu studiul bacteriilor; micologia - se ocupa cu studiul ciupercilor microscopice si macroscopice; protozoologia - se ocupa cu studiul protozoarelor; virologia - se ocupa cu studiul virusurilor; parazitologia - se ocupa cu studiul parazitismului si organismelor parazite; algologia - se ocupa cu studiul organismelor acvatice simple, numite alge.

La aceste discipline microbiologice trebuie adaugate si domeniile aplicative ale microbiologiei:

imunologia - studiaza sistemul mecanismelor de aparare al organismelor, care le protejeaza fata de o eventuala infectie si/sau de orice substanta straina care patrunde in interiorul lor.

microbiologia

sanatatii

publice

si

epidemiologice - are ca scop

monitorizarea si controlul raspandirii bolilor in comunitati; microbiologia alimentelor si a apei - examineaza rolul pozitiv sau negativ al microorganismelor in alimente si apa; microbiologia solului - studiaza interrelatia dintre microorganism, sol si planta, rolul microorganismelor in fertilitatea solului si in circuitul elementelor biogene in natura; microbiologia agricola - studiaza relatia dintre microorganisme si recolte, in scopul cresterii productiei si calitatii acestora; microbiologia petrolului - studiaza rolul microorganismelor in geneza zacamintelor de petrol; 4

microbiologia mediului - studiaza microorganismele prezente in sol, apa si aer, ocupandu-se de solutionarea problemelor practice din domeniul sanitar; biotehnologia include orice proces prin care oamenii utilizeaza

microorganisme sau procese biologice pentru obtinerea unui produs dorit; microbiologia industriala - utilizeaza microorganisme pentru a produce cantitati mari de produsi utili ca: vitamine, aminoacizi, enzime, medicamente; ingineria genetica - implica tehnici care in mod deliberat modifica fondul genetic al organismelor pentru a induce obtinerea de noi combinatii genice. Reprezinta cel mai dinamic domeniu al microbiologiei moderne.

1.2 SCURTA ISTORIE A MICROBIOLOGIEI

Istoria microbiologiei ar putea fi stucturata in patru etape, si anume:

1. Perioada de individualizare ipotetica a factorului determinant al bolilor, in special umane; 2. Etapa cunoasterii nemijlocite a microorganismelor; 3. Perioada de sintetizare si de corelare a cunostintelor stiintifice in domeniul microbiologiei; 4. Etapa contemporana, de interconectare a microbiologiei cu alte stiinte, in scopul ridicarii valorii sale socio-umane.

Timpul si spatiul tipografic nu permit discutarea pe larg a etapelor istorice ale microbiologiei amintite anterior. Din acest motiv, vom puncta numai cateva momente importante ale istoriei microbiologiei. Fara descoperirea instumentului optic numit microscop, lumea vasta si diversa a microorganismelor nu ar fi putut fi cunoscuta. ANTONIE VAN LEEWENHOEK (1632-1723) este cel care a descoperit lumea invizibila a microorganismelor, fiind primul care le-a observat prin marire cu ajutorul microscopului simplu, cu o singura lentila, de constructie personala. Pe baza desenelor detaliate ale "animalculelor" (animale foarte mici,

mobile) observate pe preparate provenind din diferite medii - apa de ploaie, tartrul dentar si apele din canalele de scurgere - acestea au fost ulterior identificate ca 5

fiind reprezentanti ai bacteriilor,drojdiilor si protozoarelor. Astfel, Leewenhoek a atras atentia asupra microorganismelor, fara sa le acorde statutul unor organisme aparte. ROBERT HOOKE, in urma studiilor realizate la microscop, descoperea in 1665 celula, marcand astfel inceputul unei teorii celulare, consolidate ulterior de alti savanti. MATTHIAS SHLEIDEN si THEODOR SCHWANN, in urma cercetarilor, stabilesc clar teoria conform careia toate organismele, deci si microorganismele, sunt alcatuite din celule. Studiile ulterioare privind structura si functiile celulelor au avut la baza aceasta teorie celulara, constituind una din cele mai importante generalizari ale Biologiei. LAZZARO SPALLANZANI (1729-1799) cunoscand indeaproape

microscopul, se ocupa de teoria " generatiei spontane", subiect controversat in acea vreme. Se credea cu toata convingerea ca "dintr-o substanta organica in descompunere se pot naste spontan organisme vii". Aceasta teorie era cunoscuta de pe vremea lui Aristotel si a fost admisa fara obiectii, deoarece asa sustinea marele Aristotel. In anul 1665, biologul florentin FRANCESCO REDI (1626 - 1697) lanseaza primele critici timide in legatura cu teoria anterior amintita, lansand aforismul "omne vivum a vivo" (tot ce e viu vine din ceva viu). Un secol mai tarziu (1765), Spallanzani aduce argumente si combate teoria lui Aristotel, care avea sa domine totusi pana in 1861, cand Louis Pasteur o inlatura definitv printr-o sintagma ramasa celebra: "si microbii trebuie sa aiba parinti". LOUIS PASTEUR (1822 - 1895), chimist, biolog si imunolog francez, unul dintre intemeietorii stiintelor microbiologice, este cel care a infiintat primele laboratoare de cercetare, fiind considerat geniul microbiologiei. Pasteur a demonstrat ca fermentatiile, considerate anterior procese pur chimice, sunt procese biologice determinate de actiunea microorganismelor, in special anaerobe. El dovedeste ca fermentatia este "un act corelativ unui proces vital", o sursa de energie necesara dezvoltarii germenilor, si ca "o fermentatie determinata are fermentul sau determinant". Realizarea faptului ca drojdiile joaca un rol crucial in fermentatii a reprezentat primul concept care asocia activitatea unui microorganism cu modificarile fizico-chimice ale materiei organice. Extinzand 6

cercetarile sale asupra fermentatiilor, a pus in evidenta natura infectioasa a unor boli ale vinului si ale berii. Pentru impiedicarea alterarii vinului si berii, Pasteur a imaginat procedeul incalzirii blande - pasteurizarea - aplicat ulterior si laptelui si utilizat ca procedeu de sterilizare si in domeniul medical. Au fost puse astfel bazele tehnicilor aseptice care constituie in prezent standardele de laborator. Pasteur stabileste principiul specificitatii microbiene, punand bazele teoriei bolilor infectioase si demonstrand ca acestea sunt rezultatul patrunderii in organism a unor agenti patogeni: intre activitatea unui agent patogen si particularitatile pe care le determina exista o anumita specificitate. Pasteur evidentiaza principiul vaccinarii si stabileste bazele stiintifice ale prepararii vaccinurilor. A demonstrat pentru prima data ca agentii patogeni, chiar cei mai periculosi, pot fi modificati pentru a fi folositi ca vaccinuri. El a numit vaccinuri culturile avirulente utilizate pentru inocularea preventiva ce stimuleaza imunitatea organismului fata de tulpina microbiana virulenta. Incununarea operei sale a fost descoperirea vaccinarii antirabice, aplicata pentru prima data la om in 1885.

ROBERT KOCH (1843-1916), savant german contemporan cu Pasteur, a avut de asemenea un rol deosebit in dezvoltarea microbiologiei medicale, prin descoperirea unor numerosi agenti patologici raspunzatori de numeroase boli la om si animale, cum ar fi tuberculoza, holera etc. El a elaborat o serie importanta de tehnici de izolare, utilizand mediile de cultura solidificate (cu gelatina) pe care cresterea microorganismelor se face sub forma de colonii izolate. Cum o colonie microbiana reprezinta descendenta unei singure celule parentale, insamantarea ei ulterioara intr-un mediu steril genereaza o cultura de celule din aceeasi specie sau tulpina. Descoperirea acestei posibilitati de a obtine culturi pure a constituit un progres care a stat la baza Microbiologiei moderne, deoarece a oferit un mijloc simplu si sigur de izolare a bacteriilor, in vedera studierii biologiei lor, a identificarii si incadrarii lor sistematice. Koch a utilizat tehnici de colorare pentru preparatele microscopice (frotiuri) si in 1882 a identificat bacilul care-i poarta numele (B.K.), agentul patogen al tuberculozei. In 1905, Koch este recompensat cu premiul Nobel pentru fiziologie si medicina. HANSEN (1842- 1909) deschide calea Microbiologiei industriale moderne, prin utilizarea culturilor pure de microorganisme ca starteri de fermentatie. 7

I. MECINIKOV (1845-1946), lucrand la Institutul Pasteur din Paris, a evidentiat procesul de fagocitoza, demonstrand pentru prima data rolul leucocitelor din sange in reactiile de aparare ale organismului fata de agentii patogeni, prin inglobarea si distrugerea acestora. P. EHRICH (1854-1915) este creatorul teoriei moderne a dezinfectiei si chimioterapiei selective, sintetizand primele substante chimice active in terapia bolilor produse de spirochete si protozoare. Lucrarile sale au deschis calea spre era substantelor chimioterapice. S. WINOGRADSKI (1856-1953), intemeietorul Microbiologiei solului, a descris procesul de asimilare la organismele chimiosintetizante si fenomenul de fixare al azotului atmosferic de catre microorganisme. A elaborat metode speciale pentru cercetarea activitatii microorganismelor din sol. A. FLEMING (1881-1955) deschide prin lucrarile sale era antibioticelor, de o mare importanta in medicina si biologie. In 1929 el observa ca unele culturi ale mucegaiului Penicillium elaboreaza o substanta antimicrobiana specifica:

penicilina. Acest prim antibiotic a fost mai tarziu purificat de Florey si Chain (1940), care au oferit terapeuticii infectioase un produs stabil, atoxic pentru om si animal, activ in vivo asupra unor specii de micoorganisme. WAKSMAN in 1944 descopera streptomicina, antibiotic elaborat de multe specii de actinomicete si deschide calea pentru obtinerea de noi antibiotice. TWORT si D'HERELLE (1915-1917) au avut un rol deosebit in evolutia conceptelor fundamentale de bacteriologie si virologie prin descoperirea bacterofagilor (virusuri care paraziteaza bacteriile) si a fenomenului de lizogenie. A. LWOFF a adus contributii deosebite la definirea virusurilor, dupa 1953. El a analizat relatia dintre fag si bacterie, precum si fenomenul de lizogenie sugerand interventia unui mecanism similar in patogenia cancerului. Este laureat al premiului Nobel pentru biologie. Agentii infectiosi subvirali au fost izolati in 1971 de DIENER, care a demonstrat ca moleculele de ARN nude, numite viroizi, pot determina efecte patogene la plante. PRUSINER, in 1981-1984, a demonstrat ca moleculele de proteine, numite prioni, pot fi infectioase pentru om si animale.

8

In Romania, doi savanti de renume mondial, VICTOR BABES si IOAN CANTACUZINO au contribuit la fondarea Microbiologiei moderne. VICTOR BABES (1854-1926) a lucrat in laboratorul lui Pasteur, iar mai tarziu in laboratorul lui Koch. De formatie anatomo-patolog, si-a insusit tehnicile microbiologice si a orientat investigatia medicala spre studiul actiunii reciproce microorganism-gazda. A colaborat cu A.V. Cornil la primul Tratat de Bacteriologie din lume aparut la Paris in 1885. A descoperit noi specii microbiene, a pus in evidenta corpusculii Babes-Negri in celulele nervoase ale indivizilor morti de turbare si corpusculii Babes-Ernst in bacilii difterici. In cercetarile sale asupra antagonismului bacterian a anticipat descoperirea antibioticelor; a studiat numeroase boli infectioase. Este creatorul Institutului "Victor Babes" din Bucuresti si organizatorul primelor laboratoare de igiena si bacteriologie. IOAN CANTACUZINO (1863-1936), format in laboratorul condus de Mecinikov la Institutul Pasteur din Paris, a continuat cercetarile maestrului sau privind imunitatea nevertebratelor. A studiat patogenia holerei, tuberculozei si a altor boli, vaccinul si vaccinarea antiholerica . A creat Scoala contemporana de microbiologie, initial in laboratorul de medicina experimentala al Facultatii de

Medicina din Bucuresti, apoi in Institutul de Cercetari Microbiologice pe care l-a fondat in 1921. Opera acestor doi mari savanti romani a fost continuata de alti savanti de reputatie internationala: Constantin Levaditi, Dumitru Combiescu, Constantin Ionescu-Mihaiesti, Stefan Nicolau, Mihai Ciuca, Gheorghe Zarnea si altii. In perioada de dupa 1910, din totalul premiilor Nobel pentru medicina si fiziologie, peste o treime au fost acordate microbiologilor si specialistilor in discipline inrudite. Microbiologia continua sa progreseze in fiecare an cu ajutorul a noi tehnici si noi date furnizate de cercetare.

9

Capitolul 2

TAXONOMIE SI SISTEMATICA GENERALA A MICROORGANISMELOR

In acest capitol va sunt prezentate: notiuni privind clasificarea, nomenclatura si identificarea microorganismelor nivele de clasificare desemnarea numelui stiintific al speciilor sistemul natural, filogenetic de organizare a lumii vii

2.1 DEFINITII

Taxonomia se ocupa cu studiul organismelor vii.

clasificarii, nomenclaturii si identificarii

CARL VON LINNE', un botanist suedez, a fost cel care si-a dat seama de importanta existentei unui sistem de recunoastere si definire a proprietatilor organismelor, stabilind reguli fundamentale pentru categoriile taxonomice sau taxoni. Sistemul lui Linne' a servit cu succes la incadrarea in categorii a celor peste doua milioane de tipuri diferite de organisme descoperite ulterior. 10

Clasificarea este aranjarea ordonata a organismelor in grupe, preferabil intr-un sistem bazat pe relatii evolutive. Nomenclatura este procesul de desemnare a numelor pentru diferitele ranguri taxonomice ale fiecarei specii de microorganisme. Identificarea este procesul de descoperire si inregistrare a trasaturilor organismelor, asfel incat globala. Toti acesti termeni se aplica in sistematica, ce reprezinta studiul diversitatii microorganismelor si al relatiilor intre ele. ele sa poata fi introduse intr-o schema taxonomica

2.2 NIVELE DE CLASIFICARE

Taxonii principali intr-o schema de clasificare sunt organizati in 7 ranguri descendente, incepand cu un regn, cel mai mare si cel mai general, si terminand cu o specie, cel mai mic si cel mai specific. Toti membrii unui regn au in comun numai una sau cateva caracteristici generale, in timp ce membrii unei specii au in comun majoritatea caracteristicilor lor, reprezentand toti acelasi fel de organism. Intre nivelul superior si cel inferior, cei cinci taxoni in ordine descendenta sunt reprezentati de: phylum (pentru animale si protozoare) sau diviziune (pentru bacterii, fungi, alge si plante), clasa, ordin, familie si gen. Bacteriile sunt studiate, cu rare exceptii, nu ca indivizi, ci ca populatii obtinute in laborator sub forma de culturi pure. Culturile pure pot fi mentinute in stare viabila, subcultivate, supuse testelor experimentale si transportate de la un laborator la altul. Unitatea taxonomica fundamentala este specia bacteriana, care este definita dupa alte criterii decat la organismele superioare. Pentru bacterii nu exista granite strict naturale ale speciilor, nici separare geografica. Sub aspect practic specia bacteriana poate fi considerata ca o colectie de alte tulpini. Tulpina reprezinta unitatea practica de lucru, fiind formata din descendentii unei singure izolari din mediu, in cultura pura. Colonia reprezinta o aglomerare macroscopica de celule, care apare pe o zona bine delimitata a suprafetei mediului de cultura solid si provine din 11

multiplicarea unei singure celule. Una dintre tulpinile speciei este desemnata ca tulpina tip si serveste ca tulpina purtatoare de nume pentru specie. Tulpinile tip ale speciilor sunt depozitate in asa numitele colectii de culturi (colectii de tulpini). De aici ele pot fi obtinute si utilizate ca tulpini de referinta pentru compararea directa cu izolatele noi in vederea identificarii lor corecte. Genul bacterian este un grup taxonomic bine definit, alcatuit din specii, in mod clar separate de alte genuri.

2.3 DESEMNAREA NUMELUI STIINTIFIC AL SPECIILOR

Pentru desemnarea numelui stiintific sau specific este utilizat sistemul binominal (cu doua nume) al nomenclaturii. Numele stiintific este intotdeauna o combinatie a numelui de gen, urmat de numele de specie (epitetul specific). Initiala genului din numele stiintific este scrisa intotdeauna cu litera mare, iar a speciei cu litera mica. Ambele nume sunt scrise cu caractere italice sau subliniate. Epitetul specific se scrie cu initiala mica si nu se prescurteaza. Pentru denumirile stiintifice se utilizeaza limba latina sau greaca. Numirea unui organism nou descoperit este supervizata de un grup international de experti care verifica daca au fost urmate procedeele standard si ca nu exista deja un nume dat anterior organismului sau un alt organism cu acelasi nume. Denumirea unui numar de specii a fost data dupa numele unui microbiolog care a descoperit microorganismul respectiv sau a adus contributii importante in domeniu. Alte nume provin de la o particularitate a microorganismului (forma, culoare), locul unde poate fi gasit sau boala pe care o produce. Exemplificam cu cateva nume specifice: Pseudomonas tomato - Gr. pseudo = fals; monas = unitate; tomato = fruct. Deci o bacterie care infecteaza tomatele. Lactobacillus sanfrancisco - L. lacto = lapte; bacillus = bastonas mic. O specie utilizata in asociere cu o drojdie ( Saccharomyces exiguus) pentru fabricarea unui tip de paine din San Francisco. Giardia lamblia - de la Alfred Giard, un microbiolog francez si Vilem Lambl, un medic din Boemia, ambii cercetand micoorganismul, care determina o infectie intestinala severa. 12

2.4 SISTEMUL NATURAL, FILOGENETIC, DE ORGANIZARE A LUMII VII

Celebrul botanist Carl Linnaeus, in opera sa "Systema naturae" (1735) a reunit toate microorganismele intr-un singur grup numit semnificativ "Chaos". Robert Whittaker a propus un sistem de organizare format din cinci regnuri de baza: 1. Procaryotae (Monera); 2. Protista; 3. Fungi; 4. Plantae; 5. Animalia. Constituirea acestor regnuri se bazeaza pe: tipul si structura celulara, organizarea si tipul de nutritie.

Regnul Procaryotae - include organisme unicelulare de tip procariot. El cuprinde bacteriile si are doua subgrupe principale: eubacterii - bacterii cu structura celulara procariota caracteristica si archaebacterii - bacterii cu structura celulara si functii atipice. Regnul Protista - contine cea mai mare parte a microorganismelor eucariote unicelulare care sunt lipsite de tesuturi. El cuprinde alge microscopice care se caracterizeaza prin celule fotosintetizante si protozoare care sunt lipsite de perete celular si se hranesc pe seama altor organisme prin ingestie. Regnul Fungi - cuprinde organisme uni- sau multicelulare si uni- sau multinucleate, de tip eucariot. Celulele eucariote prezinta perete celular, nu sunt fotosintetizante si isi dobandesc nutrientii prin absortie. El cupinde microfungi (mucagaiuri si drojdii) si macrofungi.

13

Regnurile Plantae si Animalia nu includ microorganisme, fiind reprezentate de organisme macroscopice, multicelulare. Plantele sunt alcatuite din celule eucariote cu perete celular si sunt fotosintetizante. Celulele animalelor sunt lipsite de perete celular, iar tipul de nutritie pentru acest regn este nutritia ingestiva.

Este important de retinut ca virusurile nu sunt incluse in nici o clasificare, ca o recunoastere a caracterului lor de agenti infectiosi care nu au echivalent in lumea vie.

Capitolul 3

MORFOLOGIA MICROORGANISMELOR

In acest capitol va sunt prezentate: ce si cine sunt microorganismele structura celulei microorganismelor notiuni despre virusuri ce sunt bacteriofagii 14

ce sunt viroizii si prionii

3.1 DEFINITII

Microorganismele constituie un sistem complex de organisme acelulare si celulare, inzestrate cu un metabolism propriu si continuitate genetica, diferite ca morfologie, activitate biologica si pozitie sistematica. Cu toate acestea, tuturor microorganismelor le sunt comune cateva caracteristici: dimensiunile

microscopice, organizarea lor monocelulara si pluricelulara, precum si structura interna relativ simpla. In categoria microorganismelor sunt incluse: 1. virusurile acelulare; 2. bacteriile, drojdiile monocelulare; 3. mucegaiurile, algele microscopice si protozoarele monocelulare si pluricelulare.

3.2 STRUCTURA CELULEI MICROORGANISMELOR

Unitatea morfologica si functionala fundamentala a materiei vii o constituie celula. Se cunosc doua tipuri de celule: procariote si eucariote. Celula procariota este mai simpla ca organizare, fiind fara nucleu, avand ADN dispersat in citoplasma, nedelimitat de membrana, sub forma de molecule mari de ADN spiralat sau sferic. Acest tip de celula este caracteristic bacteriilor, algelor albastre. Tipul mai evoluat, numit eucariot, intalnit la celulele constitutive ale plantelor, ale animalelor si ale unor microorganisme mucegaiuri, drojdii se caracterizeaza prin nucleu individualizat prevazut cu membrana, ce-l delimiteaza de citoplasma. In acest tip de celule, ADN-ul se afla in nucleu, unde alaturi de proteine formeaza cromozomii corpusculi ce se formeaza in timpul diviziunii celulare si care contin informatia ereditara specifica. Celula*, avand forme si dimensiuni diferite, este alcatuita din trei componente principale: citoplasma, nucleu si membrana celulara, constituind 15

protoplastul. Ea este inconjurata de un perete celular, format din polizaharuri, hipo- si glicoproteine, avand rol protector fata de influentele exterioare celulei, care delimiteaza celulele intre ele si participa, alaturi de membrana citoplasmatica la diviziunea celulara. La unele microorganisme, peretele celular este acoperit de o capsula, de cili** sau de flageli** si de pili (fimbrii).

*celula: lat. celulla- camaruta; vacuus gol **cili, flageli organe de locomotie

Citoplasma este un sistem coloidal complex, macro si micromolecular, alcatuit structural din citoplasma fundamentala si din organite. In compozitia ei intra ioni de substante anorganice si compusi organici, alcatuind, de fapt, materia vie. Citoplasma fundamentala reprezinta partea nestructurata a citoplasmei si este transparenta, elastica, in continua miscare si transformare, majoritatea reactiilor biochimice din celula avand loc la nivelul acestui complex coloidal. Organitele reprezinta sisteme structurale subcelulare bine definite ca structura, forma, specializate in activitati intra si extracelulare. Exista doua categorii de organite: comune intalnite in toate celulele organismelor vii, indiferent de origine, reprezentate prin reticulul endoplasmatic, ribozomii (granulele lui Palade*), complexul Golgi, mitocondriile, lizozomii si centrozomul si organite cu rol specific unor anumite celule specializate sub aspect fiziologic, biologic.

*George Emil Palade savant roman, laureat al premiului Nobel pentru medicina, descoperitorul formatiunilor mitocondriale

citoplasmatice si a rolului acestora in celula.

In citoplasma mai pot fi gasite si incluziunile celulare, formatiuni bine conturate, cu sau fara membrana, cu functii temporare compuse din picaturi de grasime, granule de proteine sau glicogen, alte substante dizolvate in apa, reprezentand substante de rezerva si vacuolele , continand substante sub forma de solutii hidrice. RETICULUL ENDOPLASMATIC este o retea canelara ce brazdeaza citoplasma multidirectional, considerat ca un sistem circulator celular deoarece are rolul 16

transportorului de produsi celulari. Datorita reticulului endoplasmatic suprafata de schimb celular intre substantele citoplasmatice si spatiul intercelular se mareste, imbunatatindu-se astfel calitatea si randamentul acestui schimb. Totodata, reticulul endoplasmatic poate sintetiza proteine, lipide si hormoni pe care celula le secreta in lichidul intercelular. RIBOZOMII sunt forme granulare sferice in care are loc sinteza proteinelor, fiind constituite din ARN si proteine. LIZOZOMII sunt organite sferice continand enzime digestive, avand rolul apararii celulelor contra altor microorganisme prin digerarea (liza) acestora. COMPLEXUL GOLGI reprezinta formatiuni membranoase sub forma de pachete asezate in teancuri, amplasate in apropierea nucleului, avand rolul sintetizarii unor substante celulare specifice si de transfer al acestora prin reticulul endoplasmatic in spatiul intracelular. MITOCONDRIILE sunt corpusculi sferici sau ovoidali, granulari, ce contin sisteme enzimatice care participa la transformarile energetice din celula, deci care produc energie celulara. CENTROZOMUL este un constituent celular (organit) care intervine indirect in diviziunea celulara, vizibil la microscopul electronic in vecinatatea nucleului, cu deosebire in timpul diviziunii. Impreuna cu masa citoplasmatica din jurul sau formeaza asa-numita centrosfera. In timpul diviziunii, in jurul centrosferei se contureaza filamente citoplasmatice radiale denumite aster. Centrozomul lipseste din celulele in care nu are loc diviziunea celulara. In interiorul celulelor mai pot fi intalnite organite cu forme variabile pigmentate diferit, cunoscute sub denumirea de cromoplaste, cloroplaste, s.a., avand culori specifice, cu deosebire in schimburile energetice si in reactiile redox si de schimb ionic intra si extracelulare.

Nucleul este o formatiune protoplasmatica a celulei cu o organizare superioara, continand proteine si acizi nucleici (ADN, ARN), fiind responsabil de transmiterea caracterelor ereditare, in diviziunea celulara si in metabolismul celular. Nucleul este bine individualizat in celulele eucariote de o membrana dublu stratificata, avand pori care permit schimbul de substante intre citoplasma si nucleu si se afla de obicei asezat in centrul celulei, fara ca aceasta sa reprezinte o

17

regula generala. Majoritatea celulelor au un singur nucleu, dar exista si celule polinucleare in structuri biologice superioare. Nucleul se compune din: nucleol, carioplasma (suc nuclear) si membrana nucleara. Nucleolul este o formatiune structurala din interiorul nucleului in compozitia caruia intra ARN si ADN, rolul sau fiind acela de formare a ARN-ului pe care-l transfera in citoplasma, transmitand acesteia informatia genetica continuta in ADN si cromozomi. Carioplasma*, sub aspect compozitional, este citoplasma continand in plus cromatina ** formata din acizi nucleici legati de proteine filamentoase, constituind substratul material al cromozomilor - si linina (acromatina)**. *grec. haryon fara nucleu **grec. a fara. Chroma- culoare; parti din nucleu care reactioneaza sau nu la coloranti bazici caracteristici pentru cromozomi W.

Fleming, 1879 Membrana nucleara este formata din trei straturi membranoase stratificate, traversate de pori prin care are loc schimbul de substante intre nucleu si citoplasma.

Membrana celulara (plasmatica) este un invelis extern ce are o structura trilaminara ca si membrana nucleara, structura care face ca ea sa aiba o permeabilitate selectiva fata de substante si determina o anumita sarcina electrica (stratul exterior are sarcina electrica pozitiva, iar cel din interiorul celulei este electronegativ) care imprima membranei celulare un potential electric de membrana si o anumita polaritate. Potentialul electric de membrana este mentinut de ionii de sodiu (Na+) si potasiu (K+) repartizati neuniform in ambele parti ale membranei (cei de potasiu se gasesc preponderent pe partea interna a membranei, iar cei de sodiu sunt in numar mai mare in lichidul intercelular, dar sarcina stratului interior al membranei, din cauza unor anioni in exces, isi mentine sarcina electrica negativa). Membrana devine un sistem bine organizat, care pe de o parte separa celula de mediul sau, iar pe de alta, prin caracteristicile de membrana ultraselectiva, asigura legatura cu acesta, precum si desfasurarea normala a functiunilor ei fiziologice in mediul in care se dezvolta. Permeabilitatea membranei 18

pentru ionii de sodiu creste de peste 500 de ori, devenind preponderenta celei a ionilor de potasiu. Se produce astfel o inversiune a sarcinilor electrice ale celor doua straturi intern si extern ale membranei celulare, cunoscuta sub denumirea de depolarizare, stare ce permite schimbul material si energetic intre celula si exterior prin deplasarea unor compusi ionici chiar impotriva gradientului de concentratie. Mecanismul transportului ionic-imaginativ, asemanator pomparii lichidelor, se face prin consum.

3.3 VIRUSURILE

Virusurile sunt agenti patogeni alcatuiti din proteine si acizi nucleici de dimensiuni extrem de mici - intre 10 si 300 milimicroni vizibile doar cu ajutorul microscopului electronic si activand intotdeauna ca paraziti celulari si intracelulari. Virusurile sunt lipsite de organizare celulara si intracelulara si ocupa un loc intermediar intre moleculele proteice si bacterii, avand forme spatiale diferite: cilindrice, sferice, ovoidale, poliedrice etc. Sub aspect compozitional, virusurile au doar un singur tip de acid nucleic (ARN sau ADN) si nu dispun de un complex enzimatic capabil de reproducere. Odata patrunse in celula gazda, virusurile modifica metabolismul celular, astfel incat, in locul metabolismului celular caracteristic, se substituie metabolismul specific virusului. Bolile produse la plante si la animale de catre virusuri se numesc viroze, ce se manifesta atunci cand sistemul imunitar, genetic sau dobandit, nu mai poate face fata atacului virulent. Virozele cele mai frecvente la om sunt cele ale gripei, ale hepatitelor B si C, ale poliomielitei, febrei aftoase, etc. La plante virozele cartofului, mozaicul tutunului,etc. Constituentii virali - structura virusurilor este atat de regulata si cristalina incat multe virusuri purificate formeaza agregate mari sau cristale daca sunt supuse anumitor tratamente. Organizarea unui virus este simpla si compacta, continand numai acele parti necesare pentru a invada si controla o celula gazda: un invelis si un miez central.

Modelul de organizare a unui virus poate fi prezentat astfel:

19

Capsida Invelis Anvelopa (nu este prezenta la toate virusurile) Particula virala (virion)

Molecula de acid nucleic Miez central (AND sau ARN) = genom viral Diferite proteine (enzime)

Nomenclatura

virusurilor - Comitetul International de Taxonomie al

Virusurilor (ICTV = International Commitee on Taxonomy of Viruses) este autoritatea care furnizeaza sistemul universal de clasificare si nomenclatura virusurilor. Acest sistem se bazeaza arbitrar pe nivele ierarhice de: ordin, familie, subfamilie, gen si specie. Nivelele inferioare speciei (subspecie, tulpina, varianta) sunt stabilite de experti apartinand unor grupuri speciale internationale. Nomenclatura formala a virusurilor nu implica utilizarea termenilor binominali latinizati. Numele de familie, subfamilie si gen se scriu cu litera initiala mare si caractere italice. Numele speciei, cu unele exceptii, nu se scrie cu litera mare si nici cu caractere italice. Exemplu: Ordinul Mononegavirales, Familia Rhabdoviridae, genul Lyssavirus, virus rabic. Nomenclatura virusurilor utilizeaza si termeni vernaculari, informationali: virusul gripal, virusul rabic. Denumirea virusului are diferite proveniente: aspectul microscopic (forma, marimea), zona geografica sau anatomica de izolare, efectele asupra gazdei sau mai multe caractere combinate. De exemplu: togavirus, lat. toga = roba este un virus care are o anvelopa ca o manta; adenovirus, gr. aden = glanda, descoperit pentru prima data in vegetatiile adenoide; herpesvirus, numit dupa caracterul de raspandire al eruptiei herpetice, gr. herpes = a se furisa, etc.

3.4 BACTERIOFAGII

20

Exista unele virusuri care paraziteaza celulele bacteriene si provoaca distrugerea lor. Acestea poarta denumirea de bacterioifagi, mancatori de bacterii si sunt raspandite in toate mediile in care se gasesc bacterii. Caracteristic acestora este forma de cireasa cu coada; capul rotund cuprinzand ADN inconjurat de un invelis proteic,capsida,in care se afla o molecula de AND (sau ARN viral) iar coada,pedicel, formata din proteine, are la partea terminala o zona enzimatica capabila sa dizolve peretele celulei bacteriene, creand o bresa prin care infuzeaza ADN propriu. In prezenta unei bacterii, fagul este absorbit la suprafata celulei bacteriene,dizolva membrana, si prin pedicel injecteaza AND-ul fagic,care preia toate functiile de multiplicare.Prin multiplicarea ADN-ului bacteriofagului are loc dizolvarea celulei bacteriene si eliberarea virusului care poate ataca noi celule. Aceasta comportare reprezinta ciclul litic sau vegetativ,iar bacteriofagul se numeste virulent.. Daca sub aspect medical actiunea bacteriofagilor este benefica, ei fiind folositi in combaterea unor infectii, in unele domenii de activitate, acolo unde se utilizeaza bacterii, de exemplu in biotehnologii, virozarea cu bacteriofagi poate avea efecte catastrofale, compromitand uneori in totalitate productiile. Din acest motiv, cunoasterea fiziologiei si a morfologiei virusurilor bacteriofagi, a conditiilor lor de dezvoltare, constituie un factor esential in salvarea productiei.

3.5 VIROIZII SI PRIONII

Exista un numar mic de entitati cunoscute, ale caror proprietati sunt in dezacord cu definitia virusurilor, ca elemente genetice care modifica procesul celular normal, supunandu-l propriei replicari si care au o forma extracelulara. Ca atare, aceste entitati nu sunt considerate, in prezent, virusuri, desi par strans inrudite cu acestea. Din categoria acestor entitati, care reprezinta o categorie aparte de agenti infectiosi subvirali, fac parte viroizii si prionii. Viroizii sunt molecule mici de ARN circular care nu codifica proteine si sunt total dependente, pentru replicare, de enzimele codificate de celula gazda. Izolati in 1971 de T.O. Diener, viroizii au fost considerati virusuri, ulterior stabilindu-se conceptul de viroid. Spre deosebire de virusuri, la viroizi forma lor extracelulara este aceeasi cu forma intracelulara si nu au invelis proteic (capsida). Viroizii sunt cei mai mici agenti patogeni cunoscuti (de la viroidul cadang cadang al cocotierului 21

care are 246 nucleotide, la viroidul citrus exorticus din 375 nucleotide). Ei reprezinta o categorie speciala de agenti patogeni subvirali, exclusiv la plante, determinand boli grave la importante forme de cultura: tuberculii fusiformi de la cartof; nanismul hameiului; nanismul si marmorarea clorotica la crizanteme si altele. Interesant este ca molecula de ARN infectanta nu contine gene pentru codificarea proteinelor si deci viroidul este total dependent, pentru replicarea sa, de functiile gazdei. Existenta viroizilor ridica mai multe probleme interesante si intrigante in legatura cu boala pe care o reproduc. Localizarea viroizilor, in principal, in nucleul celulei gazda, impreuna cu capacitatea lor de a servi ca matrita ARN-ului, sugereaza ca simptomele de boala pot rezulta din interferenta viroidului cu mecanismele genetice si functiile metabolice ale gazdei. O asemenea interferenta poate determina producerea unor proteine "gresite". In mod cert, viroizii sunt sisteme genetice independente, cu proprietati determinate de secventa nucleotidica a acizilor ribonucleici respectivi. Prionii reprezinta extrema cealalta fata de viroizi, luand in consideratie parametrii care definesc virusurile. Ei au o forma extracelulara distincta, dar forma extracelulara este reprezentata in intregime de proteina. Cu toate acestea, particula de proteina este infectioasa si sunt cunoscuti diferiti prioni care produc o varietate de boli la animale si la om. Termenul de prion a fost introdus de Prusiner S.B., care in 1980 propune ipoteza prionului, pentru a distinge, de viroizi si virusuri, particulele infectioase proteice ce determina un grup de boli

neurodegenerative. Bolile neurodegenerative determinate de prioni sunt in prezent clasificate impreuna, deoarece etiologia si patogeneza lor implica modificarea unei proteine celulare normale numite Prusiner PrP (proteina prionica). Aceste boli se manifesta ca boli infectioase, ereditare si sporadice. Acestea includ: encefalopatii transmisibile, encefalopatii spongiforme, etc. Boli reprezentative: scrapia oilor, boala "vacii nebune", boala Creutzfeld - Jacob, insomnia familiala fatala, etc. Pe langa boala cu urmari grave, infectia prionica are ca rezultat producerea mai multor copii ale proteinei prionice. Aceasta proteina trebuie sa fie codificata de acid nucleic, altfel, existenta prionilor ar pune sub semnul intrebarii modelul central al fluxului de informatie genetica. Cunoasterea viroizilor si prionilor prezinta interes din mai multe motive: extind definitia data virusurilor, fata de care sunt caracterizati; 22

demonstreaza existenta atat a unor modalitati neasteptate prin care elementele genetice se pot replica, cat si a unor modalitati neasteptate prin care pot supune celulele gazda;

determina boli grave care la om au un caracter unic prin aceea ca sunt atat boli genetice (ereditare) cat si infectioase. Biologia prionilor, cu radacini in virologie, neurologie si neuropatologie, a

devenit mai recent corelata cu disciplinele de biologie celulara si moleculara, ca si de chimie a proteinelor. Cunoasterea exacta a modalitatilor de multiplicare a prionilor si de producere a bolii vor deschide cu siguranta noi perspective in biochimie si genetica.

Capitolul 4 BACTERIILE

Acest capitol cuprinde: definitia, morfologia, structurile externe ale bacteriilor; sporogeneza bacteriilor; fiziologia, biochimia si metabolismul bacterian; elemente si notiuni introductive de genetica bacteriana

Bacteriile sunt microorganisme unicelulare de tip procariot care se reproduc asexuat prin diviziune directa (sciziune). Ritmul de diviziune este de 10 12 minute. Ele sunt organisme raspandite in natura, oriunde exista conditii minime de viata. In functie de modul de procurare al substantelor nutritive, bacteriile sunt autotrofe cele care isi pot sintetiza din surse anorganice metabolitii esentiali si heterotrofe acelea care traiesc pe seama unor gazde vii de la care isi procura substantele necesare. Majoritatea bacteriilor patogene ce produc imbolnaviri sunt heterotrofe.

4.1 MORFOLOGIA BACTERIILOR

23

Morfologia propriu-zisa a bacteriilor se refera la: forma celulei, dispozitia spatiala sau forma de existenta, dimensiunile si afinitatea tinctoriala. Principalele forme celulare ale bacteriilor sunt: sferica, cilindrica si curba - spiralata. Forma sferica se refera la coci. Daca celulele formate prin diviziune se separa si raman independente se numesc micrococcus; cand cocii sunt grupati perechi sunt denumiti diplococcus; daca ei sunt dispusi in lant se numesc streptococcus; dispunerea pe doua planuri perpendiculare a cocilor are denumirea de tetrade, iar structura de ciorchine (grupuri neregulate) este denumita staphylococcus. Forma cilindrica alungita, de bastonas poate exista in doua forme si anume: vegetativa care reprezinta starea de viata activa a celulei cu toate functiile normale, si sporulata forma de rezistenta, de autoconservare, pana se indeplinesc conditiile normale de transformare a sporului in forma vegetativa. Sporul este o formatie endocelulara (in interiorul celulei) ce se formeaza pentru asigurarea unei vieti latente a celulei pe timp mai indelungat. Bacteriile izolate asporulate (nesporulate) sunt denumite bacterium, iar cele sporulate se

numesc bacillus. Ambele tipuri de bacterii pot fi dispuse spatial in lant, caz in care se numesc streptobacterii in palisada (ca scandurile gardului), dar mai pot fi si alte aranjamente spatiale. Bacteriile spiralate au corpul format dintr-o jumatate de spira ca semnul virgulei si se numesc vibrioni (vibrio), sau din mai multe spire spirochete (spirochet) nedeformabile ex: genul Leptospira si deformabile ex: genul Borrelia. In afara acestor 3 forme majore de bacterii, mai exista si unele mai rar intalnite in special la germenii saprofiti: forma patrata, elipsoidala denumirea fiind cea de cocobacili,fusiforma, etc. Dimensiunea diametrului cocilor variaza intre 1 5 micrometri, iar bacilii au lungimea de 0,5 10 micrometri si diametrul ntre 0,3 si 0,5 micrometri, ei putandu-se clasifica in: scurti, in lungime medie de 2 micrometri si lungi, la care lungimea este de aproximativ 10 micrometri.

24

4.2 EXAMENUL MICROSCOPIC

Din cauza dimensiunilor foarte reduse, microorganismele nu pot fi vazute decat cu ajutorul unor instrumente si aparate optice. Caracterele morfologice ale coloniilor bacteriene se studiaza in detaliu cu ajutorul lupei, dar forma si structura microorganismelor nu pot fi cercetate decat cu ajutorul micrcoscopului optic si al celui electronic. Cu ajutorul microscopului optic bacteriile pot fi examinate fie in stare nativa, fie dupa ce sunt fixate si colorate (frotiuri).

Examenul preparatelor native

Preparatele native (umede, necolorate) se pot face dintr-o cultura microbiana sau direct din produs. Ele sunt examinate, de regula, intre lama si lamela. Se ia cu ansa sau cu o pipeta Pasteur o picatura din cultura lichida sau din cultura suspensionata in solutie salina fiziologica si se depune pe o lama curata si degresata, peste care se pune o lamela curata. Pentru examinare se plaseaza preparatul nativ pe platina microscopului, se centreaza lumina, se inchide mult diafragma, se coboara condensatorul si se aduce in dreptul preparatului un obiectiv uscat. Se apropie mult de preparat lentila frontala a obiectivului cu ajutorul macrovizei, dupa care se ridica treptat obiectivul pana la aparitia imaginii, care este pusa la punct cu ajutorul vizei micrometrice. Pe preparatele native sunt evidentiate existenta, forma si mobilitatea microorganismelor (care nu trebuie confundata, insa, cu miscarile browniene). Dupa examinare, preparatele care contin germeni vii trebuie puse intr-un cristalizator cu amestec sulfocromic. Preparatele native pot fi examinate si pe fond intunecat, precum si prin procedeul contrstului de faza.

Examenul preparatelor colorate

25

Preparatele colorate prezinta avantajul ca sunt sterilizate prin fixare, sunt usor de manipulat si de examinat si pot fi pastrate mult timp. Aceste preparate permit diferentierea bacteriilor dupa afinitatea lor pentru anumiti coloranti si pot evidentia unele elemente structurale (cili, capsula, spori, granulatii, etc.) prin coloratii speciale. Examinarea preparatelor colorate se face astfel: se centreaza lumina, se ridica condensatorul, se lasa diafragma deschisa si se pune o picatura de ulei de cedru pe frotiu. Cu ajutorul macrovizei se coboara tubul optic si se introduce lentila frontala a imersiei in ulei de cedru pana in imediata apropiere a frotiului. Punerea la punct se face cu ajutorul vizei micrometrice, iar deplasarea lamei pentru schimbarea campurilor microscopice se obtine cu ajutorul carului mobil. Dupa examinare se ridica obiectivul, se sterge uleiul de cedru de pe imersie si se scoate lama de pe platina microscopului.

Coloranti si metode de colorare

`

Colorantii folositi in mod curent in bacteriologie sunt substante organice, de

obicei colorate, usor solubile, de cele mai multe ori sintetice, avand proprietatea de a colora diferite substraturi chimice. Coloratia se realizeaza prin combinatie chimica, absorbtie sau dizolvare in structura pe care o pune in evidenta. Coloratiile pot fi facute fie pe germeni vii, fie pe germeni omorati. Colorarea microorganismelor vii se face cu coloranti netoxici pe preparate proaspete. Colorarea germenilor omorati este cea mai utilizata in microbiologie. Pentru a fi colorate, bacteriile sunt, in prealabil, supuse unor operatii pregatitoare.

Operatii pregatitoare in vederea colorarii Pregatirea frotiului. Frotiul se prepara prin etalarea produsului de examinat pe o lama curata si perfect degresata, astfel inacat germenii sa formeze un strat subtire, uniform. Etalarea culturii sau a produsului se realizeaza cu ajutorul unei anse de platina sau al unei pipete Pasteur. Se ia o picatura din cultura lichida si se 26

intinde circular pe lama. Cand cultura este pe mediu solid, se racleaza cu ansa sterilizata si racita o prtiune din cultura si se depune pe o lama de sticla, pe care, in prealabil, s-a pus o picatura de solutie salina fiziologica, dupa care se omogenizeaza si se raspandeste uniform pe o suprafata circulara. Frotiul astfel confectionat este lasat sa se usuce la temperatura camerei. Fixarea frotiului. Dupa uscare, frotiul este supus operatiei de fixare prin caldura sau prin lichide fixatoare, cum sunt: alcoolul metilic, alcoolul etilic, alcooluleter, etc. Pentru fixare prin caldura se trece lama de 2-3 ori cu fata opusa frotiului, prin flacara unui bec de gaz. Incalzirea se face la 60 - 70oC (lama este suportata pe dosul mainii). Prin fixare bacteriile sunt omorate, evitandu-se astfel pericolul infectarii. In plus, se mareste aderenta preparatului de lama, iar afinitatea sa pentru colorant creste. O fixare corecta nu trebuie sa produca modificari ale formei si ale structurii microorganismului supus acestei operatii. Mordansarea este tratarea frotiului cu anumite substante chimice, numite mordanti (de exemplu, solutia Lugol), in scopul de a intensifica activitatea colorantilor. Mordantii, prin afinitatea puternica pe care o au atat fata de colorant, cat si fata de substratul supus colorarii, faciliteaza si intaresc legatura dintre acestia, contribuind astfel la obtinerea unei coloratii mai intense si de o calitate mai buna. Pentru colorantii bazici se folosesc mordanti acizi (acid tanic, acid picric, etc.) iar pentru colorantii acizi se folosesc mordanti bazici (sulfat de fier, alaun, etc.)

Prepararea unor coloranti folositi in bacteriologie Colorantii sunt preparati si pastrati in laborator sub forma de solutii alcoolice saturate, cunoscute si sub numele de solutii-mama. Aceste solutii se prepara prin mojararea unei cantitati de 10-15 gr. colorant cu 100 ml alcool de 96o; pentru solutia saturata de violet de gentiana sunt suficiente numai 6-8 gr. colorant. Dupa preparare, solutiile saturate sunt tinute 2-7 zile la termostat la 37oC si agitate de mai multe ori pe zi. Dupa filtrare prin hartie de filtru, solutiile se pastreaza la loc intunecos in flacoane de sticla de culoare inchisa cu dop rodat. In aceste conditii, colorantii pot fi pastrati timp indelungat. Pentru colorarea germenilor se folosesc solutii apoase de colorant. Acestea se prepara dintr-o solutie alcoolica saturata, care este diluata in proportie de 1/10 in apa fenolata 2%. 27

Solutiile apoase pot fi preparate si direct din substanta colorata astfel: 1 gr. de colorant (cristale) este majorat si dizolvat in 10 ml alcool. Se adauga apoi 2 ml fenol si o parte din apa distilata. Dupa ce se amesteca bine, se terc intr-un flacon de sticla in care se adauga si restul de apa distilata pana la 100 ml. Solutia astfel preparata se mentine 24h la termostat, la 37oC, apoi se filtreaza prin hartie de filtru si se transvazeaza intr-o sticla picatoare, fiind buna de folosit. Solutiile apoase de colorant nu pot fi pastrate un timp prea indelungat, deoarece se degradeaza. In coloratiile obisnuite se mai folosesc si alte solutii, ca Solutia Lugol (1 gr. iod, 2 gr. iodura de potasiu si 300 ml apa distilata) si solutia de alcool-acetona (3 parti alcool de 96o si o parte acetona). Coloratiile pot fi simple, diferentiale si speciale.

Coloratiile simple Coloratia cu albastru de metilen. Frotiul uscat si fixat apoi la flacara este acoperit cu o solutie de albastru de metil timp de 1-2 minute. Se spala dupa aceea frotiul cu apa de robinet, se lasa sa se usuce si se examineaza la microscop cu obiectivul cu imersie. Prin aceasta metoda, toate elementele din campul microsopic apar colorate in albastru. Este o coloratie rapida, care pune in evidenta forma, gruparea si, eventual, raporturile germenilor cu leucocitele sau cu alte elemente prezente in frotiu. Coloratia cu fucsina fenicata Ziehl diluata 1/10 se efectueaza in acelasi mod ca si cea cu albastru de metilen. Elementele din frotiu apar colorate in rosu.

Coloratiile diferentiale Coloratia Gram. Este o coloratie foarte utilizata in bacteriologie, deoarece imparte bacteriile in doua mari categorii: bacterii Gram-pozitive si bacterii Gramnegative. Tehnica coloratiei este urmatoarea: frotiul uscat este fixat prin caldura; se acopera lama cu solutie apoasa de violet de gentiana si se lasa timp de 1-2 min.; se indeparteaza colorantul si se acopera lama cu solutie Lugol pentru 2 min.; 28

se indeparteaza mordantul (solutia Lugol) si se trateaza frotiul cu alcool-acetona timp de cateva secunde; se spala rapid lama cu apa de robinet si se acopera cu fucsina diluata 1/10 in apa timp de 30 sec. pana la 1 min; se indeparteaza fucsina si se spala frotiul cu apa de robinet; dupa uscare se examineaza la microscop cu obiectivul cu imersie. Bacteriile Gram-pozitive rezista la decolorare, ramanand colorate in violet, dar cele Gram-negative sunt decolorate de alcool-acetona si recolorate in rosu. Coloratia Ziehl-Nielsen se aplica in cazurile mycobacteriilor care au in compozitia peretelui celular acid micolic si le confera impermeabilitate la colorantii folositi in tehnica gram. Pentru acesti germeni numiti acid-alcool rezistenti (AAL) se foloseste aceasta tehnica speciala. Tehnica folosita pentru coloratie: frotiul uscat se fixeaza la flacara; se acopera lama cu fucsina fenicata Ziehl si timp de 10 min se incalzeste intermitent, cu ajutorul unei lampi de alcool sau cu flacara unui bec Bunsen pana la emiterea de vapori, fara a se ajunge la fierbere; fucsina evaporata prin incalzire se inlocuieste imediat; se indeparteaza colorantul, se spala frotiul cu apa de robinet si se decoloreaza cu acid azotic diluat 1/3 sau acid sulfuric diluat 1/4; se indeparteaza acidul si se spala lama cu apa de robinet, dupa care se decoloreaza frotiul cu alcool de 96o; se indeparteaza alcoolul si se spala frotiul din nou, cu apa de robinet, dupa care se recoloreaza cu o solutie apoasa de albastru de metilen 1% timp de 1min.; se spala frotiul cu apa de robinet, se lasa sa se usuce si se examineaza la microscop cu obiectivul de imersie.

Coloratii speciale

Metode de punere in evidenta a capsulei bacteriene 29

Metoda Burri. Pe o lama perfect curata se pun o picatura din susopensia de bacterii capsulate si o picatura de tus de China. Dupa ce se omogenizeaza, se face un frotiu prin etalarea amestecului cu o alta lama. Se lasa sa se usuce si se examineaza la microscop cu obiectivul cu imersie. Pe fondul negru al preparatului, bacteriile impreuna cu capsulele lor apar incolore. Coloratia Loeffler cu albastru de metilen se efectueaza cu o solutie invechita de albastru de metilen Loeffler. Prin aceasta coloratie corpul bacterian se coloreaza in albastru, iar capsula, in roz. Coloratia pentru cilii bacterieni. Cilii nu pot fi vazuti la microscopul optic pe preparatele native sau pe frotiurile cu coloratii obisnuite. Pentru a fi pusi in evidenta se folosesc metode speciale de coloratie Metoda Zettnow. Coloratia dupa aceasta metoda se esfasoara astfel: se prepara o suspensie diluata de germeni in apa distilata, astfel incat sa se obtina pe frotiu celule izolate; din aceasta se iau 2-3 picaturi cu o pipeta Pasteur si se depun pe o lamela degresata si flambata; se lasa frotiul sa se usuce, dupa care se fixeaza cu formol diluat 1/10, timp de 10 min.; se pune lamela in apa distilata timp de 3 min dupa care se introduce intr-o solutie de tanin si de tartrat dublu de stibiu si potasiu, incalzita la 60-70oC, timp de 10 min.; se scoate lamela cu o pensa si se clateste bine in apa distilata; se acopera frotiul cu o solutie de sulfat de argint si amoniac care se prepara in momentul folosirii si se incalzeste usor la flacara, timp de 30 - 60 sec.; se spala frotiul cu apa distilata, se usuca si se monteaza in ulei de cedru, prin aplicarea lamelei cu frotiul in jos pe o lama foarte curata, dupa care poate fi examinata la microscop.

Metode de colorare a sporilor

Metoda Gray modificata. Se fac frotiuri care se lasa sa se usuce si se fixeaza prin caldura. Se acopera lama cu o solutie apoasa de verde malahit 5% si se incalzeste de trei ori pana apar vapori. Dupa fiecare incalzire se indeparteaza 30

colorantul si se inlocuieste cu altul proaspat. Se spala apoi frotiul cu apa si se acopera cu o solutie de fucsina diluata 1/10, timp de 1-2 min. Se indeparteaza colorantul, se spala lama cu apa, se lasa sa se usuce si s examineaza la microscop cu obiectivul cu imersie. Sporii apar colorati in verde-albastrui, iar corpul bacterian apare colorat in violaceu. Impregnatia argentica (metoda Fontana-Tribondeau). Aceasta coloratie se foloseste, in special, pentru punerea in evidenta a treponemelor si a leptospireloor. Tehnica este urmatoarea: frotiul uscat nu se fixeaza la flacara; pentru fixare si deshemooglobinizare se acopera frotiul cu solutie Rugge, care trebuie schimbata de trei ori in decurs de 1 min; se spala lama cu apa distilata si se acopera apoi 3 min cu o solutie de acid tanic 5%, care se incalzeste pana la emisie de vapori; se spala cu apa distilata, se lasa sa se usuce si se examineaza la microscop cu obiectivul de imersie. Treponemele si leptospirele apar colorate in negru-brun, iar restul frotiului, in galben. Coloratia May-Grunwald-Giemsa se foloseste in microbiologie pentru colorarea preparatelor de sange, in care se cerceteaza prezenta unor microorganisme, ca: spirochete, hematozoarul palustru, toxoplasma, etc. Frotiul obtinut prin etalarea pe lama in strat subtire a unei picaturi proaspete de sange este fixat prin acoperirea cu solutie May-Grunwald, timp de 4 min sau cu alcool metilic pur, timp de 10 min. Dupa fixare, peste solutia May-grunwald se adauga o cantitate egala de apa distilata neutra sis e lasa 1 min. Se indeparteaza solutia May-grunwald si se acopera lama cu solutie Giemsa diluata (3 picaturi solutie Giemsa la 2 ml apa distilata neutra). Dupa 20 min. se indeparteaza colorantul, se spala lama cu apa distilata, se lasa sa se usuce si se examineaza la microscop. Pe aceste preparate spirochetele sunt colorate in violet, hematozoarul se coloreaza in albastru-violet, etc.

4.2 STRUCTURI EXTERNE ALE BACTERIILOR (Structura extraparietala)

31

Unele bacterii au la exteriorul peretelui celular o structura complexa, ce favorizeaza aderenta acestora la alte structuri sau mobilitatea celulelor. Structurile externe, considerate structuri facultative, sunt capsula, flagelii si pilii, aflati in afara invelisului bacterian. Capsula, stratul ce acopera celula, este de natura mucopoliglucidica sau mucoproteica. Stratul mucilaginos care poate ajunge la grosimi de 2 micrometri imprima bacteriilor proprietati de aderenta si rezistenta la factori chimici si fizici (antibiotice si lipsa de apa). Totodata, datorita calusului unele celule se pot asocia dand formatiuni vizibile cu aspect gelatinos. Capsula reprezinta uneori, datorita rezistentei la agentii fizico-chimici si biologici, un factor de patogenitate si de specificitate antigenica. Flagelii sunt formatiuni filamentoase prezente la unele bacterii, denumite mobile, ca organe de locomotie. Unele bacterii au un singur flagel sau un manunchi de flageli polarizat la un capat al celulei, la altele flagelii sunt amplasati pe intreaga suprafata a celulei in numar foarte mare (de ordinul 100 si 1000), iar lungimea lor poate atinge si 20 de micrometri, caz in care sunt cunoscuti sub numele de cili. Cel mai adesea nu exista simultan cili si flageli. Ca structura, flagelii sunt alcatuiti dintr-o proteina specifica, cu structura helicoidala denumita flagelina. Datorita structurii helicoidale si a specificitatii, flagelina este contractila. Ea se fixeaza la spatiul periplasmic cu ajutorul unor formatiuni denumite carlig si discuri. Flagelii se pot roti cu 40-60 de rotatii pe secunda in ambele sensuri de rotire (dreapta, stanga), imprimand datorita structurii helicoidale o miscare de deplasare a celulei bacteriene cu viteze de 2 pana la 100 de ori mai mare ca lungimea celulei intr-o singura secunda (spre comparare, campionul mondial la 100 m plat este de numai 5-6 ori mai rapid in raport cu inaltimea sa). Celulele mobile cu un singur flagel sunt numite monotriche, cele cu doi flageli, amfitriche, multiflagelate polare, lofotriche, iar ciliatele peritriche. Pilii sunt structuri proteice care acopera complet suprafata bacteriilor; pilii comuni, au rol de aderenta bacteriana; altii sunt implicati in conjugarea bacteriana permitand trecerea materialului genetic de la o bacterie la alta, fiind cunoscuti ca pili sexuali (Factor F). Pilii comuni numiti si fimbrii, sunt apendici filamentari rigizi, ce nu folosesc la deplasare, cu lungimi de aproximativ 1 micrometru si diametrul de 32

circa 3 nanometri; sunt compusi dintr-un singur tip de proteina cu molecula in forma de filament helicoidal. Pe acesti pili exista receptori ce recunosc numai anumite structuri din organism si, prin aceasta, intervin in patogenitate, avand specificitate imuno-patogenica.

4.3 SPOROGENEZA BACTERIILOR

Dupa cum se arata la morfologia bacteriilor, anumite specii de bacterii (de exemplu familia Bacillaceae) au o forma de rezistenta cunoscuta sub denumirea de spor. Forma sporului este sferica sau elipsoidala, dar pot exista mai rar si alte forme (suveica, maciuca), avand dimensiuni reprezentand 5-15% din celula mama. Rolul sporului este asigurarea perpetuarii speciei bacteriene in conditii

nefavorabile, bacteria trecand in aceasta forma de rezistenta, care nu are nici un rol in multiplicare sau patogenitate. Sporul la bacterii prezinta o forma primitiva de diferentiere celulara. El se formeaza ca un tip nou de celula in celula vegetativa, cu ultrastructura, compozitie chimica si enzimatica diferita de ale celulelor vegetative, prezentand o deosebita rezistenta la conditii nefavorabile de mediu. Unele constrangeri mecanice specifice sunt impuse de natura peretelui celular in procesul de sporogeneza, de vreme ce toate bacteriile sporogene cu exceptia genului Desulfomaculum sunt grampozitive. Sporogeneza este un caracter de specie la bacterii din clasa Bacillaceae. La bacteriile anaerobe din genul Clostridium sporul este o structura constanta in timp ce la genul Bacillus sporul apare in mod facultativ. Pentru bacterii, forma caracteristica de spor este endosporul. El apare in interiorul celulei vegetative numite sporangiu sub forma unei formatiuni foarte rezistente in conditii de mediu nefavorabile. Endosporul este o formatiune sferica sau ovoidala al carui volum

reprezinta 5-15 % din volumul si 30% din greutatea sporangelui. Structura clasica a endosporului bacterian este compusa din trei straturi: exina-invelisul exterior, medina-stratul median si altul interior-intina care la randul lor se compun dintr-unul sau mai multe straturi. Sub invelisul sporal se gaseste un al doilea invelis de natura glucoproteica, numit cortex, avand un rol 33

mixt de rezistenta mecanica, de reglare a presiunii osmotice care favorizeaza in anumite conditii transferul apei libere din endosperm spre exterior. In interiorul acesteia se afla celula propriu-zisa protoplastul sporal format din sporoplasma (citoplasma continand organite ribozomiale si nucleoplasma).

Sporularea se poate considera ca are loc in trei etape, si anume: pregatitoare, faza de prespor si stadiul de spor matur.

La inceputul sporularii celula prezinta doi nucleoli complet separati spatiali ce condenseaza intr-un filament axial de cromatina, dupa care acesta se separa din nou in doi cromozomi, dintre care unul migreaza la o extremitate a celulei unde va fi izolat printr-un perete intr-un compartiment corespunzator viitorului spor. In acest compartiment sinteza ADN este inhibata. Aceasta poate fi considerata faza pregatitoare. In continuare are loc sinteza unor substante specifice sporale ce compun protoplastul sporal (presporul) si apoi a peretelui celular peptidoglicanic al viitoarei bacterii, iar cortexul sporal capata structura rigida care ii confera rezistenta deosebita la variatii de temperatura (si peste 100oC) si la scaderea umiditatii. In celula sporala au loc modificari substantiale compozitionale si fiziologice: volumul si greutatea se reduc, continutul de apa scazand de la cca 80% la aproximativ 15%; astfel structura ei gasindu-se acum sub forma de apa legata de diferite componente citoplasmatice, care sa favorizeze ulterioarele reactii biochimice. Modificarile mentionate au drept urmare formarea invelisurilor sporale prin depozitarea pe suprafata cortexului a unor straturi proteice multiple si incorporarea de cisteina*, iar citoplasma devine mai omogena, mai densa. Este faza de maturare, de spor matur, cand sporul se afla in stare de viata latenta (criptobiotica) in care enzimele sporale se afla in stare de inactivare, iar metabolismul endosporului este redus la zero, caracteristic starii de anabioza, desi celula nu este moarta. *aminoacid cu grupari sulfhidrice ce au proprietati de donatori acceptori de electroni, component al acizilor nucleici. Faza de spor matur se caracterizeaza prin acumulare in cantitate mai mare (10 15 %) de acid dipicolinic*, un compus specific capabil sa formeze chelati cu 34

ionii de calciu si/sau magneziu, determinand in aceasta forma modificari structurale in sporoplasma, ce au drept consecinta o crestere a rezistentei sporului la factori nefavorabili de mediu. *acid 2,4 piridin dicarboxilic Astfel, in timp ce celula vegetativa este inactivata la temperaturi putin peste 65oC in cateva minute, endosporul este inactivat termic abia in 10-20 de minute in mediu umed si la 180oC timp de 45-60 de minute in mediu uscat. Aceasta rezistenta la temperaturi ridicate se explica prin continutul mare de proteine cu sulf si a complecsilor acidului picolinic. Sporularea bacteriilor este un proces morfogenetic programat sa se

desfasoare etapizat ,fiind controlat de cca. 50 de gene. Se cunoaste de exemplu ca sporogeneza la Bacillus subtilis este controlata de 42 de gene ale sporula

Formarea sporului presupune o trecere de la un potential genetic total al unei celule vegetative la unul selectiv specific sporului insotit de o regresie a genelor vegetative. Trecerea de la forma vegetativa la sporulare se caracterizeaza printr-un moment critic, dincolo de care nu se mai poate influenta in nici un fel evolutia sporului, fenomenul fiind cunoscut prin sintagma fenomen de angajare. Sporogeneza reprezinta o alternativa a cresterii vegetative de adaptare a celulelor procariote la conditii fluctuante de mediu ce depasesc limitele normale de crestere. In timp ce bacteriile propriu-zise formeaza endospori, bacteriile actomicete, filamentoase si ramificate cu o mare varietate de tipuri morfologice, de regula gram-negative, produc un alt tip de spori numiti actinospori, ce au trei forme principale si mai multe intermediare: sporangiospori, endospori si artrospori (spori hifali). In cazul acestor bacterii sporogeneza este diferita fata de cea

anterior descrisa, avand 4 stadii succesive si anume: la inceput celulele miceliene se spiraleaza, viitorul spor fiind separat de hifa printr-un perete ce determina formarea unor celule egale ce vor deveni spori. Apoi, in hifa sporogena are loc o aparitie a septurilor de sporulare asociate cu prezenta mezozomilor de cca 1-2 micrometri. Septurile apar prin cresterea la distante a unor

spre interior

diafragme inelare duble, ca o continuare a peretelui celular si a membranei citoplasmatice. Urmeaza formarea unui perete helicoidal gros, semirigid, dupa care sporii, initial de forma cilindrica, capata forma elipsoidala, peretele micelian

35

vechi dezintegrandu-se. In faza de spor matur, sporii elipsoidali sunt inlantuiti si legati de filamentul vegetativ doar printr-o singura membrana. Mai sunt si alte tipuri de spori, ca de exemplu cei de origine hifala (artrospori)*, ce provin din ingrosarea peretilor celulelor vegetative si acumularea de substante de rezerva, ori gonidiile rezultate prin contractia, condensarea si divizarea protoplasmei unei celule vegetative avand rol de reproducere (la Leptothrix ochracea), deosebindu-se intre ei atat structural, cat si prin rolul lor biologic.

*arthrom articulatie; askos sac; aktinos - raza; mykes ciuperci; kenis praf; kistis sac, vezica 4.4 FIZIOLOGIA, BIOCHIMIA SI METABOLISMUL BACTERIAN

Bacteriile se caracterizeaza printr-o mare complexitate metabolica si capacitate de adaptare, fiind raspandite peste tot in natura datorita posibilitatilor de a-si schimba metabolismul in functie de conditiile in care se gasesc, iar daca acestea lipsesc, ele construiesc forme rezistente ce le asigura o viata latenta chiar si pentru perioade masurate in sute de ani. Pentru a intelege fiziologia si metabolismul bacterian, in cele ce urmeaza va fi discutata compozitia bacteriana. Dupa cum se stie, toate vietuitoarele, deci si bacteriile, contin in celula apa, proteine, glucide, lipide, minerale, enzime, vitamine si alte substante specifice. Apa reprezint 70-80% din masa celulara si se gaseste sub doua forme: apa libera si apa legata de compusii constituie un mediu propice dispersarii moleculari ai celulei bacteriene. Ea componentelor celulare si participa la chimica si rolul compusilor chimici in fiziologia

reactiile biochimice din metabolismul bacterian. Metabolismul schimbul de substante chimice dintre celule si mediu - nu poate avea loc decat in solutii

adevarate sau coloidale. Continutul de apa al celulelor permite reglarea presiunii osmotice celulare si utilizarea substantelor chimice la nivel atomic si molecular prin dilutii, disocieri si polarizari. Prezenta apei in celula 36 imprima acesteia

mobilitatea structurala, schimbarea formei si elasticitatea necesara adaptarii la

medii diferite. Intre formele vegetativa si sporulata exista diferente ale continutului de apa, cu deosebire a apei libere, sporii avand doar 15-20% apa sub forma de apa legata. Proteinele participa cu o pondere de 30-80% in masa uscata a celulei bacteriene, la structura careia participa mai mult de 23 aminoacizi, dintre care unii specifici doar bacteriilor, cum sunt: Diaminopimelic, Aminopimelic, Theicoic, sau izomerii seriei D ai Alaninei si Acidului glutamic. Proteinele se gasesc sub forma de aminoacizi, peptide simple sau polipeptide sau participa ca proteine complexe (heteroproteine). Heteroproteinele prezinta cea mai mare importanta pentru fiziologia celulara bacteriana datorita posibilitatii acestora de a realiza multiple combinatii

biochimice complexe in functie de necesitatile fiziologice. Se vor intalni astfel combinatii binare sau polinomiale glucido-lipido-polipeptidice cum sunt

mucoproteinele, cromoproteinele, acizii nucleici, enzimele, s.a. Rolul proteinelor in celula bacteriana este ,de asemenea, complex si vizeaza atat constructia celulara propriu-zisa (rol plastic), cat si transmiterea

caracterelor genetice( energetic, antigenic, patogenic, enzimatic) etc. Enzimele sunt derivati proteici avand celulele bacterie influentand rol biocatalitic; se formeaza in intracelulare (de exemplu

desfasurarea reactiilor

mitocondriale) si extracelulare (cu rol antigenic, patogenic) sau ectocelulare (avand rol in permeabilitatea selectiva). Avand o specificitate de substrat, de grup si sterica, enzimele din zestrea celulei bacteriene cca. 2000 fac parte din toate clasele ligaze. *C. Bodea tratat de biochimie vegetala, vol. I, Ed. Academica Bucuresti, 1964, clasificarea dupa Conp. V int. Biochimie , 1961 Enzimele pot aparea in fiziologia si metabolismul bacteriilor prin inductie, ele numindu-se enzime inductive, existand numai la comanda si in prezenta inductorilor specifici sau ca o zestre celulara, acestea fiind cunoscute sub numele de enzime constitutive. Glucidele reprezint 15-20% din masa substantei uscate a bacteriilor, in compozitia acesteia fiind cuprinse toate tipurile de glucide: omogene sau neomogene, simple si complexe. Ele sunt foarte importante pentru bacteriile anaerobe pentru care constituie singura sursa de nutritie. Rolul glucidelor in celula 37 de enzime*: oxidoreductaze, hidrolaze, transferaze, liaze, izomeraze,

bacteriana este plurivalent si anume: energetic, structural, antigenic, patogenic sau de rezistenta celulara, etc. Este evident ca ele prezinta importanta capitala ca sursa de energie si ca substanta plastica ce intra in constitutia cvasitotalitara a tuturor partilor morfologice celulare. Ca o caracteristica specifica bacteriilor Grampozitive este prezenta complexului poliglucidic neomogen mureina. Lipidele din bacterii variaza in limite foarte largi in raport cu specia microorganismelor, dar si cu conditiile de mediu (metaboliti, substrat etc.) sau stadiul de maturitate. In general, continutul de lipide este de 2-14% din substanta uscata celulara, dar unele mycobacterii (Mycobacterium tuberculosis Koch)au si mai mult(30%). Lipidele bacterine sunt omogene (acizi grasi, gliceride, ceruri)

si complexe (fosfolipide, lipoproteine, lipogliceni, etc.). Ceea ce-i specific bacteriilor este prezenta in celulele lor, in peretele mycobacteriilor, a acizilor grasi micoici (ac. Tuberculostearic , ac. Dicolipenic , ac. Micocerosic ) componenti ai cerurilor. Pentru bacterii este caracteristica lipsa steridelor (esteri ai alcoolilor policiclici numiti steroli). Totusi in Azobacter chroococcum, fixator de azot, s-a gasit un sterol (Schifferd, Anderson, 1936) cu structura neprecizata. Rolul lipidelor este divers, dar functiile energetice si de permeabilitate par a fi preponderente in fiziologia celulara bacteriana. Lipidele complexe, cum sunt fosfatidele, contin elemente structurale atat hidrofile, cat si lipofile, astfel ca solutiile lor apoase, de natura coloidala, joaca un rol important in reglarea

permeabilitatii celulare. Fosfatidele pot absorbi glucide si protide, care pot fi eliberate dupa nevoie, prin desorbtie. In acest fel, ele pot functiona si ca transportori de substante in celulele bacteriene, iar alaturi de acizii ribonucleici au rol in biosinteza proteinelor. Continutul de substante minerale reprezinta 3-30% din substanta uscata a bacteriilor, acesta variind in functie de specie si de varsta. Rolul substantelor minerale rezida in primul rand din faptul ca formarea compusilor la nivel molecular se face sub forma unor complecsi ce contin obligatoriu elemente minerale sub forma ionica. Acestia (de ex. Ca, Mg) intra in structurile celulare, deci au rol

plastic, ori activeaza sistemele enzimatice (citocromoxidazele cu fier), participa la formarea si transformarile acizilor nucleici (fosforul), regleaza presiunea osmotica celulara si permeabilitatea celulara (sodiul, potasiul, sulful), precum si potentialul de oxido-reducere la nivelul celular, etc. Oligo si microelementele minerale,

38

caracterizate prin reactivitate chimica ori labilitate electronica ridicate, sunt intotdeauna intalnite in celulele bacteriene (de ex. K, Na, Fe, Ca, Mg, S, Cu s.a.). Pentru organismul uman, bacteriile sunt o bogata sursa de vitamine, deoarece ele sunt capabile sa sintetizeze aceasta categorie de substante, cu deosebire vitaminele hidrosolubile din grupul B. Astfel, vitamina B1 (tiamina) este sintetizata de bacterii in oxidarile intracelulare si metabolismul glucidelor, ca de altfel si vitaminele B2 (riboflavina) si B3 (vitamina PP), vitamina B4 (adenina) ce participa in calitate de cofactor in reactiile nucleatidelor. Acidul folic (vitamina B9) este cunoscut ca un factor de crestere pentru mai multe specii de bacterii (B.subtilis, Lactobacillus sp. etc.) fiind cofactor necesar biosintezei compusilor purinici. Cresterea unor microorganisme bacteriene, ca de exemplu Lactobacillus lactis Dorner, nu ar fi posibila fara prezenta vitaminei B12 (ciancobalamina). Vitamina H, acidul para amino benzoic, este denumit si vitamina vietii bacteriilor, deoarece reprezinta pentru acestea un metabolit primar absolut necesar vietii si inmultirii lor ,fiind si un factor de crestere. In functie de specie, bacteriile pot sintetiza pigmenti, ce se intalnesc in celula (bacterii cromofore), legati endocelular de perete, ca in cazul stafilococilor (bacterii paracromofore) sau la exteriorul celulei bacteriene, ca la Pseudomonas, bacteriile din aceasta grupa fiind numite cromopare. Pigmentii pot fi sintetizati pentru un anumit scop (de protectie, ca de exemplu carotenoizii, pentru functia de coenzima in sistemele transmitatoare de electroni si de fosforilare oxidativa, de structura, pentru elementele functionale ale mitocondriilor*, ca factor de crestere pentru unele bacterii) sau pot rezulta din procesele catabolice. * mitos fir; chondros graunte; mitocondrie organit subcelular in care se regaseste sediul fosfonilarii oxidative, absenta la procariote Bacteriile mai pot avea o serie de substante avand rol bactericid sau bacteriostatic asupra altor specii sau chiar impotriva propriei specii (substante purtand numele de bacteriocine).

Metabolismul bacterian

Metabolismul reprezinta totalitatea proceselor biochimice intracelulare prin care substratul nutritiv este transformat in energie si compusi celulari. 39

Metabolismul bacterian este de doua tipuri si anume metabolism energetic, prin care se asigura respiratia bacteriana in reactii catabolice de degradare cu eliberare de energie si metabolism de sinteza care asigur, prin reactii anabolice si catabolice, sinteza componentelor celulei bacteriene. Sursele de energie ale metabolismului energetic pot fi lumina in cazul bacteriilor fotosintetizante si reactiile biochimice de oxido-reducere la bacteriile chimio-sintetizante. Energia poate fi eliberata prin procese de oxidare aeroba, in care intervine oxigenul ce se fixeaza pe substrat si anaeroba, prin procesul de

pierdere a hidrogenului, in absenta oxigenului, care este , de asemenea, un fenomen de oxidare in care se pierd unul sau mai multi electroni (sau sarcini electrice negative) ce sunt acceptati de alta substanta. In ambele situatii se poate discuta despre o respiratie bacteriana oxibiotica (aeroba) si anoxobiotica (anaeroba). Interventia directa a oxigenului in respiratia aeroba elibereaza din substrat o cantitate insemnata de energie (de exemplu, prin oxidarea completa a glucozei de catre bacterii aerobe se obtin in final aproximativ 100 calorii/mol). Germenii anaerobi isi procura energia necesara activitatii lor metabolice prin procese fermentative, in absenta oxigenului, mai ales pe seama glucidelor. In acest caz eliberarea de energie este mai mica, iar descompunerea glucozei se

opreste la stadiul de acid piruvic, alcooli sau acid lactic, cantitatea de energie fiind de aproximativ 50 ml/mol. Descompunerea anaeroba a glucozei are loc intr-un proces de fermentatie in care intervin compusii macroenergici* (superenergetici) ai fosforului (ADP, ATP, DNP etc), proces ce decurge in 11 etape succesive (dupa Mezerhof-Emden) ce vor fi abordate la microbiologia speciala. * makros mare; ergos - actiune Bacteriile folosesc pentru respiratia lor cantitati diferite de oxidanti, astfel ca, in functie de potentialul lor de redox**, ele pot fi clasificate in: strict aerobe cuprinzand bacteriile care folosesc ca sursa energetica O2, motiv pentru care dispun de toate enzimele lantului respirator, catalaza si perozidaza (M. tuberculosis); strict anaerobe ce nu supravietuiesc in prezenta oxigenului, folosesc enzime de tip nicotinic si flavinic si nu au peroxidaza si catalaza; aerobe ce traiesc la un potential redox mai mic, au cantitati mici de peroxidaza si se pot adapta ambelor tipuri de respiratie; acest tip de respiratie este adoptat de 40

majoritatea bacteriilor; anaerobe microaerofile - care contin in cantitati mici catalaze si suporta unitati reduse de oxigen molecular. ** potentialul de oxido-reducere este diferenta de potential dintre un electrod inatacabil (platina, aur, carbune) si un sistem de oxidoreducere care elibereaza electroni. Metabolismul de sinteza reprezinta totalitatea proceselor metabolice cu consum de energie care duc la sinteza unor produse necesare cresterii si

multiplicarii bacteriilor. In functie de modul de procurare a acestor substante, pot fi deosebite 3 tipuri de bacterii: autotrofe* - care isi procura carbonul si aportul din substante anorganice (CO2, NH3-, NO3-); heterotrofe* - la care sursele de C si N provin din surse organice si isi pot sintetiza singure metabolitii esentiali; paratrofe* - ce se dezvolta doar intracelular si nu isi pot sintetiza singure metabolitii esentiali. *gr. autos insusi; trephein a hrani; heteros altul; para alaturi.

4.5 CRESTERA, MULTIPLICAREA SI MOARTEA BACTERIILOR

Bacteriile sunt niste fiinte vii si, astfel, ele cresc, se inmultesc si mor. Acest proces complex nu se refera numai la indivizi, ci si la populatia bacteriana in totalitate. In primul caz biologia cresterii si dezvoltarii este dirijata ereditar, in cel de al doilea aceste fenomene depind cu precadere de conditiile de mediu. Cresterea individului bacterian se caracterizeaza prin adaugarea de protoplasma, ca rezultanta a fenomenelor predominant anabolice in raport cu cele catabolice si are ca efect o crestere a suprafetei si a volumului sau. Intre aceste doua caractere exista un raport strans corelat cu etapa de dezvoltare in care se afla bacteria: pe masura ce bacteria creste, se mareste si volumul sau, in timp ce suprafata sa devine proportional mai mica (ipoteza Leuckart Spencer). Cand acest raport creste in favoarea volumului, celula bacteriana tinde sa se divida, sa se multiplice. Cum aparatul nuclear este activ mai ales in momentul diviziunii celulei, volumul bacteriei creste semnificativ in perioada in care aparatul nuclear este in repaus. Raportul volum/suprafata al bacteriei se schimba in favoarea suprafetei odata ce diviziunea a luat sfarsit, dupa care se pregateste un nou ciclu de crestere.

41

Multiplicarea bacteriilor inseamna cresterea numarului de indivizi intr-un mediu de viata favorabil si se realizeaza prin diviziune. Populatia care rezulta prin diviziunea bacteriilor creste in progresie geometrica cu ratia 2, timpul necesar pentru dublarea populaiei numindu-se timp de dublare sau timp de generatie. In raport cu specia bacteriana, multiplicarea atinge un maximum de populatie care se poate mentine o perioada oarecare dupa care incepe declinul ei. Multiplicarea se petrece in faze succesive. Acestea sunt: - faza de lag* sau faza de ajustare, ce se caracterizeaza prin diminuarea numarului de indivizi care constituie inoculul, prin cresterea dimensiunilor germenilor viabili. *engl. Lag intarziere, captusire Este o faza de acomodare a germenilor la noile conditii de viata. Durata de lag este, in general, apreciata pentru bacterii la aproximativ 2 ore, dar ea este in functie de specia bacteriana, cantitatea initiala de inocul si conditiile de mediu. De exemplu, bacteriile termofile si Escherichia coli au o faza de lag scurta (15-20 minute), in timp ce Mycobacterium are una mai lunga. In faza de lag cantitatea de N-total, P-organic, ARN si O2 consumat cresc. - faza logaritmica (exponentiala) de multiplicare este o faza de crestere rapida, in progresie geometrica, a bacteriilor si se caracterizeaza printr-o serie de manifestari cunoscute sub numele de tinerete fiziologica"; microorganismele sunt mai permeabile si mai sensibile la factorii de mediu. Faza dureaza in medie 2-3 ore (M. tuberculosis). Curba de multiplicare evolueaza exponential pana in momentul in care una din substantele nutritive din mediu este consumata, iar in mediu se acumuleaza metaboliti toxici. Metabolitii consumati si produsi in mediu se numesc factori limitanti. In timpul acestei faze caracterele morfologice ale bacteriilor se omogenizeaza, activitatea si echipamentul enzimatic sunt mai bine dezvoltate, proprietatile biochimice si de metabolism se manifesta la parametrii optimi, rezistenta germenilor la agentii fizici, chimici si biologici devine caracteristica speciei. - faza stationara caracterizata prin faptul ca raportul dintre germenii care se divid si cei care mor ramane relativ constant, astfel incat numarul bacteriilor se stabilizeaza. Faza de stationare este denumita si faza de concentratie M, deoarece in aceasta etapa populatia bacteriana atinge un maximum in cultura. 42

- faza de declin (faza de moarte logaritmica) este etapa in care numarul germenilor morti intrece numarul germenilor vii, deoarece consumarea substratului nutritiv si acumularea de metaboliti toxici duc la moartea majoritatii bacteriilor, iar timpul de generatie creste la cateve zile; celulele vii imbatranesc, nu-si mai pastreaza caracteristicile, speciile patogene isi pierd patogenitatea si virulenta. In aceasta faza apar tendintele de sporulare. Ea nu este valabila in cazul culturilor bacteriene continue, caracterizate prin reinnoirea continua a substratului nutritiv si prin recoltarea de asemena continua a germenilor in faza exponentiala. Culturile

continue se fac in scopuri productive si prezinta o deosebita importanta industriala, biotehnologica in domenii de activitate de mare importanta economica si sociala. In fapt, cultura bacteriana este rezultatul inmultirii, cresterii numarului de germeni, intr-un mediu favorabil formandu-se o populatie avand caractere asemanatoare. Aspectul culturii bacteriene depinde de specia, varsta indivizilor precum si de mediul de cultura. Mediile de cultura bacteriana pot fi: artificiale, create in scopul asigurarii tuturor conditiilor pentru dezvoltarea si multiplicarea indivizilor si naturale (vii), avand provenienta animala (ou embrionat, animale de experienta, tesuturi animale, culturi celulare, sange etc.) si vegetala (culturi celulare, meristeme, parti din plante s.a.). Culturile bacteriene pot fi studiate in vitro pe medii de cultura artificiale sau in vivo direct pe mediile naturale, mai ales pentru germenii patogeni. Culturile bacteriene se dezvolta pe medii artificiale lichide si solide. Primele determina aparitia dupa o perioada de 18-20 ore a unei turbiditati (tulbureli) ce poate fi omogena, datorata germenilor de varsta tanara, cu vigoare ridicata care disperseaza uniform si rapid in mediu, denumita culturi S (smooth netede) sau neomogena, cu grade de turbiditate diferite si uneori chiar limpezi dar cu depuneri pe vasele de cultura sau valuri de suprafata, purtand denumirea de culturi R (rough rugoase). Culturile de medii solide sunt obtinute prin insamantarea germenilor bacterieni rezultati din multiplicarea unei singure celule bacteriene si se numesc colonii de culturi pure sau culturi clonare. Colonia bacteriana reprezinta cultura pura aparuta dupa un timp de multiplicare de 2 - 6 ore, n care, din punct de vedere genetic, indivizii sunt identici.

43

Dupa aspect, coloniile pot avea o forma geometrica regulata sau neregulata, conturate sau difuze, colorate sau necolorate, lucioase sau rugoase, limpezi, opace sau semimate, cu sau fara caracteristici specifice speciei. Coloniile - S au aspect lucios, cu margini conturate, forma rotunda sau ovoidala, diametru 1-2 mm, consistenta onctuoasa. Coloniile - R au suprafata aspra, forme cu margini neregulate, crenelate, uneori difuze in mediul de cultura, in general colorate si mate. Coloniile - M sunt variante ale tipului S dar contin germeni cu capsula si au o consistenta gelatinoasa sau mucilaginoasa, prezentand tendinta de a difuza in mediu sau de jonctiune intre ele. Coloniile - G sunt colonii pitice obtinute din germeni normali dar afectati de interventii exterioare (ex. antibiotice, antiseptice, carente nutritionale, etc.). Coloniile bacteriene se deosebesc intre ele prin anumite caracteristici de cultura, care, singure sau impreuna, constituie criterii de departajare. Astfel, diametrul coloniei bacteriene imparte coloniile in mari cele care au diametrul mai mare de 2 mm, mijlocii si mici coloniile cu diametrul sub 1 mm. O alta caracteristica este transparenta coloniilor. Sub acest aspect exista colonii translucide, ca cele date de streptococi si opace, caracteristice, in general, coloniilor de stafilococi. In functie de proprietatea de a produce pigmenti, bacteriile pot fi pigmentogene (cromogene), daca produc pigmenti, caz in care: a)se coloreaza doar colonia (cazul bacteriilor cromofore si paracromofore) de exemplu coloniile stafilococice colorate in alb, galben, auriu si b) se coloreaza si mediul, fiind cazul bacteriilor cromopare la care pigmentul este eliberat in exteriorul celulei ca de exemplu bacilul piocianic care sintetizeaza si elibereaza in exterior doi pigmenti: piocanina albastra si pioverina verde. Alte caracteristici ce pot constitui criterii de identificare a coloniilor bacteriene, prezentate si anterior sunt: forma coloniei, rugozitatea coloniei, consistenta, forma conturului marginal, etc.

44

4.6 CULTIVAREA BACTERIILOR

Pentru identificarea unei specii bacteriene, examenul microscopic direct este de cele mai multe ori insuficient, fiind necesara cultivarea agentului patogen pe un complex de substante nutritive adecvate care alcatuiesc mediile de cultura.

Aceste medii de cultura, pentru a fi corespunzatoare, trebuie sa indeplineasca cateva conditii: sa contina substante plastice si energetice necesare cultivarii microbului insamantat, adica sa asigure surse de azot, de hidrati de carbon, de saruri minerale, de apa, de vitamine si factori de crestere necesari dezvoltarii si reproducerii celulelor bacteriene, sa satisfaca cerintele de aerobioza sau anaerobioza ale agentului tinand cont de faptul ca, in timp ce bacteriile aerobe pot folosi oxigenul molecular, cele anaerobe nu se pot dezvolta in prezenta oxigenului liber, sa aiba o concentratie de ioni de hidrogen (pH) optima si sa fie sterile, pentru a permite izolarea in cultura pura a germenului respectiv. Pe masura cunoasterii tot mai aprofundate a exigentelor unei bacterii s-a ajuns la ralizarea unor medii de cultura cu o compozitie adecvata si precisa. In unele cazuri chiar s-a ajuns la situatia optima de preparare a unor medii sinteticestandardizate, nemaifiind necesare ingrediente de origine animala sau vegetala a caror compozitie poate varia foarte mult. In general, mediile de cultura se pot prezenta sub forma lichida (bulion, apa peptonata, etc.) sau solida (medii in care se incorporeaza agrar). In functie de scopul urmarit, mediile de cultura pot fi grupate astfel: medii de izolare, care permit izoalrea bacteriei dintr-un produs patologic; medii de transport, care permit supravietuirea anumitor bacterii ce nu pot fi insamantate imediat dupa recoltare (de exemplu, mediul Stuart pentru Neisserii, Carry-Blair pentru vibrionul holeric, etc.) medii de imbogatire, destinate cultivarii unor bacterii cu necesitati nutritive particulare si care sunt stimulate sa creasca in mod special, deoarece numarul lor este redus in produsul in momentul recoltarii (de exemplu, mediul Muller-Kauffmann pentru salmonele); medii selective, care contin elemente ce permit cresterea numai a anumitor bacterii dintr-un produs (de exemplu, mediul Wilson-Blair pentru bacilul tific); 45

medii diferentiale, care contin substante ce pun in evidenta unele proprietati biochimice ale bacteriilor studiate. La randul lor, mediile diferentiale pot fi simple (de exemplu, mediul AABTL care pune in evidenta fermentarea lactozei) sau politrope (de exemplu, mediul TSI care pune in evidenta mai multe caractere biochimice). In tehnica prepararii unui mediu nutritiv trebuie sa se aiba in vedere urmatoarele: spalarea si pregatirea cores