Curs 7.Testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice.

Metode de testare a sensibilităţii bactecteriilor la agenţi antimicrobieni

7.1. Metode de testare a sensibilităţii in vitroAntibiograma face parte din prima categorie de metode menţionate. Reprezintă metoda de laborator prin care se apreciază sensibilitatea la antibiotice a germenilor recoltaţi de la bolnavii cu infecţii bacteriene, după cultivare pe medii îmbogăţite, care să permită dezvoltarea optimă a microorganismului pentru care se efectuează testarea (de exemplu pe agar Mueller-Hinton).Pentru antibiograme trebuie să folosim culturi pure (reprezentând o singură tulpină bacteriană), chiar în cazul infecţiilor multibacteriene. Cele mai frecvent utilizate tehnici sunt:a) Tehnicile calitative:

- antibiograma difuzimetrică comună (cu discuri)- antibiograma difuzimetrică comparativă- antibiograma difuzimetrică standardizată- antibiogramele difuzimetrice rapide

b) Tehnicile cantitative:- metoda diluţiilor în mediu lichid- metoda diluţiilor în agar- metoda microdiluţiilor în agar- metoda „punctelor de ruptură”- testul „E”- metode şi sisteme comerciale, automatizate, de testare etc.

7.1.1. Antibiograma difuzimetrică comunăDin punct de vedere tehnic însămânţăm germenul de testat pe mediul solid

(ex. agar Mueller-Hinton) turnat în plăci Petri. Însămânţarea se poate realiza de exemplu prin „inundarea” plăcii urmată de aspirarea, aseptic, a excesului de inocul sau cu ajutorul unui tampon (există şi alte variante tehnice). După circa 20 minute (timp în care placa Petri se lasă cu capacul întredeschis în vecinătatea becului de gaz, aprins) se aplică microcomprimatele în care sunt încorporate antibiotice în concentraţie standardizată. Aplicarea microcomprimatelor se poate face cu ajutorul unei pense, în condiţii aseptice, sau cu ajutorul unui aplicator „automat” (la minim 30 mm distanţă între ele şi minim 15 mm de marginea plăcii; vom utiliza 5 antibiotice diferite pentru o placă Petri cu diametrul de 9 cm).

Microcomprimatele trebuie să vină în contact perfect cu mediul, motiv pentru care, cu ajutorul unei pense le presăm uşor (după caz). După încă 15-20 minute, incubăm plăcile peste noapte în termostat, la 28 sau 35-37°C, în funcţie de temperatura optimă de multiplicare a microorganismului testat.

Antibioticul eliberat din microcomprimat difuzează în mediu, realizând zone de inhibiţie în care coloniile microbiene nu se dezvoltă.Cu cât zona de inhibiţie este mai largă, cu atât germenul va fi considerat mai sensibil. Dacă în interiorul zonei de inhibiţie (chiar dacă diametrul înregistrat este foarte mare) se dezvoltă colonii, „mutanţi rezistenţi”, germenul va fi considerat rezistent.

1

Această metodă, cu toate că este folosită pe scară largă în laboratoare, permite de fapt numai eliminarea antibioticelor complet inactive şi eventual selecţionarea antibioticelor foarte active, pentru că tehnica nu este standardizată.

7.1.2. Antibiograma difuzimetrică comparativă (Stokes, Balş)Se efectuează pentru microorganismul de testat în paralel cu un microorganism de referinţă, din aceeaşi specie (sau o specie asemănătoare). Spre exemplu, pentru cocii Gram-pozitivi putem alege pentru comparaţie o tulpină de Staphylococcus spp. Tulpina de referinţă are o sensibilitate cunoscută la diferitele antibiotice pe care le utilizăm.Prin această metodă se înlătură o parte din factorii de eroare ai metodei precedente, spre ex. calitatea mediului, calitatea discurilor de antibiotice, care vor fi identice pentru microorganismul de referinţă şi pentru microorganismul testat. Rezultatele se exprimă cu termenii: „sensibil”, „intermediar”, „rezistent”, în funcţie de diametrul zonelor de inhibiţie a multiplicării celor doi germeni, faţă de acelaşi antibiotic (jumătăţile de cerc se examinează comparativ). În cazul în care cunoaştem CMI (concentraţia minimă inhibitorie) a microorganismului de referinţă, putem face aprecieri cu privire la CMI pentru microorganismul testat.Din punct de vedere tehnic, pe o placă de forma unui pătrat („împărţită” în 3 zone egale marcând pe partea externă a plăcii liniile de demarcaţie) se inoculează în treimea medie microorganismul de referinţă iar în treimile exterioare 2 microorganisme diferite, pentru care dorim să realizăm testarea. Inoculul trebuie să fie astfel realizat încât să conducă la apariţia după incubare a unor colonii foarte apropiate, dar care să nu fie confluente. Plasăm microcomprimatele cu antibiotice pe liniile de demarcaţie dintre culturi. Incubăm peste noapte la 35-37°C urmând ca în ziua următoare să citim şi să interpretăm rezultatele.

7.1.3. Antibiograma difuzimetrică standardizată (Kirby-Bauer, NCCLS)Din punct de vedere tehnic se realizează asemănător cu prima metodă prezentată, dar este standardizată, fiind singura metodă difuzimetrică recunoscută pe plan internaţional, care permite obţinerea unor rezultate reproductibile şi corelabile între laboratoare diferite.Elementele necesare standardizării sunt:

- mediul (în majoritatea cazurilor agar Mueller-Hinton, pentru că are o valoare nutritivă corespunzătoare şi nu conţine substanţe cu acţiune inhibitoare)

- există elemente minerale care trebuie adăugate în cazul testării anumitor microorganisme (ex. Mg2+ şi Ca2+, pentru tulpini de Pseudomonas aeruginosa, atunci când este testată sensibilitatea la aminoglicozide);

- se va verifica pH-ul mediului (de obicei cuprins între 7,2 şi 7,4);- există suplimente nutritive care trebuie adăugate în cazul testării unor

microorganisme pretenţioase;- grosimea mediului trebuie să fie de 4 mm (25 ml de mediu/placă de 9 cm);- inoculul, care se obţine de preferat din 5 colonii izolate (cultură pură) şi trebuie să

aibă o turbiditate corespunzătoare standardului turbidimetric 0,5 McFarland (circa 108 unităţi formatoare de colonii/ml) în majoritatea cazurilor;

- timpul de incubare (în majoritatea cazurilor 16-18 ore la 35-37°C, nu mai mult de 2-3 plăci suprapuse), atmosfera de incubare, umiditatea atmosferei de incubare;

2

- concentraţia substanţelor antimicrobiene din microcomprimate şi dimensiunea microcomprimatelor (6 mm diametru);

- alegerea substanţelor antimicrobiene pentru care se face testarea;- păstrarea plăcilor cu mediu până în momentul utilizării (maxim 7 zile, în pungi de

polietilenă, la +4°C);- utilizarea tulpinilor de referinţă pentru controlul de calitate;- interpretarea rezultatelor (se măsoară diametrul zonei de inhibiţie şi se compară

rezultatele cu cele din tabelele puse la dispoziţie de producători şi/sau centrele de referinţă).

Metodele difuzimetrice au dezavantajul că nu permit aprecierea concentraţiilor eficace ale antibioticului la nivelul focarului infecţios.

7.1.4. Metoda diluţiilor în mediu lichidAcest tip de metodă oferă informaţii cu privire la CMI ale antibioticelor studiate,

faţă de microorganismul testat. CMI = concentraţia minimă inhibitorie, reprezintă cea mai mică concentraţie de agent antimicrobian, exprimată în micrograme/ml, care mai exercită o acţiune bacteriostatică asupra germenului testat.

Din punct de vedere tehnic, pentru fiecare antibiotic avem nevoie de mai multe tuburi cu bulion Mueller-Hinton în concentraţii descrescânde (diluţii binare) pornind spre ex. de la 16 micrograme/ml şi până la 0,125 micrograme/ml, în total 8 tuburi, plus 2 tuburi martor, fără antibiotic (cantitatea finală va fi de 1 ml în fiecare tub). Preparăm un inocul standardizat turbidimetric şi în condiţii aseptice inoculăm toate cele 10 tuburi cu câte 1 ml de inocul. Agităm pentru a omogeniza. Incubăm cele 8 tuburi cu antibiotice şi 1 tub martor timp de 16-20 ore la 35-37°C iar al doilea tub martor îl menţinem pentru aceeaşi perioadă la temperatura frigiderului. Pentru controlul de calitate utilizăm şi un şir de tuburi pe care le inoculăm cu o tulpină de referinţă corespunzătoare. În ziua următoare citim şi interpretăm rezultatele.

Deoarece am utilizat o cantitate de inocul egală cu cantitatea de mediu, concentraţia finală de antibiotic se va înjumătăţi (de ex. în tubul în care diluţia iniţială a fost de 16 mg/ml, diluţia finală va fi 8 mg/ml etc.). În tubul martor menţinut la +4°C ar trebui să nu fie prezentă creşterea, în tubul martor menţinut la 35-37°C creşterea trebuie să fie prezent.

În tuburile inoculate cu tulpina de referinţă trebuie să avem rezultatul corespunzător datelor pe care le cunoaştem privitor la respectiva tulpină.În tuburile cu microorganismul testat, ultima diluţie care a inhibat dezvoltarea microorganismului corespunde CMI. Se consideră (în general, pentru că CMI diferă în funcţie de specia microbiană) că microorganismele în cazul cărora CMI este £ 3 mg/ml vor fi eficient inhibate de către antibioticul respectiv şi in vivo.CMI nu are aceeaşi valoare pentru genuri, specii sau tulpini diferite. De ex. CMI la amoxicilină în cazul unor tulpini sensibile este de 0,1 mg/ml pentru Staphylococcus aureus, 0,03 mg/ml pentru Streptococcus pneumoniae, 0,25 mg/ml pentru Haemophilus influenzae, 2 mg/ml pentru E. coli, 16 mg ml (şi practic aceasta semnifică „rezistenţă in vivo”) pentru Bacteroides fragilis iar în cazul Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa sau Chlamydia trachomatis tulpinile sunt rezistente.

3

7.1.5. Determinarea CMB (concentraţia minimă bactericidă)Pornind de la rezultatul obţinut prin metoda diluţiilor în mediu lichid, se vor utiliza ca sursă de inocul tuburile în care dezvoltarea microbiană a fost inhibată.Este necesară o placă Petri cu agar Mueller-Hinton care va fi împărţită în sectoare, numărul de sectoare fiind corespunzător numărului de tuburi fără creştere microbiană. Însămânţăm în condiţii aseptice din fiecare tub fără creştere microbiană, fiecare în sectorul de placă corespunzător. Incubăm pentru 16-18 ore la 35-37°C. CMB va corespunde ultimei concentraţii de antibiotic care a distrus microorganismele însămânţate (sectoare de placă fără apariţia culturii). Se consideră că antibioticul va fi eficient in vivo dacă în serul pacientului se pot atinge concentraţii de antibiotic care să depăşească de 4-8 ori CMB.

Determinarea CMI şi CMB este extrem de importantă pentru aprecierea eficacităţii antimicrobiene a unui antibiotic asupra unei tulpini bacteriene. Pentru tratamentul infecţiilor severe (de exemplu endocardite, meningite, sepsis etc), precum şi la imunodeprimaţi, efectuarea acestei metode este indispensabilă.

7.1.6. Metoda „punctelor de ruptură” (breakpoints)Metoda este folosită în laboratoarele moderne de microbiologie şi este utilizată

pentru a defini sensibilitatea şi rezistenţa la antibiotice. Depinzând de metoda de testare rezultatele sunt exprimate sub forma unei concentraţii (mg/l sau µg/ml) sau sub forma unui diametru (mm).

Metoda este practicată de multe dintre laboratoarele din Europa de Vest, mai ales dacă volumul de muncă este mare sau foarte mare. Prin această metodă se pot testa mai multe microorganisme, în acelaşi timp. Antibioticele sunt incorporate în mediul de cultură, la o anumită concentraţie „limită”, în funcţie de cunoştinţele şi datele acumulate în ceea ce priveşte activitatea „in vivo” a respectivelor medicamente. Plăcile sunt inoculate simultan cu mai multe tulpini bacteriene, în „spot”, folosind un inoculator construit special, sunt incubate în condiţii corespunzătoare pentru 16-18 ore. În cazul în care tulpina sau tulpinile din diferitele specii bacteriene nu se dezvoltă la această concentraţie „limită” de antibiotic (considerată ca fiind eficace „in vivo”), bacteria izolată este considerată sensibilă. În cazul în care bacteria se dezvoltă (apare cultură bacteriană), bacteria izolată este considerată rezistentă.

Această concentraţie limită (breakpoint) trebuie setată în funcţie de următoarele date: distribuţia CMI, evaluarea raportului PK/PD (farmacocinetic/farmacodinamic) şi rezultatele obţinute în clinică în tratamentul pacienţilor. PD reprezintă studiul efectelor medicamentului de-a lungul timpului şi este în strânsă legătură cu PK care reprezintă modificările concentraţiilor medicamentului în timp.

”Punctele de ruptură” trebuie stabilite înainte ca un antibiotic să fie folosit în clinică şi trebuie să fie revăzute când apar cazuri de rezistenţă la antibiotice. Totuşi setarea de ”puncte de ruptură” nu este perfectă. Metoda este utilă şi în realizarea unor studii epidemiologice în ceea ce priveşte modificarea rezistenţei la antibiotice în anumite zone geografice.

7.1.7. Testul E; Determinarea CMI prin „E test”„E test” reprezintă o metodă de testare in vitro a sensibilităţii la antibiotice pentru

diferite microorganisme, inclusiv pentru bacteriile pretenţioase şi germenii anaerobi.

4

„E test” se aseamănă metodei diluţiei în agar combinând principiile metodei difuzimetrice cu cele de diluţie. „E test” este uşor de utilizat şi spre deosebire de metoda difuzimetrică permite determinarea valorii CMI.Din punct de vedere tehnic sunt necesare: o placă Petri cu agar Mueller-Hinton, inoculul standardizat şi langhetele din plastic pe care au fost fixate antibiotice în gradient, de ex. la un capăt 256 mg/ml ajungând la celălalt capăt la 0,016 mg/ml (câte o langhetă pentru fiecare antibiotic, câte 15 diluţii marcate pe fiecare langhetă). Însămânţăm microorganismul care urmează a fi testat în condiţii standardizate şi depunem radiar langhetele cu antibiotice.

Principiu:Asemănător metodei difuzimetrice, „E test” necesită un inocul bacterian ajustat ca

turbiditate (standardizat), ce urmează a fi depus pe mediul de cultură potrivit microorganismului studiat (ex. mediul Mueller-Hinton, geloză-sânge etc), în plăci Petri. Benzile „E test” conţin un gradient de agent antimicrobian şi se aplică după însămânţare. În funcţie de antibiotic, gradientul „acoperă” un şir continuu de concentraţii între 0,002-32 mg/ml; 0,016-256 mg/ml sau 0,064-1024 mg/ml. După incubare (timp de 16-18 ore la 35-37°C) se formează o zonă eliptică de inhibiţie. Valoarea CMI se citeşte acolo unde creşterea bacteriană intersectează banda „E test”.Materiale şi reactivi necesari:

- plăci Petri cu agar Mueller-Hinton (păstrate la 2-8ºC până în momentul utilizării);

- bulion Mueller-Hinton (cu 20-25 mg Ca2+ şi 10-12,5 mg Mg2+/litru; se repartizează câte 5 ml în tuburi sterile cu capac; se păstrează la 2-8ºC);

- medii de cultură pentru menţinerea în stare viabilă a tulpinilor bacteriene necesare efectuării controlului de calitate ;

- tulpini martor;- inocul bacterian;- soluţie salină sterilă (0,85% NaCl) sau bulion Mueller-Hinton, pentru ajustarea

inoculului bacterian;- benzi „E test” (a. cu agenţi antimicrobieni cu nucleu β lactam, b. cu alţi agenţi

antimicrobieni); se păstrează în congelator la -20ºC până în momentul utilizării; au o durată de utilizare de 1-2 ani (pentru prima grupă) şi respectiv de 2-3 ani

- tampoane sterile;- standard de turbiditate McFarland de 0,5 şi 1,0;- pipete Pasteur sterile;- foarfece;- plăci Petri sterile cu diametrul de 90 mm şi respectiv de 150 mm;- incubator cu atmosferă obişnuită reglat la 34-35ºC; incubarea în atmosferă

îmbogăţită cu CO2 este necesară în cazul testării anumitor microorganisme;- sursă de lumină;- aplicator „E test”şi bandă adezivă (opţional).

Tehnica de lucru:A. Benzile „E test”- scoatem plăcile cu mediul de cultură şi benzile „E test”din congelator, le lăsăm la temperatura camerei pentru echilibrare termică timp de 20 minute sau până când nu mai observăm nici o urmă de umezeală

5

- înainte de a deschide folia care include benzile, inspectăm pentru a observa dacă există perforări; dacă folia respectivă nu este intactă, atunci benzile din interiorul ei nu se mai pot folosi; dacă nu sunt probleme, pentru a deschide o folie mai întâi tăiem cu o foarfecă de-a lungul liniei întrerupte apoi între compartimentele ce conţin benzile- scoatem benzile din folie cu ajutorul unei pensete şi le punem în plăci Petri sterile; apoi le putem aplica pe mediul de cultură care conţine inoculul microbian de testat- păstrăm restul benzilor în tuburi în care introducem o substanţă desicantă pentru a le proteja faţă de umezeală; este necesară protecţia şi faţă de căldură şi expunerea directă la lumină (punem tuburile în congelator, la -20°C)B. Inoculul bacterian:- cu ajutorul ansei sau a unei pipete, transferăm mai multe colonii dintr-o cultură bacteriană de 18-24 de ore într-un tub cu soluţie salină sterilă sau bulion; omogenizăm (există şi varianta să transferăm mai multe colonii în bulion, să incubăm timp de 2-8 ore până când obţinem densitatea dorită)- ajustăm (vizual) densitatea folosind soluţie salină sterilă 0,85% sau bulion, la un standard de turbiditate echivalent cu 0.5 McFarland; alternativ, suspensia se poate ajusta la standardul dorit cu ajutorul unui nefelometru (aprecierea vizuală a turbidităţii inoculului nu garantează numărul corect al unităţilor formatoare de colonii).C. Inocularea plăcilor:- introducem tamponul steril în tubul care conţine suspensia bacteriană de testat, rotim de câteva ori, apoi eliminăm excesul de lichid prin presarea tamponului de pereţii interiori ai tubului;- depunem inoculul pe suprafaţa plăcii cu mediul de cultură având grijă să acoperim complet suprafaţa mediului (ex. inoculăm pe 3 direcţii diferite, rotind placa cu câte o treime);- lăsăm placa timp de circa 10 minute, ca să se usuce, înainte de a aplica benzile „E test”.D. Aplicarea benzilor „E test”:- luăm cu grijă o bandă fără să atingem sau zgâriem partea pe care este depus agentul antimicrobian; dacă folosim pensa sterilă, apucăm cu grijă de capătul benzii notat cu E (benzile trebuie să fie complet separate una de cealaltă înainte de a le aplica pe suprafaţa mediului de cultură inoculat cu tulpina de testat); dacă se foloseşte aplicatorul „E test”, banda adezivă trebuie să fie în poziţia corectă (la fiecare capăt al aplicatorului);- aplicăm banda „E test” pe suprafaţa mediului de cultură, cu capătul ce conţine concentraţia cea mai mare aproape de marginea plăcii;- dacă lucrăm cu plăci cu diametrul de 90 mm, aplicăm una sau două benzi; dacă lucrăm cu plăci cu diametrul de 150 mm, putem aplica şase benzi „E test” (benzile se pun la distanţe egale, radial, pornind din centrul plăcii; marginea capătului benzii notată cu E trebuie să atingă marginea plăcii);- banda trebuie să fie în contact cu suprafaţa agarului; eliminăm eventualele bule de aer de sub bandă cu ajutorul unei pense începând de la marginea bulei şi mutând-o în sus pe gradient până la capătul notat cu E (prezenţa bulelor mici nu va afecta rezultatul testării);- banda aplicată pe suprafaţa agarului nu se mută în altă poziţie (luând contact cu mediul de cultură, agentul antimicrobian de pe partea posterioară se eliberează imediat); dacă banda a fost aplicată cu partea posterioară în sus atunci se apucă cu grijă, se întoarce şi se pune corect pe suprafaţa mediului; dacă banda a atins suprafaţa mesei de lucru sau un alt obiect, se poate folosi în continuare atât timp cât nu a luat contact cu o substanţă lichidă.

6

E. Incubarea:- timpul şi temperatura de incubare depind de variantele de microorganism-agent antimicrobian ce urmează a fi testate;- incubarea în atmosferă de CO2 modifică pH-ul mediului de cultură şi poate afecta activitatea agenţilor antimicrobieni; se foloseşte numai în cazul în care microorganismele supuse testării necesită pentru multiplicare CO2 (Haemophilus spp., Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae etc).Interpretarea rezultatelor:- putem citi rezultatul în cazul în care creşterea bacteriană este confluentă sau aproape confluentă;- ţinem placa lângă o sursă de lumină (atunci când mediul este Mueller-Hinton); citim valoarea CMI în punctul în care creşterea bacteriană intersectează banda „E test”; dacă am utilizat agar Mueller-Hinton suplimentat cu 5% sânge de oaie, sau geloză-chocolate Mueller-Hinton sau alt mediu opac, vom utiliza pentru citirea rezultatului o sursă de lumină reflectantă şi o lupă;- pe geloză-sânge citim zona de inhibiţie a creşterii bacteriene nu zona de inhibiţie a hemolizei;în cazul în care nu apare nicio zonă de inhibiţie, raportăm valoarea CMI ca fiind mai mare decât cea mai mare concentraţie a agentului antimicrobian de pe banda „E test”; dacă zona de inhibiţie nu intersectează banda (zona de inhibiţie se află sub banda „E test”), valoarea CMI se raportează ca fiind mai mică decât concentraţia cea mai scăzută a agentului antimicrobian de pe banda „E test”; - în cazul unei valori CMI situată între două marcaje ale gradientului benzii, rezultatul pe care îl notăm va fi valoarea cea mai mare;- raportăm rezultatul obţinut pentru tulpina studiată după ce verificăm rezultatul obţinut pentru tulpina de referinţă (control de calitate);- rezultatele CMI se interpretează conform criteriilor stabilite de NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards).7.1.8. Alte tehnici de testare clasiceTestarea sensibilităţii la antibiotice a bacteriilor anaerobe:

metodele sunt utile în special din punct de vedere al supravegherii epidemiologice, dar sunt rezervate pentru laboratoarele de referinţă

se pot utiliza tehnici de diluţie în mediu lichid sau solid, tehnici de microdiluţii în mediu lichid, teste pentru producerea de β-lactamază etc.

Testarea sensibilităţii mycobacteriilor se efectuează respectând prevederile Programului Naţional de Control al

Tuberculozei (care indică situaţiile în care vor fi efectuate aceste testări) se pot utiliza metoda concentraţiilor absolute, metoda proporţiilor, metoda

rapoartelor de rezistenţă, metode radiometrice etc.Testarea sensibilităţii altor bacterii

există şi alte bacterii pentru care trebuie respectate condiţii particulare spre exemplu pentru testarea sensibilităţii stafilococilor la oxacilină/meticilină se

recomandă ca mediul să conţină 4% NaCl, pentru testarea sensibilităţii la antibiotice a streptococilor se recomandă ca mediul să conţină 5% sânge defibrinat de berbec etc.

7

Testarea sensibilităţii fungilor (antifungigrama) ţine cont de temperatura şi durata de incubare, care diferă faţă de cele pentru

bacterii, mediul utilizat fiind mediul Sabouraud se pot utiliza tehnici de diluţie în mediu lichid sau solid

Testarea producerii de β-lactamaze este utilă atunci când se verifică sensibilitatea la antibiotice a microorganismelor

care pot produce β-lactamază (ex. Haemophilus spp., Staphylococcus aureus etc.) se pot utiliza teste iodometrice, teste acidimetrice, teste cu cefalosporine

cromogene etc; există şi metode puse la punct pentru testarea sintezei de β-lactamaze cu spectru extins (ESBL).

Există şi sisteme automate (ex. ATB şi rapid ATB) sau sisteme semiautomate (ex. ATB Expression sau miniAPI), pentru testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice, utilizând criteriile de interpretare NCCLS.

7.1.9. Tehnici de biologie moleculară utilizate în testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapiceAu fost imaginate o serie de metode semi-automatizate sau automatizate pentru a optimiza obţinerea unor rezultate corecte şi în timp cât mai scurt, cu privire la sensibilitatea/rezistenţa microorganismelor la antibiotice şi chimioterapice. Metodele care au la bază tehnicile de biologie moleculară pot fi foarte utile (chiar dacă costurile sunt mai ridicate). De ex. se cunoaşte că agentul etiologic al tuberculozei se multiplică lent pe medii de cultură şi în aceste condiţii rezultatele vor fi obţinute în circa 2 săptămâni prin metodele clasice. Se pot utiliza diferite tehnici şi în final hibridizarea moleculară pentru a studia diferite mutaţii care pot să dea informaţii cu privire la sensibilitatea/rezistenţa tulpinilor studiate. Spre ex. INNO-LIPA Rif. TB (LIPA= Line Probe Assay), se realizează cu ajutorul unei truse comerciale puse la punct în USA. Metoda permite concomitent identificarea M. tuberculosis precum şi testarea sensibilităţii la rifampicină, după o amplificare genetică a unui material (ADN) provenit fie din culturi mycobacteriene, fie chiar din produse clinice.Principiul INNO-LIPA este hibridizarea ADN rezultat dintr-o amplificare prin PCR (Polymerase Chain Reaction) cu sonde nucleotidice specifice, imobilizate sub forma unor linii (benzi) paralele, pe fâşii de nitroceluloză. Sondele nucleotidice (S1-S5) sunt biotinilate (cuplate cu biotină). După hibridizare se adaugă streptavidină conjugată cu fosfatază alcalină, acest conjugat ataşându-se de produşii de hibridizare rezultaţi anterior. Incubarea în prezenţa unui reactiv cromogen conduce, în cazul existenţei hibridizării, la apariţia unor benzi colorate, vizibile. În cazul testării rezistenţei la rifampicină, se urmăreşte apariţia unei/unor mutaţii la nivelul genei care codifică pentru subunitatea β a ARN polimerazei (gena rpoB).Identificarea apartenenţei tulpinii testate la specia M. tuberculosis, este certificată cu ajutorul unei oligonucleotide specifice, situată în poziţia a 3-a, după linia care marchează fiecare fâşie-test şi respectiv linia care permite verificarea calităţii conjugatului (conjugate control).Produsul unei tulpini sensibile la rifampicină deţine fragmente amplificate, care hibridizează cu sondele specifice S1, S2, S3, S4 şi respectiv S5. Absenţa uneia sau a mai multor benzi demonstrează că tulpina este rezistentă la rifampicină.

8

Pentru tulpinile rezistente la rifampicină, trusa comercială INNO-LIPA permite suplimentar aprecierea locusului mutaţiei. De exemplu, o tulpină poate prezenta o mutaţie în regiunea R5 (serină-leucină) în timp ce altă tulpină prezintă o mutaţie în regiunea R4a (histidină), aceste mutaţii apărute la nivelul genei rpoB fiind dintre cele mai frecvente şi pot fi identificate prin această metodă.

7.2. Metode de testare a sensibilităţii in vivo şi de apreciere a eficienţei terapeuticeEficienţa terapeutică poate fi apreciată clinic, paraclinic şi prin teste de laborator. Există unele criterii nespecifice de laborator care sunt utile în aprecierea eficienţei terapeutice, precum leucograma, examenul sedimentului urinar, examenul citologic al LCR, VSH, proteina C reactivă etc.Dintre metodele specifice utilizate pentru aprecierea eficacităţii terapeutice sau pentru evaluarea eventualei nocivităţi a medicamentelor folosite, vom enumera:

determinarea NEI (nivel de eficienţă inhibitorie) pentru ser, LCR sau alte umori;

determinarea NEB (nivel de eficienţă bactericidă) pentru ser, LCR sau alte umori; puterea bactericidă a serului celor trataţi (NEB) măsoară capacitatea diluţiilor din serul unui bolnav tratat cu antibiotice de a inactiva un inocul conţinând germenul infectant; se determină diluţia cea mai înaltă de ser care mai manifestă capacitate bactericidă;

utilizarea acestor metode a fost indicată în cazul endocarditelor bacteriene, osteomielitelor, fibrozei chistice sau sepsisului la pacienţi cu variate grade de imunodepresie; produsele se recoltează de obicei la o oră după administrarea unei doze şi cu câteva minute înainte de administrarea următoarei doze de antibiotic;

determinarea nivelului de antibiotic realizat în sânge, LCR sau în alte umori (prin metode microbiologice, enzimatice, HPLC etc).

- Sfârşit curs -

BIBLIOGRAFIEPopa M.I., Popa G.L., Antibiotice şi chimioterapice, în Popa M.I. (coord.), Microbiologie Medicală, vol 1 - curs UMF „Carol Davila”, 2010.

9