Curcumin (diferulomethane) adalah senyawa yang diperoleh dari rimpang dari tanaman Curcuma longa, yang merupakan rempah-rempah kunyit. Kurkumin banyak digunakan sebagai pewarna dan penyedap, dan telah banyak diteliti untuk sifat anti-kanker. Curcumin juga menunjukkan aktivitas anti-inflamasi, karena kemampuannya untuk menghambat faktor transkripsi NF-ĸB dan gen yang mengkode sitokin pro-inflamasi seperti interleukin (IL) -12, interferon-γ, dan faktor-α nekrosis tumor. Beberapa penelitian telah menunjukkan curcumin berguna dalam pengobatan inflamasi.

Limfosit T penting untuk inisiasi dan patogenesis inflamasi, serta penolakan transplantasi organ. Curcumin adalah inhibitor poten aktivasi, proliferasi, dan sintesis sitokin limfosit T murin dan manusia. Efek penghambatan kurkumin pada limfosit T telah dikaitkan dengan penurunan ekspresi sitokin dan molekul kostimulari oleh antigen-presenting sel (APC) seperti makrofag dan sel dendritik yang diberi perlakuan dengan kurkumin.

IL-2 adalah sitokin yang sangat penting peranannya dalam proliferasi limfosit T. Transduksi sinyal IL-2 melalui IL-2R melibatkan JAK1, JAK3, dan STAT5. STAT5 ada dua isoform yaitu STAT5A dan STAT5B, yang keduanya diaktifkan oleh signaling IL-2R dan memiliki beberapa fungsi yang sama di T-limfosit. Dalam rangka untuk menjelaskan efek langsung dari kurkumin pada sinyal IL-2 di sel T, peneliti menggunakan antibodi monoklonal (mAb) anti-CD3 dan antiCD28 sel T expander beads untuk mengaktifkan limfosit T CD4+ murni murin dalam tidak ada atau adanya kurkumin, dan dilakukan penilaian terhadap proliferasi sel, ekspresi CD25, sintesis IL-2, serta transduksi sinyal IL-2R. IL-2 dependent sel CTLL-2 digunakan untuk mengetahui pengaruh kurkumin pada signaling IL-2R. Peneliti juga meneliti efek kurkumin pada sel T CD4+ dan CD8+ regulator sebagai fungsi penekan sel-T.

Metodologi

2.1 Tikus

Digunakan 6 tikus dengan usia 6-8 minggu

2.2 isolasi dan kultur sel T limfosit

Isolasi sel T dari limpa tikus menggunakan MACS mouse regulatory T-cell isolation kit. Kemudian sel T dikultur pada suhu 37oC/5% CO2/ kelembapan 95% pada media RPMI 1640 yang ditambah 5% serum janin anak sapi yang diinaktivasi, 100 U/mL penisilin, 100µg/mL streptomisin, 2mM L-glutamine, dan 100mM HEPES. Sel CTLL-2 diperlakukan dengan 10% FCS yang dilemahkan dan 50 U/mL IL-2 rekombinan.

2.3 proliferasi sel T

Sel T dirangsang dengan 10 ng/ml phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) dan ionomisin

2.5 viabilitas sel T (kemampuan hidup dari sel T)

Viabilitas sel T yang dipapar selama 18 jam dengan kurkumin ditentukan dengan pewarnaan tripan blue. Pewarnaan sel dengan menggunakan larutan trypan blue bertujuan untuk membedakan sel yang hidup dan yang mati. Sel yang mati akan terlihat berwarna biru, karena

mengalami lisis sehingga protein dalam plasmanya akan berikatan dengan trypan blue sehingga sel menjadi berwarna biru. Selain itu, sel yang mati akan terlihat berwarna lebih gelap dan bentuknya tidak bulat lagi atau menyusut karena isi sel (sitoplasmanya) keluar. Hal ini tidak terjadi pada sel yang hidup karena tidak mengalami kerusakan pada membran selnya, sehingga sel yang hidup masih terlihat berbentuk bulat, lebih terang dan jernih (Djajanegara, 2009).

2.6 IL-2 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

Metode Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) merupakan suatu teknik immunoassay yang digunakan untuk mendeteksi atau mengetahui kuantitas atau kadar dari suatu zat berdasarkan reaksi imunologis. Supernatan kultur sel diambil setelah 24 jam dan IL-2 dihitung dengan metode ELISA

2.6. Western blotting

2.7 Analisis statistic

Dianalisis dengan metode statistika ANOVA satu jalur (perbandingan rata-rata populasi)

HASIL DAN DISKUSI

3.1 penghambatan IL-2 atau IL-2R pada sel T limfosit dengan kurkumin

Untuk mengetahui efek kurkumin pada aktivasi proliferasi sel T limfosit CD4+ tanpa pengganggu dari fungsi APC, peneliti menstimulasi sel T limfosit CD4+ dengan T-cell expander beads yang dilapisi dengan antibody monoklonal anti-CD3 dan anti CD-28 (pengaktivasi sel T) dan sintesis DNA yang menggunakan [3 H] thymidine untuk menghitung proliferasi sel. Pada gambar 1 dosis kurkumin dan gambar 2 variabel waktu secara langsung dapat menghambat efek sintesis DNA oleh sel T limfosit CD4+, sehingga proliferasi sel berkurang pada konsentrasi 20µM kurkumin. Pewarnaan trypan blue menunjukkan kurkumin dengan konsentrasi tertinggi pada penelitian ini, tidak menyebabkan efek samping viabilitas sel T (perlakuan dengan pembawa, viabilitasnya 89 ± 8% ; dengan 20µM kurkumin, viabilitasnya 90 ± 9%). Selanjutnya, sintesis IL-2 (Gambar 1C) dan ekspresi CD25 (Gambar 1D) keduanya menurun dengan sel T yang diberi kurkumin. Data kami menunjukkan bahwa kurkumin menekan proliferasi sel T CD4+ pada respon TCR dan stimulasi CD28 dengan menghambat sintesis IL-2 dan ekspresi IL-2R yang mempunyai afinitas tinggi.

3.2. Curcumin menghambat transduksi sinyal limfosit T CD4+

Reseptor sel T menghasilkan peristiwa fosforilasi yang mengakibatkan peningkatan Ca2 + intraseluler dan aktivasi PKC. Stimulasi limfosit T dengan Ca2 + ionofor seperti ionomycin dan PKC aktivator seperti PMA sering digunakan untuk meniru reseptor sinyal sel T sinyal. Gambar 2A menunjukkan bahwa curcumin secara signifikan menghambat sintesis DNA oleh limfosit T CD4+ yang dirangsang dengan PMA dan ionomycin, menunjukkan kurkumin bekerja pada tirosin kinase protein yang memulai peristiwa paling awal di reseptor sinyal sel T. Sebuah studi sebelumnya menunjukkan bahwa kurkumin menghambat aktivasi NF-ĸB dan

translokasi nuclear subsequent di sel limpa yang dirangsang dengan mitogen sel T Concanavalin A. Ketika aktivasi NF-ĸB diperlukan, maka terjadi fosforilasi IĸBa dan degradasi oleh IĸB kinase (IKKβ), kami menggunakan western blotting untuk menguji pengaruh dari kurkumin pada fosforilasi IĸBa di limfosit T CD4+ yang dirangsang dengan T cell expander beads. Gambar 2B menunjukkan bahwa paparan 10 µM curcumin secara drastis meurunkan fosforilasi IĸBa setelah rangsangan 15 menit pada T-limfosit. Oleh karena itu kurkumin menghambat aktivasi NF-ĸB di limfosit T CD4+ dengan mengganggu fosforilasi IĸBa fosforilasi.

3.3 kurkumin menghambat signaling penggabungan IL-2R JAK3-JAK5 pada limfosit T

Untuk menentukan apakah curcumin juga mempengaruhi jalur sinyal IL-2R dalam limfosit T, peneliti mengkultur IL-2-dependent CTLL-2 Tcells dengan tidak adanya atau kehadiran kurkumin dan diukur sintesis DNA yang diinduksi IL-2 oleh [3H] TdR. Gambar 3 menunjukkan bahwa kurkumin menghambat sintesis DNA oleh sel CTLL-2 pada dosis tertentu (gambar 3A) dan variable waktu tertentu (gambar 3B). Namun, kurkumin tidak substansial mempengaruhi CTLL-2 ekspresi CD25 (Gambar. 3C), menunjukkan bahwa sel CTLL-2 yang dipajan kurkumin dapat mempertahankan kapasitas untuk mengikat IL-2 melalui IL-2R yang afinitasnya tinggi. Peneliti berhipotesis bahwa kurkumin mungkin mengganggu tranduksi sinyal IL-2R, yang terdiri dari aktivasi JAK1 dan JAK3 tirosin kinase, diikuti oleh fosforilasi, dimerisasi, dan translokasi STAT5A / B ke nucleus.

Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3D, pajanan dengan kurkumin pada sel CTLL-2 dapat menghambat fosforilasi IL-2 diinduksi dari STAT5A dan JAK3, tapi bukan JAK1. Aktivasi JAK1 tidak penting untuk transduksi sinyal IL-2R. Selain itu, dalam penelitian ini menunjukkan bahwa kurkumin menghambat aktivitas tyrosine kinase daripada mendorong dan / atau mengaktifkan satu atau lebih protein tirosin fosfatase.

GAMBAR

Gambar 1 Kurkumin menekan proliferasi limfosit T CD4+ dan menghambat ekspresi IL-2 dan CD25. Limfosit T CD4+ dirangsang dengan anti-CD3 dan anti CD28 sel T expander beads dan dikultur (A) selama 72 jam dalam pelarut atau pembawa DMSO saja atau penambahan kurkumin dengan konsentrasi tertentu atau (B) selama waktu tertentu dalam pembawa saja atau penambahan 10 µm kurkumin. (C) supernatant kultur sel dikumpulkan setelah sel limfosit T CD4+ yang distimulasi oleh Tcell expander beads selama 24 jam dan IL-2 sintesis ditentukan jumlahnya dengan ELISA. Data ditampilkan sebagai rata-rata pg / ml ± SD. (D) limfosit T dikultur selama 24 jam dalam ketiadaan atau adanya T cell expander beads tanpa atau dengan kurkumin. Sel lisat (hasil lisis) disiapkan dan ekspresi CD25 ditentukan oleh Western blotting.

Gambar 2. Curcumin menghambat fosforilasi IĸBa. (A) CD4 + T-limfosit dirangsang dengan PMA dan ionomycin (10 ng / ml) dan dikultur selama 48 jam dalam pembawa DMSO saja atau dengan penambahan kurkumin. Data ditampilkan sebagai rata-rata cpm ± SD. (B) limfosit T CD4+ dirangsang dengan mAb anti-CD3 dan anti-CD28 T cell expander beads selama 15 atau 60 menit dalam pembawa DMSO saja atau penambahan 10 µm kurkumin. Sel lisat disiapkan dan fosforilasi IĸBa ditentukan oleh Western blotting.

Gambar 3 kurkumin memblok sinyal IL-2R pada sel CTLL-2 melalui penghambatan fosforilasi STAT5A dan JAK3. Sel CTLL-2 dirangsang dengan IL-2 rekombinan tikus (50

U / ml) dan dikultur (A) selama 96 jam dalam media saja, pembawa DMSO saja atau penambahan kurkumin pada kosentrasi tertentu atau (B) selama waktu tertentu dalam pembawa DMSO saja atau 10 µm kurkumin. (C) sel CTLL-2 yang diperlakukan tersebut ditunjukkan selama 24 jam dengan IL-2 rekombinan (50 U / ml) sebelum lisis. Jumlah protein dikumpulkan dan jumlah yang sama dari protein dielektroforesis dan ditransfer ke membran nitroselulosa. Membran diperiksa dengan mAb anti-CD25. (D) sel CTLL-2 h, kendaraan (DMSO) saja, atau konsentrasi yang ditunjukkan kurkumin selama 30 menit. Sel-sel kemudian dirangsang dengan mouse rekombinan IL-2 (50 U / ml) selama 15 menit, setelah itu lisat sel disiapkan. Fosforilasi STAT5A, JAK1, dan JAK3 ditentukan oleh blotting barat. Blot itu kemudian ditelanjangi dan kembali diperiksa-total STAT5A dan ekspresi aktin mengkonfirmasi sama protein pemuatan. Semua data adalah wakil dari setidaknya tiga percobaan independen.