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Cultivos in vitro Produccioacuten y mejoramiento de plantas

CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES O CULTIVOS IN VITRO

El cultivo de tejidos vegetales o cultivo in vitro de tejidos vegetales es una teacutecnica de reproduccioacuten en condiciones totalmente aseacutepticas en la que a partir de un pequentildeo segmento inicial de tejido es posible regenerar en poco tiempo miles o millones de plantas geneacuteticamente iguales a la planta madre cuando a este tejido le es aplicado un estiacutemulo por medio de variables fiacutesicas y quiacutemicas controladas en un medio de cultivo

A diferencia de las teacutecnicas tradicionales de cultivo esta poderosa herramienta permite la propagacioacuten de grandes voluacutemenes de plantas en menor tiempo asiacute como el manejo de las mismas en espacios reducidos Por otro lado la teacutecnica es de gran utilidad en la obtencioacuten de plantas libres de patoacutegenos plantas homocigotas en la produccioacuten de plantas en peligro de extincioacuten en estudios de ingenieriacutea geneacutetica etc

Presupone el cultivo de plantas o partes de plantas (explantos) en un medio de cultivo apropiado

El cultivo se desarrolla en condiciones de temperatura humedad fotoperiodo e irradiacioacuten controlados

La manipulacioacuten se realiza en cabinas de flujo laminar

Esta teacutecnica es importante en la propagacioacuten de especies de intereacutes agroforestal micropropagacioacuten

Producen innumerables productos de importancia en la industria farmaceacuteutica cosmeacutetica y alimentaria como alcaloides compuestos aromaacuteticos o pigmentos

Los cultivos in vitro permiten obviar los inconvenientes derivados de condiciones geograacuteficas climaacuteticas y de tiempo de produccioacuten

El cultivo de tejidos comprende la micropropagacioacuten el aislamiento y cultivo de embriones la regeneracioacuten a partir de callo y de suspensiones celulares y el cultivo de protoplastos anteras y microsporas Estas teacutecnicas se estaacuten utilizando en particular para la multiplicacioacuten de plantas en gran escala La micropropagacioacuten ha resultado especialmente uacutetil en la produccioacuten de material de plantacioacuten de gran calidad y libre de enfermedades de un amplia variedad de cultivos

MICROPROPAGACIOacuteN

Es el proceso de multiplicar plantas in vitro

A traveacutes de la micropropagacioacuten a partir de un fragmento (explanto) de una planta madre se obtiene una descendencia uniforme en condiciones de asepsia

Este proceso incluye varias fases

0) Preparacioacuten de la planta madre

1) Establecimiento del cultivo en condiciones de asepsia

2) Multiplicacioacuten de brotes

3) Enraizamiento

4) Aclimatacioacuten

El cultivo in vitro de plantas superiores es una teacutecnica que exige un control absoluto del ambiente tanto fiacutesico como quiacutemico en el que se situacutea al explanto Los principales factores no bioloacutegicos que afectaraacuten al desarrollo del cultivo in vitro como

AMBIENTE QUIacuteMICO

Composicioacuten del medio

Ph

AMBIENTE FIacuteSICO

Temperatura

Luz y fotoperiacuteodo

bull El fundamento teoacuterico del cultivo in vitro es el concepto de la Totipotencialidad celular

bull Totipotencialidad

Es la capacidad de una ceacutelula vegetal de dar lugar al desarrollo de una planta completa Las ceacutelulas totipotentes son ceacutelulas somaacuteticas que han retenido su capacidad de dividirse y diferenciarse en una planta madura si se coloca en el medio adecuado

Schleiden y Schwan (1887) describen en su teoriacutea celular que la ceacutelula es capaz de subsistir por si sola si las condiciones externas le son favorables

A Morgan (1901) se le atribuye el teacutermino de la Totipotencialidad celular propiamente dicho que dice que una ceacutelula es capaz de desarrollarse hasta formar un organismo completo si las condiciones ambientales le son favorables y si se le aplican los estiacutemulos adecuados

Haberlandt (1902) con la idea de la Totipotencialidad celular desarrolla el primer cultivo in vitro de tejidos vegetales Desafortunadamente sus trabajos resultaron sin eacutexito debido a que utilizoacute un medio de cultivo relativamente simple y por otra parte tejidos vegetales demasiado diferenciados

White (1932) logra el primer cultivo in vitro estable utilizando en sus experimentos aacutepices de raiacuteces de jitomate Los tejidos meristemaacuteticos del aacutepice radical propiciaron crecimiento en longitud de los mismos en el medio de cultivo La falla en los intentos realizados por varios investigadores entre 1902 y 1932 se debioacute como lo menciona White a la mala eleccioacuten del material vegetativo y a la simplicidad de los medios de cultivo utilizados El logro de White le da un buen impulso al desarrollo de las teacutecnicas de cultivo in vitro sin embargo en sus trabajos realizados hasta entonces no obtiene proliferacioacuten celular en forma los aacutepices de raiacutez solo crecen en longitud como lo hariacutean normalmente como parte de la raiacutez de la planta intacta

No es sino hasta 1934 cuando Gautheret logra proliferacioacuten celular in vitro en tejidos cambiales provenientes de plantas adultas En 1939 el mismo Gautheret Nobecourt (en tejidos de zanahoria) y White (en tejidos de tabaco) publican casi simultaacuteneamente la formacioacuten de una masa de ceacutelulas parenquimatosas (callo) a partir de los explantes (tejidos) utilizados en sus experimentos Este hecho significativo constituye en siacute el despegue de las teacutecnicas de cultivo in vitro

Un factor importante en el desarrollo de las teacutecnicas de cultivo de tejidos vegetales fue el descubrimiento de los reguladores de crecimiento Overbeek (1941) observa el efecto de una sustancia presente en el agua de coco que estimulaba la divisioacuten celular (efecto citociniacutenico) Cuando el agua de coco se combinaba con 24-D tenia un efecto positivo en el desarrollo de tejidos de zanahoria y papa (Caplin y Steward 1948 1952)

Skoog y colaboradores observaron que el esperma de arenque desnaturalizado por calor teniacutea un efecto muy marcado en la formacioacuten de brotes a partir de tejidos de tabaco De este aacutecido desoxirribonucleico (ADN) desnaturalizado Miller y colaboradores (1955) aislaron un compuesto de naturaleza puriacutenica enominado 6- furfuril-aminopurina o cinetina

En 1926 dos cientiacuteficos japoneses descubrieron un compuesto hormonal actualmente de uso ordinario en el cultivo in vitro de tejidos vegetales denominado giberelina el cual es producido por un hongo Gibberella fujikoroi este compuesto fue descubierto cuando ellos estudiaban la causa de la pudricioacuten en plaacutentulas de arroz El efecto que produciacutea dicha sustancia era un alargamiento excesivo en los tallos sin desarrollo proporcional de la raiacutez Actualmente se le atribuyen otros efectos como la induccioacuten de germinacioacuten en semillas brotacioacuten en algunos tubeacuterculos como la papa etc

Cultivo de ceacutelulas vegetales

Definicioacuten

Cultivo aseacuteptico in vitro de cualquier parte de una planta en un medio nutritivo

Tipos de cultivos

cultivo de ceacutelulas

cultivo de tejidos

cultivos de oacuterganos

Cultivos vegetales

Cultivos agronoacutemicos

Cultivos in vitro

1 Cultivos diferenciados ( raiacuteces tallos embriones raiacuteces y tallos transformados)

2 Cultivos indiferenciados ( callos suspensiones)

Cultivos indiferenciados

Callos en medio soacutelido crecimiento lento gran heterogeneidad celular

Cultivos en suspensioacuten derivan de los anteriores en medio liacutequido de composicioacuten adecuada crecimiento maacutes raacutepido y homogeacuteneo

Composicioacuten del medio de cultivo Fuente de carbono minerales vitaminas fitohormonas (auxinas citoquininas)

Callos

Tejidos no diferenciados ( a veces diferenciados) en divisioacuten activa

Frecuentemente se desarrollan a partir de heridas

Medio de cultivo

Es la combinacioacuten soacutelida o liacutequida de nutrientes y agua Incluye sales inorgaacutenicas carbohidratos vitaminas y aa Se le denomina Medio Basal y puede ser suplementado con alguacuten regulador de crecimiento y ocasionalmente con otras sustancias

Tipos

Medio soacutelido es todo aquel que contiene un agente gelificante

Medio liacutequido no se adiciona ninguacuten gelificante

Mezcla de sustancias en los que las ceacutelulas tejidos y oacuterganos pueden desarrollarse

Sustancias inorgaacutenicas N P K Ca Mg Cl Na Cu Zn Mn Fe Bo Mo Co I

Suplementos orgaacutenicos complejos leche de coco extracto de levadura

Reguladores de crecimiento hormonas

Fuente de carbono sacarosa

Con o sin agar medio semi -soacutelido o liacutequido

Reguladores de crecimiento

Hormonas Fitohormonas

Auxinas grupo de hormonas vegetales (naturales o sinteacuteticas) que inducen la elongacioacuten o en algunos casos la divisioacuten celular

Frecuentemente inducen raiacuteces adventicias e inhiben la formacioacuten de tallos adventicios

Cytokininas grupo de hormonas vegetales (naturales o sinteacuteticas) que inducen divisioacuten celular y frecuentemente tallos adventicios y en muchos casos inhiben la formacioacuten de raiacuteces adventicias

Reglas generales para la accioacuten hormonal

bull Auxina Cytokinina = ~1 Callo

bull Auxina Cytokinina lt 1 Tallo

bull Auxina Cytokinina gt 1 Raiacuteces

Terminologiacutea y teacutecnicas

1 Explanto porcioacuten de tejido u oacutergano que se separa de la planta para iniciar el cultivo

2 Esterilizacioacuten procedimiento para la eliminacioacuten de microorganismos

Autoclave aparato en el que el medio material d vidrio instrumental etc es esterilizado por vapor bajo presioacuten (121oC 15 psi 10-20 min)

Requerimientos de asepsia desinfeccioacuten de superficie del explanto generalmente usando lavandina comercial diluido para evitar el desarrollo de microorganismos

Cabina de flujo laminar aacuterea de trabajo mantenida esteacuteril por el flujo continuo no turbulento de aire esteacuteril

Subcultivo pasaje de ceacutelulas tejidos oacuterganos etc Desde un medio de cultivo agotado a otro medio fresco

Micropropagacioacuten propagacioacuten vegetativa in vitro de plantas

bull Diferenciacioacuten desarrollo de ceacutelulas o tejidos con una funcioacuten especiacutefica yo regeneracioacuten de oacuterganos estructuras tipo oacuterganos (raiacuteces tallos) o embriones

bull Adventicios desarrollo de oacuterganos (raiacuteces yemas tallos flores etc) o embriones (embryo-like structures) desde puntos de origen no usuales incluyendo callos

Organogeacutenesis (formacioacuten de oacuterganos)

Formacioacuten de tallos raiacuteces flores etciexcliexclRegeneracioacuten de una planta completaExplanto

OrganogeacutenesisFormacioacuten de tallos Formacioacuten de raiacuteces

Enraizamiento TallosPlanta completa

Aplicaciones praacutecticas del cultivo in vitro

Propagacioacuten vegetativa Esto es lo maacutes praacutectico Dos teacutecnicas

- Micropropagacioacuten de estaquillas- Organogeacutenesis de callos

Produccioacuten de plantas libres de virus mediante dos teacutecnicas

- Cultivo de meristemos- Microinjerto in vitro

Permite hacer germinar semillas que son muy difiacutecil de hacer en condiciones normales Ejemplo algunas Orquiacutedeas tienen en los campos unos paraacutesitos obligados y en viveros no se pueden reproducir se inoculan esos paraacutesitos o in vitro

Eliminar la inhibicioacuten de germinacioacuten de las semillas El cultivo in vitro es lo maacutes eficaz porque tiene determinados inhibidores y algunos huesos de frutales no son capaces de germinar ya que no tiene desarrollado el embrioacuten

Prevencioacuten del aborto embrionario como resultado de incompatibilidad Se da en cruces de intereacutes cientiacutefico o intergeneacuteticos sobre todo en plantas herbaacuteceas Los cruces incompatibles dan abortos

Aplicacioacuten en mejora geneacutetica para obtener hiacutebridos para introducir material geneacutetico etc

Acortar los ciclos de mejora geneacutetica No hay que esperar que pase el periodo juvenil del aacuterbol para ver resultados

Produccioacuten de haploides Cruzamientos o cultivo de polen (anteras) Ventajas

- Obtencioacuten raacutepida de homocigotos- Produccioacuten de hiacutebridos (frutos puros)

Equipo necesario para el cultivo in vitro

- Autoclave- Caacutemara de flujo laminar- Medio de cultivo- Planta- Caacutemara de cultivo

Autoclave

Es donde se esteriliza todo lo que vamos a utilizar agua algunos nutrientes material etc No se pueden meter proteiacutenas Es como una olla a presioacuten pero de mayor tamantildeo donde se controla la presioacuten y la temperatura (hasta 120ordm)

Caacutemara de flujo laminar

Es donde se realizan todas las manipulaciones con la planta Es un habitaacuteculo con un operario en un ambiente esteacuteril Se usan rayos ultravioletas para esterilizar el aire

Medio de cultivo

Agua y nutrientes (hormonas) en un tubo de ensayo que se tapa con un tapoacuten Dependiendo del material que se va a propagar el tubo se pone vertical o un poco inclinado

Planta

El material vegetal de partida puede ser del campo pero esto conlleva un alto riesgo de enfermedades y contaminacioacuten aunque se lave mucho y bien Lo maacutes corriente es utilizar brotes que crecen en condiciones controlada para que halla menos infecciones

Caacutemara de cultivo

La caacutemara de cultivo es una habitacioacuten de dimensiones muy variables en la que se controlan las condiciones de luz temperatura humedad variacioacuten diacutea-noche etc

Condiciones del cultivo in vitro

En la caacutemara de flujo laminar no puede entrar material contaminado El problema maacutes importante en todo el proceso del cultivo in vitro son las contaminaciones

En el autoclave no se pueden meter determinadas sustancias como vitaminas antibioacuteticos aacutecido gibereacutelico sacarosa encimas extractos vegetales etc ni tampoco recipientes que no soporten altas temperaturas

El vidrio ha de ser de muy buena calidad para que no suministre al medio sustancias contaminantes para la planta Normalmente se prepara el medio y se filtra directamente El problema es que se absorben en el filtro determinadas sustancias

Los reguladores de crecimiento (hormonas) son imprescindibles ya que sin ellos no se puede hacer el medio de cultivo

El pH ideal es 6 pero puede oscilar entre 55 y 65

Se necesita agar y medio soacutelido 06-09

El medio de cultivo realmente soacutelo tiene que llevar agua fuente de energiacutea (azuacutecares) y reguladores de crecimiento

El medio de cultivo es secreto y se pueden tardar dos antildeos en prepararlo

En la caacutemara de cultivo se aplican cantidades variables de luz (16-20 horas) Tambieacuten existen plantas que se desarrollan en la oscuridad Las temperaturas tambieacuten variacutean Lo normal son 22-26ordmC aunque en ocasiones se exigen friacuteos de 4ordmC y tambieacuten 28-30ordmC para plantas tropicales

Igualmente en el eacutexito de esta teacutecnica de propagacioacuten tambieacuten influyen determinadas caracteriacutesticas de la planta como el tipo geneacutetica e incluso el tipo de implante parte maacutes juvenil o maacutes adulta

En cuanto a los recipientes deben permitir el intercambio de gases pero evitar la peacuterdida de agua lo que provocariacutea un aumento de la concentracioacuten de sales y por tanto la muerte de la planta De ahiacute la importancia del cierre

Subcultivos o replicado

Cuando sembramos microestaquillas en cultivo in vitro no nos interesa que se emitan raiacuteces ni hojas sino que se produzca una proliferacioacuten (crecimiento) para obtener nuevas microestaquillas Son lo que se denominan subcultivos

No se pueden hacer infinitamente ya que se agota el material vegetal tan soacutelo se hace 8-10 veces

Ocurre entonces lo siguiente

- El medio nutritivo se agota y se seca- El material vegetal ocupa todo el tubo- Se produce un cambio de olor en el medio (sustancias toacutexicas)- El medio se hace liacutequido

Fases del cultivo de meristemos

1 Toma un aacutepice meristemaacutetico (02-1 mm)

2 Siembra en el medio del tubo

3 Fase de proliferacioacuten crecimiento de brotes Subcultivos

4 Fase de enraizamiento (cambiar el medio)

5 Primera fase de aclimatacioacuten Es muy importante el que la planta pueda llegar o no al campo Invernaderos bolsas de plaacutestico bandejas de vidrio etc

6 Segunda fase de aclimatacioacuten Siempre en invernadero

7 Plantacioacuten en el campo

Fases del cultivo de embrionesSe utiliza mucho en manzano

1 Se desinfecta el fruto en alcohol Se flamea

2 Se coge el embrioacuten de la semilla

3 Se inocula en el tubo

4 A las 1-2 semanas la planta estaacute maacutes o menos reconocible

5 Se deja crecer y se pasa por las fases de aclimatacioacuten

MicropropagacioacutenSe parte de una yema de braacutectea o axilar Se empieza a desarrollar en el medio de cultivoEntre la fase de proliferacioacuten y de enraizamiento hay muchos subcultivos (para obtener maacutes plantas)El nuacutemero de subcultivos depende del material vegetal

Ejemplo de micropropagacioacuten de Kiwi

Se parte de un trozo de tallo

- Al cabo de 4 semanas se obtiene una yema y crece un brote

- En la fase de proliferacioacuten intentamos obtener gran cantidad de brotes

- Sacamos microestaquillas del primer brote haciendo subcultivos cada 6-8 semanas hasta llenar el vidrio

- Al aumentar la concentracioacuten de auxinas se obtienen plantas enraizadas

- Puede hacerse de forma industrial y la fase de enraizamiento se hace en vivo

Sacamos microestaquillas del primer brote haciendo subcultivos cada 6-8 semanas hasta llenar el vidrio



Cultivo de callo in vitro

Se parte de un trozo de hoja o de tallo bien de una planta madre de maceta o de una planta que viene de cultivo in vitro

El medio puede ser soacutelido o liacutequido

Se forma entonces una estructura de callo de la que parten brotes o tambieacuten proembriones que al unirse forman una estructura similar al embrioacuten

A partir de entonces se desarrolla normalmente

Obtencioacuten de plantas haploides

Normalmente se trabaja con la antera en su totalidad no con granos de polen en particular

De una yema de flor se coge una antera antes de que se abra y se hace un cultivo bien por embriogeacutenesis u organogeacutenesis

Embriogeacutenesis se forman ceacutelulas (poliembriones)

Organogeacutenesis se forma una estructura de callo que puede venir o bien de tejidos de la antera (diploide) o bien del grano de polen (haploide)

No se riega nunca por aspersioacuten (riesgo de patoacutegenos) siempre con regadera

Problemas en el cultivo in vitro

Contaminacioacuten es grave

Vitrificacioacuten es una reaccioacuten de las plantas que las hace adquirir apariencia de vidrio La uacutenica solucioacuten es hacer un subcultivo de material sano es decir se saca y se cortan los trocitos que esteacuten bien

Marcadores geneacuteticos en la mejora vegetal

Tradicionalmente los meacutetodos para identificar genotipos de plantas asiacute como para estimar

las relaciones filogeneacuteticas existentes entre ellas se han basado en el estudio de caracteriacutesticas morfoloacutegicas Sin embargo estas caracteriacutesticas pueden ser alteradas por enfermedades variar en funcioacuten de la etapa del crecimiento o el ambiente agroclimaacutetico En

numerosas ocasiones existen genotipos mal indexados especialmente cuando se trata de cultivares que presentan fenotipos muy similares

Por otra parte la identidad geneacutetica de un cultivar puede modificarse debido a mutaciones

somaacuteticas mantenidas durante su reproduccioacuten vegetativa

Gracias a los avances en la biologiacutea molecular se han desarrollado meacutetodos de identificacioacuten y caracterizacioacuten basados en el uso de marcadores moleculares que superan en la gran mayoriacutea de los casos las limitaciones de los meacutetodos tradicionales

Estos marcadores moleculares son fenotiacutepicamente neutros presentan mayor segregacioacuten o polimorfismo que los morfoloacutegicos pueden ser evaluados desde los primeros estados

de desarrollo de las plaacutentulas son aplicables a cualquier tipo de material vegetal son independientes de la eacutepoca del antildeo en que se realiza el anaacutelisis permiten la identificacioacuten

correcta de la variedad sin necesidad de muchos caracteres y estaacuten libre de los efectos epistaacuteticos

Los marcadores polimoacuterficos del aacutecido desoxirribonucleico (ADN) o marcadores moleculares son herramientas valiosas para los estudios geneacuteticos de las plantas

Marcadores moleculares Los marcadores moleculares son una herramienta en los estudios de diversidad geneacutetica filogenia seleccioacuten asistida por marcadores - SAM entre otros y pueden ser clasificados en tres grupos

bull Marcadores basados en la hibridacioacuten del ADN dentro de los cuales los maacutes utilizados en plantas son los Restriction Fragment Length Polymorphisms - RFLP En el proceso se utiliza una sonda que hiacutebrida solamente con fragmentos de ADN inmovilizados en una membrana Los RFLP son altamente reproducibles codominantes y multialeacutelicos pero tiene la desventaja de no ser automatizables son muy dispendiosos y exigen unas condiciones especiacuteficas de infraestructura Los Variable Number of Tandem Repeats ndash VNTR son secuencias altamente repetidas en el genoma y son detectables de manera similar a los RFLP pero difieren de eacutestos en el tipo de sonda utilizada

bull Marcadores basados en la amplificacioacuten del ADN Estos marcadores utilizan el principio de la Polymerase Chain Reaction ndash PCR teacutecnica basada en la amplificacioacuten de secuencias de ADN utilizando iniciadores y una polimerasa para la elongacioacuten de la cadena Se conocen varios tipos

bull Random Amplified Polymorphic DNA - RAPD que utilizan iniciadores al azar y no exigen un conocimiento del genoma

bull DNA amplification fingerprinting ndash DAF y Arbitrary Primer PCR ndash APPCR son teacutecnicas similares a los RADP pero su visualizacioacuten se realiza en geles de poliacrilamida Estas teacutecnicas son relativamente raacutepidas sencillas automatizables y no exigen marcadores radioactivos La disminucioacuten en los costos de secuenciacioacuten y PCR junto a la creciente informacioacuten sobre los genomas han permitido el desarrollo de otros marcadores basados en PCR con diferentes caracteriacutesticas entre ellos los maacutes utilizados en plantas son los Simple Sequencese Repeats

bull - SSR o microsateacutelites y los Amplified Fragment Lenght Polymorphisms ndash AFLP estos uacuteltimos considerados como marcadores mixtos porque contempla algunos de los principios de los RFLP y de los RAPD

bull Existen distintas estrategias para convertir estos marcadores en marcadores PCR aleloespeciacuteficos conocidos como Sequence-Tagged - STS Los Sequence Characterzed Amplified Region -SCAR Clivage Amplified Polymorphyms Sequenced - CAPS Single Nucleotide Polymorphyms - SNP y Single Strand Conformational Polymorphyns - SSCP son otro tipo de marcadores que han sido actualmente desarrollados como variantes de los descritos anteriormente y tienen la ventaja de que aumentan la precisioacuten y el nivel de informacioacuten

bull Aplicaciones

bull Entre las numerosas aplicaciones de estos marcadores moleculares figuran la identificacioacuten varietal y la comprobacioacuten de su pureza (Gorg et al (1992)) Marcadores moleculares se han empleado en el geacutenero Solanum para el anaacutelisis de la biodiversidad y para estudios filogeneacuteticos

bull Muchos han aplicado los marcadores moleculares en diversas especies frutales del troacutepico y han obtenido relevantes resultados Asiacute por ejemplo para determinar la aplicacioacuten del anaacutelisis de conglomerados con el objetivo de complementar el estudio de patrones electroforeacuteticos en la especie Psidium spp se utilizoacute la teacutecnica de isoenzimas el anaacutelisis de conglomerado complementoacute el estudio de zimograma y permitioacute diferenciar entre especies de P guajava y P friedrichsthalianum

bull En el valioso frutal del marantildeoacuten otros aplicaron los marcadores Amplificacioacuten Aleatoria del ADN Polimoacuterfico (RAPD) Inter Secuencias Simples Repetidas (ISSR) y Polimorfismo en la Amplitud de los Fragmentos Amplificados (AFLP) para comparar las diferentes accesiones

bull del banco de germoplasma y estudiaron la eficiencia y utilidad de las tres teacutecnicas en la deteccioacuten de variaciones entre plantas Las teacutecnicas pudieron discernir entre los distintos materiales Pero los AFLP exhibieron el mayor poder de discriminacioacuten de aquiacute que se recomienda para realizar los anaacutelisis geneacuteticos

El marcador RAPD tambieacuten ha sido empleado en la especie Pasiflora spp para evaluar la variabilidad geneacutetica y estimar las tasas de similitud entre las diferentes especies detectaacutendose dentro de P edulis una alta variabilidad geneacutetica

Ademaacutes para la identificacioacuten de genotipos de mango (Mangifera indica L) se ha empleado el marcador Microsateacutelite o Secuencias Simples Repetidas (SSR) porque resulta de gran utilidad en estudios de identificacioacuten variabilidad y manejo de germoplasma y domesticacioacuten

En otros estudios con el uso de la teacutecnica RAPD se determinoacute la variabilidad geneacutetica entre materiales de guanaacutebana (Annona muricata L) y se identificaron 14 fragmentos RAPD polimoacuterficos Con su empleo se determinoacute una alta variabilidad geneacutetica y ademaacutes se identificaron dos grupos de materiales los de origen venezolano y los de Brasil

ldquoLa aplicacioacuten de marcadores moleculares para la caracterizacioacuten e identificacioacuten de las variedades de frutales contribuye a la multiplicacioacuten y el mejoramiento geneacuteticordquo

Otra posibilidad de gran intereacutes es la construccioacuten de mapas geneacuteticos basados en marcadores moleculares (Gebhardt et al ( 1989raquo En estos mapas de pueden integrar marcadores para genes cualitativos De esta forma se han obtenido marcadores para resistencias monogeacutenicas a PVY PVX (Rx1 Rx2 Ritter et al (1991)) nematodos (Grol (Barone et al 1990) Hl (Gebhardt et al 1993) Gpal Gpa2) y Phytophthora infestans (R1 RJ R6 R7) (Leonards-Schippers 1992) Por otra parte se pueden integrar tambieacuten marcadores para caracteres cuantitativos (anaacutelisis QTL) Estudios realizados en patata incluyen anaacutelisis QTL para resistencia a P infestans (Leonards-Schippers (1994)) y Globodera pallida (Kreike et al (1993)) para la produccioacuten y sus paraacutemetros y para el contenido en azucares y almidoacuten (Schafer-Pregl et al (1998)) Estos marcadores permiten la seleccioacuten asistida por marcadores (MAS) en la mejora geneacutetica Se pueden observar QTLs esparcidos por todo el genoma Algunos coinciden en diferentes antildeos mientras que otros reflejan la interaccioacuten genotipo medioambiente Tambieacuten se pueden observar en ciertos casos que componentes influyen en la produccioacuten

La integracioacuten de genes (cDNA) conocidos incluyendo genes candidatos para caracteres de intereacutes (por ejemplo proteiacutenas PR y secuencias RGL) y genes homoacutelogos de otras especies nos lleva al concepto del mapa funcionar (Gebhardt et al (1989)) La alineacioacuten de diferentes mapas mediante RFLP (Gebhardt et al (1991)) AFLP comigrantes y SSR ha incrementado el nuacutemero de diferentes marcadores disponibles ademaacutes de permitir estudios comparativos entre genomas dentro del geacutenero Solanum y entre diferentes especies como patata y tomate (Fig 2)

Fig 2 Aplicaciones y conceptos de mapas geneacuteticos

GENES MARCADORES DE RESISTENCIA A ANTIBIOacuteTICOS

1048713 Canamicina Neomicina

1048713 Estreptomicina

1048713 Ampicilina

1048713 Amicacina

I Marcadores utilizados para el estudio de la variabilidad geneacutetica en los bancos de germoplasma

La evaluacioacuten de los recursos geneacuteticos es importante para identificar rasgos potencialmente valiosos de las muestras asiacute como las variedades locales que podriacutean utilizar directamente los agricultores (Cote et al1993)

La diversidad se puede analizar a nivel intraespeciacutefico o interespeciacutefico y se puede estudiar en otros niveles de organizacioacuten desde los ecosistemas hasta los niveles celular subcelular y molecular Son numerosos los meacutetodos existentes para determinar el grado de variacioacuten geneacutetica entre distintas plantas o poblaciones (Jarret 1990)

Los meacutetodos basados en la morfologiacutea permiten analizar las diferencias de rasgos observables (fenotipos) entre las distintas plantas Estos meacutetodos son relativamente econoacutemicos y constituyen la base de la caracterizacioacuten de las muestras de plantas en los bancos de germoplasma (Siquiera et al 1988 Makumbi y Rubaihayo 1995 De O et al 1997)

Los meacutetodos citogeneacuteticos y moleculares o geneacutetico-bioquiacutemicos permiten analizar las diferencias entre los cromosomas las proteiacutenas o el ADN de las plantas (Avise 1994) El anaacutelisis citogeneacutetico caracteriza y diferencia a los genotipos mediante el estudio del cariotipo y la meiosis (Lacadena 1995) mientras que el anaacutelisis isoenzimaacutetico proporciona un estimado de la diversidad geneacutetica basaacutendose en la presencia de genes comunes (Brown y Clegg 1983) por lo cual ambos estudios ofrecen nuevas posibilidades para el manejo de una coleccioacuten

I1 Evaluacioacuten morfoagronoacutemica

La clasificacioacuten mediante descriptores cualitativos y cuantitativos y el establecimiento de las relaciones entre y dentro de un grupo taxonoacutemico de Musa se convertiraacuten en herramientas importantes para el mejoramiento de bananos y plaacutetanos la identificacioacuten de duplicados y determinacioacuten de los principales caracteres para diferenciar el material geneacutetico (Osuji et al 1997 Ortiz et al1998)

La evaluacioacuten sistemaacutetica del material experimental permite realizar la seleccioacuten de clones prometedores que pueden ser empleados como nuevos cultivares en la zona agroecoloacutegica escogida (Ortiz et al 1998)

Los datos de caracterizacioacuten son descriptores morfoloacutegicos que se pueden observar faacutecilmente a simple vista y se expresan en todos los ambientes Tales datos describen los atributos de la especie objeto de muestreo como la altura de las plantas la morfologiacutea de las hojas el color de las flores entre otros Los caracteres morfoloacutegicos resultan de gran intereacutes dentro de este contexto Algunos ejemplos de la importancia de tales caracteres han sido expuestos por Jain et al (1975) Evidencias convincentes de su aplicacioacuten lo constituyen la posibilidad de distinguir el nivel de ploidiacutea mediante mediciones del grano de polen en diversos cultivares (Garciacutea et al 1996) la utilizacioacuten del grano de polen como

indicadores de tolerancia al estreacutes de temperatura y humedad asiacute como evaluar caracteres relacionados con la entrada de patoacutegenos y caracterizacioacuten de variedades (Morales et al 1996)

La deteccioacuten de diferencias en los patrones radiculares y la arquitectura entre los genotipos pueden ofrecer un criterio de seleccioacuten para la tolerancia a enfermedades plagas y estreacutes de temperatura (Leskovar y Staffella 1995) Es maacutes faacutecil llegar a medir la variacioacuten geneacutetica de caracteres como produccioacuten y rango de adaptacioacuten de variedades pero resulta imposible reconocer y enumerar en una poblacioacuten los genotipos y los loci que afectan esos caracteres baacutesicos dado que tal variacioacuten se manifiesta generalmente como diferencias sutiles las que se confunden tras el rango experimental de deteccioacuten por variacioacuten inducida por el ambiente

Muchas caracteriacutesticas agronoacutemicas que necesitan los mejoradores tienen una complejidad geneacutetica excesiva para poder distinguir en la caracterizacioacuten preliminar de las muestras de germoplasma Estos datos se suelen poner de manifiesto en la fase de evaluacioacuten del germoplasma para conocer los rasgos agronoacutemicos uacutetiles muchos de los cuales pueden estar sometidos a las interacciones entre el genotipo y el medio ambiente (G x M) siendo en consecuencia especiacuteficos de un lugar (Hayword et al 1994 Iglesias 1994)

Los marcadores claacutesicos son de uso simple ellos pueden permitir consideraciones ambiguas e interferencias entre el marcador y el fenotipo que seraacute evaluado porque se distinguen solo a nivel de plantas en un oacutergano y estadiacuteo de desarrollo (Florido 1999) de ahiacute que en la mayoriacutea de los casos como parte de la variabilidad de un cultivo se busquen estudios maacutes directos del genoma a traveacutes del anaacutelisis citogeneacutetico e isoenzimaacutetico (Tanskley y Orton 1983)

En Cuba las ventajas de los estudios morfoagronoacutemicos se han utilizado para la caracterizacioacuten y diferenciacioacuten de clones de cultivos como tomate (Lycopersicon esculentum Mill) (Florido 1999) plaacutetano (Musa spp)(Romaacuten 1996 Acosta 1999 Alonso 2000 Cazantildeas 2001) y yuca (Manihot esculenta Crantz) ( Fernaacutendez 1999) entre otros

I2 Estudios citogeneacuteticos

La citogeneacutetica es la ciencia que estudia el cromosoma bajo cualquier nivel o dimensioacuten (Lacadena 1996) Su objetivo fundamental es analizar y explicar coacutemo la estructura y el comportamiento de los cromosomas garantizan la triple funcioacuten de conservar la informacioacuten geneacutetica entre las ceacutelulas de un organismo pluricelular transmitirla de padres a hijos y liberarla de forma ordenada para controlar las funciones celulares y el desarrollo del organismo estudiando asimismo los controles y variaciones sus consecuencias geneacuteticas e implicaciones evolutivas asiacute como las aplicaciones en la mejora geneacutetica de las plantas y animales o en la medicina

En las plantas se emplean diversas metodologiacuteas para el estudio de los cromosomas que van desde los meacutetodos claacutesicos hasta el empleo de teacutecnicas moleculares La estimacioacuten de ploidiacutea se realiza generalmente mediante el conteo de cromosomas en cortes microscoacutepicos preparados a partir de las puntas de las raiacuteces en crecimiento activo (Osuji et al 1996) Este meacutetodo junto con el aplastado son los que generalmente se utilizan para contar los cromosomas en Musa (Sandoval et al 1997)

I3 Caracterizacioacuten isoenzimaacutetica

La definicioacuten de ldquoisozimasrdquo fue propuesto por Marker y Moller en 1959 para designar a cada una de las muacuteltiples formas enzimaacuteticas que catalizan la misma reaccioacuten con similar o ideacutentica especialidad de sustrato y que estaacuten presentes dentro del mismo organismo Posteriormente fue introducido el teacutermino de ldquoisoenzimasrdquo el cual algunos investigadores plantean que debe ser restringido a formas moleculares muacuteltiples de enzimas que se derivan de un mismo tejido u oacutergano que tienen oriacutegenes geneacuteticos similares y que poseen actividades cataliacuteticas muy semejantes no exactamente superpuestas Actualmente se utilizan indistintamente ambos teacuterminos (Markert y Moller1959 Brewer y Singh 1971)

Dado que las enzimas constituyen una expresioacuten de la diferenciacioacuten de las ceacutelulas el anaacutelisis de las propiedades y patrones cambiantes durante el desarrollo puede llegar al entendimiento de los mecanismos metaacutebolicos y geneacuteticos baacutesicos sobre el cual descansa la diferenciacioacuten celular (Iglesias 1994)

Las enzimas generalmente estaacuten constituidas por una o varias cadenas polipeptiacutedicas y su expresioacuten estaacute determinada casi siempre por genes mendelianos simples con alelos codominantes que en condiciones de laboratorio bien controladas presentan alta heredabilidad (Wendel y Weeden 1989)

Los genetistas vegetales han empleado las isoenzimas con diferentes objetivos anaacutelisis de la diversidad geneacutetica estudios sistemaacuteticos y evolutivos caracterizacioacuten de colecciones nuacutecleo identificacioacuten de genotipos y prediccioacuten de heterosis asiacute como el marcaje e introgresioacuten de genes de intereacutes agronoacutemico (Gonzaacutelez 1989 Romaacuten 1996 Florido 1999)

El potencial de las isoenzimas para diferenciar y desarrollar nuevas funciones depende en gran medida de la manera por la cual ellas fueron generadas (Weenden 1983) y la multiplicidad isoenzimaacutetica puede ser el resultado de diferencias en las secuencias de aminoaacutecidos o producto de modificaciones posttraduccionales

Las isoenzimas pueden ser codificadas por diferentes alelos del mismo locus (aloenzimas o aleloenzimas) (Prakash et al 1969) o por diferentes loci (isoenzimas no aleacutelicas ) asiacute como pueden haber ocurrido cambios conformacionales o de dobleces en la estructura terciaria o cuaternaria por mecanismos epigeneacuteticos (isoenzimas conformacionales) (Scandalios1974)

El hecho de que el locus o los loci que codifican para las isoenzimas pueden ser multialeacutelicos suministra grandes fuentes de variacioacuten provocando una multiplicidad de formas isoenzimaacuteticas (Iglesias 1986)

Las proteiacutenas e isoenzimas existen en una variedad de formas moleculares muacuteltiples y ellas pueden ser separadas por su movimiento relativo a traveacutes de un medio polarizado Se colocan extractos de tejidos en un medio y aplicando un campo eleacutectrico las moleacuteculas de proteiacutenas migraraacuten a una velocidad determinada basaacutendose en su carga neta su peso molecular y el pH del medio Las proteiacutenas y las enzimas separadas de esta forma en bandas pueden ser visualizadas mediante teacutecnicas histoquiacutemicas apropiadas (Iglesias 1986)

Meacutetodos de deteccioacuten de organismos geneacuteticamente modificados

1-) Bioensayos para la evaluacioacuten directa del fenotipo del Organismo Vivo

Modificado

Meacutetodo maacutes sencillo y praacutectico consiste en la evaluacioacuten del propio fenotipo modificado de la planta evidenciando la diferencia fisioloacutegica entre los individuos geneacuteticamente modificados y los no

Por ejemplo si las plantas son resistentes a un herbicida particular es muy sencillo hacer ensayos tanto en el laboratorio como en el campo Las semillas o granos se colocan a germinar en presencia y ausencia del herbicida y luego se cuenta directamente el nuacutemero de plaacutentulas resistentes versus las no resistentes ( comparaacutendolas contra el total crecidas sin herbicida)

En el campo se pueden revisar los lotes sembrados haciendo aplicaciones del herbicida en pequentildeas parcelas que representen de manera significativa el lote sembrado se cuenta el nuacutemero de plantas sobrevivientes y se establece el porcentaje en relacioacuten al total de plantas en las parcelas y de alliacute se extrapola el porcentaje de plantas geneacuteticamente modificadas sembradas en todo el lote

Este meacutetodo puede ser utilizado para determinar la presencia de soya maiacutez algodoacuten y ajonjoliacute tolerantes a herbicidas como el glifosato Esta metodologiacutea resulta precisa barata y muy praacutectica requiere de al menos una semana para poder observar los resultados

A futuro pudieran realizarse otros bioensayos para determinar resistencia e insectos u otras caracteriacutesticas en la actualidad son muy costosos complicados de realizar y de muy larga duracioacuten

2-) Meacutetodos basados en proteiacutenas

La deteccioacuten especiacutefica de las proteiacutenas producto de la introduccioacuten de nuevos genes en individuos transgeacutenicos constituye una alternativa vaacutelida cuando se utilizan anticuerpos desarrollados especiacuteficamente contra esas proteiacutenas

La modificacioacuten geneacutetica no siempre estaacute dirigida a la produccioacuten de una nueva proteiacutena o muchas veces su expresioacuten es tan baja que no permite detectarla Su expresioacuten pudiera estar limitada a algunos tejidos de la planta o durante ciertas fases de su desarrollo

Los meacutetodos de deteccioacuten basados en inmunoensayos cimentado en el reconocimiento antiacutegeno-anticuerpo hacen uso de anticuerpos muy especiacuteficos acoplados a sistemas enzimaacuteticos que amplifican la sentildeal positiva para incrementar la sensibilidad de la prueba

Este tipo de anaacutelisis tiene utilidad praacutectica cuando se aplica sobre tejidos en los cuales se expresa la proteiacutena geneacuteticamente modificada Es un meacutetodo sencillo de realizar que no necesita alta capacitacioacuten del personal ni materiales ni equipos sofisticados

Entre los inconvenientes que presenta no permite la identificacioacuten entre cultivos distintos que presentan la misma proteiacutena geneacuteticamente modficada ( ya sea en cuanto a especie o con relacioacuten a la construccioacuten introducida)

21-) Inmunoblotting oacute Western blot

Es muy especiacutefico Permite detectar de manera cualitativa y semicuantitativa la presencia de una proteiacutena en particular luego de separar electroforeacuteticamente las proteiacutenas de la muestra ( Lipton et al2000)


Es una teacutecnica inmunoenzimaacutetica que se utiliza en la deteccioacuten de proteiacutenas Se basa en la separacioacuten de las proteiacutenas de una muestra en funcioacuten del tamantildeo mediante una electroforesis en condiciones desnaturalizantes y una deteccioacuten posterior con anticuerpos especiacuteficos contra la proteiacutena que se desea detectar Permite determinar el contenido relativo de proteiacutenas presente en diferentes muestras

Fases

bull Separacioacuten mediante electroforesis en geles de poliacrilamida y SDS de las proteiacutenas El SDS de las proteiacutenas El SDS es un agente desnaturalizante de proteiacutenas que provoca la ruptura de los enlaces que mantienen la estructura de las mismas de modo que adquieren todas la misma forma

Ademaacutes les proporciona carga neta negativa de modo que la separacioacuten se realiza en funcioacuten del tamantildeo

bull Transferencia de las proteiacutenas a una membrana de nitrocelulosa

bull Incubacioacuten de la membrana con proteiacutenas inespeciacuteficas para bloquear los sitios de unioacuten de anticuerpos a la membrana

bull Adicioacuten de un anticuerpo primario contra las proteiacutenas que se quieren detectar

bull Adicioacuten de un anticuerpo secundario conjugado con una enzima que reconoce al anticuerpo primario

Revelado

22-) Southern blot

Es una teacutecnica de hibridacioacuten que se utiliza para la deteccioacuten de secuencias de ADN concretas dentro de una mezcla compleja Consiste en la separacioacuten de fragmentos de ADN en funcioacuten del tamantildeo mediante una electroforesis en geles de agarosa su transferencia a membranas de nitrocelulosa o nylon y posterior incubacioacuten con sondas de ADN complementarias a las regiones que se desea detectar Estas sondas en caso de que existan fragmentos complementarios hibridaraacuten con ellos pudieacutendose detectar marcaje

Etapas

bull Fragmentacioacuten del ADN problema mediante endonucleasas de restriccioacuten

bull Electroforesis en condiciones desnaturalizantes con urea o formaldehiacutedo para obtener ADN de cadena sencilla

Etapas

bull Transferencia a una membrana de nylon o nitrocelulosa Una vez las bandas se han transferido a las membranas es necesario fijarlas de manera irreversible mediante tratamiento a 80-85ordmC en el caso de las membranas de nitrocelulosa o con luz ultravioleta en el caso de las membranas de nylon

bull Prehibridacioacuten de la membrana con ADN heteroacutelogo para bloquear los sitios de unioacuten que han quedado libres y evitar uniones inespeciacuteficas de las sondas

bull Hibridacioacuten con la sonda y revelado del filtro para detectar con queacute bandas ha hibridado la sonda

23-) Reaccioacuten en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Es un meacutetodo de anaacutelisis raacutepido y sencillo que permite la deteccioacuten y amplificacioacuten de fragmentos especiacuteficos de ADN La polimerasa es una enzima cuya actividad es la siacutentesis de una cadena de ADN complementaria a una de cadena sencilla


Para ello necesita de pequentildeas secuencias de ADN denominadas cebadores que deben ser complementarias de los extremos de la secuencia que se desea ampliar La PCR consta de tres pasos que se repiten un nuacutemero determinado de ciclos

1-) Separacioacuten del ADN para que se encuentre en forma de cadena sencilla

2-) Unioacuten de los cebadores al ADN de cadena sencilla

3-) Siacutentesis de la cadena complementaria de ADN a partir de los cebadores

La repeticioacuten de estos ciclos hace que la cantidad del fragmento de ADN que se estaacute amplificando aumente de manera exponencial de modo aunque se parta de una cantidad muy pequentildea al final de un nuacutemero determinado de ciclos se obtendraacute una cantidad muy importante


El disentildeo de los cebadores es muy importante y su especificidad dependeraacute del tipo de amplificacioacuten que se desee hacer pudiendo utilizarse cebadores especiacuteficos semiespeciacuteficos o arbitrarios

231-) Anaacutelisis de polimorfismos de los fragmentos de restriccioacuten (RFLP)

Es un meacutetodo raacutepido de identificacioacuten basado en la aplicacioacuten de enzimas de restriccioacuten que son enzimas que cortan la moleacutecula de ADN en determinados puntos denominados dianas Dependiendo de la secuencia de nucleoacutetidos de una moleacutecula de ADN apareceraacuten distintas dianas y al tratarla con enzima de restriccioacuten se originaraacuten fragmentos de restriccioacuten de distintas longitud Estos fragmentos pueden analizarse mediante teacutecnicas de hibridacioacuten marcadas con sondas en membranas permitiendo la deteccioacuten de mezclas de especies

232-) Anaacutelisis de polimorfismos de los fragmentos de restriccioacuten de sateacutelites (SFLP)

Es una variacioacuten de RFLP en la que se analizan los polimorfismos de los fragmentos de restriccioacuten de sateacutelites El ADN sateacutelite se encuentra en los centroacutemeros de los cromosomas y se caracteriza por contener un nuacutemero repetido de secuencias de longitud variable Se utilizan para la identificacioacuten de especies hiacutebridas o con una gran homologiacutea

233-) Anaacutelisis de conformacioacuten de polimorfismos de cadena sencilla (PCR-SSCP)

Esta teacutecnica permite detectar diferencias puntuales en la secuencia de bases de una hebra de ADN La teacutecnica consiste en la amplificacioacuten mediante PCR de secuencia concreta de una mezcla de ADN Los productos de esta amplificacioacuten se desnaturalizan y se permite que vuelvan a renaturalizar raacutepidamente favoreciendo la formacioacuten de apareamientos intracatenarios que son dependientes de la secuencia de bases de la hebra de ADN y provocaraacuten que eacutesta adquiera una conformacioacuten especiacutefica

Mediante una electroforesis en condiciones no desnaturalizantes un gel de poliacrilamida se realiza la separacioacuten de estas moleacuteculas en funcioacuten de la forma ya que todas tienen el mismo tamantildeo De este modo se obtiene un patroacuten electroforeacutetico que puede compararse con patrones conocidos

234-) Anaacutelisis de perfiles de ADN por amplificacioacuten aleatoria (RAPD)

Se utilizan cebadores de tamantildeo pequentildeo y secuencia arbitraria con una especificidad de unioacuten menor lo que permite una amplificacioacuten de secuencias al azar El resultado de la amplificacioacuten mediante estos cebadores es un conjunto de fragmentos de distinta longitud en funcioacuten de en queacute lugares se encuentren las secuencias complementarias de los cebadores empleados Estos fragmentos pueden ser empleados para construir mapas geneacuteticos de gran variedad de especies

Es una teacutecnica muy empleada cuando se dispone de alta variedad de muestras con el fin de diferenciar especies sin informacioacuten previa de su secuencia

La ventaja que presenta es que los cebadores son universales y no es necesario disponer de grandes cantidades de ADN no es necesario utilizar sondas ni hibridaciones y son meacutetodos relativamente sencillos y raacutepidos Coacutemo inconvenientes presentan problemas de reproductibilidad

235-) Amplificacioacuten multiplexada

Permite la amplificacioacuten de mas de una secuencia de una muestra de ADN La deteccioacuten e identificacioacuten de varias secuencias disminuye los tiempos de manipulacioacuten

24-) Anaacutelisis cuantitativo de ADN mediante PCR

Permite cuantificar la cantidad total de una o varias secuencias de ADN presentes en una muestra Es importante la utilizacioacuten de este tipo de meacutetodos pro ejemplo para el etiquetado de los alimentos

241-) PCR anidada

Se trata de una modificacioacuten de la PCR en la que en lugar de dos cebadores se utilizan cuatro dos externos y dos internos La amplificacioacuten se realiza en dos tandas En la primera se utilizan los cebadores externos y se amplifica una secuencia de ADN a partir de la cual se realiza una segunda ronda de amplificacioacuten con los cebadores interiores

Este meacutetodo confiere una mayor especificidad y una mayor sensibilidad por lo que es uacutetil en los casos en los que se presupone que existe un bajo porcentaje de OMGs Ademaacutes no requiere el aislamiento previo del ADN

242-) PCR competitiva

Se utiliza un ADN competidor que tiene la misma secuencia complementaria al cebador de modo que se amplifica el ADN diana de la muestra y el ADN competidor A partir de las cantidades obtenidas de ambos productos amplificados se estima estadiacutesticamente la proporcioacuten real de ADN diana y de ADN competidor

243-) PCR en tiempo real

Este sistema se basa en la medicioacuten de la fluorescencia emitida por una sonda especiacutefica del ADN diana marcado con fluorocromo no reactivo que se antildeade a la reaccioacuten de PCR convencional y cuya emisioacuten de fluorescencia depende directamente de la siacutentesis del nuevo ADN La fluorescencia emitida es recogida a traveacutes de una fibra oacuteptica y leiacuteda por un laacuteser

Mediante el registro del contenido de la emisioacuten de fluorescencia en cada ciclo se puede monitorear de manera continua el incremento de los productos amplificados durante la reaccioacuten de PCR

244-) Dilucioacuten liacutemite de PCR

Consiste en la dilucioacuten de la muestra de ADN a concentraciones conocidas hasta llegar al punto liacutemite de la dilucioacuten que se corresponde con el umbral de amplificacioacuten del ADN permitiendo establecer una correlacioacuten con la cantidad de ADN presente en la muestra

25-) Secuenciacioacuten

Se utiliza habitualmente como teacutecnica de comprobacioacuten o confirmacioacuten positiva de la presencia de un ADN determinado tras su deteccioacuten por PCR Por tanto el material a detectar suele ser ADN amplificado producto de PCR Se usa regularmente en estudios de autenticacioacuten geneacutetica de alimentos ya sea para autenticacioacuten de especies deteccioacuten de componentes de origen vegetal o animal no deseados

Los diferentes tipos de secuenciacioacuten aplicados se basan en la teacutecnica desarrollada por Sanger en 1974 basado en la utilizacioacuten de anaacutelogos de base (dideoxy) marcados que provocan la finalizacioacuten de la cadena La principal diferencia entre el meacutetodo enzimaacutetico de terminacioacuten de cadena y el meacutetodo automaacutetico de secuenciacioacuten radica en primer lugar en el tipo de marcaje

En el meacutetodo automaacutetico en vez de radioactividad se utiliza inflorescencia y lo habitual es realizar cuatro mezclas de reaccioacuten cada una con nucleoacutetido trifosfato (dTTP) marcado con

fluorocromo distinto Este sistema permite automatizar el proceso de manera que es posible leer al mismo tiempo los ADNs de nueva siacutentesis producto de las cuatro mezclas de reaccioacuten

La segunda diferencia radica en el sistema de deteccioacuten de los fragmentos de ADN La deteccioacuten del tipo de fluorescencia correspondiente a cada reaccioacuten se lleva a cabo al mismo tiempo que la electroforesis de manera que los fragmentos de ADN de menor tamantildeo que ya han sido detectados se dejan escapar del gel Este sistema permite aumentar el nuacutemero de nucleoacutetidos que se pueden determinar en cada electroforesis y por consiguiente en cada secuenciacioacuten

La secuenciacioacuten de cadena simple consiste en la secuenciacioacuten de un fragmento de ADN mediante una sola reaccioacuten La secuenciacioacuten de cadena simple proporciona una excelente calidad de lectura que en la mayoriacutea de los casos alcanza una fiabilidad superior al 98 El tamantildeo medio de las lecturas que se obtiene oscila entre las 650-700 pares de bases y se realiza generalmente a partir de cebadores especiacuteficos utilizados durante la PCR

La secuenciacioacuten analiacutetica consiste en la secuenciacioacuten completa de una de las cadenas del ADN de la muestra Se recomienda esta modalidad de secuenciacioacuten cuando se desea obtener la secuencia completa de un producto de PCR o de un ADN clonado cuando el tamantildeo del amplificado o del inserto sea superior a 1 kilobase

Existen diversas teacutecnicas emergentes de secuenciacioacuten de ADN con diversas aplicaciones secuenciacioacuten por hibridacioacuten (SBH) visualizacioacuten directa por microscopiacutea de fuerza atoacutemica (AFM) secuenciacioacuten de moleacutecula sencilla y secuenciacioacuten de nucleoacutetido simple mediante suspensioacuten en vaciacuteo Dentro de ellas destacamos el FINS (Forensically Informative Nucleotide Sequencing) Es una teacutecnica de secuenciacioacuten de ADN de muestras bioloacutegicas mediante la amplificacioacuten con marcadores fluorescentes de diferente color que permiten identificar la secuencia de nucleoacutetidos

Se trata de un meacutetodo indirecto por el que las secuencias obtenidas se comparan con secuencias pertenecientes a otras especies lo que permite el anaacutelisis filogeneacutetico de las mismas Se utiliza para la identificacioacuten de especies pesqueras de intereacutes comercial normalmente como meacutetodo de confirmacioacuten tras la utilizacioacuten de otras teacutecnicas cualitativas de PCR

26-) Biosensores

Son dispositivos de anaacutelisis compactos que incorporan un elemento de reconocimiento bioloacutegico o biomimeacutetico asociado a un sistema de transduccioacuten que permite amplificar almacenar y registrar la sentildeal producida por la interaccioacuten entre el elemento de reconocimiento y el analito

Como consecuencia de la interaccioacuten especiacutefica entre el elemento de reconocimiento y el analito se produce una variacioacuten en las propiedades fisico-quiacutemicas que pueden ser variaciones de pH transferencia de electrones generacioacuten de calor cambios de masa cambios en las propiedades oacutepticas etc Estas variaciones dependen del tipo de elemento de reconocimiento que incorpora el biosensor

27-) Otras teacutecnicas

Teacutecnicas no biotecnoloacutegicas que sirven de complemento a las teacutecnicas biotecnoloacutegicas

Por ejemplo la identificacioacuten de proteiacutenas mediante huella peptiacutedica a traveacutes de la espectrometriacutea de masas MALDI-TOF o mediante espectrometriacutea de masas en taacutendem MSMS y sus aplicaciones a la secuenciacioacuten de peacuteptidos han permitido la identificacioacuten y caracterizacioacuten de determinadas proteiacutenas de caraacutecter toacutexico yo alergeacutenico

La espectroscopia infrarroja cercana (NIR) y la no dispersiva (NDIR) permiten el anaacutelisis de biomoleacuteculas de forma no destructiva y en un tiempo muy corto generalmente inferior al minuto Se utiliza para la identificacioacuten de moleacuteculas orgaacutenicas y organometaacutelicas asiacute como para la deteccioacuten de pesticidas y biotoxinas La alta selectividad del meacutetodo hace posible la estimacioacuten de un analito en una matriz compleja

Este meacutetodo implica el anaacutelisis de los movimientos de torsioacuten rotatorios y de vibracioacuten de los aacutetomos en una moleacutecula de forma que mediante comparacioacuten con patrones establecidos permite la deteccioacuten de determinados compuestos Se ha utilizado recientemente con eacutexito en la deteccioacuten de transgeacutenicos en los que los contenidos de determinadas biomoleacuteculas se ven alterados por efecto del ADN exoacutegeno

Por uacuteltimo las SNIF-NMR (Site-Specific Natural Isotopic Fractionation) se basa igualmente en el anaacutelisis de la estructura molecular a escala atoacutemica mediante resonancia magneacutetica nuclear Cada biomoleacutecula o sustancia en general presenta un patroacuten atoacutemico especiacutefico identificable a partir de su comparacioacuten con los patrones almacenados en bases de datos

22-) ELISA ( Enzime Linked Inmunoassay)

El Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a una Enzima ( siglas en ingleacutes corresponden a ELISA) es muy popular por la sencillez con la cual se puede evaluar un gran nuacutemero de muestras de manera simultaacutenea

Si bien los esquemas experimentales para el ELISA son muacuteltiples y variados dos son los formatos ampliamente utilizados las placas de ELISA y las tiras reactivas o inmunostrips

Es un meacutetodo de deteccioacuten basado en la especificidad de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Permite la deteccioacuten de distintas sustancias antigeacutenicas mediante la unioacuten de anticuerpos especiacuteficos que directa o indirectamente producen una reaccioacuten cuyo producto es visible y puede ser medido Esta reaccioacuten se produce debido a que el anticuerpo lleva unida (conjugada) una enzima que suele ser peroxidasa de raacutebano o fosfatasa alcalina que en presencia del sustrato adecuado genera un producto coloreado

Los anticuerpos son proteiacutenas sintetizadas por el sistema inmunoloacutegico como respuesta a la presencia de una sustancia extrantildea o antiacutegeno que se unen de manera selectiva a esta sustancia

Pueden ser monoclonales que son aquellos que reconocen una regioacuten concreta de un antiacutegeno o policlonales que son aquellas que reconocen distintas regiones del antiacutegeno

De manera general el meacutetodo que se utiliza es la inmovilizacioacuten del antiacutegeno sobre un sustrato generalmente plaacutestico Lo maacutes frecuente es utilizar placas multipocillo que contienen distinto nuacutemero de pocillos y pueden leerse de manera automaacutetica con lectores de placas aunque pueden utilizarse otros soportes como tubos tiras de nitrocelulosa o paletas

Etapas

bull Inmovilizacioacuten del antiacutegeno Se deposita la muestra en un pocillo y se incuba de modo que los antiacutegenos tapicen la superficie del mismo

bull Tapizado con una proteiacutena no especiacutefica para bloquear los huecos que queden sin tapizar por el antiacutegeno con el fin de evitar la unioacuten inespeciacutefica de los anticuerpos

Etapas

bull Adicioacuten de los anticuerpos Estos anticuerpos se uniraacuten a aquellos antiacutegenos especiacuteficos que se encuentren unidos en la superficie del pocillo

bull Tras varios lavados para eliminar aquellos anticuerpos que no se hayan unido se procede a antildeadir el sustrato especiacutefico de la enzima conjugada al anticuerpo Por la accioacuten de esta enzima sobre el sustrato se produce la aparicioacuten de un producto coloreado cuya concentracioacuten puede medirse y se dispone de una recta patroacuten para relacionarse con una concentracioacuten determinada

MICROPROPAGACIOacuteN

Es el proceso de multiplicar plantas in vitro

A traveacutes de la micropropagacioacuten a partir de un fragmento (explanto) de una planta madre se obtiene una descendencia uniforme en condiciones de asepsia

Este proceso incluye varias fases

0) Preparacioacuten de la planta madre

1) Establecimiento del cultivo en condiciones de asepsia

2) Multiplicacioacuten de brotes

3) Enraizamiento

4) Aclimatacioacuten

El cultivo in vitro de plantas superiores es una teacutecnica que exige un control absoluto del ambiente tanto fiacutesico como quiacutemico en el que se situacutea al explanto Los principales factores no bioloacutegicos que afectaraacuten al desarrollo del cultivo in vitro como

AMBIENTE QUIacuteMICO

Composicioacuten del medio

Ph

AMBIENTE FIacuteSICO

Temperatura

Luz y fotoperiacuteodo













Definicioacuten


Tipos de cultivos


cultivo de tejidos


Cultivos vegetales


Cultivos in vitro







Callos



Medio de cultivo


Tipos














































Autoclave




Medio de cultivo


Planta














































































bull Aplicaciones















1048713 Ampicilina

1048713 Amicacina





























Modificado
















Fases







Revelado

22-) Southern blot


Etapas



Etapas





























241-) PCR anidada




















26-) Biosensores
















Etapas



Etapas















Definicioacuten


Tipos de cultivos


cultivo de tejidos


Cultivos vegetales


Cultivos in vitro







Callos



Medio de cultivo


Tipos














































Autoclave




Medio de cultivo


Planta














































































bull Aplicaciones















1048713 Ampicilina

1048713 Amicacina





























Modificado
















Fases







Revelado

22-) Southern blot


Etapas



Etapas





























241-) PCR anidada




















26-) Biosensores
















Etapas



Etapas







Callos



Medio de cultivo


Tipos














































Autoclave




Medio de cultivo


Planta














































































bull Aplicaciones















1048713 Ampicilina

1048713 Amicacina





























Modificado
















Fases







Revelado

22-) Southern blot


Etapas



Etapas





























241-) PCR anidada




















26-) Biosensores
















Etapas



Etapas



Medio de cultivo


Tipos














































Autoclave




Medio de cultivo


Planta














































































bull Aplicaciones















1048713 Ampicilina

1048713 Amicacina





























Modificado
















Fases







Revelado

22-) Southern blot


Etapas



Etapas





























241-) PCR anidada




















26-) Biosensores
















Etapas



Etapas



































Autoclave




Medio de cultivo


Planta














































































bull Aplicaciones















1048713 Ampicilina

1048713 Amicacina





























Modificado
















Fases







Revelado

22-) Southern blot


Etapas



Etapas





























241-) PCR anidada




















26-) Biosensores
















Etapas



Etapas





Medio de cultivo


Planta














































































bull Aplicaciones















1048713 Ampicilina

1048713 Amicacina





























Modificado
















Fases







Revelado

22-) Southern blot


Etapas



Etapas





























241-) PCR anidada




















26-) Biosensores
















Etapas



Etapas















































































bull Aplicaciones















1048713 Ampicilina

1048713 Amicacina





























Modificado
















Fases







Revelado

22-) Southern blot


Etapas



Etapas





























241-) PCR anidada




















26-) Biosensores
















Etapas



Etapas













1048713 Ampicilina

1048713 Amicacina





























Modificado
















Fases







Revelado

22-) Southern blot


Etapas



Etapas





























241-) PCR anidada




















26-) Biosensores
















Etapas



Etapas



























Modificado
















Fases







Revelado

22-) Southern blot


Etapas



Etapas





























241-) PCR anidada




















26-) Biosensores
















Etapas



Etapas







Fases







Revelado

22-) Southern blot


Etapas



Etapas





























241-) PCR anidada




















26-) Biosensores
















Etapas



Etapas



Etapas





























241-) PCR anidada




















26-) Biosensores
















Etapas



Etapas
















241-) PCR anidada




















26-) Biosensores
















Etapas



Etapas






















26-) Biosensores
















Etapas



Etapas
















Etapas



Etapas



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