Técnico em BiotecnologiaMódulo IV

Cultivo de Células Animais

Aula 2 – Esterilização de materiais para a

Cultura de Células

Prof. Melissa Kayser

Biossegurança aplicada a laboratóriosde cultivo celular

• Como em qualquer atividade laboratorial, antes doinício do cultivo celular, deve-se planejar o trabalho aser realizado de modo a executá-lo com segurança.

• Deve ser preparado um procedimento com asespecificações das atividades realizadas e todo pessoaldeve ser orientado sobre os possíveis riscos e para anecessidade de seguir as especificações de cada rotinade trabalho, os procedimentos de biossegurança epráticas de segurança.

• Há, pelo menos, 24 casos documentados de infecçãoem funcionários de laboratório que manipulamculturas de células primárias (por exemplo, células demacaco Rhesus) nos últimos 30 anos.

• Embora um número limitado de infecções adquiridasem laboratórios tenha sido relatado como resultado damanipulação de células humanas e de outros primatas,há um risco significativamente maior em adquirir umainfecção pelo HIV ou pelo HBV por meio da exposiçãoao sangue humano e a outros líquidos corporais.

Biossegurança aplicada a laboratóriosde cultivo celular

• Os riscos potenciais associados às células e tecidoshumanos incluem os patógenos do sangue HBV e HIV, bemcomo agentes presentes nos tecidos humanos, comoMycobacterium tuberculosis, que pode estar presente nostecidos pulmonares.

• Outros riscos potenciais aos trabalhadores sãorepresentados pelo uso de células transformadas poragentes virais, como o SV-40, assim como as células quecarregam material genético viral. As células humanastumorogênicas também podem oferecer riscos potenciaiscomo resultado de uma autoinoculação.

Biossegurança aplicada a laboratóriosde cultivo celular

Além do risco biológico, um laboratório decultivo celular possui os riscos:

• Químicos – líquidos combustíveis, corantestóxicos (azul de Tripan, MTT, bisbenzimida),gases tóxicos;

• Físicos – calor, radiação, vibração e frio.

Biossegurança aplicada a laboratóriosde cultivo celular

Agentes físicos comumente utilizados:

Aquecimento por autoclavação;

Radiação Ultravioleta;

Radiação Ionizante

Filtração

Aplicação de Calor para Esterilização

Calor – muito utilizado para esterilização de

materiais (condições úmida ou secas);

Calor úmido:

Desnaturação e coagulação das proteínas vitais;

Calor seco:

Oxidação dos constituintes orgânicos das cells.

Calor úmido (mais eficiente)

desnaturação de proteínas exige temperaturas

e tempos de exposição menores;

Propagação calor em ambiente úmido –

mais rápido.

Ex: endósporos de Bacillus anthracis

Destruídos: 2 – 15 min à 100ºC (c. úmido)

180 min à 140ºC ( c. seco)

Calor seco

– materiais impermeáveis ou danificáveis

pela umidade (óleos, metais, etc).

AUTOCLAVE

121ºC – 15 min;

Calor úmido (mais eficiente)

RADIAÇÃO/ IRRADIAÇÃO

Aplicação de energia radiante;

Processo empregado na esterilização demateriais para cultivo de células;

Chamada esterilização a frio.

Radiação Ionizante

- Incluem raios gama e raios X

-Radiações causam ionização das moléculas

em átomos ou grupos de átomos;

-Raios podem penetrar através de materiais

empacotados e esterilizam seu interior;

- método muito empregado em cultura de célula

Radiação Gama

- Forma mais barata de radiação;

- Apresenta alto poder de penetração;

- Inicialmente, foi utilizada para esterilização demateriais sensíveis ao calor;

-Atualmente é aplicada sobre algumas reaçõesanimais e alguns alimentos (deterioração);

-Grande quantidade de material pode serdescontaminado por esse processo.

Radiação UV

- Forma efetiva de esterilizar ou reduzir floramicrobiana em quase todas as substâncias;

-atinge DNA bacteriano;

-Útil para desinfecção de superfícies(pequeno poder de penetração)

Ex: salas com lâmpadas germicidascâmaras de fluxo laminar

- Cuidados: agressivo ao olho e pele

ESPECTRO UV

O espectro UV está dividido em 3 partes:

UVC (< 280nm), UVB (280–315nm), UVA (315–400nm).

• UVA – Luz Negra – 315:400 nm– Bronzeado;

– Formação da catarata;

• UVB – Região do eritema – 280:315nm– Região potencialmente carcinogênica;

– Protetores solares;

• UVC – Bactericida e Germicida - < 280 nm– Protegidos pela camada de ozônio;

– Lâmpadas de vidro bloqueiam completamente esses raios.

Eritema: Coloração avermelhada da pele ocasionada por vasodilatação capilar.

Filtração

- Esterilização de líquidos com componentes

termossensíveis;

- Não há morte de microrganismos;

- Processo consiste na passagem de líquido

ou gás por material com pequenos poros.

Barreiras de contenção no trabalho em cultura de células

• Antes de iniciar os procedimentos de manipulação, opesquisador, ou técnico, deve usar guarda-pó limpo oudescartável, gorro, máscara cirúrgica e sapatilha, comocontenção primária.

• Lavar as mãos e a parte anterior do antebraço comágua e sabão, preferencialmente antisséptico, realizarantissepsia das mãos com álcool 70% (v/v) e calçarluvas cirúrgicas.

• Tais procedimentos são muito importantes para amanipulação de células.

• O profissional não deve usar anéis, pulseiras, relógiosou outros ornamentos durante as manipulações.

Barreiras de contenção no trabalho em cultura de células

• Células animais devem ser manipuladasusando-se as práticas e a contenção do nívelde biossegurança 2.

• O trabalho deve ser realizado em cabine desegurança biológica, e todo o material deveráser descontaminado antes do descarte.

• A contenção secundária é obtida mediante acombinação de elementos relacionados àinfraestrutura laboratorial.

Infraestrutura laboratorial

A organização de um laboratório voltado à pesquisa comcélulas depende da sua finalidade e do número de pessoasque nele vão trabalhar.

De maneira geral, o laboratório necessita dos seguintesespaços:

• Área para lavagem e esterilização;• Área para preparo de meios;• Área para incubação e observação das culturas;• Área para manipulação asséptica das culturas.

• As diversas áreas devem estar funcionalmente distribuídas,facilitando o deslocamento de pessoal e o fluxo de materiais, com amenor circulação possível nas áreas de manipulação asséptica dasculturas.

• A área destinada a manipulações, onde se localizam as cabines defluxo, deve ser preferencialmente fechada e muito limpa. Deve-setrabalhar com avental limpo, exclusivo para uso nessa sala.

• A superfície das bancadas deve ser impermeável à água e resistentea ácidos, álcalis, solventes orgânicos e a calor moderado. Asinstalações devem ser desenhadas de modo a permitir espaçosentre as bancadas, equipamentos e cabines, que devem permitirfácil limpeza.

Infraestrutura laboratorial

Os equipamentos necessários também dependem das finalidades do laboratório. Em geral, o laboratório necessita de:

• Estufa incubadora com atmosfera de CO2;• Autoclave;• Deionizador de água;• Estufa para secagem de material;• Cabine de segurança biológica (câmara de fluxo de ar laminar estéril);• Medidor de pH;• Balança analítica;• Geladeira;• Freezer;• Microscópio invertido;• Agitador magnético;• Centrífuga refrigerada;• Banho-maria;• Bomba de vácuo.

Microscópio invertido

Microscópio invertido: permite a observação de material muito espesso,

impossível de visualizar nos demais microscópios.

Permite que observe células dentro dos tubos e garrafas, sem contudo, precisar abri-

las evitando-se assim problemas de contaminação.

• Para trabalhos com culturas de células, inúmerosinstrumentos são necessários, tais como: câmarapara contagem, pipetador automático,micropipetas, estante para tubos, além de umavariedade de vidrarias e reagentes necessáriospara preparo de meios de cultura e soluções.

• As salas devem ser sinalizadas com símbolouniversal de risco biológico, com acesso restrito àequipe técnica de apoio.

Infraestrutura laboratorial

Pipetador Automático

Micropipetas

Limpeza, desinfecção e esterilização

• A superfície da área de trabalho deve sempre serlimpa, utilizando-se álcool a 70% (v/v), uma vezpor dia ou após cada atividade.

• O álcool etílico a 70% (v/v) é um excelentedesinfetante por sua ação de limpeza oudetergente, sendo eficaz também na redução daflora bacteriana da pele.

• Suas propriedades desidratante e desnaturantede proteínas podem ser responsáveis por suaação antimicrobiana.

Álcool

Etanol – mais aceito para desinfecção em

ambientes de cultivo de células;

Desnaturação das proteínas (rapidamente

na presença de água);

Etanol absoluto menos ativo que 70%.

ConcentraçãodeEtanol Tempo(segundos)

10 20 30 40 50

100 - - - - -

95 - - + + +

90 - + + + +

80 + + + + +

70 + + + + +

50 - - + + +

40 - - - - -

Ação germicida de várias concentrações de etanol em

solução aquosa Streptococcus pyogenes

Limpeza, desinfecção e esterilização

• A água sanitária comercial (2% a 5% de cloro)é, também, um bom desinfetante quandodiluída de 5 a 10 vezes, por ser um agenteoxidante e agir sobre os constituintes damembrana, levando os microrganismos àmorte.

Limpeza, desinfecção e esterilização

• Todo material aquecido no banho-maria,como meios de cultura e soluções, deve terprocesso prévio de assepsia antes de suaintrodução na cabine de segurança biológica.

• Deve-se, ao retirar o material do banho-maria,remover o excesso de umidade com auxílio deuma gaze e posterior limpeza com álcool 70%(v/v).

Limpeza, desinfecção e esterilização

• Antes de se iniciarem os procedimentos, acâmara interna do fluxo deve ser limpa comgaze embebida em álcool etílico 70% (v/v).

• O fluxo de ar, assim como a lâmpada deultravioleta devem ser ligados trinta minutosantes do uso.

• Todo material deve ser limpo com álcooletílico a 70% (v/v) antes de ser introduzido nacâmara.

Limpeza, desinfecção e esterilização

• Após o término dos procedimentos, deve-serealizar a limpeza da câmara interna, removendopossíveis sujidades.

• Manter o intervalo de pelo menos vinte minutos,com o fluxo de ar e a lâmpada de ultravioletaligados, antes de iniciar outro procedimento ouencerrar as atividades.

• Realizar avaliação e monitoramento ambiental dacabine pelo método de exposição de placas, talcomo descrito no item “controle microbiológicode ambientes e processos”.

Controle microbiológico de ambientes e processos

• O trabalho com cultivos celulares exige uma série de cuidados parase reduzirem os riscos de contaminação.

• As técnicas assépticas reduzem a probabilidade de infecção, sendoimportante que sejam mantidas a todo momento: antes, durante eao término do experimento.

• A necessidade de manutenção da assepsia inclui uma série deprocedimentos que vão desde a esterilização dos meios de cultura einstrumentos, até a adoção de quarentena para os cultivos novos.

• Isso porque as células são cultivadas em meios ricos em nutrientese a possibilidade de ocorrer propagação de microrganismoscontaminantes é alta.

• As culturas, assim como todos os resíduos damanipulação, devem ser descontaminadas,antes do descarte, em autoclave durante umahora a 121°C.

• Culturas contaminadas não devem ser abertaspara lavagem antes da descontaminação.

• Esse material deve ser retirado do laboratórioimediatamente em recipientes rígidos e àprova de vazamentos.

Controle microbiológico de ambientes e processos

• Deve-se controlar a temperatura e a umidadepara evitar o crescimento de microrganismosno ambiente.

• A climatização de uma sala de 15m2 (45m3)pode ser feita por um aparelho de arcondicionado de 15.000 BTUs, levando-se emconta que existe o aquecimento produzidopelos equipamentos.

Controle microbiológico de ambientes e processos

• O monitoramento microbiológico da sala, bem como dascabines de segurança biológica para o cultivo de células, podeser realizado pela pesquisa de microrganismos, como fungos ebactérias.

• Um procedimento rotineiro indicado para controle ambientalé o método de exposição de placas com meios nutritivos ágarcaseína de soja (trypticase soy agar-TSA) e ágar sabouraud 4%de glicose (Sab4).

• O laboratório deve possuir um programa rotineiro adequadode controle de insetos e roedores. Todas as áreas quepermitam ventilação deverão conter barreiras físicas paraimpedir a passagem de insetos ou outros animais.

Controle microbiológico de ambientes e processos