Çukurova Ünİversİtesİ fen bİlİmlerİ enstİtÜsÜ …library.cu.edu.tr/tezler/7478.pdf ·...

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

YÜKSEK LİSANS TEZİ

Zuhal ÜZÜMCÜ

PSEUDOMONAS SP. SUŞLARINDA COLD SHOCK PROTEİN İZOLASYONU VE SDS-PAGE ANALİZİ

BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

ADANA, 2009

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Zuhal ÜZÜMCÜ


BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

Bu tez 18/09/2009 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği İle Kabul Edilmiştir.

İmza………………………. İmza…………………………. İmza…………………

Prof. Dr. Burhan ARIKAN Doç. Dr.Hatice GÜVENMEZ Doç. Dr Fuat BUDAK Danışman Üye Üye

Bu tez Enstitümüz BİYOLOJİ Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No:

Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza ve Mühür

Bu Çalışma Ç.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir.

Proje No: FEF2008YL25

•Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

PSEUDOMONAS SP. SUŞLARINDA COLD SHOCK PROTEİN

İZOLASYONU VE SDS-PAGE ANALİZİ

I

ÖZ


PSEUDOMONAS SP. SUŞLARINDA COLD SHOCK PROTEİN

İZOLASYONU VE SDS-PAGE ANALİZİ

Zuhal ÜZÜMCÜ

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

Danışman: Prof. Dr. Burhan ARIKAN Yıl: 2009, Sayfa: 69 Jüri: Prof. Dr. Burhan ARIKAN Doç. Dr. Hatice GÜVENMEZ Doç. Dr. Fuat BUDAK Bu araştırmada, soğuk şoku protein izolasyonu için Çukurova Üniversitesi Balcalı Hastane Laboratuarından alınan, Pseudomonas aeruginosa balcalı-1, Pseudomonas aeruginosa balcalı-2 ve Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 suşu kullanılmıştır. Soğuk şoku protein sentezi için, 5, 10, 20 ºC sıcaklıklar seçilmiş ve bu sıcaklık değerlerinde 60 ve 480 dakika süreyle inkübasyon gerçekleştirilmiştir. Cold shock proteinlerin moleküler ağırlığının saptaması için, SDS-PAGE jel sistemi kullanılmıştır.

P. aeruginosa ATCC 27853 suşundan izole edilen 1700 ve 18130 Da ağırlığındaki proteinler, diğer proteinlere göre daha fazla sentezlenmiştir. Bu iki protein soğuk şok muamelesi ile ortaya çıkmıştır. P.aeruginosa Balcalı 1 ‘in 20ºC’ de 60 dakika ve 5, 10, 20 ºC’de 480 dakika sonra 77066 Da’ luk cold shock protein sentezledikleri bulunmuştur. SDS_PAGE analizleri P. aeruginosa Balcalı-2 suşunda 22666 ve 21576 Da’ luk iki farklı protein ürettiğini gösterdi. Araştırmada kullanılan suşlar içerisinde Pseudomonas Balcalı-1 ve 2 suşlarının, P. aeruginosa ATCC 27853 suşundan daha yüksek düzeyde soğuk şok yanıt oluşturmuştur.

Sonuç olarak P.aeruginosa’ nın 3 farklı suşu, soğuk şokuna maruz bırakıldığında, 10 ºC sıcaklıkta 60 dakika inkübasyon süresinde en fazla protein sentezi gerçekleştirmiştir.

Anahtar Kelimeler: Pseudomonas aeruginosa, Soğuk Şoku Proteinleri,

SDS-PAGE.

II

ABSTRACT

MSc THESIS

Zuhal ÜZÜMCÜ

DEPARTMENT OF BIOLOGY

INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA

Supervisor : Prof. Dr. Burhan ARIKAN

Year: 2009, Pages: 69 Jury: Prof. Dr. Burhan ARIKAN Assoc. Prof. Dr. Hatice GÜVENMEZ Assoc. Prof. Dr. Fuat BUDAK

In this research, Pseudomonas aeruginosa balcalı-1, Pseudomonas aeruginosa

balcalı-2 which taken Çukurova Univercity Balcalı Hospital Laboratory for cold shock protein isolation and Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 strains were used. For cold shock protein synthesis had choosen 20, 10, 5 ºC and the temperature values selected for 60 and 480 minutes incubation were carried out. Cold shock proteins to determine the molecular weight, SDS-PAGE gel system was used.

P. aeruginosa ATCC 27853 strain isolated in 1700 and 18130Da weight proteins, were synthesized more than other proteins. These two proteins have occuranced with the cold shock treatment.

P. aeruginosa Balcalı 1 produced the protein in 77066Da cold shock protein at 20ºC at for 60minutes and 5, 10, 20ºC for 480 minutes incubation

SDS-PAGE analysis showed that P. aeruginosa Balcalı 2 strains numbered two different protein bands in 22666and 21576 Dalton molecular weight . Strains used in the study of Pseudomonas balcalı-1 and balcalı-2 from Cold Shock response higher constituted than Pseudomonas ATCC 27853.

As a conclusion, Pseudomonas have three different strains Cold shock treatment when isolated the most cold shock protein, 10 ºC at for 60 minutes incubation

KeyWords: Pseudomonas aeruginosa. ,Cold Shock Protein, SDS-PAGE

ISOLOTION OF COLD SHOCK PROTEIN FROM PSEUDOMONAS SP.

STRAINS AND ANALYSIS OF SDS-PAGE

III

TEŞEKKÜR

Öncelikle çalışmalarım esnasında her türlü desteğini ve yardımını benden

esirgemeden sunan, değerli danışman hocam Prof. Dr. Burhan ARIKAN’ a teşekkürü

bir borç bilirim.

Her zaman desteklerini benden esirgemeyen değerli hocalarım Prof. Dr. Ömer

ÇOLAK, Doç. Dr. Hatice GÜVENMEZ ve Prof. Dr. Sadık DİNÇER’ e ve

arkadaşlarıma teşekkür ederim.

Hayatımın her aşamasında beni yüreklendiren ailemin değerli üyelerine

özellikle de babam Rüstem ÜZÜMCÜ’ ye şükranlarımı sunarım.

IV

İÇİNDEKİLER SAYFA NO

ÖZ ................................................................................................................................................................................................ I

ABSTRACT .......................................................................................................................................................................... II

TEŞEKKÜR ......................................................................................................................................................................... III

İÇİNDEKİLER .......................................................................................................................................................... IV

ÇİZELGELER DİZİNİ ......................................................................................................................................... VII

ŞEKİLLER DİZİNİ ............................................................................................................................................... VIII

SİMGELER VE KISALTMALAR ............................................................................................................................. IX

1. GİRİŞ ................................................................................................................................................................................... 1

1.1. Bakteri Hücre Yapısı ......................................................................................... 2

1.1.1. Pseudomonadaceae Familyası ................................................................... 3

1.1.1.1. Pseudomonas Cinsi ............................................................................. 4

1.1.1.2. Hücre Morfolojisi ve İnce Yapısı ........................................................ 5

Pigmentasyon ..................................................................................... 6

1.1.1.3. Plazmidler ........................................................................................... 7

1.2. Moleküler Şaperonlar ........................................................................................ 8

1.3. Isı Şoku Proteinleri ............................................................................................ 8

1.4. Büyük Molekülleri Şaperonlar .......................................................................... 9

1.5. Yüksek Sıcaklık Şoku Proteinleri ................................................................... 10

Sıcaklık Şoku Proteinlerinin (Hsp) Gruplandırılması ........................................ 10

1.5.1.1. Hsp-100 ............................................................................................. 11

1.5.1.2. Hsp-90 ............................................................................................... 11

1.6. Stres Cevabının Özellikleri ............................................................................. 12

1.7. Cold Shock Proteinler ..................................................................................... 12

1.7.1. E.coli’ nin CspA Ailesi ............................................................................ 13

1.7.2. Diğer Mezofilik Bakterilerdeki Cold Shock proteinler ............................ 13

1.7.3. Antifriz Glikoproteinlerin Yapısı ve Görevleri ........................................ 15

1.8. Soğuk Şoku ve Membran Kompozisyonu ...................................................... 16

1.8.1. Bakterilerin Membran Lipidleri ve Yağ Asidi İçeriğinde Sıcaklığa Bağlı

Olarak Ortaya Çıkan Değişiklikler .......................................................... 19

V

1.8.2. Lipid Gruplarındaki Değişiklikller ........................................................... 19

1.8.3. Karotenoidlerin Bileşimindeki Değişiklikler ........................................... 20

1.9. Elektroforez Uygulamaları .............................................................................. 21

1.9.1. Jel Elektroforezleri ................................................................................... 22

1.9.2. Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) ... 24

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR ....................................................................................................................................... 27

3. MATERYAL VE METOD ....................................................................................................................................... 30

3.1. Materyal .......................................................................................................... 30

3.1.1. Bakteri İzolasyonu ve İdentifikasyonunda Kullanılan Besiyeri ............... 30

3.1.1.1. GSP Agar Besiyeri ............................................................................ 30

3.1.1.2. N1 Besiyeri ....................................................................................... 31

3.1.2. Kullanılan Çözeltiler ................................................................................ 31

3.1.2.1. Solusyon I (Bakteri hücre duvarının yıkılması için kullanılmıştır) .. 31

3.1.2.2. Örnek Hazırlama Çözeltisi (Duvarsız bakterilerin patlatılması sonucu

oluşan protein yapılarının denatürasyonu için kullanılmıştır) ......... 32

3.1.3. SDS-PAGE İçin Kullanılan Çözeltiler ..................................................... 32

3.1.3.1. Akrilamid Monomer Solüsyonu (Sol-A) .......................................... 32

3.1.3.2. 4x Separating (Ayırma) Jel Tamponu (Sol-B) .................................. 33

3.1.3.3. 4x Stacking (Dengeleme) Jel Tamponu (Sol-C) ............................... 33

3.1.3.4. Yürütme Tamponu (pH: 8,3) ............................................................ 33

3.1.3.5. Ayırma (Seperating) Jeli (%10’ luk) ................................................. 34

3.1.3.6. Ayırma (Seperating) Jeli (% 12’ lik) ................................................. 34

3.1.3.7. Dengeleyici (Stacking) Jel ................................................................ 34

3.1.3.8. Jel Boyama Solüsyonu (CBB R-250, Coomassie Brillant Blue) ...... 35

3.1.3.9. Jelden Boyayı Uzaklaştırma Solüsyonu (Destaining) ....................... 35

3.1.3.10. AMPS Çözeltisi ............................................................................... 35

3.1.3.11. TEMED (N,N,N’N’-tetramethylenediamine) ................................. 35

3.2. Metod .............................................................................................................. 36

3.2.1. Bakteri Stok Kültürlerin Hazırlanışı ........................................................ 36

3.2.2. Bakterilerin Tanımlanmaları .................................................................... 36

3.2.3. Soğuk Şoku Protein İzolasyonu İçin Bakterilerin İnkübasyon Koşulları 36

VI

3.2.4. Protein İzolasyonu .................................................................................... 37

3.2.5. Poliakrilamid Jel Elektroforezinde (PAGE) Moleküler Ağırlık ve

Zymogram Analizi ................................................................................... 38

3.2.5.1. Moleküler Ağırlık Analizi İçin SDS-PAGE Sisteminin Hazırlanması

.......................................................................................................... 39

3.2.5.2. Enzim Örneklerinin PAGE’ ne Yüklenmesi ve Yürütülmesi ........... 40

3.2.5.3. SDS-PAGE Jelinin Boyanması ve Boyanın Geri Alınması .............. 40

4. BULGULAR VE TARTIŞMA ............................................................................................................................... 41

5. SONUÇ VE ÖNERİLER .......................................................................................................................................... 53

KAYNAKLAR ................................................................................................................................................................... 63

ÖZGEÇMİŞ ......................................................................................................................................................................... 69

VII

ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA NO

Çizelge 1.1. Bakterilerin Üreme Sıcaklıklarına Göre Sınıflandırılması .................... 18

Çizelge 1.2. Düşük Sıcaklığın Bakteri Membranında İndüklediği Değişiklikler ...... 20

Çizelge 3.1. Cold shock protein üretim uygulama sıcaklık ve süreleri ...................... 37

Çizelge 3.2. % 12 lik SDS-PAGE jeli için gerekli miktarlar ..................................... 39

Çizelge 3.3. Dengeleyici Jelin Bileşimi ..................................................................... 39

Çizelge 4.1.P. aeroginosa ATCC 27853 suşuna ait cold shock proteinlerin % 12’ lik

SDS-PAGE jelinde oluşan protein profilleri .......................................... 42

Çizelge4.2. P. aeroginosa balcalı-1 suşuna ait cold shock proteinlerin % 12’ lik SDS-

PAGE jelinde oluşan protein profilleri .................................................. 45

Çizelge 4.3. P. aeroginosa balcalı-2 suşuna ait cold shock proteinlerin % 12’ lik

SDS-PAGE jelinde oluşan protein profilleri .......................................... 48

VIII

ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA NO Şekil 1.1. Cold Shock Proteinin 3 boyutlu yapısı ...................................................... 14

Şekil 4.1. P. aeroginosa ATCC 27853 suşundan % 12’ lik SDS-PAGE ile elde edilen

protein profilleri. Albumin marker 5 µl, protein örnekleri ise 30 µl

miktarda kullanılmıştır. .............................................................................. 44

Şekil 4.2. P. aeroginosa balcalı-1 suşundan % 12’ lik SDS-PAGE ile elde edilen

protein profilleri. ........................................................................................ 47

Şekil 4.3. P.aeroginosa balcalı-2 suşundan % 12’ lik SDS-PAGE ile elde edilen

protein profilleri. ........................................................................................ 50

IX

SİMGELER VE KISALTMALAR SDS: Sodiumdodesilsülfat EDTA: Etilen daimin tetra asetik asit AMPS: Amonyum persülfat PAGE: Polyacrilamid jel TEMED: Tetrametil etilen diamin Rpm: Devir/dakika ºC: Santigrat derece Csp: Cold Shock Protein Hsp: Isı şoku proteini Da: Dalton AFGP: Antifriz glikoprotein

1. GİRİŞ Zuhal ÜZÜMCÜ

1

1. GİRİŞ

Birçok mikroorganizma sadece soğuk ortamlarda canlı kalmayıp 0 ºC’ de bile

üreyebilmektedir. Bu şekilde üreme davranışı gösterenler psikrofil

mikroorganizmalar şeklinde adlandırılırlar. Psikrofil bakteriler zorunlu ve fakültatif

olmak üzere iki alt gruba ayrılırlar. Bu ayrım yapılırken, mikroorganizmaların 20 ºC’

nin altında ya da üstündeki sıcaklıklarda hızlı üreyip ürememe durumlarına

bakılmıştır. Bazı mikroorganizmaların 0 ºC’ lerde üreyebildikleri 100 yıldan fazla bir

zamandır bilinmektedir. Değişik araştırmacılar çeşitli çevrelerden psikrofil

mikroorganizma izole ettiklerini bildirmişlerdir. Bu çevrelere örnek olarak, denizler,

okyanuslar, topraklar, balıklar, süt, et ve sebze gibi ortamlar verilebilir (Graumann,

1996).

Psikrofil mikroorganizmalar hakkında yapılmış çalışmaların büyük bir kısmını

gıda mikrobiyologlarının yapmış olduğu araştırmalar oluşturmaktadır. 0 ºC’ ye yakın

sıcaklıklar yüksek sıcaklıkların tersine fazla uç koşulları oluşturmaz.

Mikroorganizmaların düşük sıcaklıklarda üreme yetenekleri sadece prokaryotlarla

sınırlı değildir. Psikrofil mikroorganizmalara çeşitli gram pozitif ve gram negatif

bakterilerle, Cyanobakter, mantarlar ve eukaryotic algler de dahildir.

Psikrofil mikroorganizmalar yiyeceklerde yaygın şekilde bulunmaktadırlar. Bu

organizmaların kaynağı, su, toprak ve bazı durumlarda da besinin kendisidir

(örneğin, süt, et ürünleri, deniz balıkları ve sebzeler). Son zamanlarda dondurulmuş

ve özellikle soğutulmuş gıdaların aşırı şekilde tüketilmesi bu gıdaların üretim ve

tüketim zamanları arasındaki geçen sürenin uzun olması, psikrofil bakterilerin gıda

endüstrisi alanındaki önemini artırmaktadır (Uyttendaele ve ark. 1998; Wang ve ark.

1999).

Gerçek anlamda psikrofil organizmalar (deniz ürünleri hariç) oldukça ender

bulunurlar. Süt ürünlerinde bulunan psikrofil populasyon genel olarak gram negatif

çomak yapılı bakterilerdir. Bu bakteriler Pseudomonas, Acinetobacter, Alcaligenesis,

Chromobacterium ve Flavobacterium şeklindedir. Pseudomonas suşları süt

endüstrisinin en başa bela psikrofilik bakterileridir. Çünkü bu bakteriler, ürünlere hoş

olmayan tat, koku, renkler vermektedirler. Bundan öte, bu bakteriler, lipaz ve


2

protease gibi pastörizasyon ve sterilizasyona dayanabilen ısıya dayanıklı enzimler

üretme yeteneğine sahiptir (Broeze ve ark. 1978).

Escherichia coli’ nin de ortam sıcaklığı 37 ºC’ den 10 ºC’ ye düşürüldüğünde

çok sayıda farklı proteinin sentezlendiği bulunmuştur. Proteinler organizma düşük

sıcaklıklarda üreme gösterirken meydana gelen transkripsiyon ve translasyon

olaylarında görev yapmaktadırlar.

Psikrofil bir maya türü olan Trichosporon pullants’ ta yapılan soğuk

araştırmalarında ortam sıcaklığı 21 ºC’ den 5 ºC’ ye düşürüldüğünde kontrole göre

26 farklı protein sentezlendiği bulunmuştur. Buna karşılık sıcaklık 15 ºC’ den 5 ºC’

ye indirildiğinde sadece 6 protein, 24 ºC’ den 5 ºC’ ye indirildiğinde ise 10 proteinin

sentezlendiği görülmüştür (Jones ve ark. 1987; Uyttendaele ve ark. 1998).

1.1. Bakteri Hücre Yapısı

Prokaryotik canlı hücrelerinin ince yapıları, elektron ve ışık mikroskobu

çalışmalarıyla tamamen aydınlatılmıştır. Tipik bir prokaryot hücre, hücre duvarı,

hücre membranı, ribozom ve nüklear bölgeden ibarettir.

Hücre membranını saran hücre duvarı, hücreye desteklik sağlayan ve onu

koruyan, hücrenin dışındaki yapıdır. Prokaryotik canlılar hücre duvarlarının

durumuna ve diğer bazı özelliklerine göre dört büyük gruba ayrılarak incelenirler.

Bunlar; gram negatif eubakteriler, hücre duvarına sahip olan gram pozitif

eubakteriler, hücre duvarına sahip olmayan eubakteriler, archea bakterilerdir.

Hücre membranı, hücreyi dışarıdan gelebilecek olan herhangi bir etkiye karşı

koruyucu vazife gören bir yapıdır. Ribozomlar, protein ve ribonükleik asit

molekülünden oluşan küçük yapılardır. Hücredeki ribozomlar, sadece elektron

mikroskobu ile görülebilirler. Bir prokaryotik hücrenin bulundurduğu ribozom sayısı

10.000 civarındadır. Prokaryotik ribozomlar 30S ve 50S büyüklüğünde iki alt

birimden oluşan nükleoprotein yapılarıdır. Sağlam bir prokaryot ribozomu 70S

büyüklüğe sahiptir.

Prokaryotik hücreler gerçek bir nükleusa sahip değildirler. Prokaryotik

hücrelerde nükleusun fonksiyonlarını sadece tek ve uzun bir molekülü, bu hücrelerde


3

az veya çok serbest olarak bulunmaktadır. Bu nedenle, bu hücrelerde bir nükleustan

ziyade nüklear bölgeden bahsedilmektedir. Ancak, bu hücrelerdeki nükleik asit

molekülüne de ökaryotik hücrelerdekine benzer olarak kromozom adı verilmektedir.

Ayrıca, Prokaryotik hücreler bu kromozom DNA’ sına ilave olarak plazmid olarak

adlandırılan küçük, halka şeklinde DNA’ lara da sahiptirler.

Hepsi olmamakla birlikte, pek çok Prokaryotik mikroorganizma hareket

edebilme özelliğine sahiptir. Prokaryotik hücrelerin hareketleri, genellikle flagella

adı verilen organeller yardımıyla olmaktadır.

Bazı bakteriler, karşılaştığı uygun olmayan şartlarda hayatını devam

ettirebilmek için endospor olarak adlandırılan, dayanıklı formlar oluşturmaktadırlar.

Endosporlar, bakteri hücresi içerisinde meydana gelen, ısıya karşı oldukça dirençli ve

kaynama ile dahi kolaylıkla ölmeyen dayanıklı yapılardır. Aktif olarak üreyen

bakteriler spor oluşturmazlar bununla birlikte açlık veya diğer bazı nedenlerden

dolayı spor oluşumu başlatabilir. Bir bakterinin endospor oluşturup oluşturmadığının

bilinmesi ve endosporun pozisyonu taksonomik olarak önemlidir. Endospor,

hücrenin merkezinde ise merkezi endospor, ucunda kutba yakın ise terminal

endospor ve uçlarla merkez arasında ise subterminal endospor olarak adlandırılır.

1.1.1.Pseudomonadaceae Familyası

Gram-negatif çomak şeklinde bakteriler olup, polar flagella vasıtasıyla hareket

ederler. Kemoorganotrof ve aerobik bakterilerdir. Üremeleri 4 ºC’ den 43 ºC’ ye

kadar geniş ısı ortamlarında olmaktadır. Organotrofik olan Pseudomonas’ lar karbon

ve enerji kaynağı olarak bir karbonlu organik bileşikleri kullanabilirler. Katalaz

pozitif ve genellikle oksidaz pozitif bakterilerdir. DNA’ nın G+C oranı % 58-71’ dir.

Pseudomonaceae familyası Pseudomonas, Xanthomonas, Frateuria ve Zooglea

olmak üzere 4 cins ihtiva eder.

Geçmişte birçok bakteriyal cinsi Pseudomonadaceae familyasına

yerleştirilmiştir. Kluyver ve Niel, bu familyanın üç takım içinde 25’ ten fazla cins

ihtiva ettiğini ileri sürmüşlerdir. Bu fazla sayı, filogenetik kriterlerin incelenmesiyle

zamanla azaltılmış ve “Bergey’ s Manuel of Systematic Bacteriology” in sekizinci


4

baskısında, olduğu gibi cins sayısı 4’ e indirilmiştir (Sneath, A.P., Mair, N.S ve ark.,

1986).

Familyanın karakteristik cinsi, çoğu gruplara fenotipik benzerlikleriyle gram

negatif bakterilerin en kompleks gruplarından biri olan Pseudomonas’ tır. Bu cinsin

üyeleri pek çok basit organik bileşiklerin kullanıldığı basit besi yerlerinde

üremeleriyle ayırt edilirler. Oksidaz reaksiyonu genellikle pozitif ve % G+C oranı ise

58-70 arasındadır. Xanthomonas suşları bitki patojenidirler. Bunlar, besinsel olarak

Pseudomonas’ lardan daha duyarlıdırlar ve karakteristik sarı hücresel pigment

(ksanthomonadian) üretirler. Geç ve negatif oksidaz reaksiyonu verirler. Bunların

G+C oranları % 65-71 mol’ dür. Pseudomonas ve Xanthomonas suşları asit tölerant

değildirler ancak, Frateuria suşları pH 3,6’ da büyüyebilirler. Bu cins için G+C oranı

% 62-64 mol’ dür. Zooglea cinsi doğal şartlar altında katı yüzeylere tutunmak için

yapışkan bir kütle üretir ve belli laboratuar şartları altında yapışkan madde

oluşumunu gerçekleştirebilirler. Zoogloea’ nın DNA’ sının % G+C oranı da 65 mol’

dür.

1.1.1.1. Pseudomonas Cinsi

Düz veya nispeten eğri ve çubuk şeklinde olan ve 0,5-1,0 x 1,5-5,0 µm

boyutlarında bakterilerdir. Çoğu türler sudanofilik inklüzyonlar şeklinde görülen

karbon rezerv materyali olarak poli-β-hidroksibutiratı biriktirirler. Pseudomonas’ lar

kapsül ile sarılı değildir. Hücreler gram negatif boyanırlar. Hareket, bir veya birkaç

polar flagella ile olur ve nadiren de hareketsizdirler. Bazı türlerde kısa dalgalı lateral

flagella da bulunabilir. Oksijen, terminal elektron akseptörü olarak fonksiyon

görürken (aerobik), nitrat da bazı durumlarda üremenin anaerobik olarak oluşmasına

yardımcı olmak için alternatif elektron akseptörü işlev görebilir. Çoğu, asidik şartlar

altında (pH 4,5) üreme göstermez.

Çoğu türler organik büyüme faktörlerine ihtiyaç göstermezler. Oksidaz pozitif

veya negatif olabilirler. Katalaz pozitif ve kemoorganotrofiktirler. Bazı türler enerji

kaynağı olarak H2 veya CO2 kullanabilen fakültatif kemolitotrofturlar. Doğada geniş

bir şekilde yayılırlar. Bazı türler insan, hayvan ve bitkiler için patojendir. DNA’ nın


5

% G+C oranı 58-70 mol’ dür. Pseudomonas cinsi tip türü Pseudomonas aeruginosa ’

dır.

1.1.1.2. Hücre Morfolojisi ve İnce Yapısı

Pseudomonas cinsine ait bakteriler genellikle büyüklük ve şekilleri yönünden

genel tanımlamadan farklıdır. Bazı türlerde (P. putida’ nın bir sinonimi olan P.

ovalis) hücreler ovaldir, bazı bitki patojen türleri 4 µm boyunda olağan üstü

hücrelere sahiptirler.

Hücreler, sınırlı azot şartlarında ürediği zaman, çoğu türler fazla miktarda poli-

β-hidroksibutirat (PHB) biriktirirler. PHB birikiminin çok düşük olduğu durumlarda

(P.pseudoalcaligenes gibi), tanınmaları için spesifik enzimlerin meydana getirdikleri

ekstrasyon ve hidroliz (depolimerizasyon)’ lere ihtiyaç duyulmaktadır.

Bazı türler (P. vesicularis, P. pseudoflava), glikojeni andıran bir polisakkarit

biriktirirler. Glikojen, PHB’ tan daha az göze çarptığından, tanınmaları için izolasyon

ve kimyasal karakterizasyonlara ihtiyaç duyarlar. Elektron mikroskobu çalışmaları,

Pseudomonas’ ların hücre membranına ve gram-negatif bakterilerin tipik hücre

duvarına sahip olduklarını göstermektedir.

Pseudomonas aeruginosa’ nın hücre membranına ait dört farklı bileşen,

Hancock ve Nikodia tarafından, sukroz-gradient santrifigasyon yöntemiyle

tanımlanmıştır. Ayrıca P.aeruginosa ve P. saccharophila hücrelerinde mezozom

benzeri yapıların olduğu da belirlenmiştir (Hancock ve Nikodia, 1978).

Pseudomonas türlerinde rapidosom olarak bilinen mikrotibül özelliğindeki

yapılar oluşmaktadır. P. flourescens’ deki bakteriyosinlerin polimerize olduğu kılıf

ile rapidosomların aynı olduğu, Amako ve arkadaşları tarafından belirlenmiştir. P.

aeruginosa’ nın rapidosom durumunda daha önce aydınlatılamamış bazı özellikler,

Baecher ve Berk’ in yaptığı çalışmalarla açıklanmıştır (Amako ve ark.. ile Beacher

ve berk.. 1972).


6

Pigmentasyon

Pigmentasyon, başlangıçta Pseudomonas cinsinin bir genetik karakteri olarak

bilinirdi. Fakat daha sonraki çalışmalar cinsin birkaç pigment oluşturmayan tür ihtiva

ettiğini ortaya koymuştur. Koloniler normal hücresel alt yapılardan dolayı bazı

renkler gösterirler. P. stutzeri başlangıçta pigment oluşturmayan cinsler içerisinde

gruplandırılmış fakat bu türe ait birçok suşa ait kolonilerin, hücrelerdeki sitokrom c’

nin yüksek konsantrasyonundan dolayı, yaşlandıkça kırmızımsı kahverengi bir renk

oluşturdukları tespit edilmiştir.

Pseudomonas’ ın en iyi bilinen çözünebilir pigmentleri piyoverdin ve

piyosiyanindir. Piyosiyaninin yapısı iyi bilinmesine rağmen, piyoverdinler sadece

kısmi olarak karakterize edilmiştir. Flouresant pigmentler, düşük demir içerikli

besiyerlerinde bol miktarda elde edilebilirler. Bu özellikten dolayı P. flourescens’ e

ait piyoverdin pigmenti hakkında oldukça fazla bilgiler elde edilmiştir. Molekülün

yapısının yakın bir gelecekte aydınlatılabileceği umut edilmektedir.

Piyoverdinin asıl bileşeni, kompozisyonu türe göre değişen siklik peptide bağlı

quinoline kromoforudur. Meyer ve Hornsperger, piyoverdinin demir taşınmasında rol

aldığını aydınlatmışlardır. P.aeuriginosa’ ya ait piyosiyanin, çeşitle fluoresant ve

fluoresant olmayan Pseudomonas’ lar arasında bulunan en belirgin pigment grubudur

(Meyer ve Hornsperger, 1978).

Piyosiyanin mavi renge sahiptir ve fluoresant özellikteki pigmentler gibi

besiyerine kolayca difüze olurlar. Diğer fenazin pigmentleri daha az eriyebilir

özellikte oldukları için bazı kolonilerin etrafında kristalize olurlar. P.chlororaphis

türü tarafından üretilen yeşil bir pigment olan klororafin böyle bir pigmenttir.

Fenazin pigmentleri flouresant olmayan bazı türler tarafından da üretilir (Morris, B.

M. ve J. B. Roberts, 1959).

P. indigofera, indigodin pigmenti ürettiği için ‘indigo bakteri’ lerinden biri

olduğuna karar verilmiştir. İndigoidin indol ihtiva eden besiyerinde üreyen P.

indoloxidans kolonisinin etrafında toplanan, suda çözülebilen mavi bir bileşiktir.


7

Pseudomonas’ lar tarafından üretilen pigmentler, grup özellikleri ile ilişkili

oldukları için sınıflandırmada özel bir öneme sahiptirler. Bununla birlikte,

pigmentasyon durabileceği gibi inkübasyon süresi uzadığı zaman da pigment

oluşumunun düzensizleşmesi söz konusudur ( Sneath, 1960 ve Gray, 1928).

1.1.1.3. Plazmidler

Yapılan araştırmalarda Pseudomonas grubunda bir birinden farklılık gösteren

10 plazmid grubu belirlenmiştir. Pseudomonas plazmidleri ile en fazla araştırmayı

Jacoby gerçekleştirmiştir (Jacoby, 1979). Araştırmaların sonunda değişik

plazmidlerin farklı konak spesifitesi gösterdikleri saptanmıştır.

En geniş konak spektrumuna IncP-1 plazmidlerinin sahip oldukları

bulunmuştur. IncP-2 grubunda yer alan plazmidler dirençlilik (R-plazmidi) ve

değişik karbon kaynaklarının parçalanmasından sorumlu genleri taşıyan plazmidler

yer almaktadır.

Pseudomonas grubundan izole edilen plazmidler, genel olarak 16-90

megadalton arasında değişen büyüklüğe sahiptirler. Bununla birlikte büyüklüğü 300

megadaltonu geçen bazı plazmidler de izole edilmiş olup, bunlar büyük

Pseudomonas plazmidleri olarak adlandırılmışlardır. IncP-2 grubunun yanı sıra IncP-

9 grubunda da farklı karbon kaynaklarını parçalama özelliğinde olan plazmidler

saptanmıştır. Sırası ile CAM, OCT, SAL, NAH, TOL ve XYL şeklinde adlandırılan

parçalama yeteneğine sahip plazmidler, kafur, n-oktanol, salisilat, naftalen, toluen ve

ksilen gibi hidrokarbon türevi karbon kaynaklarını mineralize etme yeteneğine

sahiptirler ( Bryan, L.E., 1979).

Laboratuarlarda yapılan değişik araştırmalarda zor parçalanan karbon

kaynaklarını mineralize etme yeteneğine sahip değişik plazmidlerin Pseudomonas

suşlarına aktarılması ile yeni yetenekler kazandırılmış organizmalar elde edilmiştir.

Örneğin ham petrol bileşiği olan PAH’ ları parçalama yeteneğine sahip plazmidler,

Pseudomonas aeruginosa ve Pseudomonas putida suşlarına transfer edilmişlerdir

(Chakrabarty, 1981).


8

1.2. Moleküler Şaperonlar

Moleküler şaperonlar proteinlerin bir sınıfı olup yüksek düzeyde korunmuş

hücresel moleküllerdir. Organizmanın yaşamı için gerekli yapılardır. Moleküler

şaperonlar arasında E.coli’ de de saptanan ve stres proteinleri adı verilen GroEL-

GroES ve Dna K, Dna J, GrpE şeklinde moleküller saptanmıştır.

Birçok stres protein türü tanımlanmıştır. Örneğin ısı şoku proteinleri gibi (Hsp

70, Hsp 40).

1. Hsp 70: M.ağırlığı: 70000 dalton (kendi başına)

2. Hsp 40: M. ağırlığı: 40000 dalton (kendi başına)

Stres proteinleri protein katlanmalarında yeni sentezlenen proteinleri içerdikleri

gibi, katlanma yapan proteinlerin rasgele toplamalarını da engellerler. Bu

proteinlerin en öncelikli görevi budur. Şaperon yapıları stres altında bozulmuş

proteinleri ATP ve diğer Co-faktörlerinde yardımıyla onarırlar.

1.3. Isı Şoku Proteinleri

Isı şok proteinleri veya HSP’ ler, farklı stres koşullarında sentezlenmektedirler.

Isı şok proteinleri, protein molekülleri için moleküler şaperon gibi davranırlar. Bu

proteinlerin adlandırmaları tamamen moleküler ağırlıklarına göre yapılmaktadır. Isı

şoku proteinleri sitoplazmik proteinler olup, organizmanın yüksek sıcaklık etkisinde

kalması sonucu sentezlenirler.

Bu gruptaki proteinlerin birçok önemli görevi olduğu bulunmuştur. Buna örnek

olarak proteinlerin katlanması, proteinlerin hücresel düzenlenmeleri ve uygun

olmayan proteinlerin hücrede birikmesinin önlenmesi verilebilir.

Birçok şaperon ısı şoku proteinleri olarak adlandırılır (Örneğin Hsp 60). Bunun

nedeni, bu moleküllerin işlevlerini yüksek sıcaklıklarda gerçekleştirmeleridir. Isı,

normalde şaperonlar olmadan proteinlerin uygun olmayan katlanmalar yapmasına

sebep olur. Bu yüzden protein molekülleri sıcaklığın çok yüksek olduğu ortamlarda

doğru katlanma yapmak için şaperonlara ihtiyaç duyarlar.


9

1.4. Büyük Molekülleri Şaperonlar

Bu grupta farklı şekillerde tanımlanmış çok sayıda protein vardır. Bu proteinler

genel olarak Hsp (Isı şoku proteini) şeklinde adlandırılmışlardır. Isı şoku proteinler

Hsp-8, Hsp-10, Hsp-20, Hsp-25, Hsp-27, Hsp-32 (hücreyi strese karşı koruma), Hsp-

40, Hsp-47, Hsp-60 (protein katlanmasında görevli), Hsp-70 (Polipeptid zincirinin

uzatılması ve ısı şoku yanıtlarının düzenlenmesinde görevli), Hsp-90 (Steroid

reseptörlerin düzenlenmesi, proteinlerin katlanması ve sabitlenmesinde görevli),

Hsp-100 ve Hsp-110 (termotoleranslıktan sorumlu) şeklinde gruplanmışlardır.

-Hsp-8: Sitoplazmik proteinlerin hücre içi düzenlenmelerinde önemli role

sahiptir.

-Hsp-10: Hsp-60 ile kompleks yaparak işlevsel duruma geçer.

-Hsp-20: Farklı hetero kompleks diğer HSP’ lerle birleştiği zaman işlevsellik

kazanmaktadır. Isı ile oluşan stres koşullarında membran yapılarının düzgün şekilde

yerleşmesine yardımcı olurlar.

-Hsp-25, Hsp-27 ve Hsp-32 küçük moleküler ağırlıklı şaperonlar şeklinde

adlandırılırlar. Moleküler ağırlıkları 15-30 kDa arasında değişiklik gösterir. Hsp-25

ve Hsp-27 stres bulunmayan koşullarda sitoplazmada lokalize olmuş durumda

bulunurlar ve apoptosisin düzenlenmesinde etkindirler.

-Hsp-40 ökaryot organizmalarda Hsp-70’ in fonksiyonlarına yardımcı olur.

Büyük moleküllü şaperon grubuna ait olup, Hsp-70 ile aynı görevi yerine

getirmektedir.

-Hsp-47 özellikle fotofosforilizasyon sırasında hücredeki miktarı önemli

düzeyde artar ve serin proteaz enziminin aktivitesinde rol oynar.

-Hsp-60 sıcaklıkla özelliği bozulmuş proteinlerin tekrar aktive olmasını sağlar.

-Hsp-70’ in görevi bakteride ve ökaryotta farklıdır. Olgun polipeptid

zincirlerinin veya hatalı katlanmış protein moleküllerinin yeniden ve düzgün şekilde

katlanmalarına yardımcı olur. Bakterilerde Hsp-70’ de meydana gelecek mutasyonun

çoğu kez ölümle sonuçlandığı saptanmıştır.

-Hsp-90 dimer ya da hetero komplekslerin birleştirilmesini gerçekleştirir.


10

1.5. Yüksek Sıcaklık Şoku Proteinleri

Yüksek sıcaklık stresi, proteinlerin intermoleküler bağlarında değişikliklere

neden olarak enzimatik fonksiyonlarını ve çözünebilirliliklerini azaltmaktadır.

Sıcaklık artışı non-kovalent bağların kırılması sonucu denatürasyona neden

olmaktadır. (Buchner et al. 1998). Yüksek sıcaklık ile denatüre olan proteinler geri

dönüşümsüz olarak çökelmekte ve diğer denatüre proteinlerle hidrofobik veya

elektrostatik etkileşimler oluşturmaktadır. Bu nedenle, proteinlerin fonksiyonel

yapılarının korunması, doğal proteinlerin çökelmesinin engellenmesi, denatüre olmuş

proteinlerin yeniden fonksiyonel duruma gelmesi ve fonksiyonel olmayan, fakat

potansiyel olarak zararlı polipeptitlerin (denatürasyon veya çökelme ile meydana

gelen) uzaklaştırılması, hücrelerin stres koşulları sırasında yaşamlarını

sürdürebilmeleri için çok önemlidir ( Wang et al. 2004).

Yüksek sıcaklık stresine maruz kalan birçok organizmada, yüksek sıcaklık

şoku proteinleri (Hsp’ ler) olarak adlandırılan bir grup proteinin sentezlendiği

bildirilmiştir (Vierling 1991, Simões-Araújo et al. 2003). Yüksek sıcaklık şoku

proteinlerinin bazıları optimum sıcaklıklarda hücrede eksprese edilirken, birçok Hsp’

nin sentezi yüksek sıcaklık şoku ile teşvik edilmektedir. Ayrıca, Hsp’ lerin

biyosentezi, sadece yüksek sıcaklık stresi ile uyarılmamakta, aynı zamanda tuzluluk,

ağır metal, soğuk etkisinde kalma ve oksidatif stres gibi faktörler de bu proteinlerin

sentezini artırmaktadır.

Moleküler biyoloji ve genetik çalışmaları, çeşitli transkripsiyon faktörlerinin

stres ile uyarılan genlerin düzenlenmesinde rol oynadığını göstermiştir ( Uno et al.

2000, Sakuma et al. 2002, Doubuzet et al. 2003). Bray ve ark. (2000), gen

ifadesindeki değişikliklerin, optimum üreme sıcaklığından en az 5 ºC daha yüksek

sıcaklıklarda gözlendiğini bildirmiştir.

Sıcaklık Şoku Proteinlerinin (Hsp) Gruplandırılması

Ökaryotlar tarafından sentezlenen önemli Hsp’ ler, yapısal özellikleri farklılık

gösteren altı grupta toplanırlar. Hsp-100, Hsp-90, Hsp-70, ve Hsp-60 proteinleri


11

yaklaşık 17-30 kDA arasında moleküler ağırlığa sahipken, ubiquitin gibi proteinler

8.5 kDa moleküler ağırlıktadırlar (Waters et al., 1996; Vierling, 1997). Moleküler

ağırlıkları büyük olan Hsp-100, Hsp-90 ve Hsp-70 proteinlerinin sekansları, bitkiler

aleminde büyük benzerlik gösterirler. Bununla birlikte spesifik fonksiyonları farklılık

göstermektedir.

1.5.1.1. Hsp-100

Bu gruptaki proteinlerin hücrenin gelişmişliğiyle yakın ilişkili olduğu

belirtilmiştir. Bununla birlikte stres koşullarına bağlı olarak hücredeki sentezi artış

göstermektedir. Hsp-100 grubunda bulanan proteinler daha çok proteinlerin

yığılmasını ve/veya protein degradasyonunu önlemekte görev yaparlar (Wang et al.,

2004). Hsp-101’ in Arabidopsis,, Hsp-104’ ün ise maya hücrelerinde yüksek

sıcaklığa toleranslıkta önemli rol oynadıkları belirtilmiştir (Burke, 2001; Maestri et

al., 2002). Ayrıca Hsp-101’ in Arabidopsis’ de fazla miktarda sentezlenmesiyle

büyümeye önemli katkı yaptığı belirlenmiştir (Vinocur and Altman, 2005).

1.5.1.2. Hsp-90

Hsp-90 proteinleri yüksek düzeyde korunmuş yapılar olup, başlıca görevi

protein katlanmasını gerçekleştirmektir (Lindquist and Craig, 1988). Ayrıca sinyal

iletme ağında, hücre döngüsünün kontrolünde, protein yıkımında ve protein

taşınımında rol oynar. Toplam hücresel proteinin % 1-2’ sini oluşturur. Birçok

organizmada strese bağlı olarak artar (Wang et al., 2004).

Hsp-70

Evrimsel süreçte büyük ölçüde korunmuşlardır. Yüksek sıcaklık ve diğer stres

koşullarında uyarılmaktadırlar. Katlanmamış veya kısmen denature olmuş

polipeptidlere bağlanırlar. Omurgalı, mantar, bakteri ve bitkilerdeki bazı Hsp-70

grubu proteinleri fosforile edildiği ve/veya metillendiği bulunmuştur (Nover et al.,


12

1989). Hsp-70 grubundaki proteinlerin sıcak, soğuk, kuraklık, kimyasal ve diğer

çevresel etiler sonunda sentezlendikleri gösterilmiştir (Wang et al., 2004).

1.6. Stres Cevabının Özellikleri

Stres proteinlerinin fizyolojik fonksiyonları, hücre ısı şokuna maruz kaldığında

daha önemli hale gelir. Stres proteinleri, ısı şoku altında oligomerik komplekslerin

ayrılmasını ve polipeptitlerin açılmasını önler. Tekrar katlanma imkânsız hale

gelmişse, denature olmuş proteinlerin atılmasını hızlandırır. Diğer taraftan hücre

içinde denatüre proteinlerin varlığı stres proteinlerinin yapımını uyarır.

Mikrobiyal patojenler, konakçı fagositlerinin yarattığı stresten kendilerini

korumak için, stres proteinlerinin sentezini hızlandırırlar. Hücre içi patojen olan

Salmonella, önceden hidrojen peroksit ile muamele edilirse stres proteinlerinin

sentezi artar ve bu durum onu daha yüksek öldürücü dozdaki hidrojen peroksit

etkisinden korur. Genel olarak, yüksek dozda stres proteinleri üreten mutantların, ısı

ve oksiden ajanlara ileri derecede dirençli olduğunu, buna karşılık stres proteinlerine

ait genlerinde bozukluklar olan mutantların ise aktif makrofajların öldürücü etkisine

ileri derecede hassasiyet gösterdikleri tespit edilmiştir.

1.7. Cold Shock Proteinler

Biyolojik sistemler ultraviyole ışını, pH, tuzluluk, oksijen kullanılabilirliği,

basınç veya termal gibi stres koşullarından etkilenebilirler. Sıcaklığın düşmesi

membran akışkanlığını değiştirir ve sonuçta hücresel fonksiyonlar değişir. Hücrede

meydana gelen fonksiyonel değişiklikler cold shock adı verilen proteinlerin

sentezlenmesi sonucunda gerçekleşir. İlk tanımlanan cold shock protein E.coli’ deki

CspA’ dır. Bu protein psikrotrofik, psikrofilik, mezofilik ve termofilik birçok gram

negatif ve gram pozitif bakteride de tanımlanmış ve CspA ile homoloji gösterdikleri

belirlenmiştir.


13

1.7.1. E.coli’ nin CspA Ailesi

Bu protein E.coli’ nin en önemli cold shock proteini olup, organizmanın

ortama uyum döneminde sentezlediği toplam proteinlerin % 10’ undan daha yüksek

oranda üretilmektedir. CspA, CspB and CspG soğukla uyarılabilen fakat farklı

şekillerde regüle olan cold shock proteinlerdir. E.coli’ nin CspA ailesindeki

proteinlerin tamamı soğukla uyarılmamaktadır. CspD glukoz azlığı ve stationer fazda

uyarılmaktadır. CspC ve CspE ise 37 ºC’ de üretilmektedirler (Phadtare ve ark.,

1999).

1.7.2. Diğer Mezofilik Bakterilerdeki Cold Shock proteinler

Bacillus subtilis’ te sıcaklık 37 ºC’ den 15 ºC’ ye düşürüldüğünde 37 farklı

protein sentezlendiği bulunmuştur. Bu proteinlerin fonksiyonları hücrede kemotaksi

(CheY) ve şeker alımı (Hpr), protein folding ve genel metabolizma gibi farklı

düzeylerde ortaya çıkmaktadır. Bacillus subtilis’ te E. coli’ dekine benzer şekilde

multicopy CspA benzeri proteinlere sahiptir. Organizmanın optimum sıcaklıkta

üremesinden üç adet Csps (CspB, CspC ve CspD) homoloğunun temel olduğu ve

düşük sıcaklığa adaptasyonda gerekli olduğu saptanmıştır. B.subtilis’ te en önemli

cold shock proteinin CspB olduğu ve bunun diğerlerinin sentezlenmesinde

düzenleyici rolü olduğu belirtilmiştir (Phadtare ve ark., 1999).

Salmonella typhimurium ortam sıcaklığı düşürüldüğü zaman E.coli CspA

proteinine homoloji gösteren ve CspB adı verilen cold shock proteini

sentezlemektedir. Bu proteinin expresyonu 24 ºC’ nin eşik değeri olduğu

bulunmuştur.

Lactobacillus lactis’ in E. coli CspA proteini ile ilgili üç gen taşımakta olduğu

ve bu genlerin, CspB ile uyarıldığı belirtilmektedir. Sıcaklık 30 ºC’ den 15 ºC’ ye

düşürüldükten sonra CspB’ nin mRNA’ yı transkribe etme düzeyi artmaktadır. Bu

proteinle yapılan çalışmalar L. lactis’ in sıcaklık dahil çevre koşullarının sürekli

değiştiği, özellikle süt endüstrisinde yaygın şekilde kullanılması için önemlidir.


14

Csps sentezi, cold shock uygulamasına yanıt olarak sentezlenir, oysaki cold

shock acclimation proteini (Caps) spesifik olarak organizma soğuk sıcaklık

koşullarında sürekli üretildiği zaman sentezlenir. Daha da ilginç olan, mezofilik

bakterilerdeki Caps sentezin psikrofilik ve psikrotroflardaki Csps inden açık bir

şekilde farklı olmasıdır (Phadtare ve ark., 1999).

Şekil 1.1: Cold Shock Proteinin 3 boyutlu yapısı

Prokaryotlardan ökaryotlara ya da invertebratalardan vertebratalara, tüm

organizmalar, çok çeşitli üreme sıcaklıklarında hayatta kalmalarını sağlayacak çeşitli

adaptasyon mekanizmaları geliştirmiştir. Soğuk adaptasyon mekanizmasının önemli

bir kısmı stoplazmik membran seviyesinde gerçekleşir. Soğuk şoku, istenen

membran işlevini sürdürebilmek için membranın komposizyonunu ve

organizasyonunu ile hücre bölünmesini etkiler.

Sıcaklık düşmesi üremenin yavaşlamasına neden olur. Sıcaklığın düşmesi

sırasında organizma stoplazmik membranın komposizyonunu değiştirir ve soğuk

şoku proteinleri adı verilen yapılar sentezlenir.

Tüm canlı organizmalar çevredeki değişimlere adapte olmak zorundadır.

Soğuk, sıcak, asit şoku, ve basınç gibi çevresel değişimler bir çok organizma için

ölümcül olduğundan bu değişikliklere uyum sağlamak organizmaların hayatta

kalabilmeleri için gereklidir.

Soğuk adaptasyonu ile ilgili çalışmalar 1960’ ların sonlarında başlamıştır.

Bütün canlılar için soğuğa uyum sağlamak amacıyla değişik fizyolojik olayların

gerçekleştirildiği bilinmektedir. Örneğin, bazı balık türleri -1,9 ºC olan deniz


15

suyunun donma noktasında yaşayabilirler. Antarktik Balıkları için kanın donma

noktası -2,0 ile 2,1 ºC arasındadır. Bu olağandışı düşük donma noktalarına uyum

sağlanmasının nedeni kanda bulunan yüksek sodyum klorik konsantrasyonu ile

antifriz glikoproteinler (AFGP) olarak adlandırılan proteinlerdir Bazı böcekler ve

çam iğneleri de -3,0 ºC kadar düşük sıcaklıklara dayanabilmektedirler.

1.7.3. Antifriz Glikoproteinlerin Yapısı ve Görevleri

Trematomus borchgreviki, Trematomus bernacchi ve Dissostichhus mawsoni

Antartik Balıklarının serumlarından izole edilmiş glikoproteinlerin, tekrarlanan bir

tripeptid (Ala-Ala-Thr) ve N-asetilgalaktosamin, ve treonin posalarına iliştirilmiş

galaktoz üniteleri olur. Trematomus borchgrevinki glikoproteinlerinin, prolin içeren

antifriz glikoproteinlerden farklı olduğu ve (Ala): 7, (Thr): 2, (Pro):1 yaklaşık

oranlarını içerdiği de bildirilmiştir. Antifriz glikoprotein içeren Arginin de ayrılmış

ve Eleginus gracilis’ den karakterize edilmiştir. Bu glikoproteinlerin moleküler

ağırlıkları 2600-33000 Da’ dır.

AFGP’ lerin, suyun donma sıcaklığını düşürdüğü, muhtemelen hidroksil

karbonhidrat gruplarında bulunan hidrojen bağları aracılığıyla ve buz oluşumunun

önlendiği düşünülmektedir.

Antifriz molekülleri glikopeptid yapısındadırlar (alanin-alanin-threonin-

galaktozil-N-asetil galaktozamin). Her biri üç amino asitlik bir peptid zincirinin

üçüncü amino asidine kovalent bağlarla bağlanmış bir disakkarit molekülünden

oluşan birimlerin tekrarlanmasıyla meydana geldiği saptanmıştır (Crevel ve ark.,

2002).

Bileşiklerin molekül ağırlıkları arttıkça, antifriz etkileri de artar (Sidell, 2000).

Antifriz moleküllerinin buza nasıl bağlandığı tam olarak bilinmemekle beraber

antifrizlerin hidroksil grupları (-OH) ve diğer polar grupları amino asit

zincirlerindeki karbonil (=CO-) grupları ile buza bağlandığı tahmin edilmektedir

(Eastman ve DeVries, 1986).

Son yıllarda, en yoğun çalışmalar prokaryot ve ökaryotlarda soğuk

adaptasyonu üzerine yapılmıştır. Bazı bakterilerde, düşük sıcaklıklarda uyarılabilen


16

bir grup protein saptanmış ve bunlar soğuk-uyarımlı proteinler (CIP) ya da soğuk

şoku proteinleri (CSP) olarak adlandırılmışlardır.

1.8. Soğuk Şoku ve Membran Kompozisyonu

Sıcaklık, biyolojik membranların kompozisyonu, organizasyonu ve

fonksiyonunda çok önemli bir rol oynamaktadır. Membranlar, kendi doymamış yağ

asiti kompozisyonlarını çevresel sıcaklıklardaki değişimlere göre uyarlamaktadırlar.

Membran lipitlerin organizasyonunun ve termal adaptasyonunun moleküler

mekanizmasını anlamak için gerekli bilginin çoğu, termotolerant özellik gösteren

Tetrahymena pyriformis NT-1 kullanılarak elde edilmiştir. Sıcaklık düşecek olursa,

doymamış-yağ asitlerin oranının arttığı gözlenmiştir. Tetrahymena hücrelerindeki

mikrosomal membranlarda yer alan Palmitoyl-CoA’ nın denatürasyonu ilk kez 1977’

de saptanmıştır. Palmitik asit miktarındaki artışın hücrelerin daha düşük sıcaklıklara

adapte olmalarını sağladığı bulunmuştur.

Bacillus megaterium ATCC 14581 suşu ile yapılan çalışmalarda, Δ5 -

denatürasyonunun seviyesini düzenleyen üç kontrol mekanizmasının bulunduğu

saptanmıştır.

a) Sıcaklık tarafından ayarlanan süreç denatürasyonu uyarmaktadır. 35 ºC’ de

üreyen bir kültürde doymamış yağ asitlerinin sentezlenmediği bulunmuştur. Kültür

20 ºC’ ye aktarıldığında, denatürasyonun başladığı ve en az bir saat boyunca artan bir

oranda devam ettiği belirlenmiştir.

b) İkinci bir kontrol süreci de enzimin denatürasyonun inaktivasyon oranı olup,

sıcaklıktaki küçük değişimlere karşı aşırı duyarlıdır. Enzim 20 ºC’ nin üzerinde

inaktive olmaktadır. Ancak, sıcaklık 2 ºC düşürülecek olursa enzimin yarılanma

süresi iki kat artmaktadır.

c) Üçüncü süreç, denatürasyon sisteminin bozulmasıdır. Organizma kültürü

tekrar 34 ºC’ ye konduğu zaman denatürasyon hızla bozulmaya başlamaktadır.

Yüksek sıcaklıklarda üretilmiş Bacillus subtilis, doymuş yağlı asitleri

sentezlemektedir. Bunun nedeni Δ5-denatürasyon fonksiyonunun zayıf olmasıdır.


17

Kültür 20 ºC’ ye aktarıldığında, doymamış yağ asiti sentezinin indüklendiği

gösterilmiştir.

Bacillus megaterium kültürleri yüksek sıcaklıktan (35 ºC) düşük bir sıcaklığa

(20 ºC) aktarıldığında, membrandaki doymamış-yağ asitlerinin miktarı artar, çünkü

bakteriler 35 ºC’ de herhangi bir denatürasyon hareketliliği göstermezler. Bu olay

çok kısa bir sürede gerçekleşmektedir. Denatüranların sentezi 5 dakika içerisinde

başlar ve 15 dakikada maksimum oranına ulaşır. İnkübasyon sıcaklığı 20 ºC’ ye

düşürüldükten sonra 90 dakika süreyle yüksek oranda devam eder.

Bu “hiperindüksiyon” sürecinin kültürün farklı sıcaklığa transferinden sonra

başlayan protein sentezi ve RNA sentezi nedeniyledir. Bu düşünce 20 ºC’ de üretilen

fakat 35 ºC’ de gözlenmeyen sıcaklığa duyarlı modülatör proteinin kütlerden izole

edilmesiyle desteklenmiştir.

Ekstremophil organizmalar düşük veya yüksek sıcaklık (pisikrofil veya

termofil), ekstrem pH (asidofil veya alkalofil), yüksek veya düşük tuz

konsantrasyonları (halofiller) ve yüksek basınç (barofiller ve endolitler) gibi ekstrem

çevre koşullarında yaşamlarını sürdürmektedirler. Ekstrem çevre koşulları içerisinde

en iyi tanımlananların başında sıcaklık gelmektedir. Yeryüzünde sıcaklık kutup

bölgelerinde sıfır derecenin altında, hidrotemal bölgelerde ise suyun kaynama

noktasının üzerindedir. Böylece farklı ekolojik nişler mikroorganizmaların

üreyebilmeleri için minimum, optimum ve maksimum sıcaklıkların oluşmasını

sağlamaktadırlar.

Dünya biyosferinin % 85’ ten daha fazla bir kısmı, yılın büyük bir bölümünde

5 ºC’ den daha düşük sıcaklığa sahip olup, % 75’ ten daha büyük kısmı ise sürekli

soğuktur (yıl boyunca sıcaklık 5 ºC’ den daha düşük) (Baross ve Marita., 1978). Bu

yüzden psikrofil ve psikrotolerant bakteriler bakteriyel çeşitliliğin önemli bir

bölümünü oluştururlar. Bu organizmalar zor iklimsel koşullarda yaşayabilme

yetenekleri nedeniyle cold-adaptasyonun moleküler mekanizmasının anlaşılmasında

model organizmalar olarak kullanılmaktadırlar. Psikrofil organizmaların moleküler

biyoloji, biyokimya ve fizyolojilerinin anlaşılması, cold adaptasyon mekanizmasının

moleküler temeli üzerindeki esrar perdesinin kaldırılmasında yardımcı olabilir

(Nakagawa ve ark., 2002).


18

Bakterilerin üremeleri üzerine sınırlayıcı etki gösteren sıcaklık değerlerini

çizelge-1 deki gibi göstermek mümkündür.

Çizelge 1.1. Bakterilerin Üreme Sıcaklıklarına Göre Sınıflandırılması Üreme sıcaklığı (ºC)

Kategori Minimum Optimum Maksimum

Mezofil 10-15 30-40 45

Psikrofil ≤0 10-15 20

Psikrotolerant ≤0 20-25 30

Termofil 45 50-70 80

Hipertermofil 55 10-110 113

Bakterilerin cold-shock koşullarına karşı gösterdikleri tepki türden türe

değişiklik göstermektedir. Bununla birlikte hepsinde gözlenen ortak özellik

sıcaklıktaki değişikliğe bağlı olarak membran kompozisyonlarında ihtiyaca göre

düzenlemeler yapmak ve buna uygun protein sentezi gerçekleştirmektir.

Mikroorganizmaların non lethal cold shock koşullarına karşı oluşturdukları yanıtları

üç safhada gruplandırmak mümkündür.

Birinci safha ortama alışma olarak adlandırılır ve geçici cold shock cevabın

göstergesi olup bunun arkasından hemen cold shock yanıt ortaya çıkar. Üreme

hızının düşmesi nedeniyle bu aşamanın karakteristiği olan enzim aktivitesi ve

membran akışkanlığı azalır.

İkinci safhada hücreler üremeye başlar ve birinci aşamayla karşılaştırıldığı

zaman protein içeriğinde ileri modifikasyonlar görülür. Bu nedenle bu aşama aynı

zamanda cold adaptasyon fazı olarak adlandırılır.

Üçüncü safha stasyoner faz şeklinde adlandırılır ve hücreler protein içeriklerini

ileri düzeyde değiştirirler (Chintalapati ve ark., 2004).

Membran hücrenin iç ve dış ortamı arasındaki ayırıcı yapıdır. Bu yüzden

çevresel koşullardaki değişikliklerde ilk etkilenme membranın fiziksel yapısında

meydana gelmektedir. Membranın yapısındaki değişiklikler ve dinamik özelliği


19

özellikle solunum ve taşımada görevli membran proteinlerin fonksiyonunu

etkileyerek değiştirir. Organizma bütün bu değişikliklerin sonucunda çevredeki

değişikliklere uyum sağlar. Membran çevreyle hücre içi arasındaki ilk bariyer

olduğundan hücrenin değişikliklere uyum sağlaması ve canlılığını sürdürmesinde

önemlidir.

Bu nedenle, hücrenin yaşamının sürdürülmesinde hücre membranının fiziksel

durumu (membran akışkanlığı) ve modelinin iyi anlaşılmasına gereksinim vardır

(Chintalapati ve ark., 2004).

1.8.1. Bakterilerin Membran Lipidleri ve Yağ Asidi İçeriğinde Sıcaklığa Bağlı

Olarak Ortaya Çıkan Değişiklikler

Bazı organizmalarda çevre sıcaklığındaki değişikliğe yanıt olarak membran

lipid kompozisyonu değiştirilir ve bunun sonucunda membranın değişik

fonksiyonları için gerekli olan optimum membran akıcılığı sağlanmış olur. Bu durum

homeoviscos adaptasyon şeklinde adlandırılır. Son yıllarda yapılan çalışmalar bu

tanımın genel olmayıp genotipte meydana gelebilecek değişikliklere bağlı olarak

lipidlerde değişiklik olması nedeniyle organizmadan organizmaya değiştiğini

göstermiştir. Organizmanın genotipinde meydana gelen değişiklik termofil ve

psikrofil gibi bakterilerin ekstrem çevre koşullarında yaşamaya uyum sağlamalarına

yardımcı olur (Vigh ve ark., 1998). Membranın protein içeriği ve lipid gruplarının

değişmesiyle karotenoid tipi, yağ asidi zincirinin uzunluğu ve yağ asitlerindeki cis ve

trans oranları değişir.

1.8.2. Lipid Gruplarındaki Değişiklikller

Polar gruplardaki değişikliklerin frekansı daha düşük düzeyde olup membranın

lipid akışkanlığında daha az etkilidir. Bununla birlikte polar grupların büyüklüğü ve

elektriksel yükleri membranın çift tabakası içindeki gliserofosfolipidlerin

paketlenmesini etkileyebilir. Lipid gruplarının oranları Bacillus caldotenaxta

gözlendiği gibi çevre sıcaklığındaki farklılığa bağlı olarak değişebilir.


20

1.8.3. Karotenoidlerin Bileşimindeki Değişiklikler

Karotenoidler bakteri, alg, mantar ve bitkilerin büyük kısmında

bulunmaktadırlar. Zerkantin polar karotenoid özelliğinde olup, membrana beta-

karotenden daha fazla sertlik verdiği gösterilmiştir. İn vitro çalışmalar karotenoid

pigmentlerinin hücre membranı ile etkileşime girdiğini ve membranın sertliğini

artırdığını göstermiştir. Çok sayıda Antartik bakterinin membranlarında karotenoid

tipi pigmentler içerdikleri bulunmuştur. Bu pigmentlerin membranda yerleşerek

membran akışkanlığında tampon rolü oynadıkları ileri sürülmektedir. Çalışmalarda

membrandaki stabilitenin polar, akışkanlığın ise non polar karotenoidlerle sağlandığı

bulunmuştur. Antartik bakterilerde (Sphingobacterium antarcticus ve Micrococcus

poseus) karotenoid sentezinin üreme sıcaklığına bağlı olduğu, düşük sıcaklıklarda

polar karotenoid sentezinin arttığı ve bu nedenle membran stabilitesinde artış

meydana gelirken non polar karotenoid sentezinde düşme olduğu saptanmıştır

(Jagannatham ve ark., 2000).

Çizelge 1.2. Düşük Sıcaklığın Bakteri Membranında İndüklediği Değişiklikler

Bakteri ve Cyanobacter

Membranda Sentezlenen Yapılar

Optimum Üreme Sıcaklığı

1.Non polar karotenoidler

2.Uzun zincirli yağ asitleri

3.Düz zincirli yağ asitleri

4.Doymuş yağ asitleri

5.trans doymamış yağ asitleri

Düşük Sıcaklık

1.Polar karotenoidler

2.Kısa zincirli yağ asitleri

3.Dallanmış zincirli yağ asitleri

4.Doymamış yağ asitleri

5.cis-doymamış yağ asitleri


21

1.9. Elektroforez Uygulamaları

İyonlaşabilir gruplara sahip amino asitler, peptidler, proteinler, nükleotidler ve

nükleik asitler gibi önemli birçok biyolojik moleküller bir elektriksel alanda sahip

oldukları yüke bağlı olarak anod veya katoda göç ederler. Moleküller aynı yüke sahip

olsalar dahi, molekül ağırlık farklılığından dolayı sahip olunan yükün molekül

ağırlığına oranı (yük/kütle) farklı olacaktır. Bu farklılıklar sayesinde solüsyon

içindeki iyonlar bir elektriksel alana tabii tutulduklarında moleküllerin göçüne

yönelik oluşan temel elektroforezin prensibidir. Elektroforez için gereken gereçler

sadece bir güç kaynağı ve elektroforez ünitesinden oluşur.

Güç kaynağı elekroforez ünitesinde elektrodlar arasında doğru bir akım sağlar.

Elektriksel alanda sürekli güç arasındaki dengeye bağlı olarak katyonlar katoda (-) ve

anyonlar ise anoda (+) göç eder. Örnekler elektroforezin gerçekleşmesi için tampon

içinde çözülür veya süspanse edilmelidir ayrıca, ayırıcı ortam da (Destek matriks)

elektrik akımını iletmesi için tampon ile doyurulmalıdır. pH değişikliği, separasyonu

yapılan moleküldeki yükü de değiştirebildiğinden iyonizasyonun sabit tutulması

açısından tampon önemlidir.

Ayırıcı ortam absorban kağıdı, selüloz asetat, silika veya bir jel, nişasta, agar

ya da poliakrilamid gibi birçok farklı tipte olabilir. Her biri diğerlerine göre spesifik

seperasyonlar için farklı avantajlar sunar. Tüm ayırıcı ortamlar farklı özellikte

kapiller yapısı vardır. Doğal olarak elektroforez ayırıcı ortamın por çapından olumlu

ya da olumsuz olarak etkilenir. Bunlardan başka, tampon pH’ sı, ortam sıcaklığı,

uygulanan akım, ve zaman elektroforezde göç oranını etkileyen faktörlerdir. Örneğin

elektrodlar arasındaki akım genel olarak tampon iyonları ile az bir kısmı ise örnek

iyonları iletilir. Voltajdaki bir artış elektrodlara karşı iletilen saniyedeki toplam yükü

artıracaktır. İyonlarla gerçekleştirilen göç mesafesi hem akım hem de zamana göre

oransaldır.

Sıcaklık artışı elektroforez sırasında direncin düşmesine neden olur. Isı artışı

ayırıcı ortamdan solvent evaporasyonuna sebep olduğundan direncin düşmesi söz

konusu olacaktır. Elektroforezdeki göç yüzdesi örneğin net yükü arttıkça artacaktır.

Diğer taraftan molekül büyüklüğü arttıkça göç oranı düşecektir. Örnekler aynı


22

molekül büyüklüğüne sahip olsalar bile moleküllerin globüler ya da fibröz oluşu

farklı bir göç karakteristiği ortaya çıkaracaktır.

Elektroforez, kompozisyon ve konsantrasyondan kaynaklı olarak kullanılan

tampondan farklı yönde etkilenebilir. Yaygın olarak kullanılan tamponlar Format,

Asetat, Sitrat, Barbitat, Fosfat, Tris, Edta ve Piridin’ dir. Bu tür örnekle bağlanmayan

tamponlar göç oranını değiştirebilirken, karbohidratların seperasyonunda kullanılan

Borik Asit tamponu karbohidratlarla yüklü kompleksler oluşturduğu için bazı

durumlarda dezavantaj sağlayabilmektedir. Aynı şekilde tamponun iyonik gücü

artarsa, tamponun taşıdığı elektrik akımıda yükselecektir. Örneğin taşıdığı akım

paylaşımı ise düşecektir (Wilson ve Goulding, 1986).

1.9.1. Jel Elektroforezleri

Ayırıcı ortam olarak jellerin kullanılmaya başlanması, nükleik asit ve protein

gibi büyük moleküllü maddelerin seperasyonunda “düşük voltajlı ince tabaka

elektroforez” sistemlerinin devre dışı kalmasına sebep olmuştur. Suda çözünmez

olmaları, hidrofilik ve yarı-katı kolloid olmaları gibi fiziksel özelliklerinin katkısı

tercih edilmelerinde önemli olmaktadır. Nişasta, Agar ve poliakrilamid kullanılan jel

malzemeleri olup kullanmadan hemen önce hazırlanırlar.

Nişasta jeller, uygun tamponlar içerisinde kısmen hidrolize olmuş nişasta

karışımı ısıtılıp soğutularak hazırlanır. Nişastanın amilopektin bileşeni dallanmış

zincirlerinin sarılmaları ile yarı katı jelin oluşumu sağlar. Nişastanın bu moleküler

elek özelliği, nişastayı fizyolojik olarak aktif proteinleri ve kompleks yapısal molekül

karışımlarının seperasyonunda iyi bir tercih sebebi yapmaktadır.

Agar, ucuz, toksik olmayan, zararsız, bir malzeme olup iki galaktoz polimeri

olan agaroz ve agaropektinden oluşur. Agar kaynayan sıvı tamponlar içerisinde

çözünür ve yaklaşık 40 oC’ de jelleşir. Geniş por ölçülerine sahip olduklarında dolayı

elektroforez esnasında iyonların hareketi çok hızlı gerçekleşir. Böylece makro-

moleküllerin seperasyonuna da imkan tanır. Agar aynı zamanda seperasyon sonunda

boyama için çok uygun olup düşük difüzyon direnci sayesinde de immüno-


23

elektroforez ile antijenik proteinlerin tespiti için mükemmeldir. Saflaştırılmış agaroz

jel DNA ve nükleik asitlerin seperasyonu için yaygın olarak kullanılmaktadır.

Poliakrilamid jeller oldukça toksik sentetik bileşiklerle hazırlanır. Akrilamid

monomeri (CH2=CHCONH2) katalizör ve inisiyatör varlığında genellikle N,N-

metilenbisakrilamidin (CH2(NHCOCH=CH2)2) çapraz bağlanmaları ile polimerize

olurlar. Bunlar yeni hazırlanmış amonyum persülfat (AMPS) ve TEMED’ dir.

Moleküler oksijenin kimyasal polimerizasyonu inhibe etmesinden dolayı AMPS ve

TEMED’ in ilavesinden önce yani polimerizasyonun başlamasından önce degaz

işleminden geçirilmelidir.

Bu amaçla karışım vakum pompası ya da vakumlu desikatörde veya ultrasonik

su banyosunda 5 dakika bekletilir. Jelin dökümünden hemen sonra üst yüzeydeki

gerilim nedeniyle ortaya çıkan eğimli yüzey bantlaşmayı olumsuz yönde etkileyeceği

için ve de yüzeyin hava ile temasını önlemek için jelin üstüne çok ince bir su, su ile

doyurulmuş n-bütanol veya % 1’ lik SDS çözeltisinden biri ile eklenerek kapatılır.

Eğer jelin riboflavin ve TEMED varlığında foto-polimerizasyonu amaçlanıyor ise

oksijene ihtiyaç duyulur. Bazı durumlarda deterjan, enzim substratları ya da enzimler

jele polimerizasyondan önce tamponlar içerisine katılabilir (Wilson ve Goulding,

1986).

Akrilamid jel uygulamaları Kesiksiz (Continuous) ve Kesikli (discontinuous)

olmak üzere iki farklı şekilde gerçekleştirilebilir. Kesiksiz sistemde tek bir ayırıcı jel

vardır ve tanklarla jelde aynı tampon kullanılır. Kesikli sistemde ise jel farklı

tamponlarla hazırlanmış iki kısımdan oluşur. Büyük porlu stacking (denegeleme jeli)

ve küçük porlu separating (ayırıcı) jel şeklindedir.

Bir jelin porlarının büyüklüğü akrilamid monomerinin konsantrasyonu

oranlanarak belirlenebilir. Jeller mevcut akrilamidin toplam yüzdesi ile % 3 ila % 30

arasında bir konsantrasyonda hazırlanabilir. Düşük konsantrasyonlarda geniş por

büyüklükleri oluşurken büyük moleküllerin geçişinde daha az bir dirençle separasyon

gerçekleşecektir. Proteinlerin seperasyonu çoğunlukla % 5 ile % 15’ lik jellerde

gerçekleştirilmektedir. Benzer yüklere sahip olsalar bile farklı şekil ve büyüklükteki

moleküllerin analizinde çok uygun bir elektroforez tekniğidir.


24

Elektroforetik separasyon sonunda proteinler ya doğrudan jel üzerinde ya da

sabit bir yüzeye (örn: nitroselüloz veya naylon menbran) aktarıldıktan sonra saptanır

ve analiz edilir. Saptama amacıyla kullanılan en genel yöntem jel üzerinde

boyamadır. Jeldeki proteinler genellikle Coomassie Brillant Blue veya Gümüş Nitrat

ile; filtreye emdirilmiş proteinler ise Amido Black, India ink, Ponceau S gibi

boyalarla boyanır. Boyama sonunda ayrılmış proteinler, jel ya da membran üzerinde

bantlar şeklinde görünür hale gelirler. Herhangi bir yöntemle boyanmış protein

bantlarının bulunduğu jel çeşitli çözeltiler içinde birkaç ay veya jel kurutma aletinde

kurutulduktan sonra yıllarca saklanabilir.

Ancak görüntünün kalıcı olması açısından en pratik yol fotoğrafının

çekilmesidir. Ayrıca görüntünün bir bilgisayar ortamına aktarılması veya

spektrofotometrik ölçüm temeline dayanan bir densitometre ile analiz etmek

gerekebilir. Bu temele göre çalışan ve renkli bölgelerin jeldeki konumunu ve alanını

standartlarınkilerle karşılaştıran jel görüntüleme sistemleri günümüzde geniş bir

kullanım alanı bularak nitel analiz yanı sıra nicel analiz yapmak da mümkün

olmaktadır (Temizkan ve Arda, 2004).

Proteinlerin elektroforez uygulamalarında farklı amaçlar güdülerek Denatüre

veya Native (Doğal) jel elektroforezi olmak üzere iki şekilde gerçekleştirilir.

Denatüre jeller SDS veya üre gibi örneklerin denatürasyonu ile gerçekleştirilir. Bu

tür uygulama başta molekül ağırlık belirlenmesi olmak üzere, proteinlerin

saflıklarının araştırılması, konsantrasyonlarının tanımlanması, enzim aktivitelerinin

belirlenmesine imkan verir.

1.9.2. Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE)

Proteinlerin molekül ağırlıklarını belirlemede en yaygın olarak kullanılan

poliakrilamid jel elektroforez tipidir. Sodyum dodesil sülfat (SDS) bir anyonik

deterjan olup proteinlere sıkıca bağlanarak proteinlerin denatürasyonunu sağlar.

Yaklaşık 1 gr protein başına 1.4g SDS varlığında proteinler birim kütle başına sabit

negatif bir yük kazanırlar. Yani protein molekülünde her üç aminoasitlik birime

bağlanarak proteinlere homojen negatif bir yük kazandırır. Böylece proteinler yük


25

bakımından eşitlendiği için moleküler ağırlıklarına göre separasayonları

geçekleşecektir.

Oluşan SDS-protein kompleksi elektroforez sırasında anoda doğru hareket

kazanırlar. Jelin moleküler elek özelliğinden dolayı belirli bir sürede katettikleri

mesafe moleküler ağırlığa göre proteinden proteine farklılık gösterecektir. Eğer

moleküler ağırlığı bilinen standart bir protein de aynı ortamda yürütüldüklerinde

örnek proteinlerin moleküler ağırlıkları belirlenebilir.

Standart SDS-PAGE’ ler anodun aşağıda olduğu bir şekilde dikey olarak

yürütülürler. Protein örnekleri genellikle pH’ sı 6-8 olan tris tamponları içinde

çözülür. Bu tamponlar denatüran olarak SDS, disülfit bağlarını indirgeyen β-

merkaptoetanol, yoğunluk verici olarak sükroz veya gliserol, iz boyası veya marker

olarakta bromfenol mavisi içerir.

Separasyonun gerçekleştirileceği jel genellikle Stacking (Dengeleme) ve

Separating (ayırma) jeli olarak iki kısımdan oluşur. Bunlar akrilamid

konsantrasyonları bakımından birbirlerinden farklıdır. Bu iki jeldeki pH ve

konsantrasyon farklılığı sayesinde, proteinlerin rezolüsyonu artırılır, elektriksel

akımdan dolayı yönlendirme ve hareket kazandırılarak separatin jeldeki bantlaşma

artırılır.

SDS-Page uygulamalarının diğer bir şekli gradient jellerdir. % 5 ila % 25

arasında kademeli olarak değişen konsantrasyon ile giderek küçülen por büyüklükleri

elde edilir. Bu sayede proteinlerin daha yüksek bir oranda bantlaşmaları sağlanır.

Jeldeki gradient ise yüksek ve düşük akrilamid konsantrasyonlu solüsyonlarının bir

gradient mikseri sayesinde cam plakalar arasına dökülmesi ile sağlanır. Bu gradient

ortamında protein karışımları daha yüksek bir separasyon etkinliği ile büyüklük

farklılıklarına göre ayrışırlar.

İki boyutlu (2-dimesional) jeller ise kompleks protein karışımlarını yüksek bir

resolüsyon oranı ile ayrılmalarını sağlar. Örnekler önce izoelektrik fokuslama ile

izoelektrik nokta farklılıklarına göre kısmen separe edilirler. Sonra SDS jel

elektroforezi ile stacking jel boyunca separasyona tabii tutularak moleküler

büyüklüklerine göre ayrıştırılırlar.


26

İzoelektrik Fokuslama (IEF) tekniğinde aminoasitler ve peptidler gibi

amfoterik maddeler hem voltaj hem de pH gradientinin olduğu bir alanda

separasyonları sağlanır. Bu yöntemde jel boyunca bir pH gradienti oluşturmak için

izoelektrik noktaları belli olan düşük moleküler ağırlıklı amfolitler kullanılır. Belli

pH aralıkların ortaya koyan bu karışımlar sentetik alifatik poliamino polikarboksilik

asit yapısındadırlar. Anod ile düşük pH gradienti aynı tarafta olurlar.

Başlangıçta izoelektrik noktalarının altında bir pH’ da bulunan maddeler,

pozitif olarak yüklenecekler ve katoda doğru ilerleyeceklerdir. İzoelektrik nokta

değerine bağlı olarak çevresel pH’ sı kademeli olarak yükselecektir. Sonra belirli bir

noktada net yükün yok olduğu yani zwitterion formunda daha fazla bir hareket

gösteremeyecektir. Diğer taraftan zıt reaksiyon izoelektrik noktasının üzerinde bir

pH’ da bulunan maddeler de negatif yük kazanarak net yüklerinin dengede olduğu

ana kadar anoda doğru hareket ederler. Bu teknik izo enzim separasyonunda oldukça

kullanışlıdır. İzoelektrik noktalarındaki 0,01 pH ünitelik farklılık separasyonları için

yeterlidir.

Bu çalışmada, buzdolabında saklanan (4 °C) ürünlerden ve mezofil ortamdan

izole edilecek Pseudomonas sp. suşlarına ait hücresel proteinler SDS-PAGE

ortamında analiz edilerek, organizmalarda farklılık gösteren protein yapılarının

moleküler ağırlıklarına göre saptanması amaçlanmaktadır

Pseudomonas cinsi bakteriler gıda endüstrisinin en başa bela bakterileridir.

Besinlerde bozulmaya neden olan soğuk şoku proteinler bakterilerde ortaya

çıkarılırsa gıdalarda, özellikle süt endüstrisinde daha uzun bir raf ömrü elde

edilebilir.

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Zuhal ÜZÜMCÜ

27

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR

Zhao ve Yeo.,(2006), Pseudomonas alcaligenes NCIMB 9867’ de genistasın

varlığında ve yokluğunda P25X hücrelerinin 32 ºC veya 42 ºC’ de üretildiği zaman

yeni Hsp 100, Hsp 90, Hsp70, Hsp60, ve Hsp 45, ile küçük ısı şok protein ailesine ait

olan toplam 19 şok proteini tanımlamışlardır. Bu proteinler arasında 16 Hsps

genellikle 42 ºC’ lik inkübasyon sonunda gözlenmiştir.

Perin ve ark., (1999), ortam sıcaklığının 42 ºC’ den 15 ºC veya 20 ºC’ ye

düşürülmesi ile Streptococcus thermophilus’ un soğuk şok duyarlılığını

araştırmışlardır. Hücrelerin 15 ºC’ de 20 ºC’ dekinden daha çok etkin ürediğini

bulmuşlardır. S. thermophilus’ un optimum ürediği sıcaklık ile cold shock

koşullarında sentezlemiş olduğu proteinler iki boyutlu elektroforezde analiz edilerek

karşılaştırılmış ve 21.5 ile 7.5 kDa ağırlığındaki proteinlerin cold shock koşullarında

sentezlendiklerini saptamışlardır.

Khan ve ark., (2003), Pseudomonas flourescens MTCC 103 ve mutant suşu

Pseoudomonas flourescens CRPF, 4, 10, 20, 30 ve 37 ºC’ lik sıcaklıklarda

üretilmişlerdir. Elektron mikroskobi analizlerinde Pseudomonas flourescens MTCC

103 ve mutant suş CRPF’ de morfolojik değişimlerini gözlemlenmişlerdir.

Imbert ve Gancel., (2003), Psikrotropik bakteri olan Aeromonas hydrophila

7966 suşunu, 30 ºC’ de ürettikten sonra sırası ile 20 ºC, 15 ºC, 10 ºC ve 5 ºC’ lerde

soğuk şoka maruz bırakmışlardır. İki boyutlu elektroforez analizlerinde bazı

proteinlerin sentezinin azaldığı, buna karşılık çok sayıda yeni protein sentezlendiğini

saptamışlardır. Moleküler ağırlığı 11 kDa olan proteinin cold shock yanıtın

oluşmasından sorumlu olduğu belirtilmiştir.

Horton ve ark., (1998), Salmonella typhimurium LT2 suşuna ait kültürün 37

ºC’ den 5 ºC ve 10 ºC’ ye transfer edildikten sonra üremede yaklaşık 12 saatlik bir

gecikmenin gerçekleştiğini belirtmişlerdir. Analiz sonunda 37 ºC’ de moleküler

ağırlığı 7,4 kDa olan cold shock proteinin çok düşük miktarlarda sentezlenmiştir.

Salmonella typhimurium kültürlerinin 10 ºC ve 5 ºC’ de inkübe edilmesi sonunda 105

kDa ağırlığında yeni bir protein sentezlenirken, 6 proteinin sentezi önemli miktarda

azalmıştır.


28

Richter ve Hecker (1986), yaptıkları çalışmalarda Bacillus subtilis rel A- ve rel

A+ suşları ile yaptıkları çalışmalarda ısı şoku uygulamasıyla çeşitli proteinlerin

sentezinin arttığını belirlemişlerdir. İnkübasyon sıcaklığı 52 ºC’ ye yükseltildiği

zaman hücresel protein sentezinin inhibe olduğu, buna karşılık ısı şoku proteinlerin

korunduğu görülmüştür. Sıcaklığın 37 ºC’ den 52 ºC’ ye çıkarılmasıyla 66 kDa

ağırlığındaki proteinin sentezlendiği tespit etmişlerdir.

Ritchker ve Hecker, (1986), Qorofleh ve Streips, (1987), Miller ve ark., (1991),

Bernardt ve ark., (1997), Browne ve Dowds, (2001), Periago ve ark., (2002), Isı

stresi ile yapmış oldukları çalışmalarda ısı stres proteinlerini tanımlayabilmek için iki

boyutlu PAGE sistemini kullanmışlardır.

Mezofilik organizmalar için 10-15 ºC’ lik sıcaklık aralığı cold shock olarak

adlandırılır. Buna karşılık antarktik mikroorganizmalar, donma sıcaklığındaki soğuk

çevrede koşullarında sürekli yaşadıkları için bu konuda çok daha az çalışılmışlardır.

Antarktik organizmalarla gerçekleştirilen 0-4 ºC aralığında çalışmaların cold shock’

u tam olarak ifade ettiği açık değildir. Bu nedenle genetik ve biyokimyasal çalışmalar

yapılarak, düşük sıcaklıkta üreyen organizmaların temel biyolojik özelliklerinin

ayrıntılı olarak öğrenilmesi önemlidir (Graumann ve ark., 1996).

E.coli’ de Cold Shock’ un protein sentezi ve üreme üzerine olan etkisi de

araştırılmıştır. Sıcaklık 37 ºC’ den 10 ºC’ ye düşürüldükten sonra 14 farklı proteinin

sentezi hızla artış gösterirken bakteriler 4 saat süreyle üremelerini durdurmuşlardır.

Bu süreçte sentezlenen proteinler cold shock proteinler (Csps) olarak

adlandırılmışlardır. Bu proteinler başlangıçta sentezlenen heat shock proteinlerden

(Hsps) tamamen farklıdırlar (Grumann ve ark. 1996).

Imbert ve ark. (2004), psikrofil Aeromonas hydrophilia’ da 30 ºC’ de çok az

proteinin eksprese edilmesine karşılık, 20, 15, 10 ve 5 ºC’ de tamamen yeni

proteinlerin ortaya çıktığını ve çok daha fazla sayıda protein sentezinin

gerçekleştiğini belirtmişlerdir.

Phadtare ve ark., (1999), Psikrotrophik bakteri olan Pseudomonas fragi’ de

sıcaklık 30 ºC’ den 20 ve 5 ºC’ ye düşürüldüğü zaman lag faz boyunca 20 ºC’ de 25,

5 ºC’ de 17 farklı proteinin sentezlendiği saptanmışlardır.


29

E.coli 37 ºC’ de optimum üreme gösterdiği halde 10-15 ºC’ lik ortamda

üretildiği zaman 12’ den fazla yeni protein sentezi gerçekleştirmiştir. Bu proteinler

cold shock proteinler olarak adlandırılmış ve organizmanın düşük sıcaklık

koşullarına uyum sağlamasında gerekli oldukları belirtilmiştir (Feller ve ark., 1996).

Listeria monocytogenes gıda patojeni olup, buzdolabı sıcaklığında ürer.

Organizma 37 ºC’ den 5 ºC’ ye alındığında, 30, 60 ve 120 dakikalık inkübasyon

sonunda, moleküler ağırlıkları 48600, 41000, 21800, 21100, 19700, 19200, 18800,

18800, 17200, 15500, 14500 ve 14400 Da olan 12 cold shock proteinin sentezlendiği

saptanmıştır. Şok periyodunda önemli hücresel proteinlerin sentezinin 37 ºC’ den

daha az olduğu gözlenmiştir (Bayles ve ark., 1996).

Stres yanıtı düşük sıcaklıkta çok daha aktiftir. Bunun nedeni bu sıcaklıkta cold

shock protein (Csp) olarak adlandırılan proteindeki hedef bölgenin, soğuk

koşullarına bağlı olarak transkripsiyon ve translasyon seviyesinin etkilenmesidir

(Khan ve ark., 2003).

Michel ve ark., (1997) Protein sentezinde çeşitliliğin önemli kısmının 60

dakikalık inkübasyon sonunda gerçekleştiği belirtilmiştir. Örneğin 20 ºC’ de

sentezlenen 29 proteinden 15’ i, 30 ºC’ de sentezlenen 37 proteinden 24’ ünün,

sıcaklık 5 ºC’ ye düşürüldüğünde ilk bir saat (60 dakika) içerisinde sentezlendiğini

saptamışlardır.

3. MATERYAL METOD Zuhal ÜZÜMCÜ

30

3. MATERYAL VE METOD

3.1. Materyal

Bu araştırmada cold shock protein izolasyonu için Çukurova Üniversitesi

Balcalı Hastanesi Merkez Laboratuarından alınan Pseudomonas cinsi

mikroorganizmalar ve Pseudomonas ATCC 27853 suşu kullanılmıştır.

3.1.1. Bakteri İzolasyonu ve İdentifikasyonunda Kullanılan Besiyeri

3.1.1.1. GSP Agar Besiyeri

Glutamate Starch Phenol Red olarak da adlandırılır. Her türlü yiyecek

maddesinde Pseudomonas ve Aeromonas’ ın selektif olarak üretilmesi amacı ile

kullanılır. 1969 yılında Kielwein isimli araştırmacı tarafından bulunmuştur.

Bileşimi

Sodyum Glutamat 10

(g/L)

Nişasta 10

KH2PO4

MgSO

2

4.7H2

Fenol kırmızısı 0,036

O 0,5

Agar 12

Otoklavda 121 ºC’ de 15 dakika süre ile sterilize edilir. Otoklav sonrası 50 ºC’

ye soğutulur ve önceden Pasteur fırınında 175 ºC’ de 2 saat süreyle steril edilmiş olan

petri kutularına dökülür (Anonymous, 1978).


31

3.1.1.2. N1 Besiyeri

Saf kültür olarak seçilmiş bakteri suşlarının çoğaltılması amacıyla

kullanılmıştır (Anonymous, 1978).

Bileşimi

3.1.2. Kullanılan Çözeltiler

(g/L)

Pepton 10

Et Özütü 10

Maya 5

Glikoz 1

Agar 15

Distile su 1000 ml

pH=7.0’ a ayarlanmış olarak, otoklavda 121 ºC’ de, 1.2 atmosfer basınçta 15

dakika steril edilir.

3.1.2.1. Solusyon I (Bakteri hücre duvarının yıkılması için kullanılmıştır)

Bileşen Miktar

Glikoz 50 mM

Trisma-Base 25 mM

EDTA 10 mM

Distile su 100 ml

Otoklavda 121 ºC’ de 15 dakika steril edilir ve + 4 ºC’ de saklanır. Solusyon I’

in içine kullanacağı zaman son konsantrasyonu 5 mg/ml olacak şekilde lizozim

enzimi karıştırılır (Manniatis ve ark., 1982).


32

3.1.2.2. Örnek Hazırlama Çözeltisi (Duvarsız bakterilerin patlatılması sonucu

oluşan protein yapılarının denatürasyonu için kullanılmıştır)

Bileşimi

3.1.3. SDS-PAGE İçin Kullanılan Çözeltiler

(g/L)

Tris Buffer (pH: 6,8) 0,6 ml

Gliserol % 50 5 ml

Β-merkaptoetanol 0,5 ml

Brom Fenol Mavisi (%1) 1 ml

Distile su 2,9 ml (Bollag ve Eldestein, 1991)

3.1.3.1. Akrilamid Monomer Solüsyonu (Sol-A)

% 30 w/v Akrilamid,,% 0,8 w/v bis-akrilamid ve distile su karışımından

hazırlanır (Bollag ve Eldestein, 1991).

Bileşen Miktar

Akrilamid 29,2 gr

Bisakrilamid 0,8 gr

Distile su 100’ ye tamamlanır.

Yukarıdaki miktarlarda tartılan akrilamid ve bis-akrilamid bir miktar distile su

içerisinde çözüldükten sonra, son hacmi distile su ile 100 ml’ ye tamamlanarak

hazırlanır. Hazırlanan çözelti koyu renkli şişeye konularak buzdolabında saklanır

(Bollag ve Eldestein, 1991).


33

3.1.3.2. 4x Separating (Ayırma) Jel Tamponu (Sol-B)

Bileşen

3.1.3.3. 4x Stacking (Dengeleme) Jel Tamponu (Sol-C)

Miktar

Tris-HCl 2M (pH: 8,8) 75 ml

SDS (% 10 w/v) 4 ml

Distile su 21 ml (Bollang ve Eldestein, 1991)

Not: +4 ºC’ de buzdolabında saklanır.

3.1.3.4. Yürütme Tamponu (pH: 8,3)

Bileşimi (SDS’ li)

Tris-HCl 1M (pH: 6,8) 50 ml

SDS (% 10w/v) 4 ml

Distile su 46 ml (Bollang ve Edelstein., 1991)

SDS-PAGE jellerinde proteinlerin seperasyonu sırasında yürütme (running)

tamponu olarak kullanılmıştır.

Bileşimi

Trisma base (25 mM) 3 gr

Glisin (192 mM) 14,4 gr

SDS (% 10 w/v) 1 gr

Önce bir miktar distile suda çözülür ve pH: 8,3’ e ayarlanıp son hacim distile

su ile 1 litreye tamamlanır (Bollag ve Eldestein, 1991).


34

3.1.3.5. Ayırma (Seperating) Jeli (%10’ luk)

Bileşen Miktar

3.1.3.6. Ayırma (Seperating) Jeli (% 12’ lik)

Sol- A 6,5 ml

Sol-B 5 ml

Distile su 8,4 ml

AMPS 66 µl

TEMED 13 µl (Bollag ve Eldestein, 1991)

Not: AMPS ve TEMED çözeltiye eklenmeden önce, karışıma 5 dakika süreyle

degaz işlemi uygulanarak moleküler oksijenin uzaklaştırılması işlemi yapılır

Bileşen

3.1.3.7. Dengeleyici (Stacking) Jel

Miktar

Sol-A 7,8 ml

Sol-B 5,0 ml

Distile su 6,2 ml

AMPS 66,0 µl

TEMED 13,0 µl

Bileşen Miktar

Sol-A 1 ml

Sol-C 1,5 ml

Distile su 3,5 ml

AMPS 20 µl

TEMED 7 µl (Bollag ve Eldestein, 1991)


35

3.1.3.8. Jel Boyama Solüsyonu (CBB R-250, Coomassie Brillant Blue)

SDS-PAGE jellerinin Elektroforezden sonra boyanması ve protein bantlarının

görünür hale gelmesi amacıyla kullanılmıştır.

Bileşimi

3.1.3.9. Jelden Boyayı Uzaklaştırma Solüsyonu (Destaining)

% (v/v)

Coomassie Blue R-250 0,1 (w/v)

Metanol 41,7

Glasial Asetik Asit 16,7

Distile su 41,6 (Bollag ve Edelstein, 1991).

SDS-PAGE jellein CBB R-250 ile boyandıktan sonra jeldeki boya fazlasının

geri alınarak, bantların netleşmesi amacıyla kullanılmıştır.

Bileşimi

Distile su 60 (Bollag ve Edelstein,1991)

% (v/v)

Metanol 30

Glasial Asetik Asit 10

3.1.3.10. AMPS Çözeltisi

%10 konsatrasyonda hazırlanır. Kullanılmadan hemen önce hazırlanmalıdır.

(Bollag ve Edelstein., 1991).

3.1.3.11. TEMED (N,N,N’N’-tetramethylenediamine)

PAGE yönteminde kullanılır. Polimerizasyonda katalizör olarak görev yapar.

(Bollag ve Edelstein., 1991).


36

3.2. Metod

3.2.1. Bakteri Stok Kültürlerin Hazırlanışı

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) ATCC 27853 ve Çukurova

Üniversitesi Merkez Laboratuarından alınan P. aeruginosa suşları GSP Agar

besiyerine tek koloni oluşturacak şekilde ekilerek 37 ºC’ de 24 saat inkübasyon

gerçekleştirilmiştir. Besiyerinde üreyen mor-menekşe görünümlü koloniler aynı

besiyerine çizgi şeklinde ekilerek stok kültür elde edilmiştir. Daha sonra N1 Sıvı

besiyerine GSP Agarda çizgi ekimle üretilmiş olan Pseudomonas suşlarından

alınarak ekim yapılmış ve 200 rpm de 30 ºC’ de çalkalamalı etüvde inkübasyona

bırakılmıştır (Anonymous, 1978).

3.2.2. Bakterilerin Tanımlanmaları

Çukurova Üniversitesi Hastanesi Merkez Laboratuarından alınan Pseudomonas

sp. örnekleri API 20 E identifikasyon kiti kullanılarak tanımlanmıştır. Tanımlamanın

doğruluğunu kontrol etmek için P. aeruginosa ATCC 27853 suşu kullanılarak API

20 E testi ile tanımlama yapılmış ve yaban tip örnekler (P. aeruginosa balcalı-1 ve

balcalı-2) ATCC suşu ile karşılaştırılmıştır.

3.2.3. Soğuk Şoku Protein İzolasyonu İçin Bakterilerin İnkübasyon Koşulları

Soğuk Şok Protein üretimi için 20, 10 ve 5 ºC’ lik sıcaklıklar seçilmiştir. Bu

sıcaklık değerlerinde 60 ve 480 dakika süreyle inkübasyon gerçekleştirilmiştir.

Kontrol olarak soğuk şoku protein üretimi için kullanılan bakteriler 37 ºC’ de aynı

sürelerle üretilmişlerdir. Soğuk Şok Protein izolasyonu için Balcalı Hastane Merkez

Laboratuarından alınan iki P. aeruginosa suşu ile P. aeruginosa ATCC 27853 suşu

37 ºC’ de N1 besi yeri kullanılarak bir gece üretilmişlerdir (Horton ve ark., 2000).

Bir gecelik kültürden (37 ºC’ de üretilmiş) bakteri örnekleri 1 ml miktarda 9 ml

N1 buyyon besiyerine aktarılarak önceden belirlenen ortamlara konulup, inkübasyon


37

gerçekleştirilmiştir. Altmış dakikanın sonunda örnekler alınarak 6000 devir/dk ve +4

ºC’ lik sentrifüjde çöktürülerek bakteriler besiyerinden uzaklaştırılmıştır.

İnkübasyona devam eden örnekler 480 dakikanın sonunda alınarak çöktürülüp

bakteri pelletleri elde edilmiştir. Aynı işlemler kontrol örneği içinde yapılmıştır (37

ºC’ de üretilen örnekler 60 ve 480 dakika sonunda alınarak çöktürme işlemi sonunda

bakteri elde edilmiştir).

Çizelge 3.1. Cold shock protein üretim uygulama sıcaklık ve süreleri Örnek Kont. İnkübasyon sıc. İnk.s. Kont. İnkübasyon sıc. İnk.s.

P.aeruginosa

ATCC27853

37 ºC 5ºC 10 ºC 20 ºC 60 dk 37 ºC 5ºC 10 ºC 20 ºC 480 dk

P.aeruginosa

Balcalı-1


P.aeruginosa

Balcalı-2


3.2.4. Protein İzolasyonu

Farklı sıcaklıklarda üretilip çöktürülerek elde edilen bakteri pelletlerinin

üzerine 2 ml Sol-1 çözeltisi eklenerek 37 ºC 60 dakika inkübasyon

gerçekleştirilmiştir. Örnekler 2000 rpm ve +4 ºC’ de 10 dakika süreyle

çöktürülmüşlerdir. Üst faz temiz bir tüp içerisine aktarılarak sıvıdaki protoplast

yapılarının çöktürülmesi için 8000 rpm ve +4 ºC’ de 10 dakika sentrifüj edilmiştir.

Üst faz dökülerek protoplastların patlatılması amacıyla örneğin üzerine 2 ml distile

su eklenmiş ve -33 ºC de 60 dakika dondurma, 70 ºC de 60 dakika çözme uygulaması

yapılmıştır. Bu işlem her örnek için üç kez tekrarlanmıştır.

Dondur/çöz yöntemiyle patlatılan örneğin üzerine örneğin eşit hacımda soğuk

etanol ilave edilerek -33 ºC’ de bir gece bekletilmiştir. Örnekler +4 ºC’ de 20 dakika

10000 rpm de çöktürülerek üst faz atılmış ve total protein eldesi gerçekleştirilmiştir.


38

Her bir tüpe 200 µl örnek tamponu ilave edilerek örnekler süspansiyon haline

getirilmiştir. Hazırlanan örnekler 100 ºC 5 dakika kaynatılarak proteinler denatüre

edilmiş ve 10000 rpm’ de 10 dakika süreyle +4 ºC’ de sentrifüj edilmişlerdir. Üst faz

temiz bir ependorf tüpüne alınarak elektroforez analizlerinde kullanılmışlardır

(Maniatis ve ark. 1982).

3.2.5. Poliakrilamid Jel Elektroforezinde (PAGE) Moleküler Ağırlık ve

Zymogram Analizi

Soğuk şok proteinlerin moleküler ağırlıkların saptanması için SDS-PAGE jel

sistemi kullanılmıştır ( Laemmli,1970).

PAGE uygulamasında dengeleme ve ayırma jeli olmak üzere, yoğunlukları

farklı iki ayırma ortamının birlikte kullanılması söz konusudur. Jel oluşturulması

sırasında uygun şekilde hazırlanmış cam plakalar kullanılır.

PAGE sisteminde ayırıcı jelin konsantrasyonu analiz edilecek örneğin yaklaşık

moleküler ağırlığına göre farklılık gösterirken, dengeleme jelinin konsantrasyonu

sabittir. Hazırlanan jel karışımlarından ayırıcı jel örneğin asıl analiz edildiği yapı

olup, enzim çalışmalarında genellikle % 10-12 konsantrasyonda kullanılır.

Dengeleme jeli, ayırıcı jelin üstünde yer alır ve örneklerin yüklenmesi için

tarak gözlerinin oluşturulduğu bölümdür. SDS-PAGE sisteminde jelde denatüre edici

ajan olarak SDS bulunur.


39

3.2.5.1. Moleküler Ağırlık Analizi İçin SDS-PAGE Sisteminin Hazırlanması

Çizelge 3.2. % 12 lik SDS-PAGE jeli için gerekli miktarlar Solüsyonlar Miktar

Sol A 6,5 ml

Sol B 5,0 ml

Distile Su 8,4 ml

AMPS (%10) 66 µl

TEMED 13 µl

Sol A, Sol B ve distile su çizelgede ( çizelge 3.2) belirtilen miktarda alınarak

şişe içerisine konur, moleküler oksijenin uzaklaştırılması için 5 dakika vakum

pompası ile degaz işlemi gerçekleştirilir, örneğin üzerine uygun miktarda yeni

hazırlanmış AMPS çözeltisi ve TEMED ilave edildikten sonra cam plakalara

dökülür.

Jelin üst yüzeyi atmosferik oksijenin difüzyonunu önlemek ve düzgün bir

tabaka elde etmek amacı ile ince bir su tabakası ile kapatılarak oda sıcaklığında

polimerizasyona bırakılır.

Çizelge 3.3. Dengeleyici Jelin Bileşimi

Solüsyonlar Miktar

Sol A 1,5 mL

Sol C 2,25 mL

Distile Su 5,25 mL

AMPS (%10) 30 µL

TEMED 7,5 µL

Ayırma jelinin polimerizasyonu tamamlandıktan sonra jelin üst yüzeyindeki

distile su atılarak, üzerine uygun hacımda dengeleme jeli dökülür. Jele örnek sayısına


40

uygun tarak yerleştirdikten sonra, oda sıcaklığında polimerizasyona bırakılır. Jelin

hazırlamasında izlenecek yol ayırma jeli ile aynıdır (Bollag ve ark,1996).

3.2.5.2. Enzim Örneklerinin PAGE’ ne Yüklenmesi ve Yürütülmesi

Polimerize olmuş jeldeki tarak, oluşan örnek yükleme gözlerini yırtmadan

çıkarılır ve örnek yükleme tamponu ile karıştırılmış protein örnekleri ceplere 15-30

µL arasında gözlere doldurulur. Jel uygulaması SDS-PAGE ise örnek yükleme

tamponu ile 1/3 oranında karıştırılan protein örnekleri yüklemeden önce 2 dakika

kaynatılarak tam bir denatürasyon sağlanır. Elektroforez işlemi sonunda moleküler

ağırlıkları doğru saptamak için gözlerden birine içeriği ve moleküler ağırlığı bilinen

protein standart’ı (marker) konur.

Örnek yükleme işlemi tamamlandıktan sonra elektroforez uygulaması

başlatılır. Örnekte bulunan izleme boyası ayırma jeli içine girinceye kadar yaklaşık

30 mA, daha sonra 20 mA akım uygulanır. İzleme boyası jelin diğer ucuna 2 cm

uzaklığa ulaştığı zaman elektroforez işlemi sonlandırılır (Laemmli, 1970; Bollag ve

ark,1996).

3.2.5.3. SDS-PAGE Jelinin Boyanması ve Boyanın Geri Alınması

Elektroforezden sonra jel, cam plakalar arasından çıkarılarak Boyama

solüsyonuna (Staining) konulur. Yaklaşık 12 saat boyunca boyama solüsyonu içinde

bırakıldıktan sonra birkaç kez saf sudan geçirilir ve jele bağlanmış fazla boyanın

uzaklaştırılması için bir gece boyayı geri alma çözeltisinde inkübasyon

gerçekleştirilir. Protein örneklerine bağlanan boya jelden çıkmadığı halde jelin diğer

bölgelerindeki boya ortamdan uzaklaşır ve örnekler görünür hale gelirler (Laemmli,

1970; Bollag ve ark.,1996).

4. BULGULAR VE TARTIŞMA Zuhal ÜZÜMCÜ

41

4. BULGULAR VE TARTIŞMA

Canlı sistemlerin çevresel değişikliklere adaptasyonu evrimin anahtarı olup,

biyotik ve abiyotik stres koşulundan herhangi birisine karşı yanıt olarak ortaya

çıkmaktadır. Değişik koşullar arasında sıcaklık doğrudan hücrenin iç dengesini

(üreme, fizyoloji ve ozmolarite gibi) etkilediği için özellikle ilginçtir.

Düşük sıcaklık değerleri, besin alımı, protein sentezinin değişmesi ve

sitoplazmik membran ile ribozomu doğrudan etkilemesi nedeniyle, bakterinin

üremesi üzerinde derin bir etkiye sahiptir (Thieringer ve ark., 1998).

Stres yanıtı düşük sıcaklıkta çok daha aktiftir. Bunun nedeni bu sıcaklıkta cold

shock protein (Csp) olarak adlandırılan proteindeki hedef bölgenin, soğuk

koşullarına bağlı olarak transkripsiyon ve translasyon seviyesinin etkilenmesidir

(Khan ve ark., 2003).

Çalışmada birisi ATCC suşu, diğerleri hastane laboratuarından izole edilmiş ve

API 20 E test kiti kullanılarak adlandırılmış üç (3) P. aeruginosa suşundan soğuk

şoku proteinler izole edilerek, SDS-PAGE sisteminde analizleri yapılmıştır. Elde

edilen bulgular şekil-4.1, 4.2 ve 4.3 ile çizelge-4.1, 4.2 ve 4.3’te gösterilmiştir.

P. aeruginosa ATCC 27853 numaralı suştan 5, 10, 20 ve 37 ºC’ lerde 60 ve

480 dakika süreyle inkübasyon yapılarak izole edilen soğuk şoku proteinleri % 12

konsantrasyona sahip SDS-PAGE jelinde analiz edilmiş, çizelge-4.1 ve şekil-4.1’ de

gösterilen farklı moleküler ağırlıklara sahip protein fraksiyonları elde edilmiştir.


42

Çizelge 4.1.P. aeruginosa ATCC 27853 suşuna ait cold shock proteinlerin % 12’ lik SDS-PAGE jelinde oluşan protein profilleri

60 Dakika 480 Dakika

Marker 37 ºC 5 ºC 10 ºC 20 ºC 5 ºC 10 ºC 20 ºC

68000 Da 97140 Da 18133 Da 90660 Da 90660 Da 85000 Da 90660 Da 30220 Da

85000 Da 80000 Da 85000 Da 75550 Da 85000 Da 17430 Da

75550 Da 71570 Da 75550 Da 18130 Da 75550 Da 17000 Da

17210Da 20000 Da 20920 Da 17000 Da 18130 Da

15632 Da 18130 Da 18130 Da 17000 Da

15111 Da 16790 Da 17000 Da

15110 Da

14620 Da

P. aeruginosa ATCC 27853 numaralı standart suş ile yapılan çalışmalar

sonunda inkübasyon süresinin 60 dakika uygulandığı dönem incelendiği zaman;

İnkübasyon sıcaklığı 5 ºC seçildiği zaman 18133 Da ağırlığa sahip tek bir

protein fraksiyonu saptanmıştır. Kontrol olarak 37 ºC’ de yapılan inkübasyon

sonunda elde edilen fraksiyonlardan farklıdır.

İnkübasyon sıcaklığı 10 ºC olarak seçildiğinde 90660 Da, 80000 Da, 71570 Da,

20000 Da, 18130 Da ve 16790 Da ağırlığa sahip farklı ve 37 ºC’ de üreyen örnekten

tamamen farklı protein fraksiyonları elde edilmiştir.

İnkübasyon sıcaklı 20 ºC seçildiğinde 90660 Da, 85000 Da, 75550 Da, 20920

Da, 18130 Da, 17000 Da, 15110 Da ve 14620 Da ağırlığa sahip protein bantları elde

edilmiştir.

İnkübasyon sıcaklığı 10 ºC ve inkübasyon süresi 60 dakika seçildiğinde 18130

Da büyüklüğündeki bant hariç SDS-PAGE de saptanan bütün proteinler 10 ºC’ de

sentezlenmişlerdir.

Düşük sıcaklık stresi ve genlerin uyarılması sonucu protein sentezine etkisi

çeşitli mezofilik mikroorganizmalarda ayrıntılı olarak incelenmiştir. Örneğin E. coli

37 ºC’ de optimum üreme gösterdiği halde 10-15 ºC’ lik ortamda üretildiği zaman

12’ den fazla yeni protein sentezi gerçekleştirmiştir. Bu proteinler soğuk şoku


43

proteinleri olarak adlandırılmış ve organizmanın düşük sıcaklık koşullarına uyum

sağlamasında gerekli oldukları belirtilmiştir (Feller ve ark., 1996).

Sıcaklık 20 ºC’ ye yükseltildiğinde 60 dakika sonunda 20920, 15110 ve 14620

Da ağırlığa sahip üç protein bandı ilk kez saptanmıştır. Bu proteinlerin soğuk

ortamında yaşamaya yanıt olarak ortaya çıktıkları düşünülmektedir.

Bununla birlikte 85000 ve 75500 Da ağırlığa sahip bantların 37 ºC’ de üretilen

örnekte de ortaya çıktığı görülmüştür. Bu bantların 37 ºC’ de de görülmesi 20 ºC’ nin

mezofilliğe geçiş olduğunu düşündürmektedir.

İnkübasyon süresi 480 dakika yükseltildiğinde 20 ºC’ de 30220, 17430 ve

17000 Da ağırlığa sahip ilk kez sentezlenen protein bantları saptanmıştır. Ayrıca 60

dakikalık periyodu dikkate alındığında 480 dakikalık süre sonunda (20 ºC için) çok

az sayıda protein sentezlendiği gözlenmiştir (60 dakika da 10 farklı protein

sentezlenirken 480 dakika sonunda 2 protein gözlenmiştir).

İnkübasyon süresinin 480 dakika inkübasyon sıcaklığının 5 ºC olarak

uygulandığı uygulama sonunda 18130 Da ağırlığındaki bandın 60 dakikalık (10 ºC)

uygulamada da ortaya çıktığı, 90660 ve 17000 Da ağırlığındaki bantların 60

dakikalık sürede (20 ºC) de sentezlendiği ortaya çıkmıştır. Ayrıca 37 ºC’ de

sentezlenen 85000 Da ile 75550 Da ağırlığındaki proteinlerin 5 ºC’ de (inkübasyon

süresi 480 dakika) de sentezlendikleri bulunmuştur.

Psikrotrophik bakteri olan Pseudomonas fragi’ de sıcaklık 30 ºC’ den 20 ve 5

ºC’ ye düşürüldüğü zaman lag faz boyunca 20 ºC’ de 25, 5 ºC’ de 17 farklı proteinin

sentezlendiği saptanmıştır (Phadtare ve ark., 1999).

İnkübasyon süresinin 480 dakika, inkübasyon sıcaklığının 10 ºC olduğu

uygulamada ise 37 ºC’ de sentezlenen iki proteinin (85000 ve 75550 Da) organizma

tarafından bu sıcaklık değerinde de üretildiği bulunmuştur. Ayrıca 5 ºC’ de

sentezlenen 90660, 18130 ve 17000 Da ağırlığındaki proteinlerin 10 ºC’ de de

üretildikleri gözlenmiştir.

P. aeruginosa ATCC 27853 suşu ile yapılan soğuk şok uygulamasında, soğuk

şoku proteinlerin 60 dakikalık inkübasyonda özellikle 5 ve 10 ºC, 480 dakikalık

uygulamada ise 20 ºC’ de sentezlendikleri (diğer sıcaklıklarda ortaya çıkmamışlardır)

saptanmıştır.


44

İki proteinin (85000 ve 75550 Da) 37 ºC’ lik inkübasyon sonunda da ortaya

çıktıkları dikkate alındığında, hem 60 hem de 480 dakikalık (5, 10 ve 20 ºC)

inkübasyonlar sonunda elde edilen yeni protein bantlarının, soğuk şoku proteinleri

olduğu ortaya çıkmaktadır.

Şekil 4.1. P. aeruginosa ATCC 27853 suşundan % 12’ lik SDS-PAGE ile elde edilen

protein profilleri. Albumin marker 5 µl, protein örnekleri ise 30 µl miktarda kullanılmıştır.

Psikrotrofik bakteri Pseudomonas fragi 30 veya 20 ºC’ den 5 ºC’ lik üreme

ortamına alınarak analiz edilmiştir. Yapılan protein analizleri sonunda 25 ile 17

proteinin aşırı derecede üretildiği, 12 proteinin ise düşük düzeyde sentezlendiği

bulunmuştur. Diğer taraftan her iki sıcaklık değerinde de (30 veya 20 ºC) ve (5 ºC)

20 proteinin sentezinde değişiklikler olduğu bulunmuştur (Michel ve ark., 1997).


45

Michel ve ark., (1997), protein sentezinde çeşitliliğin önemli kısmının 60


sentezlenen 29 proteinden 15’ i, 30 ºC’ de sentezlenen 37 proteinden 24’ ünün,

sıcaklık 5 ºC’ ye düşürüldüğünde ilk bir saat (60 dakika) içerisinde sentezlendiğini

saptamışlardır.

Khan ve ark., (2003), farklı sıcaklıklarda inkübe ettikleri (4, 10, 20, 30 ve 37

ºC ) Pseudomonas flourocessens MTCC 103 suşundan 14000 Da ağırlığında cold

shock, Pseudomonas flourocessens mutant CRPF suşundan 35000 Da ağırlığında

cold resistant proteini izolasyonu gerçekleştirmişlerdir.

P. aeruginosa balcalı-1 numaralı suştan 5, 10, 20 ve 37 ºC’ lerde 60 ve 480

dakika süreyle inkübasyon yapılarak izole edilen soğuk şoku proteinleri % 12

konsantrasyona sahip SDS-PAGE jelinde analiz edilmiş, çizelge-4.2 ve şekil-4.2’ de

gösterilen farklı moleküler ağırlıklara sahip protein fraksiyonları elde edilmiştir.

Çizelge 4.2. P. aeruginosa balcalı-1 suşuna ait cold shock proteinlerin % 12’ lik SDS-PAGE jelinde oluşan protein profilleri

60 Dakika 480 Dakika

Marker 37 ºC 5 ºC 10 ºC 20 ºC 5 ºC 10 ºC 20 ºC

68000Da 85629 Da 85629 Da 85629 Da 88923 Da 85629 Da 85629 Da 92480 Da

72250 Da 72250 Da 74580 Da 77066 Da 77066 Da 77066 Da 85629 Da

64222 Da 62486 Da 23591 Da 24083 Da 21407 Da 21811 Da 77066 Da

60842 Da 25688 Da 21081 Da 21407 Da 25130 Da

23835 Da 23835 Da 20104 Da 20280 Da 21607 Da

21407 Da 21407 Da 19260 Da 19260 Da 19931 Da

19760 Da 19760 Da 18645 Da 18796 Da 19266 Da

19593 Da 19260 Da

18796 Da 18796 Da

P. aeruginosa balcalı-1 suşuyla yapılan soğuk şok çalışmalarında 60 dakikalık

inkübasyon uygulaması dikkate alındığı zaman 5 ºC’ deki uygulamada 62486, 25688

ve 19260 Da ağırlığındaki proteinlerin 37 ºC’ de üretilen örnekteki proteinlere göre

ilk kez sentezlendikleri görülmektedir. Bu sıcaklık değerinde sentezlenen


46

proteinlerden 85629, 23835, 21407, 19760 ve 18796 Da ağırlığında olanlar ise aynı

zamanda 37 ºC’ de de gözlenmişlerdir.

İnkübasyon sıcaklığı 10 ºC olarak seçildiği zaman 85629 Da dışındaki bütün

proteinlerin (74580, 23591, 21081, 20104, 19260 ve 18645 Da) ilk kez üretildikleri

görülmüştür.

İnkübasyon sıcaklığının 20 ºC olarak seçildiği inkübasyon sonunda 21407 ve

18796 Da ağırlığındaki proteinlerin 37 ºC’ de de sentezlendikleri görülmüştür. Diğer

proteinler arasında 19260 Da ağırlığındaki yapının aynı zamanda 10 ºC’ de de

sentezlendiği belirlenmiştir.

Elde edilen 7 farklı protein yapısı içerisinde 88923, 24083 ve 20280 Da

ağırlığındaki proteinler ilk kez bu sıcaklık değerinde (20 ºC’ de) sentezlenmişlerdir.

İnkübasyon süresi 480 dakika seçildiğinde 5 ve 10 ºC’ deki inkübasyonlarda

85629 ve 77066 Da ağırlığındaki proteinlerin ortak olduğu görülmüştür. Bununla

birlikte 5 ºC’ de 21407, 10 ºC’ de ise 21811 Da ağırlığında iki farklı proteinin varlığı

belirlenmiştir. Örneklerden 21470 Da ağırlığa sahip olan 60 dakikalık uygulamada 5

ve 20 ºC’ de de üretilmiştir. Buna karşılık 21181 Da’ luk protein ilk kez ortaya

çıkmaktadır.

İnkübasyon sıcaklığı 20 ºC seçildiğinde 85629 Da ağırlığındaki proteinin 37

ºC’ de sentezlendiği saptanmıştır. Sentezlenen proteinlerden 77066 Da ağırlığa sahip

olan yapı diğer sıcaklık değerlerinde de sentezlenmiştir. Buna karşılık 92480, 25130,

21607, 19931 ve 19266 Da ağırlığındaki yapılar ilk kez bu sıcaklık değerinde

sentezlenmişlerdir.

P.aeruginosa balcalı-1 suşunda 60 dakikanın 20 ºC ile 480 dakikanın bütün

sıcaklık değerlerinde sentezlenen 77066 Da ağırlığındaki protein yapıları temel

soğuk şoku proteinleri olarak değerlendirilmişlerdir.

Kontrol amacı ile 37 ºC’ de üretilen organizmadan elde edilen proteinlerin

dışında 5, 10 ve 20 ºC’ de ortaya çıkan bütün protein yapıları soğuk şoku

proteinlerdir. Bu suş dikkate alındığı zaman özellikle 60 dakikalık inkübasyonda 5 ºC

(4 yeni protein) ve 10 ºC’ nin, 480 dakikalık inkübasyonda ise 20 ºC’ nin (6 yeni

protein) soğuk şok yanıtın en fazla gerçekleştiği sıcaklıklar olduğu görülmektedir.


47

Henrike ve ark., (2002), Mikroorganizmanın düşük sıcaklıkta üretilmesinden

sonra (10 ºC) soğuk şoku proteini sentezinin uyarılma oranının maksimum düzeyde

gerçekleştiğini belirtmiştir.

Hebraud ve ark., (1994), farklı sıcaklıklarda (4, 10, 15, 20, 30 ve 34 ºC)

izolasyonunu gerçekleştirdikleri proteinlerden 7000 ve 8000 Da ağırlığa sahip iki

fragmentin 30 ºC ile karşılaştırıldığında sadece 4 ºC’ de sentezlendiğini

belirtmişlerdir.

Şekil 4.2. P. aeruginosa balcalı-1 suşundan % 12’ lik SDS-PAGE ile elde

edilen protein profilleri.

Imbert ve Gankel (2004), Aeromonas hydrophila suşunu 20, 15, 10 ve 5 ºC’

lerde ürettiklerinde sıcaklık düştükçe çok sayıda yeni proteinin sentezlendiğini

belirtmişlerdir (20 ºC’ de yaklaşık 22, 5 ºC’ de ise 30 yeni protein). Bu yeni

proteinler arasında 33000 ve 62000 Da bütün sıcaklık değerlerinde sentezlenen ortak


48

proteinlerdir. Soğuk şoku proteinleri göstermek için organizma 30 ºC’ de üretilmiş,

daha sonra 20 ve 5 ºC’ lik ortama alınarak 2 saat inkübasyon gerçekleştirilmiştir.

Kontrol (30 ºC’ de üretilen) ve soğuk ortamda üretilen (20, 15, 10 ve 5 ºC)

bakterilere ait protein örnekleri iki boyutlu SDS-PAGE jelinde karşılaştırmalı olarak

analiz edildiği zaman 20 ºC’ de 26, 5 ºC’ de ise yaklaşık 47 proteinin sentezlendiği

saptanmıştır. Analizler sonunda 5 ºC’ de sentezlenen proteinlerin büyük

çoğunluğunun 25000 ile 64000 Da arasında moleküler ağırlığa sahip oldukları ve

asidik karakterde olduklarını bulmuşlardır (Imbert ve Gankel,.2004).

P.aeruginosa balcalı-2 numaralı suştan 5, 10, 20 ve 37 ºC’ lerde 60 ve 480

dakika süreyle inkübasyon yapılarak izole edilen soğuk şoku proteinleri % 12

konsantrasyona sahip SDS-PAGE jelinde analiz edilmiş, çizelge-4. 3 ve şekil-4. 3’

de gösterilen farklı moleküler ağırlıklara sahip protein fraksiyonları elde edilmiştir.

Çizelge 4.3. P. aeruginosa balcalı-2 suşuna ait cold shock proteinlerin % 12’ lik SDS-PAGE jelinde oluşan protein profilleri

60 Dakika 480 Dakika Marker 37 ºC 5 ºC 10 ºC 20 ºC 5 ºC 10 ºC 20 ºC

68000 Da 83111 Da 86300 Da 83111 Da 86400Da 86300Da 83111Da 86300 Da

77379 Da 80142 Da 77379 Da 83111Da 80142Da 80142Da 77379 Da

68000 Da 31170 Da 68000 Da 80145Da 70125Da 70125Da 31100 Da

24129 Da 24391 Da 24391 Da 31166Da 25213Da 24933Da 25500 Da

22240 Da 22666 Da 22666 Da 25500Da 23134Da 22897Da 23375 Da

21576 Da 22000 Da 23375Da 21576Da 22000Da 22240 Da

21576 Da 22400Da 21576Da

P. aeruginosa balcalı-2 suşu ile yapılan soğuk şok yanıt oluşumu sırasında

sentezlenen proteinlerin moleküler ağırlıkları P. aeruginosa ATCC 27853 ve P.

aeruginosa balcalı-1 suşlarından elde edilenlere göre daha küçük bulunmuştur.

İnkübasyon süresinin 60 dakika olarak uygulandığı periyotta organizma 5 ºC’

de üretildiği zaman 86300, 80142, 31170, 24391, 22666 ve 21576 Da ağırlığa sahip

farklı proteinin sentezlendiği saptanmıştır. Proteinlerinden 31170, 24391 ve 2266 Da

ağırlığa sahip olanlar sadece bu sıcaklık değerinde üretilmişlerdir.


49

Organizma 10 ºC’ de üretildiği zaman 83111, 77379, 68000, 24391, 22666,

22000 ve 21576 Da ağırlığa sahip 7 farklı proteinin üretildiği bulunmuştur.

Proteinlerden 83111, 77379 ve 68000 Da ağırlığındakiler 37 ºC’ de

sentezlenmişledir. 22666 ve 21576 Da ağırlığındaki proteinler 5 ºC’ de üretilirken,

24391 ve 22000 Da ağırlığındaki yapılar bu sıcaklıkta ilk kez gözlenmişlerdir.

Buna göre, 22666 ve 21576 Da ağırlığındaki fraksiyonların her iki sıcaklık

değerinde de gözlenmesi (5 ve 10 ºC) bu yapıların temel soğuk şoku proteinleri

olduğunu göstermektedir.


23375 ve 22400 Da ağırlığında 7 farklı proteinin üretildiği belirlenmiştir. Bu

proteinlerden 83111 aynı zamanda 37 ºC’ de gerçekleştirilen inkübasyon sırasında da

sentezlenmiştir. Diğer 6 protein ilk kez bu sıcaklık değerinde indüklenmişlerdir.

İnkübasyon süresinin 480 dakika olarak uygulandığı aşamada, organizma 5 ºC’

de üretildiği zaman SDS-PAGE jelinde 86300, 80142, 70125, 25213, 23134 ve

21576 Da ağırlığında protein bantları saptanmıştır. Bu yapılardan 86300, 80142 ve

21576 Da ağırlığındaki fraksiyonlar inkübasyon 5 ºC ve 60 dakika gerçekleştirildiği

zaman elde edilenler ile aynı moleküler ağırlığa sahiptirler. Bu durum, inkübasyon

süresindeki değişikliğin P. aeruginosa balcalı-2 suşunda soğuk şok yanıt üzerinde

farklılık yaratmadığını göstermektedir.

Bununla birlikte 70125, 25213, 23134 Da ağırlığındaki fraksiyonlar ilk kez

ortaya çıkmışlardır.


22000 ve 21576 Da ağırlığında 7 farklı proteinin sentezlendiği bulunmuştur. Bu

yapılardan 83111 Da ağırlığındaki protein organizma 37 ºC’ de üretildiği zaman da

sentezlenmiştir. Proteinlerden 22000 ve 21576 Da ağırlığında olanlar 60 dakikalık

inkübasyonda (10 ºC) da sentezlenmişlerdir. SDS-PAGE jelde saptanan

proteinlerden 80142, 70125, 24933, 22897 Da ağırlığındakiler ilk kez bu sıcaklık ve

inkübasyon süresinde üretilmişlerdir.

Organizma 20 ºC’ de üretildiği zaman 86300, 77379, 31100, 25500, 23375 ve

22240 Da ağırlığında 6 farklı proteinin sentezlendiği gözlenmiştir. Proteinlerden

31100, 25500, 23375 Da ağırlığındaki yapılar ilk kez saptanmıştır. Buna karşılık


50

77379 ve 22240 Da ağırlığındaki yapılar organizma 37 ºC’ de üretildiği zaman da

üretilmiştir. Bu yapıların 20 ºC’ de ortaya çıkması (37 ºC’ de sentezlenmişlerdir)

soğuk şok yanıtta fazla öncelikli olmadıklarını düşündürmektedir.

Proteinlerden 86300 Da ağırlığındaki yapı 5 ºC’ de gerçekleştirilen, 60 ve 480

dakikalık inkübasyon sonunda da saptanmışlardır. Bu yapının her iki zamanda ve 5

ºC’ de sentezlenmiş olması soğuk şok yanıttan sorumlu olduğunu göstermektedir.

Şekil 4.3. P.aeroginosa balcalı-2 suşundan % 12’ lik SDS-PAGE ile elde edilen

protein profilleri.

Soğuk şok uygulaması sırasında bazı proteinlerin sentezinin arttığı

belirlenmiştir. Dokuz proteinin 20 ve 5 ºC’ de aşırı miktarda sentezlendiği bunun

yanısıra özellikle 5 ºC’ de ekstradan 17 proteinin daha aşırı miktarda üretildiği

gözlenmiştir. 33000 Da ve 36000 Da ağırlığındaki iki proteinin sıcaklığın düşmesine

bağlı olarak özellikle sentezlerinin arttığı saptanmıştır (Imbert ve Gankel, 2004).


51

Horton ve ark., (2000), Salmonella typhimurium LT2 suşunda CspA’ nın

karakterizasyonu ve soğuk şok sıcaklığa adaptasyon için oluşan yanıt ile ilgili

çalışmışlardır. Organizmanın 37 ºC’ den 10 veya 5 ºC’ lik ortama transferinden sonra

üremedeki lag fazının başlaması 10 ºC’ de 10 saat, 5 ºC’ de ise 25 saat sonra

gerçekleşmiştir.

Her iki sıcaklık değerinde de 74000 Da ağırlığındaki CspA’ nın yanı sıra

105000 Da ağırlığında soğuk şoku proteini sentezi gerçekleşmiştir. Bununla birlikte

10 ve 5 ºC’ de gerçekleşen üreme sırasında 21000, 24000, 26000, 32000, 36000 ve

80000 Da ağırlığında 6 farklı proteinin ekspresyonlarının önemli derecede azaldığını

saptamışlardır. Bu proteinlerden 26000 Da ağırlığında olan diğer proteinlerin

Salmonella enteritidis (Jefreys ve ark., 1998) veya E. coli (Goldstein ve ark., 1990)

de soğuk şok koşullarda sentezlenmedikleri ve ilk kez üretildikleri saptanmıştır.

Barbaro ve ark., (2002) Psikrotrophic Acinetobacter sp. HIHI-1 suşunu 25 ºC’

de inkübe ederek protein sentezini indükledikten sonra 5 ºC’ ye transfer ederek iki

boyutlu SDS-PAGE siteminde analiz etmiştir. Soğuk şok uygulamasında 2 saat sonra

moleküler ağırlığı yaklaşık 12000 Da olan protein sentezlendiğini saptamışlardır.

Araştırmacılar analizler sonunda Acinetobacter sp.HIHI-1 suşunun25 ºC’ den 5 ºC’

ye transfer edilmesinden sonraki 2 saatlik inkübasyon sonunda 19 proteinin

sentezinin arttığını saptamışlardır.

Bacillus pscychrophilus, bakterisinin 0, 5 ve 10 ºC’ de üretildiği zaman sırası

ile 11, 10 ve 4 adet soğuk şoku proteini sentezlediği belirtilmiştir (Whyte and Inniss,

1992). Cold adapted Pseudomonas flourescens bakterisi 5 ºC’ de üretildiğinde 5 adet

soğuk şoku proteini sentezlemiştir. Pseudomonas flourescens 0 ºC’ de üretildiğinde

28 proteinin sentezinde artış olduğu belirtilmiştir (Colucci ve Inniss, 1996).

Berger ve ark., (1996), Arthrobacter globiformis SI55 suşunun 25 ºC inkübe

edildiğinde sentezlenen 28 proteinden 9’ unun bakteri 4 ºC’ ye transfer edilmesinden

sonra eksprese edildiğini belirtmişlerdir.




18800, 17200, 15500, 14500 ve 14400 Da olan 12 soğuk şoku proteinin sentezlendiği


52



Listeria monocytogenes 10403S suşu 37 ºC’ den 5 ºC’ ye aktarıldığında 5 ºC’

de üremenin gerçekleştiği ve moleküler ağırlıkları 48000, 21100, 19700 ve 18800

olan 4 cold Caps (acclimation) sentezlendiği saptanmıştır (Bayles ve ark., 1996).

Phan-Thanh ve Gormon, (1995), Farklı bir Listeria monocytogenes ile

yaptıkları çalışmada 32 farklı proteinin sentezlendiğini ve bunların büyük kısmının

soğuk şoku proteinleri olduğunu belirtmişlerdir. Bu soğuk şoku proteinlerin normale

göre beş kat daha fazla sentezlendikleri moleküler ağırlıklarının 94700, 89500,

87000, 70000, 68500, 68200, 55300, 40600, 37000, 36800, 34800 ve 17600 Da

olduğunu belirtmişlerdir.

Psikrofil bir maya türü olan Trichosporon pullants’ ta yapılan soğuk

araştırmalarında ortam sıcaklığı 21 ºC’ den 5 ºC’ ye düşürüldüğünde kontrole göre

26 farklı protein sentezlendiği bulunmuştur. Buna karşılık sıcaklık 15 ºC’ den 5 ºC’

ye indirildiğinde sadece 6 protein, 24 ºC’ den 5 ºC’ ye indirildiğinde ise 10 proteinin

sentezlendiği görülmüştür (Jones ve ark. 1987; Uyttendaele ve ark. 1998).

5. SONUÇ VE ÖNERİLER Zuhal ÜZÜMCÜ

53

5. SONUÇ VE ÖNERİLER

Ekstremophil organizmalar düşük veya yüksek sıcaklık (pisikrofil veya

termofil), ekstrem pH (asidofil veya alkalofil), yüksek veya düşük tuz

konsantrasyonları (halofiller) ve yüksek basınç (barofiller ve endolitler) gibi ekstrem

çevre koşullarında yaşamlarını sürdürmektedirler. Ekstrem çevre koşulları içerisinde

en iyi tanımlananların başında sıcaklık gelmektedir. Yeryüzünde sıcaklık kutup

bölgelerinde sıfır derecenin altında, hidrotemal bölgelerde ise suyun kaynama

noktasının üzerindedir. Böylece farklı ekolojik nişler mikroorganizmaların

üreyebilmeleri için minimum, optimum ve maksimum sıcaklıkların oluşmasını

sağlamaktadırlar.

Dünya biyosferinin % 85’ ten daha fazla bir kısmı, yılın büyük bir bölümünde

5 ºC’ den daha düşük sıcaklığa sahip olup, % 75’ ten daha büyük kısmı ise sürekli

soğuktur (yıl boyunca sıcaklık 5 ºC’ den daha düşük) (Baross ve Marita., 1978). Bu

yüzden psikrofil ve psikrotolerant bakteriler, bakteriyel çeşitliliğin önemli bir

bölümünü oluştururlar. Bu organizmalar zor iklimsel koşullarda yaşayabilme

yetenekleri nedeniyle cold-adaptasyonun moleküler mekanizmasının anlaşılmasında

model organizmalar olarak kullanılmaktadırlar. Psikrofil organizmaların moleküler

biyoloji, biyokimya ve fizyolojilerinin anlaşılması, cold adaptasyon mekanizmasının

moleküler temeli üzerindeki esrar perdesinin kaldırılmasında yardımcı olabilir

(Nakagawa ve ark., 2002).

Stres, biyotik ve abiyotik faktörlerin ayrı ayrı ya da birlikte fizyolojik ve

biyokimyasal olaylarda belli değişimleri meydana getirmesi veya organizmada hasar

oluşturma kapasitesi olarak tanımlanabilir (Levitt, 1980). Başka bir deyişle, üreme,

gelişme ve üretim için genetik potansiyelin ifadesini olumsuz şekilde etkileyen

herhangi bir çevresel faktörü veya bunların etkileşimlerini içermektedir (Jones ve

Qualset, 1984).

Biyolojik sistemler ultraviyole ışını, pH, tuzluluk, oksijen kullanılabilirliği,

basınç veya termal gibi stres koşullarından etkilenebilirler. Sıcaklığın düşmesi

membran akışkanlığını değiştirir ve sonuçta hücresel fonksiyonlar değişir. Hücrede

meydana gelen fonksiyonel değişiklikler cold shock adı verilen proteinlerin


54

sentezlenmesi sonucunda gerçekleşir. İlk tanımlanan cold shock protein E. coli’ deki

CspA’ dır. Bu protein psikrotrofik, psikrofilik, mezofilik ve termofilik bir çok gram

negatif ve gram pozitif bakteride de tanımlanmış ve CspA ile homoloji gösterdikleri

belirlenmiştir (Phadtare ve ark., 1999).

Bakteri hücreleri ekstrem sıcaklık, UV ışını, etanol, tuz veya asidik koşullar

gibi çevresel streslerin etkisinde kaldıkları zaman canlılıklarını sürdürebilmek için bu

koşullara uygun protein sentezi gerçekleştirmeleri esastır. Bakteriler, düşük

sıcaklıkta spesifik olarak cold shock yanıt oluştururlar (Jones ve Inouye, 1994).

Mezofilik organizmalar için 10-15 ºC’ lik sıcaklık aralığı soğuk şok olarak

adlandırılır. Buna karşılık antarktik mikroorganizmalar, donma sıcaklığındaki soğuk

çevre koşullarında sürekli yaşadıkları için bu konuda çok daha az çalışılmışlardır.

Antarktik organizmalarla gerçekleştirilen 0-4 ºC aralığında çalışmaların soğuk şoku

tam olarak ifade ettiği açık değildir. Bu nedenle genetik ve biyokimyasal çalışmalar

yapılarak, düşük sıcaklıkta üreyen organizmaların temel biyolojik özelliklerinin

ayrıntılı olarak öğrenilmesi önemlidir (Graumann ve ark., 1996).

Bütün antarktik mikroorganizmalar iki grupta toplanmışlardır. Birinci grupta

pisikrofiller yer alır ve bunlar sıfır veya sıfır derecenin hemen altından 18-20 ºC’ ye

kadar üreyenleri kapsar. Optimum üreme sıcaklıkları ise 10-12 ºC aralığıdır.

İkinci grupta ise pisikrotroflar yer alırlar ve sıfır ile sıfır derecenin altında

üremektedirler. Bu organizmaların 30-32 ºC’ lerde de üreme yetenekleri vardır.

İkinci grupta yer alan organizmalar antarktikanın karasal çevresinde dominant olup,

laboratuarda 20-24 ºC aralığında optimum üreyebilirler. Bu nedenlerle antarktik

psikrofilik ve psikrotrofik organizmalar, tipik cold shock davranışı göstermezler.

Cold shock yanıt gerçek anlamda, mezofil organizmalarda gözlenmektedir (Ray ve

ark., 1998).

Fiziksel veya kimyasal streslere karşı mikroorganizmalarda ortaya çıkan

yanıtlar protein sentezinde kalitatif veya kantitatif düzenlemelerle karakterizedir.

Heat shock gibi bazı fenomenler fizyolojik ve moleküler düzeyde en iyi bakterilerde

araştırılmıştır. Heat shock en iyi bilinen yanıt şekli olup, bu aşamada sentezlenen

proteinlerin nasıl düzenlendikleri aydınlatılmıştır.


55

E. coli’ de soğuk şokun protein sentezi ve üreme üzerine olan etkisi de

araştırılmıştır. Sıcaklık 37 ºC’ den 10 ºC’ ye düşürüldükten sonra 14 farklı proteinin

sentezi hızla artış gösterirken bakteriler 4 saat süreyle üremelerini durdurmuşlardır.

Bu süreçte sentezlenen proteinler soğuk şoku proteinleri (Csps) olarak

adlandırılmışlardır. Bu proteinler başlangıçta sentezlenen ısı şoku proteinlerden

(Hsps) tamamen farklıdırlar.

Son yapılan çalışmalarda 4 yeni Csps tanımlanmıştır. Bunlardan birincisi

(CspA) ribozoma bağlı protein olup, çift iplikli RNA’ nın düşük sıcaklıkta

gevşemesini sağlamaktadır. Diğer iki protein (HscA ve HscB), Hsp ile büyük

homoloji gösteren şaperonlar olup, aynı zamanda DnaK ve DnaJ şeklinde de

adlandırılmaktadırlar. Bu proteinler soğuk şok yanıtın oluşmasında düzenleyici

olarak görev yapmaktadırlar. Son protein ise RbfA olup, ribozoma bağlı diğer bir

protein tipidir. Ribozomun translasyon kapasitesini artırdığı saptanmıştır.

E. coli’ nin soğuk şoku proteinleri arasında birinci sırada yer alan CspA DNA

ve RNA’ ya bağlanan potein olup, sıcaklık 37 ºC’ den 10 ºC’ ye düşürüldüğün zaman

sentezi 200 kat artmaktadır. CspA 7 genin bir araya gelmesiyle oluşmuş ve bunların

fonksiyonu sonucu sentezlenen multigenik özellik göstermektedir.

CspA E. coli’ nin soğuk şok yanıtında başrolü oynamakta olup, diğer soğuk

şok proteinlerin transkripsiyonunu aktive etmektedir. Aynı zamanda diğer soğuk

şoku proteinlerin translasyonunda mRNA’ yı spesifik olarak uyarmaktadır. Birçok

bakteride CspA analoğu olan proteinler saptanmıştır (Grumann ve ark. 1996).

Bununla birlikte multigenik özellik sadece Bacillus cereus (Mayr ve ark., 1996) ve

Bacillus subtilis’ te gözlenmiştir (Grumann ve ark., 1996).

Psikrotrofik bakteri olan Pseudomonas fragi 2-35 ºC arasında değişen çok

geniş bir aralıkta üreme yeteneğine sahiptir. Bu bakteri özellikle buzdolabında etlerin

yüzeylerinde üreyerek bozulmaya neden olur. Dondurma işlemi sırasında ürünün

yüzeyindeki sıcaklık hızla düşmektedir. Bakteri bu stres koşuluna hızla yanıt vererek

etin yüzeyinde üremektedir. P. fragi ile yapılan çalışmalarda sıcaklık 30 veya 20 ºC’

den aniden 5 ºC’ ye düşürülerek sıcaklık düşüşünün üremeye etkisi araştırılmıştır.

Sıcaklığın düşmesinden itibaren birkaç saat içerisinde organizmada öncelikli olarak

CspA proteininin sentezlendiği saptanmıştır (Hebraud ve ark., 1994).


56

Elektron mikroskobik çalışmalar Csp ve Crp’ lerin her ikisinin de sitosolde

sentezlendiğini bununla birlikte Csp’ lerin ekspresyon seviyelerinin Crp’ lerden daha

düşük düzeyde gerçekleştiği bulunmuştur. Soğuk şoku proteinleri sadece sıcaklıktaki

ani düşüşlerin sonunda sentezlenirken bazı proteinlerin ekspresyonlarının

inkübasyondan birkaç saat sonra tamamlandığı belirtilmiştir. Soğuk şok yanıtın

büyüklüğünün şokun ölçüsüne bağlı olduğu belirtilmiştir (Khan ve ark., 2003).

P. aeruginosa ATCC 27853 numaralı standart suş ile yapılan çalışmalarda 5,

10 ve 20 ºC’ de gerçekleştirilen inkübasyonda, 60 dakika sonunda toplam 15, 480

dakika sonunda ise 11 soğuk şoku proteinin sentezlendiği saptanmıştır.

SDS-PAGE analizlerinde 60 dakikalık sürede 5 ºC’ de moleküler ağırlığı

18133 Da olan tek bir protein fraksiyonu saptanırken, 10 ºC’ de moleküler ağırlığı

90660 Da, 80000 Da, 71570 Da, 20000 Da, 18130 Da ve 16790 Da olan 6 ve 20 ºC’

de moleküler ağırlığı 90660 Da, 85000 Da, 75550 Da, 20920 Da, 18130 Da, 17000

Da, 15110 Da ve 14620 Da olan 8 soğuk şoku proteinin sentezlendiği gözlenmiştir.

Aynı organizma 37 ºC’ de üretildiğinde ise 6 farklı moleküler ağırlıkta protein

sentezlenmiş, bunlardan 85000 ve 75500 Da ağırlığa sahip olanlar aynı zamanda 10

ve 20 ºC’ lerde de üretilmişlerdir (Çizelge-4.1).

P. aeruginosa ATCC 27853 numaralı standart suş ile yapılan çalışmalarda 60

dakikalık inkübasyon sonunda 20 ºC’ de 8, 480 dakika sonunda sadece 2 proteinin

sentezlenmesi, genel olarak 60 dakikalık inkübasyonda 480 dakikaya göre çok daha

fazla sayıda yeni soğuk şoku proteini üretilmesi, soğuk şok yanıtın latent aşamada

gerçekleştiğinin kanıtı olup, literatür verileri ile büyük benzerlik göstermektedir.

Ayrıca 37 ºC’ de 6 protein sentezlenirken 5, 10 ve 20 ºC’ de 26 (60 ve 480

dakikanın toplamında) protein sentezlenmesi ve bu proteinlerin 24’ ünün tamamen

yeni sentezlenmiş olması elde edilen sonuçların literatür verileriyle tam bir uyum

içerisinde olduğunu göstermektedir. Her iki inkübasyon süresinde de özellikle 17000

ve 18130 Da ağırlığındaki proteinleri 10 ve 20 ºC’ lik inkübasyonda diğer proteinlere

göre daha yüksek düzeyde indüklendikleri görülmektedir. Bu iki proteinin P.

aeruginosa ATCC 27853 suşunda soğuk şok yanıtta ön plana çıktıkları

düşünülmektedir (şekil-4.1).


57

Imbert ve ark. (2004), psikrofil Aeromonas hydrophilia’ da 30 ºC’ de çok az

proteinin eksprese edilmesine karşılık, 20, 15, 10 ve 5 ºC’ de tamamen yeni

proteinlerin ortaya çıktığını ve çok daha fazla sayıda protein sentezinin

gerçekleştiğini belirtmişlerdir.

Bakteriler düşük sıcaklıkta spesifik olarak soğuk şok yanıt oluştururlar.

Sıcaklık 37 ºC’ den 10 ºC’ ye düşürüldüğü zaman üremenin eksponansiyal faz

aşaması sırasında 4 saatlik lag fazı dönemi vardır. Bu dönemde sentezlenen protein

sayısında ciddi bir azalma gerçekleşir. Lag periyodu sırasında soğuk şoku proteini

sentezinin uyarıldığı ve iki boyutlu SDS-PAGE analizlerinde yaklaşık 16 soğuk şoku

proteini sentezlendiği saptanmıştır. Sentezlenen 16 soğuk şoku proteini arasında

başlıcası CspA olduğu belirtilmiştir (Jones ve Inouye, 1994).

P. aeruginosa balcalı-1 suşuyla yapılan soğuk şok çalışmalarında 60 dakikalık

inkübasyon uygulaması dikkate alındığı zaman 5 ºC’ deki uygulamada 62486, 25688

ve 19260 Da ağırlığındaki proteinlerin 37 ºC’ de üretilen örnekteki proteinlere göre

ilk kez sentezlendikleri görülmektedir.

Bakteri 10 ºC’ de inkübe edildiği zaman sentezlenen 7 protein içerisinde

moleküler ağırlıkları 74580, 23591, 21081, 20104, 19260 ve 18645 Da olanlar

kontrol amacı ile 37 ºC’ de üretilen örnekte sentezlenmeyip, ilk kez saptanmışlardır.

P. aeruginosa balcalı-1 suşu 20 ºC’ de üretildiği zaman 88923, 77066, 24083,

20280 ve 19260 Da ağırlığa sahip proteinlerin bu sıcaklıkta ilk kez sentezlendiği

saptanmıştır. Bununla birlikte 19260 Da ağırlığındaki protein aynı zamanda 5 ºC’ de

sentezlenmiştir. İnkübasyon süresinin 60 dakika olarak seçildiği periyotta 5, 10 ve 20

ºC’ de toplam 23 proteinin sentezi gerçekleşmiştir. Bunlardan 15’ i ilk kez

sentezlenmişlerdir (Çizelge 4.2).

İnkübasyon süresi 480 dakikaya çıkarıldığı zaman 5, 10 ve 20 ºC’ de toplam 13

protein sentezi gerçekleşmiştir. Bunlardan 10 ºC’ de 21811 Da, 20 ºC’ de ise 92480,

25130, 21607, 19931 ve 19266 Da ağırlığında toplam 6 örnek ilk kez sentezlenmiştir.

Her iki inkübasyon süresinde de 85629, 77066 ve 19260 Da moleküler ağırlığa sahip

3 proteinlerin soğuk şoku proteinleri olduğu düşünülmektedir (Şekil-4.2).

P. aeruginosa balcalı-1 suşunda, sentezlenen toplam soğuk şoku proteinleri

dikkate alındığı zaman, soğuk şok yanıtın 60 dakikalık inkübasyonda daha etkili


58

şekilde ortaya çıktığı görülmektedir. Bu sonuç litaratür verileri ile uygunluk

göstermektedir.

Imbert ve Gankel (2004), Aeromonas hydrophila suşunu 20, 15, 10 ve 5 ºC’

lerde ürettiklerinde sıcaklık düştükçe çok sayıda yeni proteinin sentezlendiğini

belirtmişlerdir. Bu araştırmacılar iki saatlik inkübasyon sonunda 20 ºC’ de yaklaşık

22, 5 ºC’ de ise 30 yeni proteininin sentezlendiğini belirtmişlerdir.

P. aeruginosa balcalı-1 suşunda, 60 dakikalık inkübasyon sonunda özellikle 10

ºC sentezlenen toplam 7 proteinden 6’ sının yeni olması, cold shock uyarımın bu

organizmada 10 ºC’ de çok yüksek olduğunu göstermektedir.

Henrike ve ark., (2002), Mikroorganizmanın düşük sıcaklıkta üretilmesinden

sonra (10 ºC) cold shock protein sentezinin uyarılma oranının maksimum düzeyde

gerçekleştiğini belirtmiştir. Elde edilen sonuç litaratür verileriyle uyum içerisindedir.

P. aeruginosa balcalı-2 suşu ile yapılan cold shock çalışmalarında 60 dakikalık

inkübasyon uygulaması dikkate alındığı zaman, 5 ºC’ deki uygulamada tamamen

yeni sentezlenen, moleküler ağırlıkları 86300, 80142, 31170, 24391, 22666 ve 21576

Da olan toplam 6 protein elde edilmiştir (şekil-4.3).

On derecede gerçekleştirilen inkübasyon sonunda moleküler ağırlıkları 83111,

77379, 68000, 24391, 22666, 22000 ve 21576 Da olan toplam 7 farklı proteinin

sentezi gerçekleşmiştir. Proteinlerden 22666 ve 21576 Da ağırlığındakiler aynı

zamanda 5 ºC’ de de sentezlenmişlerdir. Buna karşılık, 24391 ve 22000 Da

ağırlığındaki yapılar, bu sıcaklıkta ilk kez üretilmişlerdir. Moleküler ağırlıkları 22666

ve 21576 Da olan yapıların (5 ve 10 ºC’ de ortak olarak üretilmişlerdir) asıl soğuk

şoku proteinleri olduğu düşünülmektedir.

P. aeruginosa balcalı-2 suşu, 20 ºC’ de üretildiği zaman 86400, 83111, 80145,

31166, 25500, 23375 ve 22400 Da ağırlığında 7 farklı proteinin üretildiği

belirlenmiştir. Bunlardan 83111 Da ağırlığındakilerin dışındaki bütün proteinler ilk

kez sentezlenmiştir. İnkübasyon süresinin 60 dakika olarak seçildiği uygulamada 5,

10 ve 20 ºC’ de moleküler ağırlıkları farklı olan toplam 20 protein sentezi

gerçekleşmiştir (Çizelge-4.3).


59

Psikrotrophik bakteri olan Pseudomonas fragi’ de sıcaklık 30 ºC’ den 20 ve 5

ºC’ ye düşürüldüğü zaman lag faz boyunca 20 ºC’ de 25, 5 ºC’ de 17 farklı proteinin

sentezlendiği saptanmıştır (Phadtare ve ark., 1999).

E. coli 37 ºC’ de optimum üreme gösterdiği halde 10-15 ºC’ lik ortamda

üretildiği zaman 12’ den fazla yeni protein sentezi gerçekleştirmiştir. Bu proteinler

cold shock proteinler olarak adlandırılmış ve organizmanın düşük sıcaklık

koşullarına uyum sağlamasında gerekli oldukları belirtilmiştir (Feller ve ark., 1996).

İnkübasyon süresi 480 dakika olarak seçildiği zaman, 5 ºC’ de toplam 6 protein

sentezinin gerçekleştiği gözlenmiştir. Bunlar içerisinde moleküler ağırlıkları 70121,

25213 ve 23134 Da olanlar ilk kez üretilmişlerdir. On derecede gerçekleştirilen

uygulamada ise toplam 7 protein sentezi gerçekleşmiştir.

Sentezlenen proteinlerden moleküler ağırlıkları 80192, 24933 ve 22897 Da

olanlar ilk kez gözlemlenmişlerdir. İnkübasyon sıcaklığı 20 ºC olarak seçildiği

zaman, 6 protein sentezi gerçekleştiği görülmektedir. Proteinler içerisinde 31100,

25500, 23375 ve 22240 Da ağırlığa sahip olanlar ilk kez bu sıcaklıkta üretilmişlerdir

(Çizelge-4.3).

İnkübasyon süresinin 480 dakika ve inkübasyon sıcaklığının 5, 10, 20 ºC

olarak belirlendiği uygulamada toplamda 19 protein sentezi gerçekleşmiştir.

P. aeruginosa balcalı-2 suşunda moleküler ağırlıkları 86300, 80141, 22000 ve

21576 Da olan proteinler 5 ve 10 ºC’ lik inkübasyonlarda (60 ve 480 dakikanın her

ikisinde de) ortak örnekler olarak saptanmıştır. Bu yapıların soğuk şok yanıttan asıl

sorumlu proteinler olduğu düşünülmektedir.

Yamanaka ve Inouye (2001), bütün CspA ve homologlarının küçük proteinler

olduklarını ve moleküler ağırlıklarının SDS-PAGE jelinde ortalama 7500 Da

olduğunu belirtmişlerdir.

Imbert ve Gankel (2004), Psikrofilik bakteri Aeromonas hydrophila 7966 suşu

ile yaptıkları çalışmada 30 ºC’ de üreyen organizmayı 20, 15, 10 ve 5 ºC’de inkübe

ederek düşük sıcaklıkta adaptasyon için oluşan yanıtı araştırmışlardır. İki boyutlu

SDS-PAGE analizlerinde 30 ºC’ de çok az sayıda proteinin eksprese edildiğini buna

karşılık düşük sıcaklık değerlerinde yeni proteinlerin ortaya çıktığını, var olan bazı

proteinlerinde ekspresyonlarının aşırı derecede arttığını saptamışlardır.


60

Özellikle 11000 Da ağırlığındaki iki soğuk şoku proteinin ilk kez

sentezlendiğini belirlemişlerdir. Ayrıca çalışmalar sırasında E. coli ’nin temel soğuk

şoku proteini olan CspA’ ya benzer moleküler ağırlıkta protein sentezlenmediğini

belirtmişlerdir.

Perin ve ark., (1999), Streptococcus thermophilus suşunda soğuk şok

uygulamasından sonra major soğuk şok ve 21500 Da ağırlığında soğuk şoku proteini

sentezlendiğini saptamışlardır. Çalışmada 42 ºC’ de üreyen suş 15 ve 20 ºC’ lik

ortamlarda üretilerek soğuk şoku proteini sentezi araştırılmıştır.

Organizmanın üremesinin 15 ºC’ lik koşulda 20 ºC’ ye göre dramatik şekilde

etkilendiğini saptamışlardır. Analizler sonunda 7500 ve 21500 Da ağırlığında iki

soğuk şoku proteini sentezlendiği bulunmuştur. Bu proteinlerden 21500 Da

ağırlığında olanın 15 ºC’ de gerçekleştirilen üreme sırasında sentezlenmesinin soğuk

şok cevapta asıl rol oynayan yapı olduğu belirtilmiştir (Perin ve ark.,1999).

Margesin ve Schinner, (1997), Psikrofilik mikroorganizmalar uygun sıcaklık

koşullarında çevre kirliliğine yol açan bileşiklerin parçalanması ve atık suların

arıtılmasında kullanılabileceğini belirtmişlerdir.

Mikroorganizmaların düşük sıcaklıklardaki üreme mekanizmaları tam olarak

anlaşılamamıştır. Ancak, psikrofilik bakterilerin düşük sıcaklıklarda protein

sentezleme yetenekleri onları mezofilik bakterilerden ayıran önemli bir özelliktir.

Diğer psikrotrofik dünyanın aksine, Acinetobacter sp. atık suların

arıtılmasındaki rolleri, biyosürfaktan üretimi ve lipolitik enzimleri açısından öncelikli

olarak araştırılmaktadır. Ancak bu bakterilerin düşük sıcaklığa adaptasyonda

kullandıkları enzimlerin aktiviteleri için gerekli olan optimum sıcaklık ve düşük

sıcaklıkta üremelerini sağlayan fizyolojik adaptasyon yeterince araştırılmamıştır.

Yamashita ve ark., (1998), Acinetobacter sp. KINI-1 suşunun düşük sıcaklıkta

üremesi sırasında antifiriz özelliğinde proteinler sentezlediğini belirtmişlerdir. Bu

proteinlerin Acinetobacter sp.’ nin düşük sıcaklıkta üremesini sağlamasının mümkün

olduğunu ileri sürmüşlerdir.

Csp ve Cap’ lerin her ikiside soğuk şok koşullarında sentezlenen ve Vibrio sp.,

Aquaspirillum articum, Bacillus psychrophilus, Pseudomonas fragi, Lactobacillus

lactis, Bacillus subtilis ve Vibrio vulnificus gibi sınırlı sayıda psikrofilik, psikrotrofik


61

ve mezofilik organizmada tanımlanmıştır (Araki, 1991; Panoli ve ark., 1994; Roberts

ve Innis, 1992; Whyte ve Innis, 1992).

Bakterilerin düşük sıcaklıklara adaptasyonunda membran akışkanlığı, ribozom

yapısı ve çeşitli proteinlerin uyarılarak sentezlenmesi gibi etkenlerin etkili olduğu

belirtilmektedir (Khan ve ark., 2003).




18800, 17200, 15500, 14500 ve 14400 Da olan 12 soğuk şoku proteinin sentezlendiği



Listeria monocytogenes 10403S suşu 37 ºC’ den 5 ºC’ ye aktarıldığında 5 ºC’

de üremenin gerçekleştiği ve moleküler ağırlıkları 48000, 21100, 19700 ve 18800

olan 4 cold Caps (acclimation) sentezlendiği saptanmıştır (Bayles ve ark., 1996).

Sonuç olarak,

1. P. aeruginosa ATCC 27853 suşunda 37 ºC’ de gerçekleştirilen inkübasyon

sonunda moleküler ağırlıkları farklı olan 6 protein sentezi gerçekleşmiştir.

İnkübasyon süresinin 60 dakika olarak seçildiğinde 15, 480 dakika seçildiğinde 12

olmak üzere toplamda 27 proteinin sentezlendiği gözlenmiştir.

2. P. aeruginosa balcalı-1 suşunda 37 ºC’ de gerçekleştirilen inkübasyon

sonunda 9 protein sentezi gerçekleşmiştir. İnkübasyon süresi 60 dakika olarak

seçildiği zaman 23, 480 dakika seçildiğinde ise 13 protein sentezi gerçekleşmiştir. Bu

suşla yapılan soğuk şok çalışmasında toplam 36 proteinin üretildiği saptanmıştır.

3. P. aeruginosa balcalı-2 suşunda 37 ºC’ de gerçekleştirilen inkübasyon

sonunda 5 protein üretilmiştir. İnkübasyon süresi 60 dakika olarak seçildiği zaman

20, 480 dakika seçildiğinde ise 19 proteinin üretildiği saptanmıştır. Bu suşla yapılan

cold shock araştırmasında toplam 39 proteinin üretildiği bulunmuştur.

Bacillus pscychrophilus, bakterisinin 0, 5 ve 10 ºC’ de üretildiği zaman sırası

ile 11, 10 ve 4 adet soğuk şoku proteini sentezlediği belirtilmiştir (Whyte and Inniss,

1992). Cold adapted Pseudomonas flourescens bakterisi 5 ºC’ de üretildiğinde 5 adet


62

soğuk şoku proteini sentezlemiştir. Pseudomonas flourescens 0 ºC’ de üretildiğinde

28 proteinin sentezinde artış olduğu belirtilmiştir (Colucci ve Inniss, 1996).

4. Her üç organizmada da en fazla protein 60 dakikalık inkübasyonda ve 10 ºC’

de gerçekleşmiştir. Bu sonuç soğuk şok yanıtın literatürde de belirtildiği gibi

organizmanın latent döneminde ve 10 ºC’ de maksimuma ulaştığını göstermektedir.

Michel ve ark., (1997), protein sentezinde çeşitliliğin önemli kısmının 60


sentezlenen 29 proteinden 15’ i, 30 ºC de sentezlenen 37 proteinden 24’ünün,

sıcaklık 5 ºC’ye düşürüldüğünde ilk bir saat (60 dakika) içerisinde sentezlendiğini

saptamışlardır.

5. Araştırmada kullanılan suşlar içerisinde P. aeruginosa balcalı-1 ve 2

suşlarının, P. aeruginosa ATCC 27853 suşundan daha yüksek düzeyde soğuk şok

yanıt oluşturmuştur.

6. Litaratürde de belirtildiği gibi, soğuk şoku proteini sentezleyen

organizmaların atık su arıtma sitemleri başta olmak üzere çevre kirliliğinin

giderilmesinde kullanılmaları yönünde araştırmalar vardır. Diğer psikrotrofik

dünyanın aksine, Acinetobacter sp. atık suların arıtılmasındaki rolleri, biyosürfaktan

üretimi ve lipolitik enzimleri açısından öncelikli olarak araştırılmaktadır (Margesin

ve Schinner, 1997; Yamashita ve ark., 1998). Bu açıdan bakıldığında özellikle

P.aeruginosa balcalı-2 numaralı suş bu amaçla kullanılabilecek potansiyele sahiptir.

Ayrıca Pseudomonas cinsi bakteriler gıda endüstrisinin de en başa bela bakterileridir.

Eğer bu soğuk şoku proteinler bakterilerden analiz edilip bu mikroorganizmaların

soğukta sentezlemiş oldukları proteinleri eksprese edilerek gıdalarda, özellikle süt

endüstrisinde daha uzun bir raf ömrü elde edilebilir.

63

KAYNAKLAR

ANONYMOUS,. 1978. Microbiologischen Handbook. Mecrk, Darmstad.

ARAKI, T. 1991. The effect of temperature shifts on protein synthesis by the

psychrophilic bacterium Vibrio sp. strain ANT-300. J. Gen. Microbiol.

BALLARD R. W., M. DOUDOROFFD, R. Y. STAINER ve M. MANDEL 1968.

Taxonomy of the Aerobic Pseudomonas: Pseudomonas diminuta and P.

vesiculare, J. Gen. Microbiol., 53: 349-361.

BARBARO, S.E., TREVORS, J.T., and INNISS, W.E. 2002. Effect of different

carbon sources and cold shock on protein synthesis by a psychrotrophic

Acinetobacter sp. Can. J. Microbiol. 48:239-244137:817-826.

BAROSS,J.A., and MORITA,R.Y. Microbial life at low temperatures ecological

aspects.1978. In Microbiol Life in Extreme Environments. Kushner, D.J. (ed).

Acad. Pres. New York, pp.9-71.

BAYLES, D.O., ANNOUS, B.A., and WILKINSON, B.J. 1996. Cold stres proteins

induced in Listeria monocytogenes in response to temperature downshock and

growth at low temperatures. Appl. And Environm. Microbiol. 62:1136-1139.

BEAUFILS S., SAUVAGEOT N.,2007; The cold shock response of Lactobacillus

casei relation Between HPr phosphorylation and resistance freeze/thaw cycles.

J Mol Microbiol Biotechnol ; 13:65-75.

BERGER, F., NORMAND, P., and POTIER, P. 1997. CspA a cspA like gene that

encodes a cold acclimation protein in the psychrotrophic bacterium

Arthrobacter globiformis SI55. J. Bacteriol, 179:5670-5676.

BOLLAG, D.M., and EDELSTEIN, S.J. 1991. Protein Methods, VILLEY_LISS

Pres.

BOLLAG,D.M., ROZYCKI, M.D., EDELSTEIN, S.J., 1996. Protein Methods (2nd

Edt). Viley-Liss Press, USA. 414s.

BRAY, E. A., BAILEY-SERRES, J. and WERETILNYK, E., 2000, Response to

ağabeyotic Stresses In: BUNCHANAN B., GRUISSEM W., JONES R,

Biochemistry and Moleculer Biology Rockwille, MD: ASPB,1158-1203.

64

BROEZE, R.J., SOLOMON C. J., POPE D. H. 1978. Effects of low temperature on

in vivo and in vitro protein synthesis in Escherichia coli and Pseudomonas

fluorescens. J Bacteriol 134: 861-74.

BUCHNER, J. J., GRALLET, H. And JACOB, U., 1998, “Analysis of chaperone

function using citrate synthase as nonative substrate protein”, Meth, Enzymol,

Vol.290, 323-338.

BURKE, J.J. and O’ MAHONY, P. J., 2001, Protective rol in acquired

thermololerance of developmentally regulated heat shock proteins in cotton,

Journal of cotton Sience , vol.5:173-184.

CHINTALAPATHI, S., KIRAN,M.D., and SHIVAJI, S. 2004. Role of membrane

lipid fatty acids in cold adaptation. Cellular and Molecular Biology. 50 (5):

631-642.

COLICCI, M.S., and INNISS, W.E. 1996. Ethylene glycole utilization cold and

ethylene glycole shock and acclimation proteins in a psychrotrophic bacterium.

Curr. Microbiol. 32:179-182.

CRAIG J. and BOYLE D. 1998, Expression of the cold shock gene CspB Salmonella

tyohimurium Occurs below a threshold temperature. Microbiology 144, 697-

704.

FELLER, G., NARINX, E., ARPIGNY, J.L., AITTALEB, M., BAISE, E.,

GENICOT, S., and GERDAY, C. 1996. Enzymes from psychrophilic

organisms. FEMS Microbiol, Rev. 18; 189-202.

GARCİA-MIRA and SCHMID F. 2006, Key of coulombic ıntreraction for the

folding transition satate of the cold shock protein. J. Mol. Biol 364, 458-468.

GRAUMANN, P., SCHRODER, K., SCHMID, K., and MARAHIEL, M.A. 1996.

Cold Shock stres-induced proteins in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 178; 4611-

4619.

GOLDSTEIN, J., POLLIT, N.S., and INOUYE, M. 1990. Major cold shock protein

of E. coli. Proc. Natl. Acat. Sci. USA. 87:283-287.

HANCOCK, R. E., W.,H. NIKOIDA, 1978. Outer Membranes of Gram-negative

Bacteria, XIX, Isolation from Pseudomonas aeruginosa PA01 and Use in

65

Reconstitution and Definition of the Permeability Barrier, J. Bacteriol., 136:

381-390.

HEBRAUD, M., DUBOIS, E., POTIER, P., and LABADIE, J, 1994. Effect of

growth temperatures on the protein levels in a psychrotrophic bacterium

Pseudomonas fragi. J. Bacteriol, 176:4017-4024.

HENRIKE,H., KARATZAS, A.K., WOUTERS, J.A., and ABEE, T.J. 2002.

Enhanced level of cold shock proteins in Listeria monocytogenes Lo28 upon

exposure to low temperature and high hydrostatic pressure. Appl. Env.

Microbiol. 68 (2): 456-463.

HORTON,A.J., HAK, K.M., STEFFAN, R.J., FOSTER, J.W., and BEJ, A.K. 2000.

Adaptive response to cold temperatures and characterization of cspA in

Salmonella typhimurium LT2. Antonie von Leuwenhook. 77:13-20.

IMBERT, M., and GANCEL, F. 2004. Effect of different temperature downshifts on

protein synthesis by Aeromonas hydrophila. Current Microbiology, 49:79-83.

JAGANNATHAM, M.V., CATTOPADHYAY, M.K., SUBBALAKSHMI, C.,

VAIRAMANI, M., NARAYANAN, K., RAO, C.M., and SHIVAJI, S., 2000.

Carotenoids of an Antarctic psychrotolerant bacterium. Sphingobacterium

antarcticus and a mesophilic bacterium Sphingobacterium multivorum. Arch.

Microbiol. 173:418-424.

JEFREYS, A.G., HAK, K., STEFFAN, R.J., FOSTER, J.W., and BEJ, A.K. 1998.

Growth, survival and characterization of CspA in Salmonella enteritidis

following cold shock. Curr. Microbiol. 36:29-35.

JONES, P.G., and INOUYE, M. 1994. The cold shock response-a hot topic. Mol.

Microbiol. 11:811-818.

JONES, P.G., VANBOGELEN, R.A., and NEIDHART, F.C., 1987 Induction of

Proteins in Response to Low Temperature in Escherichia coli J. Bacteriol.

169:2092-2095

KHAN, M., BAJPAI,V.K., ANASARI, S.A., KUMAR,A., and GOEL, R. 2003.

Characterization and localization of fluorescent Pseudomonas cold shock

protein (s) by monospesific polyclonal antibodies. Microbiol İmmünol, 47

(12): 895-901.

66

KLAAS E. A. MAX, WUNDERLİCH M., ROSKE Y., SCHMİD F. AND

HEINEMANN U. 2007, Optimized variants of the cold shock protein from in

vitro selection: Structural Basis of Their high thermostability. J. Mol. Biol.

369, 1087-1097.

LAEMMLI, U.K., 1970., Cleauage of Structural Proteins During the Assembly of the

Head of the Bacteriophage T4. Nature, 227: 680-685.

LINNDQUIST, S. and CRAIG, E.A., 1988, “The heat shock proteins”, Ann. Rev.

Genet.,22:631-637.

MAESTRI, E., KLUEVA, N., PEROTTA, C., GULLI, M., NGUYEN, H.T. and

MARMIROLI, N., 2001, “Molecular genetics of heat tolerance and heat shock

proteins in cereals”, Plant Molecular Biology, .48:667-681.

MANIATIS, T., FRITSCH, E.F., and SAMBROOK, J. 1982. Molecular cloning: A

Laboratory Manuel Cold Spring Harbour, New York.

MAYER, J. M., Pigment Fluorescent et Metabolisme du Fer Chez Pseudomonas

flourescens, These d’Etat, Strasbourg, 1977.

MAYR, B., KAPLAN, T., LECHNER, S., and SCHERER, S. 1996. Identification

and purification of a family of dimeric major cold shock protein homologs

from the psychrotrophic Bacillus cereus WSBC 10201. J. Bacteriol, 178:2916-

2925.

MICHEL, V., LEHOUX I., DEPRET, G., ANGLADE, P., LABADIE, J., and

HEBRAUD, M. 1997. The cold shock response of the psychrotrophic

bacterium Pseudomonas fragi involves four low molecular mass nucleic acid

binding proteins. J. Bacteriol, 179 (23): 7331-7342.

NAKAGAVA, T., FUJIMOTO, Y., UCHINO, M., MIYAJI, M., TAKANO, T., and

TOMIZU, N.2002. Isolation and characterization of psychrophiles producing

cold-active beta-galactosidase. Lett. Appl. Microbiol. 37: 154-157.

PANOLI, J.M., LEGRAND, S., THAMANAVANGS, R., and RAIFIHONNES, P.

1994. The cold shock respons in Lactococcus lactis subsp lactis. Curr.


PERRIN,C., GUIMONT,C., BRACQUART,P., and GAILLARD, J.L. 1999.

Expression of a new cold shock protein of 21.5 kDa and of the major cold

67

shock protein by Streptococcus thermophilus after cold shock. Curr.


PHADTARE, S., ALSINA, J., and INOUYE, M. 1999. Cold shock response and

cold shock proteins. Current Opinion in Microbiology. 2;175-180.

PHAN-THANH, I., and GORMON, T. 1995. Analyses of heat and cold shock

proteins in Listeria by two dimentional electrophoresis. Electrophoresis,

16:444-446.

RAY, M.K., KUMAR, G.S., JANIYANI, K., KANNAN, K., JAGTAP, P., BASU,

M.K., and SHIVAJI, S. 1998. Adaptation to low temperature and regulation of

gene expression in antarctic psychrotrophic bacteria. J. Bioscience. 23 (4):423-

435.

ROBERTS, M.E., and INNISS, W. 1992. The synthesis of cold shock proteins and

cold acclimations proteins in the psychrophilic bacterium Aquaspirillum

arcticum. Curr. Microbiol. 25:275-278.

SAKUMA, Y., LIU, Q., DUBOUZET, J.G.,2002 DNA-binding specificity of the

ERF/AP2 domain of Arabidopsis DREBs, transcription factors involved in

dehydration-and cold-inducible gene expression, Biochem. Biophys. Res.

Commun., 998-1009.

SNEATH, A. P., BERGEY’s Manuel of Systematic Bacteriology, Volume 2,

Sneath,A. P., MAIR, N. S., SHARPE, M. S., HOLT, J.G., WILLIAMS and

WILKINS, 428 East Proston Street, Baltimore, D. M., 21202.

THIERINGER,H., PAMELA,A., JONES,G., and INOUYE, M. 1998. Cold shock

and adaptation. BioAssey, 20:49-57

UNO, Y., FURUHATA, T., ABE, H., YOSHIDA, R., SHINOZAKİ, K. and

YAMAGUCHI-SHINOZAKI, K., 2000, Arabidopsis basic acid-dependent

signal transduction pathway under drought and high-salinity conditions, Proc,

Natl. Acad. Sci. USA, 11632-11637.

UYTTENDAELE, M., GRANGETTE, C., ROGERİE, F., PASTEAU, S.,

DEBEVERE, J., and LANGE, M., 1998. Influence of cold stress on the

Preliminary Enrichment Time Needed for Detection of Enterohemorrhagic

68

Escherichia coli in Ground Beff by PCR. Apll Environ. Microbiol. 64:1640-

1643.

VIERLİNG, E., 1991, the roles of heat shock proteins, Annu. Rev. Mol Biotech. 579-

620.

VIGH, L., MARESCA, B., and HARWOOD, J.L. 1998. Does the membran’s

physical state control the expression of heat shock and other genes. Trends

Biochem. 23:369-373.

WALKER V.,. PALMER G. And VOORDOUW G., 2006, Freeze-Thaw tolerance

and Clues to the winter survival of a soil community. Applied and

Environmental Microbiology 1794-1792.

WANG, W., VINOCUR, B., SHOSEYOV, B. And ALTMAN, A., 2004, Moleculer

chaparones in the abiotic stress response, Trends Plant Sci. Vol.9:244-252.

WANG, N., YAMANAKA, K., and INOUYE, M., 1999 CspI, ın the Ninth Members

of the CspA Family of Escherichia coli, Is Induced upon Cold Shock. J.

Bacteriol.181:1603-1609.

WATERS, E.R., LEE, G.J. and VIERLING, E., 1996, “Evolution, structure and function

of the small heat shock proteins in plants”, J. Exp. Bot., Vol.47, pp.325-338.

WHYTE, L.G. and INNISS, W.E. 1992. Cold shock proteins and cold acclimation

proteins in a psychrotrophic bacterium. Can. J. Microbiol. 38:1281-1285.

WUNDERLİCH M., MARTIN A. and SCHMID F. 2005,Stabilization of the cold

shock protein CspB from Bacillus subtilis by evolutionary optimization of

coulombic ınteractions. J. Mol. Biol.347, 1063-1076.

YAMANAKA, K., and INOUYE,M. 2001. Induction of CspA an E.coli major cold

shock protein upon nutritional upshift at 37 ºC. Genes to Cells, 6:279-290.

YAMASHITA, Y., KAWAHARA, H., and OBATA, H. 1998. Purifications and

characterizations of anti-freeze proteins produced by Acinetobacter sp. KINI-1

and Bromhomella sp. KAF-1. FASEB J. 11:2449-2460.

ZHAO and YEO, 2006, Proteome analysis of Heat Shock Protein expression.

Pseudomonas alcaligenesis NCIMB 9867 in Response to gentisate exposure

and elevated growth temperature. Genome Institue of Singapore 138672.

69

ÖZGEÇMİŞ

1983 yılında İskenderun’ da doğdum. İlk ve orta öğrenimimi İskenderun’ da

tamamladım 2002 yılında Çukurova Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji

Bölümü’ ne kaydoldum. 2006 yılında mezun oldum. Yine aynı sene Çukurova

Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı’ nda Yüksek Lisans

öğrenimime başladım.

Çukurova Ünİversİtesİ fen bİlİmlerİ enstİtÜsÜ …library.cu.edu.tr/tezler/7478.pdf ·...

Documents