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Cromatografia–Noções gerais e Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência:
Vitória Berg Cattani
Universidade Federal de Santa MariaCentro de Educação Superior Norte - RS
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CROMATOGRAFIA
Michael Tswett - 1906
éter depetróleo
CaCO3
mistura depigmentos
pigmentosseparados
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CROMATOGRAFIA
Separação de misturas por interação diferencial dos seus componentes entre uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou
sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).
Princípio Básico
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TIPOS DE MECANISMOS Depende do tipo de fase estacionária.
Transferência dos componentes da fase móvel para a fase estacionária.
ADSORÇÃO
Na superfície das partículas sólidas.
PARTIÇÃO
Entre os líquidos da fase móvel e da fase estacionária que fica nos poros de um suporte sólido inerte.
BIOAFINIDADE
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TIPOS DE MECANISMOS
TROCA IÔNICA
Com componentes iônicos da fase estacionária;
Inclui resinas trocadoras de cátions e de ânions.
EXCLUSÃO
Processo mecânico
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CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA
CROMATOGRAFIACROMATOGRAFIA
Planar Em coluna
Gasosa Fluidosupercrítico
LíquidaLíquido
Centrífuga (chromatotrom)
CCD CP CG ClássicaCGAR CLAE
ou HPLC
Técnica
Fase Móvel
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CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA: 1. PLANAR
padrões amostras
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CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA: 1. PLANAR
Aplicações:
•separação de substâncias;
•identificação de substâncias.Rf = ds/dmdm
ds1
ds2
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CHROMATOTRON®
Aplicações:
•separação de substâncias.
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA: 1. PLANAR
Eluente
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CROMATOGRAFIA EM COLUNA CLÁSSICA
Aplicações:
•separação de substâncias.
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA: 2. EM COLUNA
Solvente
Fase estacionária
Algodão
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CROMATOGRAFIA EM COLUNA CLÁSSICA
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA: 2. EM COLUNA
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CROMATOGRAFIA GASOSA
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
Usada para separar compostos orgânicos voláteis;Separação ocorre devido a partição entre:
fase móvel (gás inerte);fase estacionária (sílica da coluna).
Aplicações:
Separação de substâncias;
Identificação de substâncias:
tempo de retenção;
espectro de massas (CG-MS);
Quantificação de substâncias (padrão).
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AU
ME
NT
O D
A
TE
MP
ER
AT
UR
A D
A C
OL
UN
A
CROMATOGRAFIA GASOSA
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA: 2. EM COLUNA
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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) OU
HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA: 2. EM COLUNA
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HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
COLUNA CROMATOGRÁFICA
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HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
COLUNA CROMATOGRÁFICA
Solvente (fase móvel)
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HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
FASE ESTACIONÁRIA
FASE NORMAL
Superfície da sílica com característica POLAR.
FASE REVERSA
Superfície da sílica com revestimento APOLAR.
Ex.: C18 (ODS), C8 – fase ligada;
Ex.: poliestireno, poliacrilato – polímeros adsorvidos.
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HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
FASE ESTACIONÁRIA
CH3O
CHCH3
COOH
Si O Si O
Si O Si O
OH OHPontes de hidrogênio
Si O O
Si O Si O
Fase normal (sílica gel) Fase reversa (sílica ODS)
COOH
CHCH3
CH3OInteração Van der Waals
OC18H37 OC18H37
Si
Figura 1- Interação do naproxeno com a superfície da sílica gel e sílica gel ODS
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HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
ESTRUTURA DO HPLC
fase móvel
descarte
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HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
ESTRUTURA DO HPLC
fase móvel
descarte
bomba
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HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
ESTRUTURA DO HPLC
fase móvel
descarte
bomba injetor
detector
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HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
ESTRUTURA DO HPLC
fase móvel
descarte
bomba injetor
detector
mistura
degasser
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HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
ESTRUTURA DO HPLC
fase móvel
descarte
bomba injetor
detector
mistura
degasser
ELUIÇÃO ISOCRTÁTICAOU ELUIÇÃO EM GRADIENTE
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HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
ESTRUTURA DO HPLC
fase móvel
descarte
bomba injetor
detector
Degas-ser
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HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
ESTRUTURA DO HPLC
fase móvel
descarte
bomba injetor
detector
Degas-ser
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HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
ESTRUTURA DO HPLC
fase móvel
descarte
bomba injetor
detector
Degas-ser
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HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
ESTRUTURA DO HPLC
fase móvel
descarte
bomba injetor
detector
Degas-ser
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HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
ESTRUTURA DO HPLC
fase móvel
descarte
bomba injetor
detector
Degas-ser
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HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
ESTRUTURA DO HPLC
fase móvel
descarte
bomba injetor
detector
Degas-ser
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HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
DETECTORES:
UV/vis – baseado na absorção de luz pelo analito. Boa sensibilidade (0,01-100µg)
DAD (diode array detector) – tipo avançado de UV
Fluorescência
Eletroquímico
Massa
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HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
APLICAÇÕES:
Separação de substâncias;
Identificação de substâncias:
tempo de retenção;
espectro de absorção no UV-VIS( HPLC-UV/VIS);
Quantificação de substâncias (padrão).
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HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
VANTAGENS:
Versatilidade (compostos orgânicos, inorgânicos, sólidos, líquidos) e variedade de colunas e detectores;
Seletividade;
Menor risco de degradação da amostra (CG);
Boa sensibilidade (nanogramas).
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HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
LIMITAÇÕES:
Alto custo do equipamento;
Alto custo da operação (colunas e solventes);
Experiência do analista no manuseio do equipamento;
Necessidade de extração antes do uso;
Grande quantidade de resíduo formado.
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CLAE – PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS
•Retenção ou Fator de Capacidade (k’)•Mede o tempo de permanência do composto na fase estacionária comparado com o tempo de permanência na fase móvel durante a corrida.
•Indica o grau de afinidade que a fase estacionária e a fase móvel possuem pelo composto.
0
01
0
01'V
VV
T
TTK
T0: tempo de retenção de um composto não retido pela coluna
•Seletividade ()•Compara a retenção de um componente com a retenção de outro componente, indicando até que ponto o sistema químico (coluna e fase móvel) os diferencia.
01
02
1'
2'
VV
VV
K
K
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CLAE – PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS
•Resolução (R)•Avalia a qualidade da separação entre dois componentes de acordo com uma determinada condição cromatográfica.
)( 122
12
WW
TTR
•Eficiência (N)•Indica o quanto o sistema de CLAE permite que a banda de um componente se dilua durante a corrida cromatográfica.
•Avalia o alargamento da banda de um pico de um componente causados por fatores ligados ao injetor, coluna, fase móvel, detector.
2
1
116
W
TN
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CLAE – PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS
•Influência da geometria da coluna na separação Influência da geometria da coluna na separação cromatográficacromatográfica
•Comprimento (maior)
•Maior eficiência (no de pratos teóricos);
•Maior tempo de análise e consumo de solventes;
•Maior resolução;
•Maior capacidade;
•Maior pressão de trabalho.
•Diâmetro interno (menor)
•Maior seletividade (picos mais finos);
•Maior eficiência (menor diluição do pico);
•Menor capacidade;
•Análise mais rápida, menor consumo de solventes e menor pressão.
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SPE NH2
SPE C18
Benomyl
Tebuthiuron
Simazine
Atrazine
Diuroion
Ametryn
Coluna C18, FM: ACN:0,01% NH4OH (35:65, v/v), fluxo 0,7 mL/min.
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Triazine
Simazine
Atrazine
FM: ACN:H2O: CH3COOH (50:50:0,01, v/v)
Coluna C18; fluxo: 0,3 mL/mi); detecção: 220nm
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Folpet
Chlorothalonil
Quinomethionat
Tetradifon
Trifluralin
FM (gradiente côncavo): ACN:H2O (40:60 a 90:10 em 20 min; permaneceu 90:10 por 5 min; retornou a 40:60 em 5 min).
Coluna C18; fluxo: 1,0 mL/min; detecção: 220 e 260 nm