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CROMATOGRAFÍA
(parte I)
Graciela Escandar
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Conceptos generales Clasificación La elución en cromatografía en columna Resolución
Sistemas cromatográficos (reparto, adsorción, intercambio iónico y exclusión molecular)
Cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) Cromatografía de gases
TEMAS A DESARROLLAR
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Origen
A principios del siglo XX, el botánico ruso Tswett separó pigmentos vegetales pasando soluciones de estos pigmentos por una columna de vidrio empaquetada con CaCO3. Las especies separadas aparecían como bandas de colores, lo que dio origen al nombre del método
chroma = color graphé = escribir
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Fase móvil (líquida o gaseosa): contiene los componentes a separar y fluye a través de la fase estacionaria
Fase estacionaria (líquida o sólida): a través de la cual fluye la fase móvil y donde quedan momentáneamente retenidos los componentes de la muestra
Un sistema cromatográfico consta de dos fases
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Cromatografía: técnica separativa donde
los componentes de una muestra se
distribuyen entre dos fases (FM y FE), como
consecuencia de su diferente afinidad hacia
dichas fases. La separación se basa en las
distintas velocidades de migración de los
analitos, determinadas por el tiempo que
permanecen en cada fase
Definición
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líquida
sólida
resina i.i.
gel poroso
otras
líquida
sólida
L-L y L-FL partición L-L
intercambio iónicoInter. Iónico
G-L y G-FL
exclusión
G-S
tamizado
L-S
adsorción
partición G-L
adsorción
afinidad reacción específica
Líquida(cromatografía líquida)
Gaseosa(cromatografía gaseosa)
Fluido supercrítico (cromatografía de fluidos supercríticos)
FM FE Método InteracciónClasificación
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Clasificación
De acuerdo a la disposición física de la FE
Planar
papel
capa delgada
Columna
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B Detector
B
At0
BA
BA
Muestra
Cromatografía en columna: elución
A + B
t2t1 t4t3
FM FM FM FM
Análisis cualitativo y cuantitativo
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Objetivo de la cromatografía
resolver los componentes de una muestra
Cromatograma con picos no resueltos
Mejora por aumento en la separación de bandas
Mejora por disminución del ancho de bandas
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1t
t2
B A
3t
B A
Distribución de A y B dentro de la columna
Distancia de migración (L)
Con
cent
raci
ón (
CE)
El ensanchamiento de cada banda se produce a una velocidad menor que su desplazamiento → se logran separaciones exitosas
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Teorías del proceso cromatográfico
Teoría de los platos: concepto de N y H (similitud con columna de destilación fraccionada). Explica la forma gaussiana de las bandas pero no su ensanchamiento durante el proceso cromatográfico.
Teoría cinética: La columna opera en situación de no-equilibrio. Nuevo concepto de N y H
La teoría del proceso cromatográfico debe explicar las variables que influyen en la velocidad de migración de los analitos y en el ensanchamiento de las bandas
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SE
ÑA
L D
ET
EC
TO
RtR
TIEMPO
tR
Cromatograma
compuesto no retenido por FE
analito
tM
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CE
CM
Cromatografía líquida Cromatografía de adsorción
Isotermas de reparto y adsorción
CM
mda/mte
masa adsorbida/masa adsorbente
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Factor de separación (factor de selectividad)
Factor de retención(factor de capacidad)
= kB
kA
k = nE
nM
Constante de reparto
K =CE
CM
Constantes termodinámicas
Mide la distribución del analito entre FE y FM
Describe la velocidad de migración del analito en la columna
Mide la selectividad de la columna de un analito respecto a otro
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Relación entre las constantes termodinámicas y el tiempo de retención
velocidad lineal del soluto v = L/tR
velocidad lineal de la FM u = L/tM
velocidad relativa del analito dentro de la columna
v/u = L/tR
L/tM
La velocidad relativa también se puede definir a partir de la fracción molar del soluto en la FM
v/u = nM
nM + nE
=1
1 + nE/nM
v/u = tM/tR
=1 + k
1
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Igualando los segundos miembros de ambas expresiones
tM
tR 1 + k
1= tR = tM (1 + k)
tR = tM (1 + K VE/VM)
tR - tM
tM
k =
v/u = tM/tR =1 + k
1v/u
velocidad relativa
Relación entre las constantes termodinámicas y el tiempo de retención
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señ
al d
etec
tor
tiempo
W= 4
punto de inflexión
Ancho de banda
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Parámetros relacionados con el ancho de banda
N y H
N = 16 (tR/W)2
N = L/H
Eficiencia
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N = 16 (tR / W)2
DemostraciónH = 2/L
LtR
= LtR
= 2 2
2 2
LtR
= HLtR
= 2
2
HWL16tR
= 2
2
LtR
HW
= 162
N
recordando que: W = 4= W/4
N = 16 (tR / W)2
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Ecuaciones relacionadas con la eficiencia
H = A + B/ + C
Relacionan la altura de plato teórico con los procesos dispersivos que ocurren dentro de la columna (A, B y C) y la velocidad de la fase móvil
difusión en remolino
difusión longitudinal
Ecuación de van Deemter
H = A + B/ + CE + CM
Otra ecuación
resistencia a la transferencia de masa
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2
1
2
Difusión en remolino
A = 2 dp
33
1
constante de empaque
diámetro medio de partículas
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B = 2 DM
Dir
ecci
ón
de
FM
Difusión longitudinal
factor de obstrucción
coeficiente difusión del analito en FM
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FMFE
FMFE
dirección de elución
Resistencia a la transferencia de masa
Desde y hacia la FE: CE
t1
t2
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FE líquida
FE sólida
E2
2fEDk)(1
qkdC+
=
2d
Ek)(1
k2tC
+=
Resistencia a la transferencia de masa
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Dentro de la FM: CM
soporte soporte
M
2c
2p
MD
)d,,f(dC
=
Resistencia a la transferencia de masa
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H
H = A + B/ + CE + CM
H mínimo
óptimo
AB/
CE
CM
Ecuación de van Deemter
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Tiempo
Señ
al d
el d
etec
tor
0
1
tr
WA WB
Resolución
2tr(WA + WB)
R =
kBR =
1+kB
4
N
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Optimización de la columna
aumentar la separación entre bandas (tR)
Modificar variables termodinámicas (K, k y ) modificando FM, FE y temperatura
disminuir el ancho de bandas
Modificar variables que permiten ↓H y ↑N (ecuación tipo van Deemter)