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CROMATOGRAFÍA
Fase estacionaria: sólido o líquido fijado a un sólido
Fase móvil: fluído (líquido o gas) que arrastra la muestra a través de la fase estacionaria
Los distintos componentes de la mezcla interaccionan de manera diferente con las dos fases estableciéndose un
reparto entre ambas
Se establece un equilibrio entre partículas adsorbidas y desorbidas
α = [moléculas adsorbidas] [mol. adsorbidas] + [mol. desorbidas]
coeficiente de reparto
FASE ESTACIONAR
IA
FASE MÓVIL
Clasificaciones de cromatografía
1. Según como se encuentre la fase estacionaria
b. batch
a. columna
c. plana cromatografía en papel y en capa fina
2. Según el tipo de fase estacionaria y fase móvil
Fase estacionaria
Líquido adsorbido
Fase móvil
Sólida Líquida o gaseosa
Líquida o gaseosa
3. Según el tipo de flujo empleado
a. Gravedad
b. Capilaridad (papel, capa fina)
c. Fluído a presión (HPLC)
HPLC (high performance liquid chromatography)
Se basa en los mismos principios que la cromatografía a baja presión
Tiene mejor resolución, tiempos menores, mejor reproducibilidad
El material empacado en las columnas está formado por pequeñas partículas de tamaño muy uniforme y gran rigidez
Permite trabajar con flujos altos para lo que se requiere aplicar presión
Se requiere de columnas especiales construidas en acero inoxidable o vidrio grueso
FPLC (fast protein liquid chromatography)
Es una variante del HPLC con columnas y equipamiento especialmente diseñado para separar o purificar proteínas
Las columnas de FPLC soportan menos presión que las de HPLC
4. Según la finalidad del experimento
Separación y purificación Preparativa
Separación, cuantificación y caracterización
Analítica
4. Según la interacción entre la fase móvil y el soluto
a. Cromatografía de intercambio iónico carga-carga
b. Cromatografía de interacción hidrofóbica efecto hidrofóbico
c. Cromatografía de afinidad variada pero específica
d. Cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC)
e. Cromatografía de fase normal y reversa dipolo-dipolo
enlaces coordinación
Cromatografía de intercambio iónico
La separación se basa en diferencias de carga a un pH dado
Las interacciones son electrostáticas
Dos tipos
Elución: puede llevarse a cabo mediante cambios de pH, fuerza iónica o ambos
Intercambio aniónico: matriz cargada positivamente (DEAE, TEA, QAE)
Intercambio catiónico: matriz cargada negativamente (CarboxiMetilos (CM), Sulfonatos (S), fosfatos)
DEAE
Q (DEPEA)
Q (TMEA)
CM
S
Cromatografía de intercambio iónico
La carga neta de la proteína depende de su p.Isoeléctrico y el pH
Elución: puede llevarse a cabo mediante cambios de pH, fuerza iónica o ambos
Interacción con:
Intercambiador catiónico
Intercambiador aniónico
Cromatografía de intercambio iónico
Amonio Quaternario
Cromatografía de intercambio iónico
Cromatografía de afinidad
Se basa en una interacción biológica específica:
Enzima-sustrato
Anticuerpo-antígeno
Enzima-coenzima
Proteína-ligando específico
La elución se puede lograr agregando el ligando (el que está unido a la columna) en solución o mediante cambios en el buffer que sean capaces de debilitar la interacción
Cromatografía de afinidad
Interacción Biológica específica:
La elución se puede lograr agregando el ligando (el que está unido a la columna GSH / Imidazol) en solución o mediante cambios en el buffer que sean capaces de debilitar la interacción (bajar el pH, etc.)
Inmovilizado en Columna
Glutatión
Proteína A (o G)
Streptavidina
Quelante con Ni2+
Proteína
Recombinante de fusión con GST
Anticuerpo - IgG
Conjugada con biotina
Recombinante de fusión poliHistidina
IMAC (immobilized metal affinity chromatography)
Se basa en la formación de enlaces de coordinación entre iones metálicos inmovilizados y grupos básicos en proteínas (histidinas)Principalmente a los iones divalentes de metales de transición como Fe, Co, Ni, Cu y Zn
La elución se lleva a cabo adicionando quelantes más fuertes como el imidazol a distintas concentraciones (hasta 500 mM) o cambios en el pH
Es muy utilizada para la purificación de proteínas recombinantes
Generalmente se adicionan 6 histidinas en el extremo Nt o en el Ct
Cola de (Histidina)6
Ni2+
Cromatografía de interacción hidrofóbica
El soporte está sustituído con cadenas alifáticas de 2 a 10 carbonos (eter, c4-c8) u otros grupos hidrofóbicos (Fenilos)
La interacción es de tipo hidrofóbica (guiada por entropia)
La fase móvil debe tener una alta concentración de sales ((NH4)2SO3 2 – 4 M)
Salting out
Para la elución se disminuye la concentración de sales en la fase móvil
Cromatografía de interacción hidrofóbica
Cromatografía de interacción hidrofóbica
Cromatografía de fase reversa
Está muy relacionada con la cromatografía de interacción hidrofóbica pero son diferentes
El soporte está sustituído por alifáticas pero más largas (8 -18 carbonos/ C8-C18) y la densidad de sustituyentes es mayor
La unión es más fuerte y por eso requiere mezclas con solventes no polares para la elución
Desnaturaliza proteínas Se usa mas para péptidos y algunas proteínas particularmente hidrofóbicas
Se utiliza en HPLC
Cromatografía de fase reversa
Gel filtración (cromatografía de exclusión molecular / SEC)
No es una cromatografía estrictamente porque no ocurre adsorción
La separación se da por tamaño radio hidrodinámico
El gel debe ser inerte, de tamaño de poro definido y sin carga
Las proteínas mas pequeñas pueden entrar por difusión simple en las partículas en la fase estacionaria, por lo que son retenidas más tiempo y salen más tarde en una cromatografía.
Aplicaciones:
Cambios de buffer / desalado PD-10 (gravedad) / HiTrap (FPLC)
Aplicaciones:
Determinación del peso molecular
Aplicaciones:
Purificación de proteínas
La pregunta más importante…
¿En qué son distintas las sustancias que deseo separar?
Concluyendo….