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Dra. Shanise Lisie Mello El Halal
Disciplina de Tecnologia de Pós-colheita e Industrialização de Arroz
Cromatografia aplicada a determinação de qualidade de arroz
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“Qualidade é o grau em que um
produto atinge ou excede as
expectativas do consumidor”
Fonte: FAO – Food Safety and Quality in Europe (2004).
Agregação de valor
Propriedades nutricionais e sensoriais
Ausência de defeitos
e adulterações
O que é qualidade?
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Visão geral dos componentes em alimentos
Componentes voláteis
• Sabor e fragrância
• Sabores indesejáveis
Não voláteis e semi voláteis
• Lipídeos
• Proteínas
• Carboidratos
• Carotenoides
• Vitaminas
• Antioxidantes
• Polifenóis....
Outros
• Agrotóxicos
• Medicamentos veterinário
• Micotoxinas
• Contaminantes - como metais
• Migrantes de material de embalagens
• Resíduos de processo e/ou armazenamento
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Determinação de compostos orgânicos em alimentos
Extração com solventes orgânicos
Separação, identificação e quantificação cromatografia
Cromatografia de camada delgada
Cromatografia líquida de alta
eficiência
Cromatografia gasosa
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Principais técnicas de extração
Extração Líquido-Líquido
Extração em Fase Sólida (SPE)
Microextração em fase sólida - Voláteis
Coluna de iminoafinidade – Micotoxinas
QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe)
(Rápido, Fácil, Barato, eficaz, robusto, seguro
Multiresíduos de agrotóxicos e micotoxinas
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Procedimentos de purificação do extrato da amostra comumente utilizados para análise em alimentos. (A) extração líquido-líquido (LLE), (B) extração em fase sólida (SPE) e (C) coluna de imunoafinidade (IAC).
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Extração a partir da técnica Microextração em fase sólida
Muito usada para compostos voláteis
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Extração a partir da técnica QuEChERS
Acetonitrila = extrai ampla faixa de agrotóxico Menor extração de interferentes lipofílicos Sal diminui solubilidade dos componentes polares, aumentando sua recuperação. PSA (AMINA PRIMARIA SECUNDÁRIA) Sorvente que remove interferentes da matriz Açucares , ácidos graxos, ácidos orgânicos, pigmentos.
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Extração a partir da técnica QuEChERS
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Histórico da Cromatografia
Mikhail (Michael, Mikhael) Semenovich Tswett (1903), botânico russo: Separação de misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com adsorventes sólidos e solventes variados.
éter de petróleo
CaCO3
mistura de pigmentos
pigmentos separados
1906 Cromatografia = chroma [cor] + graphe [escrever] (grego)
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Definição de cromatografia
Método de separação no qual a amostra sofre um processo de partição entre duas fases: uma permanece imóvel (estacionária) e a outra percola através dela (móvel).
Figura 1. Esquema simplificado de separação de duas misturas.
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Analogia O processo cromatográfico pode ser comparado a um grupo de abelhas e moscas sobrevoando uma certa região.Ao passarem por uma flor, espera-se algum efeito sobre as moscas e abelhas.
Fase estacionária Analitos
Definição de cromatografia
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Analogia Para uma mesma mistura, a simples troca da fase estacionária pode ser suficiente para alterar completamente a ordem de eluição de componentes da mistura.
Fase estacionária Analitos
Definição de cromatografia
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Classificação
Técnica
Planar
Coluna
Fase móvel
Liquida
Gás
Tipo de cromatografia
Camada delgada
Líquida
Gasosa
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Mecanismo de separação
Adsorção
Absorção (Partição)
Troca iônica
Exclusão
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Adsorção A adsorção ocorre entre a interface entre o sólido e a
fase móvel, devido aos grupos ativos da superfície.
OH
OH OH
Mecanismo de separação
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Absorção (Partição) • Processo intrafacial e baseia-se na diferença de
polaridade. OH
Mecanismo de separação
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Diferença entre Absorção e Adsorção
Mecanismo de separação
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Troca iônica
Resina _
+
Troca Catiônica
contra-íon
Resina +
-
Troca Aniônica
contra-íon
Processo químico onde na FE estão adicionados grupos ionizáveis.
A FM é tamponante de acordo com o tipo de trocador usado.
Mecanismo de separação
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Exclusão • Processo mecânico, onde partículas com tamanhos
diferenciados são separadas.
Fase Estacionária
Mecanismo de separação
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Cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE)
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Quais misturas podem ser separadas por CLAE ?
Líquidos e sólidos
Para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um líquido ela deve dissolver-se nesse líquido.
DE FORMA GERAL: CL é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes sejam
solúveis na FM. Não há limitação de volatilidade ou de estabilidade térmica.
Cromatografia líquida de alta eficiência
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Cromatografia líquida de alta eficiência
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FASE MÓVEL A fase móvel é o solvente que arrasta a amostra pela coluna (FASE
ESTACIONÁRIA)
A escolha da fase móvel depende:
Compostos a serem separados;
Tipo de coluna;
Cuidados com os solventes:
Eliminação de impurezas;
Água ultrapura, solventes orgânicos;
Uso de filtros no reservatório da FM;
Cromatografia líquida de alta eficiência
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Coluna (Fase estacionária)
Cromatografia líquida de alta eficiência
•Material: aço inox
•Comprimento: 10 a 30 cm
•Diâmetro: 4 a 10 mm
•FE: Partículas de 5 a 10 mm
•Eficiência: 40 mil a 60 mil pratos/metro
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Coluna (Fase estacionária)
Cromatografia líquida de alta eficiência
As fases estacionárias quimicamente ligadas são as fases mais importantes da cromatografia líquida.
Coluna C18 (Octadecilsilano)
Mais usado nos laboratórios de cromatografia. Devido: estabilidade do ligante e por ser compatível com as análises em fase reversa (mais comuns utilizadas) e a maioria dos compostos orgânicos tem interações com essa coluna.
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Detectores
Dispositivos que examinam continuamente o material eluído, gerando sinal quando da passagem de substâncias.
Cromatografia líquida de alta eficiência
Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA Idealmente: cada substância separada aparece como um PICO no cromatograma.
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UNIVERSAIS: Geram sinal para qualquer
substância eluída.
SELETIVOS: Detectam apenas
substâncias com determinada
propriedade físico-química.
ESPECÍFICOS: Detectam substâncias
que possuam determinado
elemento ou grupo funcional em
suas estruturas
Detectores
Cromatografia líquida de alta eficiência
Ex: ESPECTROMETRO DE MASSA
Ex: FLUORESCÊNCIA
EX: DE NITROGÊNIO E FÓSFORO
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Cromatografia gasosa (CG)
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Quais misturas podem ser separadas por CG ?
Misturas cujos constituintes sejam VOLÁTEIS (=“evaporáveis”)
Para uma substância qualquer ser “arrastada” por um fluxo de um gás ela deve dissolver-se, pelo menos parcialmente, nesse gás.
DE FORMA GERAL: CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes
tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300oC e que sejam termicamente estáveis.
Cromatografia gasosa
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Esquema de um cromatográfico a gás
Cromatografia gasosa
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Fase estacionária
Fase móvel
Detecção
Esquema de um cromatográfico a gás
Cromatografia gasosa
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Fase Móvel - Gás de arraste
INERTE: Não deve reagir com a amostra, nem com a fase estacionária ou superfícies do instrumento.
PURO: Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária.
Cromatografia gasosa
Mais usado HÉLIO
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Fase estacionária - Colunas EMPACOTADA
= 3 a 6 mm
L = 0,5 m a 5 m
CAPILAR
= 0,1 a 0,5 mm
L = 5 m a 100 m
Paredes internas recobertas com um filme fino (fração de m) de FE líquida
ou sólida
Cromatografia gasosa (CG)
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Cromatografia para análise de agrotóxico em arroz
Nas lavouras Brasil à fora, os agrotóxicos são utilizados para o controle de pragas, doenças e plantas daninhas.
O uso de agrotóxicos podem representar significativos riscos ambientais e à saúde humana quando produtores não utilizam produtos recomendados ou não seguem as especificações técnicas de aplicação.
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Arroz recusado por exceder LMRs
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Distribuição de agrotóxicos no arroz
Tebuconazol - 150 g/hectare
1 aplicação em estágio R3
~18 mg ia/kg
13,6 mg ia/kg 3,3 mg ia/kg
1,1 mg ia/kg SOLO + COLMO + FOLHAS
CASCA
FARELO
Fonte: Dors et al., J. Braz. Chem. Society, 22 (10), 1921-1930, 2011.
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Distribuição de agrotóxicos no arroz
Arroz polido <0,01 ppm
75%
18% 6%
Solo, colmo, folhas
Casca
Farelo
Arroz integral ~0,13 ppm
Fonte: Dors et al., J. Braz. Chem. Society, 22 (10), 1921-1930, 2011.
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DETECTOR Espectrômetro de massas
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DETECTOR Espectrômetro de massas
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Análise “multiresíduo”
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Micotoxinas metabólitos secundários produzidos por fungos.
Já encontradas no arroz, destacam-se: aflatoxinas (AFs), Ocratoxina A (OTA), Desoxinivalenol (DON), Zearalenona (ZON) e Fumonisina (FUM).
Cromatografia para análise de micotoxinas em arroz
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Deoxinivalenol e Nivalenol
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Determinação de compostos fenólicos em arroz
Os metabólitos primários e secundários têm sido usados para
discriminar a origem geográfica dos alimentos.
cromatografia gasosa e a cromatografia líquida, acopladas à
espectrometria de massa tem sido utilizada.
Análise de fenólicos
Cromatografia para análise de compostos fenólicos
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Cromatografia para análise de compostos fenólicos
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Cromatografia para análise de compostos fenólicos
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Exemplo de cromatograma –
Mira et al., 2008. Ciênc. Tecnol. Aliment. vol.28 no.4 Campinas Oct./Dec. 2008
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Cromatografia para análise de proteínas
Distribuição molecular de proteínas de arroz
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Cromatografia para análise de proteínas
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Cromatografia para análise de compostos voláteis
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Cromatografia para análise de arsênio