crecimiento de biofilm de placa dental en fedula con discos
TRANSCRIPT
5/7/2018 Crecimiento de Biofilm de Placa Dental en Fedula Con Discos - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/crecimiento-de-biofilm-de-placa-dental-en-fedula-con-discos 1/28
Influencia del ritmo circadiano en la sustantividad in vivo de la clorhexidina
1
RESUMEN
Se evaluó la sustantividad in vivo de la clorhexidina al 0,2% sobre la saliva
y la placa bacteriana, diferenciando entre 2 momentos de aplicación (diurna vs
nocturna), mediante microscopía de epifluorescencia y de láser confocal.
Nuestros resultados corroboran el mayor dinamismo fisiológico de la flora
salival y la posible función reservorio asociada a la estructura de la placa " de
novo ".
5/7/2018 Crecimiento de Biofilm de Placa Dental en Fedula Con Discos - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/crecimiento-de-biofilm-de-placa-dental-en-fedula-con-discos 2/28
Influencia del ritmo circadiano en la sustantividad in vivo de la clorhexidina
2
INTRODUCCIÓN
El estudio de la actividad antibacteriana in vivo de un antiséptico implica el
análisis de su efecto inmediato y de su sustantividad. La sustantividad se define
como la adherencia prolongada del antiséptico a las superficies orales (dientes
y mucosas) y su liberación lenta a dosis eficaces que garanticen la persistencia
de su actividad antimicrobiana (Manau y Guasch, 2003 ). Numerosos autores
demostraron que la Clorhexidina (CHX) provoca el mayor efecto antibacteriano
inmediato y presenta la mayor sustantividad in vivo en comparación a otros
antisépticos empleados en la cavidad oral (Moran et al, 1992; Jenkins et al,
1994; Elworthy et al, 1996; Balbuena et al, 1998 ). Por ello, en la mayoría de los
estudios microbiológicos más recientes, la CHX al 0,12% o al 0,2% se aplica
como control positivo, para analizar los resultados obtenidos con otros
principios activos sobre diferentes ecosistemas orales (Fernandes-Naglik et al,
2001; Rosin et al, 2002; van der Mei et al, 2006 ).
Sin embargo, actualmente existen aspectos asociados a la actividad
antibacteriana de la CHX que no están suficientemente investigados. Se ha
demostrado que la retención de la CHX en la cavidad oral depende no sólo de
la naturaleza del producto, sino también de factores intrínsecos asociados al
antiséptico (como la concentración, el tiempo y la temperatura) y de factores
extrínsecos (como la presencia de dientes, prótesis dentarias o materia
orgánica, el pH salival, así como la ingesta de comida o bebida) (Bonesvoll et
al, 1974; Bonesvoll y Olsen, 1974; Tsuchiya et al, 1999), lo que podría
condicionar su actividad antibacteriana. Hasta el momento, pocos autores han
estudiado la actividad antibacteriana in vivo de una única aplicación de CHX
5/7/2018 Crecimiento de Biofilm de Placa Dental en Fedula Con Discos - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/crecimiento-de-biofilm-de-placa-dental-en-fedula-con-discos 3/28
Influencia del ritmo circadiano en la sustantividad in vivo de la clorhexidina
3
sobre el ecosistema oral, analizando la influencia de factores intrínsecos y
extrínsecos al enjuague (König et al, 2002; Caballero et al, 2009).
Desde hace varias décadas, la determinación de los recuentos
bacterianos salivales representa una prueba aceptada por la comunidad
científica para investigar el efecto antibacteriano in vivo de la CHX (Addy y
Moran, 1997; Sekino et al 2003 ), siendo considerada predictora de su
sustantividad (Roberts y Addy, 1981; Addy et al, 1989; Jenkins et al, 1994) y de
su actividad antiplaca (Jenkins et al, 1990 ). A partir de los primeros resultados
aportados por Schiött et al en 1970 (Schiött et al, 1970 ), existen numerosos
estudios en la literatura en los que se evaluó la sustantividad de la CHX sobre
la flora salival (Moran et al, 1992; Jenkins et al, 1994; Elworthy et al, 1996;
Balbuena et al, 1998 ).
Se demostrado en investigaciones in vitro que el biofilm dental presenta
una mayor resistencia a los agentes antibacterianos como consecuencia de un
ritmo lento de crecimiento, de la dificultad para penetrar su estructura y de la
posible inactivación del agente en su interior (Wood et al, 2000 ). Por
consiguiente, el otro nicho ecológico oral sobre el que se ha estudiado
ampliamente la actividad antibacteriana in vivo de la CHX es la placa
bacteriana (König et al, 2002; Arweiler et al, 2002; van der Mei et al, 2006;
García-Caballero et al, 2008 ).
En la mayoría de las series publicadas, la determinación de la actividad
antimicrobiana in vivo de la CHX en saliva se efectuó con técnicas
microbiológicas de cultivo en placa (Moran et al, 1992; Jenkins et al, 1994;
Elworthy et al, 1996; Balbuena et al, 1998; Tomás et al, 2008 ). Sin embargo,
hay autores que cuestionaron la fiabilidad de estas técnicas y propusieron
5/7/2018 Crecimiento de Biofilm de Placa Dental en Fedula Con Discos - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/crecimiento-de-biofilm-de-placa-dental-en-fedula-con-discos 4/28
Influencia del ritmo circadiano en la sustantividad in vivo de la clorhexidina
4
como alternativa los métodos de fluorescencia que emplean fluorocromos
específicos para el marcaje de bacterias viables y no-viables (Weiger et al,
1998; Caballero et al, 2009; Tomás et al, 2009 ).
Existen estudios recogidos en la literatura en los que la determinación de
la actividad antimicrobiana in vivo de la CHX sobre la placa dental se efectuó
con técnicas microbiológicas de cultivo en placa (Rosin et al, 2001; Rosin et al
2002 ). Sin embargo, desde que Netuschil en 1983 (Netuschil, 1983 ) aplicó por
primera vez las técnicas de fluorescencia para la investigación del biofilm
dental, numerosos autores utilizaron estos métodos para evaluar el efecto
antibacteriano in vivo de la CHX sobre la placa (König et al, 2002; Arweiler et
al, 2002; van der Mei et al, 2006; Arweiler et al 2006). Un aspecto metodológico
común en todas estas series es que la placa bacteriana evaluada es
previamente removida de la superficie dentaria (König et al, 2002; Arweiler et
al, 2002; van der Mei et al, 2006; Arweiler et al 2006), lo que implica un análisis
inadecuado de la acción in vivo de la CHX sobre la estructura del biofilm dental
(Arweiler et al, 2002; Arweiler et al, 2004; Watson et al, 2005 ). Por
consiguiente, con el propósito de mejorar la metodología de este tipo de
trabajos, algunos autores diseñaron aparatos removibles especiales que
incorporaban diferentes discos sobre los que se producía el crecimiento del
biofilm dental (Netuschil et al, 1998; Auschill et al, 2001; Arweiler et al, 2004;
Auschill et al 2005; García-Caballero el al, 2008 ). Posteriormente, estas placas
bacterianas “no desestructuradas” se analizaban mediante técnicas de
microscopía de láser confocal y soluciones de fluorescencia que permiten el
estudio simultáneo de la estructura tridimensional del biofilm y la evaluación de
5/7/2018 Crecimiento de Biofilm de Placa Dental en Fedula Con Discos - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/crecimiento-de-biofilm-de-placa-dental-en-fedula-con-discos 5/28
Influencia del ritmo circadiano en la sustantividad in vivo de la clorhexidina
5
la viabilidad bacteriana (Netuschil et al, 1998; Auschill et al, 2001; Arweiler et al,
2004; Auschill et al 2005; García-Caballero et al, 2008 )
El objetivo del presente trabajo fue evaluar la sustantividad in vivo de un
único enjuague de digluconato de CHX al 0,2% sobre la flora salival y la placa
bacteriana “no desestructurada”, diferenciando entre 2 momentos de aplicación
(enjuague diurno vs enjuague nocturno). La metodología implicó la aplicación
de técnicas de microscopía de epifluorescencia, de microscopía de láser
confocal y la solución de tinción dual LIVE/DEAD® BacLight™.
MATERIAL Y MÉTODOS
Selección del grupo de estudio
El grupo de estudio lo conformaron 5 voluntarios adultos con edades
comprendidas entre los 20 y 45 años que presentaban un buen estado de salud
oral: mínimo de 24 dientes permanentes, sin evidencia de gingivitis ni
periodontitis (Community Periodontal Index score= 0) (World Health
Organisation, 1997 ), y ausencia de caries. Los criterios de exclusión aplicados
fueron: fumar, ser portador de prótesis dentales o aparatos ortodóncicos, haber
recibido antibióticos o utilizar de forma rutinaria antisépticos orales durante los
últimos 3 meses, y padecer alguna enfermedad sistémica que provoque una
alteración en la producción y/o la composición de la saliva. Previamente al
inicio del estudio, a todos los voluntarios se les efectuó una tartrectomía.
Este proyecto fue aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de
Medicina y Odontología de la Universidad de Santiago de Compostela. En
todos los casos se obtuvo por escrito el consentimiento informado de los
participantes en el estudio.
5/7/2018 Crecimiento de Biofilm de Placa Dental en Fedula Con Discos - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/crecimiento-de-biofilm-de-placa-dental-en-fedula-con-discos 6/28
Influencia del ritmo circadiano en la sustantividad in vivo de la clorhexidina
6
Confección de la férula porta-discos
Considerando diversos modelos in vivo previamente descritos (Auschill et
al, 2004; Arweiler et al, 2004 ), a cada voluntario se le confeccionó una férula
individualizada de la arcada inferior para albergar 6 discos de cristal (5 mm de
diámetro, 1 mm de grosor) y pulidos a 4000 grid. Esta férula consta de 2
planchas de vinilo; la interna tiene 1 mm de grosor y es la que proporciona
retención y soporta los discos, mientras que la externa es de 0,5 mm de grosor
y está fenestrada para permitir el contacto de la superficie vestibular de los
discos con la saliva, a la vez que éstos se encuentran protegidos de la acción
de las mejillas y la lengua (Figura 1a). Se colocaron 3 discos en una
hemiarcada y los 3 restantes en la contralateral. El disco 1 o anterior se colocó
entre la porción distal del canino y la mesial del primer premolar; el disco 2 o
medio entre la distal del segundo premolar y la mesial del primer molar; el
disco 3 o posterior entre la distal del primer molar y la mesial del segundo molar
(Figura 1b).
Durante 48 horas, el voluntario portó la férula con los discos de cristal
para favorecer el crecimiento del biofilm bacteriano, retirándola de la cavidad
oral únicamente durante las comidas y para efectuar maniobras de higiene oral
(basadas exclusivamente en la remoción mecánica de la placa bacteriana sin el
empleo de ninguna pasta dentífrica o colutorio).
Aplicación del protocolo de clorhexidina
De cada voluntario, se recogieron muestras de saliva no estimulada (1 ml)
y se retiraron 2 discos de cristal de la férula (derecho e izquierdo; en dirección
mesio-distal) a las 8, 10 y 12 horas después de realizar bajo supervisión:
5/7/2018 Crecimiento de Biofilm de Placa Dental en Fedula Con Discos - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/crecimiento-de-biofilm-de-placa-dental-en-fedula-con-discos 7/28
Influencia del ritmo circadiano en la sustantividad in vivo de la clorhexidina
7
1) Un único Enjuague de 10 ml durante 30 segundos con CHX al 0,2%
(Oraldine Perio®, Pfizer, Barcelona, España) a las 7 a.m. (ENJ-CHX-diurno).
2) Un único Enjuague de 10 ml durante 30 segundos con CHX al 0,2%
(Oraldine Perio®) a las 1 a.m. (ENJ-CHX-nocturno).
El día del experimento, a los voluntarios se les prohibió ingerir alimentos o
bebidas durante su transcurso. La recogida de las diferentes muestras salivales
y de placa bacteriana se realizaron: después del ENJ-CHX-diurno, desde las
4:00 p.m. (muestra de las 8 horas post-enjuague) hasta las 8 p.m. (muestra de
las 12 horas post-enjuague); después del ENJ-CHX-nocturno, desde las 9:00
a.m. (muestra de las 8 horas post-enjuague) hasta las 1 p.m. (muestra de las
12 horas post-enjuague). Aplicando un sistema de aleatorización equilibrada,
todos los voluntarios efectuaron los 2 enjuagues, estableciéndose un “período
de descanso” de 2 semanas entre las diferentes aplicaciones. Las muestras de
saliva no estimulada se recogieron aplicando métodos previamente descritos
(“spitting method”) (Navazesh y Christensen, 1982 ).
Preparación de la solución de fluorescencia
La solución de fluorescencia LIVE/DEAD® BacLight™ (Molecular Probes,
Leiden, The Netherlands) la componen 2 fluorocromos, SYTO-9 y yoduro de
propidio (YP), que al ser aplicados simultáneamente permiten diferenciar entre
bacterias con membranas intactas (emiten fluorescencia verde) y bacterias con
membranas dañadas (emiten fluorescencia roja) (Figuras 2a y 2b).
La solución de fluorescencia LIVE/DEAD® BacLight™ se preparó
siguiendo las recomendaciones del fabricante en 5 ml de agua estéril y filtrada
mediante un filtro de membrana Millipore (Millipore Ibérica S.A., Madrid,
5/7/2018 Crecimiento de Biofilm de Placa Dental en Fedula Con Discos - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/crecimiento-de-biofilm-de-placa-dental-en-fedula-con-discos 8/28
Influencia del ritmo circadiano en la sustantividad in vivo de la clorhexidina
8
España), alcanzando una proporción 1:1 de ambos fluorocromos y se conservó
a -20 ºC. Las longitudes de onda de excitación (rango de emisión) para el
SYTO 9 y el YP son 488 nm (492-550 nm) y 561 nm (588-655 nm)
respectivamente.
Procesamiento de las muestras salivales
Las muestras de saliva se centrifugaron a 2000 rpm durante 6 minutos. El
sobrenadante se desechó y el pellet obtenido fue resuspendido en 100 l de
agua estéril. Después de agitar la suspensión bacteriana para homogeneizarla,
se mezcló con 100 l de la solución de fluorescencia y se almacenó en la
oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos. La observación
microscópica la realizaron 2 investigadores que desconocían el diseño del
estudio, empleando un microscopio Olympus BX51 (Olympus, Tokyo, Japón)
equipado con un set de filtros para fluoresceína y Texas Red. El contaje debacterias viables y no-viables se realizó a gran aumento (100x) en 20 campos
microscópicos (10 campos por portaobjetos) que presentaban un mínimo de
100-150 bacterias, y se excluyeron los agregados bacterianos. Se calculó el
porcentaje medio de viabilidad bacteriana de cada muestra salival.
Procesamiento de las muestras de placa bacteriana
Los discos de cristal se retiraron de la férula e inmediatamente fueron
sumergidos en 100 l de la solución de fluorescencia y almacenados en la
oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos. La observación
microscópica la realizó 1 investigador que desconocía el diseño del estudio,
empleando un microscopio Láser Confocal Espectral Leica TCS SP2 (Leica
5/7/2018 Crecimiento de Biofilm de Placa Dental en Fedula Con Discos - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/crecimiento-de-biofilm-de-placa-dental-en-fedula-con-discos 9/28
Influencia del ritmo circadiano en la sustantividad in vivo de la clorhexidina
9
Microsystems HeidelberGmbH, Mannheim, Alemania) y el objetivo HCX APO L
63x/0,9 de inmersión en agua.
En la parte central de cada disco se evaluaron 4 campos o series xyz
seleccionados aleatoriamente. La emisión de fluorescencia se determinó en
series de imágenes xy, en las que cada imagen se correspondió con cada una
de las posiciones en z (en profundidad). Las secciones ópticas son escaneadas
en secciones de 1 µ desde la superficie del biofilm hasta la base del mismo,
determinándose el grosor máximo del campo y posteriormente el grosor
máximo del biofilm de la correspondiente muestra.
La cuantificación de la viabilidad bacteriana en series de imágenes xy se
determinó mediante el análisis del citofluorograma (Leica Confocal Software).
En este análisis las imágenes de cada fluorocromo se describen como
“canales” (SYTO 9 ocupa el “canal verde” y YP el “canal rojo”), obteniéndose
valores de área (µm2) ocupada por cada canal, el área total ocupada por biofilm
y el correspondiente porcentaje de viabilidad. Para el cálculo del porcentaje
medio de viabilidad bacteriana de cada campo se incluyeron las secciones con
un área mínima de biofilm de 250 µm2 y posteriormente se determinó el
porcentaje medio de viabilidad bacteriana del biofilm de la correspondiente
muestra.
Análisis estadístico
Los resultados se analizaron con el programa estadístico SPSS versión
15.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, USA). Para el análisis intra- e inter-
observador, en la técnica de microscopía de epifluorescencia se determinó el
coeficiente de correlación intraclase (modelo de 2 factores, efectos aleatorios) y
5/7/2018 Crecimiento de Biofilm de Placa Dental en Fedula Con Discos - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/crecimiento-de-biofilm-de-placa-dental-en-fedula-con-discos 10/28
Influencia del ritmo circadiano en la sustantividad in vivo de la clorhexidina
10
el grado de homogeneidad de los elementos mediante la perspectiva “acuerdo
absoluto”.
Los valores de las variables cuantitativas analizadas (“porcentaje de
viabilidad bacteriana”) mostraron una distribución normal; que se determinó
aplicando el test Kolmogorov-Smirnov. Se aplicó el test de ANOVA (modelo de
2 factores, ambos con medidas repetidas) y se efectuaron comparaciones por
pares (con el ajuste de Bonferroni) para el análisis intra- e inter-enjuague de la
viabilidad bacteriana en la flora salival y placa bacteriana, así como el análisis
de la viabilidad en cada tipo de enjuague (ENJ-CHX-diurno y ENJ-CHX-
nocturno) entre ambos ecosistemas orales.
Se consideró estadísticamente significativo un valor de p< 0.05.
RESULTADOS
En la técnica de microscopía de epifluorescencia, en el análisis intra-
observador, los coeficientes de correlación intraclase fueron 0,937 (para el
observador 1) y 0,928 (para el observador 2); en el análisis inter-observador, el
valor de este coeficiente fue 0,916.
Tras la aplicación del ENJ-CHX-diurno y ENJ-CHX-nocturno, los grosores
medios de biofilm detectados a las 8, 10 y 12 horas después de las
aplicaciones oscilaron entre 9-26 µm y 6-26 µm respectivamente.
En la tabla 1 se muestran los porcentajes de viabilidad bacteriana en la
flora salival y el biofilm detectados a las 8, 10 y 12 horas después de efectuar
una única aplicación de CHX al 0,2%, diferenciando entre el ENJ-CHX-diurno y
el ENJ-CHX-nocturno.
5/7/2018 Crecimiento de Biofilm de Placa Dental en Fedula Con Discos - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/crecimiento-de-biofilm-de-placa-dental-en-fedula-con-discos 11/28
Influencia del ritmo circadiano en la sustantividad in vivo de la clorhexidina
11
En la flora salival, se detectaron diferencias estadísticamente significativas
en la viabilidad bacteriana en el análisis intra-enjuague (entre los diferentes
tiempos de recogida de las muestras) y el análisis inter-enjuague (entre el ENJ-
CHX-diurno y el ENJ-CHX-nocturno) (p= 0,025) (Tabla 2). En las
comparaciones por pares intra-enjuague, las frecuencias de bacterias viables
aumentaron con el transcurso del tiempo (8 horas vs 10 horas vs 12 horas),
tanto en el ENJ-CHX-diurno (las diferencias de medias oscilaron entre -9,00% y
-23,40%) como en el ENJ-CHX-nocturno (las diferencias de medias oscilaron
entre -15,60% y -32,60%), alcanzándose la significación estadística en la
mayoría de los contrastes (p= 0,001-0,020). En las comparaciones por pares
inter-enjuague, los porcentajes de bacterias viables obtenidos con el ENJ-CHX-
diurno fueron significativamente superiores a los detectados con el ENJ-CHX-
nocturno (las diferencias de medias oscilaron entre 24,80% y 34,00%; p=
0,000-0,005)
En el biofilm, no se detectaron diferencias estadísticamente significativas
en la viabilidad bacteriana en el análisis intra-enjuague (entre los diferentes
tiempos de recogida de las muestras) ni en el análisis inter-enjuague (entre el
ENJ-CHX-diurno y el ENJ-CHX-nocturno) (Tabla 2).
En las figuras 3 y 4 se contrastan las prevalencias de viabilidad bacteriana
en la flora salival y biofilm detectadas a las 8, 10 y 12 horas después de
efectuar un ENJ-CHX-diurno y un ENJ-CHX-nocturno. En el ENJ-CHX-diurno,
la frecuencia de bacterias viables presente en la flora salival fue
significativamente superior a la observada en la placa bacteriana a las 8 horas
(56,40 vs 35,30%; p< 0,001) 10 horas (70,80 vs 34,39%; p= 0,001) y 12 horas
post-enjuague (79,80 vs 30,72%; p= 0,001). En el ENJ-CHX-nocturno, la
5/7/2018 Crecimiento de Biofilm de Placa Dental en Fedula Con Discos - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/crecimiento-de-biofilm-de-placa-dental-en-fedula-con-discos 12/28
Influencia del ritmo circadiano en la sustantividad in vivo de la clorhexidina
12
frecuencia de bacterias viables presente en la flora salival fue
significativamente superior a la observada en la placa bacteriana a las 10 horas
(38,00 vs 28,57%; p= 0,044) y 12 horas post-enjuague (55,00 vs 28,95%; p=
0,008).
DISCUSIÓN
A partir del trabajo publicado por Schiött et al en 1970 (Schiött et al, 1970 ),
la comunidad científica asumió que: "La sustantividad de la CHX persiste hasta
las 12-14 horas después de su aplicación ". Sin embargo, son escasas lasseries en las que se realizaron determinaciones de la sustantividad in vivo de la
CHX sobre la flora salival o placa bacteriana posteriores a las 7 horas post-
aplicación de este antiséptico, en la mayoría de éstas se analizaron muestras
recogidas a las 24 horas post-aplicación (Addy y Wright, 1978; Dahlen, 1984;
Netuschil el 1989 ). Con la finalidad de aportar resultados a este respecto, en el
presente estudio se determinó la sustantividad in vivo de la CHX al 0,2% sobre
ambos ecosistemas (flora salival y placa bacteriana) a las 8, 10 y 12 horas
después de realizar un único enjuague con este antiséptico.
La solución de fluorescencia SYTO 9/YP detecta viabilidad bacteriana en
base a la integridad de la membrana citoplasmática, por lo que se ha
considerado especialmente útil para analizar la actividad antimicrobiana de la
CHX (Hope y Wilson, 2004; Filoche et al, 2007 ). Hasta el momento, la solución
SYTO 9/YP se ha aplicado sólo para estudiar la acción antibacteriana de la
CHX sobre el biofilm (Hope y Wilson, 2004; van Der Mei et al, 2006; Filoche et
al, 2007 ). Recientemente, nuestro grupo demostró que la microscopía de
epifluorescencia empleando la solución de tinción dual SYTO 9/YP es una
técnica eficaz para cuantificar la actividad antibacteriana de la CHX sobre la
5/7/2018 Crecimiento de Biofilm de Placa Dental en Fedula Con Discos - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/crecimiento-de-biofilm-de-placa-dental-en-fedula-con-discos 13/28
Influencia del ritmo circadiano en la sustantividad in vivo de la clorhexidina
13
flora salival en “tiempo real” (Tomás et al, 2009 ). Al ser considerada una
técnica observador-dependiente (Tomas et al, 2009 ), resulta importante la
determinación de las correlaciones intra- e interobservador, cuyos valores en la
presente serie fueron >0,9.
Aunque algunos autores emplearon técnicas de epifluorescencia para el
análisis de la flora salival (Weiger et al, 1997; Weiger et al 1998; Ihalin et al,
2003 ), no hemos encontrado ningún trabajo en el que se aplicara la
microscopía de epifluorescencia y la solución SYTO 9/YP para evaluar la
actividad antimicrobiana in vivo de la CHX sobre la flora salival, por lo que la
comparación de nuestros resultados con los obtenidos por otros autores que
aplicaron técnicas de cultivo en placa debe ser interpretada con cautela.
Aplicando la microscopía de epifluorescencia y una solución de diacetato
de fluoresceína y bromuro de etidio, Weiger et al (Weiger et al, 1998 )
encontraron que aproximadamente el 85% de la flora salival es viable en
condiciones basales. Aunque en el presente estudio no se recogió una muestra
de saliva en condiciones basales, en estudios previos realizados por nuestro
grupo, observamos que el porcentaje de viabilidad bacteriana basal de la flora
salival es aproximadamente 90% (Tomás et al, 2009 ).
Los resultados obtenidos en diferentes estudios in vivo constataron que la
aplicación de un enjuague de CHX 0,2% (10 ml/1 minuto) se asociaba a un
efecto antibacteriano inmediato con una reducción de ≥90% (≥1 log10 UFC/ml)
en la concentración bacteriana salival con respecto a los valores basales
(Jenkins et al, 1991; Reynolds et al, 1991; Simonsson et al, 1991; Moran et al,
1992; Moran et al, 1995) y su sustantividad persistía como mínimo hasta las 7
horas post-aplicación, con una reducción ≥90% (≥1 log10 UFC/ml) (Jenkins et
5/7/2018 Crecimiento de Biofilm de Placa Dental en Fedula Con Discos - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/crecimiento-de-biofilm-de-placa-dental-en-fedula-con-discos 14/28
Influencia del ritmo circadiano en la sustantividad in vivo de la clorhexidina
14
al, 1991; Reynolds et al, 1991; Moran et al, 1992; Moran et al, 1995) .
Resultados previos obtenidos por nuestro grupo con el empleo de la
microscopía de epifluorescencia y la solución SYTO 9/YP, revelaron que un
enjuague de CHX al 0,2% ocasionaba un descenso inmediato en el porcentaje
de bacterias salivales viables (≥90%) y que la actividad antimicrobiana aún era
detectable a las 7 horas post-aplicación (Cousido et al, 2006 ). En la presente
serie, la CHX al 0,2% ejerció una mayor actividad antimicrobiana, ya que en
comparación con los valores basales previamente descritos (Tomás et al,
2009 ), esta actividad persistió hasta las 12 horas post-aplicación con una
reducción de la viabilidad del 13% para el ENJ-CHX-diurno y del 38% para el
ENJ-CHX-nocturno. Probablemente estos resultados estén condicionados por
las férulas porta-discos que llevaban los participantes, ya que éstas pueden
favorecer la retención de la CHX como se ha demostrado en los pacientes con
prótesis removibles (Bonesvoll y Olsen, 1974 ) y por consiguiente potenciar su
efecto antibacteriano. A diferencia de los resultados obtenidos en estudios
previos basados en técnicas de cultivo en placa (Jenkins et al, 1991; Reynolds
et al, 1991; Moran et al, 1992; Moran et al, 1995), y coincidiendo con
investigaciones previas realizadas por nuestro grupo (Cousido et al, 2006;
Tomás et al, 2009 ), en la presente serie se detectó una recuperación
progresiva de la viabilidad bacteriana en las tomas salivales conforme se
incrementaba el número de horas transcurridas desde la realización del
enjuague con CHX (8 horas vs 10 horas vs 12 horas) estadísticamente
significativa en la mayoría de las comparaciones.
Se ha demostrado que la retención de la CHX en la cavidad oral esta
condicionada por factores extrínsecos asociados al enjuague (Bonesvoll y
5/7/2018 Crecimiento de Biofilm de Placa Dental en Fedula Con Discos - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/crecimiento-de-biofilm-de-placa-dental-en-fedula-con-discos 15/28
Influencia del ritmo circadiano en la sustantividad in vivo de la clorhexidina
15
Olsen, 1974). Sin embargo, no hemos encontrado ninguno trabajo en la
literatura sobre la influencia del momento de aplicación del enjuague (día vs
noche) en la sustantividad in vivo de la CHX sobre la flora salival. En la
presente serie, el ENJ-CHX-diurno se asoció a una duración de la actividad
antimicrobiana sobre la flora salival significativamente inferior a la originada por
el ENJ-CHX-nocturno (las diferencias en los porcentajes de viabilidad
bacteriana oscilaron entre 34% a las 8 horas post-aplicación y 25% a las 12
horas post-aplicación). En nuestra opinión, la mayor sustantividad asociada al
ENJ-CHX-nocturno sobre la flora salival podría atribuirse al ritmo circadiano de
secreción salival, ya que está demostrado que durante el sueño se produce
una reducción significativa del flujo salival y su composición (Dawes, 1972;
Dawes, 2008 ). Como consecuencia, existe una disminución de los efectos
protectores de la saliva sobre la cavidad oral y simultáneamente un descenso
en el aporte de nutrientes, lo que condiciona directamente el crecimiento
bacteriano (Craig y Stitzel, 2003 ; Dawes, 2008).
Actualmente, la comunidad científica considera que la metodología más
adecuada para el estudio in vivo de la arquitectura y fisiología del biofilm dental
y del efecto antibacteriano de los antisépticos sobre esta estructura microbiana,
es la aplicación de la microscopía confocal junto con soluciones de
fluorescencia (Wood et al, 2000; Arweiler et al, 2004 ). Esta metodología precisa
que el biofilm a evaluar crezca previamente sobre determinados sustratos
incorporados a aparatos removibles de diferentes diseños (Wood et al, 2000;
Arweiler et al, 2004; Sreenivasan et al, 2004; Watson et al, 2005 ). En las series
publicadas, se utilizaron sustratos de distinta naturaleza como: discos de
esmalte humano (Netuschil et al, 1998; Wood et al, 2000; Auschill et al, 2001),
5/7/2018 Crecimiento de Biofilm de Placa Dental en Fedula Con Discos - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/crecimiento-de-biofilm-de-placa-dental-en-fedula-con-discos 16/28
Influencia del ritmo circadiano en la sustantividad in vivo de la clorhexidina
16
de dentina bovina (Zaura-Arite et al, 2001) o de cristal (Netuschil et al, 1998;
Auschill et al, 2004; Arweiler et al, 2004; Auschill et al, 2005 ). Dependiendo del
tipo de biofilm que se pretende analizar, el tiempo de permanencia en la
cavidad oral de los aparatos removibles es heterogéneo, oscilando entre las 6
horas (Zaura-Arite et al, 2001) y las 168 horas (Watson et al, 2005 ). Auchill et al
(Auchill et al, 2004 ) demostraron que el espesor medio del biofilm de 48 horas
no estaba condicionado por la localización del aparato removible en la cavidad
oral (maxilar superior vs mandíbula) ni por la del disco (distal vs mesial;
derecha vs izquierda). Aunque la rugosidad de la superficie y su energía libre
son considerados factores importantes para el crecimiento in vivo del biofilm
(Auschill et al, 2004 ), Netuschil et al (Netuschill, 1998 ) no detectaron grandes
diferencias en el espesor del biofilm de 48 horas al utilizar discos de esmalte y
de cristal. Igualmente, Arweiler et al (Arweiler et al, 2004 ) observaron que el
patrón de viabilidad bacteriana no estaba condicionado por la localización del
disco en la cavidad oral. En la presente serie, los aparatos removibles se
colocaron en la arcada inferior durante 48 horas; como soporte del biofilm se
utilizaron discos de cristal y en cada momento de recogida se procedió al
análisis de 2 discos (derecho e izquierdo; extraídos en dirección mesio-distal).
Centrándonos en las características de los biofilms de 48 horas, Auschill
et al (Auschill et al, 2004 ) y Arweiler et al (Arweiler et al, 2004 ) señalaron la
elevada heterogeneidad interindividual existente en los valores de espesor
máximo y viabilidad bacteriana, que oscilaron entre 14-150 µm y 64-77%
respectivamente. Diferentes autores coinciden en atribuirle a este tipo de
biofilm un modelo de “arquitectura abierta” caracterizado por la presencia de un
complejo sistema de canales (Zaura-Arite et al, 2001; Auschill et al, 2004;
5/7/2018 Crecimiento de Biofilm de Placa Dental en Fedula Con Discos - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/crecimiento-de-biofilm-de-placa-dental-en-fedula-con-discos 17/28
Influencia del ritmo circadiano en la sustantividad in vivo de la clorhexidina
17
Arweiler et al, 2004 ). Aunque estos parámetros no han sido evaluados en la
presente serie, los resultados obtenidos previamente por nuestro grupo en un
modelo in vivo de biofilm de 48 horas revelaron un espesor máximo de 20-51
µm y un porcentaje medio de viabilidad bacteriana del 80% (García-Caballero
et al, 2008 ).
Hasta el momento, no hemos encontrado ningún estudio en la literatura
que haya evaluado el efecto antibacteriano in vivo de la CHX al 0,2% sobre la
placa bacteriana “no desestructurada”. Recientemente, nuestro grupo evaluó el
efecto inmediato y la sustantividad in vivo hasta 7 horas después de la
aplicación de un único enjuague de CHX al 0,2% (10 ml/30 segundos) sobre el
biofilm intacto de 48 horas (García-Caballero et al, 2008 ). En contraste con la
viabilidad basal (80%), las frecuencias detectadas en las posteriores
determinaciones post-enjuague resultaron significativamente inferiores (a los 30
segundos= 4%, a la hora= 16%, a las 3 horas= 35%; a las 5 horas= 23% y a las
7 horas= 30%). En consonancia con estos resultados, en la presente serie, a
las 8 horas post-enjuague se detectó un porcentaje de viabilidad en torno al
30%, persistiendo este efecto antibacteriano constante hasta 12 horas después
de la aplicación de la CHX. A diferencia de lo que acontece en la flora salival,
en el biofilm no se detectó una recuperación progresiva del ecosistema ni
diferencias en la viabilidad entre los 2 tipos de enjuagues de CHX aplicados
(ENJ-CHX-diurno vs ENJ-CHX-nocturno). En contraste con el grosor medio del
biofim de 48 horas previamente descrito por nuestro grupo (García-Caballero et
al, 2008 ), en la presente serie estos valores fueron inferiores, lo que podría
sugerir un cierto “efecto anti-placa” después de un practicar un único enjuague
de CHX.
5/7/2018 Crecimiento de Biofilm de Placa Dental en Fedula Con Discos - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/crecimiento-de-biofilm-de-placa-dental-en-fedula-con-discos 18/28
Influencia del ritmo circadiano en la sustantividad in vivo de la clorhexidina
18
Aunque se ha afirmado que la actividad antibacteriana de la CHX sobre la
flora salival no es extrapolable a su acción sobre las bacterias presentes en la
placa bacteriana (Netuschil et al, 1989 ), la saliva representa un “medio de
diseminación” de los microorganismos orales de un nicho ecológico a otro
(Collaert et al, 1992 ). Sekino et al (Sekino et al, 2003 ) demostraron que la
concentración de bacterias salivales presentes después de la aplicación de
diferentes protocolos de CHX puede condicionar los niveles de placa
bacteriana durante las primeras fases de su formación. A pesar de la
interconexión existente entre ambos ecosistemas y la importancia de su
estudio, muy pocos autores han investigado simultáneamente la actividad
antibacteriana ejercida después de una única aplicación de CHX al 0,2% sobre
la saliva y otras biopelículas orales (Sreenivasan y Gittins, 2004; García-
Caballero et al, 2008 ). En consonancia con los resultados previos descritos por
nuestro grupo (García-Caballero et al, 2008 ), en la presente serie los
porcentajes de viabilidad bacteriana detectados a las 8, 10 y 12 horas después
del ENJ-CHX-diurno y del ENJ-CHX-nocturno fueron significativamente
superiores en la flora salival que en la placa bacteriana.
CONCLUSIONES
La aplicación de un único enjuague de CHX al 0,2% ejerció una menor
sustantividad entre las 8-12 horas post-aplicación sobre la flora salival con
respecto a la observada en la placa bacteriana “no desestructurada” de 48
horas. En la flora salival, la viabilidad bacteriana se recuperó progresivamente y
estuvo condicionada por el momento de aplicación del enjuague, siendo más
eficaz la práctica de un enjuague nocturno. En la placa, la viabilidad bacteriana
5/7/2018 Crecimiento de Biofilm de Placa Dental en Fedula Con Discos - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/crecimiento-de-biofilm-de-placa-dental-en-fedula-con-discos 19/28
Influencia del ritmo circadiano en la sustantividad in vivo de la clorhexidina
19
se mantuvo constante hasta las 12 horas post-aplicación y no estuvo
condicionada por el momento de aplicación del enjuague. Estos resultados
corroboran el mayor dinamismo fisiológico de la flora salival y la posible función
reservorio asociada a la estructura de la placa bacteriana "de novo ".
5/7/2018 Crecimiento de Biofilm de Placa Dental en Fedula Con Discos - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/crecimiento-de-biofilm-de-placa-dental-en-fedula-con-discos 20/28
Influencia del ritmo circadiano en la sustantividad in vivo de la clorhexidina
20
FIGURA 1a. Diseño de la férula doble porta-discos de cristal.
1- Férula interna en contacto con la arcada dentaria inferior.2- Disco de cristal.3- Férula externa fenestrada en el área de los discos.
FIGURA 1b. Imagen clínica de la férula doble porta-discos de cristal.
D1 (Disco 1): Colocado entre la porción distal del canino y la mesial del primer premolar.D2 (Disco 2): Colocado entre la porción distal del segundo premolar y la mesial del primer molar.D3 (Disco 3): Colocado entre la porción distal del primer molar y la mesial del segundo molar.
D1
D2
D3
1
2
3
5/7/2018 Crecimiento de Biofilm de Placa Dental en Fedula Con Discos - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/crecimiento-de-biofilm-de-placa-dental-en-fedula-con-discos 21/28
Influencia del ritmo circadiano en la sustantividad in vivo de la clorhexidina
21
FIGURA 2a. Bacterias con membranas intactas (emiten fluorescencia verde) ybacterias con membranas dañadas (emiten fluorescencia roja) en la florasalival.
FIGURA 2b. Bacterias con membranas intactas (emiten fluorescencia verde) ybacterias con membranas dañadas (emiten fluorescencia roja) en la placabacteriana “de novo ”.
5/7/2018 Crecimiento de Biofilm de Placa Dental en Fedula Con Discos - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/crecimiento-de-biofilm-de-placa-dental-en-fedula-con-discos 22/28
Influencia del ritmo circadiano en la sustantividad in vivo de la clorhexidina
22
TABLA 1. Porcentajes de viabilidad bacteriana en la flora salival y la placabacteriana detectados a las 8, 10 y 12 horas después de efectuar una únicaaplicación de clorhexidina al 0,2%, diferenciando entre ENJ-CHX-diurno y ENJ-CHX-nocturno.
VIABILIDAD BACTERIANA EN SALIVA (%)
ENJ-CHX-diurno
(media ± d.t.)
ENJ-CHX-nocturno
(media ± d.t.)
8 horas post-aplicación
10 horas post-aplicación
12 horas post-aplicación
56,40 ± 10,26
70,80 ± 7,52
79,80 ± 6,22
22,40 ± 10,83
38,00 ± 11,64
55,00 ± 9,13
VIABILIDAD BACTERIANA EN PLACA BACTERIANA (%)
ENJ-CHX-diurno
(media ± d.t.)
ENJ-CHX-nocturno
(media ± d.t.)
8 horas post-aplicación
10 horas post-aplicación
12 horas post-aplicación
35,30 ± 10,60
34,39 ± 8,46
30,72 ± 11,89
30,06 ± 7,34
28,57 ± 6,49
28,95 ± 8,17
ENJ-CHX-diurno= Un único enjuague de 10 ml durante 30 segundos con CHX al 0,2%efectuado a las 7 a.m.; ENJ-CHX-nocturno= Un único enjuague de 10 ml durante 30 segundoscon CHX al 0,2% efectuado a las 1 a.m; d.t.= desviación típica.
5/7/2018 Crecimiento de Biofilm de Placa Dental en Fedula Con Discos - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/crecimiento-de-biofilm-de-placa-dental-en-fedula-con-discos 23/28
Influencia del ritmo circadiano en la sustantividad in vivo de la clorhexidina
23
TABLA 2. Porcentajes de viabilidad bacteriana en la flora salival y la placabacteriana detectados a las 8, 10 y 12 horas después de efectuar una únicaaplicación de clorhexidina al 0,2% (comparaciones por pares intra-enjuague einter-enjuague)
VIABILIDAD BACTERIANA EN SALIVA (%)
Diferencias entremedias
p
COMPARACIONES INTRA-ENJUAGUE CHX
ENJ-CHX-diurno: 8 horas vs 10 horas
ENJ-CHX-diurno: 8 horas vs 12 horas
ENJ-CHX-diurno: 10 horas vs 12 horas
ENJ-CHX-nocturno: 8 horas vs 10 horas
ENJ-CHX-nocturno: 8 horas vs 12 horasENJ-CHX-nocturno: 10 horas vs 12 horas
-14,40
-23,40
-9,00
-15,60
-32,60-17,00
0,020
0,001
0,069
0,063
0,0050,008
COMPARACIONES INTER-ENJUAGUE CHX
8 horas: ENJ-CHX-diurno vs ENJ-CHX-nocturno
10 horas: ENJ-CHX-diurno vs ENJ-CHX-nocturno
12 horas: ENJ-CHX-diurno vs ENJ-CHX-nocturno
34,00
32,80
24,80
<0,001
0,005
0,003
VIABILIDAD BACTERIANA EN PLACA BACTERIANA (%)
Diferencias entremedias p
COMPARACIONES INTRA-ENJUAGUE CHX
ENJ-CHX-diurno: 8 horas vs 10 horas
ENJ-CHX-diurno: 8 horas vs 12 horas
ENJ-CHX-diurno 10 horas vs 12 horas
ENJ-CHX-nocturno: 8 horas vs 10 horas
ENJ-CHX-nocturno: 8 horas vs 12 horas
ENJ-CHX-nocturno: 10 horas vs 12 horas
0,90
4,58
3,67
1,48
1,10
-0,37
1,000
1,000
1,000
1,000
1,000
1,000
COMPARACIONES INTER-ENJUAGUE CHX
8 horas: ENJ-CHX-diurno vs ENJ-CHX-nocturno
10 horas: ENJ-CHX-diurno vs ENJ-CHX-nocturno
12 horas: ENJ-CHX-diurno vs ENJ-CHX-nocturno
5,24
5,82
1,77
0,191
0,396
0,780
ENJ-CHX-diurno= Un único enjuague de 10 ml durante 30 segundos con CHX al 0,2% efectuadoa las 7 a.m.; ENJ-CHX-nocturno= Un único enjuague de 10 ml durante 30 segundos con CHX al0,2% efectuado a las 1 a.m.
5/7/2018 Crecimiento de Biofilm de Placa Dental en Fedula Con Discos - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/crecimiento-de-biofilm-de-placa-dental-en-fedula-con-discos 24/28
Influencia del ritmo circadiano en la sustantividad in vivo de la clorhexidina
24
FIGURA 3. Porcentajes de viabilidad bacteriana en la flora salival y la placabacteriana detectados a las 8, 10 y 12 horas después de efectuar un ENJ-CHX-diurno al 0,2%.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
8 HORAS 10 HORAS 12 HORAS
SALIVA
PLACA
ENJ-CHX-diurno= Un único enjuague de 10 ml durante 30 segundos con CHX al 0,2%efectuado a las 7 a.m.
FIGURA 4. Porcentajes de viabilidad bacteriana en la flora salival y la placabacteriana detectados a las 8, 10 y 12 horas después de efectuar un ENJ-CHX-nocturno al 0,2%.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
8 HORAS 10 HORAS 12 HORAS
SALIVA
PLACA
ENJ-CHX-nocturno= Un único enjuague de 10 ml durante 30 segundos con CHX al 0,2%efectuado a las 1 a.m.
p< 0,001
p= 0,001 p= 0,001
p= 0,090p= 0,044
p= 0,008
5/7/2018 Crecimiento de Biofilm de Placa Dental en Fedula Con Discos - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/crecimiento-de-biofilm-de-placa-dental-en-fedula-con-discos 25/28
Influencia del ritmo circadiano en la sustantividad in vivo de la clorhexidina
25
BIBLIOGRAFÍA
Addy M, Jenkins S, Newcombe R. Toothpastes containing 0.3% and 0.5%triclosan. II. Effects of single brushings on salivary bacterial counts. Am J Dent 1989; 2: 215-219.
Addy M, Moran J. Evaluation of oral hygiene products: science is true; don’t bemisled by the facts. Periodontology 2000 1997; 15: 40-51.Addy M, Wright R. Comparison of the in vivo and in vitro antibacterial properties
of povidone iodine and chlorhexidine gluconate mouthrinses. J Clin Periodontol 1978; 5: 198-205.
Arweiler NB, Auschill TM, Donos N, Sculean A. Antibacterial effect of an enamelmatrix protein derivative on in vivo dental biofilm activity. Clin Oral Invest 2002; 6: 205-209.
Arweiler NB, Hellwig E, Sculean A, Hein N, Auschill TM. Individual vitalitypattern of in situ dental biofilms at different locations in the oral cavity.Caries Res 2004; 38: 442-447.
Arweiler NB, Boehnke N, Sculean A, Hellwig E, Auschill TM. Differences inefficacy of two commercial 0.2% chlorhexidine mouthrinse solutions: a 4-days plaque regrowth study. J Clin Periodontol 2006; 33: 334-339.
Auschill TM, Artweiler NB, Netuschil L, Brecx M, Reich E, Sculean A. Spatialdistribution of vital and dead microorganisms in dental biofilms. Arch Oral Biol 2001; 46: 471-476.
Auschill TM, Hein N, Hellwig E, Follo M, Sculean A, Arweiler N.B. Effect of twoantimicrobial agents on early in situ biofilm formation. J Clin Periodontol 2005; 32: 147-152.
Auschill TM, Hellwig E, Sculean A, Hein N, Arweiller NB. Impact of the intraorallocation on the rate of biofilm growth. Clin Oral Invest 2004; 8: 97-101.
Balbuena L, Stambaugh KI, Ramirez SG, Yeager C. Effects of topical oralantiseptic rinses on bacterial counts of saliva in healthy human subjects.Otolaryngol Head Neck Surg 1998; 118: 625-629.
Bonesvoll P, Lokken P, Rolla G. Influence of concentration, time, temperature,and pH on the retention of chlorhexidine in the human. Arch Oral Biol 1974;19: 1025-1029.
Bonesvoll P, Olsen I. Influence of teeth, plaque and dentures on the retention ofchlorhexidine in the human oral cavity. J Clin Periodontol 1974; 1: 214-221.
Caballero LG, Carmona IT, Gónzalez MC, Posse JL, Taboada JL, Dios PD.Evaluation of the substantivity in saliva of different forms of application of
chlorhexidine. Quintessence Int 2009; 40: 141-144..Collaert B, Edwardsson S, Attstrom R, Hase JC, Astrom M, Movert R. Rinsingwith delmopinol 0.2% and chlorhexidine 0.2%: short-term effect on salivarymicrobiology, plaque, and gingivitis. J Periodontol 1992; 63: 618-625.
Cousido C, García-Caballero L, Tomás Carmona I, Limeres J, Diz Dios P.Evaluación de la sustantividad en saliva de un colutorio de clorhexidina al0,2%. XIII Congreso de la Sociedad Española de Epidemiología y SaludPública Oral. Santiago de Compostela 2006. Med Oral Patol Oral Cir Bucal 2006; (s1): 67.
Craig R, Stitzel RE. Modern pharmacology with clinical applications, 6 th edition.Lippincott Williams & Wilkins, 2003.
Dahlen G. Effect of antimicrobial mouthrinses on salivary microflora in healthysubjects. Scand J Dental Res 1984; 92: 38-42.
5/7/2018 Crecimiento de Biofilm de Placa Dental en Fedula Con Discos - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/crecimiento-de-biofilm-de-placa-dental-en-fedula-con-discos 26/28
Influencia del ritmo circadiano en la sustantividad in vivo de la clorhexidina
26
Dawes C. Circadian rhythms in human salivary flor rate and composition. J Physiol 1972; 220: 529-545.
Dawes C. Salivary flor patterns and the health of hard and soft oral tissues.JADA 2008; 139 (Suppl 5): 18S-24S.
Elworthy A, Greenman J, Doherty FM, Newcombe RG, Addy M. The
substantivity of a number of oral hygiene products determined by theduration of effects on salivary bacteria. J Periodontol 1996; 67: 572-576.Fernandes-Naglik L, Downes J, Shirlaw P et al. The clinical and microbiological
effects of a novel acidified sodium chlorite mouthrinse on oral bacterialmucosal infections. Oral Dis 2001; 7: 276-280.
Filoche SK, Coleman MJ, Angker L, Sissons CH. A fluorescence assay todetermine the viable biomass of microcosm dental plaque biofilms. J Microbiol Methods 2007; 69: 489-496.
García-Caballero L, Tomás Carmona I, Cousido M, Limeres J, Torres S, Diz P.Substantivity of a chlorhexidine mouthrinse on saliva and biofilm. PEFInternational Association for Dental Research. Londres, 2008.
Hope CK, Wilson M. Analysis of the effects of chlorhexidine on oral biofilmvitality and structure based on viability profiling and an indicator ofmembrane integrity. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48: 1461-1468.
Ihalin R, Nuutila J, Loimaranta V, Lenander M, Tenovuo J, Lilius EM.Susceptibility of Fusobacterium nucleatum to killing by peroxidase-iodide-hydrogen peroxide combination in buffer solution and in human whole saliva.Anaerobe 2003; 9: 23-30.
Jenkins S, Addy M, Newcombe R. The effects of 0.5% chlorhexidine and 0.2%triclosan containing toothpastes on salivary bacterial counts. J Clin Periodontol 1990; 17: 85-89.
Jenkins S, Addy M, Newcombe R. Triclosan and sodium lauryl sulphatemouthwashes (I). Effects on salivary bacterial counts. J Clin Periodontol 1991; 18: 140-144.
Jenkins S, Addy M, Wade W, Newcombe RG. The magnitude and duration ofthe effects of some mouthrinse products on salivary bacterial counts. J Clin Periodontol 1994; 21: 397-401.
König J, Storcks V, Kocher T, Bössmann K, Plagmann H-C. Anti-plaque effectof tempered 0.2% chlorhexidine rinse: an in vivo study. J Clin Periodontol 2002; 29: 207-210.
Manau Navarro C, Guasch Serra S. Métodos de control de la placa bacteriana.En: Cuenca Sala E, Manau Navarro C, Serra Majem L (eds). Odontología
preventiva y comunitaria: Principios, métodos y aplicaciones, 2a
edn.Masson: Barcelona. 2003: 79.Moran J, Addy M, Wade W, Milson S, McAndrew R, Newcombe RG. The effect
of oxidising mouthrinses compared with chlorhexidine on salivary bacterialcounts and plaque regrowth. J Clin Periodontol 1995; 22: 750-755.
Moran J, Addy M, Wade WG et al. A comparison of delmopinol andchlorhexidine on plaque regrowth over a 4-day period and salivary bacterialcounts. J Clin Periodontol 1992; 19: 749-753.
Navazesh M, Christensen CM. A comparison of whole mouth resting andstimulated salivary measurement procedures. J Dental Res 1982; 61: 1158-1162.
5/7/2018 Crecimiento de Biofilm de Placa Dental en Fedula Con Discos - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/crecimiento-de-biofilm-de-placa-dental-en-fedula-con-discos 27/28
Influencia del ritmo circadiano en la sustantividad in vivo de la clorhexidina
27
Netuschil L, Reich E, Brecx M. Direct measurement of the bactericidal effect ofchlorhexidine on human dental plaque. J Clin Periodontol 1989; 16: 484-488.
Netuschil L, Reich E, Unteregger G, Sculean A, Brecx M. A pilot study ofconfocal laser scanning microscopy for the assessment of undisturbed
dental plaque vitality and topography. Arch Oral Biol 1998; 43: 277-285.Netuschil L. Vitalfärbung von plaque-mikroorganismen mit fluoresceindiacetatund ethidium-bromid. Dtsch Zahnärztl Z 1983; 38: 914-917.
Reynolds S, Moran J, Addy M, Wade WG, Newcombe R. Taurolin as an oralrinse. I. Antimicrobial effects in vitro and in vivo . Clin Prev Dent 1991; 13:13-17.
Roberts WR, Addy M. Comparison of the in vivo and in vitro antibacterialproperties of antiseptic mouthrinses containing chlorhexidine, alexidine, cetylpyridinium chloride and hexetidine. Relevance to mode of action. J Clin Periodontol 1981; 8: 295-310.
Rosin M, Welk A, Bernhardt O et al. Effect of a polyhexamethylene biguanide
mouthrinse on bacterial counts and plaque. J Clin Periodontol 2001; 28:1121-1126.
Rosin M, Welk A, Kocher T, Majic-Todt A, Kramer A, Pitten FA. The effect of apolyhexamethylene biguanide mouthrinse compared to an essential oil rinseand a chlorhexidine rinse on bacterial counts and 4-day plaque regrowth. J Clin Periodontol 2002; 29: 392-399.
Schiött CR, Loe H, Jensen SB, Kilian M, Davies RM, Glavind K. The effect ofchlorhexidine mouthrinses on the human oral flora. J Periodontal Res 1970;5: 84-89.
Sekino S, Ramberg P, Uzel NG, Socransky S, Lindhe J. Effect of variouschlorhexidine regimens on salivary bacteria and de novo plaque formation. J Clin Periodontol 2003; 30: 919-925
Simonsson T, Hvid EB, Rundegren J, Edwardsson S. Effect of delmopinol on in vitro dental plaque formation, bacterial acid production and the number ofmicroorganisms in saliva. Oral Microbiol Immunol 1991; 6: 305-309.
Sreenivasan PK, Mattai J, Nabi N, Xu T, Gaffar A. A simple approach toexamine early oral microbiol biofilm formation and the effects of treatments.Oral Microbiol Inmunol 2004; 19: 297-302.
Sreenivasan PK, Gittins E. The effects of a chlorhexidine mouthrinse onculturable microorganisms of the tongue and saliva. Microbiol Res 2004; 159:365-370.
Tomás Carmona I, Cousido MC, Tomás M, Limeres J, García-Caballero L, DizP. In vivo bactericidal effect of 0.2% chlorhexidine but not 0.12% on salivaryobligate anaerobes. Arch Oral Biol 2008; 53: 1186-1191.
Tomás Carmona I, García-Caballero L, Cousido M, Limeres J, Álvarez M, DizP. Evaluation of chlorhexidine substantivity on salivary flora byepifluorescence microscopy. Oral Dis 2009 (en prensa).
Tsuchiya H, Miyazaki T, Ohmoto S. High-performance liquid chromatographicanalysis of chlorhexidine in saliva after mouthrinsing. Caries Res 1999; 33:156-163.
Van der Mei H.C, White D.J, Atema-Smit J, van de Belt-Gritter E, Busscher HJ.A method to study sustained antimicrobial activity of rinse and dentifrice
components on biofilm viability in vivo . J Clin Periodontol 2006; 33: 14-20.
5/7/2018 Crecimiento de Biofilm de Placa Dental en Fedula Con Discos - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/crecimiento-de-biofilm-de-placa-dental-en-fedula-con-discos 28/28
Influencia del ritmo circadiano en la sustantividad in vivo de la clorhexidina
28
Watson PS, Pontefract HA, Devine DA et al. Penetration of fluoride into naturalplaque biofilms. J Dent Res 2005; 84: 451-455.
Weiger R, Netuschil L, Wester-Ebbinghaus T, Brecx M. An approach todifferentiate between antibacterial and antiadhesive effects of mouthrinses in vivo . Arch Oral Biol 1998; 43: 559-565.
Weiger R, von Ohle C, Decker E, Axmann-Krcmar D, Netuschil L. Vitalmicroorganisms in early supragingival dental plaque and in stimulatedhuman saliva. J Periodontal Res 1997; 32: 233-240.
Wood SR, Kirkham J, Marsh PD, Shore RC, Nattress B, Robinson C.Architecture of intact natural human plaque biofilms studied by confocallaser scanning microscopy. J Dent Res 2000; 79: 21-27.
World Health Organisation. Oral health surveys, Basic methods, 4 th ed. WHO:Geneva, 1997.
Zaura-Arite E, van Marle J, ten Cate JM. Confocal microscopy study ofundisturbed and chlorhexidine-treated dental biofilm. J Dent Res 2001; 80:1436-1440.