cósmidos clonación vectorial
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Ingeniería genética, Clonación vectorial, Cósmidos Conocimientos clave: Plásmido, fago.TRANSCRIPT
Cósmidos
José David Navarro Jiménez; Iván Kerguelén; Mario ChadidMedicina
Universidad de Sucre
2014
Introducción
Conceptos
• El término DNA recombinante hace referencia a segmentos omoléculas de DNA que no se encuentran juntas de maneranatural.
• Este término se reserva a las moléculas de DNA producidas porla unión de segmentos que provienen de diferentes fuentesbiológicas.
• La tecnología del DNA recombinante utiliza técnicas queprovienen de la bioquímica de los ácidos nucleicos unidas ametodologías genéricas desarrolladas originalmente para lainvestigación de bacterias y de virus.
Procedimientos
• La utilización del DNA recombinante es una herramientapoderosa para el aislamiento de poblaciones puras desecuencias específicas de DNA a partir de una población desecuencias mezcladas. Los procedimientos básicos incluyen unaserie de pasos:
Procedimientos
1- Las endonucleasas de restricción,
cortan el DNA por secuencias
nucleotídicas específicas.
2- Los fragmentos productos de las
enzimas de restricción se unen a DNA
vectorial.
Los vectores pueden replicarse
autónomamente en la célula
huésped y facilitan la
manipulación
3. La molécula de DNA
recombinante, se transfiere
a una célula huésped.
4- Al replicarse las
células huésped, las
células descendientes
heredan el DNA
recombinante clones.
5-Los segmentos de
DNA clonados se
recuperarse, purifican y
analizan.
Fabricación de DNA recombinante
El desarrollo de las técnicas de DNA recombinante ofrecenuevas oportunidades para la investigación, ya quesimplifica la obtención de grandes cantidades de DNA quecodifican genes específicos, y facilita las investigaciones dela organización, estructura y expresión génicas.
Procedimiento
Fabricación de DNA recombinante
Esta metodología también ha dado un impulso al desarrollode la naciente industria biotecnológica, que estásuministrando un número creciente de productos almercado.
Procedimiento
Fabricación de DNA recombinante
La piedra angular de la tecnología del DNA recombinante es un tipode enzimas denominadas endonucleasas de restricción.
Las enzimas de restricción reconocen una secuencia específica denucleótidos (denominada sitio de restricción) de una molécula deDNA de doble cadena, y cortan el DNA por esa secuencia.
Procedimiento
Enzimas de restricción
Fabricación de DNA recombinante
El premio Nobel de 1978 se otorgó a Werner Arber, Hamilton Smith yDaniel Nathans por su investigación sobre las enzimas de restricción.Hasta la fecha, se han aislado y caracterizado casi 200 tipos de enzimasde restricción diferentes.
Estas enzimas, aisladas en bacterias, reciben este nombre debido a quelimitan o previenen las infecciones víricas degradando el ácido nucleicoinvasor
Procedimiento
Enzimas de restricción
Fabricación de DNA recombinante
Las enzimas de restricción se denominan según el organismoen el que se descubrieron, utilizando un sistema alfanumérico.
La enzima EcoRI proviene de Escherichia coli; HindIII sedescubrió en Hemophilus influenzae. Hay dos tipos deenzimas de restricción:
Procedimiento
Enzimas de restricción
Fabricación de DNA recombinante
• Las enzimas de Tipo I cortan las dos cadenas del DNA enuna posición aleatoria a cierta distancia del sitio derestricción. No se utilizan normalmente en la investigación deDNA recombinante ya que el sitio de corte no es preciso.
Procedimiento
Enzimas de restricción
Fabricación de DNA recombinante
• Las enzimas de Tipo II: reconocen una secuenciaespecífica y cortan las dos cadenas de la molécula de DNAcon absoluta precisión dentro de la secuencia reconocida.
• Se usan ampliamente en investigación de DNA recombinantepuesto que cortan en sitios específicos.
• Las secuencias reconocidas por las enzimas de Tipo II sonsimétricas es decir, la secuencia de una de las cadenas leídaen dirección 5' Ö 3' es la misma que la secuencia de lacadena complementaria leída también en dirección 5' Ö 3'.
Procedimiento
Enzimas de restricción
Fabricación de DNA recombinante
Procedimiento
Enzimas de restricción
Fabricación de DNA recombinante
Procedimiento
Enzimas de restricción
Fabricación de DNA recombinante
Otras tipo dos
Las moléculas de DNA recombinante pueden formarse a partirDNA cortado con enzimas que dejan extremos romos.
En este método se utiliza la enzima desoxinucleotidiltransferasa terminal para crear colas complementariasmediante la adición de fragmentos de poli-dA y de poli-dT.
Estas colas sirven para unir el DNA de diferentes fuentes ypara crear moléculas de DNA recombinante, que son unidascovalentemente por tratamiento con la DNA ligasa.
Procedimiento
Enzimas de restricción
Fabricación de DNA recombinante
Otras tipo dos
Las moléculas de DNA recombinante pueden formarse a partirDNA cortado con enzimas que dejan extremos romos.
En este método se utiliza la enzima desoxinucleotidiltransferasa terminal para crear colas complementariasmediante la adición de fragmentos de poli-dA y de poli-dT.
Estas colas sirven para unir el DNA de diferentes fuentes ypara crear moléculas de DNA recombinante, que son unidascovalentemente por tratamiento con la DNA ligasa.
Procedimiento
Enzimas de restricción
Fabricación de DNA recombinante
Después de unirse a un vector o vehículo de clonación, unsegmento de DNA puede llegar a entrar en una célula huéspedy replicarse o clonarse. Los vectores son, esencialmente,moléculas de DNA transportadoras. Para servir de vector, unamolécula de DNA debe tener unas determinadascaracterísticas:
Actualmente se utilizan tres tipos principales de vectores:
- los plásmidos
- los bacteriófagos
- los cósmidos
Procedimiento
Vectores
Fabricación de DNA recombinante
Características
1. Debe poder replicarse independientemente junto con elsegmento de DNA que transporta.
2. Debe contener algunos sitios de corte para enzimas derestricción, presentes sólo una vez en el vector. Estos sitios derestricción se cortan con una enzima de restricción y se utilizanpara insertar segmentos de DNA cortados con la mismaenzima.
3. Debe tener algún marcador de selección (normalmentegenes de resistencia a antibióticos o genes de enzimas quela célula huésped no tiene) para poder distinguir las célulashuésped que transportan el vector de las que no lo contienen.
4. El vector de la célula huésped debe ser fácil de recuperar.
Procedimiento
Vectores
Fabricación de DNA recombinante
• Plásmidos.
- Los plásmidos son moléculas de DNA de doble cadenaextracromosómicas de origen natural que tienen un origen dereplicación (ori+).
- Se replican autónomamente en las células bacterianas.
- Para poder utilizarlos en ingeniería genética, se hanmodificado o diseñado plásmidos de manera que contengan unnúmero limitado de sitios de restricción y genes deresistencia a antibiótico s específicos.
Procedimiento
Vectores
Fabricación de DNA recombinante
• Plásmidos.
Procedimiento
Vectores
Fabricación de DNA recombinante
• Bacteriófagos lambda (fago λ) y M13
- Se extrae el DNA de una preparación de fago lambda y seelimina el grupo central de genes por tratamiento con unaenzima de restricción.
- El DNA a clonar se corta con la misma enzima y se liga entrelos brazos del cromosoma de lambda.
- Luego se empaqueta el cromosoma recombinante dentro de lasproteínas del fago para formar un virus recombinante.
- Este virus puede infectar células bacterianas y replicar sucromosoma, incluido el inserto de DNA.
Procedimiento
Vectores
Fabricación de DNA recombinante
• Bacteriófagos lambda (fago λ) y M13
Procedimiento
Vectores
Fabricación de DNA recombinante
• Bacteriófagos lambda (fago λ) y M13
Procedimiento
Vectores
Cósmidos
Descritos por primera vez por Collins y Hohn en 1978.
Son vectores híbridos construidos utilizando partes delcromosoma del fago lambda y de DNA plasmídico.
Contienen la secuencia “cos” del fago lambda.
Secuencias plasmídicas de replicación y de genes deresistencia a antibióticos.
Cósmidos
Su DNA, que contiene DNA insertado, se empaqueta en lacápside proteica de lambda para formar partículas fágicasinfectivas.
Una vez el cósmido entra en la célula huésped, se replicacomo un plásmido.
Los cósmidos pueden transportar insertos de DNA muchomás grandes que los que lambda puede llevar.
Cósmidos
Características
Características
Cósmidos: 37-52 kb de ADN.
Vectores fágicos: 15 kb.
Plásmidos: 1- 10kb (limitados).
Cósmidos
Características
Cósmidos
Sitios de restricción
para la clonación
Características
Cósmidos
Sitios de restricción
para la clonación
Características
Pueden replicarse como plásmidos si tienen un origen dereplicación adecuados.
Generalmente contienen marcadores genéticos que permitensu selección en los dos sistemas huésped.
SV40 ori en células de mamífero.
ColE1 ori para la replicación del ADN de doble cadena.
f1 ori para la replicación de ADN de cadena sencilla enprocariotas.
Cósmidos
Cósmidos
Pasos en la clonación usando cósmidos como vectores
Aplicación
Clonación y caracterización de genes involucrados en la utilización de la sacarosa en cepas de E. coli enteropatógena
• Sacarosa
• PTS
• SACAROSA 6-fostato
Hidrólisis
• D-glucosa -6-fosfato
• D-fructosa
Fosforilación• Fructokinasa
dependiente de ATP
Vías metabólicas
Clonación y caracterización de genes involucrados en la utilización de la sacarosa en cepas de E. coli enteropatógena
OBJETIVOS:
• Determinar la capacidad de nueve cepas de E. colienteropatógenas.
• Aislar y caracterizar los genes involucrados.
Clonación y caracterización de genes involucrados en la utilización de la sacarosa en cepas de E. coli enteropatógena
9 cepas de E. coli
MackScr0.2%
M9Scr0.2%
Clonación y caracterización de genes involucrados en la utilización de la sacarosa en cepas de E. coli enteropatógena
Clonación y caracterización de genes involucrados en la utilización de la sacarosa en cepas de E. coli enteropatógena.
pCP13
E.Coli
W3110Scr-
W3110
Sacarosa +
Clonación y caracterización de genes involucrados en la utilización de la sacarosa en cepas de E. coli enteropatógena.
• Las nueve cepas de E. coli crecen en medios deM9Scr0.2% y producen colonias rojas en MackScr0.2%.
Clonación y caracterización de genes involucrados en la utilización de la sacarosa en cepas de E. coli enteropatogena
Resultados y Discusión
• Las nueve cepas utilizadas son capaces de crecer en presencia de sacarosa pero su capacidad de emplear esta azúcar es diferente.
• La utilización de un procedimiento de selección positiva nos permitió aislar los genes involucrados en el catabolismo de esta azúcar.
Clonación y caracterización de genes involucrados en la utilización de la sacarosa en cepas de E. coli enteropatogena
Conclusiones
Gracias
“Si el amor es el que guía
tu vida, realizarás
grandes empresas”San Agustín
• Características de un vector
• ¿Qué es un cósmido?
• Diferencias entre cósmido, plásmido y bacteriófago