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COPOLÍMERO DE FUMARATO- QUITOSANO ENTRECRUZADO DIRIGIDO

COMO SCAFFOLDS PARA INGENIERIA DE TEJIDO OSTEO-CARTILAGINOSO

M. L. Lastra1, 2, M. S. Molinuevo1, M. S. Cortizo2

1 Laboratorio de Investigación en Osteopatías y Metabolismo Mineral (LIOMM), Fac. de Cs. Exactas, UNLP, 47 y 115, La Plata, Argentina.

2 Grupo Macromoléculas, Instituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y Aplicadas (INIFTA), Dpto. de Química, Fac. Cs. Exactas, UNLP, CCT- La Plata,

CONICET CC 16, Suc. 4. La Plata, Bs. As., Argentina. e-mail: [email protected]

RESUMEN

La ingeniería de tejidos pretende recrear el ambiente adecuado para promover el

comportamiento de las células apropiadas para la regeneración de tejidos.

Lesiones osteocondrales son difíciles de restaurar sin la ayuda de un “scaffold”

debido a la complejidad de este tejido. Una condición necesaria para el uso de

estos materiales es la velocidad de degradación que debe estar en línea con el

tiempo necesario para la reparación del tejido, la capacidad de absorción de agua

y una necesaria baja toxicidad. Previamente, hemos preparado un “scaffold” de un

copolímero de fumarato entrecruzado con quitosano, y hemos demostrado que

este andamio permite el crecimiento y la diferenciación de las células

osteoprogenitoras. En este trabajo se evaluó la tasa de degradación, propiedades

de hinchamiento y la posible respuesta inflamatoria de este biomaterial

entrecruzado. Nuestros resultados sugieren que el “scaffold” entrecruzado

fumarato/ quitosano sería útil en la regeneración de la ingeniería de tejidos

osteocondral ya que es capaz de incorporar agua, se degrada lentamente con el

tiempo y presenta baja citotoxicidad.

Palabras claves: ingeniería de tejidos, copolímeros fumáricos, quitosano, cartílago,

hueso.

9º Congresso Latino-Americano de Orgãos Artificiais e Biomateriais13º Congresso da Sociedade Latino Americana de Biomateriais, Orgãos Artificiais e Engenharia de Tecidos - SLABO

24 a 27 de Agosto de 2016, Foz do Iguaçu, PR

649

INTRODUCCIÓN

La zona de interfase entre el tejido óseo y el cartilaginoso de un hueso se

denomina tejido osteocondral. Esta zona se encuentra altamente organizada y

juega un papel crítico en el mantenimiento del hueso. La naturaleza avascular del

cartílago es la razón de la pobre capacidad de regeneración después de lesiones

o enfermedades degenerativas (1). Cuando existen daños en este tejido, a

menudo se requieren procedimientos quirúrgicos para la regeneración de las

lesiones e incluso en algunos casos es necesario el uso de algún material para

promover la regeneración del tejido.. El diseño de un biomaterial adecuado para la

reparación de un tejido específico puede ser modulada por la selección apropiada

de los comonomeros y/o mezcla con otro biomaterial. Entre los polímeros

estudiados, el quitosano presenta gran interés debido a su alta biocompatibilidad y

baja toxicidad; sin embargo, sus propiedades mecánicas débiles y la tasa de

degradación no controlada han llevado al diseño de materiales compuestos entre

polímeros sintéticos y naturales.

Desde hace varios años nuestros grupos trabajan en ingeniería de tejidos,

habiendo desarrollado y caracterizado matrices poliméricas de origen natural y

sintético para promover el proceso de reparación ósea (2-5). Hemos estudiado

previamente nuevas matrices preparadas por entrecruzamiento de un copolímero

de fumarato con quitosano, encontrando que presentan una buena

biocompatibilidad con células osteoprogenitoras de la médula ósea y condrocitos

primarios. En el presente trabajo estudiaremos la degradación, el swelling y la

citotoxicidad de estos biomateriales, que han sido previamente caracterizados.



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El copolímero (PVF) de acetato de vinilo (AcV) y fumarato de diisoproplilo (FIP) se

obtuvo por una síntesis en masa empleando energía de microondas siguiendo una

metodología previamente desarrollada (6).

Con el objetivo de introducir grupos hidrófilos en la cadena macromolecular

principal del copolímero y mejorar su compatibilidad con el quitosano se sometió el

copolímero a una reacción de hidrolisis básica (7). El producto de este

procedimiento se designa como PVFH.

Preparación de las membranas

Se preparó una mezcla 50% p/p de quitosano (CHI) (Sigma Aldrich, high molecular

weight) y el copolímero previamente sintetizado (PVFH). Para lo cual se preparan

soluciones de los polímeros en ácido acético y se vierten en moldes, donde se

dejan a temperatura ambiente hasta evaporación completa del solvente. La

mezcla se entrecruza por incorporación de bórax in situ, según la metodología

descripta por Sreedhar (8). Así las membranas se obtienen por el método de

solvent casting. Por último la película se seca bajo vacío hasta peso constante.

Estudio de degradación enzimática

Para la degradación enzimática, los scaffolds (conteniendo o no bórax para fines

comparativos) previamente pesados a seco (w0), se colocan , en 10 ml de una

solución estéril de PBS (pH 7,4) conteniendo lipasa 115 U/L (EC 3.1.1.3,

Pseudomonas sp., Sigma) e incubándolos a 37°C durante diferentes períodos de

tiempo (7, 15 y 45 días), cambiando el medio cada semana. Para cada condición

experimental se ensayaron un mínimo de cuatro muestras. A los distintos tiempos

evaluados, las muestras se lavan con agua destilada, se secan en vacío a

temperatura ambiente y se pesan en estado seco (wd). La degradación se evalúa

con la pérdida porcentual de peso (% weight loss) empleando la siguiente fórmula:



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MATERIALES Y MÉTODOS

Obtención del copolímero

0

0 100

w

wwloss weight%

d (A)

Estudio de swelling

Para obtener el máximo swelling y la capacidad de absorción de agua de las

matrices, éstas se pesan en estado seco (w0), se sumergen en una solución salina

de buffer fosfato (PBS, pH 7,4) a 37°C y a intervalos regulares de tiempo se retiran

las muestras, y se pesan en estado húmedo (w). El swelling porcentual de la

membrana (%Sw) se define como:

0

0 100

w

)ww(S% w

(B)

Con el fin de tener conocimientos sobre el proceso de transporte de agua a través

de los scaffolds, se utilizó la siguiente ecuación para analizar el proceso de

hinchamiento:

nt tkW

W

(C)

Donde k es una constante característica del sistema, que depende de las

características estructurales del polímero y su interacción con el disolvente, n es el

exponente swelling, que describe el mecanismo de transporte de agua en la

membrana, mientras que Wt y W∞ representan la cantidades de agua absorbida en

el momento t y en el tiempo de equilibrio, respectivamente (9). Representando

gráficamente log (Wt/W∞) versus log t, a partir de los datos experimentales

tomados hasta 60% de la swelling máximo, se puede obtener de la pendiente el

valor de n, mientras que k se obtiene de la intercepción con el eje de la ordenada.



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La citotoxicidad de los scaffolds se evaluó mediante la medición de la producción

de óxido nítrico (NO) y la interleuquina-1β (IL1β) utilizando un modelo de

macrófagos RAW264.7 en cultivo. Resumidamente, los macrófagos se cultivaron

con los scaffolds o directamente sobre las placas de cultivo (condición control) en

DMEM sin rojo fenol suplementado con 5% de suero fetal bovino y antibióticos

(100 U/mL penicilina y 100 g/mL estreptomicina) en atmósfera humificada con 5%

CO2 a 37ºC. Se recogieron los sobrenadantes después de 24 h, 48 y 72 horas y se

evaluó la producción de NO por el ensayo de Griess (10). La producción IL-1β se

midió en el medio después de 2, 7 y 13 días de incubación mediante kit de ELISA

(BD OptEIA™ mouse IL-1β ELISA, ELISA set).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los estudios de cinética de degradación en presencia de la enzima lipasa

muestran un aumento lineal en la pérdida de peso, con un máximo de degradación

de aproximadamente 10% después de 45 días de incubación (Fig 1). Sin embargo,

en esta figura puede observarse que inicialmente la degradación es

significativamente menor en las matrices entrecruzadas con bórax (PVFH/CHI/B)

que en aquellas que no se entrecruzaron (PVFH/CHI) (Fig 1). Se sabe que el

quitosano es susceptible de ser degradado in vivo por la lipasa al actuar sobre los

residuos acetilados (11). Nuestros resultados muestran que la presencia de bórax

en la preparación de los scaffolds disminuye la capacidad de degradación

enzimática, lo que sería un indicio de que el entrecruzamiento disminuiría la

exposición de los residuos de quitosano suceptibles de degradarse. Por otro lado,

el hecho que inicialmente el scaffold entrecruzado se degrade menos permitiría a

las células poder colonizar la matriz y desarrollarse de manera adecuada para

reparar la lesión



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Estudio de citotoxicidad con macrófagos

FIGURA 1. Estudio de degradación enzimática. Los scaffolds con (PVFH-CHI-B) y sin

bórax (PVFH-CHI) fueron incubados en presencia de lipasa a 37°C durante diferentes

períodos de tiempo. *p<0.05 vs PVFH-CHI, n=5.

A continuación, se evaluó la cinética de hinchamiento (swelling) de los scaffolds

en solución de PBS pH 7.4 a 37 °C (Figura 2). En esta figura se puede observar

que el grado de hinchamiento aumenta con el tiempo, hasta un cierto punto en el

que se hace constante, este equilibrio se alcanza dentro de 30 minutos;

observando un swelling máximo de aproximadamente 300%. Este valor nos

indicaría que el scaffold entrecruzado con bórax se comporta como un hidrogel.

Durante el proceso de hinchamiento las moléculas de agua difunden hacia el

interior de la matriz del polímero actuando como plastificantes y promueven la

relajación de las cadenas macromoleculares. Como se mencionó anteriormente, la

cinética de este proceso puede ser analizada mediante el modelo de Fick

(ecuación C) con el fin de determinar el parámetro n. El recuadro dentro de la

figura 2 muestra el gráfico de regresión lineal de la fracción de agua absorbida a

tiempos cortos de acuerdo con la ecuación (C); la pendiente de esta curva nos

permite calcular el valor de n que es igual a 0.809. Este resultado sugiere que el

mecanismo de transporte de agua dentro del scaffold se produce por un proceso

de difusión “no Fickiano”, probablemente con una difusión de agua rápida en

comparación con la relajación de la cadena macromolecular.



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FIGURA 2. Swelling. Scaffold PVFH-CHI-B estudiado en PBS pH 7.4 a 37°C.

Uno de los requisitos de los materiales empleados en ingeniería de tejidos es que

presenten nula o baja toxicidad. Previamente se ha descripto que los macrófagos

tienen la capacidad de reaccionar a cuerpos extraños que producen mediadores

de la inflamación, tales como IL-1β y NO, y por lo tanto representan un buen

modelo para investigar la citotoxicidad de los biomateriales. Así, investigamos si

nuestros scaffolds tienen efecto citotóxico empleando macrófagos murinos

(RAW264.7) en cultivo y evaluando la producción de NO y IL-1β durante diferentes

tiempos de incubación. Nuestros resultados muestran que no existe un aumento

significativo en la producción de NO ni de IL-1β (Tabla 1 y 2, respectivamente)

después de que las células se incubaron sobre los scaffolds en comparación con

la condición control (placas de cultivo estándar). Aunque hubo un aumento en la

secreción de la citoquina en función del tiempo de cultivo, se encontró que este

aumento no presenta diferencias estadísticas entre la condición control y la

condición de estudio (células creciendo sobre el scaffolds PVFH-CHI-B),

demostrando que la combinación de estos dos materiales entrecruzados por

utilización de bórax no generó ningún tipo de toxicidad.



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Tabla 1. Producción de NO determinada por la reacción de Griess con RAW264.7.

NO [nmol/ml]

24hs 48hs 72hs

Control 0,014 ± 0,017 0,262 ± 0,074 0,096 ± 0,041

PVFH-CHI-B 0,034 ± 0,034 0,389 ± 0,148 0,035 ± 0,023

Los resultados son expresados como la media ± SEM, n=6.

Tabla 2.Producción de IL-1β determinada por kit ELISA con RAW264.7.

IL-1β [pg/ml]

2 día 7 días 15 días

Control 0.33 ± 0.31 1.57 ± 0.31 1.11 ± 0.20

PVFH-CHI-B 0.28 ± 0.05 1.92 ± 0.37 1.78 ± 0.26

Los resultados son expresados como la media ± SEM, n=3.

CONCLUSIONES

En conclusión, hemos desarrollado un biomaterial basado en un copolímero de

acetato de vinilo –fumarato de diisopropilo entrecruzado con quitosano para ser

empleado en ingeniería de tejido. Este biomaterial entrecruzado puede ser

considerado un hidrogel basándonos en su comportamiento de swelling. Por otra

parte, hemos demostrado que este scaffold presenta baja citotoxicidad y podría

degradarse lentamente para cumplir los requisitos de reparación de tejido

osteocondral. Estos resultados, junto con los previamente publicados, sobre su

buena biocompatibilidad, sugieren que las matrices entrecruzadas generan

scaffolds prometedores para ser empleados en ingeniería de tejido cartilaginoso,

aunque se requieren aun estudios in vivo para asegurar su eficacia.

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FUMARATE COPOLYMER – CHITOSAN CROSSLINKED SCAFFOLD

DIRECTED TO OSTEOCHONDRAL TISSUE ENGINEERING

ABSTRACT

Tissue engineering aims to recreate the native environment to promote the

appropriate cell behaviour for tissue regeneration. Osteochondral lesions are

difficult to restore without the aid of a scaffold because of the complexity of this

tissue. One necessary condition for the use of these materials is the degradation

rate that must be in line with the time needed for tissue repair, water absorption

capacity and the needed of low toxicity. We have previously prepared a scaffold by

cross-linking fumarate copolymer and chitosan and we have demonstrated that this

scaffold allowed growth and differentiation of osteoprogenitor cells. In this work we

evaluated the degradation rate, swelling properties and the possible inflammatory

response of this cross-linked biomaterial. Our results suggested that cross-linked

fumarate/chitosan based scaffold would be useful in the regeneration of

osteochondral tissue engineering since it is able to incorporate water, degrades

slowly with time and presented low cytotoxicity.

Key-words: tissue engineering, fumarate copolymer, chitosan, cartilage, bone.



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